JP2017037070A - 分離剤及び液体クロマトグラフィー用カラム - Google Patents
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Abstract
Description
これに対して、粒子状であれば、このような問題がなく、多種多様な形態に容易に対応することができる。しかしながら、多孔性粒子にあっては、液体クロマトグラフィーカラムに充填して用いる際に要求される細孔径と強度及び通液時の圧力損失とが共に良好な値となるように設計することが難しく、一般的に細孔径が大きい多孔性粒子は強度が低く、その結果として圧力損失が大きくなり易い。
一方、強度を高めて圧力損失を小さくした多孔性粒子は、細孔径が小さくなってしまい分離剤として適用可能な用途が限られるという問題が生じる。例えば、特許文献5に開示されている多孔性エポキシ系球状粒子が水保持性20〜30重量%程度の極めて細孔容積の小さい粒子であるように、液体クロマトグラフィーカラム用の分離剤として用いるためには不十分な細孔の多孔性粒子しか知られていなかった。
即ち、本発明は以下を要旨とする。
(1) 乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により10%圧縮変形させた時の強度が2.0MPa以上
(2) 下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が7.0MPa以下
<圧力損失測定方法>
前記分離剤を内容積4mL(内径0.5mm、層高20cm)のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製HPLCシステム(Hitachi LC ELITE LaChrom、カラムオーブンL−2350、RI検出器L−2490、オートサンプラーL−2200)に接続し、純水を流速1.3ml/min(線速度400cm/h)で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。
(1) 乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により10%圧縮変形させた時の強度が2.0MPa以上
(2) 下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が7.0MPa以下
<圧力損失測定方法>
前記分離剤を内容積4mL(内径0.5mm、層高20cm)のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製HPLCシステム(Hitachi LC ELITE LaChrom、カラムオーブンL−2350、RI検出器L−2490、オートサンプラーL−2200)に接続し、純水を流速1.3ml/min(線速度400cm/h)で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。
<非特異吸着試験>
水に分散した前記分離剤を2.5mg/mlのIgG(免疫グロブリンG)水溶液に浸漬し、25℃で3時間吸着させる。吸着前後の上清の280nmの吸光度より、IgGの回収率を評価する。さらにIgG吸着後遠心分離で分別した分離剤を0.1N NaOH水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のBCA測定(ビシンコニン酸タンパク質定量法)により、NaOH処理によるIgGの回収率を求める。IgG水溶液中のIgGに対する上清のIgG回収率(%)とNaOH処理によるIgG回収率(%)の合計を100%から差し引いた値を非特異吸着性(%)の評価値とする。
(イ) 平均細孔径が10nm〜2000nmである。
(ロ) 水分含有量が50重量%以上である。
(1) 乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により10%圧縮変形させた時の強度が2.0MPa以上
(2) 下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が7.0MPa以下
<圧力損失測定方法>
前記分離剤を内容積4mL(内径0.5mm、層高20cm)のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製HPLCシステム(Hitachi LC ELITE LaChrom、カラムオーブンL−2350、RI検出器L−2490、オートサンプラーL−2200)に接続し、純水を流速1.3ml/min(線速度400cm/h)で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。
本明細書において「ポロゲン」とは、細孔形成剤としての不活性溶媒または不活性溶媒混合物を意味する。上述の通り、多孔性エポキシ樹脂または多孔性樹脂の原料中にポロゲンを共存させた状態で重合を行い、その後、重合反応して得られる混合物からポロゲンを除去することにより細孔を形成することができる。このようにして、非粒子凝集型の三次元網状骨格構造の多孔性樹脂を製造することができる。
柱状骨格を有する三次元網状骨格構造を形成することにより、細孔径を大きくしたり貫通孔やパーフュージョンと呼ばれるような細孔状態にした場合でも、粒子の強度を高く保つことができることから、圧力損失を低くすることができる。更には、圧力損失を低く保てるために、粒子径を小さくして分離特性を上げることも可能となる。
[多孔性エポキシ樹脂粒子の製造方法]
本発明の分離剤を構成する多孔性エポキシ樹脂粒子(以下、「本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子」と称す場合がある。)の製造方法には特に制限はないが、例えば、後述の製造例1に記載されるように、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とを、細孔形成剤として機能するポロゲンの存在下に付加重合反応させて多孔性エポキシ樹脂を製造する際に、界面活性剤を用いて乳化物とし、乳化物中で加熱撹拌しながら重合反応を進行させることにより、付加重合体とポロゲンのスピノーダル分解に基づく共連続構造が形成され、この共連続構造が、多孔性エポキシ樹脂粒子の三次元網状骨格構造の柱状骨格を構成する本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子を製造することができる。より具体的には、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とポロゲンを用いて混合液(以下「原料混合液」と称す場合がある。)を調製し、この原料混合液と、別途調製した界面活性剤(分散剤)とを混合して乳化物とし、この乳化物中で重合反応を進行させる。
