JP2019124639A - カチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高い吸着容量及び高い不純物除去性を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。【解決手段】カチオン交換基を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法であって、基材にグラフト鎖を結合させるグラフト結合工程と、カチオン交換基を有するグラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に３時間以上浸漬する浸漬工程と、を有する、カチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、強カチオン交換基を有するイオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法に関する。

免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬あるいは対応する抗原タンパク質の分離精製等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。ただし、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含しているため、それらの不純物成分から抗体タンパクを分離精製する必要があり、バイオテクノロジー産業において抗体タンパクの有効な大量精製技術の確立が望まれている。

液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。

イオン交換クロマトグラフィーは、吸着材表面のイオン交換基を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う方法である。吸着材の基材としては、ビーズあるいは平膜及び中空糸等の膜などが採用されており、これらの基材にカチオン交換基又はアニオン交換基を結合したものが吸着材として市販されている。

カチオン交換基を有する吸着材では、低塩濃度の抗体溶液を吸着材に接触させることにより、抗体を吸着させ、移動相の塩濃度を高めることにより、吸着させた抗体を溶出させるバインド＆エリュート法による精製が行われ、夾雑物の除去、特に抗体単量体と抗体２量体等の凝集体との分離がしばしば目的とされている。

近年では、抗体医薬の需要の増加から、抗体医薬品の大量生産及び製造コスト低減が指向されている。抗体医薬品の製造工程は、培養工程と精製工程からなっているが、培養技術の急速な進歩に対し精製効率はあまり向上しておらず、精製抗体のコストが高い一因といわれている。精製工程の効率向上が望まれている中で、効率向上のアプローチとして例えば吸着容量の向上、高純度精製、及びフロースルー精製方法の開発が盛んにおこなわれている。

吸着容量の向上により、担体使用量の削減、精製処理時間の短縮などの生産効率の改善が可能となる。またフロースルー様式は、不純物を選択的に吸着材に吸着させる精製方法の様式である。不純物を選択的に吸着するため、担体単位容量当たりのタンパク処理量が向上し、担体使用量の削減が可能となる。また、従来の吸着及び溶出を利用した方法に比べ、緩衝液の節約や工程の簡略化、高流速での抗体精製が可能であり、精製処理時間を短縮することができるため、産業上よく用いられている。

一方、フロースルー様式においては、抗体溶液が一定の流速で基材に接触するため、選択性を高めることが重要であるが、抗体単量体と抗体２量体の分離が困難な傾向にあり、抗体単量体と抗体２量体を分離するためには、カチオン交換基の密度をはじめとする、カチオン交換体の緻密な設計が必要である。

精製能力の高いイオン交換基を有する担体の製造方法として、グラフト重合によりイオン交換基を有するモノマーを導入する手法が広く用いられている。グラフト重合によって基材上に固定されたグラフト鎖に存在するイオン交換基によって、タンパク質の大量精製時にイオン交換担体が吸着対象タンパク質を吸着する。しかしながら、これまでのグラフト重合法は、イオン交換担体の吸着容量の向上において検討の余地があった。

タンパク質の吸着容量の向上及びフロースルー精製のためのタンパク吸着材に関する技術は、例えば特許文献１及び２に開示されている。

特許文献１では、タンパク質吸着能を有するアニオン交換基を含有する高分子鎖を含んだ吸着材に対し、該吸着材を高分子湿潤状態で加熱することにより、吸着性能を高めたタンパク質吸着材の製造方法が開示されているが、カチオン交換担体における詳細な検討はされていない。

フロースルー様式を用いたタンパク精製方法として、例えば特許文献２では、弱カチオン交換基を有するフロースルー精製に適したクロマトグラフィー担体が開示されており、多量の生理活性物質の精製を可能としている。しかし、特許文献２において、該クロマトグラフィー担体の不純物選択性を上げる検討はされておらず、高純度精製の観点において改善の余地がある。

特開２０１２−５５２号公報 国際公開第２０１６／０１３６０９号

カチオン交換基を有するイオン交換クロマトグラフィー担体において、タンパク質の吸着量及び不純物除去性能を向上させる方法には検討の余地がある。そこで、本発明では、高い吸着容量及び高い不純物除去性を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、高い吸着性能及び不純物除去性を有するカチオン交換体の製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の形態によれば、カチオン交換基を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法であって、基材にグラフト鎖を結合させるグラフト結合工程と、カチオン交換基を有するグラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に３時間以上浸漬する浸漬工程と、を有する、カチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法が提供される。

上記の方法において、アルカリ性水溶液が、水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化カリウム水溶液であってもよい。

上記の方法の浸漬工程において、アルカリ性水溶液の温度が２０℃以上であってもよい。

上記の方法において、放射線グラフト重合法により、基材にグラフト鎖が結合されてもよい。

上記の方法において、カチオン交換基が、スルホン酸基又はカルボキシル基であってもよい。

また、本発明の態様によれば、カチオン交換基を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法であって、基材にグラフト鎖を結合させるグラフト結合工程と、カチオン交換基を有するグラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に１分以上３時間未満浸漬する第１浸漬工程と、第１浸漬工程の後に、グラフト鎖が結合している基材を水溶液に浸漬する第２浸漬工程と、を有し、第２浸漬工程において、５０００Ｋ・分以上のエネルギーが基材に加えられる、カチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法が提供される。

