JPH04317740A - 液体クロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体クロマトグラフィー
用充填剤に関する。詳しくは、多孔質構造を有し、粒径
分布の標準偏差が小さく、小粒径であって、しかも、カ
ラム差圧が低く、また分離対象物質の不可逆的吸着が少
なく、分離段数の高い特定の方法で製造された液体クロ
マトグラフィー用充填剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリマー系液体クロマトグラフィー用充
填剤として従来知られているものの大部分は懸濁重合法
で製造されており、粒径分布が広い為に、カラム差圧が
高く、又、その製法では分離段数の高いものが得られな
いという欠点があった。粒径分布の狭い液体クロマトグ
ラフィー用充填剤としては、乳化重合で得られた粒径１
μｍ以下のラテックス粒子をシードポリマーとするシー
ド重合により体積で約１０００倍に肥大化させて得られ
た粒径約１０μｍの多孔質ポリスチレン粒子を母体とし
てその表面を親水化したものがある（Ｊ．Ｕｇｅｌｓｔ
ａｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、第３０３巻、第５号、９５頁
、１９８３年）。しかしながら、この充填剤は疎水性の
高いポリスチレン粒子を母体としている為、分離対象物
の蛋白質を不可逆的に吸着する欠点を有しており、また
、高流速で通液した際、分離段数が低下するという欠点
を有していた。

【０００３】また、特開昭６４−２６６１７号公報には
、分散重合で得られたポリマー粒子をシードポリマーと
してシード重合することにより、粒径分布の狭い液体ク
ロマトグラフィー用充填剤を製造できることが示されて
いる。しかし、この場合、例示されているアクリル系充
填剤は、シード重合時の架橋性モノマーの使用量が全モ
ノマー中９０％以上と高いので、機械的強度の点では優
れるものの該架橋性モノマーに由来する疎水性により、
分離対象物の蛋白質の一部を不可逆的に吸着するという
問題点を有していた。更に、官能基の導入される部分が
主にシードポリマー由来の部分であるために、官能基の
導入量を上げられないという問題点を有していた。

【０００４】一方、分離段数の高い液体クロマトグラフ
ィー用充填剤としては、非多孔質粒子の表面のみを使用
した充填剤がある（Ｙ．Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ、第３９８巻、３２７頁、１９８７年
）。この場合、分離対象物の細孔内部への拡散によるピ
ークのブロード化が抑えられる為、極めて良好な分離が
得られるが、粒子の表面しか使用しない為、試料負荷量
を上げた場合、極端に性能が低下するという欠点があっ
た。また、非多孔質である為、カラム差圧が高く、長尺
のカラムが製造できないという欠点や高流速で通液でき
ないといった欠点もあった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を改良し、分離対象物である生体高分子を回収率良く高
精度に分離でき、しかも試料負荷量が高く、カラム差圧
が低い液体クロマトグラフィー用充填剤の提供を目的と
する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、下記各
工程により得られる液体クロマトグラフィー用充填剤を
その要旨とする。 第１工程 グリシジルメタクリレート６０〜１００（重量）％、多
価アルコールと炭素−炭素２重結合を有するモノカルボ
ン酸とのポリエステル架橋性モノマー０〜１（重量）％
、グリシジルメタクリレート以外の炭素−炭素２重結合
を有するモノ不飽和化合物０〜４０（重量）％を含む混
合物を、該混合物を溶解するが生成するポリマーは溶解
しない溶媒の存在下に分散重合し、シードポリマーを製
造する。

【０００７】第２工程 第１工程において製造したシードポリマー及び該シード
ポリマーの２〜２０重量倍の重合性モノマーを、該重合
性モノマーの４０〜２００（重量）％の希釈剤の存在下
、シード重合してエポキシポリマーを製造する。但し、
該重合性モノマーは、多価アルコールと炭素−炭素２重
結合を有するモノカルボン酸とのポリエステル架橋性モ
ノマー１０〜５０（重量）％、グリシジルメタクリレー
ト５０〜９０（重量）％及びグリシジルメタクリレート
以外の炭素−炭素２重結合を有するモノ不飽和化合物０
〜４０（重合）％を含有する。

【０００８】第３工程 第２工程で得られたエポキシポリマーを有機溶媒で処理
し、可溶分を抽出除去する。 第４工程 第３工程において製造したエポキシポリマーに官能基を
導入する。以下本発明を詳細に説明する。

【０００９】本発明の第１工程および第２工程で用いる
架橋性モノマーは炭素−炭素２重結合を２個以上有する
モノマーであり、該架橋性モノマーとしては、多価アル
コールと炭素−炭素２重結合を有するモノカルボン酸と
のポリエステルを使用する。該多価アルコールとしては
、テトラメチロールメタン、テトラメチロールエタン、
トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ジペ
ンタエリスリトール、グリセリン、エチレングリコール
、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポ
リプロピレングリコール等を挙げることができ、これら
の多価アルコールと炭素−炭素２重結合を有するモノカ
ルボン酸のポリエステルである架橋性モノマーの一例と
して、エチレングリコールジアクリレート（又はジメタ
クリレート）、ジエチレングリコールジアクリレート（
又はジメタクリレート）、グリセリンジアクリレート（
又はジメタクリレート）、グリセリントリアクリレート
（又はトリメタクリレート）、トリメチロールプロパン
トリアクリレート（又はトリメタクリレート）、ペンタ
エリスリトールテトラアクリレート（又はメタクリレー
ト）等のアクリル系架橋性モノマーを挙げることができ
る。これらのポリエステル架橋性モノマーは単独で用い
ても混合して用いても良く、更に他の架橋性モノマーを
併用することも出来る。これらの多価アルコールとカル
ボン酸とのポリエステルである架橋性モノマーは使用す
る全架橋性モノマー中７０重量％以上含まれているのが
好ましい。ここで第２工程のシード重合の際架橋性モノ
マーの種類、量、及び希釈剤を適宜組み合わせることに
よりシード重合して得られるエポキシポリマーの多孔度
物性（細孔容積、細孔半径、表面積等）を変化させるこ
とができる。また、上記以外の併用しうる架橋性モノマ
ーとしては、ジビニルベンゼン等のポリビニル化合物を
挙げることが出来、これらは架橋性モノマー成分のうち
３０重量％以下となるように添加する。また、第１工程
と第２工程で用いられる架橋性モノマーは必ずしも同一
である必要はない。