以下、この製造方法について説明する。
本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子の原料となる多官能エポキシ基含有化合物は、1分子中にエポキシ基を2個以上有するエポキシ化合物である。この多官能エポキシ基含有化合物は、エポキシ基を3個以上有することが好ましい。多官能エポキシ基含有化合物は芳香族エポキシ化合物であっても非芳香族エポキシ化合物であってもよい。また、多官能エポキシ基含有化合物は高分子化合物(オリゴマーやエポキシ樹脂)であっても、低分子化合物(単量体)であってもよい。
本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子の原料となる多官能アミノ基含有化合物は、1分子中にアミノ基を2以上有するアミノ化合物であって、芳香族アミノ化合物であっても非芳香族アミノ化合物であってもよい。
ポロゲンは、多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物を溶解させることができ、且つ多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物が重合した後、反応誘起相分離を生ぜしめることが可能な溶媒であり、例えばメチルセロソルブ、エチルセロソルブなどのセロソルブ類、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートなどエステル類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどのグリコール類などが挙げられる。中でも分子量200〜20,000程度のポリエチレングリコール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートが好ましく、特に分子量200〜20,000程度のポリエチレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートが好ましい。
原料混合液は、前述の多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とをポロゲンに混合して均一化することにより調製することができる。
原料混合液中のポロゲン溶媒の含有割合は、原料混合液に含まれる多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物の合計に対して、通常50〜500重量%であることが好ましく、100〜400重量%であることがより好ましい。ポロゲンの含有割合が上記下限以上であるとより空孔率の高い多孔質構造を形成することができ、他方、上記上限以下であると得られる多孔性エポキシ樹脂の空孔率を適度な範囲に抑えることができ、機械的強度が向上する傾向にある。
乳化物を形成するための界面活性剤としては、原料混合液と混合して安定な乳化物を形成することができるものであればよく、特に制限されず、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、親水性ブロックと疎水性ブロックからなるブロックコポリマー、例えばポリアクリル酸ブロックとポリアクリルエステルブロックからなるブロックコポリマー、ポリオキシエチレンブロックとポリアクリルエステルブロックからなるブロックコポリマー、ポリオキシエチレンブロックとポリオキシプロピレンブロックからなるブロックコポリマー、等が挙げられる。また、界面活性剤の分子量についても、特に限定されず、低分子化合物でも高分子化合物でも使用することができる。
また、分散剤としてブロックコポリマーを用いる場合は、一般に知られる分散媒を用いることができ、例えば、γ−ブチロラクトン、グリセリン、エチレングリコール、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、n−ブタノール等のアルコール類、トルエン、キシレン、n−オクタン、n−ドデカン等の炭化水素類、リノール酸等の脂肪酸類、ポリエチレングリコール、ジメチルシリコーン、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール、イソブチルアルコール、tert−ブチルアルコール、1−ペンタノール、2−ペンタノール、3−ペンタノール、2−メチル−1−ブタノール、イソペンチルアルコール、tert−ペンチルアルコール、1−ヘキサノール、2−メチル−1−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、2−エチルブタノール、1−ヘプタノール、2−ヘプタノール、3−ヘプタノール、2−オクタノール、2−エチル−1−ヘキサノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール等のアルコール類;メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、イソプロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、ジエチレンブリコールモノブチルエーテル等のエーテルアルコール類;アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類;酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、セロソルブアセテート等のエステル類;ペンタン、2−メチルブタン、n−ヘキサン、シクロヘキサン、2−メチルペンタン、2,2−ジメチルブタン、2,3−ジメチルブタン、ヘプタン、n−オクタン、イソオクタン、2,2,3−トリメチルペンタン、デカン、ノナン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、p−メンタン、ジシクロヘキシル、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン等の脂肪族又は芳香族炭化水素類;四塩化炭素、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、テトラブロムエタン等のハロゲン化炭化水素類;エチルエーテル、ジメチルエーテル、トリオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類;メチラール、ジエチルアセタール等のアセタール類;ギ酸、酢酸、プロピオン酸等の脂肪酸類;ニトロプロペン、ニトロベンゼン、ジメチルアミン、モノエタノールアミン、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の硫黄、窒素含有有機化合物類等が挙げられる。