JPH10500164A - 粒子の製造方法、及び該方法によって製造され得る粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開始剤を用いて、エマルジョン中においてモノビニルモノマー及びジビニルモノマー及び／又はポリビニルモノマー（架橋剤）を重合することにより、開放細孔を有する球状粒子を製造する。この方法は、（ｉ）油中水型エマルジョンを含む液滴を乳化状態で含有する水層を含むｗ／ｏ／ｗエマルジョンを調製する工程であり、ここで、この液滴中の油相はビニルモノマーと逆エマルジョンを提供する乳化剤とを含み、かつこの液滴は２，０００μｍ未満の直径を有し、水の全量は７５−９９％（ｗ／ｗ）である工程；及び（ｉｉ）その後、重合を開始し、重合工程の後、任意に篩分けした後に、反応混合物から粒子を単離する工程を含む。開放細孔を有する球状ポリマー粒子群は５０μｍ−２，０００μｍの範囲内の直径を有し、かつ（ａ）粒子直径の＜１／９の直径の球状中空；及び（ｂ）この球に対する及び粒子表面上の開口直径がこの球の直径の約１／１０−１／３である連結細孔を有する細孔系を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 粒子の製造方法、及び該方法によって製造され得る粒子 技術分野及び関連する従来技術の説明 本発明は、開放細孔構造を有する新規な微細孔粒子に関し、そのような粒子の 製造方法にも関する。この粒子は、特にこの粒子が親水性形態にある場合に、ク ロマトグラフィー並びにオリゴペプチド類及びオリゴヌクレオチド類の固相合成 における支持体マトリックス、並びに細胞、例えば、足場依存性細胞の培養にお ける微小担体、並びに異種イムノアッセイにおける固相として用いることができ る。 本明細書において、球とは球状中空及び球状粒子を指し、並びに緩やかな丸み を帯び、かつわずかに引き伸ばされたそれらの球様体形態でもある。 多年にわたって、これらの用途のための微細孔粒子及びそれらの製造が強く求 められている。微細孔性の増大は、粒子を通る流れが改善される結果となり、こ の流れの改善は動力学の改善を生じる。 本発明の粒子は、ｗ／ｏ／ｗエマルジョン中での重合により製造することがで きる。このタイプのエマルジョンは、分散し た水層を含む油滴の水性エマルジョンと考えることができる。ｗ／ｏ／ｗエマル ジョンは、従来、細孔粒子の製造に用いられている（Ｔｉｏｘｉｄｅ Ｇｒｏｕ ｐ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌｔｄ．、ＧＢ−Ａ−２，２４５，５７５）。また、粒子 は、不飽和ポリエステルをスチレン及びジビニルベンゼンのような不飽和モノマ ーで架橋することによっても製造されている。 本発明の方法は、分散相含量の高い（＝高分散相エマルジョン）、いわゆる逆 エマルジョン（油中水型エマルジョン、ｗ／ｏエマルジョン）の使用を利用する 。逆エマルジョンの油相における重合は、従来、とりわけＳｈｅｒｒｉｎｇｔｏ ｎ（ＥＰ−Ａ−６０１３８）及びＢａｙｅｒ ＡＧ（ＤＥ−Ａ−１１６０６１６ ）に記載されている。この逆エマルジョンは、通常、＞６０％、好ましくは＞７ ５％の水（ｗ／ｗ）及び油相（モノマー相）に分配されている乳化剤を含有する 。このような逆エマルジョンに含まれる乳化剤は、通常、＞２、好ましくは２− ６のＨＬＢ値を有する。このＨＬＢ値は、単に乳化剤が所定のタイプの逆エマル ジョンに適するか否かを決定するための指針としてのみ用いることができる。し たがって、前述の範囲は、ＨＬＢ値が＞６の乳化剤もまた高含量の分散相を有す る逆エマ ルジョンを提供する可能性を排除するものではない。 発明の開示 本発明の方法によると、適切な開始剤を用いて、エマルジョン中においてモノ ビニルモノマーとポリビニルモノマー（架橋剤）とを重合することにより、開放 細孔を有する(open porous)球状粒子が製造される。