WO2017026453A1

WO2017026453A1 - 分離剤及び液体クロマトグラフィー用カラム

Info

Publication number: WO2017026453A1
Application number: PCT/JP2016/073329
Authority: WO
Inventors: 紀生石塚; 京子小西; 俊和小田; 敬亘辻井; 圭太榊原; 與田　祥也
Original assignee: 三菱化学株式会社; 株式会社エマオス京都; 国立大学法人京都大学
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2017-02-16
Also published as: EP3335789A1; EP3335789A4; JP2017037070A; US10773241B2; US20180161758A1

Abstract

本発明は、液体クロマトグラフィー用途として十分な細孔径を有すると共に高強度で通液時の圧力損失が小さく、目的物の分離性に優れ、非特異吸着性の低い多孔性樹脂粒子よりなる分離剤を提供する。本発明の分離剤は、多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなり、分離剤の平均細孔径が１０ｎｍ～２０００ｎｍである分離剤、又は多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなり、水分含有量が５０重量％以上である分離剤である。

Description

分離剤及び液体クロマトグラフィー用カラム

　本発明は、ワクチン精製用分離剤、タンパク質精製用分離剤等として有用な分離剤と、この分離剤を含む液体クロマトグラフィー用カラムに関する。

　タンパク質等の生体高分子の製造、開発において、それらの吸着・分離・精製には液体クロマトグラフィーが多く用いられている。液体クロマトグラフィー用分離剤に用いられる担体としては、シリカゲル、ヒドロキシアパタイト等の無機系担体や、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等の天然高分子系担体や、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル等の合成ポリマー系担体が知られている。これらの担体はそのままで、または多様な分離モードでの使用を可能とするために必要に応じて各種官能基を付与して用いられる。

　近年、耐衝撃性、耐薬品性、耐久性、取り扱い性、生産性等の面から、液体クロマトグラフィー用分離剤に用いられる担体としてエポキシ樹脂系担体についての提案が多くなされている。

　特許文献１には、アフィニティゲルの担体として、又は精製媒体、吸収吸着媒体、カラムクロマトグラフィーの充填剤等に使用できるエポキシ樹脂硬化物多孔体として、エポキシ樹脂硬化物の三次元網目状骨格と連通する空隙を有する多孔体であって、該三次元網目状骨格が柱状の三次元分岐構造からなる非粒子凝集型の多孔体を形成し、且つ該エポキシ樹脂硬化物を構成する炭素原子全体に占める芳香環由来の炭素原子の比率が０．１０～０．６５であり、該多孔体の空孔率が２０％～８０％、平均孔径が０．５μｍ～５０μｍであるものが提案されている。特許文献１には、エポキシ樹脂硬化物多孔体は、シート状、棒状、筒状など任意の形状を採ることができるとされているが、粒子状との記載はない。

　特許文献２には、クロマトグラフィー用分離媒体、血液分離用多孔質体、環境分析用試料濃縮媒体、吸湿用多孔質体、消臭等低分子吸着用多孔質体、均一径微粒子を製造する膜乳化法に用いる多孔質膜あるいは酵素担体及び触媒担体用多孔質体等に適した多孔体として、エポキシ樹脂硬化物からなる三次元網目構造の骨格と空隙とを有する多孔体であって、骨格内に１ｎｍ～１μｍの孔径のメソポアを備える多孔体が提案されている。特許文献２の多孔体も、シート状、棒状、筒状など任意の形状を容易に採ることができるとされているが、特許文献２には粒子状との記載はない。

　特許文献３には、１分子中に３個以上のエポキシ基を有する脂環式エポキシ化合物と、脂環式アミン硬化剤と、前記脂環式エポキシ化合物及び前記脂環式アミン硬化剤に対して不活性な溶媒とを含有する混合液を加熱して硬化物を得た後、前記硬化物から前記溶媒を除去することにより得られる多孔質構造のエポキシ樹脂硬化物である、エポキシ樹脂硬化物多孔体が提案されている。この特許文献３においても、多孔体の形状については、シート状、棒状、筒状と記載され、粒子状との記載はない。

　特許文献４には、エポキシ樹脂（成分Ａ）と、アミン系硬化剤（成分Ｂ）と、前記成分Ａ及びＢに対して不活性な溶媒（成分Ｃ）とを含有する混合液を３０～５５℃の温度条件で６時間以上加熱して硬化物を得た後、前記硬化物から前記成分Ｃを除去してエポキシ樹脂硬化物多孔体を得るエポキシ樹脂硬化物多孔体の製造方法が提案されている。この特許文献４においても、製造される多孔体の形状については、シート状、棒状、筒状等任意の形状とすることができると記載されるのみで、粒子状の記載はない。

