JP2021506928A - 分離マトリックスの調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)固体支持体及びアルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを用意する工程;
b)アルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを固体担体と反応させ、共有結合アルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを有する分離マトリックスを形成する工程;並びに
c)共有結合アルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを有する分離マトリックスを、少なくとも10mM、例えば少なくとも25mMのアルカリ金属水酸化物を含む洗浄溶液で洗浄する工程。アルカリ金属水酸化物は、例えば、NaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物であり得る。
本明細書で使用される場合、「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含有する(containing)」、「有する(having)」等の用語は、米国特許法でそれらに帰する意味を有することができ、「含む(includes)」、「含んでいる(including)」等を意味することができる;「から本質的になる」又は「本質的になる」は同様に米国特許法に帰する意味を有し、その用語はオープンエンドであり、記載されたものの基本的な又は新規の特徴が、記載されている以上の存在によって変化しないが、先行技術の実施形態を除外する限り、記載されている以上の存在を許容する。
一態様では、本発明は、a)〜c)の工程を含む、分離マトリックスの調製方法を開示する。この方法は、調製中又は調製直後に、非共有結合プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを分離マトリックスから除去する方法として説明することもできる。そのため、それは共有結合アルカリ安定プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを含み、非共有結合プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドが実質的に無い分離マトリックスの調製方法でもある。
多孔質担体粒子は、任意の適切な周知の種類のものであり得る。従来のアフィニティ分離マトリックスは、多くの場合、有機性であり、使用される水性媒体に親水性表面を曝すポリマー、すなわち、それらの外部表面上及び存在する場合は更に内部表面上のヒドロキシ(-OH)、カルボキシ(-COOH)、カルボキサミド(-CONH2、おそらくN-置換型で)、アミノ(-NH2、おそらく置換型で)、オリゴ又はポリエチレンオキシ基を曝すポリマーに基づいている。担体粒子の多孔質の性質は、それらの内部がリガンド及び免疫グロブリンにアクセス可能であることを意味する。定量的には、多孔質の性質は、逆サイズ排除クロマトグラフィーによって、例えば、Gel Filtration Principles and Methods、Pharmacia LKB Biotechnology 1991、6〜13頁に記載される方法に従って測定されたKav又はKd値(特定のサイズのプローブ分子が利用できる細孔容積の割合)として表すことができる。Kavは、比(Ve-V0)/(Vt-V0)として決定され、ここで、Veはプローブ分子(例:Dextran 110kD)の溶出容量であり、V0はカラムのボイド容量(例えば、未加工デキストラン等の高Mwボイドマーカーの溶出容量)であり、Vtはカラムの総容量である。Kdは、(Ve-V0)/Viとして決定でき、ここで、Viは、マトリックス容量(マトリックスポリマー分子が占める容量)を除くすべての容量にアクセスできる塩(例えば、NaCl)の溶出容量である。定義により、Kd値とKav値の両方は常に0から1の範囲内にある。Kav値は、Mw 110kDaのデキストランをプローブ分子として用いて測定した場合、有利に0.6〜0.95であってよく、例えば、0.7〜0.90又は0.6〜0.8であってよい。Mw 110kDaのデキストランを用いて測定したKd値は、適切には、0.68〜0.85又は0.70〜0.85等、0.68〜0.90であってよい。このことの利点は、担体が、リガンド及びリガンドに結合する免疫グロブリンの両方を収容することができ、免疫グロブリンの結合部位への及び結合部位からの大量輸送を提供することができる、細孔の大部分を有することである。或いは、担体粒子は、Mw 110kDaのデキストランについてのKd値が0.1未満又は0.05未満である場合のように、本質的に非多孔質であり得る。そのような粒子は、主に分析分離に関して興味深く、1〜10又は1〜5マイクロメートル等、10マイクロメートル未満の体積加重メジアン径(d50、v)を有する可能性がある。
アルカリ安定プロテインAリガンドは、IgGへの結合能力がインキュベーション前のIgG結合能力と比較して45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.5又は0.1M NaOHとのインキュベーションに耐えることができ得る。IgG結合能力の減少は、例えば20%未満又は10%未満等、45%未満が適切であり得る。これは、表面プラズモン共鳴(SPR)チップ、例えばUS20170334954に記載されているようなBiacore CM5センサーチップ(GE Healthcare Bio-Sciences AB社)に、例えばNHSカップリング化学を使用して、リガンドを結合させ、Biacore機器(GE Healthcare Bio-Sciences AB社)内でチップの免疫グロブリン結合能力を、典型的にはポリクローナルヒトIgGを使用して、チップのインキュベーションの前後に0.5M NaOHで100×10分間サイクルで測定することにより適切に測定することができる。或いは、アルカリ安定性は、共有結合したリガンドを含む分離マトリックスが、インキュベーション前のIgG結合能力と比較したIgGに対する結合能力の20%未満の減少で、22+/-2℃で100×15分間の0.5M又は0.1M NaOHとのインキュベーションに耐えることができると定義できる。IgG結合能力の減少は、適切には15%未満、例えば10%未満又は5%未満であり得る。US20170334954に記載されるように、2.4又は6分の滞留時間で10%ブレイクスルー動的能力(Qb10%)を測定することにより、評価を行うことができる。
