CN103857692A - 蛋白质纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种吸附蛋白质的纯化方法，该方法使用了蛋白质吸附多孔膜，方法中提供一种可抑制蛋白质的吸附能力降低的被吸附蛋白质的溶出方法。该方法包含吸附工序和溶出工序，在溶出工序中，使至少1种溶出液沿着与原液的通过方向相反的方向进行通过，所述原液是吸附工序中的含有吸附对象蛋白质的原液。

Description

蛋白质纯化方法
技术领域
本发明涉及一种用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆基体材料表面而成的多孔膜进行的蛋白质纯化方法。
背景技术
近年来，在生物技术产业中，期望确立一种可有效地大量生产及大量纯化蛋白质的技术。
一般而言，由于蛋白质通过使用源自动物的细胞株或大肠杆菌等菌体的培养来生产，因此，需要将作为目标的蛋白质(以下，有时记为“目标蛋白质”。)从培养液中分离且纯化。特别是为了将利用了抗体的医药品(抗体医药品)实用化，需要从细胞培养液中将细胞碎片等浑浊成分、及源自细胞的溶存的蛋白质等非浑浊成分除去，将其纯化至对人类的治疗用途而言充分的纯度。在该纯化工序中，使用蛋白质吸附多孔膜或空心颗粒(粒子状的吸附材料)等蛋白质吸附材料。
作为这样的蛋白质吸附材料，可以举出如专利文献1～5及非专利文献1中所记载那样的蛋白质吸附多孔膜。
最近，对抗体医药品的需要迅速增加，意向大量生产作为抗体医药品的蛋白质。而且，伴随培养技术的迅速进步，提高纯化工序的能力也成为了课题，特别是对提高可实现高流速处理的蛋白质吸附多孔膜的能力寄予期待。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2009/054226号
专利文献2:日本特开2009-53191号公报
专利文献3:日本特表2006-519273号公报
专利文献4:美国专利第6780327号说明书
专利文献5:美国专利第5547575号说明书
非专利文献
非专利文献1:Kyoichi Saito,CHARGED POLYPER BRUSH GRAFTEDONTO POROUS HOLLOW-FIBER MEMBRANE IMPROVES SEPARATIONAND REACTION IN BIOTECNOLOGY,Separation Science and Technology,ENGLAND,Taylar&Francis,2002,37(3),535-554
发明内容
发明所要解决的技术问题
一般而言，使含有作为吸附对象的蛋白质的原液(以下，有时记为“原液”)通过蛋白质吸附多孔膜通过，使蛋白质吸附后，再使吸附的蛋白质(以下，有时记为“被吸附蛋白质”)溶出，当实现纯化的目的之后，则将蛋白质吸附多孔膜废弃。但是，为了提高纯化工序的能力，要求重复使用蛋白质吸附多孔膜。
通过现有技术的处理使蛋白质吸附多孔膜再生而重复使用时，则存在吸附能力逐渐降低的倾向。
另外，如上所述，近年来从大量生产、大量纯化的需要考虑，则期望进一步提高蛋白质吸附多孔膜的吸附能力。作为提高吸附能力的方法，使蛋白质多层地吸附于有限的膜的细孔表面的方法很有效，但越是使更多的蛋白质多层地吸附于有限的膜的细孔表面，则越降低蛋白质吸附多孔膜再生而重复使用时的吸附能力，结果使这样的课题变得更显著。
用于解决问题的方案
吸附能力降低的原因之一，是因为全部被吸附的蛋白质无法完全溶出。因此，如果能够提高被吸附蛋白质的溶出效率，并使蛋白质吸附多孔膜再生，就可以抑制因重复使用而引起的吸附能力的降低。
本发明人等为了解决上述课题进行了潜心研究的结果发现，通过使至少1种溶出液沿着与吸附工序中的含有吸附对象蛋白质的原液的通过方向相反的方向通过，可以解决上述课题而完成本发明。此外，本发明人等还发现，通过多层地吸附蛋白质的蛋白质吸附多孔膜，则上述方法可以更有效地发挥作用，于是完成了本发明。
即，本发明如下所述。
一种蛋白质纯化方法，其是利用多孔膜进行的蛋白质纯化方法，所述多孔膜是基体材料表面被具有蛋白质吸附能力的高分子覆盖而形成的多孔膜，
该方法包括：
吸附工序，使含有吸附对象蛋白质的原液通过所述多孔膜，使该吸附对象蛋白质吸附于所述高分子；
溶出工序，使溶出液通过所述多孔膜，使吸附于所述高分子的所述吸附对象蛋白质溶出在该溶出液中，
在所述溶出工序中，使至少1种溶出液沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过。
如[1]所述的蛋白质纯化方法，其中，所述溶出液选自：含有盐的水溶液、调整了pH的水溶液、水、有机溶剂及它们的混合溶液。
如[1]或[2]所述的蛋白质纯化方法，其中，在所述溶出工序中，使所述溶出液沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相同的方向和相反的方向通过。
如[1]～[3]中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述高分子接枝于所述基体材料表面，且所述高分子的接枝率为5%以上且200%以下。
如[4]所述的蛋白质纯化方法，其中，所述高分子的接枝率为30%以上且90%以下。
如[1]～[5]中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜为离子交换膜，且所述溶出液包含含有盐的水溶液或调整了pH的水溶液。
如[1]～[6]中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜的多层度为1.1以上。
如[6]或[7]所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜为弱碱性阴离子交换膜或弱酸性阳离子交换膜，且
所述溶出工序包括：
使pH调整为所述吸附对象蛋白质的等电点和所述多孔膜的等电点之间以外的水溶液通过的工序、以及
使含有盐的水溶液通过的工序，
在上述至少一个工序中，沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过水溶液。
如[8]所述的蛋白质纯化方法，其中，在使调整了pH的水溶液通过的所述工序及使含有盐的水溶液通过的所述工序中，沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过水溶液。
如[6]或[7]所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜为弱碱性阴离子交换膜或弱酸性阳离子交换膜，并且，
所述溶出工序包含：
使含有盐的水溶液通过的第一工序；
使pH调整为所述吸附对象蛋白质的等电点和所述多孔膜的等电点之间以外的水溶液通过的第二工序；以及
使含有盐的水溶液通过的第三工序，
在所述第一工序中，沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相同的方向通过水溶液，
在所述第二工序及所述第三工序中，沿着与吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过水溶液。
如[1]～[10]中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述溶出液被调整为所述吸附对象蛋白质稳定的pH。
如[1]～[11]中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述溶出液为含有0.3mol/L以上的中性盐的水溶液。
如[1]～[12]中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，其中，所述多孔膜是在通过液体或蒸汽进行了湿润化的状态下进行加热至50～110℃的处理而制造的。
发明效果
按照本发明，可提供一种被吸附蛋白质的溶出方法，用于在使用蛋白质吸附多孔膜的蛋白质纯化方法中抑制蛋白质的吸附能力的降低。
具体实施方式
下面，对本发明的优选的实施方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式，可以在其主旨的范围内进行各种变形而实施。
本实施方式的蛋白质纯化方法为如下方法：含有吸附工序和溶出工序，在溶出工序中，使至少1种溶出液沿着与吸附工序中含有吸附对象蛋白质的原液的通过方向相反的方向通过。
本实施方式中所使用的多孔膜，是含有基体材料和包覆于该基体材料表面且具有蛋白质吸附能力的高分子的膜，有时记为“蛋白质吸附多孔膜”。
另外，在本实施方式中，所谓“蛋白质吸附多孔膜”作为如下概念使用：该概念包含在称为整块体的具有一条或多条中空部的圆筒状多孔烧结体上包覆具有蛋白质吸附能力的高分子而形成的形态。因此，在本实施方式中，所谓“用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆基体材料表面而成的多孔膜”，也包含用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆表面而成的整块体(中空圆筒状的多孔烧结体)。
在本实施方式中，通过“蛋白质吸附多孔膜”这样的记载的例示，这种用高分子包覆的整块体(中空圆筒状的多孔质烧结体)也包含在其主旨的范围内。
在本实施方式中，通过使含有吸附对象蛋白质的原液通过蛋白质吸附多孔膜，使吸附对象蛋白质吸附于蛋白质吸附多孔膜。所谓含有吸附对象蛋白质的原液，是含有将要吸附于蛋白质吸附多孔膜的蛋白质的溶液，是指通过该膜之前的溶液。
在本实施方式中，通过该膜后的溶液记为“透过液”。
