CN116899633B - 一种亲水阴离子交换层析介质及其制备方法与应用 - Google Patents
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- B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
Abstract
本发明涉及层析技术领域，尤其涉及一种亲水阴离子交换层析介质及其制备方法与应用，该亲水阴离子交换层析介质包括多孔基材，以及交联在所述多孔基材的外表面和内部孔道侧壁的交联层，所述多孔基材的平均孔径为0.4~4μm，孔隙率为50~80%，所述交联层包括胍基聚合物；所述亲水阴离子交换层析介质的交联增重率为31~48%。本发明将接枝有胍基基团的胺基多聚物引入至耐盐阴离子交换层析介质中，由此得到的含胍基聚合物层析膜能够在大的pH值范围、高离子强度和不同缓冲液中观察到HCP的还原和病毒清除，表现出优异的耐盐性阴离子交换吸附功能，在用于生物制造纯化工艺中时，可以不稀释料液直接流穿除杂，提高了纯化工艺的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及层析技术领域，尤其涉及一种亲水阴离子交换层析介质及其制备方法与应用。
背景技术
阴离子交换色谱（AEX）常用于生物制药的纯化过程，用以去除带负电荷的宿主细胞蛋白（HCP）和病毒。然而，由于色谱柱通常会使用数十到数百个净化周期，生物制造商必须考虑使用过程中发生的降解问题，无疑增加了运营和监管成本。传统微球层析主要依靠树脂扩散来实现传质，需要较长的停留时间才能达到良好的结合能力。而膜层析则依赖于对流传质，能够实现高流速操作。由于结合位点密度的限制，传统的高渗透性膜结构在短的停留时间内，表现出适度的结合能力。对流膜层析通过凝聚填充膜，或者静电纺丝技术制备高比表面积基材，使离子交换膜具有高动态负载能力，因此对流膜层析成为了高效、一次性净化平台的选择。
Natrix Q色谱膜是离子交换膜的一种，Natrix Q色谱膜实现高结合能力和短停留时间的关键在于其采用了高密度惰性无纺布增强的多孔网状骨架和含有官能团的多孔水凝胶层。聚丙烯酰胺水凝胶创造了一个大的三维表面积，并具有相互连接的孔隙，包含10至3000 nm之间的“大孔隙”，高密度的官能团位于支撑结构的孔隙内，使得对流通道实现高流速。水凝胶中高密度的结合位点以及大孔结构，使蛋白质、病毒和DNA等大分子具有大量的结合位点。然而由自由基聚合反应制备的聚合物水凝胶容易导致复合材料中的孔隙率和孔径分布难以控制。同时，由于盐离子会屏蔽电荷，当盐浓度升高时，季(“Q”)铵功能阴离子树脂及其配体的相互作用减弱，这种减弱的相互作用通过静电筛选介质上的正电荷基团来实现，从而减少了纯静电相互作用，导致高盐浓度仅能实现较低的蛋白质结合量。因此，当其被设计用在生物制药的下游纯化工艺中时，需要在进行阴离子层析步骤之前，稀释产品以降低蛋白质溶液的离子强度，并将料液调节至最佳工艺性能所需的最佳条件。然而，这些步骤通常耗费大量时间、水和劳力。
目前，有现有技术在基底或者膜上通过自由基反应接枝含有胍基官能团的物质，由此得到可用于从生物样品中选择性结合以除去生物材料如核酸、宿主细胞蛋白质、内毒素和病毒的官能化基底。但是胍基官能团是通过自由基接枝反应引入至基底上，自由基反应容易引发多种副反应，导致产物的复杂性增加，且反应条件苛刻，并不利于对胍基官能团引入数量密度的控制。由于胍基官能团通过聚合物的形式的引入，基底上聚合物的接枝量会影响到基底的吸附载量和通量，且基底孔洞的孔径大小、数量以及孔洞的形状等因素都会对层析精度、流速等性质产生较大的影响。
如今市场上常用的基底材料为聚丙烯、聚酯、聚酰胺和其他合成材料材质，这种材质的多孔基底具有通量高，机械强度优异的效果，但是在面对生物制药的纯化过程，用以去除带负电荷的宿主细胞蛋白（HCP）和病毒时，由于基底本身的疏水性能导致其对于蛋白具有较高的吸附性能，从而通量衰减剧烈，蛋白回收率较低。因此现有技术中的层析介质的缺点为：在高浓度盐缓冲液体系下，由于减少了纯静电相互作用，仅能实现较低的蛋白质结合量且在使用过程中容易发生通量骤减的情况。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中用于生物制药纯化过程的阴离子交换层析介质耐盐性较差，无法在大的pH值范围以及高离子强度条件下有效吸附带负电荷的宿主细胞蛋白和病毒，因此本发明提供了一种亲水阴离子交换层析介质及其制备方法以克服上述不足之处。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本申请首先提供了一种亲水阴离子交换层析介质，包括多孔基材，以及交联在所述多孔基材的外表面和内部的交联层，所述多孔基材的平均孔径为0.4~4 μm，孔隙率为50~80%，所述交联层包括胍基聚合物；所述亲水阴离子交换层析介质的交联增重率为31~48 %。
