TWI457165B - Purification of proteins - Google Patents

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Hironobu Shirataki
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Asahi Kasei Chemicals Corp
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Description

蛋白質之純化方法
本發明係關於一種利用基材表面經具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋之多孔膜進行之蛋白質的純化方法。
近年來，於生物技術產業中，業界期待確立一種可高效地大量生產及大量純化蛋白質之技術。
一般而言，由於蛋白質係藉由使用源自動物之細胞株或大腸菌等菌體之培養而生產，故而必需將作為目標之蛋白質(以下有記為「目標蛋白質」之情形)自培養液中分離並且純化。尤其是為了將利用抗體之醫藥品(抗體醫藥品)實用化，必需自細胞培養液中將細胞碎片等雜質成分及源自細胞之溶存之蛋白質等非雜質成分除去，將其純化至對人類之治療用途而言充分之純度。於該純化步驟中，使用蛋白質吸附多孔膜或顆粒(粒子狀之吸附材料)等蛋白質吸附材料。
作為此種蛋白質吸附材料，可列舉如專利文獻1至5及非專利文獻1中所記載之蛋白質吸附多孔膜。
最近，對抗體醫藥品之需要迅速增加，意向大量生產成為抗體醫藥品之蛋白質。並且，伴隨著培養技術之迅速進步，提高純化步驟之能力亦成為課題，業界尤其是對提高可實現高流速處理之蛋白質吸附多孔膜之能力寄予期待。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2009/054226號
[專利文獻2]日本專利特開2009-53191號公報
[專利文獻3]日本專利特表2006-519273號公報
[專利文獻4]美國專利第6780327號說明書
[專利文獻5]美國專利第5547575號說明書
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Kyoichi Saito, CHARGED POLYPER BRUSH GRAFTED ONTO POROUS HOLLOW-FIBER MEMBRANE IMPROVES SEPARATION AND REACTION IN BIOTECNOLOGY, Separation Science and Technology, ENGLAND, Taylar & Francis, 2002, 37(3), 535-554
一般而言，使含有成為吸附對象之蛋白質之原液(以下有記為「原液」之情形)通過蛋白質吸附多孔膜，使蛋白質吸附之後，溶出所吸附之蛋白質(以下有記為「被吸附蛋白質」之情形)，若達到純化之目的，則將蛋白質吸附多孔膜廢棄。然而，為了提高純化步驟之能力，要求重複使用蛋白質吸附多孔膜。
若藉由先前技術之處理使蛋白質吸附多孔膜再生而重複使用，則有吸附能力逐漸降低之傾向。
又，如上所述，近年來由於大量生產、大量純化之需要，業界期望更提高蛋白質吸附多孔膜之吸附能力。作為提高吸附能力之方法，使蛋白質以多層吸附於有限之膜之 微孔表面的方法較為有效，但越使更多之蛋白質以多層吸附於有限之膜之微孔表面，使蛋白質吸附多孔膜再生而重複使用時之吸附能力越降低，該課題變得更顯著。
吸附能力降低之原因之一為全部之被吸附蛋白質無法完全溶出。因此，若可提高被吸附蛋白質之溶出效率，則可抑制因使蛋白質吸附多孔膜再生、重複使用而引起之吸附能力之降低。
本發明者等人為了解決上述課題而銳意研究，結果發現，藉由使至少1種溶出液以與吸附步驟中之含有吸附對象蛋白質之原液之通過方向反向之方式通過，可解決上述課題，從而完成本發明。除此以外，本發明者等人發現，藉由以多層吸附蛋白質之蛋白質吸附多孔膜，上述方法會更有效地發揮作用，從而完成本發明。
即，本發明如以下所述。
[1]
一種蛋白質之純化方法，其係利用基材表面經具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋之多孔膜而進行者，且包括：吸附步驟：使含有吸附對象蛋白質之原液通過上述多孔膜，使該吸附對象蛋白質吸附於上述高分子上；溶出步驟：使溶出液通過上述多孔膜，使吸附於上述高分子上之上述吸附對象蛋白質溶出至該溶出液中，於上述溶出步驟中，使至少1種溶出液以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
[2]
如上述[1]之蛋白質之純化方法，其中上述溶出液選自由含有鹽之水溶液、pH值經調整之水溶液、水、有機溶劑及該等之混合溶液所組成之群。
[3]
如上述[1]或[2]之蛋白質之純化方法，其中於上述溶出步驟中，使上述溶出液以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向順向及反向之方式通過。
[4]
如上述[1]至[3]中任一項之蛋白質之純化方法，其中上述高分子接枝於上述基材表面上，且上述高分子之接枝率為5%以上200%以下。
[5]
如上述[4]之蛋白質之純化方法，其中上述高分子之接枝率為30%以上90%以下。
[6]
如上述[1]至[5]中任一項之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為離子交換膜，且上述溶出液包含含有鹽之水溶液或pH值經調整之水溶液。
[7]
如上述[1]至[6]中任一項之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜之多層度為1.1以上。
[8]
如上述[6]或[7]之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜 為弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜，且上述溶出步驟包括：使pH值調整為上述吸附對象蛋白質之等電點與上述多孔膜之等電點之間以外之水溶液通過之步驟，及使含有鹽之水溶液通過之步驟，於任一步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
[9]
如上述[8]之蛋白質之純化方法，其中於使pH值經調整之水溶液通過之上述步驟、及使含有鹽之水溶液通過之上述步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
[10]
如上述[6]或[7]之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜，且上述溶出步驟包括：使含有鹽之水溶液通過之第一步驟，使pH值調整為上述吸附對象蛋白質之等電點與上述多孔膜之等電點之間以外之水溶液通過之第二步驟，及使含有鹽之水溶液通過之第三步驟，於上述第一步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向順向之方式通過，於上述第二步驟及上述第三步驟中，以與吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
[11]
如上述[1]至[10]中任一項之蛋白質之純化方法，其中上述溶出液係以上述吸附對象蛋白質之穩定pH予以調整。
[12]
如上述[1]至[11]中任一項之蛋白質之純化方法，其中上述溶出液為含有0.3 mol/L以上之中性鹽之水溶液。
[13]
如上述[1]至[12]中任一項之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜係進行於藉由液體或蒸汽濕潤化之狀態下加熱至50~110℃之處理而製造。
藉由本發明，可提供一種被吸附蛋白質之溶出方法，其係使用蛋白質吸附多孔膜之蛋白質之純化方法，且可抑制蛋白質之吸附能力之降低。
以下對本發明之較佳之實施形態進行詳細之說明。然而本發明並不受以下之實施形態所限定，可於其主旨之範圍內進行各種變形而實施。
本實施形態之蛋白質之純化方法包括吸附步驟與溶出步驟，於溶出步驟中，使至少1種溶出液以與吸附步驟中之含有吸附對象蛋白質之原液之通過方向反向之方式通過。
本實施形態中所使用之多孔膜為包括基材、覆蓋於該基材表面上之具有蛋白質吸附能力之高分子之膜，有記為「蛋白質吸附多孔膜」之情形。
再者，於本實施形態中，所謂「蛋白質吸附多孔膜」，係以如下概念而使用：其亦包括於稱作獨塊體(中空圓筒狀之多孔質燒結體)之具有1個或複數個中空部之圓筒狀多孔質燒結體上覆蓋有具有蛋白質吸附能力之高分子之形態。因此，於本實施形態中，所謂「基材表面經具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋之多孔膜」，亦包含表面經具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋之獨塊體。
於本實施形態中，該經高分子覆蓋之獨塊體亦藉由「蛋白質吸附多孔膜」之記載而例示。
於本實施形態中，藉由使含有吸附對象蛋白質之原液通過蛋白質吸附多孔膜，而使吸附對象蛋白質吸附於蛋白質吸附多孔膜上。所謂含有吸附對象蛋白質之原液，為含有吸附於蛋白質吸附多孔膜上之蛋白質之溶液，意指通過該膜之前之溶液。
於本實施形態中，將通過該膜之後之溶液記作「透過液」。