好ましくは、メタノールやエタノールなどの低級アルコール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブなどのエーテルアルコール、水と低級アルコールの混合物、水とエーテルアルコールの混合物のような水溶性及び親水性の媒体、トルエン、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、メチルエチルケトン(MEK)、メチルイソブチルケトン(MIBK)、アセトン、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)、ジクロロメタン、テトラクロロエチレンなどが挙げられる。これらは単独で使用してもよいし、2種類以上を併用してもよい。分散媒中のブロックコポリマーの濃度は、0.5〜15重量%、特に1〜10重量%程度であることが好ましい。
多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物の付加重合反応は、前述の原料混合液と界面活性剤(分散剤)とを混合して安定な乳化状態とした後、撹拌下に所定の時間加熱することにより行う。
なお、乳化状態は、水と油からなるエマルションを形成する場合は油滴が水に分散する水中油滴(O/W型)エマルションと、水滴が油中に分散する油中水滴(W/O型)エマルションの形態がある。また、非相溶の油からなる油中油滴(O/O型)エマルションも好ましく用いることができる。使用する多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物、ポロゲンにより乳化状態を選ぶことができるが、ポロゲンの親水性及び水溶性の観点から、油中油滴型を好適に用いることができる。
本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子は、粒状の中でも球状であることが好ましい。特に真球に近いほど好ましい。球状であることによりカラム充填において理論段数が高くしやすく、分離特性が向上する。真球に近いほど更に理論段数は高くなり分離特性も更に向上する。上述の方法で作製された多孔性エポキシ樹脂粒子は、撹拌下の乳化物中に生成したものであるため、通常、真球に近い粒状粒子である。また、この多孔性エポキシ樹脂粒子の平均細孔径は好ましくは10nm〜2000nmで、平均粒径は好ましくは1μm〜1000μmである。
本発明の第一態様の分離剤は、上記のようにして製造された多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなることを特徴とする。
ここで、多孔性エポキシ樹脂粒子の処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子の目的物の分離性(選択的吸着性)を向上させると共に、非特異吸着性を低減させるような処理が好ましく、例えば、表面親水化、表面疎水化、官能基導入、生体分子導入、分級、有機溶媒洗浄、アルカリ洗浄などの処理が挙げられる。
これらの親水化や疎水化、官能基導入などは、粒子の表層に何らかの異なる化学構造のものを付与することにつながるため、表層と断面との化学構造を比較することで処理の有無を確認することができる。例えば、固体核磁気共鳴法(固体NMR)や赤外分光法(IR)、X線光電子分光法(XPS)などにより測定することで、処理の有無を確認することができる。これらの処理のうち、1種のみを行ってもよく、複数の処理を選択して組み合わせて行ってもよい。
表面親水化処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基に、水酸基及び/またはアミノ基を有する化合物を付加させることによりエポキシ基を開環する処理が挙げられる。この親水化処理に用いる水酸基及び/またはアミノ基を有する化合物としては、硫酸、リン酸、水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、エタノールアミン、アミノメチルプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール等の1種又は2種以上が挙げられる。親水化処理は、これらの化合物を多孔性エポキシ樹脂粒子に接触させることにより行うことができる。また、親水化処理にて導入された官能基に更に同様の親水化処理を行うこともできる。またそれらを複数組み合わせて実施することもできる。具体的には、後述の実施例に示されるように、多孔性エポキシ樹脂粒子を1〜50重量%程度の親水化処理用化合物の水溶液に投入し、10〜90℃で1〜24時間程度加熱撹拌する方法が挙げられる。親水化処理後は多孔性エポキシ樹脂粒子を濾別し、水洗を行って、残留する親水化処理用化合物を除去する。
親水化処理を行うことで、粒子の水への分散性向上や、疎水性を有する物質の非特異的な吸着が抑制される。
表面親水化の指標としては、後述する非特異吸着量などにて評価できる。
表面疎水化処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基やアミノ基などに疎水性基を有する化合物を付加することにより疎水化処理する方法が挙げられる。この疎水化処理に用いる化合物としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、メチルクロライド、エチルクロライド、ブチルクロライド、ベンジルクロライドなどのアルキルクロライド類等の1種又は2種以上が挙げられる。疎水化処理は、例えば多孔性エポキシ樹脂粒子を疎水化処理用化合物を含む溶液中に分散させ、10〜90℃で1〜6時間程度加熱撹拌することにより行うことができる。疎水化処理後は多孔性エポキシ樹脂粒子を濾別して水洗を行って、残留する疎水化処理用子化合物を除去する。
疎水化処理を行うことで、疎水性を有する物質の吸着を促進することができる。一般的な逆相クロマトグラフィーの評価条件において、分離対象の保持を強くすることができるため、疎水性の高い物質を分離する際などには有用である。
表面疎水化の指標としては、ジプロピルフタレートのような疎水性物質の保持時間として評価できる。
官能基導入処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子表面に残存するエポキシ基及び/またはアミノ基を介して、イオン性官能基を有する水溶性ポリマーを付加するグラフト処理などが挙げられる。