【００１０】本発明においてグリシジルメタクリレート
以外の炭素−炭素２重結合を有するモノ不飽和化合物を
用いることにより、エポキシポリマーの多孔度物性や疎
水性を微妙に変化させ、クロマトグラフィーにおける保
持挙動を調節することができるのでより好ましい。グリ
シジルメタクリレート以外の炭素−炭素２重結合を有す
るモノ不飽和化合物は、親水性のモノマーから疎水性の
モノマーまで種々用いることができ、一例として、グリ
シジルアクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト（又はメタクリレート）、グリセリンモノアクリレー
ト（又はメタクリレート）、メチルアクリレート（又は
メタクリレート）、２−エチルヘキシルアクリレート（
又はメタクリレート）等のアクリル系モノマー、クロロ
メチルスチレン、ビニルベンジルグリシジルエーテル等
の芳香族ビニルモノマー等が挙げられる。また、モノ不
飽和化合物は陽イオン交換基や陰イオン交換基等の各種
官能基を有していても良い。更に、これら例示されたモ
ノマーを単独で用いても、混合しても良く、第１工程と
第２工程で用いられるグリシジルメタクリレート以外の
炭素−炭素２重結合を有するモノ不飽和化合物は必ずし
も同一である必要はない。

【００１１】次に本発明の液体クロマトグラフィー用充
填剤を製造する方法について説明する。液体クロマトグ
ラフィー用充填剤は、第１工程において、分散重合によ
りシードポリマーを製造し、第２工程において、第１工
程で製造したシードポリマーに、架橋性モノマーを含む
重合性モノマーを含浸後、重合（シード重合）させるこ
とにより肥大化させ、第３工程により、第２工程で製造
した肥大化ポリマー（エポキシポリマー）を有機溶媒に
より処理し、主としてシードポリマー由来の線状可溶分
を抽出除去し、次いで第４工程により、有機溶媒処理し
たエポキシポリマーに官能基を導入する各工程により製
造される。

【００１２】第１工程では、グリシジルメタクリレート
を主成分とするモノマーを分散重合することによりシー
ドポリマーを製造するが、所望の粒径を有するポリマー
粒子を得るためには用いる溶媒を選択する必要がある。 即ち、用いる溶媒としてはモノマーは溶解するが生成す
るポリマーは溶解しない溶媒（生成するポリマーに対し
ては貧溶媒）を用いる。このような溶媒は、水と相溶性
があり、具体的にはメタノール、エタノール、２−プロ
パノール、２−メチル−２−プロパノール等のアルコー
ル類、２−メトキシ−エタノール等のエーテル−アルコ
ール類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル
類、これら各種溶媒の混合物、更にこれらの各種溶媒と
水との混合物等を挙げることができる。

【００１３】また、これらの溶媒のうち、生成するポリ
マーに対する貧溶媒としての性質が強い程、即ち該溶媒
の溶解度パラメーターと生成するポリマーの溶解度パラ
メーターの差が大きくなる程ポリマーの粒径が小さくな
る傾向がある。更に、上記のような貧溶媒を主体とする
溶媒中にシクロヘキサン等の良溶媒を少量添加すること
によってポリマーの粒径が大きくなる傾向にある。この
ような溶媒の種々の性質を利用して、所望の粒径が得ら
れるように溶媒を適宜選択し、これらを単独あるいは混
合して媒体として使用する。

【００１４】一方、生成するポリマーの粒径に影響を与
える他の要因としては、仕込みのモノマー濃度が挙げら
れる。この濃度が高いと粒径は大きくなり、濃度が低い
と粒径は小さくなる傾向がある。シードポリマーを製造
するための分散重合の際、生成するポリマーの凝集、変
形、融着を防ぎ、その分散安定性を増すために分散安定
剤を用いることが好ましい。分散安定剤としてはこの種
の重合反応に用いられている各種ホモポリマー、コポリ
マー、グラフトポリマー、ブロックポリマー等の合成高
分子化合物、更に天然高分子化合物およびその誘導体等
を用いることができる。具体的にはポリビニルピロリド
ン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンイミン、
ポリアクリル酸、ビニルアルコール−酢酸ビニルコポリ
マー、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロー
ス等を挙げることができるが、特に用いる反応媒体に対
して溶解するものが好ましい。

【００１５】更に分散重合に際して、より重合を安定に
進行させ、分散安定性を高めるために、上記分散安定剤
に加えて補助安定剤を用いることもできる。このような
補助安定剤としてはアニオン性界面活性剤、ノニオン性
界面活性剤、４級アンモニウム塩、長鎖アルコール等が
用いられる。具体的にはジ（２−エチルヘキシル）スル
ホコハク酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシ
エタノール、メチルトリカプリリルアンモニウムクロリ
ド、セチルアルコール等を挙げることができる。

【００１６】本発明の第２工程においては、第１工程で
得られたシードポリマーに重合性モノマーを含浸させシ
ード重合することにより肥大化するが、その際、希釈剤
を存在させることが必要である。希釈剤は重合性モノマ
ーを溶解するとともにシードポリマーに対する親和性が
高いものが好ましく、具体的には、エチレンジクロライ
ド、プロピレンジクロライド等のハロゲン化炭化水素が
挙げられ、特にエチレンジクロライドが好適である。ま
た、シード重合時に相分離剤として作用し、粒子の多孔
質化を促進する有機溶媒である脂肪族あるいは芳香族の
炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類等も使
用することが出来る。このような有機溶媒としては、例
えばトルエン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジメチ
ル、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、シクロヘキ
サノール等か挙げられる。これらの希釈剤は単独、もし
くは混合して用いることができる。