通常，於製造醫藥品時之實際生產線上，原液中除目標蛋白質以外，含有不需要之蛋白質、菌體、病毒、雜質成分等。亦有藉由預處理而自原液中將雜質成分及/或菌體除去之情形。於本實施形態中，亦可為如下方法：使目標蛋白質作為吸附對象而吸附於蛋白質吸附多孔膜上，使其他成分透過之後，僅使目標蛋白質溶出並回收之純化方法；將其他蛋白質(例如不需要之蛋白質)作為吸附對象而吸附，使目標蛋白質透過並將其回收之純化方法。即，所 謂「吸附對象蛋白質」，為吸附於蛋白質吸附多孔膜上之蛋白質，並不限定於目標蛋白質。根據純化方法，可為目標蛋白質，亦可為不需要之蛋白質。又，原液中所包含之吸附對象蛋白質可為1種，或可為1種以上。
於本實施形態中，所謂「吸附」，意指蛋白質藉由與蛋白質吸附多孔膜之微孔表面之交互作用而緊貼其上，與僅僅相接觸之「附著」相區別。
於本實施形態中，有將含有吸附對象蛋白質之原液通過蛋白質吸附多孔膜並吸附吸附對象蛋白質之步驟記作「吸附步驟」之情形。
然後，有進行沖洗「附著」於蛋白質吸附多孔膜上之成分(即非吸附對象之蛋白質(非吸附蛋白質)或雜質成分)之步驟之情形。將該步驟記作「清洗步驟」，與後面敍述之「溶出步驟」相區別。藉由清洗步驟，於蛋白質吸附多孔膜表面上存在「吸附」之蛋白質。
最後，藉由溶出液使吸附於蛋白質吸附多孔膜上之被吸附蛋白質自蛋白質吸附多孔膜中溶出並回收。此處所謂溶出液，為用以溶出被吸附蛋白質之溶液，並非以通過蛋白質吸附多孔膜而流出之溶液之含義而使用。
於本實施形態中，有將溶出液通過蛋白質吸附多孔膜，自蛋白質吸附多孔膜中溶出被吸附蛋白質之步驟記作「溶出步驟」之情形。
於本實施形態中，所謂溶出步驟，並非僅為自蛋白質吸附多孔膜中溶出被吸附蛋白質，亦可為使溶出液通過以使 蛋白質吸附多孔膜再生之步驟。即，並未將溶出步驟中之被吸附蛋白質於溶出液中之含量特別視為問題。
於溶出步驟中，藉由使至少1種溶出液以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通過，可將蛋白質純化，使蛋白質吸附多孔膜再生。
於本實施形態中，於利用基材表面經具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋之多孔膜進行之蛋白質之純化方法中，不僅提供抑制蛋白質之吸附能力之降低的被吸附蛋白質之溶出方法，並且由於被吸附蛋白質之溶出係蛋白質吸附多孔膜之再生處理之一部分，故而亦可認為可提供一種蛋白質吸附多孔膜之再生方法。
本實施形態之蛋白質之純化方法中之機制的詳細內容尚不明確，但可以如下之方式考察。
通常，於溶出步驟中，溶出液係以與吸附步驟中之原液之通過方向順向之方式通過。
並非拘泥於以下之理論，但一般認為，如本實施形態之方式，藉由至少1次將溶出液之流動方向改變為與原液之通過方向相反之方向而通過，搖動導入蛋白質吸附多孔膜中之基材之表面之具有蛋白質吸附能力的高分子鏈，藉由該效果，可使被吸附蛋白質溶出。即，會有蛋白質以進入相鄰接之高分子鏈之間之方式而以多層堆積並吸附之情況，潛入深處之蛋白質不易溶出。認為於吸附步驟中，高分子鏈於原液之流動方向上拉長。因此認為，於溶出步驟中使溶出液以與原液之流動方向反向之方式流動，藉此反 捋高分子鏈，高效地溶出潛入深處之蛋白質，故而可使蛋白質吸附多孔膜作為重複使用時抑制吸附能力之下降之膜而再生。
作為蛋白質吸附材料，除蛋白質吸附多孔膜以外，亦有使用蛋白質吸附顆粒進行蛋白質之純化之情況。於使用蛋白質吸附顆粒之情形時，於筒狀之盒體(管柱)中填充有蛋白質吸附顆粒之狀態下進行蛋白質之純化。作為再生方法，有使溶液流向相對於盒體、與原液之通過方向相反之方向之情況，其係為了除去雜質或松解經壓密化之顆粒而進行。即便使溶液相對於盒體流向相反之方向，亦難以控制各顆粒粒子之表面之溶液的流動，並且關係到自顆粒表面向內部之微孔部內之蛋白質之移動的擴散受到限制，故而溶液相對於盒體之流向不會對溶出造成影響，可認為本實施形態對蛋白質吸附多孔膜而言係尤其有效之再生方法。
作為蛋白質吸附多孔膜之形狀，可列舉：平板膜、中空纖維膜等。
所謂平板膜，意指片狀之膜，片之表面與背面藉由作為貫穿孔之微孔而連接。
所謂中空纖維膜，意指具有中空部分之圓筒狀或纖維狀之膜，中空纖維膜之中空側(內側)與外側藉由作為貫穿孔之微孔而連接。
關於蛋白質吸附多孔膜之形狀，只要液體或氣體可藉由貫穿孔自表面向背面或自背面向表面、或者自內側向外側 或自外側向內側透過，則並無特別限定。
通常，蛋白質吸附多孔膜僅藉由膜無法有效使用，為了使溶液通過，係於收容至稱作模組之捆包容器中之狀態下使用，就模組成型時之流路結構簡單，且易於進行與吸附步驟中之原液之通過方向反向之通過而言，較佳為中空纖維膜。模組結構可為與各個蛋白質吸附多孔膜之形狀相對應之公知之結構，於本實施形態中並無特別限定。
於本實施形態中，蛋白質吸附多孔膜之尺寸可根據模組設計、膜之製造方法、使用用途而自由地選擇。例如，若為平板膜，則只要可於模組中成型並能使溶液通過，則可自由設計片之厚度、大小。若為中空纖維膜或獨塊體，則外徑及內徑只要可物理性地保持多孔膜之形狀，則可自由設計尺寸。
於本實施形態中，作為蛋白質吸附多孔膜之基材，若對用於蛋白質之純化而接觸的溶液具有耐性，則可使用公知技術之原材料。
例如，可列舉：高分子材料、無機材料及有機無機混合材料等，就成形性之觀點而言，較佳為使用高分子材料之高分子基材。
於使用高分子基材之情形時，就機械性質保持之觀點而言，高分子基材較佳為含有聚烯烴系聚合物。
作為聚烯烴系聚合物，例如，可列舉：乙烯、丙烯、丁烯等烯烴之均聚物、該烯烴之2種以上之共聚物等。
於使用鹼性溶液作為溶出液之情形時，該等之中，更佳 為機械強度尤其優異、具有耐鹼性之聚乙烯。
可藉由熱誘導相分離法、非溶劑相分離法、電子束照射法等公知技術將高分子基材製造為多孔膜。
熱誘導相分離法係於高溫下將聚烯烴系聚合物等高分子之溶液溶解，其後進行冷卻之方法。於冷卻過程中，高分子溶液以網狀相分離為高分子與溶劑，故而若於冷卻後除去溶劑，則可獲得多孔膜。其特徵在於可獲得孔徑分佈較小之多孔膜。
非溶劑相分離法係將高分子溶液浸漬於非溶劑中之方法。藉由非溶劑浸透於高分子溶液中，高分子之溶解度降低，高分子以網狀而析出，從而獲得多孔膜。其特徵在於可獲得孔徑傾斜之多孔膜。
電子束照射法係向製成膜狀之高分子照射電子束，形成複數個貫穿孔，從而獲得多孔膜之方法。可獲得孔徑均勻之多孔膜。
於本實施形態中，可根據所製作之蛋白質吸附多孔膜之設計而自該等方法中選擇較為適當者。
關於本實施形態中之基材之平均孔徑，考慮到吸附對象蛋白質之種類、混合存在之雜質成分、溶液之黏度等，若可達成製程所必需之分離/純化度及溶液通過速度，則並無特別限定。以可除去雜質成分之方式設計平均孔徑之上限，以可達成所需之溶液通過速度之方式設計平均孔徑之下限，該平均孔徑較佳為0.001 μm~10 μm，更佳為0.01 μm~10 μm，進而較佳為0.1 μm~1 μm。
關於基材中之微孔所占之體積比率即孔隙率，若在可保持蛋白質吸附多孔膜之形狀且達成通過速度之範圍，則並無特別限定。以可保持形狀之方式設計孔隙率之上限，以可達成所需之溶液通過速度之方式設計孔隙率之下限，該孔隙率較佳為5%~99%，更佳為10%~95%，於實用方面，進而較佳為30~90%。
平均孔徑及孔隙率之測定可藉由如例如Marcel Mulder著「膜技術」(IPC股份有限公司)所記載之對業者而言通常之方法而進行。作為測定法之具體例，可列舉：利用電子顯微鏡進行之觀察、泡點法、汞滲法、穿透率法等。
於本實施形態中，基材之表面較佳為微孔之至少一部分經具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋。
作為高分子，例如，可列舉：直鏈狀高分子、交聯型之高分子等。由於朝相反方向之溶出液之流動可高效地溶出進入高分子鏈之間之蛋白質，故而較佳為直鏈狀高分子。
蛋白質吸附多孔膜根據覆蓋基材表面之高分子之官能基，分為離子交換膜、族特異性親和吸附膜、個別特異性親和吸附膜、疏水性交互作用吸附膜。離子交換膜細分為強酸性陽離子交換膜、弱酸性陽離子交換膜、強鹼性陰離子交換膜及弱鹼性陰離子交換膜。
於本實施形態中，該等官能基可根據被吸附蛋白質之種類、較佳為目標蛋白質之種類、所要求之純化度等而選擇適當者。
作為強酸性陽離子交換膜之官能基，例如，可列舉磺酸 基(-SO3 - )等，作為弱酸性陽離子交換膜之官能基，例如，可列舉羧酸基(-COO- )等。
作為強鹼性陰離子交換膜之官能基，例如，可列舉：四級銨基(Q、-N+ R3 )、四級胺基乙基(QAE、-(CH2 )2 -N+ R3 )等。此處，R並無特別限定，鍵結於同一個N上之R可相同或不同，較佳為表示烷基、芳基等烴基。更具體而言，可列舉三甲胺基(TMA、-N+ Me3 )等。
作為弱鹼性陰離子交換膜之官能基，例如，可列舉：1級胺基(-NH2 )、2級胺基(-NHR)、3級胺基(-NR2 )等，具體而言，可列舉：二乙胺基乙基(DEAE、-(CH2 )2 -NEt2 )、二乙胺基丙基(DEAP、-(CH2 )3 -NEt2 )等。此處R亦並無特別限定，鍵結於同一個N上之R可相同或不同，較佳為表示烷基、芳基等烴基。
作為族特異性親和吸附膜之官能基，例如，可列舉：Cibacron Blue F3G-A、Protein A、刀豆球蛋白A、肝素、單寧、金屬螯合基等。
作為個別特異型親和吸附膜之官能基，例如，可列舉：抗原、抗體類等。
作為疏水性交互作用吸附膜之官能基，例如，可列舉：烷基或芳香族系官能基。關於烷基，就更提高疏水性之交互作用、提高吸附能力之觀點而言，較佳為碳原子為4個以上。
於本實施形態中，關於將覆蓋基材表面之具有蛋白質吸附能力之高分子導入基材表面之方法，例如，可列舉化學 反應或高分子塗佈等。於本實施形態中，可根據基材之材質、蛋白質吸附多孔膜之使用用途、製造方法等觀點而選擇最佳之方法，亦可應用於稱作獨塊體之多孔質燒結體。
作為藉由化學反應，以具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋基材表面之方法，例如，可列舉：放射線接枝聚合法等。放射線接枝聚合法係向基材照射γ射線等放射線而使基材表面活化並使單體聚合之方法。與後面敍述之利用高分子塗佈進行之覆蓋方法相比，可期待基材與覆蓋基材表面之高分子之牢固之結合。進而，由於不需要聚合起始劑等試劑，就可減輕於反應後清洗該等試劑之負荷之觀點而言，可較佳地使用。