　特許文献５には、エポキシ化合物と相溶し、かつ抽出あるいは揮散可能な化合物を溶解したエポキシ系化合物のエマルションに水溶性アミン系化合物を加えて硬化したエポキシ系球状粒子から、上記化合物を抽出あるいは揮散して除去することにより得られる、多孔性エポキシ系球状粒子が開示されている。

国際公開第２００６／０７３１７３号日本国特開２００９－２６９９４８号公報国際公開第２０１１／０１９０３３号日本国特開２０１１－４６８５６号公報日本国特開昭６１－７２０３６号公報

　上記の通り、従来のクロマトグラフィー用担体としてのエポキシ樹脂系多孔体は、いずれもシート状、棒状、筒状といった形状のカラム一体式モノリス型多孔体として提供されているが、モノリス型多孔体は、カラムのサイズ変更に対応し難く、交換時のコストも高くつくなどの欠点がある。
　これに対して、粒子状であれば、このような問題がなく、多種多様な形態に容易に対応することができる。しかしながら、多孔性粒子にあっては、液体クロマトグラフィーカラムに充填して用いる際に要求される細孔径と強度及び通液時の圧力損失とが共に良好な値となるように設計することが難しく、一般的に細孔径が大きい多孔性粒子は強度が低く、その結果として圧力損失が大きくなり易い。
　一方、強度を高めて圧力損失を小さくした多孔性粒子は、細孔径が小さくなってしまい分離剤として適用可能な用途が限られるという問題が生じる。例えば、特許文献５に開示されている多孔性エポキシ系球状粒子が水保持性２０～３０重量％程度の極めて細孔容積の小さい粒子であるように、液体クロマトグラフィーカラム用の分離剤として用いるためには不十分な細孔の多孔性粒子しか知られていなかった。

　本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、液体クロマトグラフィー用途として十分な細孔径を有すると共に高強度で通液時の圧力損失が小さく、目的物の分離性に優れ、非特異吸着性の低い粒子状の多孔性樹脂分離剤と、これを用いた液体クロマトグラフィー用カラムを提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、多孔性エポキシ樹脂粒子に適切な処理を施すことにより、上記課題を解決することができることが分かり、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は以下を要旨とする。

［１］　多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、該分離剤の平均細孔径が１０ｎｍ～２０００ｎｍであることを特徴とする分離剤。

［２］　多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、水分含有量が５０重量％以上であることを特徴とする分離剤。

［３］　前記分離剤の平均細孔径が１０ｎｍ～２０００ｎｍである、［２］に記載の分離剤。

［４］　前記多孔性エポキシ樹脂粒子が、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とを含む化合物の付加重合体に相当するエポキシ樹脂の粒子であって、平均粒径が１μｍ～１０００μｍである、［１］乃至［３］のいずれか１つに記載の分離剤。

［５］　前記多官能エポキシ基含有化合物が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラグリシジル－ｍ－キシリレンジアミン及びトリグリシジルイソシアヌレートのうちの少なくとも１つである、［４］に記載の分離剤。

［６］　前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基に、水酸基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを有する化合物を付加させることによりエポキシ基を開環する、親水化処理である、［１］乃至［５］のいずれか１つに記載の分離剤。

［７］　前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを介して、イオン性官能基を有する水溶性ポリマーを付加する、グラフト処理である、［１］乃至［５］のいずれか１つに記載の分離剤。

［８］　前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを介して、タンパク質及びタンパク質誘導体のうちの少なくとも１つを付加する、カップリング処理である、［１］乃至［５］のいずれか１つに記載の分離剤。

［９］　下記（１）及び（２）の特性を満たす、［１］乃至［８］のいずれか１つに記載の分離剤。
（１）　乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により１０％圧縮変形させた時の強度が２．０ＭＰａ以上
（２）　下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が７．０ＭＰａ以下
＜圧力損失測定方法＞
　前記分離剤を内容積４ｍＬ（内径０．５ｍｍ、層高２０ｃｍ）のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＬＣ　ＥＬＩＴＥ　ＬａＣｈｒｏｍ、カラムオーブンＬ－２３５０、ＲＩ検出器Ｌ－２４９０、オートサンプラーＬ－２２００）に接続し、純水を流速１．３ｍｌ／ｍｉｎ（線速度４００ｃｍ／ｈ）で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。

［１０］　多孔性樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、下記（１）及び（２）の特性を満たすことを特徴とする分離剤。
（１）　乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により１０％圧縮変形させた時の強度が２．０ＭＰａ以上
（２）　下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が７．０ＭＰａ以下
＜圧力損失測定方法＞
　前記分離剤を内容積４ｍＬ（内径０．５ｍｍ、層高２０ｃｍ）のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＬＣ　ＥＬＩＴＥ　ＬａＣｈｒｏｍ、カラムオーブンＬ－２３５０、ＲＩ検出器Ｌ－２４９０、オートサンプラーＬ－２２００）に接続し、純水を流速１．３ｍｌ／ｍｉｎ（線速度４００ｃｍ／ｈ）で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。