この方法は、 ｉ．油中水型エマルジョンを含む液滴を乳化状態で含有する水相を有するｗ／ ｏ／ｗエマルジョンを調製する段階（ここで、該液滴中の油相はビニルモノマー と逆エマルジョンを提供する乳化剤とを含み、かつ該液滴は２，０００μｍ未満 の直径を有し、並びに水の全量は７５−９９％（ｗ／ｗ）、好ましくは９０−９ ９％である）、 ｉｉ．その後、重合を開始し、重合工程の後、任意に篩がけした後に、反応混 合物から粒子を単離する段階、 を含むことを特徴とする。 重合は、中間相、すなわち、液滴の油相において行われる。 好ましい態様において、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンは２段階で形成される。第１ 段階において、油相が約５−４５％、好まし くは１０−３０％（ｗ／ｗ）を構成する油中水型エマルジョン（ｗ／ｏエマルジ ョン）を形成する。第１段階において、油中水型エマルジョンを形成するために 、好ましくは攪拌しながら、ビニルモノマー及び乳化剤を水と混合する。第２段 階において、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成するために、残りの水を添加する。 通常、残りの水を添加する間混合物の攪拌を中止し、その後再開する。開始剤は 好ましくは第１段階で添加し、開始剤は水溶性であっても油溶性であってもよい 。 液滴中の油相（中間相）は、通常、乳化剤、ビニルモノマー（例えば、一及び 二官能性モノマー）及び、適用可能である場合には、油溶性開始剤を含む。これ らの成分の量は、ほとんどの場合、合計で油相の実質的に１００％となる量であ る。この中間相は、潜在的に、水混和性溶媒及び添加物を含んでいてもよい。 重合段階での撹拌は通常回避される。こうすると、粒子が緩く結合したケーキ の形態で得られる。重合工程で系を撹拌すると、遊離形態の粒子が直接生じる結 果となり易く、したがって、水溶性乳化剤を第２段階において添加することが有 益であり得る。 製造された粒子が本明細書の導入部において述べられた用途の１つに用いられ る場合には、重合が行われる条件は、好ましくは、１０−２，０００μｍ（好ま しくは、５０−２，０００μｍの範囲）の直径を有する粒子を実質的に形成する のに適するものである。したがって、ｗ／ｏ／ｗエマルジョン中の大部分の液滴 （ｗ／ｏエマルジョン）の直径はこの範囲にある。粒子径は、とりわけ、添加さ れる成分（一官能性及び多官能性モノマー、乳化剤、含水量及び攪拌条件）の相 対量及び種類によって決定される。 通常、本発明の粒子の径は、クロマトグラフィーの場合、特に異なる下流プロ セッサーにおける初期精製の場合には、あまり問題とならない。これは、これら の粒子の非常に高い多孔性により、これらの粒子を含んでなるベッドを通して対 流が可能となるためである。しかしながら、これらの粒子は小さすぎるべきでは ない。適切な径は、１００μｍ−７００μｍ、例えば、３００μｍ−７００μｍ である。 細胞培養用担体の場合には、適切な粒子径は、最大径分布が１００μｍで、１ ００μｍ−１，０００μｍ、好ましくは２００μｍ−１，０００μｍである。好 ましい形態の場合には、 細孔径は少なくとも３０μｍ、好ましくは３０μｍ−５０μｍである。 固相合成の場合には、粒子径は５０μｍ−２，０００μｍであればよい。 形成された粒子の多孔度は、粒子径と同じ変数によって決定される。＞８０％ 、例えば＞９０％のように非常に高い多孔度を有する粒子は、本発明の方法によ って製造することが可能である。この細孔系は、球状の中空（cavities）とこれ らの球間を連結する細孔で形成される。これらの球は、一般に、粒子の直径の＜ １／９の直径を有しており、これは、通常、球の直径が１μｍ−２５μｍである ことを意味する。連結細孔の直径は、通常、球の径の約１／１０−１／３であり 、しばしば０．５μｍ−１０μｍである。