放射線接枝聚合法中包括：(1)將含有具有蛋白質吸附能力之官能基之單體直接接枝聚合於基材上之方法；或(2)將含有可導入具有蛋白質吸附能力之官能基之官能基的單體接枝聚合於基材上，繼而導入具有蛋白質吸附能力之官能基之方法。可採用任一種。
於本實施形態中，有將藉由接枝聚合而導入之高分子稱作「接枝鏈」之情形。
由於上述(1)所示之方法可藉由一個階段之反應而獲得具有蛋白質吸附能力之高分子之覆蓋層，就簡便而言，較佳為該方法。
作為(1)之方法中所使用之上述單體，並無特別限定，例如，可列舉：甲基丙烯酸酯衍生物、乙烯系化合物、烯丙基化合物等，具體而言，可列舉：甲基丙烯酸二乙胺基 乙酯、甲基丙烯酸磺丙酯、乙烯基苄基三甲基氯化銨、烯丙胺等。
上述(2)所示之方法易於使各種具有蛋白質吸附能力之官能基之變化一致，或易於使具有蛋白質吸附能力之官能基之導入率(以下有稱作「配體轉化率」之情形)之變化一致，就該觀點而言，為較佳之方法。
作為(2)之方法所使用之上述單體，並無特別限定，例如，可列舉具有反應性較高之環氧基之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)等。
於藉由放射線接枝聚合法而導入具有蛋白質吸附能力之高分子之情形時，接枝鏈之量(以下有記作「接枝率」之情形)及配體轉化率有會影響到蛋白質吸附多孔膜之吸附能力及機械強度之情形。
於本實施形態中，接枝率(dg[%])係基於放射線接枝聚合前後之相對於基材之增加重量而定義，可根據下述式(1)求得。
W0 ：基材重量(g)
W1 ：放射線接枝聚合後之重量(g)
於本實施形態中，配體轉化率(T[%])係以具有蛋白質吸附能力之官能基相對於接枝鏈中之可導入具有蛋白質吸附能力之官能基之官能基的存在比率而定義，可根據下述式(2) 求得。
W0 ：基材重量(g)
W1 ：放射線接枝聚合後之重量(g)
W2 ：導入具有蛋白質吸附能力之官能基後之總重量(g)
M1 ：接枝鏈單體單位之分子量(g/mol)
M2 ：具有蛋白質吸附能力之官能基之分子量(g/mol)
a：每1分子接枝鏈單體之可導入具有蛋白質吸附能力之官能基之官能基數
於上述式(2)中，於使用GMA作為含有可導入具有蛋白質吸附能力之官能基之官能基的單體而導入接枝鏈之情形時，該單體中，可導入官能基之官能基為1個環氧基，故而a=1。
於本實施形態中，為了於有限之微孔表面上吸附大量之蛋白質，較佳為接枝率更大。然而，若增大接枝率，則有接枝鏈將微孔空間橫切，與相對向之微孔表面相接觸，因改變溶液通過方向引起之接枝鏈之搖動減少，被吸附蛋白質之溶出效率降低之情況，故而接枝率較佳為5%~200%。除此以外，若增大接枝鏈，則有微孔空間變小故而溶液通過壓強上升，無法達成所需之溶液通過速度之情況，故而更佳為20%~150%。又，若增大接枝鏈，則有機械強度亦降低之情況，故而就實用上之觀點而言，進而較佳為 30%~90%。
就獲得更高之吸附容量之觀點而言，配體轉化率較佳為20%~100%，更佳為50%~100%，進而較佳為70%~100%。
導入配體之後，繼續進行蛋白質吸附多孔膜之乾燥步驟、模組成形步驟與製造步驟，作為蛋白質吸附多孔膜，若對機械強度、吸附性能等無實用性能上之影響，則於各個步驟中可選擇適當之方法。又，亦可適當增加追加之步驟，亦可省略。
例如，於模組成形步驟之後，可對蛋白質吸附多孔膜實施於藉由液體或蒸汽濕潤化之狀態下進行加熱之處理(濕熱處理)步驟。就有藉由該濕熱處理提高吸附能力之情況而言，故而較佳為實施該濕熱處理。
該濕熱處理所使用之液體較佳為純水或水溶液。水溶液若為含有無機鹽之水溶液，則並無特別限定。就維護處理裝置之觀點、減輕調整水溶液之作業負荷之觀點而言，較佳為使用純水。
又，該濕熱處理之溫度較佳為50~110℃，就使用純水之情形時之作業性及該濕熱處理之效果之觀點而言，更佳為60~95℃。
作為藉由化學反應，以具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋基材表面之方法，亦可列舉使用聚合起始劑之接枝聚合法。其係使用聚合起始劑將基材活化而使單體聚合並將接枝鏈導入基材表面上之方法。就即便對於利用放射線進行之活化較困難之基材亦可實現接枝聚合之方面，及無需放 射線照射設備之方面而言，可較佳地使用。例如，以藉由公知技術製造之獨塊體等多孔質燒結體作為基材之情形時，有用作覆蓋其表面之方法之情況。
作為藉由高分子塗佈，以具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋基材表面之方法，例如，可列舉將含有具有蛋白質吸附能力之官能基之高分子塗佈於基材上，藉由交聯劑將高分子固定於基材表面上之方法等。作為該方法，例如，於專利文獻4中揭示有具體之方法。除此以外，可列舉於基材表面上形成聚合物或聚合物前驅物之覆膜，以構成該覆膜之高分子作為聚合起始點而獲得新接枝聚合物之方法等。作為該方法，例如，於專利文獻5中揭示有具體之方法。
作為可應用本實施形態之蛋白質之純化方法之蛋白質吸附多孔膜，例如，可列舉專利文獻1~5中所記載之膜等。
於專利文獻1中，揭示有微孔表面上具有接枝鏈並於該接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜。業界報告有蛋白質以多層吸附於微孔表面導入有具有離子交換基之聚合物刷(直鏈狀之接枝鏈)之與專利文獻1相同之多孔質中空纖維膜上(非專利文獻1)。
即，可認為專利文獻1中所記載之膜為使溶出液反向流動，反持聚合物鏈，高效地溶出被吸附蛋白質之本純化方法尤其有效地發揮作用之膜。
於專利文獻2中揭示有多孔質基材經具有第1胺基鍵結之交聯聚合物之吸附材料覆蓋之多孔質吸附介質。關於覆蓋 基材之皮膜聚合物，記載有「將蛋白質及其他雜質捕獲於該皮膜之深處」。可認為於專利文獻2中所記載之膜為本純化方法有效地發揮作用之膜。
於專利文獻3中揭示有複數個孔延伸之支持體構成構件、及含有配置於該支持體構成構件之孔中且充滿該支持體構成構件之孔之巨多孔質交聯凝膠而成的複合材料。
於專利文獻4中揭示有包含具有陽離子官能基(於本實施形態中，意指「陰離子交換型之官能基」)之交聯覆膜與多孔質基材之帶正電之多孔質膜。作為製造方法之一例，例如揭示有以下之方法。首先，於二烯丙胺與具有4級銨型之官能基之甲基丙烯酸酯衍生物之共聚物中添加具有環氧基之試劑(例如表氯醇)，藉此將其活化。另外，調合含有五伸乙基六胺與縮水甘油基三甲基氯化銨之交聯劑。然後，將成為基材之多孔膜浸漬於經活化之共聚物與交聯劑之溶液中，藉此獲得蛋白質吸附膜。
於專利文獻5中揭示有於高分子多孔質基材膜表面上形成N-鹵化之化合物(聚合物或聚合物前驅物)之覆膜，使接枝起始劑與單體接觸，並於基材上接枝聚合之膜。作為具體例，記載有如下膜：該膜係使用N-鹵化之尼龍66作為上述N-鹵化之化合物，使用GMA作為上述單體，於纖維素製之多孔質膜上進行接枝聚合，其後，藉由利用由磺酸離子之處理進行之環氧基之磺化而獲得。又，記載有於GMA之環氧基中導入由二級/三級胺而得之三級胺基/四級銨基而成之膜。
列舉該等專利文獻1至5及非專利文獻1中所揭示之膜作為本實施形態之利用蛋白質吸附多孔膜進行之蛋白質之純化方法中可較佳地使用之蛋白質吸附多孔膜之例示。
於本實施形態中，所謂多層度，為表示被吸附蛋白質於蛋白質吸附多孔膜之有限之微孔表面上之吸附形態的指標。蛋白質吸附於蛋白質吸附多孔膜之微孔表面上時，有於微孔表面上僅附有蛋白質之單層吸附、及吸附之蛋白質上進而積層有其他蛋白質而吸附之多層吸附。蛋白質吸附多孔膜之微孔表面之具有蛋白質吸附能力之高分子的結構對被吸附蛋白質之吸附形態造成影響，故而可認為多層度為間接表示微孔表面之高分子結構之指標。所謂本實施形態中之多層度，為蛋白質吸附於蛋白質吸附多孔膜之微孔表面上直至填充最密集且達到平衡吸附量時之BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)換算層數。即，以任意蛋白質測定平衡吸附量，用於測定之任意蛋白質設為BSA之粒子尺寸之情形時之換算積層數為多層度，根據評價對象之蛋白質吸附多孔膜而使用任意尺寸之蛋白質進行測定之情形時，亦為可比較微孔表面之高分子結構之指標。
例如，於非專利文獻1中揭示，多層度之概念本身為蛋白質之多層黏合度(degree of multilayer binding of protein)，對業者而言為已知之概念。
於本實施形態中，多層度為藉由以下之式算出之值。
[數3]多層度=(平衡吸附容量)/(理論單層吸附容量) (3)
所謂「平衡吸附容量」，為表示蛋白質吸附多孔膜之吸附能力之用語，於業界廣泛使用。意指使含有吸附對象蛋白質之原液通過蛋白質吸附多孔膜時，原液之透過液之蛋白質濃度達到與原液之蛋白質之濃度相平衡之時間點(吸附平衡)為止之吸附容量，藉由式(4)而算出。
所謂「吸附容量」，意指將吸附量換算為每單位膜量之值之數值，所謂「吸附量」，意指蛋白質吸附多孔膜吸附之被吸附蛋白質之重量。
再者，評價吸附容量時，與用於實際之生產線之情形不同，通常以將純化之蛋白質製成溶液之原液進行評價。
C0 ：原液之蛋白質之濃度[g/L]
C：原液透過液之蛋白質濃度[g/L]
Q：累積之原液透過液量[L]
Qe ：達到吸附平衡時之原液透過液量[L]
W：蛋白質吸附多孔膜之重量[g]
平衡吸附容量之測定係使用市售之實驗用蛋白質而進行，將其換算為BSA之蛋白質之多層度(後面詳細敍述)。用於測定之蛋白質可根據蛋白質吸附多孔膜而任意選擇。例如，BSA可較佳地用於強鹼性陰離子交換膜及弱鹼性陰離子交換膜。另一方面，溶菌酶可較佳地用於強酸性陽離子交換膜及弱酸性陽離子交換膜。