上記の方法において、第２浸漬工程で用いられる水溶液が、第１浸漬工程で用いられるアルカリ性水溶液と同じであってもよい。

上記の方法において、第２浸漬工程で用いる水溶液が、ｐＨ６．０以上のアルカリ性水溶液であってもよい。

上記の方法において、第２浸漬工程で用いる水溶液が、純水であってもよい。

上記の方法の第２浸漬工程において、グラフト鎖が結合している基材を水溶液に１５分以上浸漬してもよい。

上記の方法において、第２浸漬工程における水溶液の温度が、第１浸漬工程におけるアルカリ性水溶液の温度より高くともよい。

上記の方法の第２浸漬工程において、水溶液の温度が５０℃以上であってもよい。

上記の方法の第２浸漬工程において、グラフト鎖が結合している基材を水溶液に１０時間以上浸漬してもよい。

上記の方法の第２浸漬工程において、水溶液の温度が２０℃以上であってもよい。

上記の方法において、放射線グラフト重合法により、基材にグラフト鎖が結合されてもよい。

上記の方法において、カチオン交換基が、スルホン酸基又はカルボキシル基であってもよい。

本発明によれば、高い吸着容量及び高い不純物除去性を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法が提供される。

実施例に係る浸漬工程及びリゾチーム吸着量を示す表である。 実施例及び比較例に係る第１及び第２浸漬工程並びにリゾチーム吸着量を示す表である。 クロマトチャートの一例である。 図３に示したクロマトチャートの部分拡大図である。 実施例に係る浸漬工程を示す表である。 実施例及び比較例に係る凝集体除去評価試験の条件及び結果を示す表である。 実施例及び比較例に係る第１及び第２浸漬工程を示す表である。 実施例及び比較例に係る凝集体除去評価試験の条件及び結果を示す表である。 実施例及び比較例に係る第１及び第２浸漬工程並びにリゾチーム吸着量を示す表である。 実施例及び比較例に係る第１及び第２浸漬工程並びにリゾチーム吸着量を示す表である。 実施例及び比較例に係るリゾチーム吸着量を示す表である。

以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。

実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法は、基材にグラフト鎖を結合させるグラフト結合工程と、カチオン交換基を有するグラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に３時間以上浸漬する浸漬工程と、を有する。

あるいは、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法は、基材にグラフト鎖を結合させるグラフト結合工程と、カチオン交換基を有するグラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に１分以上３時間未満浸漬する第１浸漬工程と、第１浸漬工程の後に、グラフト鎖が結合している基材を水溶液に浸漬する第２浸漬工程と、を有し、第２浸漬工程において、５０００Ｋ・分以上のエネルギーが基材に加えられる。また第２浸漬工程において５０００Ｋ・分以上のエネルギーが基材に加えられる場合、第２浸漬工程の実施途中に別の工程を実施してもよい。

カチオン交換基を有するグラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に３時間以上浸漬する浸漬工程を実施する場合は、その後、グラフト鎖が結合している基材を水溶液に浸漬する第２浸漬工程を実施してもよいし、しなくともよい。

実施の形態に係るカチオンイオン交換クロマトグラフィー担体が備える基材の形状の例としては、特に限定されないが、中空糸膜状、平膜状、不織布状、モノリス、キャピラリー、焼結体、円板及び円筒状等が挙げられる。特に好ましくは、合成の簡便さや処理時の流速の観点から、中空糸膜状、平膜状、及び不織布状等の平膜状である。また、基材の材料の例としては、特に限定を受けないが、ポリオレフィン系重合体や、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、及びセルロース等が挙げられる。その中でも特に放射線グラフト重合を行う場合、放射線照射によるラジカルの安定性の観点から、ポリオレフィン系重合体や、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステルから構成されていることが好ましい。

ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィン単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体などが挙げられる。パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。これらの中でも、機械的強度に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましい。また、ポリアミドとしては特に限定を受けないが、ナイロン６（ε−カプロラクタムの重縮合体）、ナイロン１１（ウンデカンラクタムの重縮合体）、ナイロン１２（ラウリルラクタムの重縮合体）、ナイロン６６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６１０（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６Ｔ（ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン９Ｔ（ノナンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロンＭ５Ｔ（メチルペンタンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン６２１（カプロラクタムとラウリルラクタムの共縮重合体）、ｐ−フェニレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体、ｍ−フェニレンジアミンとイソフタル酸の共縮重合体等が挙げられる。ポリエステルとしては、特に限定を受けないが、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレート等が挙げられる。

基材は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されないが、基材が中空糸膜状の場合は、例えば５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、さらに好ましくは１００ｎｍ以上、特に好ましくは１５０ｎｍ以上、あるいは４００ｎｍ以上である。また、表面積の観点から、好ましくは９００ｎｍ以下、より好ましくは８００ｎｍ以下、さらに好ましくは７００ｎｍ以下、特に好ましくは６５０ｎｍ以下である。細孔径が５ｎｍ以上であると、分離できる抗体タンパク質の分子量が大きくなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以下であると、当該膜状基材の表面積が大きくなり、不純物の結合容量が大きくなる傾向にある。

また、後述する基材表面にグラフト重合法によってイオン交換基を導入する場合において、グラフト重合に用いる共重合体中の親水性モノマーが占める割合が高い場合やグラフト率が高い場合は、透水性の観点から４００ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の孔径が特に好ましい。

また、基材が平膜状や不織布状の場合、細孔径が大きく強度の低い膜であっても、外部からハウジング等で基材を支持したり、基材同士を積層したりすることで、強度の低い基材を用いることが可能となる。基材が平膜状や不織布状の場合の細孔径の好ましい範囲としては、１０ｎｍ以上１ｍｍ以下であり、タンパク溶液の処理流速の観点から好ましくは１００ｎｍ以上、より好ましくは２００ｎｍ以上、更に好ましくは３００ｎｍ以上である。また表面積の観点から、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。

実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、グラフト重合法により基材に共有結合で固定された共重合体であるグラフト鎖を備える。グラフト鎖は、カチオン交換基を備える。カチオン交換基としては、カルボン酸基、ホスホン酸基、リン酸、及びスルホン酸基等が挙げられる。グラフト重合法としては、放射線グラフト重合法や、表面リビングラジカル重合法が挙げられる。好ましくは、製造の簡便性の観点から、放射グラフト重合法を用いる。