本发明中的胍基聚合物指接枝有胍基基团的胺基多聚物，其中胍基基团中同时含有伯胺和仲胺基团，是具有高胺基密度的基团。本发明以交联的方法将胍基聚合物引入至层析介质表面和孔道内，在多孔基材的外表面和内部孔道侧壁形成交联层，交联层包括胍基聚合物和用于交联胍基聚合物的交联剂，从而能够引入高密度的胺基数量，能提供比现有产品中的阴离子交换膜高很多的耐盐性伯或仲胺配基；并且胍基具有高pKa(13.6)，几乎在所有生物纯化环境中都具有共振离域正电荷，能够形成多个共面氢键对组。独特的氢键与带负电荷的蛋白质羧酸残基之间形成坚固的盐桥氢键相互作用。胍基与羧酸酯残基牢固结合的独特能力，使含胍基聚合物层析膜能够在大的pH值范围、高离子强度和不同缓冲液中观察到HCP的还原和病毒清除。与常用的Q -功能柱树脂相比，在pH和电导率高达20 mS/cm的广泛范围内，含有胍基聚合物的混合一次性阴离子层析膜在许多单价和多价缓冲液中显示出强大的HCP还原性。因此，本发明的亲水阴离子交换层析介质不仅有耐盐性阴离子交换吸附功能，而且吸附载量更高。
交联增重率是指交联层的质量（m1）与阴离子交换层析介质质量(m0+m1)的比值，可以通过简单称重计算，其中m0是多孔基材的质量，交联增重率：CW=m1/(m0+m1) ×100%。
胍基聚合物链与多孔基材表面结合，灵活的胍基聚合物链向孔内空间伸展，伸展的具有立体结构的胍基聚合物链可提供三维吸附空间，提高蛋白质吸附位点的可利用率。交联增重率的大小可以反应层析介质上胍基官能团的数量，从而体现层析介质的吸附能力。
由于本发明中的阴离子交换层析介质，主张应用在层析领域，若所使用的层析基质孔径过小，将不利于与基质不发生作用的小分子量蛋白质透过，且易造成堵塞；若孔径过大，在实际应用中，有些目标吸附蛋白，将不能充分的与层析介质表面吸附基团接触，造成蛋白质流穿，从而影响分离效果。发明人在实验过程中发现，基材本身的结构对交联增重率以及后续的通量具有一定的影响，例如由于制备的胍基聚合物涂层具有粘度，当多孔基材的平均孔径较小时，涂层大多都覆盖在基材的表层，或较少部分进入到内部后堵塞通孔，导致难以继续渗透，造成后续测得的交联增重率值不高。平均孔径较大时，虽然通量会明显提高，但是会导致多孔基材的截留效率降低，使得一些不期望的杂质无法被去除，还会影响到多孔基材的比表面积，导致可交联的总面积减小，交联增重率不够，载量效果不好。孔隙率的变化会影响到涂层与多孔基材内部表面的接触大小以及多孔基材的整体强度，孔隙率较低使得多孔基材上可负载的胍基聚合物明显降低，而孔隙率较高又会难以保证层析介质的耐压效果。
发明人在实验过程中还发现仅仅控制交联增重率也无法获得载量和通量都理想的阴离子交换层析介质，因为在交联过程中胍基聚合物会使得介质的表面孔径和孔隙率变小，以及在阴离子交换层析介质在使用过程中主要通过吸附的作用去除流体中的宿主细胞蛋白（HCP）和病毒，都会对层析介质的通量造成不好的影响。
通过多次实验最终确定选择平均孔径为0.4~4 μm，孔隙率为50~80 %的多孔基材作为胍基聚合物的交联载体，控制交联增重率为31~48%时，层析介质可以用于医药纯化领域，去除宿主细胞蛋白（HCP）和病毒。当交联增重率大于48 %时，胍基聚合物链密度显著影响蛋白质传递，通量较低；当交联增重率小于31 %时，层析介质上交联的胍基聚合物较少，很难维持三维吸附空间，用于蛋白质吸附位点明显不足，导致层析介质载量低。
作为优选，所述多孔基材为泡沫、纤维、膜、织造织物或非织造织物。
进一步优选，所述多孔基材的材质为聚醚砜（PES）、聚偏氟乙烯（PVDF）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚乙烯（PE）、再生纤维素或醋酸纤维素。
所述多孔基材厚度为50~500 μm。
所述平均孔径、孔隙率和膜厚度可以通过使用扫描电子显微镜对膜结构进行形貌表征后，再利用计算机软件(如Matlab、NIS-Elements等)或手工进行测量后计算测得，上述方法只是举例，还有其它相关测试方法为本领域技术人员熟知，以上方法仅供参考。
作为优选，所述亲水阴离子交换层析介质外表面氧元素含量为9~19%，水接触角为30~49°。
采用X射线光电子能谱（型号：Thermo Kalpha）对层析介质表面的氧含量进行测定，采用接触角/表面张力测量仪（型号：JY-82）对层析介质表面的水接触角进行测定。