これまでに製造された粒子は、比表面 積は５−３０ｍ²／ｇであった。しかしながら、この方法は、５０ｍ²／ｇまでの より広い表面積を作り出すことが可能である。表面積はＮ₂吸着（ＢＥＴ法）に より測定され、多孔度はＳＥＭ−画像（細孔径）及び第１段階において製造され るエマルジョンの含水量（細孔容積）から見積もることができる。 粒子径及び多孔度（細孔容積、表面積、細孔径）は攪拌、乳 化剤、モノマー及び含水量に複雑に依存する。所定の粒子を製造するための適正 な条件の選択についての指針は、実験の部及び結果の要約から得ることができる 。 エマルジョンは、逆エマルジョンを提供する乳化剤を、水及び油相と共に常に 含有する（上記並びにＤＥ−Ａ−１１６０６１６及びＥＰ−Ａ−６０１３８を参 照）。適切な乳化剤の具体的な例は、（ａ）Ｃ_10-25カルボン酸と糖アルコール とのモノエステル、並びに（ｂ）親水性セグメント及び疎水性セグメントの両者 を有するブロック共重合体である。逆エマルジョンを提供し得る乳化剤の量は、 通常、＜３０％である。一般に、５％（ｗ／ｗ）が下限である。新規の、より効 果的な乳化剤が発見された場合には、逆エマルジョンを形成し得る下限は、例え ば、２−４％（ｗ／ｗ）まで低下するであろう。これらのパーセンテージは、第 １段階において用いられる油相に関連する乳化剤の量に関係する。 重合は、通常、フリーラジカル型の重合（ビニル重合）である。重合しようと するモノマーは、水に全くもしくは実質的に不溶性である。任意に、少量のモノ マーが、相界面において、モノマーの重合性端部を油相に向けかつモノマーの親 水性端部 を水層に向けてそれ自身を配向するようなＨＬＢバランスを有していてもよい（ 反応性界面活性剤）。 モノマーは、１個以上のアルケン基、すなわち、置換もしくは非置換ビニル基 （一官能性、二官能性及び多官能性ビニルモノマー）を包含する。適切なビニル 基（ＣＨ₂＝ＣＨ−）上の最も一般的な置換基は、炭素原子のいずれかもしくは 両者の水素を置換することが可能なメチルである。ビニルモノマーのビニル基は 、エステル中のカルボニル基もしくはカルボキシ官能基に直接結合していてもよ い。特に、モノアクリレートエステルもしくはジアクリレートエステル又は対応 メタクリレートエステル、ビニルベンゼンもしくはジビニルベンゼンを挙げるこ とができる。通常、ｗ／ｏ／ｗエマルジョン中の二官能性及び多官能性ビニルモ ノマーと一官能性ビニルモノマーとの重量比は重要ではなく、０．５−１００％ の範囲にあればよい。加水分解に対して安定なモノマーを使用すること、すなわ ち、炭素−炭素結合、炭素−水素結合又はエーテル結合のみを有するモノマーを 使用することが好ましい。特定の場合には、メタクリレートエステル類及びメタ クリルアミド類が好ましい。 モノマーが、重合可能な基に加えて官能基、例えばオキシラ ン、をも示す場合には、これらの官能基は粒子の細孔表面の誘導に用いることが できる。これに関する例はグリシジルメタクリレートである。 重合工程は、異なるタイプのラジカル開始剤によって開始することが可能であ る。熱開始剤が好ましい。このような開始剤は、３０−９０℃の範囲において有 効である。ここで、温度の上限は重合工程で水が消失するという望ましからざる 事実によって決定されるのに対して、活性化温度が低くなると室温で自発的に活 性化するという事実によって下限は決定される。開始剤は水溶性であっても、油 溶性であってもよい。熱開始剤の例は、アゾ化合物（例えば、実験の部において 用いられる開始剤（油溶性）、疎水性過酸化物（油溶性）、過硫酸塩（水溶性） 、異なる酸化還元系、例えば、フェントン試薬（Ｆｅｎｔｏｎ’ｓ ｒｅａｇｅ ｎｔ）（過酸化水素＋Ｆｅ²⁺、水溶性））である。 重合は、ＵＶ放射、ガンマー放射及び電子照射等によって開始することもでき る。 前述のエマルジョンは、室温もしくはその近傍の温度で、適切に形成される。 温度は重合工程の過程で変動し得るが、ｗ／ ｏ／ｗエマルジョンが壊れないような温度である。