［１１］　下記非特異吸着試験により求められる非特異吸着性が５％以下である、［１］乃至［１０］のいずれか１つに記載の分離剤。
＜非特異吸着試験＞
　水に分散した前記分離剤を２．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）水溶液に浸漬し、２５℃で３時間吸着させる。吸着前後の上清の２８０ｎｍの吸光度より、ＩｇＧの回収率を評価する。さらにＩｇＧ吸着後遠心分離で分別した分離剤を０．１Ｎ　ＮａＯＨ水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のＢＣＡ測定（ビシンコニン酸タンパク質定量法）により、ＮａＯＨ処理によるＩｇＧの回収率を求める。ＩｇＧ水溶液中のＩｇＧに対する上清のＩｇＧ回収率（％）とＮａＯＨ処理によるＩｇＧ回収率（％）の合計を１００％から差し引いた値を非特異吸着性（％）の評価値とする。

［１２］　［１］乃至［１１］のいずれか１つに記載の分離剤からなる、ワクチン精製用分離剤。

［１３］　［１］乃至［１１］のいずれか１つに記載の分離剤からなる、タンパク質精製用分離剤。

［１４］　［１］乃至［１３］のいずれか１つに記載の分離剤と、該分離剤が充填された容器とを備える、液体クロマトグラフィー用カラム。

　本発明の分離剤は、液体クロマトグラフィー用途として適切な細孔径を設計可能であると共に、高強度で通液時の圧力損失が小さく、目的物の分離性に優れ、非特異吸着性が低い。このため、本発明の分離剤は、ワクチン精製用分離剤、タンパク質精製用分離剤等の各種分離剤として、工業的に有用である。

　以下に本発明について詳述するが、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々に変更して実施することができる。なお、本明細書において「～」という表現を用いる場合、その前後の数値または物性値を含む表現として用いるものとする。

　なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」と「メタクリル」の一方または双方をさし、「（共）重合」とは「重合」と「共重合」の一方または双方を意味する。「（メタ）アクリレート」についても同様である。また、「（ポリ）アルキレン………」は「アルキレン………」と「ポリアルキレン………」の一方または双方を意味する。「（ポリ）エチレン………」についても同様である。

　本発明の第一態様の分離剤は、多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなり、少なくとも下記（ｉ）、（ｉｉ）の何れかを満たすことを特徴とする。
　（ｉ）　平均細孔径が１０ｎｍ～２０００ｎｍである。
　（ｉｉ）　水分含有量が５０重量％以上である。

　また、本発明の第二態様の分離剤は、多孔性樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、下記（１）及び（２）の特性を満たすことを特徴とする。
（１）　乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により１０％圧縮変形させた時の強度が２．０ＭＰａ以上
（２）　下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が７．０ＭＰａ以下
＜圧力損失測定方法＞
　前記分離剤を内容積４ｍＬ（内径０．５ｍｍ、層高２０ｃｍ）のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＬＣ　ＥＬＩＴＥ　ＬａＣｈｒｏｍ、カラムオーブンＬ－２３５０、ＲＩ検出器Ｌ－２４９０、オートサンプラーＬ－２２００）に接続し、純水を流速１．３ｍｌ／ｍｉｎ（線速度４００ｃｍ／ｈ）で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。

　第一態様の分離剤を構成する多孔性エポキシ樹脂粒子の多孔性エポキシ樹脂及び第二態様の分離剤を構成する多孔性樹脂粒子の多孔性樹脂は、三次元網状骨格構造を有する多孔性樹脂であって、この三次元網状骨格構造の骨格部分は、微小な樹脂粒子の凝集体ではなく、柱状の連続相となっていることが好ましい。このような非粒子凝集型の三次元網状骨格構造の多孔性樹脂は、例えば多孔性エポキシ樹脂粒子の場合であれば、後述の通り、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物の付加重合体を製造する際、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物をポロゲンに溶解して均一混合溶液を調製し、これを界面活性剤（分散剤）に展開、撹拌して乳化重合させる工程において、個々の乳化粒子内に、付加重合体とポロゲンのスピノーダル分解に基づく共連続構造が形成され、この共連続構造が、多孔性エポキシ樹脂粒子の三次元網状骨格構造の柱状骨格を構成することにより形成される。また、エポキシ樹脂以外の多孔性樹脂についても、同様の原理で柱状骨格を有する三次元網状骨格構造が形成される。
　本明細書において「ポロゲン」とは、細孔形成剤としての不活性溶媒または不活性溶媒混合物を意味する。上述の通り、多孔性エポキシ樹脂または多孔性樹脂の原料中にポロゲンを共存させた状態で重合を行い、その後、重合反応して得られる混合物からポロゲンを除去することにより細孔を形成することができる。このようにして、非粒子凝集型の三次元網状骨格構造の多孔性樹脂を製造することができる。
　柱状骨格を有する三次元網状骨格構造を形成することにより、細孔径を大きくしたり貫通孔やパーフュージョンと呼ばれるような細孔状態にした場合でも、粒子の強度を高く保つことができることから、圧力損失を低くすることができる。更には、圧力損失を低く保てるために、粒子径を小さくして分離特性を上げることも可能となる。