アルカリ安定プロテインLリガンドは、PpLの1つ又は複数の変異IgG結合ドメインを適切に含むことができる。ネイティブPpLドメインは、ドメインB1(配列番号149)、ドメインB2(配列番号150)、ドメインB3(配列番号151)、ドメインB4(配列番号152)、ドメインB5(配列番号153)、ドメインC1(配列番号168)、ドメインC2(配列番号169)、ドメインC3(配列番号170)、ドメインC4(配列番号171)及びドメインD1(配列番号172)である。変異は、1つ又は複数のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基による置換を含むことができるが、他の変異もまた可能である。アルカリ安定プロテインLリガンドの構造は、典型的には、タンパク質L'-(ドメイン' -S ')n-T'であり、ここでL'はN末端を含む1〜10アミノ酸リーダー配列であり、ドメイン'は(変異)IgG結合ドメインであり、S'は任意選択の1〜15アミノ酸スペーサー配列であり、nは1〜10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10等、例えば3〜7又は4〜6であり、T'は、0〜10アミノ酸テール配列であり、C末端を含む(T'に少なくとも1つのアミノ酸残基がある場合)。
アルカリ安定プロテインGリガンドは、SpGの1つ又は複数の変異IgG結合ドメインを適切に含むことができる。変異は、1つ又は複数のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基による置換を含むことができるが、他の変異もまた可能である。アルカリ安定プロテインGリガンドの構造は、典型的には、タンパク質L''-(ドメイン'' -S'')n-T''であり、ここでL''はN末端を含む1〜10アミノ酸リーダー配列であり、ドメイン''は(変異)IgG結合ドメインであり、S''は任意選択の1〜15アミノ酸スペーサー配列であり、nは1〜10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10等、例えば3〜7又は4〜6であり、T''は、0〜10アミノ酸テール配列であり、C末端を含む(T''に少なくとも1つのアミノ酸残基がある場合)。
およそ130mLのアルカリ安定プロテインAマトリックスプロトタイプは、L=AQGT(配列番号142)、ドメイン=配列番号11及びT=C末端システインである構造L-(ドメイン)6-Tを有する六量体の高度アルカリ安定リガンドを、高架橋アガロースビーズにカップリングさせることにより調製された。カップリングの前にビーズをエピクロロヒドリンでエポキシ活性化し、US6399750に記載されるようにカップリングを行った。カップリング後のリガンド含量は18mg/mlマトリックスであり、固定化後、ゲルを1ゲル容量の蒸留水で2回洗浄した。
使用した多孔質担体粒子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるUS6602990の方法に従って調製された62マイクロメートル(体積加重、d50V)メジアン径の硬質架橋アガロースビーズであり、孔径は、Gel Filtration Principles and Methods、Pharmacia LKB Biotechnology 1991、6〜13頁に記載の方法に従って、Mw 110kDaのデキストランについて逆ゲル濾過クロマトグラフィーKav値0.70に相当する。
50mlファルコンチューブ内の20mLのリガンド溶液(50mg/mL)に、169mgのNaHCO3、21mgのNa2CO3、175mgのNaCl及び7mgのEDTAを添加した。ファルコンチューブをローラーテーブルに5〜10分間置き、77mgのDTEを添加した。還元は45分以上進行させた。次に、リガンド溶液をSephadex G-25を充填したPD10カラムで脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含量を、276nmのUV吸収を測定することにより決定した。
アフィニティ分離マトリックスのIgG結合能力に対する異なる洗浄溶液の影響
プロトタイプマトリックスの10mlフィルターケーキから10%ゲルスラリーを調製し、90.0mLの20%エタノール(90×0.97=87.3g)を添加した(20%エタノールの密度は0.97g/mL)。その後、Gilsonロボットを用いて96ウェルフィルタープレート(GE Healthcare社)に、スラリーを分注し、200μLスラリー/ウェル(20μLゲル/ウェル)とした。その後、プレートを真空で排水した。フィルタープレートの底を密閉し、互換性研究用の溶液を200μL/ウェルのフィルタープレートにピペットで移した。その後、プレートを室温(22+/-2℃)で18時間一晩保存した。真空を使用して溶液を除去し、ウェルをPBS緩衝液で約10×200μL洗浄し、最後の排水を500gで1分間の遠心分離により行った。
アフィニティ分離マトリックスからの未結合リガンドの除去に対する異なる洗浄溶液の影響