通常，在制造医药品时的实际生产线上，原液中除目标蛋白质以外，还含有没有用的蛋白质、菌体、病毒、浑浊成分等。也有通过前处理从原液中除去浑浊成分和/或菌体的情况。在本实施方式中，也可以为如下方法：使目标蛋白质作为吸附对象吸附于蛋白质吸附多孔膜，并使其它的成分透过后，仅使目标蛋白质溶出而回收的纯化方法；将其它的蛋白质(例如没有用的蛋白质)作为吸附对象进行吸附，使目标蛋白质透过而回收的纯化方法。即，所谓“吸附对象蛋白质”为吸附于蛋白质吸附多孔膜的蛋白质，并不限定于目标蛋白质。根据纯化方法，可以为目标蛋白质，也可以为没有用的蛋白质。另外，原液中所含的吸附对象蛋白质可以为1种，另外，也可以为1种以上。
在本实施方式中，所谓“吸附”是指蛋白质通过与蛋白质吸附多孔膜的细孔表面的相互作用而粘贴住，与仅接触的“附着”相区别。
在本实施方式中，有时将使含有吸附对象蛋白质的原液通过蛋白质吸附多孔膜并吸附吸附对象蛋白质的工序记为“吸附工序”。
接下来，有时进行冲洗“附着”于蛋白质吸附多孔膜的成分(即，不是吸附对象的蛋白质(非吸附蛋白质)或浑浊成分)的工序。将该工序记为“清洗工序”，与后述的“溶出工序”相区别。通过清洗工序，在蛋白质吸附多孔膜表面仍存在“吸附”的蛋白质。
最后，通过溶出液使吸附于蛋白质吸附多孔膜的被吸附蛋白质从蛋白质吸附多孔膜中溶出而被回收。在此所谓的溶出液是为用于使被吸附蛋白质溶出的液体，并不用作通过蛋白质吸附多孔膜而流出的溶液的含义。
在本实施方式中，有时将使溶出液通过蛋白质吸附多孔膜，使被吸附蛋白质从蛋白质吸附多孔膜溶出的工序记为“溶出工序”。
在本实施方式中，所谓溶出工序并不仅仅是从蛋白质吸附多孔膜中溶出被吸附蛋白质，也可以是使溶出液通过蛋白质吸附多孔膜从而使蛋白质吸附多孔膜再生的工序。即，溶出工序中，被吸附蛋白质在溶出液中的含量不特别地视为问题。
在溶出工序中，使至少1种溶出液沿着与吸附工序中原液的通过方向相反的方向通过，从而则可以纯化蛋白质，并使蛋白质吸附多孔膜再生。
在本实施方式中，在通过用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆基体材料表面而成的多孔膜进行的蛋白质纯化方法中，不仅提供抑制蛋白质吸附能力降低的被吸附蛋白质溶出方法，而且由于被吸附蛋白质的溶出为蛋白质吸附多孔膜的再生处理的一部分，因此，也可以认为可提供一种蛋白质吸附多孔膜的再生方法。
本实施方式的蛋白质纯化方法中的机理的详细情况尚不明确，但可以如下考察。
通常，在溶出工序中，溶出液沿着与吸附工序中原液的通过方向相同的方向通过。
本发明不拘泥于以下的理论，但认为如本实施方式所示，通过至少1次将溶出液的流动方向变为与原液的通过方向相反的方向通过溶出液，并通过导入到蛋白质吸附多孔膜中基体材料表面的具有蛋白质吸附能力的高分子链振动的效果，则可以溶出被吸附蛋白质。即、蛋白质有时以进入相邻的高分子链间的方式以多层堆积并吸附，潜入深处的蛋白质不易溶出。认为在吸附工序中，高分子链在原液的流动方向拉长。因此，认为在溶出工序中，通过使溶出液沿着与原液的流动方向相反的方向流动，则反捋高分子链，高效地溶出潜入深处的蛋白质，因此，可以得到重复使用时吸附能力降低得以抑制的膜，并使蛋白质吸附多孔膜再生。
作为蛋白质吸附材料，除蛋白质吸附多孔膜以外，也有时使用蛋白质吸附球进行蛋白质的纯化。在使用蛋白质吸附球的情况下，在筒状的容器(柱)中填充有蛋白质吸附球的状态下进行蛋白质的纯化。作为再生方法，有时使液体在容器中沿着与原液通过方向相反的方向流动，但这是为了除去浑浊或解开压密化后的球而进行的。即使让液体在容器中沿着相反方向流动，也难以控制各球粒子的表面的液体流动，并且从球表面连接至内部的细孔部内的蛋白质的移动扩散受到限制，因此，液体在容器中的流动方向不会对溶出造成影响，可以说本实施方式对于蛋白质吸附多孔膜为特别有效的再生方法。
作为蛋白质吸附多孔膜的形状，可以举出：平板膜、中空纤维膜等。
所谓平板膜是指片状的膜，片材的正面和反面通过作为贯穿孔的细孔而连续的平板膜。
所谓中空纤维膜是指具有中空部分的圆筒状或纤维状的膜，中空纤维膜的中空侧(内侧)和外侧通过作为贯穿孔的细孔而连通。
对蛋白质吸附多孔膜的形状而言，只要液体或气体可透过贯穿孔从正面向反面或从反面向正面、或从内侧向外侧或从外侧向内侧透过就没有特别限定。
通常，蛋白质吸附多孔膜仅有膜是无法有效使用的，为了通过液体，蛋白质吸附多孔膜在收纳于被称为组件的捆包容器中的状态下使用，从组件成型时的流路结构简单，且沿着与吸附工序中原液通过方向相反的方向的液体流通变得容易的方面考虑，优选中空纤维膜。组件结构只要是与各个蛋白质吸附多孔膜的形状对应的公知的结构即可，在本实施方式中没有特别限定。
在本实施方式中，蛋白质吸附多孔膜的尺寸可根据组件设计、膜的制造方法、使用用途自由地选择。例如若为平板膜，则只要可在组件中成型且可通过液体，则可自由地设计片材的厚度、大小。若为中空纤维膜或整块体，则外径及内径只要可物理上地保持多孔膜的形状，则可自由地设计尺寸。
在本实施方式中，作为蛋白质吸附多孔膜的基体材料，若对于蛋白质的纯化中所使用并接触的液体具有耐受性，则可以使用公知技术的原材料。
例如可以举出：高分子材料、无机材料、及有机无机混合材料等，但从成形性的观点考虑，优选使用了高分子材料的高分子基体材料。
在使用高分子基体材料的情况下，从保持机械性质的观点考虑，高分子基体材料优选由聚烯烃类聚合物构成。
作为聚烯烃类聚合物，例如可以举出：乙烯、丙烯、丁烯等烯烃均聚物、2种以上该烯烃的共聚物等。
在使用碱性溶液作为溶出液的情况下，其中，优选机械强度特别优异、具有耐碱性的聚乙烯。
可通过热诱导相分离法、非溶剂相分离法、电子束照射法等公知技术将高分子基体材料制成多孔膜。
热诱导相分离法，是将聚烯烃类聚合物等高分子的溶液在高温下溶解，之后进行冷却的方法。在冷却过程中，高分子溶液网状地相分离为高分子和溶剂，因此，若在冷却后除去溶剂，则可得到多孔膜。其特征在于，可得到细孔径分布较小的多孔膜。
非溶剂相分离法，是将高分子溶液浸渍在非溶剂中的方法。通过非溶剂浸渍在高分子溶液中，高分子的溶解度降低，高分子网状地析出，从而可得到多孔膜。其特征在于，可得到带细孔径倾斜的多孔膜。
电子束照射法，是对制成膜状的高分子照射电子束，形成多个贯穿孔，从而得到多孔膜的方法。可得到均匀的细孔径的多孔膜。
在本实施方式中，可根据制作的蛋白质吸附多孔膜的设计从这些方法中适宜选择。
本实施方式中的基体材料的平均细孔径只要可考虑吸附对象蛋白质的种类、混合存在的浑浊成分、溶液的粘度等实现工艺所需要的分离?纯化度及通过速度就没有特别限定。以可除去浑浊成分的方式设计平均细孔径的上限，以可实现期望的通过速度的方式设计平均细孔径的下限，该平均细孔径优选为0.001μm～10μm，更优选为0.01μm～10μm，进一步优选为0.1μm～1μm。
基体材料中的细孔所占的体积比率，即孔隙率只要在可保持蛋白质吸附多孔膜的形状且实现通过速度的范围就没有特别限定。以可保持形状的方式设计孔隙率的上限，以可实现期望的通过速度的方式设计平均细孔径的下限，该孔隙率优选为5%～99%，更优选为10%～95%，从实用的方面考虑，进一步优选为30～90%。
平均细孔径及孔隙率的测定例如可以通过Marcel Mulder著“膜技术”(株式会社IPC)中所记载那样的本领域从业人员通常采用的方法来进行。作为测定方法的具体例，可以举出：利用电子显微镜的观察、始沸点法、水银压入法、透过率法等。
在本实施方式中，基体材料的表面优选细孔的至少一部分用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆。
作为高分子，例如可以举出直链状高分子、交联型的高分子等。从相反方向的溶出液的流动可有效地溶出嵌入高分子链间的蛋白质的方面考虑，优选直链状高分子。
蛋白质吸附多孔膜根据包覆基体材料表面的高分子的官能团，可分类为离子交换膜、群特异性亲和吸附膜、个别特异性亲和吸附膜、疏水性相互作用吸附膜。离子交换膜细分为强酸性阳离子交换膜、弱酸性阳离子交换膜、强碱性阴离子交换膜、及弱碱性阴离子交换膜。
在本实施方式中，这些官能团可根据被吸附蛋白质的种类、优选目标蛋白质的种类、要求的纯化度等选择适当的官能团。
作为强酸性阳离子交换膜的官能团，例如可以举出：磺酸基(-SO3 -)等，作为弱酸性阳离子交换膜的官能团，例如可以举出：羧酸基(-COO-)等。
作为强碱性阴离子交换膜的官能团，例如可以举出：季铵基(Q、-N+R3)、季铵基乙基(QAE、-(CH2)2-N+R3)等。在此，R没有特别限定，与同一个N键合的R可以相同或不同，优选为烷基、芳基等烃基。更具体而言，可以举出：三甲基氨基(TMA、-N+Me3)等。
作为弱碱性阴离子交换膜的官能团，例如可以举出：伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NHR)、叔氨基(-NR2)等，具体而言，可以举出：二乙基氨基乙基(DEAE、-(CH2)2-NEt2)、二乙基氨基丙基(DEAP、-(CH2)3-NEt2)等。在此，R也没有特别限定，与同一个N键合的R可以相同或不同，优选表示烷基、芳基等烃基。
作为群特异性亲和吸附膜的官能团，例如可以举出：Cibacron BlueF3G-A、Protein A、伴刀豆球蛋白A、肝素、单宁、金属螯合基团等。
作为个别特异型亲和吸附膜的官能团，例如可以举出抗原、抗体类等。
作为疏水性相互作用吸附膜的官能团，例如可以举出：烷基或芳香族类官能团。烷基从进一步提高疏水性的相互作用、提高吸附能力的观点考虑，优选碳原子为4个以上。
在本实施方式中，关于将包覆基体材料表面的具有蛋白质吸附能力的高分子导入基体材料表面的方法，例如可以举出：化学反应或高分子涂布等。在本实施方式中，可以根据基体材料的材质、蛋白质吸附多孔膜的使用用途、制造方法等观点选择最佳的方法，也可应用于被称为整块体的多孔质烧结体。