〔第一態様の分離剤〕
［多孔性エポキシ樹脂粒子の製造方法］
　本発明の分離剤を構成する多孔性エポキシ樹脂粒子（以下、「本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子」と称す場合がある。）の製造方法には特に制限はないが、例えば、後述の製造例１に記載されるように、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とを、細孔形成剤として機能するポロゲンの存在下に付加重合反応させて多孔性エポキシ樹脂を製造する際に、界面活性剤を用いて乳化物とし、乳化物中で加熱撹拌しながら重合反応を進行させることにより、付加重合体とポロゲンのスピノーダル分解に基づく共連続構造が形成され、この共連続構造が、多孔性エポキシ樹脂粒子の三次元網状骨格構造の柱状骨格を構成する本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子を製造することができる。より具体的には、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とポロゲンを用いて混合液（以下「原料混合液」と称す場合がある。）を調製し、この原料混合液と、別途調製した界面活性剤（分散剤）とを混合して乳化物とし、この乳化物中で重合反応を進行させる。
　以下、この製造方法について説明する。

＜多官能エポキシ基含有化合物＞
　本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子の原料となる多官能エポキシ基含有化合物は、１分子中にエポキシ基を２個以上有するエポキシ化合物である。この多官能エポキシ基含有化合物は、エポキシ基を３個以上有することが好ましい。多官能エポキシ基含有化合物は芳香族エポキシ化合物であっても非芳香族エポキシ化合物であってもよい。また、多官能エポキシ基含有化合物は高分子化合物（オリゴマーやエポキシ樹脂）であっても、低分子化合物（単量体）であってもよい。

　芳香族エポキシ化合物としては、ビスフェノールＡ型エポキシ化合物、臭素化ビスフェノールＡ型エポキシ化合物、ビスフェノールＦ型エポキシ化合物、ビスフェノールＡＤ型エポキシ化合物、スチルベン型エポキシ化合物、ビフェニル型エポキシ化合物、ビスフェノールＡノボラック型エポキシ化合物、クレゾールノボラック型エポキシ化合物、ジアミノジフェニルメタン型エポキシ化合物、テトラキス（ヒドロキシフェニル）エタンベースなどのポリフェニルベースエポキシ化合物、フルオレン含有エポキシ化合物、トリアジン環含有エポキシ化合物等、複素芳香環を含むエポキシ化合物などが挙げられる。

　好ましくは、ビスフェノールＡ型エポキシ化合物、臭素化ビスフェノールＡ型エポキシ化合物、ビスフェノールＦ型エポキシ化合物、ビスフェノールＡＤ型エポキシ化合物、フルオレン含有エポキシ化合物、トリグリシジルイソシアヌレートであり、特に好ましくは、エポキシ当量が５００以下で、融点が１００℃以下である、ビスフェノールＡ型エポキシ化合物、臭素化ビスフェノールＡ型エポキシ化合物、ビスフェノールＦ型エポキシ化合物、ビスフェノールＡＤ型エポキシ化合物、フルオレン含有エポキシ化合物である。

　芳香族エポキシ化合物としてはまた、下記式（ｃ）で表されるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラグリシジル－ｍ－キシリレンジアミンも好ましく用いることができる。

　非芳香族エポキシ化合物としては、脂肪族グリシジルエーテル型エポキシ化合物、脂肪族グリシジルエステル型エポキシ化合物、脂環族グリシジルエーテル型エポキシ化合物、脂環族グリシジルエステル型エポキシ化合物などが挙げられる。好ましくは脂環族グリシジルエーテル型エポキシ化合物、脂環族グリシジルエステル型エポキシ化合物であり、特に好ましくは、エポキシ当量が５００以下で、融点が１００℃以下の脂環族グリシジルエーテル型エポキシ化合物、脂環族グリシジルエステル型エポキシ化合物である。