熱開始剤が用いられる場合に は、重合を開始させるために温度を上昇させる必要がある。一般に、温度は、水 の沸点及び他の成分の沸点より少なくとも１０℃以下（すなわち、通常９０℃未 満）に維持されるべきである。温度が上昇すると、しばしば、当該エマルジョン の安定性が損なわれる。 製造された粒子の細孔表面を親水性とし、かつ所望の構造を示すように誘導す ることが可能である。これは、所望構造を示す適切な試薬を吸着させることによ り達成することができる。この吸着される試薬は、確実に安定な層を形成するた め、後の段階において表面に共有結合及び／又は架橋させることができる。ある いは、重合段階において、アルケン基に加えて細孔表面の化学的誘導に用いるこ とが可能な官能基をも有するモノマーを使用してもよい。例えば、粒子表面（内 面及び外面）へのヒドロキシル化合物又はアミン含有化合物のカップリングに後 に用いるため、グリシジルメタクリレートによりエポキシ基を導入することが可 能である。これに続いて、粒子に吸着もしくは共有結合している重合性親水性化 合物を架橋することができる。 このように、本発明の側面の１つによると、それらの内面及び外面に親水性基 （１級アルコール性及び／又はフェノール性ヒドロキシル基及び／又は第一、第 二もしくは第三アミン基）を担持する多孔性粒子であって、その親水性基がそれ らの基を含有する化合物の吸着又は共有結合によって該親水性基に導入されてい る多孔性粒子が製造される。当該化合物は、重合性構造を有していてもよい。 本発明は、下記請求の範囲においてさらに定義される。 実験の部−合成一般的手順 ： 一官能性ビニルモノマー、二官能性ビニルモノマー、乳化剤及び開始剤を混合 して均一な溶液を得、その後、この混合物を激しく攪拌しながら水を滴下により 添加することにより逆エマルジョン（ｗ／ｏ）を調製した（第１段階）。有機相 と水相との比は１０−４０％（ｗ／ｗ）であった（表１を参照）。次いで、混合 物の攪拌を停止し、実験毎に有機相と水相との比が２．５ないし２０％（ｗ／ｗ ）の間で変化するように水を添加した（表１を参照）。その後、混合物の攪拌を 再開し、これにより、ほとんどの例において、３相エマルジョン（ｗ／ｏ／ｗ） が生じた。このエマルジョンを熱風オーブン中において約５０−７０℃の温度に 加熱することにより、重合を行った。粒子をＳＥＭ分析により特性決定し、粒子 の比表面積をＮ₂吸着により決定した。反応混合物の正確な成分を表１に示す。 １．具体的な手順の例： ５．４ｇのスチレン（Ｍｅｒｃｋ、Ａｌ酸化物で精製）、５．４ｇのジビニル ベンゼン（Ｍｅｒｃｋ、Ａｌ酸化物で精 ０．２ｇのＶ６５（２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル；Ｐ ｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を混合して均一な溶液とし、この溶液を激し く攪拌しながら、５０ｇの（蒸留）水を滴下により添加した。その後、さらに５ ８ｇの水を一度に添加した。この溶液をさらに１５分間程度激しく攪拌した。こ のエマルジョンを、熱風オーブン中において、５０℃で一晩、その後７０℃で５ 時間、重合させた。これにより、緩く結合した粒子のケーキが生じた。このケー キを粉砕して１リットルガラスビンに入れ、水を加えた。このビンを超音波浴に １５分間入れた後には、ほとんどの粒子が互いに分離した。 ５００μｍより大きい粒子及び１００μｍ未満の粒子を篩にかけることにより除 去した。残りの粒子をガラスフィルター上でアセトンで洗浄した後、水で十分す すいだ。ＳＥＭは、これらの粒子が非常に大きな気孔を有することを示した。 ２．具体的な手順の例： ２．７ｇのスチレン（Ｍｅｒｃｋ、Ａｌ酸化物で精製）、５．４ｇのジビニル ベンゼン（Ｍｅｒｃｋ、Ａｌ酸化物で精製）、２．７ｇのＧＭＡ（グリシジルメ タクリレート； Ｉ）及び０．