關於用於評價之蛋白質溶液之pH值，可為蛋白質吸附於蛋白質吸附多孔膜上，蛋白質未改性且穩定之pH值區域。例如，於離子交換膜之情形時，使用pH值調整為蛋白質之等電點(pI)與離子交換膜之pI之間的含有蛋白質之原液。關於蛋白質之pI與離子交換膜pI之關係，後面詳細敍述。
所謂「理論單層吸附容量」，係以蛋白質吸附多孔膜之比表面積除以1分子蛋白質之佔有面積，藉此算出理論上於表面最密排列之蛋白質之數，利用阿佛加德羅常數(NA )與蛋白質之分子量(Mr )，根據式(5)而求出。
[數5]理論單層吸附容量[g -單層吸附量/g -膜]=(S M /S P )(M r /N A ) (5)
SM ：蛋白質吸附多孔膜之比表面積[m2 /g]
SP ：1分子蛋白質之佔有面積[m2 ]
Mr ：BSA之分子量[g/mol]
NA ：阿佛加德羅常數[/mol]
於本實施形態中，如上所述，將多層度設為BSA換算之積層數。因此，將理論單層吸附容量設為BSA換算之理論單層吸附容量。即，於式(5)中，1分子蛋白質之佔有面積SP 為根據BSA之粒子尺寸(4.0 nm×4.0 nm×11.5 nm)，為SP =4.0 nm×4.0 nm=16 nm2 ，分子量Mr 使用67500。
蛋白質吸附多孔膜之比表面積SM可藉由氮氣吸附法(BET法，Brunauer-Emmett-Teller method)進行測定。
多層度較佳為蛋白質吸附多孔膜之微孔表面之高分子鏈 的易拉長度(即溶出效果之大小)更大。但藉由多層度增大，溶液通過壓強上升，不易達成所需之溶液通過速度，故而多層度較佳為設為15以下，多層度更佳為1.1~15，進而較佳為2~15，進而更佳為3~15。
於本實施形態中，吸附步驟可以與使用通常之蛋白質吸附多孔膜之純化方法相同之方式實施，以如下順序進行：(1-1)利用緩衝液進行之蛋白質吸附多孔膜之平衡化；(1-2)藉由含有吸附對象蛋白質之原液之通過進行之蛋白質於蛋白質吸附多孔膜上之吸附。
上述(1-1)步驟係藉由使緩衝液通過，而使具有蛋白質吸附功能之高分子之狀態(電荷狀態等)平衡化之步驟，作為蛋白質吸附之準備順序而進行。
上述(1-2)步驟係使含有吸附對象蛋白質之原液通過經平衡化之蛋白質吸附多孔膜，藉此使吸附對象蛋白質吸附於蛋白質吸附多孔膜上之步驟，作為對本實施形態中之吸附步驟而言必需之順序而進行。
於(1-2)步驟中，吸附之蛋白質可適當選擇，可列舉吸附目標蛋白質，然後溶出回收之方法，及吸附不需要之蛋白質，使目標蛋白質通過而回收之方法。
本實施形態所使用之緩衝液可根據純化製程、吸附對象蛋白質之種類、具有蛋白質吸附能力之官能基之種類(疏水性交互作用膜、離子交換膜、族特異性親和吸附膜、個別特異性親和吸附膜)而選擇合適者，並無特別限定，可進行適當選擇。例如，可列舉：鹽酸-氯化鉀緩衝液、甘 胺酸-鹽酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、乙酸緩衝液、檸檬酸-磷酸緩衝液、磷酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液、甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液等，可根據吸附對象蛋白質及純化製程而選擇合適者。
於本實施形態中，關於吸附對象蛋白質之分子量，只要該蛋白質可吸附於蛋白質吸附多孔膜之微孔表面上，則可任意選擇。只要可藉由溶出液而溶出，小於蛋白質吸附多孔膜之孔徑，為可通過微孔內之分子尺寸即可，較佳為1,000~1,000,000，更佳為1,000~500,000，進而更佳為1,000~300,000。
關於清洗步驟，為了提高於其後進行之溶出步驟中回收之蛋白質之純化純度，可視需要而實施。例如，於回收被吸附蛋白質之情形時，在欲藉由預先沖洗附著於蛋白質吸附多孔膜上之原液中所含之雜質成分、或不需要之蛋白質，來避免混入其後進行之溶出步驟中回收之蛋白質中時實施。
於本實施形態中，於溶出步驟中進行藉由溶出液之通過進行之被吸附蛋白質之溶出。於被吸附蛋白質為目標蛋白質之情形時，回收透過蛋白質吸附多孔膜之溶出液之透過液。又，於被吸附蛋白質為不需要之蛋白質之情形時，亦可廢棄透過蛋白質吸附多孔膜之溶出液之透過液。
於任一情形時，於本實施形態中，在溶出步驟中，關於溶出液，可使1種或替換複數種之溶出液而通過，使至少1種溶出液以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通 過，藉此使蛋白質吸附多孔膜再生。
本實施形態之蛋白質之純化方法係使用含有基材與覆蓋於該基材之表面上之具有蛋白質吸附能力之高分子的蛋白質吸附多孔膜之純化方法，且亦可為於吸附步驟後之溶出步驟中，以至少1種溶出液通過蛋白質吸附多孔膜時，使上述溶出液中至少任一種溶出液以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通過之蛋白質之純化方法。
於本實施形態中，於溶出步驟中，進行複數次溶出之情形時，只要其中至少1次使溶出液以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通過即可，溶出液反向通過之次數並無特別限定，可複數次反向通過。亦可於全部數次之溶出中，使溶出液以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通過。
於本實施形態中，所謂「反向通過」，於蛋白質吸附多孔膜為平板膜，於吸附步驟中自表面(其中一面)向背面(另一面)通過之情形時，意指自背面(另一面)向表面(其中一面)之通過。於蛋白質吸附多孔膜為中空纖維膜，於吸附步驟中自中空纖維膜之內側(其中一面)向外側(另一面)通過之情形時，意指自外側(另一面)向內側(其中一面)通過，於吸附步驟中自中空纖維膜之外側(另一面)向內側(其中一面)通過之情形時，意指自內側(其中一面)向外側(另一面)通過。
本實施形態之溶出步驟所使用之溶出液只要可溶出被吸附蛋白質，則並無特別限定。
作為溶出液，可選自由含有鹽之水溶液、pH值經調整之水溶液、水、有機溶劑及該等之混合溶液所組成之群中，可根據被吸附蛋白質之種類、分離目的、具有蛋白質吸附能力之官能基之種類(疏水性交互作用膜、離子交換膜、族特異性親和吸附膜、個別特異性親和吸附膜)等各個製程而選擇1種以上適當者。以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通過之至少1種溶出液可選自上述溶出液中。
作為「混合溶液」，可列舉：將含有鹽之水溶液、pH值經調整之水溶液、或水與有機溶劑以所需之比率混合而成之混合溶液。
作為「有機溶劑」，可列舉通常用於蛋白質之純化之有機溶劑，例如，可列舉：乙醇等醇系溶劑、乙腈等腈系溶劑等。
作為「pH值經調整之水溶液」，可列舉藉由鹼(例如NaOH水溶液)或酸(例如鹽酸)調整pH值之水溶液。又，可列舉調整為所需之pH值之緩衝液。後面詳細敍述，但並未將含有中性鹽之緩衝液等分類為「pH值經調整之水溶液」。為方便起見，於本實施形態中將含有中性鹽之緩衝液分類為「含有鹽之水溶液」，但並非對作為溶出液之實質之溶出效果之差異進行分類。
再者，於必需回收被吸附蛋白質之情形時，較佳為使用經被吸附蛋白質之穩定pH調整之溶出液。所謂穩定pH，意指被吸附蛋白質不改性之pH值區域。
於使用「pH值經調整之水溶液」之情形時，溶出步驟中之溶液通過方向可為與吸附步驟中之原液之通過方向順向，亦可反向，較佳為於其後進行中和操作。該中和操作中之溶液通過亦可為順向，亦可為反向。中和操作可使用調整為所需之pH值之含有鹽之緩衝液作為「含有鹽之水溶液」，亦可使用調整為所需之pH值之緩衝液作為「pH值經調整之水溶液」。
所謂「含有鹽之水溶液」之「鹽」，意指中性鹽，較佳為NaCl(氯化鈉)或KCl(氯化鉀)等鹽。
僅含有鹽之水溶液既非酸性亦非鹼性，為中性，作為本實施形態中之「含有鹽之水溶液」，可含有中性鹽，進而亦可為pH值經調節之緩衝液。即，將含有中性鹽之緩衝液分類為「含有鹽之水溶液」。
如專利文獻1中所記載，若為低濃度之含有鹽之溶液中，則可實現蛋白質之吸附，故而為了實施更高效之溶出，鹽濃度較佳為0.3 mol/L以上，更佳為0.5 mol/L以上，進而較佳為0.8 mol/L以上，進而更佳為1 mol/L以上。0.3 mol/L以上、保持蛋白質吸附多孔膜之機械強度及形狀、溶液通過壓強等使用上無問題之濃度以下之含有中性鹽之水溶液可於本實施形態中較佳地通過，該通過可為順向，亦可為反向。
所謂鹽濃度，為中性鹽之濃度，與其他溶質之濃度無關。因此可僅自中性鹽水溶液、含有中性鹽之緩衝液等中選擇適當者。
於溶出步驟中，為了使蛋白質吸附多孔膜平衡化，通常使緩衝液通過，故而考慮到再次轉移至吸附步驟，就操作之簡化之觀點而言，較佳為使用pH值調節為與溶出步驟中之原液相同之含有鹽之緩衝液。
族特異性親和吸附膜或個別特異性型親和吸附膜之蛋白質吸附多孔膜時，較佳為使用可實現利用pH值變化進行之被吸附蛋白質之溶出、調整為合適之pH值之水溶液。
如上所述，於本實施形態中，所謂離子交換膜，為具有蛋白質吸附能力之官能基為離子交換型官能基之蛋白質吸附多孔膜。作為蛋白質吸附多孔膜之離子交換膜之通用性較高，故而可較佳地用於利用本實施形態之純化方法進行之課題解決。
以下對離子交換膜之本實施形態進行更具體之說明。
於離子交換膜時中，作為溶出步驟之溶出液，可選擇至少包含「含有鹽之水溶液」或「pH值經調整之水溶液」之溶出液。
於離子交換膜中，強酸性陽離子交換膜、弱酸性陽離子交換膜、強鹼性陰離子交換膜及弱鹼性陰離子交換膜全部可使用「含有鹽之水溶液」作為溶出液，尤其是弱酸性陽離子交換膜、弱鹼性陰離子交換膜時亦可使用「pH值經調整之水溶液」作為溶出液。
通常，蛋白質於水溶液中，於等電點(pI)之pH值時蛋白質之總電荷為零，於超過pI之pH值時為帶負電之狀態，於未達pI之pH值時為帶正電之狀態。又，弱酸性陽離子交換 膜及弱鹼性陰離子交換膜亦取決於pH值。