放射線グラフト重合法で基材表面に共重合体を固定する場合、基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、基材に電離性放射線を照射すると、基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線は、コバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等から得られる。

電離性放射線の照射線量は、ラジカル発生量に関与し得る。ラジカル発生量は、形成されるグラフト鎖の密度に関与し得る。タンパク質分子のグラフト鎖への吸着形態の観点から、グラフト鎖密度はタンパク質分子が侵入し得る状態であることが好ましい。すなわち、ラジカルの発生量が、タンパク質分子のグラフト鎖への吸着に関与し得る。上記観点より、電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下、特に好ましくは１０ｋＧｙ以上３０ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ以上の場合、ラジカルが均一に生成しやすい傾向にある。また、膜状基材の物理的強度の観点から、照射線量が１０００ｋＧｙ以下であるとよい。

電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性化合物と接触させる前照射法と、基材を反応性化合物と接触させた状態で基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。ここでいうオリゴマーとは、遊離オリゴマーのことを指す。遊離オリゴマーはグラフト鎖中には取り込まれないため、生成されないことが好ましい。

実施の形態において共重合体の重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、メタノールやエタノール、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。

実施の形態に係るカチオン交換基を導入する方法としては特に限定を受けないが、グラフト重合の際に、カチオン交換基を有するモノマーを含む反応溶液を用いる方法や、「カチオン交換基導入前駆体」を有するモノマーを含む反応溶液を用いて共重合した後、カチオン交換基導入前駆体をカチオン交換基に変換する方法等が挙げられる。

カチオン交換基を有するモノマーを含む反応溶液を用いる方法では、カチオン交換基を有するモノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸化合物、及びメタクリル酸化合物、（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸、ビニルスルホン酸、アクリルアミドｔ−ブチルスルホン酸、及びスチレンスルホン酸、（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸、ビニルスルホン酸、アクリルアミドｔ−ブチルスルホン酸、及びスチレンスルホン酸等が挙げられる。アクリル酸化合物としては、２−アクリロキシエチルコハク酸、２−アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、及び２−アクリロイロキシエチルフタル酸等が挙げられる。メタクリル酸化合物としては、２−メタクリロキシエチルコハク酸、２−メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、及び２−メタクリロイロキシエチルフタル酸等が挙げられる。

「カチオン交換基導入前駆体」を有するモノマーを含む反応溶液を用いて共重合した後、カチオン交換基導入前駆体をカチオン交換基に変換する方法において、「カチオン交換基導入前駆体」とは、グラフト鎖にカチオン交換基を付与しうる官能基のことをいい、例えばエポキシ基等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「カチオン交換基導入前駆体を有するモノマー」とは、カチオン交換基を付与しうる官能基を有するモノマーのことをいい、例えば、スチレン及びグリシジルメタクリレート等が挙げられる。また、「カチオン交換基導入前駆体」は「カチオン交換基の前駆体」を含みうる。「カチオン交換基の前駆体」とは、例えばカチオン交換基に保護基が付いたものであり、例えば、フェニルビニルスルホネート、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、アリルアクリレート、及びアリルメタクリレート等のモノマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

カチオン交換基がスルホン酸基であり、スルホン酸基導入前駆体を有するモノマーがグリシジルメタクリレートの場合、グリシジルメタクリレートを重合した後、亜硫酸ナトリウムと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をスルホン酸基に変換することができる。

実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体における基材へのグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、基材の密度により、最適値が異なりうる。基材がポリエチレンの場合は、吸着容量及び立体的な吸着の観点から１０％以上が好ましく、より好ましくは２５％以上、更に好ましくは３０％以上、特に好ましくは４０％以上、５０％以上、６０％以上、又は７０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、更に好ましくは１２０％以下である。グラフト率は下記式（１）によって表される。
ｄ_g（％）＝（ｗ₁−ｗ₀）／ｗ₀×１００ （１）
ここで、ｗ₀はグラフト鎖が導入される前の基材（例えば、多孔質中空糸）の質量、ｗ₁はグラフト鎖が導入された後の基材の質量である。本開示において、グラフト率は、グラフト重合前後の質量変化として定義している。すなわち、本開示においてグラフト率は、グラフト重合後であって官能基変換前に測定しており、官能基変換による質量変化は考慮していない。

基材がポリフッ化ビニリデンの場合は、ポリフッ化ビニリデンはポリエチレンに比べ、密度が高いため、適したグラフト率がポリエチレンの場合と異なる。基材がポリフッ化ビニリデンの場合は、吸着容量の観点から５％以上が好ましく、より好ましくは１０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは１００％以下、より好ましくは８０％以下、更に好ましくは７０％以下である。

また、グラフト鎖の割合は、カチオン交換クロマトグラフィー担体体積当たりのグラフト鎖の質量（グラフト鎖密度）として表すことも出来る。その場合、吸着容量等の観点から、グラフト鎖密度は、０．０３ｇ／ｍＬ以上が好ましく、より好ましくは０．０４ｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは０．０５ｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは０．０６ｇ／ｍＬ以上、０．０７ｇ／ｍＬ以上、０．０８ｇ／ｍＬ以上、０．０９ｇ／ｍＬ以上、０．１ｇ／ｍＬ以上、０．１１ｇ／ｍＬ以上、又は０．１２ｇ／ｍＬ以上である。力学的に安定な強度の観点からは、グラフト鎖密度は、好ましくは０．２５ｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．２０ｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは０．１８ｇ／ｍＬ以下である。本開示において、上記の値は、製造の過程でなく、最終産物として得られたカチオン交換担体のグラフト鎖の量から算出している。グラフト鎖密度は下記式（２）によって表される。