導入された官能基は、上述の固体NMR、IR、XPSなどにより分析することができる。また、酸やアルカリなどによる滴定によっても官能基の導入を確認することができる。
付加率={(W1−W0)/W0}×100
これらは1種を単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。
生体分子導入処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子表面に残存するエポキシ基及び/またはアミノ基を介して、タンパク質及び/またはタンパク質誘導体を付加するカップリング処理などが挙げられる。カップリング処理は、上記グラフト処理後にタンパク質及び/またはタンパク質誘導体を付加することにより行うこともできる。
導入する生体分子としては、タンパク質及び/またはタンパク質誘導体や核酸、多糖、脂質、ビタミン等が挙げられ、特にタンパク質及び/またはタンパク質誘導体が好ましい。また、これらの生体分子の中でも、ある特定の物質と特異的に結合するアフィニティーリガンドがより好ましい。
導入された官能基は、上述の固体NMR、IR、XPSなどにより分析することができる。また、ビシンコニン酸(BCA)法やBradford法よるタンパク質の定量などによっても導入された官能基を分析可能である。
特に、抗体の分離を主目的とする場合、リガンドとしては免疫グロブリンの一部と特異的に結合可能なものが好ましく、その中でもプロテインA、プロテインG、プロテインLおよびこれらの改変体、とりわけプロテインAの改変体が抗体の分離に用いる際の選択率が高く好ましい。
多孔性エポキシ樹脂粒子の構成成分の有する官能基及び前記リガンドの有する官能基とそれぞれ反応可能な官能基を分子内にそれぞれ1個以上有する低分子又は高分子化合物(以下このような化合物をまとめて「スペーサー」と記す)を介して結合させる方法を採用することができる。
また、後者の方法としては、スペーサーとしてアミノ酸(アミンカルボン酸)類を用い、そのアミノ基部位と多孔性エポキシ樹脂粒子のエポキシ基とを反応させた上で、他の末端のカルボキシル基によってプロテインAのアミノ基と反応させる方法や、スペーサーとしてジアミンやジオールと(ポリ)エチレングリコールジグリシジルエーテル等のジグリシジル化合物を逐次的に用いて、多孔性エポキシ樹脂粒子のエポキシ基とジアミン又はジオールの一方の末端を結合させ、他の末端にジグリシジル化合物の一方のエポキシ基を結合させて、残る末端のエポキシ基をプロテインAと結合させる方法などが挙げられる。
スペーサーとしてはリガンドとの反応性や固定化時の多孔性エポキシ樹脂粒子との立体障害の関係を考慮すると、直鎖状の構造を有していることが好ましい。分岐鎖状の構造のスペーサーを用いると、立体障害が大きくなって、リガンドと抗体とのアフィニティ結合の形成を抑制するためか、吸着量が低下する傾向となる。
固定化反応の温度は常温〜30℃程度が好ましい。温度が高くなるとプロテインA等が不活性化することがあり、一方温度が低いと反応に長時間を要することとなる。
リガンドの固定化密度は、分離剤1リットル当たり1g以上であることが好ましい。またその上限は特に限定されないが、通常50g/L以下である。
リガンドの固定化密度が1g/L未満では抗体の吸着量が低下し、分離剤の効率が低くなる。一方、50g/Lを超えてリガンドを固定しても、リガンドの利用効率が低くなる。
より好ましい固定化密度としては、多孔性エポキシ樹脂粒子1mL当たり0.05〜50μ(エポキシ)当量が挙げられる。
また、多孔性エポキシ樹脂粒子の多孔性粒子を用いた上記分離剤を該保管媒体中で保管した時に、該分離剤の膨潤度が適切になり、かつ該分離剤に対する保管媒体への親和性が良好である。したがって細菌類の繁殖が抑制する効果や細孔内に固定されたプロテインAの保存安定性が良くなる効果が発現するので好ましい。より好ましいエタノールの濃度は10〜30重量%、さらに好ましい濃度は15〜25重量%である。
多孔性エポキシ樹脂粒子の分級処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子を、重力分級、慣性分級などの乾式分級、沈降分級や水力分級などの湿式分級、篩による篩分け分級など公知の方法により分級して、所望の粒径及び粒度分布のものを得る方法が挙げられる。
多孔性エポキシ樹脂粒子を分級処理して得られる分離剤としては、平均粒径が1μm〜1000μmであることが好ましく、均一係数(累積残留百分率が40%となる粒径/累積残留百分率が90%となる粒径)が1.6以下であることが好ましい。より好ましくは、均一係数が1.4以下、更に好ましくは1.2以下である。
多孔性エポキシ樹脂粒子の有機溶媒の洗浄に用いる有機溶媒としては、メタノールやエタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、トルエンやキシレンなどの芳香族類等の1種又は2種以上が挙げられる。有機溶媒洗浄は、例えば、多孔性エポキシ樹脂粒子を1〜10容量倍の有機溶媒に投入して1〜5時間程度撹拌することにより行うことができる。この洗浄時には、必要に応じて40〜100℃程度に加熱してもよい。また、有機溶媒洗浄は複数回繰り返し行ってもよく、その際、異なる有機溶媒を用いてもよい。有機溶媒による洗浄後は、水洗を行って有機溶媒を除去することが好ましい。
有機溶媒洗浄により、多孔性エポキシ樹脂粒子の合成時に使用した界面活性剤(分散剤)やポロゲンなどを除去することが可能である。これらが残存していると、多孔性エポキシ樹脂粒子を分離剤として使用した際に非特異吸着が起きたり、分離対象を溶離する際に不純物として混入したりするため、あらかじめ洗浄除去しておくことが好ましい。
多孔性エポキシ樹脂粒子のアルカリ洗浄に用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機アルカリが好ましく用いられる。これらのアルカリは0.1〜10重量%程度の濃度の水溶液として用いることができる。アルカリ洗浄は、例えば、多孔性エポキシ樹脂粒子を1〜10容量倍のアルカリ水溶液に投入して1〜5時間程度撹拌することにより行うことができる。この洗浄時には、必要に応じて40〜100℃程度に加熱してもよい。また、アルカリ洗浄は複数回繰り返し行ってもよく、その際、異なるアルカリを用いてもよい。アルカリによる洗浄後は、水洗を行ってアルカリを除去することが好ましい。