作为通过化学反应，用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆基体材料表面的方法，例如可以举出：放射线接枝聚合法等。放射线接枝聚合法为对基体材料照射γ射线等放射线使基体材料表面活化而使单体聚合的方法。与后述的利用高分子涂布的包覆方法相比，可以期待基体材料和包覆基体材料表面的高分子的牢固的结合。进而，由于不需要聚合引发剂等试剂，因此，从可减轻在反应后清洗这些试剂的负荷的观点考虑，可优选使用。
放射线接枝聚合法中包含(1)将包含具有蛋白质吸附能力的官能团的单体直接接枝聚合于基体材料上接枝聚合的方法、或(2)将含有可导入具有蛋白质吸附能力的官能团的官能团的单体接枝聚合于基体材料上，接下来，导入具有蛋白质吸附能力的官能团的方法，任一方法均可以采用。
在本实施方式中，有时将通过接枝聚导入的高分子称为“接枝链”。
作为上述(1)所示的方法可通过一阶段的反应得到具有蛋白质吸附能力的高分子的包覆层，因此，是简便且优选的方法。
作为(1)的方法中所使用的上述单体，没有特别限定，例如可以举出：甲基丙烯酸酯衍生物、乙烯基化合物、烯丙基化合物等，具体而言，可以举出：甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸磺丙酯、乙烯基苄基三甲基氯化铵、烯丙基胺等。
作为上述(2)所示的方法，从容易使各种具有蛋白质吸附能力的官能团的变化一致或容易使具有蛋白质吸附能力的官能团的导入率(以下，有时记为“配体转化率”。)的变化一致这样的观点考虑，是优选的方法。
作为(2)的方法中所使用的上述单体，没有特别限定，例如可以举出：具有反应性较高的环氧基的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)等。
在通过放射线接枝聚合法导入具有蛋白质吸附能力的高分子的情况下，接枝链的量(以下，有时记为“接枝率”。)及配体转化率有时对蛋白质吸附多孔膜的吸附能力及机械强度造成影响。
在本实施方式中，接枝率(dg[%])基于放射线接枝聚合前后的相对于基体材料的增加重量而定义，可通过下述式(1)求得。
[数学式1]
dg [ % ] = W 1 - W 0 W 0 × 100 - - - ( 1 )
W0：基体材料重量(g)
W1：放射线接枝聚合后的重量(g)
在本实施方式中，配体转化率(T[%])以具有蛋白质吸附能力的官能团相对于接枝链中的可导入具有蛋白质吸附能力的官能团的官能团的存在比例而定义，可以通过下述式(2)求得。
[数学式2]
T [ % ] = ( W 2 - W 1 ) / M 2 { ( W 1 - W 0 ) / M 1 } × a × 100 - - - ( 2 )
W0：基体材料重量(g)
W1：放射线接枝聚合后的重量(g)
W2：具有蛋白质吸附能力的官能团导入后的整体重量(g)
M1：接枝链单体单元的分子量(g/mol)
M2：具有蛋白质吸附能力的官能团的分子量(g/mol)
a：每1分子接枝链单体的可导入具有蛋白质吸附能力的官能团的官能团数
在上述式(2)中，在使用GMA作为含有可导入具有蛋白质吸附能力的官能团的官能团的单体而导入接枝链的情况下，在该单体中，可导入官能团的官能团为一个环氧基，因此，a=1。
在本实施方式中，为了在有限的细孔表面吸附大量的蛋白质，接枝率优选为更大的接枝率。然而，若增大接枝率，则接枝链将细孔空间横切，与对向的细孔表面接触，因改变液体通过方向引起的接枝链的摇动减少，被吸附蛋白质的溶出的效率降低，因此，接枝率优选为5%～200%。此外，若增大接枝链，则细孔空间变小，因此，通液压上升，有时无法实现期望的通过速度，因此，更优选为20%～150%。另外，若增大接枝链，则有时机械强度也降低，因此，从实用方面的观点考虑，进一步优选为30%～90%。
从得到更高的吸附容量这样的观点考虑，配体转化率优选为20%～100%，更优选为50%～100%，进一步优选为70%～100%。
导入配体后，继续进行蛋白质吸附多孔膜的干燥工序、组件成形工序和制造工序，作为蛋白质吸附多孔膜，若对机械强度、吸附性能等没有实用性能方面的影响，则在各个工序中可选择适当的方法。另外，也可以增加适宜追加的工序，也可以省略。
例如，在组件成形工序之后，可对蛋白质吸附多孔膜实施在通过液体或蒸汽湿润化的状态下进行加热的处理(湿热处理)工序。通过该湿热处理，有时吸附能力提高，因此，优选实施该湿热处理。
该湿热处理中所使用的液体优选为纯水或水溶液。水溶液只要为含有无机盐的水溶液就没有特别限定。从保护处理装置的观点、减轻调整水溶液的作业负荷的观点考虑，优选使用纯水。
另外，该湿热处理的温度优选50～110℃，从使用纯水时的作业性及该湿热处理的效果的观点考虑，更优选60～95℃。
作为通过化学反应，用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆基体材料表面的方法，也可以举出使用了聚合引发剂的接枝聚合法。其为使用聚合引发剂将基体材料活化，使单体聚合，将接枝链导入基体材料表面的方法。从即使对于利用放射线的活化困难的基体材料也可进行接枝聚合的方面及不需要放射线照射设备的方面考虑，可优选使用。例如在将通过公知技术制造的整块体等多孔质烧结体作为基体材料的情况下，有时用作包覆其表面的方法。
作为通过高分子涂布，用具有蛋白质吸附能力的高分子包覆基体材料表面的方法，例如可以举出：将含有具有蛋白质吸附能力的官能团的高分子涂布在基体材料上，通过交联剂将高分子固定于基体材料表面的方法等。作为这种方法，例如在专利文献4中公开有具体的方法。此外，可以举出：在基体材料表面形成聚合物或聚合物前体的被膜，以构成该被膜的高分子作为聚合引发点而得到新的接枝聚合物的方法等。作为这种方法，例如在专利文献5中公开有具体的方法。
作为可应用本实施方式的蛋白质纯化方法的蛋白质吸附多孔膜，例如可以举出专利文献1～5中记载的膜等。
在专利文献1中，公开有一种在细孔表面具有接枝链，在该接枝链上固定有阴离子交换基的多孔膜。报导了蛋白质以多层吸附在将具有离子交换基的聚合物刷(直链状的接枝链)导入细孔表面的与专利文献1同样的多孔质中空纤维膜上(非专利文献1)。
即，可以说专利文献1中记载的膜使溶出液反向流动，反捋聚合物链，有效地溶出被吸附蛋白质的本纯化方法为特别有效地发挥作用的膜。
在专利文献2中，公开了一种多孔质基体材料用具有伯氨基键合的交联聚合物的吸附材料覆盖的多孔质吸附介质。覆盖基体材料的皮膜聚合物记载有“将蛋白质及其它的杂质捕获于该皮膜的深处”。可以说专利文献2中记载的膜为本纯化方法有效地发挥作用的膜。
在专利文献3中，公开了一种多个孔延伸的支承体构成部件及含有配制在该支承体构成部件的孔中且充满该支承体构成部件的孔的巨多孔质交联凝胶而成的复合材料。
在专利文献4中，公开了一种包含具有阳离子官能团(在本实施方式中，是指“阴离子交换型的官能团”)的交联被膜和多孔质基体材料的带正电的多孔质膜。作为制造方法的一个例子，例如示出以下的方法。首先，在二烯丙基胺和具有季铵型的官能团的甲基丙烯酸酯衍生物的共聚合物中添加具有环氧基的试剂(例如表氯醇)，由此使其活化。另外，配合由五亚乙基六胺和缩水甘油基三甲基氯化铵构成的交联剂。然后，将作为基体材料的多孔膜浸渍在活化后的共聚合物和交联剂的溶液中，由此可得到蛋白质吸附膜。
在专利文献5中，公开了一种在高分子多孔质基体材料膜表面形成N-卤代的化合物(聚合物或聚合物前体)的被膜，使接枝引发剂和单体接触，在基体材料上接枝聚合的膜。作为具体例，记载有如下的膜：使用N-卤代的尼龙66作为上述N-卤代的化合物，使用GMA作为上述单体，在纤维素制的多孔质膜上进行接枝聚合，然后，通过利用由磺酸离子处理的环氧基的磺化而得到的膜。另外，还记载了在GMA的环氧基上导入由仲/叔胺得到的叔氨基/季铵基而成的膜。
可以举出这些专利文献1至5及非专利文献1中所公开的膜，是作为本实施方式的利用蛋白质吸附多孔膜的蛋白质纯化方法中可优选使用的蛋白质吸附多孔膜的例示。
在本实施方式中，所谓多层度，是表示被吸附蛋白质在蛋白质吸附多孔膜的有限的细孔表面上的吸附形态的指标。蛋白质吸附于蛋白质吸附多孔膜的细孔表面时，有在细孔表面上仅附着蛋白质的单层吸附，和在已吸附的蛋白质上还有其它的蛋白质层叠吸附的多层吸附。蛋白质吸附多孔膜的细孔表面的具有蛋白质吸附能力的高分子的结构，会对被吸附蛋白质的吸附形态造成影响，因此，可以说多层度为间接地表示细孔表面的高分子结构的指标。所谓本实施方式中的多层度，是指蛋白质吸附于蛋白质吸附多孔膜的细孔表面上直至最密填充、且平衡吸附量时的BSA(牛血清白蛋白)换算的层数。即，用任意的蛋白质测定平衡吸附量，用于测定的任意的蛋白质设为BSA的粒子尺寸时的换算层叠数为多层度，在根据评价对象的蛋白质吸附多孔膜使用任意的尺寸的蛋白质进行测定的情况下，也可设定为较细孔的表面的高分子结构的指标。
例如，在非专利文献1中公开多层度的概念自身，是蛋白质的多层粘合度(degree of multilayer binding of protein)，对该领域从业人员而言，是已知的概念。
在本实施方式中，多层度为由下述式(3)求得的值。
[数学式3]
多层度＝(平衡吸附容量)/(理论单层吸附容量)
所谓“平衡吸附容量”，是表示蛋白质吸附多孔膜的吸附能力的术语，在业界被广泛使用。是指使含有吸附对象蛋白质的原液通过蛋白质吸附多孔膜时，原液的透过液的蛋白质浓度达到与原液的蛋白质的浓度平衡的时刻(吸附平衡)为止的吸附容量，由下述式(4)求得。
所谓“吸附容量”是指将吸附量换算为每单位膜量的值的数值，所谓“吸附量”是指蛋白质吸附多孔膜所吸附的被吸附蛋白质的重量。
另外，评价吸附容量时，与用于实际的生产线上的情况不同，通常用将纯化的蛋白质制成溶液的原液进行评价。
[数学式4]
Figure BDA0000483675630000141
