JP2008232764A - 充填床用新規充填剤及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】不飽和型合成モノマーを重合してなる、細孔容積が50体積%以上である多孔性粒子であって、その細孔内部が、架橋構造を有していない水溶性ポリマーが共有結合により固定化されて満たされ、かつ、その水溶性ポリマー部位に、共有結合された親和性官能基を有することを特徴とする新規充填剤により、高吸着容量と精製速度の向上を達成する。
【選択図】なし
Description
多官能性モノマーを添加することで得られる架橋度は5モル%以上必要であり、好ましくは、5モル%以上50モル%以下である。ここで架橋度のモル%とは、全モノマー類のモル数に対する多官能性モノマーのモル%を示す値である。5モル%未満である場合は、得られる粒子が軟質で充填床の高流速の処理には使用できず、50モル%より高い場合、粒子が脆くなるという問題が生じる。好ましくは10〜20モル%である。
粒子の製造方法としては、特に限定されず、一般的に粒子を製造する公知の方法であればいかなる方法も用いることができるが、特に好ましくは懸濁重合である。懸濁重合を行う場合、媒体として水を用い、これにモノマー類の有機溶液を添加、攪拌し重合して粒子を製造することができる。モノマーが水溶性である場合には、媒体として疎水性有機溶媒を用い逆相懸濁重合により粒子を製造することもできる。粒子を多孔性にする方法としては、特に限定されず、通常多孔性粒子を製造する方法であれば、如何なる方法を用いても良いが、例えば順相懸濁重合では、好ましくはモノマー、2官能性モノマーなどの混合液に、有機溶媒を添加し均一溶液とし、重合の進行とともにポリマーを析出させ細孔を形成させる方法が好ましい。この時、用いられる有機溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えばクロロベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ヘキサン、ヘプタン、デカン等の飽和炭化水素類、イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類が挙げられるが、水に不溶性で、用いたモノマー及び開始剤を溶解する有機溶媒であれば、特にこれらに限定されるものではない。またこれらの有機溶媒は単独で用いても良いし、混合物を用いても良い。その有機溶媒の添加量は充填剤の排除限界分子量や細孔容積の体積%(充填剤粒子の全容積に対する細孔容積の割合を示す)に影響を与える。
製造例1
まず、ケン化率88%、重合度3500のポリビニルアルコール(懸濁安定剤)1.5grと1リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコールを水に溶解させた。その後、水溶液が60℃になるよう調節し、グリシジルメタクリレート54gr、エチレングリコールジメタクリレート3.2gr、クロロベンゼン70gr及びアゾビスイソブチロニトリル0.3grからなる混合溶液を作り、60℃の水溶液中に攪拌を行いながら、該混合溶液を滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を6時間、60℃で重合させた。反応器を室温に冷却し、生成した粒状ゲルを濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄した。更に、水で良く洗浄を行った後、該重合物55gr(ドライゲル重量)を0.5N硫酸水溶液 500mlとよく混合した。これを水浴上で90℃に加熱し、5時間反応を行い、エポキシ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、粒子径40μm〜110μm、架橋度4モル%の水湿潤ゲルを220gr取得し、これを親水化基材とした。その粒子の含水率をケット式水分計で120℃、15分加熱して粒子の重量減より求めた。その結果、含水率は75%であった。
親水化基材のゲルスラリー水溶液を用いて内径10.7mm、長さ150mmのステンレス製カラムに最密充填になるように充填した。次に、東ソー製RI−8000検出器を装備した東ソー製HLC−803Dに該カラムを装着した。引き続き、標準物質に分子量4000万のデキストラン及び各分子量のプルランを用い、0.5ml/分の流速で種々の分子量の標準物質を注入し、その溶出容量から排除限界分子量を求めた。また、デキストランとエチレングリコールの溶出容量及びカラム容積から細孔容積を求めた。該粒子の排除限界分子量は、168万、細孔容積は80体積%であった。
製造例2
まず、ケン化率88%、重合度3500のポリビニルアルコール(懸濁安定剤)1.5grと1リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコールを水に溶解させた。その後、水溶液が60℃になるよう調節し、次に、グリシジルメタクリレート49gr、エチレングリコールジメタクリレート10gr、クロロベンゼン70gr及びアゾビスイソブチロニトリル0.3grからなる混合溶液を作り、60℃の水溶液中に攪拌を行いながら、該混合溶液を滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を6時間、60℃で重合させた。反応器を室温に冷却し、生成した粒状ゲルを濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄した。更に、水で良く洗浄を行った後、該重合物57gr(ドライゲル重量)を0.5N硫酸水溶液500mlとよく混合した。これを水浴上で90℃に加熱し、5時間反応を行い、エポキシ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、粒子径40μm〜110μm、架橋度13モル%の水湿潤ゲルを227gr取得し、これを親水化基材とした。その粒子の含水率をケット式水分計で120℃、15分加熱して粒子の重量減より求めた。その結果、含水率は75%であった。