多孔性エポキシ樹脂粒子をアルカリで洗浄することにより、エステル結合や水素結合など、耐アルカリ性が低い不完全な結合を形成している箇所を加水分解することができ、分離剤としての性能を安定化させることができる。一般に、分離剤として使用する場合にはアルカリ洗浄工程があるため、あらかじめアルカリ洗浄を実施しておくことで、分離剤として繰り返し使用する際に安定した性能を示すため好ましい。
分離剤を製造するにあたって必須ではないが、多孔性エポキシ樹脂粒子に乾燥処理を施してもよい。乾燥処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子を真空乾燥機やセーフベンドライヤー、凍結乾燥機等により、温度−20〜120℃、圧力1〜100kPaで、1〜12時間程度処理して乾燥させることにより、多孔性エポキシ樹脂粒子が保存する水分の95%以上を除去する方法が挙げられる。
本発明の第一態様の分離剤は、少なくとも下記(イ)、(ロ)の何れかを満たす。これらの特性は、分離剤を構成する多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に液体クロマトグラフィー用途として十分な細孔が存在していることを意味しており、いずれか一方を満たしていても、両方を満たしていてもよい。
(イ) 平均細孔径が10nm〜2000nmである。
(ロ) 水分含有量が50重量%以上である。
本発明の分離剤は、粒子表面にまで貫通する細孔を有していることを特徴とする。このことは、粒子表面及び断面の走査型電子顕微鏡(SEM)観察を行うことによって確認できる。また、水銀圧入法で細孔径を測定可能である場合には、粒子表面にまで達する細孔を有することが確認できる。さらに、これらの顕微鏡観察及び細孔径測定を組み合わせることで更に正確に確認できる。なお、水銀圧入法は、圧力をかけて水銀を開孔部に侵入させ、圧力値と対応する侵入水銀体積とを用いて、円柱状と仮定した細孔の径をWashburnの式から算出する方法であり、セラミックス成形体について規定されたJIS R1655を準用することができる。
平均細孔径が上記下限値以上であると、分離対象のタンパク質等が粒子の細孔内に入りやすくなり、結果的に吸着量が向上する傾向にある。一方、平均細孔径が上記上限値以下であると、細孔内部の吸着に寄与しない空間を低減することが可能であり、吸着量が向上する傾向にあり、更に粒子の機械的な強度も向上する傾向にある。
なお、本発明の分離剤の平均細孔径は、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。
分離剤の平均細孔径は、前述の多孔性エポキシ樹脂粒子の製造に当たり、多孔性エポキ
シ樹脂粒子の各構成単位及びポロゲンとの混合比率や、撹拌時の加熱温度等を調整することにより制御することができる。
本発明の分離剤の水分保持量は、好ましくは50重量%以上であり、より好ましくは60重量%以上、さらに好ましくは70重量%以上、分子サイズが大きな分離対象の分離に用いる場合には75重量%以上であることが特に好ましい。なお、分離剤の水分保持量とは、分離剤が細孔内などの空間を含めて保持可能な水の量を意味しており、水分保持量が大きいほど、分離剤が有する細孔容積が大きいことを意味する。細孔径が一定の場合、水分保持量が多いほど有効な表面積が大きくなるため、吸着容量の増大や分離性向上の点で水分保持量は大きい方が好ましい。物理的な強度の観点から、水分保持量は95重量%以下が好ましい。また、表面処理において、高分子量のポリマーなどを導入すると、細孔内の空間を占有し水分保持量が低下する傾向がある。
なお、本発明の分離剤の水分保持量は、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。
本発明の分離剤の平均粒径は、1μm〜1000μmの範囲であることが好ましく、より好ましくは10μm〜100μm、更に好ましくは30μm〜60μmである。平均粒径が上記下限値以上であると、カラムに充填して通液した時の圧力損失が大きくなることが防止され、通液速度を高くすることができ、処理効率を高めることができる傾向にある。一方、上記上限値以下であると、吸着量や分離性能を高く維持することができる傾向にある。
なお、本発明の分離剤の平均粒径は、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。
分離剤は、クロマトグラフィーカラムの通液時の変形を防止して、適当な通液速度での処理が可能な十分な強度を有することが好ましく、本発明の分離剤は、乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により10%圧縮変形させた時の強度が2.0MPa以上であることが好ましい。10%圧縮変形強度は大きい程好ましく、4.0MPa以上であることがより好ましいが、好適な細孔径及び分離挙動との両立の面から、通常その上限は20MPaである。
なお、本発明の分離剤の10%圧縮変形強度は、具体的には、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。
本発明の分離剤は、下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が7.0MPa以下、特に3.0MPa以下であることが好ましい。
<圧力損失測定方法>
前記分離剤を内容積4mL(内径0.5mm、層高20cm)のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製HPLCシステム(Hitachi LC ELITE LaChrom、カラムオーブンL−2350、RI検出器L−2490、オートサンプラーL−2200)に接続し、純水を流速1.3ml/min(線速度400cm/h)で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。
なお、本発明の分離剤の圧力損失は、具体的には、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。
<非特異吸着試験>
水に分散した前記分離剤を2.5mg/mlのIgG(免疫グロブリンG)水溶液に浸漬し、25℃で3時間吸着させる。吸着前後の上清の280nmの吸光度より、IgGの回収率を評価する。さらにIgG吸着後遠心分離で分別した分離剤を0.1N NaOH水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のBCA測定(ビシンコニン酸タンパク質定量法)により、NaOH処理によるIgGの回収率を求める。IgG水溶液中のIgGに対する上清のIgG回収率(%)とNaOH処理によるIgG回収率(%)の合計を100%から差し引いた値を非特異吸着性(%)の評価値とする。