为了保证所述层析介质的亲水效果，限定层析介质外表面的氧元素含量大于9%，水接触角小于49°，可以减少蛋白非特异性吸附，从而提高蛋白回收率。这是因为氧的电负性很大——在各种元素中仅次于氟。当氧和电负性比它小很多的元素结合在一起时，电子云强烈偏向氧，造成很强的偶极。这在水中很容易形成氢键，同时在这个过程中，氧原子的孤电子对也协助形成氢键。当膜外表面的氧元素含量低于9%时，会导致亲水性效果不好，水接触角大于50°，会减低蛋白回收率。
作为优选，亲水阴离子交换层析介质包括进液面和出液面，进液面水接触角/出液面水接触角为 1:（1~2）。
液体主要接触到层析介质的进液面和孔道，因此对于进液面和孔道内的亲水性要优于出液面，控制进液面的水接触角小于出液面水接触角，但多组层析介质层叠使用时，进液面和出液面均会接触到料液，需要控制进液面和出液面均具有较好的亲水性，因此出液面的水接触角可以和进液面水接触角相同。进液面水接触角/出液面水接触角为 1:（1~2），进液面水接触角为 30~49°，出液面水接触角为 30~98°。
作为优选，所述亲水阴离子交换层析介质的蛋白质载量大于45mg/mL，流速大于45mV/s。
第二方面，本申请提供了一种用于制备以上所述的亲水阴离子交换层析介质的方法，包括以下步骤：
（1）将多胺聚合物、胍基盐、叔胺催化剂、水混合后反应得到胍基聚合物溶液；
（2）在所述胍基聚合物溶液中加入交联剂形成交联溶液，将所述交联溶液涂覆到多孔基材上形成初步层析介质；
（3）加热所述初步层析介质使胍基聚合物交联固定到多孔基材上；
（4）洗涤去除多孔基材上未交联的胍基聚合物，干燥得到所述的亲水阴离子交换层析介质。
本发明直接采用接枝反应在多胺聚物上接枝胍基基团，并使用机叔胺类催化剂——氮源催化剂，在加快接枝反应的同时，避免其它杂质的引入影响亲水阴离子交换层析介质的耐盐效果。在多孔基材表面通过交联反应接枝胍基聚合物，相对于通过自由基反应接枝胍基聚合物而言，交联反应可以在较温和的条件下进行，不需要光照或强化学试剂。此外，交联反应可以提供更高的接枝密度和更稳定的接枝结构，因为交联反应可以形成交联点，使聚合物与多孔基材更牢固地连接在一起。多胺聚物上接枝胍基基团，在接枝反应得到的胍基聚合物溶液中添加交联剂，进而在多孔基材表面交联接枝胍基聚合物，整个工艺过程操作简单，可以更快速地完成多孔基材上胍基聚合物的交联固定，由于不需要多个步骤和中间产物的生成，因此避免了多个步骤中可能出现的副反应，这可以提高生产效率和产品质量。
作为优选，以重量百分数计，所述步骤（1）中的多胺聚合物、胍基盐、叔胺催化剂、水的添加量为（1~10）:（1~5）:（1~5）:（5~50）。
所述反应时间为1-48小时。
作为优选，所述步骤（1）中的多胺聚合物为聚乙烯胺、聚丙烯胺、树状高分子聚酰胺中的至少一种，胍基盐为O-烷基异脲盐、氯甲脒盐酸盐、1-脒基-1 ,2 ,4-三唑盐酸盐、3,5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐、吡唑-1-甲脒盐酸盐、N-脒基吡唑-1-甲脒盐酸盐、碳二亚胺中的至少一种；所述步骤（2）中的交联剂为环氧氯丙烷、环氧氯丁烷、环氧溴丙烷、环氧溴丁烷、丁基双缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚中的至少一种。
多胺聚合物具有较好的耐盐性能，其结构和性质可以通过不同的合成方法和反应条件进行调控，从而实现对其离子交换能力、交换容量和选择性的调整。此外，多胺聚合物如聚乙烯胺、聚丙烯胺和树状高分子聚酰胺具有许多氨基官能团，这些官能团可以与阴离子形成离子交换作用，从而实现对阴离子的选择性吸附和分离。环氧氯丙烷、环氧氯丁烷、环氧溴丙烷、环氧溴丁烷、丁基双缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚等交联剂具有良好的溶解性和反应性，可以在多孔管材表面上均匀分布并与多胺聚合物快速反应。
作为优选，所述步骤（1）中胍基聚合物溶液的粘度为5~2000 mpa.s，所述步骤（3）中加热温度为50℃~100 ℃，加热时间为10~60分钟。
进一步优选，交联剂分子量为50~5000。
粘度是胍基聚合物溶液流动特性的重要表征，影响到胍基聚合物的交联效果，当胍基聚合物溶液的粘度过高时会影响多孔基材表面交联的胍基聚合物的均匀性和平整性，甚至会导致只能进入到多孔基材的表层孔隙内，而无法进入到内部更深层处的孔隙，这样不仅会影响到最后层析膜的通量，也会使得层析膜的载量降低。因此，控制胍基聚合物溶液的粘度在5~2000mpa.s内可以保证胍基聚合物溶液具有较好的流动特性，制备通量和载量优异的阴离子交换层析膜。
进一步优选，所述胍基聚合物溶液的粘度为5~1000 mpa.s。
选择胍基聚合物溶液的粘度在5-1000 mpa.s内不仅可以获得优异的通量和载量，还可以进一步加快交联速度，缩短交联时间。