於弱酸性陽離子交換膜時，膜之pI以下時電荷無偏差，若超過pI則會帶負電。因此，於蛋白質之pI以上且膜之pI以上之pH值區域中兩者均帶負電，故而會溶出被吸附蛋白質。又，於蛋白質之pI以下且膜之pI以下時，兩者之靜電交互作用消失，故而亦會溶出被吸附蛋白質。即，蛋白質可吸附於膜上之pH值區域為蛋白質之pI與膜之pI之間，除此以外之pH值區域中可使用「pH值經調整之水溶液」作為溶出液。
於弱鹼性陰離子交換膜時亦相同，弱鹼性陰離子交換膜為膜之pI以上時電荷無偏差，若成為未達pI則帶正電。因此，於蛋白質之pI以上且膜之pI以上之pH值區域中，兩者之靜電交互作用消失，故而會溶出被吸附蛋白質。又，蛋白質之pI以下且膜之pI以下時，兩者亦均帶正電，故而會溶出被吸附蛋白質。即蛋白質可吸附於膜上之pH值區域為蛋白質之pI與膜之pI之間，除此以外之pH值區域中可使用「pH值經調整之水溶液」作為溶出液。此處，膜之pI可藉由流動電位法求出。
根據以上所述，於本實施形態中，蛋白質吸附多孔膜為弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜之情形時，可使用「pH值經調整之水溶液」作為pH值在吸附之蛋白質之等電點與上述蛋白質吸附多孔膜之等電點之間以外之溶出液。但為了高效之溶出，較佳為使用pH值偏離pH閾值之溶出液，具體而言，較佳為pH閾值±1，更佳為pH閾值 ±2，進而較佳為pH閾值±3以上。又，作為調整pH值之溶質，較佳為使用NaOH或HCl。此處，所謂pH閾值，意指蛋白質之pI或膜之pI中之任一pH值。
於使用弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜作為蛋白質吸附多孔膜之情形時，於溶出步驟中使用「pH值經調整之水溶液」之情形(步驟(B))時，較佳為其後使「含有鹽之水溶液」、較佳為含有鹽之緩衝液通過(步驟(C))。藉由步驟(B)及步驟(C)，可使膜之電荷狀態恢復至用以藉由少量之通過量進行蛋白質吸附之平衡化狀態。
於本實施形態中，更佳為於使「含有鹽之水溶液」通過之步驟(A)之後，進行使「pH值經調整之水溶液」通過之步驟(B)，繼而進行使「含有鹽之水溶液」再次通過之步驟(C)。
可於蛋白質吸附狀態下立刻改變pH值而使其溶出，但就防止由於pH值變化引起之被吸附蛋白質之改性之觀點而言，藉由進行步驟(A)並進行步驟(B)，可提高被吸附蛋白質之溶出效率。
於本實施形態中，較佳為於步驟(A)、步驟(B)、步驟(C)中之任一步驟中，以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通過，更佳為於步驟(B)及步驟(C)中之任一步驟中反向通過，進而較佳為使步驟(B)及步驟(C)兩者之溶出液以與吸附步驟中之原液之通過方向反向之方式通過，該情況時溶出之效率較佳。
於溶出步驟中，使溶出液通過蛋白質吸附多孔膜之通過 速度為溶出被吸附蛋白質之速度以上，於可維持蛋白質吸附多孔膜及其模組之形狀，並維持吸附功能之速度以下之範圍內，可進行任意設定。
於模組成型之中空纖維狀蛋白質吸附多孔膜之情形時，以內壓式(自內側向外側之通過)通過之情形時，較佳為1 MV/min~110 MV/min，更佳為3 MV/min~40 MV/min，進而較佳為4 MV/min~15 MV/min。以外壓式(自外側向內側之通過)通過之情形時，較佳為1 MV/min~15 MV/min，更佳為3 MV/min~10 MV/min，進而較佳為4 MV/min~10 MV/min。此處，所謂MV意指膜體積。即，所謂1 MV/min，意指1分鐘內通過與膜體積等量之液量。關於膜體積之計算方法，後面詳細敍述。
於溶出步驟中，使溶出液通過蛋白質吸附多孔膜之通過量只要為可充分溶出被吸附蛋白質之量，則可進行任意設定。於替換複數種溶出液而通過之情形時，必需亦考慮到置換所必需之量。於模組成型之中空纖維狀蛋白質吸附多孔膜之情形時，關於各溶出液，較佳為10 MV以上，更佳為25 MV以上，進而較佳為30 MV以上。
[實施例]
以下列舉實施例及比較例，對本發明進行具體之說明。但本發明並不受該等實施例所限定。
[製造例1]作為高分子基材之中空纖維多孔膜之製造
預混合細粉末矽酸(Aerosil(註冊商標)R972級)27.2質量份、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)54.3質量份及聚乙烯樹脂粉 末(旭化成化學股份有限公司製造之Sunfine(商標)SH-800級)18.5質量份，藉由雙軸擠出機以中空纖維狀而擠出，從而獲得中空纖維狀之膜。繼而，藉由將該膜依序浸漬於二氯甲烷及氫氧化鈉水溶液中，而萃取鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)及矽酸，其後，實施水洗、乾燥處理，從而獲得聚乙烯製之中空纖維多孔膜。
以泡點法測定所得之中空纖維多孔膜之平均孔徑為0.3 μm。測定係按照於ASTM(American Society for Testing and Materials，美國材料試驗協會)標準之F316-86所記載之平均孔徑之測定方法(又稱半乾法)而測定。使用作為液體之乙醇、作為加壓用氣體之氮氣對6 cm長之中空纖維多孔膜進行測定。針對所得之半乾平均壓力，藉由以下之式(6)算出平均孔徑。
孔隙率為69%。孔隙率係藉由以下之式(7)而算出。
γ：表面張力(dynes/cm)
p：半乾平均壓力(Pa)
Wwet ：水濕潤時之中空纖維多孔膜之重量(g)
Wdry ：乾燥時之中空纖維多孔膜之重量(g)
ρ：測定時之水溫中之水之密度(g/mL)
V：中空纖維之圓環截面面積體積(mL)
再者，於平板膜之情形時，V表示膜體積，膜體積係以膜面積與膜厚度相乘而得之值而求出。此處，中空纖維之圓環截面面積體積(V)係藉由以下之式(8)而算出。
L：用於測定之中空纖維之長度(cm)
Do ：中空纖維之外徑(cm)
Di ：中空纖維之內徑(cm)
[製造例2]具有吸附能力之中空纖維多孔膜之製造
將製造例1所製造之聚乙烯製之中空纖維多孔膜放入密閉容器中，對容器內進行氮氣置換。繼而，將裝有中空纖維多孔膜之密閉容器與乾冰共同裝入發泡苯乙烯製之箱內，一面冷卻一面照射γ射線200 kGy，使聚乙烯產生自由基，並使中空纖維多孔膜活化。
於氮氣環境之密閉容器內使經活化之中空纖維多孔膜恢復至室溫。其後，將中空纖維多孔膜投入反應容器中，密閉而使其成為真空狀態(100 Pa以下)。將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)5質量份與甲醇95質量份進行混合，並進行氮發泡，利用壓力差將預先準備之反應液壓送至真空狀態之反應容器內。於40℃下使經壓送之反應液循環4小時，靜置一整夜後，排出反應液。依序利用甲醇、水充分清洗 中空纖維多孔膜，從而獲得聚乙烯主鏈上接枝聚合有甲基丙烯酸縮水甘油酯之接枝中空纖維多孔膜。
選取所得之接枝中空纖維膜之一部分，將其乾燥並測定重量，藉由式(1)算出接枝率，接枝率為66~73%。
於裝有接枝中空纖維多孔膜之反應容器中加入50體積濃度之二乙基胺水溶液，於30℃下循環5小時，靜置一整夜後，排出二乙基胺水溶液。繼而利用水充分清洗中空纖維多孔膜，將其乾燥，從而獲得作為蛋白質吸附多孔膜之接枝鏈上具有二乙基胺基之接枝中空纖維多孔膜。
選取所得之蛋白質吸附多孔膜之一部分，將其乾燥並測定重量，由式(2)算出配體轉化率，配體轉化率為91%。
又，蛋白質吸附多孔膜之外徑為3.6 mm，內徑為2.2 mm。
[製造例3]模組成型
使製造例2所製造之蛋白質吸附多孔膜於裝有纖維有效長度為9.4 cm、纖維數量為1根之模組中成型。
[蛋白質吸附多孔膜之吸附能力評價]
作為表示蛋白質吸附多孔膜之吸附能力之用語，業界廣泛使用「平衡吸附容量」(或「靜態吸附容量」)與「動態吸附容量」。
所謂「動態吸附容量」，意指使含有蛋白質之原液通過蛋白質吸附多孔膜時，該原液之透過液之蛋白質濃度達到基準濃度之時間點之吸附容量。該基準濃度稱作破開點，通常作為破開點，相對於通過之原液之蛋白質濃度，該原 液之透過液之蛋白質濃度係選自5%~20%之範圍。
再者，一般而言，吸附量可使用重量、體積或莫耳數等適於表示其特性之單位。又，作為蛋白質吸附多孔膜之單位量而表示之吸附容量，不僅可使用單位體積，亦可使用單位重量等適於表示其特性之單位。
求吸附容量時，膜體積係於由上述式(8)算出之圓環剖面體積(V)中，將有助於吸附之有效膜長代入式中之L而求得之體積。有效膜長係自用於測定之中空纖維之長度中減去用以與裝置連接之連接器等之接觸部分之長度(無助於吸附之長度)而算出。再者，平板膜之情形時之膜體積為有效膜面積與膜厚度相乘而得之值。
對於根據製造例3而製造之模組，平衡吸附容量及動態吸附容量之測定係連接於通用HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析)系統(GE Healthcare Japan AKTAexplorer100)而進行。根據製造例3，由製造例1、2所製造之同一批次之蛋白質吸附多孔膜製作複數個模組，平衡吸附容量之測定與動態吸附容量之測定使用不同模組個體。平衡吸附容量及動態吸附容量之任一情形時，均為監控原液之透過液之吸光度，並對所得之層析圖進行數值解析而求出。再者，動態吸附容量係以達到蛋白質原液(1 mg/mL)之吸光度之10%之原液透過液量作為破開點而算出。
[評價例1]多層度
製造例2所獲得之蛋白質吸附多孔膜之比表面積SM 為6.8 m2 /g。再者，測定時使用BECKMAN COULTER股份有限公司製造之比表面積/微孔分佈測定裝置(Coulter SA3100系列)，利用BET法進行。
將BSA1分子之佔有面積SP =16×10-18 (m2 )、分子量Mr =67500(g/mol)、阿佛加德羅常數NA =6.02×1023 (/mol)代入式(5)中進行計算，算出理論單層吸附容量4.8×10-2 (g/g)。