２ｇのＶ６５（２，２′−アゾビス）２，４−ジメチルバレロニト リル；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を混合して均一な溶液とし、この溶 液を激しく攪拌しながら、５０ｇの蒸留水を滴下により添加した。その後、５８ ｇの水を一度に添加した。この混合物をさらに１５分間程度激しく攪拌した。こ のエマルジョンを、熱風オーブン中において、５０℃で一晩、その後７０℃で５ 時間、重合させた。これにより、緩く結合した粒子のケーキが生じた。このケー キを粉砕して１リットルガラスビンに入れ、水を加えた。このビンを超音波浴に １５分間入れた後には、ほとんどの粒子が互いに分離した。５００μｍより大き い粒子及び１００μｍ未満の粒子及び凝集物を篩にかけることにより除去した。 残りの粒子をガラスフィルター上でアセトンで洗浄した後、蒸留水で十分すすい だ。ＳＥＭは、その気孔が純粋なスチレン／ＤＢＶ粒子の気孔よりも小さいこと を示した。 ３．オキシラン基を有する多孔性粒子へのＤＥＡＥ基の導入の例： 三首５００ｍｌフラスコ中において、ＤＥＡＥデキストラン（２０ｇ）を（わ ずかに加熱した）蒸留水で１００ｇに希釈した。上記例２からの脱水(drain)し た（しかし、乾燥吸引はしていない）粒子１４６．６ｇを系に加え、得られたス ラリーを６０℃でごく穏やかに攪拌した（ロータリースターラー）。３０分後、 １０ｇの小球状(pastilles)ＮａＯＨ（約１Ｍ）及び２２０ｍｇのホウ水素化ナ トリウムを添加し、その後、６０℃でさらに４時間、系を穏やかに攪拌もしくは 振とうした。次いで、酢酸を添加することにより系のｐＨを中性とし、粒子を水 （５リットル）で十分洗浄した。 ４．吸着による表面改質： フェニルデキストランによるコーティング： 系を激しく攪 拌しながら、フェニルデキストラン（５．０ｇ）（単糖類当たり０．２フェニル 基の置換度）を蒸留水（５０ｍｌ）に溶解した。次いで、本発明の方法（ジャー ナル番号４８１００）により製造された微細孔粒子を添加し、この混合物を懸垂 スターラーで注意深く攪拌した。最後に、粒子をガラスフィルター上で蒸留水で 注意深く洗浄した。 フェニルデキストランの架橋： 前段階からの粒子（１５ｇ）を、５０ｍｌの １Ｍ ＮａＯＨ、１ｍｌのエピクロロヒドリン及び０．０５ｇのホウ水素化ナト リウムと共に、反応容器に入れた。この反応物を室温で２時間攪拌した後、反応 生成物をガラスフィルター上で蒸留水で洗浄した。 エピクロロヒドリンの活性化： 前段階からの粒子（１５ｇ）を、１５ｍｌの 蒸留水、４ｍｌのエピクロロヒドリン、０．０５ｇのホウ水素化ナトリウム及び １．８ｇのＮａＯＨ（Ｐｒｏｌａｂｏ）と共に、反応容器に入れた。２４℃で２ 時間反応を行った後、粒子をガラスフィルター上で蒸留水で洗浄した。 アミノデキストランのカップリング： 前段階からの粒子（１５ｇ）を、１０ ｍｌの蒸留水に溶解したアミノデキストラ ン（１．０ｇ、Ｎ含有率０．４％）を含む反応容器に入れ、次いで、０．０５ｇ のホウ水素化ナトリウムを入れた。０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを１１．５に調製 した後、５０℃で一晩、反応を行った。最後に、粒子をガラスフィルター上で蒸 留水で洗浄した。これらの表面処理した粒子は、水と接触させた際に、良好な湿 潤特性を示した。元素分析は、これらの粒子がカップリング後に６％のアミノデ キストランを含有することを示した。 結果の要約 調製された非誘導粒子(non-derivated)のＳＥＭ−分析の結果を表１に示す。 これらの結果は、本発明の方法により様々な多孔度の粒子を製造することが可能 であることを示す。また、これらの結果は、約５−３５％の範囲、好ましくは１ ０−３０％（ｗ／ｗ）の範囲内の乾燥固体含量にて第１段階（ｗ／ｏエマルジョ ンの製造）を行った場合に、微細孔粒子を得ることができることをも示す。