JP2020509928A - 分離マトリックス及び抗体を分離する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同義で使用され、抗体の断片、抗体又は抗体断片を含む融合タンパク質及び抗体又は抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
配列番号8
KEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号9
KEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
配列番号10
KEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
a)プロセスフィードを、少なくとも第1の上記で開示されているクロマトグラフィーカラムに通して、フィードから抗体を吸着する工程(プロセスフィードは、例えば、少なくとも1mg/ml〜2mg/ml又は少なくとも4mg/mlの抗体、例えば4mg/ml〜15mg/ml、4mg/ml〜10mg/ml又は4mg/ml〜5mg/ml等を含んでもよく、かつ/又はこの工程での滞留時間は、例えば、2分未満、例えば0.3分〜1分又は0.3分〜0.8分等であってもよい)、
b)任意に、第1のクロマトグラフィーカラムを洗浄する工程、
c)溶離液を第1のクロマトグラフィーカラムに通して、抗体を溶離する工程、及び
d)抗体を含む溶離液を回収する工程
を含む。
工程a)の後、工程a')において、プロセスフィードを第2のクロマトグラフィーカラム12に向け直し、第2のクロマトグラフィーカラムからの溶出液に、第1及び第2のカラムと同じ分離マトリックスを充填した第3のクロマトグラフィーカラム13を通過させ、
工程a')の後、工程a'')において、プロセスフィードを第3のクロマトグラフィーカラム13に向け直し、第3のクロマトグラフィーカラムからの溶出液を、第1のクロマトグラフィーカラム11に通過させ、
工程a'')の前に工程c)を実施し、
工程a')の後、工程c')において、溶離液を第2のクロマトグラフィーカラム12に通して、抗体を溶離し、
工程a'')の後、工程c'')において、溶離液を第3のクロマトグラフィーカラム13に通して、抗体を溶離し、
工程a)、a')、a'')、c)、c')及びc'')の順番を1回又は複数回、任意に反復する。
ベースマトリックス
使用したベースマトリックスは、硬質架橋アガロースビーズの17〜50μm(体積加重、d50V)中央直径(Malvern Mastersizer 2000レーザー回折機器で測定)のふるい画分試料セットであり、US6602990の方法に従って調製され、「Handbook of Process Chromatography, A Guide to Optimization, Scale-Up and Validation」(1997)Academic Press、San Diego、Gail Sofer & Lars Hagel編、ISBN 0-12-654266-X、368頁に記載の方法に従って、0.2MのNaCl中、プローブ分子としてある範囲のデキストラン画分とともにプロトタイプを充填したHR10/30カラム(GE Healthcare)(流速0.2mL/分)を使用して、Mwが110kDaのデキストランに対する逆ゲル濾過クロマトグラフィーKd値0.50〜0.82に対応する細孔径を有していた。ベースマトリックスプロトタイプをふるいにかけて、所望の粒径分布を得た。
100mlのベースマトリックスをガラスフィルターにおいてゲル体積の10倍量の蒸留水で洗浄した。ゲルを計量し(1g=1ml)、撹拌機を用いて250mlフラスコ中で30mlの蒸留水及び8.08gのNaOH(0.202mol)と混合した。温度は水浴中で27±2℃に調整した。16mlのエピクロロヒドリン(0.202mol)を、90±10分の間、激しく撹拌しながら(約250rpm)添加した。反応を更に80±10分間継続させ、次いで、中性pHに達するまで、ガラスフィルターにおいてゲル体積の10倍を超える量の蒸留水でゲルを洗浄した。この活性化されたゲルを、下記の通り結合に直接使用した。
0.5、1、2、4及び6分の滞留時間でのポリクローナルヒトIgGについてのQb10%動的容量を、下記に概略を述べるように決定した。
平衡化バッファー中で2mg/mlまで希釈したGammanorm 165mg/ml(Octapharma)。
PBSリン酸バッファー20mM+0.15M NaCl、pH7.4
PBSリン酸バッファー20mM+0.15M NaCl、pH7.4
100mM酢酸 pH2.9
0.5ml又は1mlの樹脂をTRICORN(商標)5/50カラムに充填した(層高2.5〜5cm)。AKTAExplorer 10システムを用いて、0.5〜6分の滞留時間で、当該の樹脂体積にとって望ましい滞留時間に応じて流速を調整して、破過容量を決定した。安定なベースラインが得られるまで、平衡化バッファーをバイパスカラムに流した。これは自動ゼロ点調整の前に行った。100%のUVシグナルが得られるまで、試料をカラムにアプライした。次いで、安定なベースラインが得られるまで平衡化バッファーを再びアプライした。
2 円筒形充填床
3 入口ネット/フリット
4 出口ネット/フリット
5 入口分散板構造
6 出口分散板構造
7 入口
8 出口
10 クロマトグラフィーシステム
11 第1のクロマトグラフィーカラム
12 第2のクロマトグラフィーカラム
13 第3のクロマトグラフィーカラム
14, 15, 16 接続ライン
17, 18, 19 オン/オフバルブ
20 フィードポンプ
21 第1の検出器
22 第1のバルブブロック
23 バッファーポンプ
24 第2の検出器
25 第2のバルブブロック
26 第3の検出器
27, 28, 29 バルブ
30 第4の検出器
31 バルブ
32 判定ユニット
33 制御ユニット
Claims (29)
- 抗体結合タンパク質リガンドが共有結合により固定化された多孔質粒子を含む分離マトリックスであって、前記リガンドの密度が5mg/mlより高く、前記多孔質粒子の体積加重中央直径が10μm以上30μm未満であり、前記多孔質粒子が有する、分子量110kDaのデキストランに対するKDとして表されるゲル相分配係数が、0.5〜0.9である、分離マトリックス。
- 前記リガンドの密度が、5mg/ml〜25mg/mlの範囲内、例えば11mg/ml〜20mg/ml等である、請求項1に記載の分離マトリックス。
- 前記多孔質粒子が有する、分子量110kDaのデキストランに対するKDとして表されるゲル相分配係数が、0.6〜0.85である、請求項1又は2に記載の分離マトリックス。