　非芳香族エポキシ化合物としては、１分子中にエポキシ基を３個以上、例えば３～４個有する脂環式エポキシ化合物も好ましく用いることができる。このように、１分子中に３個以上のエポキシ基を有する脂環式エポキシ化合物を用いることにより、適切な細孔径と強度を合わせ持った多孔性エポキシ樹脂粒子を製造することが可能となる。

　１分子中に３個以上のエポキシ基を有する脂環式エポキシ化合物としては特に制限されず、脂環式の炭化水素基と３個以上のエポキシ基とを有するものを適宜利用することができる。更に、このような１分子中に３個以上のエポキシ基を有する脂環式エポキシ化合物としては、より親水性を高めるという観点からは、脂環式エポキシ化合物中に窒素原子を含んだものを用いることが好ましく、下記式（１）で表される化合物がより好ましい。なお、後述する親水化処理を施して分離剤とする場合には、多孔性エポキシ樹脂粒子の親水性を高めることが好ましく、官能基導入や生体分子導入などを行う場合には、多孔性エポキシ樹脂粒子の表面にこれらを導入可能な反応性基が増える点で親水性を高めることが好ましい。

（式（１）中、Ｘは式中の窒素原子と直接又は炭素数が１～５の直鎖アルキレン基を介して結合する炭素数が３～８の脂環式炭化水素基を示し、Ｙは式中の窒素原子と直接又は炭素数が１～５の直鎖アルキレン基を介して結合するエポキシ基を示し、ｍ及びｎはＹの総数が３以上となるようにして選択される整数であって、ｍは２～４のうちのいずれかの整数を示し、ｎはそれぞれ独立に１又は２の整数を示し、ｐはそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｐとｎとの和は２である。）

　上記式（１）中のＸは、式中の窒素原子と直接又は炭素数が１～５（より好ましくは１～３、更に好ましくは１）の直鎖アルキレン基を介して結合する炭素数が３～８（より好ましくは４～７、更に好ましくは５～６）の脂環式炭化水素基である。また、窒素原子と脂環式炭化水素基との間に存在し得る前記直鎖アルキレン基はメチレン基、エチレン基、プロピレン基等であるが、このような直鎖アルキレン基の炭素数が前記上限を超えると多孔質体の機械的強度が低下する傾向にある。このようなＸとしては、例えば、式中のｍが２である場合、下記式（Ｉ）～（ＶＩ）で表される基が挙げられる。

　上記式（１）中のＹは式中の窒素原子と直接又は炭素数が１～５（より好ましくは１～３、更に好ましくは１）の直鎖アルキレン基を介して結合するエポキシ基である。このような直鎖アルキレン基はＸで説明したものと同様のものである。

　また、上記式（１）中のｍ及びｎはＹの総数が３以上となるようにして選択される整数である。このようなＹの総数が３未満では、化合物中のエポキシ基の数が３未満となってしまう。また、このような式（１）中のｍは２～４のうちのいずれかの整数（より好ましくは２）である。このようなｍの数値が前記下限未満では架橋反応が不十分となる傾向にあり、他方、前記上限を超えると立体障害による反応性の低下を引き起こす傾向にある。また、前記式（１）中のｎはそれぞれ独立に１又は２の整数（より好ましくは２）である。このような数値が前記下限未満では架橋反応が不十分となる傾向にあり、他方、前記上限を超えると立体障害による反応性の低下を引き起こす傾向にある。また、上記式（１）中のｐはそれぞれ独立に０又は１の整数である。このようなｐの値は式（１）中の窒素原子に結合した水素原子の数を示すものである。そのため、１つの括弧内に存在するｐとｎは、窒素原子に対するエポキシ基（Ｙ）の結合数（ｎ）が１の場合にｐは１となり、エポキシ基（Ｙ）の結合数（ｎ）が２の場合にはｐは０となる関係にある。このように、上記式（１）中においては、一つの括弧内に存在するｐとｎとの和はそれぞれ２である。

　また、このような１分子中に３個以上のエポキシ基を有する脂環式エポキシ化合物としては、下記式（２）～（３）で表されるものが挙げられる。

　非芳香族エポキシ化合物としてはまた、下記式（ａ）で表されるトリグリシジルイソシアヌレート（２，２，２，－トリ－（２，３－エポキシプロピル）－イソシアヌレート）のように、イソシアヌル環を有するものも好ましく用いることができる。

　得られる多孔性エポキシ樹脂粒子に高い親水性を付与できる観点から、多官能エポキシ基含有化合物としては窒素原子を有するものが好ましく、特に多官能アミノ基含有化合物との相溶性や反応性、得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の強度の観点からＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラグリシジル－ｍ－キシリレンジアミンが、また、高い親水性及び原料の汎用性の観点からトリグリシジルイソシアヌレートが好ましい。