第２ 段階に関して、これらの結果は、乾燥固体含量が減少した場合に、より多くの解 放細孔構造が得られることを示す。 また、これらの結果は、微細孔粒子を得るためには、第１段階と第２段階との 間の乾燥固体含量の相違が５％を超えるべきであることをも示す。 実験の部−クロマトグラフィー クロマトグラフィー評価 材料及び装置：上記例３によるＤＥＡＥ吸着剤。 蛋白質：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、等電点５．０；Ｓｉｇｍａ）、βラクト グロブリン（等電点５．２；Ｓｉｇｍａ）及びウマ心臓由来のミオグロビン（等 電点７．０；Ｓｉｇｍａ）。 バッファ：５０Ｍｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３）。 溶離液：１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）を含む１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を含む１Ｍ ＮａＣｌ及び １．０Ｍ ＮａＯＨ。 カラム：ＸＫ１６／２０。 ポンプ：２つの（２）Ｐ６０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）。 ホース：内径１．２ｍｍ。 バルブ：１つの（１）ＩＭＶ７及び４つの（４）ＩＭＶ８。 （全ての装置は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンの製品）。 ゲルの圧力／流れ特性の測定： 上記による脱水したＤＥＡＥ（２０ｇ）を１０ｍｌのバッファ（５０ｍＭトリ スバッファ、ｐＨ７．５）と混合し、カラム（ＸＫ１６／２０）に注いだ。ゲル が沈降し、密になった後、ゲルの高さは１２．７ｃｍであった。トリスバッファ （５０ｍＭトリスバッファ、ｐＨ７．５）を直線流速（３００ｃｍ／ｈ）でこの カラムに流した。系及びカラムの圧力を記録し、同様に系単独にかかる圧力も記 録した。合わせた系とカラムとの圧力から系単独にかかる圧力を減じることによ り、カラムの圧力を算出した。圧力を記録する際、ゲルが破壊され、圧力が急速 に消失するまで、流速を連続的に増加させた。 有効及び動的蛋白質容量の決定： 上記による脱水したＤＥＡＥ粒子（２０ｇ）をカラム（ＸＫ１６／２０）に注 いだ。このゲルを結合バッファで平衡にした後、ＢＳＡの溶液（２．０ｇ／ｍｌ ）をカラムにのせた（この実験は、４種類のバッファの各々で繰返した）。完全 漏出曲線をプロットした後、非結合蛋白質をカラムから洗い流した。結合蛋白質 を１Ｍ ＮａＣｌで溶離した。これらの実験は、 １５０及び１，５００ｃｍ／ｈの直線流速で行った。プレート数及び非対称係数 (asymmetry factor)を決定した。 ゲルの有効容量は、１Ｍ ＮａＣｌで溶出したＢＳＡの量をゲル容積で除する ことにより算出した。動的結合容量（ＤＢＣ）は、ＵＶ読取り値がそれぞれ１％ 及び５０％の蛋白質溶液を示す場合の、ゲルのミリリットル当たりの吸着蛋白質 の量として得られる。ゲル容積を漏出曲線から減じる。これは、蛋白質がカラム 内をさまようのに要する時間が動的容量の非常に大きな部分に相当するためであ る。 ゲルの分離能の決定： 上記による脱水したＤＥＡＥゲル（２０ｇ）を１２ｃｍの高さにカラムに充填 した。ゲルを結合バッファ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）で平衡にし た後、２種類の蛋白質を各々５０ｍｇずつ含有する蛋白質混合物１００ｍｌをの せた。非結合蛋白質をカラムから洗い流した後、結合蛋白質を、トリス溶液（１ ０ｍＭトリス）中０ないし１Ｍ ＮａＣｌのＮａＣｌ勾配で溶離した。これらの 実験においては、１００ｃｍ／ｈの直線流速を適用した。 蛋白質混合物は： １． 