ｓ_g（ｇ／ｍＬ）＝（ｗ₂−ｗ₀）／ｖ₁×１００ （２）

ここで、ｗ₂は最終産物として得られたカチオン交換クロマトグラフィー担体の質量であり、ｖ₁は最終産物として得られたカチオン交換クロマトグラフィー担体の体積である。なお、上述したように、式（１）においては、ｗ₁は、グラフト重合直後で、その後の官能基変換を行う前の基材の質量である。

実施の形態において、浸漬工程又は第１浸漬工程で用いるアルカリ性水溶液は、ｐＨ９．０以上である。第２浸漬工程で用いるアルカリ性水溶液は、ｐＨ６．０以上である。本開示において、特に限定がなければ、アルカリ性水溶液とは、ｐＨが６．０より高い水溶液をいう。ｐＨが６．０よりも高い水溶液であれば、アルカリ性水溶液とは、緩衝液も含む。水溶液のｐＨがカチオン交換基のｐＫａより高ければカチオン交換基がイオン化するため、ｐＨが６．０から７．０の間でも、水溶液は相対的にアルカリ性であるといえる。

第１浸漬工程で用いるアルカリ性水溶液としては、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、Ｔｒｉｓ緩衝液及びリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限られない。

実施の形態において、第２浸漬工程で用いる水溶液はｐＨ６．０以上のアルカリ水溶液であって、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、Ｔｒｉｓ緩衝溶液及びリン酸緩衝溶液が挙げられるが、これらに限られない。第１浸漬工程で用いられるアルカリ水溶液と、第２浸漬工程で用いられる水溶液が異なる場合、第２浸漬工程を実施する前に、基材の洗浄操作を行ってもよいし行わなくてもよい。洗浄を実施する場合の洗浄溶液の例としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、Ｔｒｉｓ緩衝溶液、リン酸緩衝溶液及び純水が挙げられるが、これらに限られない。

実施の形態において、第２浸漬工程で用いる水溶液は純水でもよい。第２浸漬工程を実施する前に、基材の洗浄操作を行ってもよいし行わなくてもよい。洗浄を実施する場合の洗浄溶液の例としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、Ｔｒｉｓ緩衝溶液、リン酸緩衝溶液及び純水が挙げられるが、これらに限られない。

実施の形態において、第１浸漬工程で用いられるアルカリ水溶液と、第２浸漬工程で用いられる水溶液が同一でもよい。第１浸漬工程で用いられるアルカリ水溶液と、第２浸漬工程で用いられる水溶液が同一の場合、第２浸漬工程を実施する前に、基材の洗浄操作を、行ってもよいし行わなくてもよい。すなわち、第１浸漬工程で用いられるアルカリ水溶液を変更せず、そのまま第２浸漬工程で用いてもよい。洗浄を実施する場合の洗浄溶液の例としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、Ｔｒｉｓ緩衝溶液、リン酸緩衝溶液及び純水が挙げられるが、これらに限られない。

ｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に３時間以上グラフト鎖が結合された基材を浸漬する浸漬工程の実施、あるいは第１浸漬工程及び第２浸漬工程の実施により、製造されるカチオン交換クロマトグラフィー担体の吸着容量及び不純物除去性能が向上する。これは、理論に束縛されるものではないが、以下の理由によると推定される。

カチオン交換クロマトグラフィーにおいては、担体（吸着材）へタンパク質が吸着するのは、タンパク質分子と吸着材の有するイオン交換基との静電的な相互作用によるものである。そのため、担体がタンパク質を吸着するためには、担体が吸着点となり得るイオン交換基を有し、かつイオン交換基が、タンパク質分子が十分に接触可能な基材表面上に形成されたグラフト鎖に存在することが必要と考えられる。基材表面に形成されたグラフト鎖を、以下、「表面グラフト鎖」と称する。ここでいう基材表面とは、移動相と接する界面にあたる部分を指し、基材の細孔表面も含む。

本実施形態において、タンパク質吸着能を有する官能基を含有するグラフト重合鎖は、グラフト結合工程において、多孔性基材内部にも形成されることがある。基材内部に形成されたグラフト鎖を、以下、「内部グラフト鎖」と称する。ここでいう基材内部とは、基材における基材表面以外の結晶部及び非結晶部を指す。

ここで、第１浸漬工程において、グラフト鎖が形成された基材をアルカリ性溶液に浸漬することにより、グラフト鎖中のカチオン交換基が荷電される。グラフト鎖が荷電した状態で第２浸漬工程を実施すると、カチオン交換基同士による静電反発が生じてグラフト鎖が伸長し、内部グラフト鎖が静電反発により膨張する。これにより、基材内部から基材表面に内部グラフト鎖が伸長することで表面グラフト鎖が増え、結果としてタンパク吸着点として作用するカチオン交換基が増大するためと考えられる。また、上記に加えて、内部グラフト鎖の膨張により、基材を構成する高分子が疎になるため、より内部グラフトが外部へ伸長しやすくなり、表面グラフト鎖が増大するとも考えられる。なお、第１浸漬工程においてもカチオン交換基同士による静電反発が始まり得るし、第２浸漬工程においてもグラフト鎖中のカチオン交換基の荷電が生じ得る。

また、ｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に３時間以上基材を浸漬する浸漬工程を実施すれば、第１浸漬工程と第２浸漬工程を実施した場合と同様の現象がカチオン交換基を有するグラフト鎖に生じているものと考えられる。

グラフト重合法によって製造されたイオン交換担体の不純物、すなわち抗体凝集体への吸着における選択性は、必ずしも理論に束縛されないが、グラフト鎖にカチオン交換基が立体的に配置されることにより、グラフト鎖が吸着対象分子を立体的に吸着することが可能となるためと考えられる。特にグラフト重合法によって製造されたイオン交換担体をフロースルー様式で用いる場合、抗体単量体に比べて分子量の大きい抗体凝集体が、グラフト鎖上のカチオン交換基と多点結合するため、抗体凝集体が選択的に担体に吸着され、抗体単量体を高い純度で得ることが可能となると推測される。