上記のようにして、プロトタイプマトリックスの(水中の)10%ゲルスラリーを、Gilsonロボットを用いて、96ウェルフィルタープレート(GE Healthcare社)に、200μLスラリー/ウェル(20μLゲル/ウェル)で調製した。その後、プレートを真空で排水した。フィルタープレートの底を密閉し、洗浄効率研究用の溶液を200μL/ウェルでフィルタープレートにピペットで移した。その後、プレートを室温(22+/-2℃)で、1時間、1200rpmで振とうしながら保存した。1分間、500gの遠心分離を使用して溶液を除去し、上記の洗浄効率研究用の溶液を用いてプレートを再び調製した。溶出溶液をLC-MS(Zorbax 300SB-C8 2.1×50mmカラムを備えたWater社のAquity UPLCシステム及びWaters社のXevo G2 Q-TOF MS)で試験して、総イオン電流(TIC)及び溶液中の遊離リガンドで調製した較正曲線としてのリガンド濃度を決定した。LC-MS法の詳細は以下の通りである:
緩衝液B: 80:20のアセトニトリル:2-プロパノール中に0.1%ギ酸及び0.05%TFA
時間:0〜12分
極性:正
アナライザーモード:解像度
m/z範囲:50〜4000
スキャン時間:1秒
衝突エネルギー:なし
クロマトグラムの各ピークについてのMwの決定は、MassLynxソフトウェア中に提供されたMaxEnt1関数によって行った。
0.5M及び1M NaOH:150μLのサンプル+20μLの1Mジチオトレイトール(DTT)&2M Tris HCl&10%ギ酸+2.5μLのギ酸
0.1M NaOH:200μLのサンプル+20μLの1M DTT&2M Tris-HCl
0.05M NaOH:200μLのサンプル+10μLの1M DTT&2M Tris-HCl
0.5M酢酸pH2.5:150μLのサンプル+15μLの1M DTT&2M Tris pH8.5+5μLの50% NaOH
0.1M HAc+40% EtOH:200μL溶液+20μLの1M DTT+2M Tris塩基(NaOH後の最初の洗浄はpH13〜14、したがってサンプル調製は異なる方法で行われる:たとえば、200μLサンプル+ + 10μLの1M DTT+2M Tris HCl)
0.5M HAc+40% EtOH:200μL溶液+20μLの1M DTT+2M Tris塩基+2.5μLの50% NaOH
0.025M NaAc pH5:200μLのサンプル+20μLの1M DTT&2M Tris塩基
MQ:200μLのサンプル+20μLの1M DTT及び2M Tris-HCl
上記のサンプルとは別に、残りのサンプルは0.025M NaAcと同じサンプル調製、つまり200μLのサンプル+20μLの1M DTT及び2M Tris塩基であった。
全ての中和されたサンプルを37℃で30分間インキュベートし、LC-MSに注入した。
NaOH溶液及びHAc/EtOH溶液間の除去効率の比較
プロトタイプマトリックスをガラスフィルターファネル(no 3)から排出し、0.7〜0.8g(mL)のフィルターケーキのアリコートを空の10mlプラスチックカラム(PD-10、GE Healthcare社)に充填した。10分のサイクル(5サイクル、Table 2(表2)を参照)のインキュベーション後、溶出液を収集し、サンプルを上記のようにLC-MSにより分析した。液体の完全な除去のために、シリンジを使用して空気圧をカラムに加えて、各カラム内の樹脂を排水した。
NaOH洗浄、続いてHAc/EtOH及びNaAc洗浄
実施例3を、50又は100mM NaOHのいずれかで10回の洗浄サイクル、100mM HAc+40% EtOHの3サイクル及び25mM NaAc、pH5で5サイクルのシーケンスで繰り返し、その後、20%EtOH保存水溶液に移した。
リガンド漏れ-従来のHAc及び緩衝液洗浄との比較
リガンド漏れ試験方法
2.0mLのゲル沈殿物を、20%エタノール+0.2M NaClをパッキング液として用い、パッキングフローを3.5mL/minとして、5×100mm Tricorn 5/100カラム(GE Healthcare社)に充填した。ベッドの高さは9.7cmであった。カラムを0,020M NaH2PO4、pH7.0(A-緩衝液)で平衡化し、6分間の滞留時間でA-緩衝液に16.65CV 2g/LポリクローナルヒトIgG溶液(Octapharma Gammanorm社)をロードし、続いてA-緩衝液で3CV洗浄し、IgGを5CVの0.1Mグリシン、pH3.0(B-緩衝液)で溶出し、溶出液をELISAでの後の分析のために収集した。IgGを含有する溶出液をプールし、プール内の漏れリガンドの濃度を、プロテインAのELISAイムノ分析(Repligen社 #9000-1)で測定した。
Claims (43)
- a)固体担体及び細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来するアルカリ安定リガンドを用意する工程;
b)前記アルカリ安定リガンドを前記固体担体と反応させて、共有結合アルカリ安定リガンドを有する分離マトリックスを形成する工程;並びに
c)共有結合アルカリ安定リガンドを有する前記分離マトリックスを、少なくとも10mMのアルカリ金属水酸化物、例えばNaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物を含む洗浄溶液で洗浄する工程を含む、分離マトリックスの調製方法。 - 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインAリガンドである、請求項1に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインLリガンドである、請求項1に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインGリガンドである、請求項1に記載の方法。