【００１７】シードポリマーに含浸させる重合性モノマ
ーは、該重合性モノマー中、多価アルコールと炭素−炭
素２重結合を有するモノカルボン酸とのポリエステル架
橋性モノマー１０〜５０重量％、グリシジルメタクリレ
ート５０〜９０重量％、及びグリシジルメタクリレート
以外の炭素−炭素２重結合を有するモノ不飽和化合物０
〜４０重量％含有するものである。含浸させる重合性モ
ノマーの量はシードポリマーに対して２〜２０重量倍、
好ましくは４〜２０重量倍、更に好ましくは５〜１５重
量倍である。また希釈剤の量は重合性モノマーに対し４
０〜２００重量％、好ましくは５０〜１５０重量％であ
る。

【００１８】重合性モノマー及び希釈剤の分散液の調製
においては、分散性を高めるために分散安定剤を用いる
ことが好ましい。このような分散安定剤としては公知の
ものを用いることができるが、重合性モノマーを微分散
安定化するのがよく、具体的にはドデシルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ジアルキ
ルスルホコハク酸ナトリウム等のアニオン系界面活性剤
を挙げることができ、更にポリエチレングリコールモノ
ステアレート、ソルビタンモノステアレート等の非イオ
ン系界面活性剤、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン
イミン、ビニルアルコール−酢酸ビニルコポリマー等の
合成高分子を併用することができる。

【００１９】また、シード重合に用いることができる重
合開始剤としては、２，２′−アゾビスイソブチロニト
リル、４，４′−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、
２，２′−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）、
２，２′−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）等のアゾ系重合開始剤、又は過酸化ベンゾイル、ラ
ウロイルパーオキシド、オクタノイルパーオキシド、３
，３′，５−トリメチルヘキサノイルパーオキシド等の
過酸化物を挙げることができる。

【００２０】本発明においてはシード重合の際、重合開
始剤及び重合性モノマーを吸収して肥大化したシードポ
リマーが凝集、変形、融着することを防止し、その分散
安定性を増すために、重合性モノマーを含浸後、重合を
始める前に再度、分散安定剤を添加することが好ましい
。このような分散安定剤としては公知のアニオン系、ノ
ニオン系の界面活性剤、及びポリビニルピロリドン、ポ
リエチレンイミン、ビニルアルコール−酢酸ビニルコポ
リマー等の合成高分子が使用できる。

【００２１】本発明のシード重合における重合温度とし
ては通常４０℃〜９０℃、好ましくは５０℃〜８０℃で
ある。第２工程で得られる肥大化ポリマー（エポキシポ
リマー）の好ましい粒径範囲は１．５μｍ〜２０μｍで
あり、さらに好ましくは２μｍ〜１５μｍである。また
、９０％以上の粒子が平均粒径±１μｍの範囲にあるこ
とが好ましい。シード重合の際適当な希釈剤を重合性モ
ノマー相に存在させることにより多孔性のエポキシポリ
マー粒子を得る。多孔性にすることによって表面積が増
え、導入できる官能基量が増加するので、充填剤として
使用する際、試料負荷量を上げることができる。本発明
充填剤の製造法によれば、シードポリマー由来のポリマ
ー成分がシード重合の際、相分離剤として作用する為に
希釈剤の効果以上に多孔質構造が発達する。本発明充填
剤は、その発達した多孔質構造の為に溶離液の粒子内へ
拡散性が良く、高流速の通液に耐えうるものである。 また同様の理由により架橋性モノマーの使用量を１０〜
５０重量％と低くできる為に、架橋性モノマー単位に由
来する母体樹脂の疎水性を低くすることができ、分離対
象物質の不可逆的吸着をも抑えることができるのである
。

【００２２】第３工程により、第２工程で得られたエポ
キシポリマーを有機溶媒で処理することにより、主とし
てシードポリマー由来の線状可溶分を抽出除去する。抽
出に用いられる有機溶媒はシードポリマー中の線状可溶
分を溶解するものであればどのようなものでも良いが、
アセトン等のケトン系有機溶媒や１，２−ジクロロエタ
ン等のハロゲン化炭化水素系有機溶媒が好適に用いられ
る。抽出操作にはソックスレー抽出器を用いる方法や還
流管を付けたフラスコを用いるバッチ法等が挙げられる
。この操作で抽出される線状可溶分の量は、分散重合時
に使用する架橋性モノマーの量やその重合条件に依存す
るが、一般に、抽出した液を貧溶媒と混合することによ
りシードポリマーの２５〜７５重量％に相当する、平均
分子量が１０万〜１００万の線状可溶分が回収される。

【００２３】次いで、第４工程により第３工程で得られ
たエポキシポリマーに官能基を導入する。その導入方法
としては、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基
を、水、エチレングリコール、ポリエチレングリコール
、グリセリン、アミノ糖等により開還変性し、生成した
水酸基に直接あるいはスペーサーを介して官能基を結合
させる方法、あるいは該エポキシ基を開還変性せず、直
接あるいはスペーサーを介して官能基を結合させる方法
等を挙げることができる。導入する官能基としてはイオ
ン交換基、疎水性基、アフィニティリガンド等が挙げら
れ、用いられるクロマトグラフィーの様式に応じて選択
できる。具体的にはカルボキシル基やスルホプロピル基
等の陽イオン交換基、１級から４級のアミノ基等の陰イ
オン交換基、脂肪族または芳香族アルキル基等の疎水性
基、色素、レクチン、酵素、阻害剤、抗体、ペプチド、
ＤＮＡ等の各種アフィニティリガンド等が挙げられる。 官能基の導入量は樹脂の滴定や元素分析、あるいは導入
前後の重量変化等により推定できる。また、その好適な
導入量は目的に応じて適宜選択される。