第三方面，本申请提供了以上所述的亲水阴离子交换层析介质或者以上所述的方法所制备得到的亲水阴离子交换层析介质在生物制药纯化过程中的应用，即本申请提供了一种阴离子交换层析吸附器，包含以上所述的亲水阴离子交换层析介质或者由以上所述的方法所制备得到的亲水阴离子交换层析介质。
第四方面，本申请提供了一种阴离子交换层析系统，包含以上所述的阴离子交换层析吸附器。
因此，本申请具有以下有益效果：
（1）本发明将接枝有胍基基团的胺基多聚物引入至亲水阴离子交换层析介质中，由此得到的含胍基聚合物层析介质能够在大的pH值范围、高离子强度和不同缓冲液中观察到HCP的还原和病毒清除，表现出优异的耐盐性阴离子交换吸附功能，以及更高的吸附载量；
（2）本发明将亲水阴离子交换层析介质的多孔基材平均孔径控制为0.4~4 μm，孔隙率为50~80%，控制层析介质的交联增重率为31-48%，使得最终获得的亲水阴离子交换层析介质的最佳通量和蛋白质结合量进一步得到保障；
（3）本发明中的亲水阴离子交换层析介质由于具有优异的亲水性，外表面的氧元素含量为9~19%，水接触角为30~49°，可以减少蛋白非特异性吸附，从而提高蛋白回收率；
（4）本发明先将胍基引入到多胺聚合物上形成胍基聚合物，然后再交联接枝到多孔基材上，反应便于控制引入胍基数量的密度，不会引发多种副反应，导致产物的复杂性增加。同时本申请还在反应过程中添加了有机叔胺催化剂，在加快接枝反应的同时，避免其它杂质的引入影响亲水阴离子交换层析介质的耐盐效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
（1）多胺聚合物接枝制备胍基聚合物溶液
称量72 g聚乙烯胺（Mn=70000），36 g 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐与328 mL去离子水，加入配备有磁力搅拌器的烧杯中。称量36 g有机叔胺催化剂N,N-二异丙基乙胺（DIEA），在室温搅拌下接枝反应，得到（粘度为14 mpa.s）胍基聚合物溶液；
（2）引入交联剂并涂膜
取50 mL上述胍基聚合物溶液，加入1mL 0.5 %聚乙二醇二缩水甘油醚（PEG-DGE）溶液，搅拌过夜。将（平均孔径为：0.8μm，孔隙率为：72%）多孔聚醚砜膜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES膜浸润，取出滤纸吸干多余溶液。在交联剂（ PEG-DGE）作用下，胍基聚合物交联固定在聚醚砜（PES）多孔膜表面，形成胍基聚合物/聚醚砜膜；
（3）热交联
在烘箱80℃加热交联20分钟，使胍基功能化的多胺聚合物交联固定在多孔基材上，交联增重率为43 %；
（4）洗涤干燥
先用异丙醇/去离子（1:1）浸泡1小时，随后大量去离子水洗涤以去除未交联的聚合物，最后置于托盘上风干，从而得到亲水阴离子交换层析介质。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中添加的胍基盐为氯甲脒盐酸盐，得到（粘度为10 mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（2）中多孔基材的材质为聚偏氟乙烯（PVDF）；步骤（3）中热交联时间为15分钟，交联增重率为36.8%。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中添加的胍基盐为1-脒基-1 ,2 ,4-三唑盐酸盐，得到（粘度为18 mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（2）中的交联剂为2 mL 的1%环氧氯丙烷；步骤（2）中多孔基材的材质为聚乙烯（PE）；步骤（3）中热交联温度100 ℃，时间为10分钟，交联增重率为43.3%。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中添加的多胺聚合物为聚乙烯胺(PEI)和聚丙烯胺（PAA）（Mn=500w），添加的胍基盐为碳二亚胺，得到（粘度为985 mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（2）中的交联剂为1 mL 1.5 %丁基双缩水甘油醚，多孔基材的材质为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）；步骤（3）中热交联温度100℃，时间为20分钟，交联增重率为44.5%。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中添加的多胺聚合物为聚丙烯胺（PAA）（Mn=700w），添加的胍基盐为N-脒基吡唑-1-甲脒盐酸盐，得到（粘度为1000 mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（2）中的交联剂为3 mL 的0.25 %丁基双缩水甘油醚，多孔基材的材质为醋酸纤维素；步骤（3）中热交联温度100℃，时间为20分钟，交联增重率为38.1%。