- 前記固体担体が、複数の多孔質担体粒子等の複数の担体粒子を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)が、少なくとも1回繰り返される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)が、少なくとも5回繰り返される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)の後に、前記分離マトリックスを保存溶液に移す工程d)を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)の後に、前記分離マトリックスを輸送容器に分配する工程を更に含む、請求項8に記載の方法。
- 工程c)が、工程b)の後24時間以内に行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)において、前記洗浄溶液が、25mM〜1Mのアルカリ金属水酸化物、例えば、NaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)において、前記洗浄溶液が、40mM〜1Mのアルカリ金属水酸化物、例えば90mM〜0.5Mのアルカリ金属水酸化物、又は50〜200mMのアルカリ金属水酸化物を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)において、前記洗浄溶液が、40mM〜1M NaOH又はKOH、例えば90mM〜0.5M NaOH若しくはKOH、又は50〜200mM NaOH若しくはKOHを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)において、前記分離マトリックスが、2〜60分間、例えば5〜30分間、洗浄溶液でインキュベートされる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- インキュベーション後、前記洗浄溶液が濾過により除去される、請求項14に記載の方法。
- 工程c)において、温度が、2〜40℃、例えば15〜30℃又は20〜25℃である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の前に、前記固体担体を活性化する工程a')を更に含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a')が、前記固体担体上でのアルデヒド基の形成を含む、請求項17に記載の方法。
- 工程a')が、前記固体担体上でのエポキシド基の形成を含む、請求項17に記載の方法。
- 工程b)の後、前記分離マトリックスが、残留エポキシド基を含む、請求項19に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、前記アルデヒド基又はエポキシド基と反応することができるリジン残基を含む、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、前記エポキシド基と反応することができるチオールを持つシステイン残基を含む、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記システイン残基が、細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドのC末端又はN末端に近接する、請求項22に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、IgGへの結合能力において45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.1M NaOHでのインキュベーションに耐えることができる、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、IgGへの結合能力において45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.5M NaOHでのインキュベーションに耐えることができる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインAドメインを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインAドメインの多量体を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多量体が、少なくとも4つのアルカリ安定プロテインAドメインを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記多量体が、少なくとも6つのアルカリ安定プロテインAドメインを含む、請求項27又は28に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインLドメインを含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインAドメインの多量体を含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインGドメインを含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインGドメインの多量体を含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体担体が、架橋多糖を含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体担体が、架橋寒天又はアガロースを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離マトリックスが、マトリックス1mLあたり少なくとも11mgの共有結合リガンド、例えばマトリックス1mLあたり少なくとも15mgの共有結合リガンドを含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)の後、前記分離マトリックスが、IgG溶出物プールにおけるELISA分析によって測定して、IgG1mgあたり40ng未満のリガンドのリガンド漏れを生じる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 非共有結合プロテインAリガンドを前記分離マトリックスから除去する方法である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離マトリックスの調製中に非共有結合プロテインAリガンドを前記分離マトリックスから除去する方法である、請求項38に記載の方法。