C0：原液的蛋白质的浓度[g/L]
C：原液透过液的蛋白质浓度[g/L]
Q：累积的原液透过液量[L]
Qe：达到吸附平衡时的原液透过液量[L]
W：蛋白质吸附多孔膜的重量[g]
平衡吸附容量的测定，使用市售的实验用蛋白质进行，将其换算为BSA的蛋白质的多层度(后面详细叙述)。用于测定的蛋白质可根据蛋白质吸附多孔膜任意选择。例如，在强碱性阴离子交换膜及弱碱性阴离子交换膜中可优选使用BSA。另一方面，在强酸性阳离子交换膜及弱酸性阳离子交换膜中可优选使用溶菌酶。
用于评价的蛋白质溶液的pH，只要是蛋白质吸附于蛋白质吸附多孔膜上时，蛋白质不变性且稳定的pH区域即可。例如在离子交换膜的情况下，使用pH调整为蛋白质的等电点(pI)和离子交换膜的pI之间的pH的含有蛋白质的原液。关于蛋白质的pI和离子交换膜pI的关系后面详细叙述。
所谓“理论单层吸附容量”是以蛋白质吸附多孔膜的比表面积除以蛋白质1分子的占有面积，由此算出理论上在表面最密排列的蛋白质数，使用阿佛加德罗常数(NA)和蛋白质的分子量(Mr)，由下述式(5)求得。
[数学式5]
理论单层吸附容量[g-单层吸附量/g-膜]＝(SM/SP)(Mr/NA)
SM：蛋白质吸附多孔膜的比表面积[m2/g]
SP：蛋白质1分子的占有面积[m2]
Mr：BSA的分子量[g/mol]
NA：阿佛加德罗常数[/mol]
在本实施方式中，如上所述，将多层度设为BSA换算的层叠数。因此，将理论单层吸附容量设为BSA换算的理论单层吸附容量。即，在式(5)中，蛋白质1分子的占有面积SP根据BSA的粒子尺寸(4.0nm×4.0nm×11.5nm)，为SP=4.0nm×4.0nm=16nm2、分子量Mr使用67500。
蛋白质吸附多孔膜的比表面积SM可以通过氮吸附法(BET法)进行测定。
多层度优选蛋白质吸附多孔膜的细孔表面的高分子链的易拉长度(即，溶出的效果的大小)更大。但是，通过多层度变多，通液压上升，不易实现期望的通过速度，因此，多层度优选设为15以下，多层度更优选1.1～15，进一步优选2～15，更进一步优选3～15。
在本实施方式中，吸附工序可以与使用通常的蛋白质吸附多孔膜的纯化方法同样地实施，以如下顺序进行：(1-1)利用缓冲液进行蛋白质吸附多孔膜的平衡化、(1-2)通过含有吸附对象蛋白质的原液进行蛋白质向蛋白质吸附多孔膜上的吸附。
上述(1-1)工序是通过流通缓冲液来使负责蛋白质吸附功能的高分子的状态(电荷状态等)平衡化的工序，是作为蛋白质吸附的准备步骤进行的。
上述(1-2)工序是使含有吸附对象蛋白质的原液通过平衡化了的蛋白质吸附多孔膜，由此使吸附对象蛋白质吸附于蛋白质吸附多孔膜上的工序，本实施方式中的吸附工序是作为必需的步骤进行的。
在(1-2)工序中，吸附的蛋白质可适宜选择，可以举出：吸附目标蛋白质，然后溶出回收的方法，和吸附没有用的蛋白质，使目标蛋白质通过并回收的方法。
本实施方式中所使用的缓冲液，只要根据纯化工艺、吸附对象蛋白质的种类、具有蛋白质吸附能力的官能团的种类(疏水性相互作用膜、离子交换膜、群特异性亲和吸附膜、个别特异性亲和吸附膜)选择适当的缓冲液就没有特别限定，可适宜选择。例如可以举出：盐酸-氯化钾缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液、磷酸缓冲液、三盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等，可根据吸附对象蛋白质及纯化工艺选择适当的缓冲液。
在本实施方式中，吸附对象蛋白质的分子量，只要该蛋白质可吸附于蛋白质吸附多孔膜的细孔表面就可以任意地选择。只要是可通过溶出液溶出、并比蛋白质吸附多孔膜的细孔径小、且可通过细孔内的分子尺寸即可，优选1,000～1,000,000，更优选1,000～500,000，进一步优选1,000～300,000。
为了提高在其后进行的溶出工序中所回收的蛋白质的纯化纯度，可根据需要实施清洗工序。例如，在回收被吸附蛋白质的情况下，通过预先冲洗吸附于蛋白质吸附多孔膜的原液中所含的浑浊成分、或没有用的蛋白质来避免混入接下来溶出工序中所回收的蛋白质中的情况下，即可实施清洗工序。
在本实施方式中，在溶出工序中通过流通溶出液进行被吸附蛋白质的溶出。在被吸附蛋白质作为目标蛋白质的情况下，回收透过蛋白质吸附多孔膜而得到的溶出液的透过液。另外，在被吸附蛋白质是没有用的蛋白质的情况下，也可以废弃透过蛋白质吸附多孔膜的溶出液的透过液。
在任一情况下，在本实施方式中，在溶出工序中，溶出液可以使1种或切换多种溶出液通过，使至少1种溶出液沿着与吸附工序中的原液的通过方向相反的方向通过，由此可使蛋白质吸附多孔膜再生。
本实施方式的蛋白质纯化方法，是使用蛋白质吸附多孔膜的纯化方法，所述蛋白质吸附多孔膜含有基体材料和包覆于该基体材料表面且具有蛋白质吸附能力的高分子，且也可以是在吸附工序后的溶出工序中，以至少1种溶出液通过蛋白质吸附多孔膜时，使上述溶出液中至少任1种溶出液沿着与吸附工序中原液的通过方向相反的方向通过。
在本实施方式中，在溶出工序中，在进行多次溶出的情况下，只要其中至少1次使溶出液沿着与吸附工序中原液的通过方向相反的方向通过即可，溶出液反向通过的次数没有特别限定，也可以多次反向通过。也可以在全部多次溶出中，使溶出液沿着与吸附工序中原液的通过方向相反的方向通过。
在本实施方式中，所谓“反向通过”，在蛋白质吸附多孔膜为平板膜，且在吸附工序中从正面(一面)向反面(另一面)通过时，是指从反面(另一面)向正面(一面)通过的情况。在蛋白质吸附多孔膜为中空纤维膜，且在吸附工序中从中空纤维膜的内侧(一面)向外侧(另一面)通过时，是指从外侧(另一面)向内侧(一面)通过的情况，在吸附工序中从中空纤维膜的外侧(另一面)向内侧(一面)通时，是指从内侧(一面)向外侧(另一面)通过的情况。在本实施方式中，在使用组件反向通过液体的情况下，可以通过切换吸附工序中液体通过的组件入口和出口，并使之从出口侧向入口侧通过液体来进行。另外，组件入口侧和出口侧的切换也可以通过安装有组件的装置的配管的阀的切换来进行，另外，也可以从装置上暂时卸下并切换组件的安装方向。
本实施方式的溶出工序中所使用的溶出液，只要可溶出被吸附蛋白质就没有特别限定。
作为溶出液，选自含有盐的水溶液、调整了pH的水溶液、水、有机溶剂、及这些的混合溶液，可根据被吸附蛋白质的种类、分离目的、具有蛋白质吸附能力的官能团的种类(疏水性相互作用膜、离子交换膜、群特异性亲和吸附膜、个别特异性亲和吸附膜)等各个工艺来选择1种以上适当的溶出液。沿着与吸附工序中原液的通过方向相反的方向通过的至少1种溶出液，可以从上述溶出液中选择。
作为“混合溶液”，可以举出以期望的比例混合含有盐的水溶液、调整了pH的水溶液、或水和有机溶剂而成的混合溶液。
作为“有机溶剂”，可以举出通常在蛋白质的纯化中所使用的有机溶剂，例如可以举出：乙醇等醇类溶剂、乙腈等腈类溶剂等。
作为“调整了pH的水溶液”，可以举出利用碱(例如NaOH水溶液)或酸(例如盐酸)调整了pH的水溶液。另外，可以举出调整为期望的pH的缓冲液。后面详细叙述，但未将含有中性盐的缓冲液等归类为“调整了pH的水溶液”。为了方便，在本实施方式中，将含有中性盐的缓冲液归类为“含有盐的水溶液”，但这不是作为溶出液的实质溶出效果的差异的分类。
另外，在需要回收被吸附蛋白质的情况下，优选使用调整为被吸附蛋白质的稳定pH的溶出液。所谓稳定pH，是指被吸附蛋白质不变性的pH区域。
在使用“调整了pH的水溶液”的情况下，溶出工序中的通过方向可以为与吸附工序中原液的通过方向相同的方向，也可以为相反的方向，优选在之后进行中和操作。这种中和操作中的液体通过可以为相同的方向，也可以为相反的方向。中和操作可使用调整为期望的pH的含有盐的缓冲液作为“含有盐的水溶液”，也可以使用调整为期望的pH的缓冲液作为“调整了pH的水溶液”。
所谓“含有盐的水溶液”的“盐”是指中性盐，优选为NaCl(氯化钠)或KCl(氯化钾)等盐。
仅含有盐的水溶液既非酸性也非碱性，而是中性，作为本实施方式中的“含有盐的水溶液”，可含有中性盐，进而，也可以为pH调节后的缓冲液。即，含有中性盐的缓冲液分类为“含有盐的水溶液”。
如专利文献1中记载那样，若在低浓度的含有盐的溶液中，就可以实现蛋白质的吸附，因此，为了实施更有效的溶出，盐浓度优选为0.3mol/L以上，更优选为0.5mol/L以上，进一步优选为0.8mol/L以上，更进一步优选为1mol/L以上。盐浓度为0.3mol/L以上时，可保持蛋白质吸附多孔膜的机械强度及形状，通液压等使用上没有问题的浓度以下的含有中性盐的水溶液，可在本实施方式中合适地通过，这种通过可以沿相同方向通过，也可以沿相反方向通过。
所谓盐浓度为中性盐的浓度，不管其它的溶质的浓度。因此，可仅从中性盐水溶液、含有中性盐的缓冲液等中选择适当的溶液。
在溶出工序中，为了使蛋白质吸附多孔膜平衡化，通常使缓冲液通过。因此，考虑到再次移至吸附工序，从操作的简化的观点考虑，优选使用pH调节为与溶出工序中的原液相同的含有盐的缓冲液。
在群特异性亲和吸附膜或个别特异性亲和吸附膜的蛋白质吸附多孔膜中，优选使用可实现利用pH变化进行的被吸附蛋白质的溶出、调整为适当的pH的水溶液。
如上所述，在本实施方式中，所谓离子交换膜，是具有蛋白质吸附能力的官能团为离子交换型的官能团的蛋白质吸附多孔膜。作为蛋白质吸附多孔膜的离子交换膜的通用性较高，因此，可优选用于利用本实施方式的纯化方法解决课题方面。
以下，对离子交换膜中的本实施方式更具体地进行说明。
在离子交换膜中，作为溶出工序的溶出液，可选择至少包含“含有盐的水溶液”或“调整了pH的水溶液”的溶出液。
在离子交换膜中，强酸性阳离子交换膜、弱酸性阳离子交换膜、强碱性阴离子交换膜、及弱碱性阴离子交换膜全部可使用“含有盐的水溶液”作为溶出液，特别是弱酸性阳离子交换膜、弱碱性阴离子交换膜中也可使用“调整了pH的水溶液”作为溶出液。