なお、本発明の分離剤の非特異吸着性は、具体的には、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。
本発明の第二態様の分離剤を構成する多孔性樹脂粒子としては、第一態様の分離剤の多孔性エポキシ樹脂粒子以外であって、スチレン、エチルスチレン、メチルスチレン、ヒドロキシスチレン、クロロスチレン等のスチレン系単量体などの芳香族モノビニル化合物;(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチル、(メタ)アクリル酸ヒドロキシエチル、(メタ)アクリル酸ヒドロキシプロピル、(メタ)アクリル酸ブチル、(メタ)アクリル酸2−エチルヘキシル、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、グリセリンモノ(メタ)アクリレート等の(メタ)アクリル酸エステル類;(メタ)アクリルアミド、ジメチル(メタ)アクリルアミド、ヒドロキシエチル(メタ)アクリルアミド等の(メタ)アクリルアミド類;(メタ)アクリロニトリルのようなニトリル類;グリシジル(メタ)アクリレート、4,5−エポキシブチル(メタ)アクリレート、9,10−エポキシステアリル(メタ)アクリレート等のエポキシ基含有化合物;その他のビニルエステル類、ビニルエーテル類等のモノビニル単量体の1種又は2種以上を(共)重合した後、得られた(共)重合物に対してエピクロルヒドリン、(ポリ)アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入することにより多孔質架橋粒子としたものや、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、(ポリ)エチレングリコールジ(メタ)アクリル酸エステル、グリセロールジ(メタ)アクリル酸エステル等のポリ(メタ)アクリル酸エステル類、ポリカルボン酸ポリビニルエステル類、ポリカルボン酸ポリアリルエステル類、ポリオールポリビニルエーテル類、ポリオールポリアリルエーテル類、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物の1種又は2種以上を(共)重合させたもの、もしくはこのようなポリビニル化合物の1種又は2種以上と、上述のモノビニル単量体の1種又は2種以上とを共重合して得られる多孔質架橋粒子などが挙げられる。
第二態様の分離剤の平均粒径や平均細孔径の好適範囲についても、第一態様の分離剤と同様である。
第一態様の分離剤と同様の理由から、第二態様の分離剤10%圧縮変形強度は2.0MPa以上で、好ましくは4.0MPa以上であり、通常20MPa以下である。
また、非特異吸着性についても、第一態様の分離剤と同様の理由から、5%以下、好ましくは3%以下であり、通常0.1%以上である。
クロマトグラフィー分離剤には、その分離モードから、大分子量不純物を排除し、目的物を細孔内に拡散して分離するサイズ排除分離剤、核酸などの小分子量不純物のみを吸着除去するフロースルー型分離剤、リガンドにより目的物を吸着分離するリガンド型分離剤とに分類されるが、本発明の分離剤は、これらのいずれの分離剤にも適用することができる。
特に好ましい標的分子としては、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質もしくはその化学変性物が挙げられ、中でも免疫グロブリンがモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が好ましい。
標的分子の分離処理は、以下の工程を含むように行うのが好ましい。
(b)前記標的分子を吸着した分離剤から該標的分子を溶離する工程。
このような方法により、上記のような各種タンパク質を選択性良く分離することが可能である。
以下の製造例、実施例及び比較例で得られた多孔性樹脂粒子を処理してなる分離剤の評価方法は以下の通りである。
堀場製作所社製レーザー回析/散乱式粒度分布測定装置LA−920を用いて、粒度分布を測定した。具体的には、水に分散した少量の試料樹脂粒子をフローセル水に分散させ、これにレーザー光を照射し、回析、散乱光の強度パターンから作成した粒度分布のメディアン径(50%径)値を平均粒径とした。
平均細孔径は、水銀圧入法により測定した。水銀圧入法は、圧力をかけて水銀を開孔部に侵入させ、圧力値と対応する侵入水銀体積とを用いて、円柱状と仮定した細孔の径をWashburnの式から算出する方法であり、セラミックス成形体について規定されたJIS R1655を準用することができる。
乾燥処理した試料樹脂粒子を秤量し、専用セルに入れ、真空下(50μmHg×10分)で脱気による前処理を行った後、マイクロメリテックス社製オートポアIV9520型を用いて、水銀圧入退出曲線を測定した。細孔容積、細孔径をそれぞれ縦軸、横軸とした細孔の分布を示すヒストグラムにより、細孔容積の合計が最も多い部分の細孔径を平均細孔径とした。
水に分散した試料樹脂粒子をそれぞれ2.5mg/mlのIgG(免疫グロブリンG)水溶液に浸漬し、25℃で3時間吸着させた。吸着前後の上清の280nmの吸光度より、IgGの回収率を評価した。さらにIgG吸着後遠心分離で分別した樹脂粒子を0.1N NaOH水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のBCA測定により、NaOH処理によるIgGの回収率を評価した。IgG水溶液中のIgGに対する上清のIgG回収率(%)とNaOH処理によるIgG回収率(%)の合計を100%から差し引いた値を非特異吸着性(%)の評価値とした。この値は小さい程好ましい。
水に分散した試料樹脂粒子をメンブレンフィルター(メルクミリポア社製親水性デュラポアSVLP04700(5μm))を用いて吸引濾過により水分が落ちなくなるまで5分以上濾過し、得られた樹脂粒子のウエット重量(Wg)を測定した。このウエット樹脂粒子をヤマト科学社製角型真空定温乾燥器DP200を用い、50℃で9時間真空乾燥し、真空乾燥後のドライ重量(Dg)を測定した。(W−D)で水分量を求め、水分量/樹脂粒子のウエット重量×100=(W−D)/W×100を水分保持量とした。
島津製作所社製 微小圧縮試験器「MCT−W500」を用いて、減圧下で加熱(50℃、8時間)することにより乾燥させた試料樹脂粒子から任意に選んだ10個以上の粒子の10%変位強度を測定し、その平均値を10%圧縮変形強度とした。