【００２４】

【作用】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、
特定の製造方法により製造することにより、シードポリ
マーの粒径均一性をシード重合後の肥大化ポリマーに反
映させた担体である。また、シードポリマー由来の線状
ポリマー成分がシード重合の際、相分離剤として作用す
る為に希釈剤の添加効果以上に多孔質構造が発達したも
のである。従って、本発明の液体クロマトグラフィー用
充填剤は粒径の均一性と発達した多孔質構造の効果によ
り、従来の同じ平均粒径の担体を用いた場合よりもカラ
ム差圧が低く、高速で溶離液を流すことができ、分離パ
ターンもシャープで理論段数も高い。また、架橋性モノ
マーの使用量を少なくすることができる為に、架橋性モ
ノマー単位に由来する樹脂母体の疎水性を低くすること
ができ、分離対象物質の不可逆的吸着を抑えることがで
きる。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【００２６】実施例１ （１）エポキシポリマーの製造 ポリビニルピロリドン（商品名Ｋ−３０：東京化成株式
会社製、平均分子量４０，０００）２．２６ｇ、グリシ
ジルメタクリレート２１．９５ｇをエタノール８５．５
２ｇ中に溶解させ、窒素ガスで溶存酸素を置換後７０℃
に昇温した。この溶液に、２０重量％の２，２′−アゾ
ビスイソブチロニトリルを溶解したアセトン溶液１．１
０ｇを添加した。約２０秒後にポリマー粒子の析出が始
まり、５分後には反応系全体が白濁した。更に６時間、
７０℃で反応させ分散重合を続けた。放冷後、ポリマー
粒子を単離し、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム水溶
液で洗浄した。この操作におけるポリマー粒子の回収量
は１８ｇであった。この粒子を電子顕微鏡で観察したと
ころ、粒径が１．６〜１．９μｍの極めて粒径分布の狭
い球状粒子であることが確認された。この球状粒子をシ
ードポリマーとして以下の操作を行った。

【００２７】まず２，２′−アゾビスイソブチロニトリ
ル０．７６ｇ、エチレングリコールジメタクリレート２
２．７ｇ、グリシジルメタクリレート５２．９ｇ、１，
２−ジクロロエタン３７．８ｇ、トルエン３７．８ｇ、
ドデシル硫酸ナトリウム１．２７ｇ、及び水５４４ｇを
混合し、大部分の油滴の粒径が、０．１〜３μｍの範囲
となるように微分散し乳化液を調製した。次いで、この
乳化液を先の分散重合て得られたシードポリマー６．２
ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．６ｇ及び水６０ｇから
成る水性分散液に、室温にて３回に分けて添加し、その
ままの温度で１３時間ゆっくり攪拌しながら油滴をシー
ドポリマーに吸収させた。次いで、これに１％ポリビニ
ルアルコール水溶液５６７ｇを加え、７０℃で８時間シ
ード重合を行った。放冷後、遠心分離してポリマー粒子
を単離し、水及びメタノールで洗浄した。単離したポリ
マー粒子に１０重量倍のアセトンを加え、７０℃で１０
分間加熱処理することによりシードポリマー由来の線状
可溶分を抽出除去した。この抽出除去操作を３回繰り返
した後、ろ過し、乾燥した。抽出液は回収し、１／１０
量まで濃縮した後、２０倍量の水に添加することにより
シードポリマー由来の線状可溶分を沈澱として回収した
。得られた沈澱を濾過し乾燥したところ１．９ｇであり
、シードポリマーの少なくとも３１％が抽出除去された
ことを確認した。沈澱として回収した線状可溶分を１，
２−ジクロロエタンに溶解し、ＧＰＣにより分子量を測
定したところ重量平均分子量が２４万であった。一方、
乾燥後のポリマー粒子の収率はシード重合の仕込み原料
に対し、約７０％であった。この重合で得られたポリマ
ー粒子は、走査電子顕微鏡により観察したところ、平均
粒径４．０μｍの多孔性粒子であり、９０％以上の粒子
が平均粒径±１μｍ以内にあることが確認された。 また、ポロシメーターによりその多孔度を測定したとこ
ろ、細孔容積が０．３５ｍｌ／ｇ、細孔半径が５５０Å
であり、また窒素吸着法により測定した表面積は１１．
４ｍ２　／ｇであった。

【００２８】（２）官能基の導入 前記（１）で得られたエポキシポリマー５０ｇを１０％
Ｈ２　ＳＯ４　水溶液５３５ｇ中、５０℃の温度下で５
時間加熱することにより加水分解を行ない、エポキシ環
の開環反応を行なった。反応終了後、ポリマーをろ別し
、脱塩水にて十分に洗浄し、乾燥した。こうして得られ
た水酸基を有するポリマー５０ｇに５Ｎ−ＮａＯＨ水溶
液２００ｍｌを加え含浸させた。次いで、ジエチルアミ
ノエチルクロライドの５０重量％水溶液３００ｇを添加
し、５０℃にて６時間反応させ、ジエチルアミノエチル
基を導入した。反応終了後、ポリマーをろ別し、脱塩水
、１Ｎ−ＨＣｌ水溶液、脱塩水の順で洗浄した。得られ
た樹脂の陰イオン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり０．３
２ミリ当量であった。

【００２９】（３）分離性能評価 （２）で得られたジエチルアミノエチル基を有する樹脂
２．０ｇ（湿潤状態）を定圧ポンプにて内径４．６ｍｍ
、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、得られ
た充填カラムを島津社製高速液体クロマトグラフＬＣ−
６Ａシステムに接続して分離性能評価を行なった。試料
としてはミオグロビン、オバルブミン、トリプシンイン
ヒビターの混合液を用いた。その測定条件は以下に示す
通りである。

【００３０】流速：１．４ｍｌ／分 溶離：下記ＡからＢへ、１０分直線グラジエントＡ：２
０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン・塩酸塩緩
衝液（ｐＨ８．０） Ｂ：Ａ＋０．５Ｍ塩化ナトリウム 検出：ＵＶ２８０ｎｍ 温度：２５℃ サンプル注入量：５μｌ サンプル濃度： ミオグロビン：２．５μｇ／５μｌ オバルブミン：５μｇ／５μｌ トリプシンインヒビター：５μｇ／５μｌ