このように、本実施形態によれば、表面グラフト鎖が増加するため、抗体凝集体の吸着容量を向上させることができ、また静電反発によってグラフト鎖同士の自由度が高まり、効率的な多点結合が促進されるものと考えられる。

カチオン交換基を荷電させる観点から、浸漬工程又は第１浸漬工程におけるアルカリ性水溶液のｐＨは、ｐＨ９．０以上、好ましくはｐＨ１０．０以上、さらに好ましくはｐＨ１１．０、ｐＨ１２．０以上、あるいはｐＨ１３．０以上である。

実施の形態において、浸漬工程の浸漬時間は、担体の形態により溶液の拡散速度に依存するため一概には決められるものではないが、例えば、３時間以上、５時間以上、１０時間以上、１５時間以上、２０時間以上、あるいは２５時間あるいは３０時間以上が好ましい。また、基材の強度及びクロマトグラフィーの性能を維持する観点から、浸漬工程の浸漬時間は、７２時間以下、５６時間以下、４８時間以下、あるいは４２時間以下、３６時間以下が好ましい。

実施の形態において、浸漬工程におけるアルカリ性水溶液の温度は、例えば、２０℃以上、より好ましくは２５℃以上、さらに好ましくは３０℃以上、特に好ましくは３５℃以上、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、８０℃以上である。

実施の形態において、第１浸漬工程の浸漬時間は、担体の形態により溶液の拡散速度に依存するため一概には決められるものではないが、例えば、１分以上、５分以上、１０分以上、１５分以上、３０分以上、１時間以上、あるいは２時間以上が好ましい。また、製造の効率の観点から、第１浸漬工程の浸漬時間は、３時間以下が好ましい。

実施の形態において、第１浸漬工程におけるアルカリ性水溶液の温度は、例えば、２０℃以上、より好ましくは２５℃以上、さらに好ましくは３０℃以上、特に好ましくは３５℃以上、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、８０℃以上である。

実施の形態において、第２浸漬工程の浸漬時間は、内部グラフト鎖の静電反発が生じた状態を維持することにより、表面グラフト鎖を増大させるという観点から、例えば１５分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、５時間以上、１０時間以上、１５時間以上、２０時間以上、あるいは２５時間あるいは３０時間以上が好ましい。

実施の形態において、第２浸漬工程における水溶液の温度は、２０℃以上、より好ましくは２５℃以上、さらに好ましくは３０℃以上、特に好ましくは３５℃以上、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、８０℃以上である。

実施の形態において、第２浸漬工程においては、担体に加わるエネルギー量、すなわち浸漬時間及び水溶液の温度が相乗的に影響し得る。したがって、第２浸漬工程における水溶液の温度が高ければ浸漬時間は短くてもよく、第２浸漬工程における水溶液の温度が低ければ浸漬時間は長くなる傾向にある。第２浸漬工程における水溶液の絶対温度と浸漬時間の積は、５０００Ｋ・分以上、６０００Ｋ・分以上、７０００Ｋ・分以上、８０００Ｋ・分以上、９０００Ｋ・分以上、１００００Ｋ・分以上、１１０００Ｋ・分以上、１２０００Ｋ・分以上が好ましい。また、基材の強度及びクロマトグラフィーの性能を維持する観点から、エネルギーは、１５０００００Ｋ・分以下、１４０００００Ｋ・分以下、１３０００００Ｋ・分以下、１２０００００Ｋ・分以下、１１０００００Ｋ・分以下、１００００００Ｋ・分以下、９０００００Ｋ・分以下、８０００００Ｋ・分以下が好ましい。

以下に、実施の形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。

［製造例１］
製造例１では、放射線グラフト重合法によって中空糸状のカチオン交換膜を作製した。

１）カチオン交換膜の作製
２−ヒドロキシエチルメタクリレート５．１０ｇ、グリシジルメタクリレート０．６９ｇをメタノール１１５ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５μｍのポリエチレン多孔質中空糸３．０３ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、５５ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３６ｇ、グラフト率７７％の中空糸膜を得た。

放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、イソプロピルアルコールの混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／イソプロピルアルコール／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）１６０ｇに投入し、８０℃で２０時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。水及びメタノールで洗浄した後真空乾燥させ、５．４８ｇの、カチオン交換膜を得た。

この中空糸１本（０．３６５ｇ）をエタノールにより湿潤させ、水に置換した後、水を入れたメスシリンダーに投入して体積の増加分により体積を測定したところ、１．２ｍＬであった。基材膜の質量が０．２０２ｇであることから、グラフト鎖の質量は０．１６３ｇ、密度は０．１３６ｇ／ｍＬであった。水を除去した後、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加えた。１時間放置した後、水酸化ナトリウム水溶液を取り出し、純水１０ｍＬを加えた。更に１時間放置した後、純水を回収することにより、膜内に残った水酸化ナトリウムを回収した。回収した水酸化ナトリウム溶液を統合し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸により滴定をおこなったところ、８．７８ｍＬを要した。ブランク（イオン交換基を有しない中空糸）の滴定では９．９８ｍＬであったことから、水酸化ナトリウムと反応した、カチオン交換膜が有するスルホン酸基の量は１２０μｍｏｌ（０．０００１２０ｍｏｌ）であった。これを測定した体積で除して算出されたスルホン酸基の密度は１００ｍｍｏｌ／Ｌであった。得られたカチオン交換膜をカチオン交換膜１とした。

スルホン酸基を有するモノマー単位の質量は、スルホン酸基の量から求めることができる。スルホン酸基に変換後のグリシジルメタクリレートの分子量は２２４．２３であることから、スルホン酸基を有するモノマー単位の質量は、０．０２６９ｇであった。また、中空糸１本あたりのグラフト鎖の質量は、反応前後の多孔質中空糸の質量から、０．１６３ｇであった。したがって、中性モノマー単位の質量は、中空糸１本あたりのグラフト鎖の質量と、スルホン酸基を有するモノマー単位の質量と、から、０．１３６１ｇであった。ここから計算すると、スルホン酸基を有するモノマー単位の質量は、中性モノマー単位の質量の１／５．８７であった。