製造例3
まず、ケン化率88%、重合度3500のポリビニルアルコール(懸濁安定剤)1.5grと1リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコールを水に溶解させた。その後、水溶液が60℃になるよう調節し、次に、グリシジルメタクリレート25gr、エチレングリコールジメタクリレート43gr、クロロベンゼン70gr及びアゾビスイソブチロニトリル0.3grからなる混合溶液を作り、60℃の水溶液中に攪拌を行いながら、該混合溶液を滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を6時間、60℃で重合させた。反応器を室温に冷却し、生成した粒状ゲルを濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄した。更に、水で良く洗浄を行った後、該重合物66gr(ドライゲル重量)を0.5N硫酸水溶液500mlとよく混合した。これを水浴上で90℃に加熱し、5時間反応を行い、エポキシ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、粒子径40μm〜110μm、架橋度55モル%の水湿潤ゲルを244gr取得し、これを親水化基材とした。その粒子の含水率をケット式水分計で120℃、15分加熱して粒子の重量減より求めた。その結果、含水率は73%であった。
製造例4
まず、ケン化率88%、重合度3500のポリビニルアルコール(懸濁安定剤)1.5grと1リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコールを水に溶解させた。その後、水溶液が60℃になるよう調節し、次に、グリシジルメタクリレート49gr、エチレングリコールジメタクリレート10gr、クロロベンゼン60gr及びアゾビスイソブチロニトリル0.3grからなる混合溶液を作り、60℃の水溶液中に攪拌を行いながら、該混合溶液を滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を6時間、60℃で重合させた。反応器を室温に冷却し、生成した粒状ゲルを濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄した。更に、水で良く洗浄を行った後、該重合物55gr(ドライゲル重量)を0.5N硫酸水溶液500mlとよく混合した。これを水浴上で90℃に加熱し、5時間反応を行い、エポキシ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、粒子径40μm〜110μm、架橋度13モル%の水湿潤ゲルを190gr取得し、これを親水化基材とした。その粒子の含水率をケット式水分計で120℃、15分加熱して粒子の重量減より求めた。その結果、含水率は71%であった。
製造例5
まず、ケン化率88%、重合度3500のポリビニルアルコール(懸濁安定剤)1.5grと1リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコールを水に溶解させた。その後、水溶液が60℃になるよう調節し、次に、グリシジルメタクリレート49gr、エチレングリコールジメタクリレート10gr、クロロベンゼン55gr及びアゾビスイソブチロニトリル0.3grからなる混合溶液を作り、60℃の水溶液中に攪拌を行いながら、該混合溶液を滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を6時間、60℃で重合させた。反応器を室温に冷却し、生成した粒状ゲルを濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄した。更に、水で良く洗浄を行った後、該重合物56gr(ドライゲル重量)を0.5N硫酸水溶液500mlとよく混合した。これを水浴上で90℃に加熱し、5時間反応を行い、エポキシ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、粒子径40μm〜110μm、架橋度13モル%の水湿潤ゲルを181gr取得し、これを親水化基材とした。その粒子の含水率をケット式水分計で120℃、15分加熱して粒子の重量減より求めた。その結果、含水率は69%であった。
製造例6
まず、ケン化率88%、重合度3500のポリビニルアルコール(懸濁安定剤)1.5grと1リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコールを水に溶解させた。その後、水溶液が60℃になるよう調節し、次に、グリシジルメタクリレート49gr、エチレングリコールジメタクリレート10gr、クロロベンゼン85gr及びアゾビスイソブチロニトリル0.3grからなる混合溶液を作り、60℃の水溶液中に攪拌を行いながら、該混合溶液を滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を6時間、60℃で重合させた。反応器を室温に冷却し、生成した粒状ゲルを濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄した。更に、水で良く洗浄を行った後、該重合物56gr(ドライゲル重量)を0.5N硫酸水溶液500mlとよく混合した。これを水浴上で90℃に加熱し、5時間反応を行い、エポキシ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、粒子径40μm〜110μm、架橋度13モル%の水湿潤ゲルを241gr取得し、これを親水化基材とした。その粒子の含水率をケット式水分計で120℃、15分加熱して粒子の重量減より求めた。その結果、含水率は77%であった。
実施例1