　これらの多官能エポキシ基含有化合物は、１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

＜多官能アミノ基含有化合物＞
　本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子の原料となる多官能アミノ基含有化合物は、１分子中にアミノ基を２以上有するアミノ化合物であって、芳香族アミノ化合物であっても非芳香族アミノ化合物であってもよい。

　芳香族アミノ化合物としては、メタフェニレンジアミン、ジアミノジフェニルメタン、ジアミノジフェニルスルホン、ベンジルジメチルアミン、ジメチルアミノメチルベンゼン等の芳香族アミノ化合物、無水フタル酸、無水トリメリット酸、無水ピロメリット酸などの芳香族酸無水物、フェノール樹脂、フェノールノボラック樹脂、トリアジン環などの複素芳香環を有するアミノ化合物などが挙げられる。好ましくは分子内に一級アミノ基を２以上有する芳香族アミノ化合物であり、特に好ましくは、メタフェニレンジアミン、ジアミノジフェニルメタン、ジアミノジフェニルスルホンである。

　非芳香族アミノ化合物としては、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、イミノビスプロピルアミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、１，３，６－トリスアミノメチルヘキサン、ポリメチレンジアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、ポリエーテルジアミン等の脂肪族アミノ化合物、イソホロンジアミン、メンタンジアミン、Ｎ－アミノエチルピペラジン、３，９－ビス（３－アミノプロピル）２，４，８，１０－テトラオキサスピロ（５，５）ウンデカンアダクト、ビス（４－アミノ－３－メチルシクロヘキシル）メタン、ビス（４－アミノシクロヘキシル）メタンやこれらの変性物等の脂環式アミノ化合物、その他、ポリアミノ化合物とダイマー酸からなる脂肪族ポリアミドアミノ化合物などが挙げられる。

　これらのうち、効率的な架橋反応を達成するという観点から、分子内に１級アミノ基を２個以上有する脂環式アミノ化合物が好ましく、イソホロンジアミン、メンタンジアミン、ビス（４－アミノ－３－メチルシクロヘキシル）メタン、ビス（４－アミノシクロヘキシル）メタン、及びこれらの変性物からなる群の中から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、中でも、ビス（４－アミノ－３－メチルシクロヘキシル）メタン、下記式（ｂ）で表されるビス（４－アミノシクロヘキシル）メタンが特に好ましい。なお、このようなアミンの変性物としては、エポキシ変性物、カルボン酸変性物、尿素変性物、ケトン化合物による変性物、シラン化合物による変性物等の各種変性物が挙げられ、前述のような脂環式アミノ化合物を公知の方法で変性させたものを適宜用いることができる。

　これらの多官能アミノ基含有化合物は、１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

＜ポロゲン＞
　ポロゲンは、多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物を溶解させることができ、且つ多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物が重合した後、反応誘起相分離を生ぜしめることが可能な溶媒であり、例えばメチルセロソルブ、エチルセロソルブなどのセロソルブ類、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートなどエステル類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどのグリコール類などが挙げられる。中でも分子量２００～２０，０００程度のポリエチレングリコール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートが好ましく、特に分子量２００～２０，０００程度のポリエチレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートが好ましい。

　ポロゲンとしてのこれらの溶媒は、１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

＜原料混合液＞
　原料混合液は、前述の多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とをポロゲンに混合して均一化することにより調製することができる。

　原料混合液中における多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物の含有割合は、多官能エポキシ基含有化合物中のエポキシ基１当量に対して多官能アミノ基含有化合物中のアミノ基が０．８～１．３当量、好ましくは０．８～１．２当量、より好ましくは０．９～１．１当量となるように調整することが好ましい。多官能アミノ基含有化合物の当量比を上記下限以上とすると、得られる多孔性エポキシ樹脂の架橋密度を高めることができ、機械的強度、耐熱性、耐溶剤性等が向上する傾向にあり、他方、上記上限以下とすると、未反応の多官能アミノ基含有化合物を低減することができ、多官能アミノ基含有化合物が未反応のまま多孔性エポキシ樹脂中に残留することを抑制し、架橋密度を高めることができる傾向にある。

　また、原料混合液中のポロゲンとなる溶媒の含有割合は、得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の細孔径、細孔分布等に影響し、ポロゲンの含有割合が多いと細孔径は大きく、少ないと細孔径は小さくなる傾向にある。また、ポロゲンの含有割合が多いと細孔分布はブロードとなり、少ないとシャープとなる傾向にある。
　原料混合液中のポロゲン溶媒の含有割合は、原料混合液に含まれる多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物の合計に対して、通常５０～５００重量％であることが好ましく、１００～４００重量％であることがより好ましい。ポロゲンの含有割合が上記下限以上であるとより空孔率の高い多孔質構造を形成することができ、他方、上記上限以下であると得られる多孔性エポキシ樹脂の空孔率を適度な範囲に抑えることができ、機械的強度が向上する傾向にある。