［実施例１］
実施例１では製造例１で得られたカチオン交換膜１を用いた。カチオン交換膜１を親水化するためにメタノールによりカチオン交換膜１を細孔内まで湿潤させた後、メタノールを純水に置換してメタノールを除去した。次に、図１に示すとおり、浸漬工程としてカチオン交換膜をｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃にて１８時間５分間浸漬させた。なお、実施例において水溶液のｐＨは、ｐＨメーター（型番ＨＭ−２５Ｒ、東亜ディーケーケー株式会社製）にて測定を行った。

その後、以下の手順に従って、浸漬工程を経たカチオン交換膜のリゾチームの吸着量を測定した。カチオン交換膜０．１ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬振とうして平衡化した。平衡化後のカチオン交換体を、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶かした濃度１ｇ／Ｌのリゾチーム溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｌ６８７６−１０Ｇ）に２５℃、１００ｒｐｍで浸漬振とうし、カチオン交換膜にリゾチームを吸着させた。リゾチームの吸着量は、リゾチーム溶液への浸漬後９６時間経過時に測定した。吸着操作前及び９６時間吸着操作後のリゾチーム溶液の濃度を吸光度より測定し、リゾチーム溶液で減少したリゾチームの量をカチオン交換膜への吸着量とした。吸着操作におけるリゾチーム溶液とカチオン交換体の比率（ｍＬ／ｇ）は１０００ｍＬ／ｇとした。カチオン交換体１ｇ当たりの吸着したリゾチーム量を図１に示す。ｐＨ６．０の溶液中ではリゾチームは正に帯電しているため、リゾチームの吸着量が多いほど、カチオン交換膜のカチオン交換基が有効に機能していることを示している。

［実施例２］
実施例２では製造例１で得られたカチオン交換膜１を用いた。浸漬工程としてカチオン交換膜１をｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃にて３時間浸漬させた以外は、実施例１と同様に実施し、浸漬工程を経たカチオン交換膜のリゾチームの吸着量を測定した。結果を図１に示す。

［実施例３］
実施例３では製造例１で得られたカチオン交換膜１を用いた。浸漬工程としてカチオン交換膜１をｐＨ９．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に２０℃にて１８時間５分浸漬させた以外は、実施例１と同様に実施し、浸漬工程を経たカチオン交換膜のリゾチームの吸着量を測定した。結果を図１に示す。

［実施例４］
実施例４では製造例１で得られたカチオン交換膜１を用いた。メタノールによりカチオン交換膜１を細孔内まで湿潤させた後、メタノールを純水に置換した。次に、図２に示すとおり、第１浸漬工程としてカチオン交換膜１をｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃にて５分間浸漬させた後、第２浸漬工程としてカチオン交換膜を８０℃、ｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２時間浸漬させた以外は実施例１と同様の操作を行い、第１及び第２の浸漬工程を経たカチオン交換膜のリゾチーム吸着量を測定した。結果を図２に示す。

［実施例５］
実施例５では、図２に示すとおり、第１浸漬工程としてｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃で３０分間浸漬させ、第２浸漬工程として８０℃の純水に２時間浸漬させた以外は実施例４と同様の操作を行い、リゾチーム吸着量を測定した。結果を図２に示す。

［比較例１］
比較例１では、図２に示すとおり、浸漬工程、第１浸漬工程及び第２浸漬工程のいずれも実施しなかったカチオン交換膜１を用いてリゾチームの吸着量を測定した。ゾチーム吸着量の測定方法は実施例１と同様に実施した。結果を図２に示す。リゾチーム吸着量は、実施例１から５と比較して少なかった。

［比較例２］
比較例２では、図２に示すとおり、第１浸漬工程でｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃で５分間浸漬させ、第２浸漬工程は実施しなかったカチオン交換膜を用いて、実施例１と同様にリゾチーム吸着量を測定した。結果を図２に示す。リゾチーム吸着量は、実施例１から５と比較して少なかった。

［比較例３］
比較例３では、図２に示すとおり、第１浸漬工程を実施せず、第２浸漬工程で８０℃の純水に２時間浸漬させたカチオン交換膜を用いて、実施例１と同様にリゾチーム吸着量を測定した。結果を図２に示す。リゾチーム吸着量は、実施例１から５と比較して少なかった。

［実施例６］
製造例１で用いたカチオン交換膜１をモジュール化したものをカチオン交換体として用い、下記の手順にて凝集体除去性能評価を実施した。

（細胞培養液の調製）
抗体タンパク質として、ＣＨＯ細胞ＣＲＬ１２４４５から発現させたヒトモノクローナル抗体（以降、ＣＲＬ１２４４５抗体）を含む培養液上澄みを用意した。ＣＲＬ１２４４５抗体生産細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名 ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標） ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。

（アフィニティーカラムによる抗体タンパク質の精製）
リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））で平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを充填したカラム）に、抗体溶液を添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体溶液を回収した。

（凝集体の調製）
得られた抗体溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ２．５に調整し、一時間放置した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、多量の抗体凝集体を含む抗体溶液を調製した。

（凝集体を含む抗体溶液の調製）
プロテインＡカラムから得られた抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にバッファー交換した溶液と、多量の凝集体を含む抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にバッファー交換した溶液を任意の割合で混合し、凝集体を含む抗体溶液を調製した。

（凝集体量の測定）
得られた抗体溶液を下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて測定した。
カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ ＹＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：３０℃
システム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ ＣＬＡＳＳ（ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）−アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）