【００３１】
得られたクロマトグラムを図１に示した。 このクロマトグラムからオバルブミンとトリプシンイン
ヒビターの分離度は９．８と計算され、非常に良好な分
離が得られていることがわかる。また、この測定条件に
おける通液時の圧力は、４０ｋｇ／ｃｍ２　であり、従
来の懸濁重合法で製造した同様の粒径を有するものに比
べ、はるかに低いものであった。また、サンプル回収率
も８９％であり、極めて低いサンプル負荷量にも拘わら
ず良好な結果を与えた。

【００３２】実施例２ ポリビニルピロリドン（商品名Ｋ−３０：東京化成株式
会社製、平均分子量４０，０００）２．２６ｇをエタノ
ール８５．５２ｇ中に溶解させ、窒素ガスで溶存酸素を
置換後７０℃に昇温した。この溶液にグリシジルメタク
リレート２６．３３ｇ、メチルメタクリレート２．９３
ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル０．１４６
ｇの溶液を添加した。約３分後にポリマー粒子の析出が
始まり、５分後には反応系全体が白濁した。更に６時間
、７０℃で反応させ分散重合を続けた。放冷後、ポリマ
ー粒子を単離し、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム水
溶液で洗浄した。この粒子を電子顕微鏡で観察したとこ
ろ、粒系が２．０〜２．５μｍの極めて粒系分布の狭い
球状粒子であることが確認された。これをシードポリマ
ーとして以下の操作を行なった。

【００３３】まず２，２′−アゾビスイソブチロニトリ
ル１．０１ｇ、エチレングリコールジメタクリレート２
７．３ｇ、グリセリンジメタクリレート３．０ｇ、グリ
シジルメタクリレート７０．５ｇ、１，２−ジクロロエ
タン５０．４ｇ、トルエン３０．２ｇ、ドデシル硫酸ナ
トリウム１．６９ｇ、及び水７２５ｇを混合し、大部分
の油滴の粒径が、０．１〜３μｍの範囲となるように微
分散して乳化液を調製した。次いで、この乳化液を先の
分散重合で得られたシードポリマー８．２ｇ、ドデシル
硫酸ナトリウム０．８ｇ及び水８０ｇから成る水性分散
液に、室温にて３回に分けて添加し、そのままの温度で
１３時間ゆっくり攪拌しながら油滴をシードポリマーに
吸収させた。次いで、これに１％ポリビニルアルコール
水溶液７５６ｇを加え、７０℃で８時間シード重合を行
った。放冷後、遠心分離して単離し、水及びメタノール
で洗浄した。単離したポリマー粒子には１０重量倍のア
セトンを加え、７０℃で１０分間加熱処理することによ
りシードポリマー由来の線状可溶分を抽出除去した。こ
の抽出除去操作を３回繰り返した後ろ過し、乾燥した。 抽出液は回収し、１／１０量まで濃縮した後、２０倍量
の水に添加することによりシードポリマー由来の線状可
溶分を沈澱として回収した。得られた沈澱をろ過し乾燥
したところ４．９ｇであり、シードポリマーの少なくと
も６０％が抽出除去されたことを確認した。沈澱として
回収した線状可溶分を１，２−ジクロロエタンに溶解し
、ＧＰＣにより分子量を測定したところ重量平均分子量
が１２万であった。乾燥後のエポキシポリマー粒子の収
率はシード重合の仕込み原料に対し、７５％であった。 この重合で得られたポリマー粒子は、走査電子顕微鏡に
より観察したところ、平均粒径６．５μｍの多孔性粒子
であり、９０％以上の粒子が平均粒径±１μｍ以内にあ
ることが確認された。

【００３４】得られたエポキシポリマーを用い、実施例
１と全く同様の方法によりジエチルアミノエチル基を導
入した。得られた樹脂の陰イオン交換容量は乾燥重量１
ｇ当たり０．４１ミリ当量であった。この樹脂を実施例
１と全く同様にして分離性能の評価を行なったところ、
実施例１と同様のクロマトパターンが得られ、オバルブ
ミンとトリプシンインヒビターの分離度が７．５と良好
な分離が得られた。また、サンプル回収率も９０％と良
好であった。

【００３５】実施例３ ポリビニルピロリドン（商品名Ｋ−３０：東京化成株式
会社製、平均分子量４０，０００）２．２６ｇ、グリシ
ジルメタクリレート３７．６ｇをエタノール８５．５２
ｇ中に溶解させ、窒素ガスで溶存酸素を置換後７０℃に
昇温した。この溶液に２０重量％の２，２′−アゾビス
イソブチロニトリルを溶解したアセトン溶液１．８８ｇ
を添加した。約２５秒後にポリマー粒子の析出が始まり
、５分後には反応系全体が白濁した。更に６時間、７０
℃で反応させた分散重合を続けた。放冷後、ポリマー粒
子を単離し、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液
で洗浄した。この操作におけるポリマー粒子の回収量は
２９ｇであった。この粒子を電子顕微鏡で観察したとこ
ろ、粒径が２．６〜３．０μｍの極めて粒径分布の狭い
球状粒子であることが確認された。このポリマー粒子を
シードポリマーとして以下の操作を行った。