- 細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する共有結合アルカリ安定リガンドを含み、前記細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する非共有結合リガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 共有結合アルカリ安定プロテインAリガンドを含み、非共有結合プロテインAリガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 共有結合アルカリ安定プロテインLリガンドを含み、非共有結合プロテインLリガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 共有結合アルカリ安定プロテインGリガンドを含み、非共有結合プロテインGリガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
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Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000500649A (ja) * | 1995-11-07 | 2000-01-25 | アメルシャム・ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ | IgG分離媒体および新規プロテインA変異体 |
WO2011118699A1 (ja) * | 2010-03-24 | 2011-09-29 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
WO2015046473A1 (ja) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 株式会社カネカ | アルカリ水溶液を用いた多孔質セルロースビーズの製造方法、リガンド固定化用担体および吸着体 |
JP2016079149A (ja) * | 2014-10-21 | 2016-05-16 | 株式会社プロテイン・エクスプレス | プロテインl変異体 |
JP2016079153A (ja) * | 2014-10-21 | 2016-05-16 | 株式会社プロテイン・エクスプレス | プロテインg変異体 |
JP2017037070A (ja) * | 2015-08-10 | 2017-02-16 | 三菱化学株式会社 | 分離剤及び液体クロマトグラフィー用カラム |
WO2017194592A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Method of storing a separation matrix |
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Patent Citations (8)
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---|---|---|---|---|
JP2000500649A (ja) * | 1995-11-07 | 2000-01-25 | アメルシャム・ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ | IgG分離媒体および新規プロテインA変異体 |
WO2011118699A1 (ja) * | 2010-03-24 | 2011-09-29 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
WO2015046473A1 (ja) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 株式会社カネカ | アルカリ水溶液を用いた多孔質セルロースビーズの製造方法、リガンド固定化用担体および吸着体 |
JP2016079149A (ja) * | 2014-10-21 | 2016-05-16 | 株式会社プロテイン・エクスプレス | プロテインl変異体 |
JP2016079153A (ja) * | 2014-10-21 | 2016-05-16 | 株式会社プロテイン・エクスプレス | プロテインg変異体 |
JP2017037070A (ja) * | 2015-08-10 | 2017-02-16 | 三菱化学株式会社 | 分離剤及び液体クロマトグラフィー用カラム |
WO2017194592A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Method of storing a separation matrix |
WO2017194594A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
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