その結果、図３に例示するクロマトチャートが得られ、図３の一部を拡大したものが図４である。図４の（１）及び（２）のピークは抗体の凝集体を表しており、（３）で現れるピークは抗体の単量体を表している。以下の実施例及び比較例において、最初に現れる凝集体のピークを凝集体（１）、２番目に現れる凝集体のピークを凝集体（２）という。

（カチオン交換体の浸漬工程）
カチオン交換体を、メタノールにより細孔内まで湿潤させた後、メタノールを純水に置換した。続いて、図５に示すように、浸漬工程としてｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃で１８時間５分、カチオン交換体を浸漬させた。その後、以下の手順に従って、浸漬工程を経たカチオン交換体の凝集体除去性能の評価を実施した。

（凝集体除去評価）
上記カチオン交換体に、図６に示すように、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（約５．３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で、１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬを用いてカチオン交換体を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分析したところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図６に示す。

［実施例７］
実施例７では、図７に示すように、第１浸漬工程としてｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃で５分、第２浸漬工程としてｐＨ１４．０、８０℃の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２時間、カチオン交換体を浸漬させた以外は、実施例６と同様の操作を行い、凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。

［実施例８］
実施例８では、図７に示すように、第１浸漬工程としてｐＨ１０．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に２０℃で５分、第２浸漬工程としてｐＨ１０．０、８０℃の１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に２時間、カチオン交換体を浸漬させた以外は、実施例６と同様の操作を行い、凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。

［実施例９］
実施例９では、図７に示すように、第１浸漬工程としてｐＨ９．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に２０℃で５分、第２浸漬工程としてｐＨ９．０、８０℃の１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に２時間、カチオン交換体を浸漬させた以外は、実施例６と同様の操作を行い、凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。

［実施例１０］
実施例１０では、図７に示すように、第１浸漬工程としてｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃で３０分、第２浸漬工程として８０℃の純水に２時間、カチオン交換体を浸漬させた以外は、実施例６と同様の操作を行い、凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。

［比較例４］
比較例４では、図７に示すように、第１浸漬工程、第２浸漬工程を未実施であること以外は、実施例６と同様の操作を行い、カチオン交換体の凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。凝集体除去性能は、実施例６から１０と比較して低かった。

［比較例５］
比較例５では、図７に示すように、第１浸漬工程としてｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃で５分、カチオン交換体を浸漬させ、第２浸漬工程は未実施であること以外は、実施例６と同様の操作を行い、凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。凝集体除去性能は、実施例６から１０と比較して低かった。

［比較例６］
比較例６では、図７に示すように、第１浸漬工程としてｐＨ８．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に２０℃で３０分、第２浸漬工程として純水に２０℃で１８時間、カチオン交換体を浸漬させた以外は、実施例６と同様の操作を行い、凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。凝集体除去性能は、実施例６から１０と比較して低かった。

［比較例７］
比較例７では、図７に示すように、第１浸漬工程としてｐＨ８．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に２０℃で３０分、第２浸漬工程として８０℃の純水に２時間、カチオン交換体を浸漬させた以外は、実施例６と同様の操作を行い、凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図６に示す。凝集体除去性能は、実施例６から１０と比較して低かった。

［製造例２］
製造例２では以下に説明するカチオン交換体を作成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．０８ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５μｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。製造例１と同様にし、カチオン交換基密度を求めたところ、１７５ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、カチオン交換体とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０３及び０．８９７であった。

［実施例１１］
実施例１１では、製造例２で得られたカチオン交換体を下記の手順で浸漬処理し、浸漬処理されたカチオン交換体の凝集体除去性能評価を実施した。

（細胞培養液の調製）
抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクローナル抗体）を含む培養液上澄みを用意した。ＡＥ６Ｆ４産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞の培養は、文献（日本生物工学会講演要旨集、１９９４年、６５巻、６５ページ）を参考に培養した。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名 ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標） ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。

（アフィニティーカラムによる抗体タンパク質の精製）
リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））で平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを充填したカラム）に、抗体溶液を添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体溶液を回収した。

（凝集体の調製）
得られた抗体溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ３．０に調整し、一時間放置した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、多量の抗体凝集体を含む抗体溶液を調製した。

（凝集体を含む抗体溶液の調製）
プロテインＡカラムから得られた抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液と、多量の凝集体を含む抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液を任意の割合で混合し、凝集体を含む抗体溶液を調製した。

（凝集体量の測定）
得られた抗体溶液を下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて測定した。

カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ ＹＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：３０℃
システム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ ＣＬＡＳＳ（ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）−アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）

（カチオン交換体の浸漬工程）
カチオン交換体を、メタノールにより細孔内まで湿潤させた後、メタノールを純水に置換し、続いて図８に示すように、浸漬工程としてｐＨ１４．０の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に２０℃で１８時間５分浸漬させたカチオン交換体を用い、以下の手順に従って凝集体除去性能の評価を実施した。

（凝集体除去評価）
カチオン交換体に、図９に示すように抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は４０ｍＬ（約５．０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で、１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬを用いてカチオン交換体を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分析したところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図９に示す。

［比較例８］
比較例８では、図８に示すように、浸漬工程、第１浸漬工程及び第２浸漬工程のいずれも実施せず、それ以外は、実施例１１と同様の操作を行い、カチオン交換体の凝集体除去性能の評価を実施した。結果を図９に示す。凝集体除去率は、実施例１１より低かった。

［製造例３］
製造例３では、６−ナイロン繊維にアクリル酸をグラフト重合し、繊維状のカチオン交換体を作成した。

直径２５μmのナイロン繊維基材１ｇを、溶液導入口を取り付けた密閉容器に入れ、密閉容器内の空気を窒素で置換した。その後、ドライアイスで冷却しながら、１００ｋＧｙの電子線をナイロン繊維基材に照射し、ラジカルを発生させた。