　この原料混合液には、硬化促進剤を添加してもよい。このような硬化促進剤としては、公知のものを適宜使用することができ、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の三級アミン、２－フェノール－４－メチルイミダゾール、２－エチル－４－メチルイミダゾール、２－フェノール－４，５－ジヒドロキシメチルイミダゾールなどのイミダゾール類等を用いることができる。

　また、原料混合液には、多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物以外の反応原料化合物を混合して用いてもよい。多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物と共に付加重合反応に供し得る反応原料化合物としては、多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物と共に付加重合し得るものであればよく、特に制限はないが、例えば、後述の本発明の第二態様の分離剤の多孔性樹脂粒子の（共）重合物の原料単量体として例示したものの１種又は２種以上が挙げられる。ただし、多孔性エポキシ樹脂本来の耐衝撃性、耐薬品性、耐久性、取り扱い性、生産性等の特長を有効に得る上で、多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物以外の反応原料化合物は、全反応原料化合物中に３０重量％以下、特に０～１５重量％であることが好ましい。

　原料混合液の調製方法としては特に制限されず、常温で又は加温しながら多官能エポキシ基含有化合物、多官能アミノ基含有化合物及びポロゲンを混合する方法を採用してもよく、常温で又は加温しながら多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物の混合物をポロゲン中に添加して混合ないしは溶解させる方法を採用してもよい。

＜界面活性剤（分散剤）＞
　乳化物を形成するための界面活性剤としては、原料混合液と混合して安定な乳化物を形成することができるものであればよく、特に制限されず、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、親水性ブロックと疎水性ブロックからなるブロックコポリマー、例えばポリアクリル酸ブロックとポリアクリルエステルブロックからなるブロックコポリマー、ポリオキシエチレンブロックとポリアクリルエステルブロックからなるブロックコポリマー、ポリオキシエチレンブロックとポリオキシプロピレンブロックからなるブロックコポリマー等が挙げられる。また、界面活性剤の分子量についても、特に限定されず、低分子化合物でも高分子化合物でも使用することができる。

　アニオン界面活性剤としては、脂肪酸塩、高級アルコールの硫酸エステル塩、脂肪アルコールのリン酸エステル塩、アルキルアリルスルホン酸塩、ホルマリン縮合ナフタレンスルホン酸塩等が挙げられる。カチオン界面活性剤としては、アルキル１級アミン塩、アルキル２級アミン塩、アルキル３級アミン塩、アルキル４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩等が挙げられる。ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルエステル類、ソルビタンアルキルエステル類、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類等が挙げられる。高分子界面活性剤としては、部分ケン化ポリビニルアルコール、澱粉、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、部分ケン化ポリメタクリル酸塩等が例示される。

　用いる界面活性剤を選択することにより、得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の平均粒径や粒度分布、粒子の凝集状態を制御することができ、例えば、アニオン界面活性剤やカチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤を用いることにより、平均粒径を小さく且つ粒度分布を狭くすることができる。また、高分子界面活性剤を用いることにより平均粒径を大きくすると共に、粒子の凝集を抑制することができる。なかでも、界面活性剤として、親水性ブロックと疎水性ブロックからなるブロックコポリマーを用いる場合には、少量の添加で乳化できることから、重合反応時の溶液の粘度を低く保つことができるため撹拌が容易となり好ましい。

　これらの界面活性剤は、１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

　界面活性剤水溶液を用いる場合の界面活性剤濃度は、０．５～１０重量％、特に１～５重量％程度であることが好ましい。界面活性剤水溶液の界面活性剤濃度を上記下限以上とすると、粒径の制御が容易であったり、重合時の凝集を抑制することができ、上記上限以下とすると、重合時に泡が立ったり粘度が上昇することを抑制でき、製造が容易となる。
　また、分散剤としてブロックコポリマーを用いる場合は、一般に知られる分散媒を用いることができ、例えば、γ－ブチロラクトン、グリセリン、エチレングリコール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、ｎ－ブタノール等のアルコール類、トルエン、キシレン、ｎ－オクタン、ｎ－ドデカン等の炭化水素類、リノール酸等の脂肪酸類、ポリエチレングリコール、ジメチルシリコーン、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、１－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチルブタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、３－ヘプタノール、２－オクタノール、２－エチル－１－ヘキサノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール等のアルコール類；メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、イソプロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、ジエチレンブリコールモノブチルエーテル等のエーテルアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、セロソルブアセテート等のエステル類；ペンタン、２－メチルブタン、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン、２－メチルペンタン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、ヘプタン、ｎ－オクタン、イソオクタン、２，２，３－トリメチルペンタン、デカン、ノナン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ－メンタン、ジシクロヘキシル、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン等の脂肪族又は芳香族炭化水素類；四塩化炭素、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、テトラブロムエタン等のハロゲン化炭化水素類；エチルエーテル、ジメチルエーテル、トリオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；メチラール、ジエチルアセタール等のアセタール類；ギ酸、酢酸、プロピオン酸等の脂肪酸類；ニトロプロペン、ニトロベンゼン、ジメチルアミン、モノエタノールアミン、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の硫黄、窒素含有有機化合物類等が挙げられる。好ましくは、メタノールやエタノールなどの低級アルコール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブなどのエーテルアルコール、水と低級アルコールの混合物、水とエーテルアルコールの混合物のような水溶性及び親水性の媒体、トルエン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、アセトン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ジクロロメタン、テトラクロロエチレンなどが挙げられる。これらは単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。分散媒中のブロックコポリマーの濃度は、０．５～１５重量％、特に１～１０重量％程度であることが好ましい。