实施例6
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中添加的多胺聚合物为树状高分子聚酰胺（PAMAM）（Mn=20000），胍基盐为3 ,5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐，得到（粘度为200mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（2）中多孔基材的材质为再生纤维素；步骤（3）中热交联时间为15分钟，交联增重率为47.7%。
实施例7
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中添加的多胺聚合物为聚乙烯胺(PEI)和树状高分子聚酰胺（PAMAM）（Mn=15000），胍基盐为1-脒基-1 ,2 ,4-三唑盐酸盐，得到（粘度为150 mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（3）中热交联温度为50℃，时间为25分钟，交联增重率为46.8%。
实施例8
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中称量36 g聚乙烯胺（Mn=70000），180 g 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐与1800 mL去离子水，加入配备有磁力搅拌器的烧杯中。称量36 g有机叔胺催化剂N,N-二异丙基乙胺（DIEA），在室温搅拌下接枝反应，得到（粘度为5mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（3）中时间为60分钟，交联增重率为31.4%。
实施例9
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中称量360g聚乙烯胺（Mn=70000），36 g 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐与180 mL去离子水，加入配备有磁力搅拌器的烧杯中。称量180 g有机叔胺催化剂N,N-二异丙基乙胺（DIEA），在室温搅拌下接枝反应，得到（粘度为768mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（3）中热交联温度为60℃，时间为25分钟，交联增重率为47.2%。
实施例10
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中称量183 g聚乙烯胺（Mn=70000），100 g 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐与1000 mL去离子水，加入配备有磁力搅拌器的烧杯中。称量70 g有机叔胺催化剂N,N-二异丙基乙胺（DIEA），在室温搅拌下接枝反应，得到（粘度为163mpa.s）胍基聚合物溶液；步骤（3）中交联增重率为46.3%。
实施例11
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为：0.4 μm，孔隙率为80%）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液；步骤（3）中交联增重率为32.4%。
实施例12
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为0.8 μm：，孔隙率为69 %）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液；步骤（3）中交联增重率为47.6%。
实施例13
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为：4 μm，孔隙率为50 %）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液；步骤（3）中交联增重率为40.2%。
实施例14
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为：2.2 μm，孔隙率为54 %）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液；步骤（3）中交联增重率为34.5%。