製造例2で得られた湿潤多孔性粒子150gr(含水率75%)を300mlの水とともに攪拌機付き反応器に仕込んだ。良く攪拌を行いながら、この懸濁液にエピクロロヒドリン160grを添加した。内部温度を55℃以下になるように調整しながら48%NaOH水溶液130grを2時間で滴下した。滴下終了後反応は4時間行い、反応終了後、反応液はガラスフィルター濾過器を用いて濾過した。濾過後濾液が中性になるまで水でよく洗浄し、エポキシ活性化した水湿潤ゲル155grを得た。含水率をケット式水分計で120℃、15分加熱して粒子の重量減より求めた。その結果、含水率は74%であった。
(1)充填剤の硬さ測定
得られた充填剤の流通特性を測定する為に、篩分級で得た充填剤(体積平均粒子径:78μm、標準偏差:16.5μm)を内径22mm長さ200mmのPEEKカラムにスラリー充填法で線速度400cm/時で充填した。定流量ポンプ(最大流速200ml/分)で0から80ml/分で純水を通液し、最大0.4MPaまで測定可能なブルドン管式圧力計を用い、各流速での圧力損失を測定した。次に充填剤をカラムより抜出し、空カラム及び送液システムの同一流速での圧力損失を測定し、充填剤ベッドの正味の圧力損失を算出した。その結果、最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、線流速1263cm/時での圧力損失は0.12MPaと低い値を示した。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を内径6mm、長さ40mmのステンレス製クロマトグラフ管に充填した。ヒト免疫グロブリンを100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.7)に溶解し濃度1mg/mlの溶液を調整した。充填剤を充填したカラムを東ソー製定量ポンプCCPMに接続し、酢酸ナトリウム緩衝液を流して平衡化した。このカラムに調整したヒト免疫グロブリン溶液を1ml/分の流速で流し込んだ。タンパク質の破過曲線を、東ソー製紫外線吸収検出器UV−8020を用いて測定した。破過曲線が10%の高さに達するまでの時間からヒト免疫グロブリンの吸着容量を測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は150mg/mlと高い値を示した。
実施例2
プルラン固定化ゲルまでは、実施例1に示した方法と同様の方法で合成を行った。含水率は74%で、プルラン固定化量は99mg/gドライゲルであった。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、線流速1263cm/時での圧力損失は0.15MPaと低い値を示した。
(2)ウシ血清アルブミン吸着容量の測定
得られた充填剤を内径6mm、長さ40mmのステンレス製クロマトグラフ管に充填した。ウシ血清アルブミンを50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)に溶解し濃度1mg/mlの溶液を調整した。充填剤を充填したカラムを東ソー製定量ポンプCCPMに接続し、トリス塩酸緩衝液を流して平衡化した。このカラムに調整したウシ血清アルブミン溶液を1ml/分の流速で流し込んだ。タンパク質の破過曲線を、東ソー製紫外線吸収検出器UV−8020を用いて測定した。破過曲線が10%の高さに達するまでの時間からウシ血清アルブミンの吸着容量を測定した。結果、ウシ血清アルブミンの吸着容量は180mg/mlと高い値を示した。
実施例3
製造例4で得られた多孔性粒子を用いた以外は、実施例1に示した方法と同様の方法でプルラン固定化ゲルの合成を行った。含水率は71%で、プルラン固定化量は55mg/gドライゲルであった。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流速の圧力損失は0.11MPaと実施例1と同様の値を示した。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は110mg/mlであった。
実施例4
製造例6で得られた多孔性粒子を用いた以外は、実施例1に示した方法と同様の方法でプルラン固定化ゲルの合成を行った。含水率は78%で、プルラン固定化量は115mg/gドライゲルであった。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。流速と圧力損失とは最初直線関係を示したが、流速600cm/時以上で圧力が急激に増加し、実施例1より高い0.27MPa以上の値を示した。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は160mg/mlであった。
実施例5
製造例1で得られた多孔性粒子を用いた以外は、実施例1に示した方法と同様の方法でプルラン固定化ゲルの合成を行った。含水率は76%で、プルラン固定化量は105mg/gドライゲルであった。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。流速と圧力損失とは直線関係を示さず、線流速800cm/時での圧力損失は0.35MPaと実施例1と比較して高い値を示した。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は155mg/mlであった。
実施例6
製造例3で得られた多孔性粒子を用いた以外は、実施例1に示した方法と同様の方法でプルラン固定化ゲルの合成を行った。含水率は74%で、プルラン固定化量は90mg/gドライゲルであった。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。流速と圧力損失とは最初直線関係を示したが、線流速600cm/時以上で圧力が急激に増加し、実施例1より高い0.25MPa以上の値を示した。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は145mg/mlであった。