【００３６】まず２，２′−アゾビスイソブチロニトリ
ル１．０１ｇ、エチレングリコールジメタクリレート２
０．１ｇ、グリシジルメタクリレート８０．６ｇ、１，
２−ジクロロエタン４０．３ｇ、トルエン４０．３ｇ、
ドデシル硫酸ナトリウム１．６９ｇ、及び水７２５ｇを
混合し、大部分の油滴の粒径が、０．１〜３μｍの範囲
となるように微分散し、乳化液を調製した。次いで、こ
の乳化液を、先の分散重合で得られたシードポリマー８
．２ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．８ｇ及び水８０ｇ
から成る水性分散液に、室温にて３回に分けて添加し、
そのままの温度で１３時間ゆっくり攪拌しながら油滴を
シードポリマーに吸収させた。次いで、これに１％ポリ
ビニルアルコール水溶液７５６ｇを加え、７０℃で８時
間シード重合を行った。放冷後、遠心分離してポリマー
粒子を単離し、水及びメタノールで洗浄した。単離した
ポリマー粒子に１０重量倍のアセトンを加え、７０℃で
１０分間加熱することによりシードポリマー由来の線状
可溶分を抽出除去した。この抽出除去操作を３回繰り返
した後、ろ過し、乾燥した。抽出液は回収し、１／１０
量まで濃縮した後、２０倍量の水に添加することにより
シードポリマー由来の線状可溶分を沈澱として回収した
。得られた沈澱を濾過し乾燥したところ２．９ｇであり
、シードポリマーの少なくとも３５％が抽出除去された
ことを確認した。沈澱として回収した線状可溶分を１，
２−ジクロロエタンに溶解し、ＧＰＣにより分子量を測
定したところ重量平均分子量が３２万であった。乾燥後
のエポキシポリマー粒子の収率はシード重合の仕込み原
料に対し、６８％であった。この重合で得られたポリマ
ー粒子は、走査電子顕微鏡により観察したところ、平均
粒径７．５μｍの多孔質粒子であり、９０％以上の粒子
が平均粒径±１μｍ以内にあることが確認された。

【００３７】得られたエポキシポリマーを用い、実施例
１と全く同様にしてエポキシ環の開環反応を行なった。 次いで、プロパンスルトンと反応させることにより強酸
性陽イオン交換基であるスルホプロピル基を導入した。 得られた樹脂の陽イオン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり
０．４７ミリ当量であった。この樹脂を実施例１と同様
にして内径７．５ｍｍ、長さ７５ｍｍのステンレス製カ
ラムに充填し、分離性能の評価を行なった。試料として
はリボヌクレアーゼ、Ａ、チトクロームＣ、リゾチーム
の混合液を用いた。その測定条件は以下に示す通りであ
る。

【００３８】流速：１．０ｍｌ／分 溶離：下記ＡからＢへ、２０分直線グラジエントＡ：２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）Ｂ：Ａ＋０．５Ｍ塩
化ナトリウム 検出：ＵＶ２８０ｎｍ 温度：２５℃ サンプル注入量：５μｌ サンプル濃度： リボヌクレアーゼ　　Ａ：６５μｇ／５μｌチトクロー
ムＣ：４５μｇ／５μｌ リゾチーム：３０μｇ／５μｌ 得られたクロマトグラムを図２に示したが、良好な分離
が得られていることがわかる。

【００３９】実施例４ ポリビニルピロリドン（商品名Ｋ−３０：東京化成株式
会社製、平均分子量４０，０００）２．２６ｇ、グリシ
ジルメタクリレート２９．２６ｇをエタノール８５．５
２ｇ中に溶解させ、窒素ガスで溶存酸素を置換後７０℃
に昇温した。この溶液に２０重量％の２，２′−アゾビ
スイソブチロニトリルを溶解したアセトン溶液１．４６
ｇを添加した。約２０秒後にポリマー粒子の析出が始ま
り、５分後には反応系全体が白濁した。更に６時間、７
０℃で反応させ分散重合を続けた。放冷後、ポリマー粒
子を単離し、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液
で洗浄した。この操作におけるポリマー粒子の回収量は
２３ｇであった。この粒子を電子顕微鏡で観察したとこ
ろ、粒径が１．８〜２．２μｍの極めて粒径分布の狭い
球状粒子であることが確認された。この球状粒子をシー
ドポリマーとして以下の操作を行った。

【００４０】まず２，２′−アゾビスイソブチロニトリ
ル１．０１ｇ、エチレングリコールジメタクリレート３
０．３ｇ、グリシジルメタクリレート７０．５ｇ、１，
２−ジクロロエタン８０．６ｇ、ドデシル硫酸ナトリウ
ム１．６９ｇ、及び水７２５ｇを混合し、大部分の油滴
の粒径が、０．１〜３μｍの範囲となるように微分散し
、乳化液を調製した。次いで、この乳化液を先の分散重
合で得られたシードポリマー８．２ｇ、ドデシル硫酸ナ
トリウム０．８ｇ及び水８０ｇから成る水性分散液に、
室温にて３回に分けて添加し、そのままの温度で１３時
間ゆっくり攪拌しながら油滴をシードポリマーに吸収さ
せた。次いで、これに１％ポリビニルアルコール水溶液
７５６ｇを加え、７０℃で８時間シード重合を行った。 放冷後、遠心分離してポリマー粒子を単離し、水及びメ
タノールで洗浄した。単離したポリマー粒子に１０重量
倍のアセトンを加え、７０℃で１０分間加熱処理するこ
とにより、シードポリマー由来の線状可溶分を抽出除去
した。この抽出除去操作を３回繰り返した後ろ過し、乾
燥した。抽出後は回収し、１／１０量まで濃縮した後、
２０倍量の水に添加することによりシードポリマー由来
の線状可溶分を沈澱として回収した。得られた沈澱を濾
過し乾燥したところ３．０ｇであり、シードポリマーの
少なくとも３７％が抽出除去されたことを確認した。沈
澱として回収した線状可溶分を１，２−ジクロロエタン
に溶解し、ＧＰＣにより分子量を測定したところ重量平
均分子量が２８万であった。乾燥後のエポキシポリマー
粒子の収率はシード重合の仕込み原料に対し、７５％で
あった。この重合で得られたポリマー粒子は、走査電子
顕微鏡により観察したところ、平均粒径５．８μｍの多
孔性粒子であり、９０％以上の粒子が平均粒径±１μｍ
以内にあることが確認された。得られたエポキシポリマ
ーを用い、実施例１と全く同様にしてエポキシ環の開環
反応を行なった。次いで水酸化ナトリウム水溶液存在下
、モノクロロ酢酸と反応させ、弱酸性陽イオン交換基で
あるカルボキシメチル基を導入した。得られた樹脂の陽
イオン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり０．３６ミリ当量
であった。この樹脂を実施例３と全く同様にして評価し
た。そのクロマトグラフムを図３に示したが良好な分離
が得られていることがわかる。