試料樹脂粒子を内容積4mL(内径0.5mm、層高20cm)のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製HPLCシステム(Hitachi LC ELITE LaChrom、カラムオーブンL−2350、RI検出器L−2490、オートサンプラーL−2200)に接続し、純水を流速1.3ml/min(線速度400cm/h)で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。
分離剤1〜3をそれぞれ内容積4mL(内径0.5mm、層高20cm)のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製HPLCシステム(Hitachi LC ELITE LaChrom、カラムオーブンL−2350、RI検出器L−2490、オートサンプラーL−2200)に接続した。ここへエチレングリコール(EG、分子量62)と分子量の異なるデキストランを含む水溶液をオートサンプラーで注入し、流出液の分析結果より、分子量と保持体積の関係を評価した。流速は、0.125mL/min、サンプル量は10μL、カラム温度は30℃で実施した。測定に使用したデキストランの分子量は、4×104、6×104、1.5×104、1.5×105(100〜200×103)、2.5×105(200〜300×103)、5×105、2.2×106(1.5〜2.8×106)、5×106(3〜7×106)、2.3×107(5〜40×106)である。
(原料混合液の調製)
エポキシ当量が99である下記式(a)で表される多官能エポキシ基含有化合物「トリグリシジルイソシアヌレート」(商品名「TEPIC−S」、日産化学工業社製)1.6重量部と、硬化剤として、アミン価が520〜550である下記式(b)で表される多官能アミノ基含有化合物「ビス(4−アミノシクロヘキシル)メタン」(東京化成工業社製)0.37重量部と、ポロゲンとして、平均分子量が200である「ポリエチレングリコール(PEG)」(商品名「ポリエチレングリコール200」、和光純薬工業社製)7重量部を用い、あらかじめTEPIC−SとPEG200を110℃に加熱溶融し、別途85℃で加熱溶融したビス(4−アミノシクロヘキシル)メタンを合わせてボルテックスミキサー3000rpmで数分間混合して原料混合液を得た。
円筒状のガラス製サンプル瓶(内径19mm、高さ60mmの)に分散媒としてドデカン10gにブロックコポリマー(分散剤)K−1を0.6g溶解したものを準備し、上記で得られた原料混合液8.97gを加え、ボルテックスミキサーで外見上の乳化状態が安定するまで撹拌(6〜10分)して分散液を調製した。なお、分散媒は、分散液調製に先立ち、予め50℃以上に加温した。また、前記ブロックコポリマーK−1は、ラウリルメタクリレート(以下、LMAと略記)5重量部とポリエチレングリコールメタクリレート(以下、PEGMAと略記)9.34重量部とのリビングラジカル重合により合成された数平均分子量18,700、PDI1.27のブロックコポリマーである。
前記分散液を、撹拌翼で毎分回転数を50回転として高温浴槽中温度90℃で180分間重合した。重合して得られたものをテトラヒドロフランに入れ十分撹拌した後、遠心分離機を用いて生成した多孔性エポキシ樹脂粒子を分離した。このテトラヒドロフランによる洗浄工程を10回繰り返してポロゲンや残存する原料化合物等を十分に除去した後、減圧乾燥してエポキシ樹脂からなる球形の多孔性粒子を1.75g得た。これを多孔性エポキシ樹脂粒子1という。得られた多孔性エポキシ樹脂粒子1は、柱状骨格の三次元網状骨格構造であり、平均粒径は29μmの球状粒子であった。
製造例1の(重合工程および後処理)において、重合温度を80℃とした以外は製造例1と同じ条件で多孔性粒子を製造し、球形の多孔性粒子を1.83g得た。これを多孔性エポキシ樹脂粒子2という。得られた多孔性エポキシ樹脂粒子2は、柱状骨格の三次元網状骨格構造であり、平均粒径は26μmの球状粒子であった。
製造例1の(原料混合液の調製)において、PEG200を8.4重量部、分散剤を0.67重量部、分散媒を9重量部として重合した以外は製造例1と同じ条件で多孔性粒子を製造し、球形の多孔性粒子を1.85g得た。これを多孔性エポキシ樹脂粒子3という。得られた多孔性エポキシ樹脂粒子3は、柱状骨格の三次元網状骨格構造であり、平均粒径は38μmの球状粒子であった。
撹拌翼付フラスコにて、製造例1で得られた多孔性エポキシ樹脂粒子1に5重量%硫酸水溶液を加え、50℃で5時間加熱撹拌することで親水化処理した。処理後の多孔性エポキシ樹脂粒子をフィルターにより濾別し、硫酸を水洗除去し、分離剤1を得た。
実施例1と同様にして、製造例2で得られた多孔性エポキシ樹脂粒子2を硫酸で親水化処理し、分離剤2を得た。
実施例1と同様にして、製造例3で得られた多孔性エポキシ樹脂粒子3を硫酸で親水化処理し、分離剤2を得た。
水100重量部にポリビニルアルコール0.5重量部を溶解した水中に、グリシジルメタクリレート80重量部、エチレングリコールジメタクリレート20重量部,2,2’−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニトリル)1重量部、及びジクロルプロパン100重量部の混合物を加え、撹拌して懸濁状態とした。このとき、撹拌速度を調整して液滴の平均直径が約45μmになるようにした。この懸濁液を70℃に昇温し、6時間反応させた。冷却後、濾別、水洗して多孔性メタクリル樹脂粒子を得た。得られた多孔性メタクリル樹脂粒子は、微小な樹脂粒子からなる凝集体であった。
市販のビスフェノールAジクリシジルエーテルタイプのエポキシ樹脂jER 828(三菱化学社製)10gとトリアセチン(東京化成工業社製)2gを100mLのポリカップに取り、混合して均一な液体とした。これにテフロン(登録商標)製半月羽根(36mm)を先端に着けた撹拌棒を挿入し100rpmで撹拌した。別にポリビニルアルコールGL−05(日本合成化学社製)1.5gを含む水溶液10gを用意しておき、jER828とトリアセチンの混合物に2.5gずつ3分おきに添加した。
その結果、jER828とトリアセチン混合物はポリカップ内で乳化されて、白色のエマルションが得られた。
次いでこのエマルションに硬化剤としてピペラジン(東京化成工業社製)1.9gを含む8gの水を加えた後、室温の静置条件で5日間硬化させたところ、平均粒径約14μmの微細な球状粒子が得られた。この粒子を濾過、洗浄後、100mLの水に再分散させて、4N H2SO4を5g加え、90℃で2時間処理した。再び濾過、洗浄後、粒子を風乾した。
ソックスレー脂肪抽出器にこの粒子を入れ、エタノールの沸点で5時間抽出し、エポキシ樹脂粒子を得た。抽出後のエポキシ樹脂粒子は約16重量%の水分保持量を示した。また、平均細孔径の測定において10nm以上の細孔は検出されなかった。