比較例1
製造例5で得られた多孔性粒子を用いた以外は、実施例1に示した方法と同様の方法でプルラン固定化ゲルの合成を行った。含水率は69%で、プルラン固定化量は40mg/gドライゲルであった。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流速の圧力損失は0.11MPaと実施例1と同様の値を示した。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は実施例1〜5と比較して80mg/mlと低い値を示した。
比較例2
実施例1に示した方法と同様の方法でプルラン固定化ゲルの合成を行った。含水率は74%で、プルラン固定化量は100mg/gドライゲルであった。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流速の圧力損失は0.09MPaと低い値を示した。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は40mg/mlと極端に低い値を示した。
比較例3
市販品であるToyopearl SP650M(東ソー株式会社製)を用いて物性評価を行った。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、線流速1263cm/時での圧力損失は0.26MPaであった。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は12mg/mlと極端に低い値を示した。
比較例4
市販品であるToyopearl SuperQ−650M(東ソー株式会社製)を用いて物性評価を行った。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、線流速1263cm/時での圧力損失は0.20MPaであった。
(2)ウシ血清アルブミン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例2で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ウシ血清アルブミンの吸着容量は120mg/mlと低い値を示した。
比較例5
市販品であるFractogel EMD SE. Hicap(M)(Merck社製)を用い、物性評価を実施した。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、線流速1263cm/時での圧力損失は0.25MPaであった。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は90mg/mlであった。
比較例6
市販品であるS Ceramic Hyper D (F)(Pall Life Science社製)を用い、物性評価を実施した。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、線流速1263cm/時での圧力損失は0.20MPaであった。
(2)ヒト免疫グロブリン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例1で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ヒト免疫グロブリンの吸着容量は60mg/mlであった。
比較例7
市販品であるDEAE Spherodex(Pall Life Science社製)を用い、物性評価を実施した。
(1)充填剤の硬さ測定
実施例1で示した方法と同様の方法で充填カラムの圧力損失を測定した。最大流速80ml/分(線流速1263cm/時)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、線流速1263cm/時での圧力損失は0.21MPaであった。
(2)ウシ血清アルブミン吸着容量の測定
得られた充填剤を用い、実施例2で示した方法と同様な方法で測定した。結果、ウシ血清アルブミンの吸着容量は75mg/mlであった。
Claims (10)
- 不飽和型合成モノマーを重合してなる、細孔容積が50体積%以上である多孔性粒子であって、その細孔内部が、架橋構造を有していない水溶性ポリマーが共有結合により固定化されて満たされ、かつ、その水溶性ポリマー部位に、共有結合された親和性官能基を有することを特徴とする新規充填剤。
- 多孔性粒子の細孔容積が95体積%以下であり、かつ、その架橋度が5モル%以上50モル%以下であることを特徴とする、請求項1記載の新規充填剤。
- 多孔性粒子の粒子サイズが30μm以上300μm以下であることを特徴とする、請求項1記載の新規充填剤。
- 親和性官能基が、イオン交換官能基、疎水性官能基、アフィニティー官能基のいずれかであることを特徴とする、請求項1記載の新規充填剤。
- 水溶性ポリマーが水溶性直鎖状有機高分子であり、その骨格にヒドロキシル官能基、もしくはアミノ官能基を有することを特徴とする、請求項1記載の新規充填剤。
- 水溶性直鎖状有機高分子が多糖類又は多糖類を含有する混合物である、請求項5記載の新規充填剤。
- 多糖類がアガロース、デキストラン、プルラン、デンプン、セルロース、又はその誘導体である、請求項6記載の新規充填剤。
- 水溶性直鎖状有機高分子がポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン又はポリビニルアミンである、請求項5記載の新規充填剤。
- タンパク質を含む生体高分子を試料から分離精製する方法であって、請求項1乃至8記載の充填剤と試料とを接触させる工程を含む、方法。
- 充填剤をクロマトグラフィー用カラムに充填した状態で試料と接触させることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
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