通常，蛋白质在水溶液中，在等电点(pI)的pH时，蛋白质的总电荷为零，在超过pI的pH时为负，在低于pI的pH时，成为带正电的状态。另外，弱酸性阳离子交换膜及弱碱性阴离子交换膜也取决于pH。
在弱酸性阳离子交换膜中，在膜的pI以下时，电荷没有偏差，在超过pI时，带负电。因此，在蛋白质的pI以上且膜的pI以上的pH区域中，两者均带负电，因此，溶出被吸附蛋白质。另外，在蛋白质的pI以下且膜的pI以下时，两者的静电相互作用消失，因此，也会溶出被吸附蛋白质。即，蛋白质可吸附于膜的pH区域在蛋白质的pI和膜的pI之间，除此以外的pH区域中使用“调整了pH的水溶液”作为溶出液。
在弱碱性阴离子交换膜时也相同，弱碱性阴离子交换膜为膜的pI以上时，电荷没有偏差，若低于pI，则带正电。因此，在蛋白质的pI以上且膜的pI以上的pH区域中，两者的静电相互作用消失，因此，溶出被吸附蛋白质。另外，在蛋白质的pI以下且膜的pI以下时，两者均带正电，因此，也会溶出被吸附蛋白质。即，蛋白质可吸附于膜的pH区域在蛋白质的pI和膜的pI之间，除此以外的pH区域中可使用“调整了pH的水溶液”作为溶出液。在此，膜的pI可通过流动电位法求得。
如上所述，在本实施方式中，在蛋白质吸附多孔膜为弱碱性阴离子交换膜或弱酸性阳离子交换膜的情况下，“调整了pH的水溶液”可以用作pH在吸附的蛋白质的等电点和上述蛋白质吸附多孔膜的等电点之间以外的溶出液。但是，为了有效的溶出，优选使用pH偏离pH阈值的溶出液，具体而言，优选为pH阈值±1，更优选为pH阈值±2，进一步优选为pH阈值±3以上。另外，作为调整pH的溶质，优选使用NaOH或HCl。在此，所谓pH阈值是指蛋白质的pI或膜的pI的任一pH。
在使用弱碱性阴离子交换膜或弱酸性阳离子交换膜作为蛋白质吸附多孔膜的情况下，在溶出工序中使用“调整了pH的水溶液”的情况下(工序(B))，优选其后使“含有盐的水溶液”、优选含有盐的缓冲液通过(工序(C))。通过工序(B)及工序(C)，可使膜的电荷状态恢复至用于以少量的通过量进行蛋白质吸附的平衡化状态。
在本实施方式中，优选在使“含有盐的水溶液”通过的工序(A)之后，进行使“调整了pH的水溶液”通过的工序(B)，接着再次进行使“含有盐的水溶液”通过的工序(C)。
可在蛋白质吸附状态下突然改变pH使其溶出，但从防止因pH变化引起的被吸附蛋白质的变性的观点考虑，通过进行工序(A)并进行工序(B)，可提高被吸附蛋白质的溶出效率。
在本实施方式中，优选在工序(A)、工序(B)、工序(C)的任一工序中，沿着与吸附工序中原液的通过方向相反的方向通过液体，更优选在工序(B)及工序(C)的任一工序中沿相反方向通过液体，进一步优选使工序(B)及工序(C)两者的溶出液沿着与吸附工序中原液的通过方向相反的方向通过。该情况的溶出的效率良好。
在溶出工序中，使溶出液通过蛋白质吸附多孔膜的通过速度为被吸附蛋白质溶出的速度以上，在可维持蛋白质吸附多孔膜及其组件的形状、并维持吸附功能的速度以下的范围内任意地设定。
在组件成型的中空纤维状蛋白质吸附多孔膜的情况下，在以内压式(从内侧向外侧通过)通过情况下，优选为1MV/min～110MV/min，更优选为3MV/min～40MV/min，进一步优选为4MV/min～15MV/min。在以外压式(从外侧向内侧通过)通过情况下，优选为1MV/min～15MV/min，更优选为3MV/min～10MV/min，进一步优选为4MV/min～10MV/min。在此，所谓MV是指膜体积。简言之，所谓1MV/min是指在1分钟内通过与膜体积等量的液体量。关于膜体积的算出方法，后面详细叙述。
在溶出工序中，使溶出液通过蛋白质吸附多孔膜的通过量，只要为可充分溶出被吸附蛋白质的量，就可以任意地设定。在切换多个溶出液而通过的情况下，也需要考虑置换所需要的量。在组件成型的中空纤维状蛋白质吸附多孔膜的情况下，关于各溶出液，优选为10MV以上，更优选为25MV以上，进一步优选为30MV以上。
实施例
以下，举出实施例及比较例对本发明具体地进行说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。
[制造例1]作为高分子基体材料的中空纤维多孔膜的制造
将微粉硅酸(Aerosil(注册商标)R972级)27.2质量份、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)54.3质量份、及聚乙烯树脂粉末(旭化成化学株式会社制Sunfine(商标)SH-800级)18.5质量份预混合，通过双螺杆挤出机挤出成为中空纤维状，得到中空纤维状的膜。接着，将该膜依次浸渍在二氯甲烷及氢氧化钠水溶液中，萃取邻苯二甲酸二丁酯(DBP)及硅酸，然后，实施水洗、干燥处理，得到聚乙烯制的中空纤维多孔膜。
以始沸点法测定而得到的中空纤维多孔膜的平均细孔径为0.3μm。测定依据ASTM标准的F316-86中所记载的平均孔径的测定方法(别称：半干法)进行测定。使用作为液体的乙醇、作为加压用气体的氮气对6cm长的中空纤维多孔膜进行测定。对于得到的半干平均压力，平均细孔径通过下述式(6)算出。
孔隙率为69%。孔隙率通过下述式(7)算出。
[数学式6]
Figure BDA0000483675630000211
γ：表面张力(dynes/cm)
ρ：半干平均压力(Pa)
[数7]
Figure BDA0000483675630000212
Wwet：水湿润时的中空纤维多孔膜的重量(g)
Wdry：干燥时的中空纤维多孔膜的重量(g)
ρ：测定时的水温中的水的密度(g/mL)
V：中空纤维的圆环剖面体积(mL)
另外，在平板膜的情况下，V表示膜体积，膜体积以膜面积和膜厚度相乘的值求出。在此，中空纤维的圆环剖面积体积(V)通过下述式(8)算出。
[数学式8]
V = L { ( D o 2 ) 2 - ( D i 2 ) 2 } × π - - - ( 8 )
L：用于测定的中空纤维的长度(cm)
Do：中空纤维的外径(cm)
Di：中空纤维的内径(cm)
[制造例2]具有吸附能力的中空纤维多孔膜的制造
将制造例1中制造的聚乙烯制的中空纤维多孔膜放入密闭容器，将容器内进行氮置换。接着，将装有中空纤维多孔膜的密闭容器与干冰一起放入发泡苯乙烯制的箱中，一边冷却一边照射γ射线200kGy，在聚乙烯上产生自由基，使中空纤维多孔膜活化。
在氮气氛的密闭容器内使活化的中空纤维多孔膜恢复到室温。然后，将中空纤维多孔膜投入反应容器中并密闭，形成真空状态(100Pa以下)。将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)5质量份和甲醇95质量份混合并进行氮鼓泡，利用压力差将预先准备的反应液送液至真空状态的反应容器内。将所送液的反应液在40℃下循环4小时，静置一整夜后，排出反应液。利用甲醇、接着利用水对中空纤维多孔膜充分地进行清洗，得到在聚乙烯主链上接枝聚合有甲基丙烯酸缩水甘油酯的接枝中空纤维多孔膜。
采取得到的接枝中空纤维膜的一部分，使其干燥并测定重量，若通过式(1)算出接枝率，则接枝率为66～73%。
在装有接枝中空纤维多孔膜的反应容器中放入50体积浓度的二乙基胺水溶液，在30℃下循环5小时，静置一整夜后，排出二乙基胺水溶液。接着，将中空纤维多孔膜用水充分地清洗并使其干燥，得到在接枝链上具有二乙基氨基的接枝中空纤维多孔膜作为蛋白质吸附多孔膜。
采取得到的蛋白质吸附多孔膜的一部分，使其干燥并测定重量，若通过式(2)算出配体转化率，则配体转化率为91%。
另外，蛋白质吸附多孔膜的外径为3.6mm、内径为2.2mm。
[制造例3]组件成型
将制造例2中制造的蛋白质吸附多孔膜在装有丝有效长度9.4cm、丝根数为1根的模件中成型。
[蛋白质吸附多孔膜的吸附能力评价]
作为表示蛋白质吸附多孔膜的吸附能力的术语，有“平衡吸附容量”(或“静态吸附容量”)和“动态吸附容量”，在业界被广泛使用。
所谓“动态吸附容量”，是指使含有蛋白质的原液通过蛋白质吸附多孔膜时，该原液的透过液的蛋白质浓度达到基准浓度的时刻的吸附容量。该基准浓度称为破开点，通常作为破开点，相对于通过的原液的蛋白质浓度，该原液的透过液的蛋白质浓度从5%～20%的范围选择。
另外，一般而言，吸附量可以使用重量、体积或摩尔数等适于表示其特性的单位。另外，作为蛋白质吸附多孔膜的单位量而表示的吸附容量，不仅可使用单位体积，而且也可以使用单位重量等适于表示其特性的单位。
求出吸附容量时，膜体积为在由上述式(8)算出的圆环剖面体积(V)中，将有助于吸附的有效膜长代入式中的L而求得的体积。有效膜长为从用于测定的中空纤维的长度中减去用于与装置连接的连接器等接触部分的长度(无助于吸附的长度)而算出。另外，平板膜时的膜体积为有效膜面积和膜厚度相乘而得到的值。
对于根据制造例3制造的组件，平衡吸附容量及动态吸附容量的测定，是与通用HPLC系统(GE Healthcare Japan AKTAexplorer100)连接而进行的。根据制造例3，由制造例1、2中制造的同一批次的蛋白质吸附多孔膜制作多个组件，平衡吸附容量的测定和动态吸附容量的测定使用不同的组件个体。在平衡吸附容量及动态吸附容量的任一情况下，均监测原液的透过液的吸光度，对得到的光谱图进行数值分析而求得。另外，动态吸附容量以达到蛋白质原液(1mg/mL)的吸光度的10%的原液透过液量作为破开点而算出。
[评价例1]多层度
制造例2中得到的蛋白质吸附多孔膜的比表面积SM为6.8m2/g。另外，测定使用BECKMAN COULTER株式会社制比表面积·细孔分布测定装置(Coulter SA3100系列)以BET法进行。
将BSA1分子的占有面积SP=16×10-18(m2)、分子量Mr=67500(g/mol)、阿佛加德罗常数NA=6.02×1023(/mol)代入式(5)进行计算，算出理论单层吸附容量4.8×10-2(g/g)。