上記の密閉容器とは別の４０℃の水浴中に設置した容器中において、０．５ｍｏｌ／Ｌのアクリル酸水溶液に窒素を３０分間バブリングし、脱酸素を行い、反応溶液を調製した。その後、ナイロン繊維の入った密閉容器の溶液導入口から反応溶液を１００ｍＬ導入し、４０℃で３０分間浸漬し、放射線グラフト重合を行い、グラフト率８０％の繊維状のカチオン交換体を得た。

［実施例１２］

製造例３で得られたカチオン交換体を、図１０に示すように２０℃でｐＨ１３．７の０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）に３０分間浸漬した後、２０℃で純水に１０分浸漬し、その後、８０℃で２時間加熱した。

得られたカチオン交換体０．１ｇを０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬振とうして平衡化した。平衡化後のカチオン交換体を、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶かした濃度４ｇ／Ｌのリゾチーム溶液に２５℃、１００ｒｐｍで浸漬振とうし、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｌ６８７６−１０Ｇ）を吸着させた。リゾチームの吸着は９６時間以内に平衡に達したため、９６時間経過時で測定値を求めた。吸着操作におけるリゾチーム溶液とカチオン交換体の比率（ｍＬ／ｇ）は６００ｍｇ／ｍＬとした。カチオン交換体１ｇ当たりの吸着したリゾチーム量を図１０に示す。

［比較例９］
比較例９では、製造例３で得られたカチオン交換体を、図１０に示すように第１浸漬工程及び第２浸漬工程を経ずに、実施例１２と同様に、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬振とうして平衡化した後、リゾチームを吸着させた。結果を図１０に示す。リゾチーム吸着量は、実施例１２より低かった。

［比較例１０］
比較例１０では、製造例３で得られたカチオン交換体を、図１０に示すように第１浸漬工程を経ずに、純水中、８０℃で２時間加熱した。得られたカチオン交換体に、実施例１２と同様に０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬振とうして平衡化した後、リゾチームを吸着させた。結果を図１０に示す。リゾチーム吸着量は、実施例１２より低かった。

［実施例１３］
実施例１３では、実施例１２と同様に、製造例３で得られたカチオン交換体を、図１０に示すように２０℃でｐＨ１３．７の０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）に３０分間浸漬した後、２０℃で純水に１０分浸漬し、その後、８０℃で２時間加熱した。得られたカチオン交換体０．１ｇを０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬振とうして平衡化した。平衡化後のカチオン交換体を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ、及び２５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のそれぞれに溶かした濃度４ｇ／Ｌのリゾチーム溶液に２５℃、１００ｒｐｍで浸漬振とうし、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｌ６８７６−１０Ｇ）を吸着させた。リゾチームの吸着は９６時間以内に平衡に達したため、９６時間経過時で測定値を求めた。吸着操作におけるリゾチーム溶液とカチオン交換体の比率（ｍＬ／ｇ）は６００ｍｇ／ｍＬとした。カチオン交換体１ｇ当たりの吸着したリゾチーム量を図１１に示す。

［比較例１１］
比較例１１では、製造例３で得られたカチオン交換体を、図１０に示すように第１浸漬工程及び第２浸漬工程を経ずに、実施例１３と同様に、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬振とうして平衡化した後、リゾチームを吸着させた。結果を図９に示す。リゾチーム吸着量における緩衝液濃度の影響は実施例１３より大きく、緩衝液濃度が高いほど吸着量は減少した。

Claims (16)

1. カチオン交換基を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法であって、
   基材にグラフト鎖を結合させるグラフト結合工程と、
   カチオン交換基を有する前記グラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に３時間以上浸漬する浸漬工程と、
   を有する、カチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法。
2. 前記アルカリ性水溶液が、水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化カリウム水溶液である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記浸漬工程において、前記アルカリ性水溶液の温度が２０℃以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 放射線グラフト重合法により、前記基材に前記グラフト鎖が結合される、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 前記カチオン交換基が、スルホン酸基又はカルボキシル基である、請求項１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. カチオン交換基を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法であって、
   基材にグラフト鎖を結合させるグラフト結合工程と、
   カチオン交換基を有する前記グラフト鎖が結合している基材をｐＨ９．０以上のアルカリ性水溶液に１分以上３時間未満浸漬する第１浸漬工程と、
   前記第１浸漬工程の後に、前記グラフト鎖が結合している基材を水溶液に浸漬する第２浸漬工程と、
   を有し、
   前記第２浸漬工程において、５０００Ｋ・分以上のエネルギーが前記基材に加えられる、
   カチオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法。
7. 前記第２浸漬工程で用いられる水溶液が、前記第１浸漬工程で用いられるアルカリ性水溶液と同じである、請求項６に記載の製造方法。
8. 前記第２浸漬工程で用いる水溶液が、ｐＨ６．０以上のアルカリ性水溶液である、請求項６に記載の製造方法。
9. 前記第２浸漬工程で用いる水溶液が、純水である、請求項６に記載の製造方法。
10. 前記第２浸漬工程において、前記グラフト鎖が結合している基材を前記水溶液に１５分以上浸漬する、請求項６から９のいずれか１項に記載の製造方法。
11. 前記第２浸漬工程における前記水溶液の温度が、前記第１浸漬工程における前記アルカリ性水溶液の温度より高い、請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記第２浸漬工程において、前記水溶液の温度が５０℃以上である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
13. 前記第２浸漬工程において、前記グラフト鎖が結合している基材を前記水溶液に１０時間以上浸漬する、請求項６から９のいずれか１項に記載の製造方法。
14. 前記第２浸漬工程において、前記水溶液の温度が２０℃以上である、請求項１３に記載の製造方法。
15. 放射線グラフト重合法により、前記基材に前記グラフト鎖が結合される、請求項６から１４のいずれか１項に記載の製造方法。
16. 前記カチオン交換基が、スルホン酸基又はカルボキシル基である、請求項６から１５のいずれか１項に記載の製造方法。