平衡吸附容量係使用BSA進行，對原液之透過液之280 nm吸光度進行監控。BSA之平衡吸附量(式4之分子)為45 mg，模組成形之蛋白質吸附多孔膜之重量W為226 mg。因此，根據式(4)，平衡吸附容量為0.20 g/g。
因此根據式(3)，算出多層度為4.2。
[評價例2]重複動態吸附容量之評價
將模組連接於上述之通用HPLC系統，重複進行吸附步驟、清洗步驟及溶出步驟，算出吸附步驟中之動態吸附容量。再者，於測定時，使用BSA，對原液之透過液之280 nm吸光度進行監控。
吸附步驟後，經由清洗步驟、溶出步驟而測定吸附容量，依序重複複數次，測定每次之動態吸附容量。將第1次之動態吸附容量(即，第一次吸附蛋白質時之動態吸附容量)設為100，算出溶出步驟後之吸附時之動態吸附容量之比作為「保持率(%)」，比較利用溶出方法而得之效果之程度。認為保持率越接近100，溶出效果越大。
再者，動態吸附容量係動態吸附量(mg)除以式(8)所求得之膜體積V(mL)，單位設為mg/mL。
於本實施例中，使用以下之試劑等。
<三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(tris hydroxymethyl aminomethane hydrochloride,Tris HCl)緩衝液(緩衝液)>
將三(羥甲基)胺基甲烷(Nacalai Tesque股份有限公司製造)4.84 g溶解於約1.9 L之超純水中，加入鹽酸，將pH值調整為8後，進行定容，設為2 L、濃度20 mmol/L(pH值為8)。其後，使用通過孔徑0.45 μm之過濾器者。
<BSA溶液>
使用通常使用之BSA(牛血清白蛋白，Sigma-Aldrich製造)作為樣本蛋白質。進行生物技術之純化裝置之性能顯示時，通常使用經純化之蛋白質溶液作為樣本。
於20 mmol/L(pH值為8)三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液1 L中溶解BSA 1 g，使用通過孔徑0.45 μm之過濾器者。
<鹽緩衝液>
將三(羥甲基)胺基甲烷(Nacalai Tesque股份有限公司製造)4.84 g溶解於約1.9 L之超純水中，繼而溶解NaCl(和光純藥工業股份有限公司製造之特級試劑)117 g後，加入鹽酸，將pH值調整為8。進行定容，製備2 L、濃度1 mol/L之含有氯化鈉之緩衝液。其後，使用通過孔徑0.45 μm之過濾器者。
<氫氧化鈉水溶液(鹼)>
使用1 mol/L氫氧化鈉水溶液(和光純藥工業股份有限公司製造之特級試劑)。
將溶出步驟中之溶出液之流動方向相對於吸附步驟中之 流動方向，以相同方向通過之情形記作「順向」，以相反之方向通過之情形記作「反向」。又，於全部實施例及比較例中，任一步驟均以評價流速為3 mL/min(5 MV/min)進行。
[實施例1]
關於製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組，以內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，反向)、鹽緩衝液(20 mL，反向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為47.7 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為45.9 mg/mL，保持率為96%。
[實施例2]
關於製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組，以內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，順向)、鹽緩衝液(20 mL，反向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為58.6 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為50.5 mg/mL，保持率為86%。
[實施例3]
關於製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組，以 內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，反向)、鹽緩衝液(20 mL，順向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為51.4 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為43.5 mg/mL，保持率為85%。
[比較例1]
關於製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組，於溶出步驟中，全部順向通過，除此以外，以與實施例1相同之溶出液、通過順序及通過量通過。
以內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，順向)、鹽緩衝液(20 mL，順向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為51.2 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為40.0 mg/mL，保持率為78%。
[比較例2]
關於製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組，以內壓式(自中空部內側向外側通過)對製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL反向通過，繼而使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步 驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，順向)、鹽緩衝液(20 mL，順向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為55.5 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為42.7 mg/mL，保持率為77%。
將實施例1~3及比較例1、2之結果示於表1。
於於比較例1中，保持率為78%，與此相對，實施例1之保持率為96%，實施例2之保持率為86%，實施例3之保持率為85%，藉由使溶出液以與吸附方向反向之方式通過獲 得之效果得以證實。
於比較例2中，於清洗步驟中使緩衝液反向通過之情形時，重複10次後吸附容量之保持率為77%。於實施例1~3中，藉由使溶出液反向通過獲得之效果得以證實。
[實施例4]
作為1種溶出液，例示使用鹽緩衝液進行溶出步驟時之實施例。
關於製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組，以內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(20 mL，反向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為49.5 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為42.2 mg/mL，保持率為85%。
[比較例3]
關於製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之模組，於溶出步驟中為順向通過，除此以外，以與實施例4相同之溶出液及通過量通過。
以內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(20 mL，順向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為38.7 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為27.5 mg/mL，保持率為71%。
將實施例4及比較例3之結果示於表2。
於比較例3中，保持率為71%，與此相對，實施例4之保持率為85%，藉由使溶出液以與吸附方向反向之方式通過獲得之效果得以證實。
以下表示實施例5~11、比較例4~10中，針對各種接枝率及多層度之蛋白質吸附多孔膜，使溶出液反向通過時之結果(將結果匯總示於表3)。
[實施例5]
以製造例1所製造之聚乙烯製中空纖維多孔膜作為基材，藉由接枝反應，獲得蛋白質吸附多孔膜。接枝反應除將反應液中之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)：甲醇之混合比設為13.9質量份：86.1質量份以外，按照製造例2進行。所得之蛋白質吸附多孔膜之接枝率為195%，配體轉化率為98%。又，外徑為4.4 mm，內徑為2.8 mm。
選取3根所得之蛋白質吸附多孔膜，分別以與製造例3相同之方式成形模組(5A、5B、5C)。
按照評價例1對模組5A實施測定，算出多層度，為5.5。
按照評價例2對模組5B實施重複動態吸附容量之評價。以內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，反向)、鹽緩衝液(20 mL，反向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為73.9 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為69.5 mg/mL，保持率為94%。