【００４１】実施例５ 実施例３と全く同様にしてシードポリマーを製造し、更
に以下の操作を行ってエポキシポリマーを製造した。ま
ず２，２′−アゾビスイソブチロニトリル０．５１ｇ、
エチレングリコールジメタクリレート１５．２ｇ、グリ
シジルメタクリレート３５．３ｇ、１，２−ジクロロエ
タン５０．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．８５ｇ及
び水３６３ｇを混合し、大部分の油滴の粒径が、０．１
〜３μｍの範囲となるように微分散し、乳化液を調製し
た。次いで、この乳化液を、先の分散重合で得られたシ
ードポリマー４．１ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．４
ｇ及び水４０ｇから成る水性分散液に、室温にて３回に
分けて添加し、そのままの温度で１３時間ゆっくり攪拌
しながら油滴をシードポリマーに吸収させた。次いで、
これに１％ポリビニルアルコール水溶液３７８ｇを加え
、７０℃で８時間シード重合を行った。放冷後、遠心分
離してポリマー粒子を単離し、水及びメタノールで洗浄
した。単離したポリマー粒子に１０重量倍のアセトンを
加え、７０℃で１０分間加熱処理することにより、シー
ドポリマー由来の線状可溶分を抽出除去した。この抽出
除去操作を３回繰り返した後ろ過し、乾燥した。抽出液
は回収し、１／１０量まで濃縮した後、２０倍量の水に
添加することによりシードポリマー由来の線状可溶分を
沈澱として回収した。得られた沈澱をろ過し乾燥したと
ころ２．１ｇであり、シードポリマーの少なくとも５１
％が抽出除去されたことを確認した。沈澱として回収し
た線状可溶分を１，２−ジクロロエタンに溶解し、ＧＰ
Ｃにより分子量を測定したところ重量平均分子量が２５
万であった。乾燥後のエポキシポリマー粒子の収率はシ
ード重合の仕込み原料に対し、約６５％であった。この
重合で得られたポリマー粒子は、走査電子顕微鏡により
観察したところ、平均粒径５．６μｍの多孔性粒子であ
り、９０％以上の粒子が平均粒径±１μｍ以内にあるこ
とが確認された。得られた原料エポキシポリマーを用い
、実施例１と全く同様にしてエポキシ環の開環反応を行
なった後、エピクロロヒドリンを反応させ、更にトリメ
チルアミンを反応させ、強塩基性陰イオン交換基である
４級アンモニウム基を導入した。得られた樹脂の陽イオ
ン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり０．６２ミリ当量であ
った。この樹脂を実施例１と同様にして内径７．５ｍｍ
、長さ７５ｍｍのステンレス製カラムに充填し、分離性
能の評価を行なった。試料としてはミオグロビン、オバ
ルブミン、トリプシンインヒビターの混合液を用いた。 その測定条件は以下に示す通りである。

【００４２】流速：１．０ｍｌ／分 溶離：下記ＡからＢへ、２０分直線グラジエントＡ：２
０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン・塩酸緩衝
液（ｐＨ７．９） Ｂ：Ａ＋０．５Ｍ塩化ナトリウム 検出：ＵＶ２８０ｎｍ 温度：２５℃ サンプル注入量：１０μｌ サンプル濃度： ミオグロビン：３０μｇ／１０μｌ オバルブミン：１６０μｇ／１０μｌ トリプシンインヒビター：１００μｇ／１０μｌそのク
ロマトグラムを図４に示したが良好な分離が得られてい
ることがわかる。

【００４３】実施例６ （１）エポキシポリマーの製造 ポリビニルピロリドン（商品名Ｋ−３０：東京化成株式
会社製、平均分子量４０，０００）２．２６ｇ、グリシ
ジルメタクリレート２０．８２ｇ、２−ヒドロキシエチ
ルメタクリレート１．０９ｇ、ジエチレングリコールジ
メタクリレート０．０４３９ｇをエタノール８５．５２
ｇ中に溶解させ、窒素ガスで溶存酸素を置換後７０℃に
昇温した。この溶液に２０重量％の２，２′−アゾビス
イソブチロニトリルを溶解したアセトン溶液０．６６ｇ
を添加した。約２０秒後にポリマー粒子の析出が始まり
、４分後には反応系全体が白濁した。更に６時間、７０
℃で反応させ分散重合を続けた。放冷後、ポリマー粒子
を単離し、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で
洗浄した。この操作におけるポリマー粒子の回収量は２
０ｇであった。この粒子を電子顕微鏡で観察したところ
、粒径が１．５〜１．８μｍの極めて粒径分布の狭い球
状粒子であることが確認された。このポリマー粒子をシ
ードポリマーとして以下の操作を行った。