实施例15
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为1.5μm，孔隙率为61 %）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液；步骤（3）中交联增重率为42.1%。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：步骤（3）中的交联时间为5min，交联增重率为26.4 %。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中加入2mL 1.5%聚乙二醇二缩水甘油醚（PEG-DGE）溶液，多孔基材聚醚砜（PES）的平均孔径为0.4μm，孔隙率为75 %；步骤（3）中交联温度为100℃，交联时间为30min，交联增重率为49.9 %。
对比例3
本对比例与实施例6的不同之处在于：步骤（2）中加入2mL 1.5%聚乙二醇二缩水甘油醚（PEG-DGE）溶液，多孔基材聚醚砜（PES）的平均孔径为0.6μm，孔隙率为80 %；步骤（3）中交联温度为100℃，交联时间为30min，交联增重率为69.7 %。
对比例4
本对比例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为0.1 μm，孔隙率为：78 %）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液。步骤（3）中交联增重率为22.1%。
对比例5
本对比例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为：4 μm，孔隙率为：48 %）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液。步骤（3）中交联增重率为30.3%。
对比例6
本对比例与实施例1的不同之处在于：步骤（2）中将（平均孔径为0.2 μm，孔隙率为82 %）多孔基材聚醚砜（PES）浸泡在交联溶液中，使PES浸润，取出滤纸吸干多余溶液。步骤（3）中交联增重率为34.5%。
对比例7
本对比例与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中称量72 g聚乙烯胺（Mn=70000），36 g 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐与2600 mL去离子水，加入配备有磁力搅拌器的烧杯中。称量36 g有机叔胺催化剂N,N-二异丙基乙胺（DIEA），在室温搅拌下接枝反应，得到（粘度为3.2mpa.s）胍基聚合物溶液。步骤（3）中交联增重率为23.7%。
【性能测试】
B S A载量检测方法如下(参考文献：HeD ,UlbrichtM .Preparation andcharacterization of porous anion-exchange membrane adsorbers withhighprotein-binding capacity[J] .Journal of Membrane Science ,2008 ,315(1-2):155-163.)。
实际检测时，使一定浓度的BSA蛋白溶液通过Pure系统上的一次性过滤器，在确定的每分钟10倍膜体积流速(mV/min)下接触目标材料(待测层析膜)直至过滤器出口后的浓度超过装载量浓度的10％。蛋白浓度与UV吸光度成一定线性关系，通过系统内的UV检测探头可侦测浓度变化，该技术为同领域内技术人员所熟知。考虑到系统和贮器设备中的死体积，通过在Unicorn软件中分析色谱图来确定10％穿透下吸附到过滤器上的蛋白的总量。
表1为实施例1~15以及对比例1~7中制备得到的不同亲水阴离子交换层析介质的BSA载量（20 mM Tris/HCl， pH 7.5, 200 mM NaCl ）以及0.05 Mpa压力下膜的流速，其中MV为膜体积。
表1 蛋白质载量和流速测试结果
通过对比例1说明，交联增重率太低的话，配基密度过低，不能提供充分的吸附位点，将会导致载量的下降；对比例2和3说明，交联增重率过高，会使孔尺寸受到影响，从而影响通量；对比例4~5说明，过小的孔径和孔隙率很大程度影响载量和流速，因为此时聚合物在基质表面的反应不够充分，从而载量下降，而较小的孔径会影响流速的影响，对于较低的孔隙率，影响配基密度的反应量从而促使载量下降，同时也不能提供较理想的流速； 对比例5中孔径较大，增重率范围低的原因可能是随着孔径的增大，导致多孔基材的比表面下降，能够接枝的面积减小，载量下降；