平衡吸附容量使用BSA进行，对原液的透过液的280nm吸光度进行监测。BSA的平衡吸附量(式4的分子)为45mg，组件成形的蛋白质吸附多孔膜的重量W为226mg。因此，根据式(4)，平衡吸附容量为0.20g/g。
因此，根据式(3)，算出多层度为4.2。
[评价例2]重复动态吸附容量的评价
将组件与上述的通用HPLC系统连接，重复进行吸附工序、清洗工序及溶出工序，算出吸附工序中的动态吸附容量。另外，测定中使用BSA，对原液的透过液的280nm吸光度进行监测。
吸附工序后，重复多次经由清洗工序、溶出工序测定吸附容量这样的步骤，测定每次的动态吸附容量。将第一次的动态吸附容量(即，第一次吸附蛋白质时的动态吸附容量)设为100，算出溶出工序后的吸附时的动态吸附容量的比作为“保持率(%)”，比较利用溶出方法得到的效果的程度。可以说保持率越接近100，溶出效果越大。
另外，动态吸附容量用动态吸附量(mg)除以式(8)中所求得的膜体积V(mL)，单位设为mg/mL。
在本实施例中，使用以下的试剂等。
<三盐酸盐缓冲液(缓冲液)>
将三(羟甲基)氨基甲烷(Nacalai Tesque株式会社制)4.84g溶解于约1.9L的超纯水中，加入盐酸将pH调整为8后，进行定容，制成2L、浓度20mmol/L(pH8)。然后，使用通过孔径0.45μm的过滤器的溶液。
<BSA溶液>
使用通常所使用的BSA(牛血清白蛋白、Sigma-Aldrich制)作为模型蛋白质。进行生物技术的纯化装置的性能表示时，通常使用所纯化的蛋白质溶液作为模型。
在20mmol/L(pH8)三盐酸缓冲液1L中溶解BSA1g，使用通过孔径0.45μm的过滤器的溶液。
<盐缓冲液>
将三(羟甲基)氨基甲烷(Nacalai Tesque株式会社制)4.84g溶解于约1.9L的超纯水中，接着，溶解NaCl(和光纯药工业株式会社制特级试剂)117g，加入盐酸，将pH调整为8。进行定容，制备2L含有浓度1mol/L的氯化钠的缓冲液。然后，使用通过孔径0.45μm的过滤器的溶液。
<氢氧化钠水溶液(碱)>
使用1mol/L氢氧化钠水溶液(和光纯药工业株式会社制特级试剂)。
将溶出工序中的溶出液的流动方向相对于吸附工序中的流动方向，以相同方向通过的情况记作“顺向”，将以相反的方向通过的情况记作“反向”。另外，在全部实施例及比较例中，在任一工序中均以评价流速为5MV/min来进行。
[实施例1]
在制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件中，以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，以顺向通过缓冲液10mL。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、反向)、盐缓冲液(20mL、反向)。
第一次吸附的动态吸附容量为47.7mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为45.9mg/mL，保持率为96%。
[实施例2]
在制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件中，以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，然后，作为清洗工序，以顺向通过缓冲液10mL。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、顺向)、盐缓冲液(20mL、反向)。
第一次吸附的动态吸附容量为58.6mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为50.5mg/mL，保持率为86%。
[实施例3]
在制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件中，以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，以顺向通过缓冲液10mL。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、反向)、盐缓冲液(20mL、顺向)。
第一次吸附的动态吸附容量为51.4mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为43.5mg/mL，保持率为85%。
[比较例1]
在制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件中，在溶出工序中，全部顺向通过，除此以外，以与实施例1相同的溶出液、通过顺序、及通过量进行通过。
以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，以顺向通过缓冲液10mL。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、顺向)、盐缓冲液(20mL、顺向)。
第一次吸附的动态吸附容量为51.2mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为40.0mg/mL，保持率为78%。
[比较例2]
在制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件中，以内压式(从中空部内侧向外侧通过)对制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，使缓冲液10mL反向通过，接着，使缓冲液10mL顺向通过。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、顺向)、盐缓冲液(20mL、顺向)。
第一次吸附的动态吸附容量为55.5mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为42.7mg/mL，保持率为77%。
将实施例1～3及比较例1、2的结果示于表1。
[表1]
Figure BDA0000483675630000271
在比较例1中，保持率为78%，与此相对，在实施例1中保持率为96%，在实施例2中，保持率为86%，在实施例3中保持率为85%，通过使溶出液以与吸附方向反向的通过而得到的效果得到了证实。
在比较例2中，在清洗工序中使缓冲液反向通过的情况下，重复10次后，吸附容量的保持率为77%。在实施例1～3中，使溶出液反向通过而得到的效果得到了证实。
[实施例4]
作为1种溶出液，示出使用盐缓冲液进行溶出工序时的实施例。
在制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件中，以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，使缓冲液10mL顺向通过。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(20mL、反向)。
第一次吸附的动态吸附容量为49.5mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为42.2mg/mL，保持率为85%。
[比较例3]
在制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的组件中，在溶出工序中以顺向通过，除此以外，以与实施例4相同的溶出液及通过量进行通过。
以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，使缓冲液10mL顺向通过。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(20mL、顺向)。
第一次吸附的动态吸附容量为38.7mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为27.5mg/mL，保持率为71%。
将实施例4及比较例3的结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0000483675630000281
在比较例3中，保持率为71%，与此相对，在实施例4中，保持率为85%，通过使溶出液以与吸附方向反向的方式通过而得到的效果被证实。
以下示出实施例5～11、比较例4～10中，相对于各种接枝率及多层度的蛋白质吸附多孔膜，使溶出液反向通过时的结果(将结果汇总示于表3)。
Figure BDA0000483675630000291
[实施例5]
以制造例1中制造的聚乙烯制中空纤维多孔膜作为基体材料，通过接枝反应，得到蛋白质吸附多孔膜。接枝反应中，将反应液中的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA):甲醇的混合比设为13.9质量份:86.1质量份，除此以外，依据制造例2进行。得到的蛋白质吸附多孔膜的接枝率为195%、配体转化率为98%。另外，外径为4.4mm、内径为2.8mm。
采取3条得到的蛋白质吸附多孔膜，分别与制造例3同样地成形组件(5A,5B,5C)。
依据评价例1对组件5A实施测定，算出多层度为5.5。
根据评价例2对组件5B重复实施动态吸附容量的评价。以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，以顺向通过缓冲液10mL。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、反向)、盐缓冲液(20mL、反向)。