【００４４】まず２，２′−アゾビスイソブチロニトリ
ル１．０１ｇ、エチレングリコールジメタクリレート３
５．４ｇ、ジビニルベンゼン（純度５５％）５．０ｇ、
グリシジルメタクリレート５０．５ｇ、メチルメタクリ
レート１０．１ｇ、１，２−ジクロロエタン８０．７ｇ
、ドデシル硫酸ナトリウム０．８５ｇ及び水３６３ｇを
混合し、大部分の油滴の粒径が、０．１〜３μｍの範囲
となるように微分散し、乳化液を調製した。次いで、こ
の乳化液を先の分散重合で得られたシードポリマー８．
２ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．８ｇ及び水８０ｇか
ら成る水性分散液に、室温にて３回に分けて添加し、そ
のままの温度で１３時間ゆっくり攪拌しながら油滴をシ
ードポリマーに吸収させた。次いで、これに１％ポリビ
ニルアルコール水溶液７５６ｇを加え、７０℃で８時間
シード重合を行った。放冷後、遠心分離でポリマー粒子
を単離し、水及びメタノールで洗浄した。単離したポリ
マー粒子に１０重量倍のアセトンを加え、７０℃で１０
分間加熱処理することによりシードポリマー由来の線状
可溶分を抽出除去した。この抽出除去操作を３回繰り返
した後ろ過し、乾燥した。抽出液は回収し、１／１０量
まで濃縮した後、２０倍量の水に添加することによりシ
ードポリマー由来の線状可溶分を沈澱として回収した。 得られた沈澱をろ過し乾燥したところ２．２ｇであり、
シードポリマーの少なくとも２７％が抽出除去されたこ
とを確認した。沈澱として回収した線状可溶分を１，２
−ジクロロエタンに溶解し、ＧＰＣにより分子量を測定
したところ重量平均分子量が２８万であった。乾燥後の
ポリマー粒子の収率はシード重合の仕込み原料に対し、
約７８％であった。この重合で得られたポリマー粒子は
、走査電子顕微鏡により観察したところ、平均粒径５．
７μｍの多孔性粒子であり、９０％以上の粒子が平均粒
径±１μｍ以内にあることが確認された。得られたエポ
キシポリマーを用い、実施例１と全く同様にしてエポキ
シ環の開環反応を行なった後、エピクロロヒドリンを反
応させた。導入されたグリシジル基の量は乾燥重量１ｇ
当たり０．２９ミリ当量であった。更にこの樹脂にブチ
ルアルコールを反応させてブチル基を導入し、疎水性ク
ロマトグラフィー担体を製造した。このものを常法に従
って実施例１と同様にして内径７．５ｍｍ、長さ７５ｍ
ｍのステンレス製カラムに充填し、分離性能の評価を行
なった。試料としてはミオグロビン、オバルブミン、ト
リプシンインヒビターの混合液を用いた。その測定条件
は以下に示す通りである。

【００４５】流速：１．０ｍｌ／分 溶離：下記ＡからＢへ、２０分直線グラジエントＡ：Ｂ
＋１．７Ｍ硫酸アンモニウム Ｂ：０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）検出：ＵＶ２
８０ｎｍ 温度：２５℃ サンプル注入量：８μｌ サンプル濃度： ミオグロビン：１５μｇ／５μｌ オバルブミン：８５μｇ／５μｌ トリプシンインヒビター：５５μｇ／５μｌ得られたク
ロマトグラムから各蛋白質の保持時間を求めたところ、
以下の表のようになり、良好な分離が得られていること
がわかる。

【００４６】

【００４７】比較例１ 実施例１の第２工程で含浸させた重合性モノマー及び希
釈剤を用い、通常の懸濁重合により実施例１と同じ平均
粒径を有するポリマー粒子を製造した。得られたポリマ
ー粒子を風ヒ分級（歩留まり１８％）後、実施例１と同
様の方法で、ジエチルアミノエチル基を導入した。得ら
れた樹脂の交換容量は０．３５ミリ当量であった。さら
に実施例１と同一の条件で蛋白質の分離を行ったところ
、分級したにも拘らず粒径分布が広く、実施例１と同様
の通液条件では測定圧力が１５０ｋｇ／ｃｍ２　以上と
なり同一流速での分離は不可能であった。

【００４８】

【発明の効果】本発明の液体クロマトグラフィー用充填
剤は、従来の液体クロマトグラフィー用充填剤に比較し
て、粒径分布が狭い為に通液時のカラム差圧が低く、小
粒径である為に分離段数が高く、また樹脂母体の親水性
が高い為に分離対象物質の不可逆的吸着が少ないと言う
利点を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤を用
いて蛋白質混合物を分離した際のクロマトグラムを示す
図であり、夫々、縦軸は吸光度、横軸は時間（分）を表
わす。

【図２】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤を用
いて蛋白質混合物を分離した際のクロマトグラムを示す
図であり、夫々、縦軸は吸光度、横軸は時間（分）を表
わす。

【図３】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤を用
いて蛋白質混合物を分離した際のクロマトグラムを示す
図であり、夫々、縦軸は吸光度、横軸は時間（分）を表
わす。

【図４】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤を用
いて蛋白質混合物を分離した際のクロマトグラムを示す
図であり、夫々、縦軸は吸光度、横軸は時間（分）を表
わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記各工程により得られる液体クロマ
   トグラフィー用充填剤 第１工程 グリシジルメタクリレート６０〜１００（重量）％、多
   価アルコールと炭素−炭素２重結合を有するモノカルボ
   ン酸とのポリエステル架橋性モノマー０〜１（重量）％
   、グリシジルメタクリレート以外の炭素−炭素２重結合
   を有するモノ不飽和化合物０〜４０（重量）％を含む混
   合物を、該混合物を溶解するが生成するポリマーは溶解
   しない溶媒の存在下に分散重合し、シードポリマーを製
   造する。 第２工程 第１工程において製造したシードポリマー及び該シード
   ポリマーの２〜２０重量倍の重合性モノマーを、該重合
   性モノマーの４０〜２００（重量）％の希釈剤の存在下
   、シード重合してエポキシポリマーを製造する。但し、
   該重合性モノマーは、多価アルコールと炭素−炭素２重
   結合を有するモノカルボン酸とのポリエステル架橋性モ
   ノマー１０〜５０（重量）％、グリシジルメタクリレー
   ト５０〜９０（重量）％及びグリシジルメタクリレート
   以外の炭素−炭素２重結合を有するモノ不飽和化合物０
   〜４０（重合）％を含有する。 第３工程 第２工程で得られたエポキシポリマーを有機溶媒で処理
   し、可溶分を抽出除去する。 第４工程 第３工程において処理したエポキシポリマーに官能基を
   導入する。