通过对比例6说明，仅仅控制交联增重率无法获得载量和通量都理想的阴离子交换层析介质，因为在交联过程中胍基聚合物会使得介质的表面孔径和孔隙率变小，以及在阴离子交换层析介质在使用过程中主要通过吸附的作用去除流体中的宿主细胞蛋白（HCP）和病毒，都会对层析介质的通量造成不好的影响。另外在对比例7中，由于胍基聚合物溶液的组分比例不满足规定配比：多胺聚合物、胍基盐、叔胺催化剂、水的添加量为（1~10）:（1~5）:（1~5）:（5~50），所制备得到的亲水阴离子交换层析介质的载量和流速都受到了一定程度的影响，说明本发明中的胍基聚合物溶液组分配比具有一定的协同作用。
综上所述，若要达到较理想的载量与流速，必须同时调控平均孔径（0.4~4 μm），孔隙率（50~80 %）和交联增重率（31~48%）三者的参数，才能制备出理想的产品。
分别抽取实施例1、6、7以及对比例1、4、5中制备得到的亲水阴离子交换层析介质，对亲水阴离子交换层析介质表面的氧含量和水接触角进行测定，判断其亲水性能，结果如表2所示。
表2 亲水性能测试结果
由上表可知，相较于对比例1、4、5而言，实施例1、7、8所制备得到的亲水离子交换介质的出液面具有较高的氧元素含量，使得出液面的接触角明显变小，亲水性增强，介质的载量和流速明显改善，抗污染性能够大大减少，从而可更好的在生物医药行业中应用。
Claims (9)
1.一种亲水阴离子交换层析介质，其特征在于，包括多孔基材，以及交联在所述多孔基材的外表面和内部的交联层，所述多孔基材的平均孔径为0.4~4 μm，孔隙率为50~80%，所述交联层包括胍基聚合物；所述胍基聚合物为多胺聚合物、胍基盐、叔胺催化剂和水混合后反应得到的聚合物，所述多胺聚合物、胍基盐、叔胺催化剂、水的添加量为（1~10）:（1~5）:（1~5）:（5~50），所述多胺聚合物为聚乙烯胺、聚丙烯胺、树状高分子聚酰胺中的至少一种，所述胍基盐为1-脒基-1 ,2 ,4-三唑盐酸盐、3 ,5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐、吡唑-1-甲脒盐酸盐、N-脒基吡唑-1-甲脒盐酸盐中的至少一种；所述亲水阴离子交换层析介质的交联增重率为31~48 %；所述亲水阴离子交换层析介质外表面氧元素含量为9~19%，水接触角为30~49°；所述亲水阴离子交换层析介质的蛋白质载量大于45mg/mL，流速大于45mV/s。
2.如权利要求1所述的亲水阴离子交换层析介质，其特征在于，所述亲水阴离子交换层析介质包括进液面和出液面，进液面水接触角/出液面水接触角为 1:（1~2）。
3.如权利要求1或2所述的亲水阴离子交换层析介质，其特征在于，所述多孔基材的材质为聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、再生纤维素或醋酸纤维素；所述多孔基材的厚度为50~500 μm。
4.一种用于制备权利要求1~3中任一项所述的亲水阴离子交换层析介质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将多胺聚合物、胍基盐、叔胺催化剂、水混合后反应得到胍基聚合物溶液；
（2）在所述胍基聚合物溶液中加入交联剂形成交联溶液，将所述交联溶液涂覆到多孔基材上形成初步层析介质；
（3）加热所述初步层析介质使胍基聚合物交联固定到多孔基材上；
（4）洗涤去除多孔基材上未交联的胍基聚合物，干燥得到所述的亲水阴离子交换层析介质。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的反应时间为1~48小时。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的交联剂为环氧氯丙烷、环氧氯丁烷、环氧溴丙烷、环氧溴丁烷、丁基双缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚中的至少一种。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中胍基聚合物溶液的粘度为5~2000 mpa.s，所述步骤（3）中加热温度为50℃~100 ℃，加热时间为10~60分钟。
8.一种阴离子交换层析吸附器，其特征在于，包含权利要求1~3中任意一项所述的亲水阴离子交换层析介质或者由权利要求4~7中任意一项所述的方法所制备得到的亲水阴离子交换层析介质。
9.一种阴离子交换层析系统，其特征在于，包含权利要求8所述的阴离子交换层析吸附器。
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