[比較例4]
針對實施例5所製造之模組5C，除於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，順向)、鹽緩衝液(20 mL，順向)、及溶出液全部順向通過以外，以與實施例5相同之方式進行評價。
第1次吸附之動態吸附容量為75.0 mg/mL，重複10次後 之動態吸附量為52.7 mg/mL，保持率為70%。
於多層度為5.5之情形時，相對於比較例4之保持率70%，實施例5之保持率為94%，提高保持率。再者，以(以反向實施溶出時之保持率)/(僅以順向實施溶出時之保持率)表示保持率之提高率，為134%。
[實施例6]
以製造例1所製造之聚乙烯製中空纖維多孔膜作為基材，藉由接枝反應，獲得蛋白質吸附多孔膜。接枝反應除將反應液中之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)：甲醇之混合比設為9.4質量份：90.6質量份以外，按照製造例2進行。所得之蛋白質吸附多孔膜之接枝率為131%，配體轉化率為97%。又，外徑為4.1 mm，內徑為2.5 mm。
選取3根所得之蛋白質吸附多孔膜，分別以與製造例3相同之方式成形模組(6A、6B、6C)。
按照評價例1對模組6A實施測定，算出多層度，為4.5。
按照評價例2對模組6B實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與實施例5完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，朝反向通過)
第1次吸附之動態吸附容量為56.4 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為54.1 mg/mL，保持率為96%。
[比較例5]
針對實施例6所製造之模組6C，按照評價例2實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順 序、通過量、通過方向與比較例4完全相同之方式進行。 (即，於溶出步驟中，使溶出液全部順向通過)
第1次吸附之動態吸附容量為56.0 mg/mL，重複10次後之動態吸附量為40.9 mg/mL，保持率為73%。
於多層度為4.5之情形時，相對於比較例5之保持率73%，實施例6之保持率為96%，提高保持率。保持率之提高率為131%。
[實施例7]
以製造例1所製造之聚乙烯製中空纖維多孔膜作為基材，藉由接枝反應，獲得蛋白質吸附多孔膜。接枝反應除將反應液中之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)：甲醇之混合比設為6.1質量份：93.9質量份以外，按照製造例2進行。所得之蛋白質吸附多孔膜之接枝率為85%，配體轉化率為95%。又，外徑為3.8 mm，內徑為2.4 mm。
選取3根所得之蛋白質吸附多孔膜，分別以與製造例3相同之方式成形模組(7A、7B、7C)。
按照評價例1對模組7A實施測定，算出多層度，為4.3。
按照評價例2對模組7B實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與實施例5完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，朝反向之通過)
第1次吸附之動態吸附容量為55.0 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為53.9 mg/mL，保持率為98%。
[比較例6]
針對實施例7所製造之模組7C，按照評價例2實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與比較例4完全相同之方式進行。 (即，於溶出步驟中，使溶出液全部順向通過)
第1次吸附之動態吸附容量為54.4 mg/mL，重複10次後之動態吸附量為41.0 mg/mL，保持率為75%。
於多層度為4.3之情形時，相對於比較例6之保持率75%，實施例7之保持率為98%，提高保持率。保持率之提高率為130%。
[實施例8]
以製造例1所製造之聚乙烯製中空纖維多孔膜作為基材，藉由接枝反應，獲得蛋白質吸附多孔膜。接枝反應除將反應液中之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)：甲醇之混合比設為3.6質量份：96.4質量份以外，按照製造例2進行。所得之蛋白質吸附多孔膜之接枝率為50%，配體轉化率為98%。又，外徑為3.4 mm，內徑為2.1 mm。
選取3根所得之蛋白質吸附多孔膜，分別以與製造例3相同之方式成形模組(8A、8B、8C)。
按照評價例1對模組8A實施測定，算出多層度，為3.8。
按照評價例2對模組8B實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與實施例5完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，朝反向之通過)
第1次吸附之動態吸附容量為46.0 mg/mL，重複10次後 之動態吸附容量為44.6 mg/mL，保持率為97%。
[比較例7]
針對實施例8所製造之模組8C，按照評價例2實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與比較例4完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，使溶出液全部順向通過)
第1次吸附之動態吸附容量為46.4 mg/mL，重複10次後之動態吸附量為35.9 mg/mL，保持率為77%。
於多層度為3.8之情形時，相對於比較例7之保持率77%，實施例8之保持率為97%，提高保持率。保持率之提高率為125%。
[實施例9]
以製造例1所製造之聚乙烯製中空纖維多孔膜作為基材，藉由接枝反應，獲得蛋白質吸附多孔膜。接枝反應除將反應液中之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)：甲醇之混合比設為2.3質量份：97.7質量份以外，按照製造例2進行。所得之蛋白質吸附多孔膜之接枝率為32%，配體轉化率為96%。又，外徑為3.3 mm，內徑為2.0 mm。
選取3根所得之蛋白質吸附多孔膜，分別以與製造例3相同之方式成形模組(9A、9B、9C)。
按照評價例1對模組9A實施測定，算出多層度，為2.3。
按照評價例2對模組9B實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與實施例5完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，朝 反向之通過)
第1次吸附之動態吸附容量為21.1 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為20.7 mg/mL，保持率為98%。
[比較例8]
針對實施例9所製造之模組9C，按照評價例2實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與比較例4完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，使溶出液全部順向通過)
第1次吸附之動態吸附容量為21.4 mg/mL，重複10次後之動態吸附量為18.5 mg/mL，保持率為86.6%。
於多層度為2.3之情形時，相對於比較例8之保持率77%，實施例9之保持率為98%，提高保持率。保持率之提高率為113%。
[實施例10]
以製造例1所製造之聚乙烯製中空纖維多孔膜作為基材，藉由接枝反應，獲得蛋白質吸附多孔膜。接枝反應除將反應液中之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)：甲醇之混合比設為1.0質量份：99.0質量份以外，按照製造例2進行。所得之蛋白質吸附多孔膜之接枝率為14%，配體轉化率為97%。又，外徑為3.2 mm，內徑為1.9 mm。
選取3根所得之蛋白質吸附多孔膜，分別以與製造例3相同之方式成形模組(10A、10B、10C)。
按照評價例1對模組10A實施測定，算出多層度，為1.6。
按照評價例2對模組10B實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與實施例5完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，朝反向之通過)
第1次吸附之動態吸附容量為10.4 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為10.1 mg/mL，保持率為97%。
[比較例9]
針對實施例10所製造之模組10C，按照評價例2實施重複動態吸附容量之評價。以評價中之通過溶液種類、通過順序、通過量、通過方向與比較例4完全相同之方式進行。(即，於溶出步驟中，使溶出液全部順向通過)
第1次吸附之動態吸附容量為10.6 mg/mL，重複10次後之動態吸附量為9.9 mg/mL，保持率為93%。
於多層度為1.6之情形時，相對於比較例9之保持率93%，實施例10之保持率為97%，提高保持率。保持率之提高率為104%。
[實施例11]
於室溫下攪拌尼龍6(0.2 g)、二氯甲烷(10 g)、甲酸(0.1 g)，於其中添加第三丁基次氯酸鈉(2 g)，等待尼龍6溶解。於所得之溶液中，進而以總質量達到100 g之方式加入二氯甲烷，從而獲得用以形成塗層之N-氯-尼龍6溶液。