また、実施例1〜3で得られた分離剤1〜3と、比較例2で得られた樹脂粒子の分離挙動評価(iSEC)結果を表2に示す。
多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる本発明の分離剤1〜3は、処理前の多孔性エポキシ樹脂粒子に比べていずれも非特異吸着性が低減され、硫酸による親水化処理でタンパク質の多孔性エポキシ樹脂粒子表面への吸着が抑制され、回収率が向上している。また、本発明の分離剤1〜3は、比較例1の多孔性メタクリル樹脂粒子に比べて、10%圧縮変形強度が十分に高く、圧力損失は非常に小さい。加えて本発明の分離剤1〜3は、SEM観察により粒子表面にまで貫通する細孔を有していることが確認でき、水銀圧入法で測定した平均細孔径は所望の範囲で調整可能であり、水分保持量は比較例2に比べて十分に高い。
比較例2の樹脂粒子は10nm以上の細孔は検出されず、水分保持量は20重量%以下と極めて少量であること、さらにSEM観察によれば表面には有効な孔は開いておらず、また内部に細孔を形成していたとしても少量であることが分かる。
これらは、重合の過程で本発明の分離剤1〜3に用いたエポキシ樹脂粒子が相分離して細孔を形成するのに対し、比較例2の樹脂粒子は合成方法の違いから、相分離することなく重合していることによるものと推察される。
また、表2より、本発明の分離剤1〜3は、分子量と保持体積とに相関があり、サイズ排除分離剤として用いることができることが分かる。ここで、分離剤1、分離剤2、分離剤3の順に保持体積が大きくなっており、平均細孔径の大きい分離剤ほど保持体積が大きくなることが分かる。比較例2の樹脂粒子は、デキストランの分子量範囲においてほとんど保持体積が同じであり分離性を有していない。
Claims (13)
- 多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、該分離剤の平均細孔径が10nm〜2000nmであることを特徴とする分離剤。
- 多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、水分含有量が50重量%以上であることを特徴とする分離剤。
- 前記分離剤の平均細孔径が10nm〜2000nmである、請求項2に記載の分離剤。
- 前記多孔性エポキシ樹脂粒子が、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とを含む化合物の付加重合体に相当するエポキシ樹脂の粒子であって、平均粒径が1μm〜1000μmである、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の分離剤。
- 前記多官能エポキシ基含有化合物が、N,N,N’,N’−テトラグリシジル−m−キシリレンジアミン及び/またはトリグリシジルイソシアヌレートである、請求項4に記載の分離剤。
- 前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基に、水酸基及び/またはアミノ基を有する化合物を付加させることによりエポキシ基を開環する、親水化処理である、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の分離剤。
- 前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基及び/またはアミノ基を介して、イオン性官能基を有する水溶性ポリマーを付加する、グラフト処理である、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の分離剤。
- 前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基及び/またはアミノ基を介して、タンパク質及び/またはタンパク質誘導体を付加する、カップリング処理である、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の分離剤。
- 下記(1)及び(2)の特性を満たすことを特徴とする、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の分離剤。
(1) 乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により10%圧縮変形させた時の強度が2.0MPa以上
(2) 下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が7.0MPa以下
<圧力損失測定方法>
前記分離剤を内容積4mL(内径0.5mm、層高20cm)のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製HPLCシステム(Hitachi LC ELITE LaChrom、カラムオーブンL−2350、RI検出器L−2490、オートサンプラーL−2200)に接続し、純水を流速1.3ml/min(線速度400cm/h)で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。 - 下記非特異吸着試験により求められる非特異吸着性が5%以下であることを特徴とする、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の分離剤。
<非特異吸着試験>
水に分散した前記分離剤を2.5mg/mlのIgG(免疫グロブリンG)水溶液に浸漬し、25℃で3時間吸着させる。吸着前後の上清の280nmの吸光度より、IgGの回収率を評価する。さらにIgG吸着後遠心分離で分別した分離剤を0.1N NaOH水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のBCA測定(ビシンコニン酸タンパク質定量法)により、NaOH処理によるIgGの回収率を求める。IgG水溶液中のIgGに対する上清のIgG回収率(%)とNaOH処理によるIgG回収率(%)の合計を100%から差し引いた値を非特異吸着性(%)の評価値とする。 - 請求項1乃至10のいずれか1項に記載の分離剤からなる、ワクチン精製用分離剤。
- 請求項1乃至10のいずれか1項に記載の分離剤からなる、タンパク質精製用分離剤。
- 請求項1乃至12のいずれか1項に記載の分離剤と、該分離剤が充填された容器とを備えることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カラム。
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