第一次吸附的动态吸附容量为73.9mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为69.5mg/mL，保持率为94%。
[比较例4]
对于实施例5中制造的组件5C，在溶出工序中，使盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、顺向)、盐缓冲液(20mL、顺向)和溶出液全部顺向通过，除此以外，以与实施例5相同的方式进行评价。
第一次吸附的动态吸附容量为75.0mg/mL，重复10次后的动态吸附量为52.7mg/mL，保持率为70%。
在多层度5.5的情况下，相对于比较例4的保持率70%，实施例5的保持率为94%，保持率得以提高。另外，以(实施反向溶出时的保持率)/(仅实施顺向溶出时的保持率)表示时的保持率提高率为134%。
[实施例6]
以制造例1中制造的聚乙烯制中空纤维多孔膜作为基体材料，通过接枝反应，得到蛋白质吸附多孔膜。接枝反应中，将反应液中的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA):甲醇的混合比设为9.4质量份:90.6质量份，除此以外，依据制造例2进行。得到的蛋白质吸附多孔膜的接枝率为131%、配体转化率为97%。另外，外径为4.1mm、内径为2.5mm。
采取3条得到的蛋白质吸附多孔膜，分别与制造例3同样地成形组件(6A,6B,6C)。
依据评价例1对组件6A实施测定，算出多层度为4.5。
依据评价例2对组件6B重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与实施例5完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，向反向进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为56.4mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为54.1mg/mL，保持率为96%。
[比较例5]
相对于实施例6中制造的组件6C，依据评价例2重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与比较例4完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，使溶出液全部顺向地进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为56.0mg/mL，重复10次后的动态吸附量为40.9mg/mL，保持率为73%。
在多层度4.5的情况下，相对于比较例5的保持率73%，实施例6的保持率为96%，保持率得以提高。保持率的提高率为131%。
[实施例7]
以制造例1中制造的聚乙烯制中空纤维多孔膜作为基体材料，通过接枝反应，得到蛋白质吸附多孔膜。接枝反应中，将反应液中的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA):甲醇的混合比设为6.1质量份:93.9质量份，除此以外，依据制造例2进行。得到的蛋白质吸附多孔膜的接枝率为85%、配体转化率为95%。另外，外径为3.8mm、内径为2.4mm。
采取3条得到的蛋白质吸附多孔膜，分别与制造例3同样地成形组件(7A,7B,7C)。
依据评价例1对组件7A实施测定，算出多层度为4.3。
依据评价例2对组件7B重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与实施例5完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，向反向进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为55.0mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为53.9mg/mL，保持率为98%。
[比较例6]
相对于实施例7中制造的组件7C，依据评价例2重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与比较例4完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，使溶出液完全顺向地进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为54.4mg/mL，重复10次后的动态吸附量为41.0mg/mL，保持率为75%。
在多层度4.3的情况下，相对于比较例6的保持率75%，实施例7的保持率为98%，保持率得以提高。保持率的提高率为130%。
[实施例8]
以制造例1中制造的聚乙烯制中空纤维多孔膜作为基体材料，通过接枝反应，得到蛋白质吸附多孔膜。接枝反应中，将反应液中的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA):甲醇的混合比设为3.6质量份:96.4质量份，除此以外，依据制造例2进行。得到的蛋白质吸附多孔膜的接枝率为50%、配体转化率为98%。另外，外径为3.4mm、内径为2.1mm。
采取3条得到的蛋白质吸附多孔膜，分别与制造例3同样地成形组件(8A,8B,8C)。
依据评价例1对组件8A实施测定，算出多层度为3.8。
依据评价例2对组件8B重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与实施例5完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，向反向进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为46.0mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为44.6mg/mL，保持率为97%。
[比较例7]
相对于实施例8中制造的组件8C，依据评价例2重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与比较例4完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，使溶出液完全顺向地进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为46.4mg/mL，重复10次后的动态吸附量为35.9mg/mL，保持率为77%。
在多层度3.8的情况下，相对于比较例7的保持率77%，实施例8的保持率为97%，保持率得以提高。保持率的提高率为125%。
[实施例9]
以制造例1中制造的聚乙烯制中空纤维多孔膜作为基体材料，通过接枝反应，得到蛋白质吸附多孔膜。接枝反应中，将反应液中的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA):甲醇的混合比设为2.3质量份:97.7质量份，除此以外，依据制造例2进行。得到的蛋白质吸附多孔膜的接枝率为32%、配体转化率为96%。另外，外径为3.3mm、内径为2.0mm。
采取3条得到的蛋白质吸附多孔膜，分别与制造例3同样地成形组件(9A,9B,9C)。
依据评价例1对组件9A实施测定，算出多层度为2.3。
依据评价例2对组件9B重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与实施例5完全相同的方式实施。(即，在溶出工序中，向反向进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为21.1mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为20.7mg/mL，保持率为98%。
[比较例8]
相对于实施例9中制造的组件9C，依据评价例2重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与比较例4完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，使溶出液完全顺向地进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为21.4mg/mL，重复10次后的动态吸附量为18.5mg/mL，保持率为86.6%。
在多层度2.3的情况下，相对于比较例8的保持率77%，实施例9的保持率为98%，保持率得以提高。保持率的提高率为113%。
[实施例10]
以制造例1中制造的聚乙烯制中空纤维多孔膜作为基体材料，通过接枝反应，得到蛋白质吸附多孔膜。接枝反应中，将反应液中的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA):甲醇的混合比设为1.0质量份:99.0质量份，除此以外，依据制造例2进行。得到的蛋白质吸附多孔膜的接枝率为14%、配体转化率为97%。另外，外径为3.2mm、内径为1.9mm。
采取3条得到的蛋白质吸附多孔膜，分别与制造例3同样地成形组件(10A,10B,10C)。
依据评价例1对组件10A实施测定，算出多层度为1.6。
依据评价例2对组件10B重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与实施例5完全相同地进行。(即，在溶出工序中，向反向进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为10.4mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为10.1mg/mL，保持率为97%。