將孔徑0.45 μm、膜厚0.15 mm之含有纖維素衍生物之多孔質平板膜(日本Millipore股份有限公司製造)浸漬於N-氯-尼龍6溶液中，等待溶液含浸於多孔質部中。自含浸有溶 液之多孔質平板膜除去剩餘之溶液，首先將該膜於室溫下進行乾燥，繼而於80℃之熱風循環乾燥器內進而進行乾燥，最後於140℃下加熱15分鐘，藉此獲得纖維素衍生物之多孔質平板膜及具有覆蓋其表面之N-氯-尼龍6之覆膜之平板膜狀的基材。
於反應容器內充分攪拌具有甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)5%、Tween80(關東化學股份有限公司製造)0.3%及二亞硫磺酸鈉0.1%之組成之磷酸鈉緩衝液(pH值為7.5)。於該磷酸鈉緩衝液中投入上述之平板膜狀之基材，於室溫下進行12分鐘之接枝聚合反應。利用純水、丙酮依序清洗反應後之膜，之後於80℃下將其乾燥，藉此獲得具有接枝聚合GMA而形成之接枝鏈之接枝多孔質平板膜。接枝率為8%。
再者，該接枝率係以相對於經N-氯-尼龍6覆膜前之膜重量之接枝鏈重量而定義。即接枝率係由將上述式(1)變形而得之下述式(1)'算出。
W0 ：覆膜前之膜重量(g)
W0 '：導入接枝鏈前之基材重量(g)
W1 ：接枝聚合後之重量(g)
於裝有接枝多孔質平板膜之反應容器中加入50體積濃度之二乙基胺水溶液，於30℃下循環5小時，靜置一整夜 後，排出二乙基胺水溶液。繼而利用水充分清洗多孔質平板膜，並將其乾燥，從而獲得作為蛋白質吸附多孔膜之接枝鏈上具有二乙基胺基之接枝多孔質平板膜。根據上述式(2)求得之配體轉化率為96%。
使用該多孔質平板膜，成形平板膜模組(11A、11B、11C)。
按照評價例1對模組11A實施測定，算出多層度，為1.2。
按照評價例2對模組11B實施重複動態吸附容量之評價。即，任一步驟中均以評價流速為5膜體積/min進行。於吸附步驟中，自平板膜之表面向背面通過，其後於清洗步驟中，使緩衝液自表面向背面(順向)通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(順向)、氫氧化鈉水溶液(反向)、鹽緩衝液(反向)通過。此處，所謂反向，意指自平板膜之背面向表面通過。
第1次吸附之動態吸附容量為7.7 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為7.5 mg/mL，保持率為97%。
[比較例10]
針對實施例11所製造之模組11C，以與上述實施例11相同之方式評價重複動態吸附容量。但以通過方向全部為順向進行。
第1次吸附之動態吸附容量為8.4 mg/mL，重複10次後之動態吸附量為7.9 mg/mL，保持率為94%。
於多層度為1.2之情形時，相對於比較例10之保持率 94%，實施例11之保持率為97%，提高保持率。保持率之提高率為103%。
[實施例12]
對製造例1~3所得之蛋白質吸附膜多孔膜之3個模組，實施通過90℃之熱水1小時之處理(模組12A、12B、12C)。
按照評價例1對模組12A實施測定，算出多層度，為4.7。按照評價例2對模組12B實施重複動態吸附容量之評價。以內壓式(自中空部內側向外側通過)進行吸附步驟(緩衝液30 mL，BSA溶液40 mL)，其後於清洗步驟中，使緩衝液10 mL順向通過。然後，於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，反向)、鹽緩衝液(20 mL，反向)通過。
第1次吸附之動態吸附容量為58.5 mg/mL，重複10次後之動態吸附容量為56.7 mg/mL，保持率為97%。
[比較例11]
針對實施例12所製造之模組12C，除於溶出步驟中，使鹽緩衝液(15 mL，順向)、氫氧化鈉水溶液(20 mL，順向)、鹽緩衝液(20 mL，順向)、及溶出液全部順向通過以外，以與實施例5相同之方式進行評價。
第1次吸附之動態吸附容量為58.6 mg/mL，重複10次後之動態吸附量為42.2 mg/mL，保持率為72%。
藉由90℃之熱水處理，製造例1~3之多層度自4.2變大成為4.7。又，相對於比較例11之保持率72%，實施例12之保持率為97%，提高保持率。再者，保持率之提高率為 135%。
將實施例12及比較例11之結果示於表4。
本申請案係基於2011年9月30日提出申請之日本專利申請案(日本專利特願2011-217856號)者，其內容作為參照而引用於本文中。
[產業上之可利用性]
本發明可提供一種使用蛋白質吸附多孔膜之有效之蛋白質之純化方法。並且，本發明於高效地大量生產抗體醫藥方面，於目標蛋白質之純化時具有產業上之可利用性。

Claims (18)

  1. 一種蛋白質之純化方法，其係利用基材表面經具有蛋白質吸附能力之高分子覆蓋之多孔膜而進行者，且包括：吸附步驟：使含有吸附對象蛋白質之原液通過上述多孔膜，使該吸附對象蛋白質吸附於上述高分子上；溶出步驟：使溶出液通過上述多孔膜，使吸附於上述高分子之上述吸附對象蛋白質溶出至該溶出液中，於上述溶出步驟中，使至少1種溶出液以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過，其中上述溶出液係選自由含有鹽之水溶液、pH值經調整之水溶液、水、有機溶劑及該等之混合溶液所組成之群。
  2. 如請求項1之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜之多層度為1.1以上。
  3. 如請求項1或2之蛋白質之純化方法，其中上述高分子接枝於上述基材表面上，且上述高分子之接枝率為5%以上200%以下。
  4. 如請求項3之蛋白質之純化方法，其中上述高分子之接枝率為30%以上90%以下。
  5. 如請求項1或2之蛋白質之純化方法，其中於上述溶出步驟中，使上述溶出液以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向順向及反向之方式通過。
  6. 如請求項3之蛋白質之純化方法，其中於上述溶出步驟中，使上述溶出液以與上述吸附步驟中之上述原液之通 過方向順向及反向之方式通過。
  7. 如請求項1或2之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為離子交換膜，且上述溶出液包含含有鹽之水溶液或pH值經調整之水溶液。
  8. 如請求項3之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為離子交換膜，且上述溶出液包含含有鹽之水溶液或pH值經調整之水溶液。
  9. 如請求項7之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜，且上述溶出步驟包括：使pH值調整為上述吸附對象蛋白質之等電點與上述多孔膜之等電點之間以外的水溶液通過之步驟，及使含有鹽之水溶液通過之步驟，於任一步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
  10. 如請求項8之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜，且上述溶出步驟包括：使pH值調整為上述吸附對象蛋白質之等電點與上述多孔膜之等電點之間以外的水溶液通過之步驟，及使含有鹽之水溶液通過之步驟，於任一步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
  11. 如請求項9之蛋白質之純化方法，其中於使pH值經調整 之水溶液通過之上述步驟、及使含有鹽之水溶液通過之上述步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
  12. 如請求項10之蛋白質之純化方法，其中於使pH值經調整之水溶液通過之上述步驟、及使含有鹽之水溶液通過之上述步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
  13. 如請求項9之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜，且上述溶出步驟包括：使含有鹽之水溶液通過之第一步驟，使pH值調整為上述吸附對象蛋白質之等電點與上述多孔膜之等電點之間以外的水溶液通過之第二步驟，及使含有鹽之水溶液通過之第三步驟，於上述第一步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向順向之方式通過，於上述第二步驟及上述第三步驟中，以與吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
  14. 如請求項10之蛋白質之純化方法，其中上述多孔膜為弱鹼性陰離子交換膜或弱酸性陽離子交換膜，且上述溶出步驟包括：使含有鹽之水溶液通過之第一步驟，使pH值調整為上述吸附對象蛋白質之等電點與上述多孔膜之等電點之間以外的水溶液通過之第二步驟，及 使含有鹽之水溶液通過之第三步驟，於上述第一步驟中，以與上述吸附步驟中之上述原液之通過方向順向之方式通過，於上述第二步驟及上述第三步驟中，以與吸附步驟中之上述原液之通過方向反向之方式通過。
  15. 如請求項9之蛋白質之純化方法，其中上述溶出液係以上述吸附對象蛋白質之穩定pH予以調整。
  16. 如請求項10之蛋白質之純化方法，其中上述溶出液係以上述吸附對象蛋白質之穩定pH予以調整。
  17. 如請求項9之蛋白質之純化方法，其中上述溶出液為含有0.3mol/L以上之中性鹽之水溶液。
  18. 如請求項10之蛋白質之純化方法，其中上述溶出液為含有0.3mol/L以上之中性鹽之水溶液。
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