結合バッファ１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を含む、ＢＳＡ及びβ−ラ クトグロブリン。 ２． 結合バッファ１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を含む、ＢＳＡ及びミオグ ロビン。 ３． 結合バッファ１０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）を含む、ＭＳＡ及びミオグ ロビン。 であった。 プレート数及び非対称係数を決定した。 結果 ゲルの圧力及び流れ特性の決定： ゲルは、３，０００ｃｍ／ｈの直線流速で１ ０バールの対圧(counterpressure)を示した。ゲルは４，５００ｃｍ／ｈの流速 で破壊され、圧力が急速に消失した。 有効及び動的蛋白質容量の決定： カラム１メートル当たりのプレート数は９９ ０であり、一方、非対称係数は１．０５であった。異なるバッファ及び異なる流 速でＤＥＡＥ粒子の容量を決定した場合、以下の値が得られた。 １．バッファ： １０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 流速： １５０ｃｍ／ｈ 有効容量 ４．０ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ １％： ４．０ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ ５０％： ５．７ｍｇ／ｍｌ ２．バッファ： ２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 流速： １５０ｃｍ／ｈ 有効容量 ５．４ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ １％： ３．６ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ ５０％： ５．４ｍｇ／ｍｌ ３．バッファ： １０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 流速： １，５００ｃｍ／ｈ 有効容量 ８．３ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ １％： ４．４ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ ５０％： ８．０ｍｇ／ｍｌ ４．バッファ： ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 流速： １，５００ｃｍ／ｈ 有効容量 ４．６ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ １％： ２．９ｍｇ／ｍｌ ＤＢＣ ５０％： ５．６ｍｇ／ｍｌ ゲルの分離能の決定： ＢＳＡ及びβ−ラクトグロブリンの混合物を用いる実験 において、これらの蛋白質は同じトップ中に溶出した。ゲル上へのＢＳＡ及びミ オグロビンの最も効率的な吸着は、ｐＨ８．３のトリス溶液を用いた場合に達成 された。バッファに関わらず、蛋白質は互いに分離された。カラム１メーター当 たりのプレート数は７１０であり、非対称係数は１．１４であった。 結論 試験した本発明の粒子は少なくとも１５００ｃｍ／ｈまでの流速に依存しない 動的容量を有し、高速の動力学的耐性及び僅かな拡散耐性を示した。これは、例 えば早期段階におけるクロマトグラフィー（捕獲）に非常に有益である。 試験した本発明の粒子は、クロマトグラフィーマトリックス ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）では対処でき る程度の高流速に対処できなかった。試験した粒子は、異なる等電点を有する蛋 白質を分離することが可能であった。