- 前記多孔質粒子が、球状である、請求項1から3のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- 前記多孔質粒子が、架橋多糖を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- 前記多孔質粒子が、架橋アガロースを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- アガロースが、ゲル化の前にアリル化されている、請求項6に記載の分離マトリックス。
- 前記リガンドが、Fc結合タンパク質を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- 前記Fc結合タンパク質が、プロテインAである、請求項8に記載の分離マトリックス。
- 前記リガンドが、プロテインAドメインの単量体、二量体又は多量体を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- 前記ドメインの1つ又は複数が変異している、請求項10に記載の分離マトリックス。
- 前記ドメインの1つ又は複数が、プロテインZ又はプロテインAのB若しくはCドメインに由来し、23位のアミノ酸残基がトレオニンである、請求項11に記載の分離マトリックス。
- 前記ドメインの1つ又は複数が、配列番号8、9若しくは10によって規定される、又は前記配列番号に対して少なくとも90%若しくは少なくとも95若しくは98%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項10から12のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- 20±2℃で0.5MのNaOH中での5時間のインキュベーション後に、その元の結合容量の少なくとも95%を保持する、請求項1から13のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- 前記マトリックスが、0.5分の滞留時間で少なくとも20mg/ml、例えば少なくとも30mg/ml等の動的IgG容量q10%を有する、請求項8から14のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の分離マトリックスを含む、クロマトグラフィーカラム(1)。
- 前記分離マトリックスの充填床(2)を含み、前記充填床が、5cm又は10cmまで、例えば2cm〜5cm、2cm〜4cm又は2cm〜3cm等の層高(h)を有する、請求項16に記載のクロマトグラフィーカラム。
- 複数の請求項16又は17に記載のクロマトグラフィーカラム(11、12、13)を含む、クロマトグラフィーシステム(10)。
- 前記複数のクロマトグラフィーカラムが、並列に連結されている、請求項18に記載のクロマトグラフィーシステム。
- 連続クロマトグラフィーを実施するように配置されている、請求項18に記載のクロマトグラフィーシステム。
- 液体が、1つのカラムから後続のカラム及び最後のカラムから第1のカラムに流れることができるように、同じ分離マトリックスを充填し、1つ又は複数の接続ライン(14、15、16)と接続された、少なくとも2つの、例えば少なくとも3つの請求項16又は17に記載のクロマトグラフィーカラム(11、12、13)を含み、2つのカラムの間の各接続ラインが、少なくとも1つのオン/オフバルブ(17、18、19)を備える、請求項18又は20に記載のクロマトグラフィーシステム(10)。
- アフィニティクロマトグラフィーによる抗体の分離方法であって、
a)プロセスフィードを、少なくとも第1の請求項16から17のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーカラムに通して、前記フィードから抗体を吸着する工程、
b)任意に、前記第1のクロマトグラフィーカラムを洗浄する工程、
c)溶離液を前記第1のクロマトグラフィーカラムに通して、抗体を溶離する工程、及び
d)抗体を含む前記溶離液を回収する工程
を含む、方法。 - 請求項18から20のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーシステムにおいて行われる、請求項22に記載の方法。
- 工程a)において、前記第1のクロマトグラフィーカラムからの溶出液を、第1のカラムと同じ分離マトリックスを充填した第2のクロマトグラフィーカラムに通過させ、
工程a)の後、工程a')において、プロセスフィードを第2のクロマトグラフィーカラムに向け直し、第2のクロマトグラフィーカラムからの溶出液を、第1及び第2のカラムと同じ分離マトリックスを充填した第3のクロマトグラフィーカラムに通過させ、
工程a')の後、工程a'')において、プロセスフィードを第3のクロマトグラフィーカラムに向け直し、第3のクロマトグラフィーカラムからの溶出液を、第1のクロマトグラフィーカラムに通過させ、
工程a'')の前に工程c)を実施し、
工程a')の後、工程c')において、溶離液を第2のクロマトグラフィーカラムに通して、抗体を溶離し、
工程a'')の後、工程c'')において、溶離液を第3のクロマトグラフィーカラムに通して、抗体を溶離し、
工程a)、a')、a'')、c)、c')及びc'')の順番を1回又は複数回、任意に反復する、
請求項22又は23に記載の方法。 - 工程a)において、滞留時間が2分未満、例えば、0.3分〜1分又は0.3分〜0.8分等である、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)、a')及びa'')において、滞留時間が2分未満、例えば、0.3分〜1分又は0.3分〜0.8分等である、請求項24に記載の方法。
- 前記プロセスフィードは、少なくとも4mg/mlの、例えば4mg/ml〜15mg/ml又は4mg/ml〜10mg/ml等の抗体を含む、請求項22から26のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)、c')及びc'')の後にそれぞれ、クリーニング液を前記第1、第2及び第3のクロマトグラフィーカラムに通す工程を含む工程e)、e')及びe'')を更に含む、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クリーニング液が、少なくとも0.1Mのアルカリ、例えばNaOH等を含む、請求項28に記載の方法。
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