[比较例9]
相对于实施例10中制造的组件10C，依据评价例2重复实施动态吸附容量的评价。以评价中的通过的液体种类、通过顺序、通过量、通过方向与比较例4完全相同的方式进行。(即，在溶出工序中，使溶出液完全顺向地进行通过。)
第一次吸附的动态吸附容量为10.6mg/mL，重复10次后的动态吸附量为9.9mg/mL，保持率为93%。
在多层度1.6的情况下，相对于比较例9的保持率93%，实施例10的保持率为97%，保持率得以提高。保持率的提高率为104%。
[实施例11]
在室温下搅拌尼龙6(0.2g)、二氯甲烷(10g)、甲酸(0.1g)，在其中添加叔丁基次氯酸钠(2g)，等到尼龙6溶解。在得到的溶液中再加入二氯甲烷以使全体质量成为100g，得到用于形成涂层的N-氯-尼龙6溶液。
将孔径0.45μm、膜厚0.15mm的由纤维素衍生物构成的多孔质平板膜(日本Milipore株式会社制)浸渍于N-氯-尼龙6溶液中，等待溶液含浸于多孔质部。从含浸了溶液的多孔质平板膜中除去剩余的溶液，首先将该膜在室温下干燥，接着，在80℃的热风循环干燥器内进一步干燥，最后在140℃下加热15分钟，由此得到纤维素衍生物的多孔质平板膜及具有覆盖其表面的N-氯-尼龙6的被膜的平板膜状的基体材料。
在反应容器内充分搅拌具有甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)5%、Tween80(关东化学株式会社制)0.3%及连二亚硫酸钠0.1%的组成的磷酸钠缓冲液(pH7.5)。在该磷酸钠缓冲液中投入上述的平板膜状的基体材料，在室温下进行12分钟的接枝聚合反应。利用纯水、丙酮依次清洗反应后的膜之后，在80℃下使其干燥，由此得到具有GMA接枝聚合形成的接枝链的接枝多孔质平板膜。接枝率为8%。
另外，该接枝率以相对于用N-氯?尼龙6被膜前的膜重量的接枝链重量定义。即接枝率通过将上述的式(1)变形而得到的下述式(1)’算出。
[数学式9]
dg [ % ] = W 1 - W 0 &prime; W 0 &times; 100 - - - ( 1 ) &prime;
W0：被膜前的膜重量(g)
W0’：接枝链导入前的基体材料重量(g)
W1：接枝聚合后的重量(g)
在装有接枝多孔质平板膜的反应容器中加入50体积浓度的二乙基胺水溶液，在30℃下循环5小时，静置一整夜后，排出二乙基胺水溶液。接着，用水充分地清洗多孔质平板膜并使其干燥，得到了以在接枝链上具有二乙基氨基的接枝多孔质平板膜作为蛋白质吸附多孔膜。通过上述的式(2)求得的配体转化率为96%。
使用该多孔质平板膜成形平板膜组件(11A,11B,11C)。
依据评价例1对组件11A实施测定，算出多层度为1.2。
依据评价例2对组件11B重复实施动态吸附容量的评价。即，任一工序中均以评价流速为5MV/min进行。在吸附工序中，从平板膜的正面向反面通过，然后，作为清洗工序，使缓冲液从正面向反面(顺向)通过。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(顺向)、氢氧化钠水溶液(反向)、盐缓冲液(反向)。在此，所谓反向是指从平板膜的反面向正面通过。
第一次吸附的动态吸附容量为7.7mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为7.5mg/mL，保持率为97%。
[比较例10]
相对于实施例11中制造的组件11C，与上述实施例11同样地重复评价动态吸附容量。但以通过方向全部为顺向进行。
第一次吸附的动态吸附容量为8.4mg/mL，重复10次后的动态吸附量为7.9mg/mL，保持率为94%。
在多层度1.2的情况下，相对于比较例10的保持率94%，实施例11的保持率为97%，保持率得以提高。保持率的提高率为103%。
[实施例12]
对制造例1～3中得到的蛋白质吸附膜多孔膜的3条组件实施通过90℃的热水1小时的处理(组件12A,12B,12C)。
依据评价例1对组件12A实施测定，算出多层度为4.7。依据评价例2对组件12B重复实施动态吸附容量的评价。以内压式(从中空部内侧向外侧通过)进行吸附工序(缓冲液30mL、BSA溶液40mL)，然后，作为清洗工序，以顺向通过缓冲液10mL。然后，作为溶出工序，通过盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、反向)、盐缓冲液(20mL、反向)。
第一次吸附的动态吸附容量为58.5mg/mL，重复10次后的动态吸附容量为56.7mg/mL，保持率为97%。
[比较例11]
相对于实施例12中制造的组件12C，在溶出工序中，使盐缓冲液(15mL、顺向)、氢氧化钠水溶液(20mL、顺向)、盐缓冲液(20mL、顺向)和溶出液完全顺向地进行通过，除此以外，以与实施例5相同的方式进行评价。
第一次吸附的动态吸附容量为58.6mg/mL，重复10次后的动态吸附量为42.2mg/mL，保持率为72%。
通过90℃的热水处理，制造例1～3的多层度从4.2变大为4.7。另外，相对于比较例11的保持率72%，实施例12的保持率为97%，保持率得以提高。另外，保持率的提高率为135%。
将实施例12及比较例11的结果示于表4。
[表4]
Figure BDA0000483675630000361
本申请基于2011年9月30日申请的日本专利申请(日本特愿2011-217856号)，其内容在此作为参照被引入。
工业实用性
本发明可提供一种使用蛋白质吸附多孔膜的有效的蛋白质纯化方法。而且，本发明在有效地大量生产抗体医药的方面，在目标蛋白质的纯化中具有工业上的可利用性。

Claims (13)

1.一种蛋白质纯化方法，其是利用多孔膜进行的蛋白质纯化方法，所述多孔膜是基体材料表面被具有蛋白质吸附能力的高分子覆盖而形成的多孔膜，
该方法包括：
吸附工序，使含有吸附对象蛋白质的原液通过所述多孔膜，使该吸附对象蛋白质吸附于所述高分子；
溶出工序，使溶出液通过所述多孔膜，使吸附于所述高分子的所述吸附对象蛋白质溶出在该溶出液中，
在所述溶出工序中，使至少1种溶出液沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过。
2.如权利要求1所述的蛋白质纯化方法，其中，所述溶出液选自：含有盐的水溶液、调整了pH的水溶液、水、有机溶剂及它们的混合溶液。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质纯化方法，其中，在所述溶出工序中，使所述溶出液沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相同的方向和相反的方向通过。
4.如权利要求1～3中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述高分子接枝于所述基体材料表面，且所述高分子的接枝率为5%以上且200%以下。
5.如权利要求4所述的蛋白质纯化方法，其中，所述高分子的接枝率为30%以上且90%以下。
6.如权利要求1～5中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜为离子交换膜，且所述溶出液包含含有盐的水溶液或调整了pH的水溶液。
7.如权利要求1～6中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜的多层度为1.1以上。
8.如权利要求6或7所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜为弱碱性阴离子交换膜或弱酸性阳离子交换膜，且
所述溶出工序包括：
使pH调整为所述吸附对象蛋白质的等电点和所述多孔膜的等电点之间以外的水溶液通过的工序、以及
使含有盐的水溶液通过的工序，
在上述至少一个工序中，沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过水溶液。
9.如权利要求8所述的蛋白质纯化方法，其中，在使调整了pH的水溶液通过的所述工序及使含有盐的水溶液通过的所述工序中，沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过水溶液。
10.如权利要求6或7所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜为弱碱性阴离子交换膜或弱酸性阳离子交换膜，并且，
所述溶出工序包含：
使含有盐的水溶液通过的第一工序；
使pH调整为所述吸附对象蛋白质的等电点和所述多孔膜的等电点之间以外的水溶液通过的第二工序；以及
使含有盐的水溶液通过的第三工序，
在所述第一工序中，沿着与所述吸附工序中所述原液的通过方向相同的方向通过水溶液，
在所述第二工序及所述第三工序中，沿着与吸附工序中所述原液的通过方向相反的方向通过水溶液。
11.如权利要求1～10中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述溶出液被调整为所述吸附对象蛋白质稳定的pH。
12.如权利要求1～11中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述溶出液为含有0.3mol/L以上的中性盐的水溶液。
13.如权利要求1～12中任一项所述的蛋白质纯化方法，其中，所述多孔膜是在通过液体或蒸汽进行了湿润化的状态下进行加热至50～110℃的处理而制造的。
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