蛋白質容量は低かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 開始剤を用いて、エマルジョン中においてモノビニルモノマー及びジビニ ルモノマー及び／又はポリビニルモノマー（架橋剤）を重合することにより、開 放細孔を有する球状粒子が製造する方法であって、 ｉ．存在する水の全量が７５−９９％（ｗ／ｗ）、好ましくは９０−９９％で あるｗ／ｏ／ｗエマルジョンを調製する工程、および ｉｉ．その後、重合を開始し、重合工程の後、任意に篩分けした後に、反応混 合物から粒子を単離する工程を含み、 前記エマルジョン中には油中水型エマルジョンを含む液滴が乳化されており、 該液滴中の油相はビニルモノマーと逆エマルジョンを提供する乳化剤とを含み、 かつ該液滴は２，０００μｍ未満の直径を有する ことを特徴とする方法。 ２． 第１段階で約５−４５％、好ましくは１０−３０％（ｗ／ｗ）の油相を含 む、油中水型エマルジョン（ｗ／ｏエマルジョン）を調製し、かつ第２段階でｗ ／ｏ／ｗエマルジョンを形 成するために残りの水を添加することからなる２段階でｗ／ｏ／ｗエマルジョン を調製することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３． 単離された粒子が１０μｍ−２，０００μｍの範囲のサイズ（直径）を有 し、かつ粒子の細孔系が細孔によって相互に連結されている球状中空で形成され ており、 ａ．該球の直径が粒子の直径の＜１／９であり、かつ ｂ．連結細孔の直径が該球の直径の約１／１０−１／３であることを特徴とす る請求項１または２に記載の方法。 ４． 開始剤が、例えばアゾ型の、３０−９０℃の範囲の活性化温度を有するラ ジカル重合用熱開始剤であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項 に記載の方法。 ５． 乳化剤が、第１段階におけるエマルジョンの油相の＜３０％を構成するこ とを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の方法。 ６． ビニルモノマーを、ビニル基がエステル基もしくはカルボキシ基中のカル ボニル炭素又は芳香族環に直接結合している化合物、特に、モノアクリレートエ ステル類もしくはジアクリレートエステル類又は対応メタクリレートエステル類 、ビニル ベンゼンもしくはジビニルベンゼンから選択することを特徴とする請求項１ない し５のいずれか１項に記載の方法。 ７． 乳化剤が、（ａ）Ｃ_10-25カルボン酸と糖アルコールとのモノエステル又 はジエステル、及び（ｂ）親水性セグメント及び疎水性セグメントの両者を有す るブロック共重合体から選択される化合物を含むことを特徴とする請求項１ない し６のいずれか１項に記載の方法。 ８． ５０μｍ−２，０００μｍの範囲内の直径を有し、かつ ａ．粒子直径の＜１／９の直径の球状中空；及び ｂ．該球に対する及び粒子表面上の開口径が該球の直径の約１／１０−１／３ である連結細孔、 を有する細孔系を含む開放細孔を有する球状ポリマー粒子群。 ９． 前記ポリマーが、好ましくは、ビニル基がエステル基もしくはカルボキシ 基に含まれるカルボニル炭素又は芳香族環に直接結合している化合物、特に、モ ノアクリレートエステル類もしくはジアクリレートエステル類又は対応メタクリ レートエステル類、ビニルベンゼンもしくはジビニルベンゼンから選択されるビ ニルモノマーから選択されるモノマー単位で形成されることを特徴とする請求項 ８に記載の球状粒子群。 １０． 前記粒子群が請求項１ないし７のいずれか１項に従って製造されること を特徴とする請求項８ないし９のいずれか１項に記載の粒子群。 １１． 請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の粒子群の、液体クロマトグ ラフィーにおける支持体又は固相合成における支持体又は細胞培養担体としての 使用。