＜付加重合反応＞
　多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物の付加重合反応は、前述の原料混合液と界面活性剤（分散剤）とを混合して安定な乳化状態とした後、撹拌下に所定の時間加熱することにより行う。
　なお、乳化状態は、水と油からなるエマルションを形成する場合は油滴が水に分散する水中油滴（Ｏ／Ｗ型）エマルションと、水滴が油中に分散する油中水滴（Ｗ／Ｏ型）エマルションの形態がある。また、非相溶の油からなる油中油滴（Ｏ／Ｏ型）エマルションも好ましく用いることができる。使用する多官能エポキシ基含有化合物及び多官能アミノ基含有化合物、ポロゲンにより乳化状態を選ぶことができるが、ポロゲンの親水性及び水溶性の観点から、油中油滴型を好適に用いることができる。

　ここで、界面活性剤（分散剤）は、多官能エポキシ基含有化合物、多官能アミノ基含有化合物、及びポロゲンの合計量に対して１～２０重量％、特に２～１０重量％程度用いることが好ましい。界面活性剤の使用量は、得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の平均粒径や粒度分布、粒子の凝集に影響し、界面活性剤の使用量が多いと平均粒径や粒度分布、粒子の凝集を制御とすることができ、少ないと泡立ちや粘度を低く保つことができる傾向にある。よって、界面活性剤の使用量が上記下限以上であると、原料混合液を均一に乳化できて粒度分布を狭い範囲にすることができたり、粒子の凝集を抑制することができる。また、上記上限以下であると、泡立ちや粘度の上昇を抑制することができ、製造が容易となる。

　また、付加重合反応時の撹拌速度は、得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の粒径に影響し、一般的に、撹拌速度が大きいと得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の粒径が小さくなり、撹拌速度が小さいと得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の粒径が大きくなる傾向がある。撹拌速度が適度に大きいと相分離等が抑制され、均一な粒径のものを得ることができ、撹拌速度が適度に小さいと粒子径が小さくなりすぎず、泡立ちも抑制可能であるため、加熱温度や反応スケール、ポロゲン、界面活性剤の使用量等によっても異なるが、撹拌速度は３０～８００ｒｐｍ、特に５０～４００ｒｐｍの範囲で適宜調整することが好ましい。

　また、付加重合反応時の加熱温度は、得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の細孔径に影響し、一般的に、加熱温度が高いと得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の細孔径が小さくなり、加熱温度が低いと得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の細孔径が大きくなる傾向がある。加熱温度が適度に高いと付加重合反応が円滑に進行し、加熱温度が適度に低いと反応速度が速くなり過ぎることを防止し、多孔質構造をうまく形成することができるため、撹拌速度やポロゲン、界面活性剤の使用量等によっても異なるが、加熱温度は４０～１２０℃、特に６０～９０℃の範囲で適宜調整することが好ましい。

　また、付加重合反応時間は、得られる多孔性エポキシ樹脂粒子の反応率に影響し、一般的に、反応時間が長いと反応率が高く未反応物が少ないため機械的強度が高くなる傾向があり、反応時間が短いと反応率が低く未反応物が多いため機械的強度が低くなる傾向がある。反応時間が適度に長いと付加重合反応が十分に進行して所望の多孔質構造を形成でき、適度に短いと撹拌による破砕などの可能性を低減することができるため、撹拌速度、加熱温度やポロゲン、界面活性剤の使用量等によっても異なるが、反応時間は１～１２時間、特に２～６時間の範囲で適宜調整することが好ましい。

　このように、原料混合液と界面活性剤（分散剤）とを均一に撹拌混合してなる乳化物中で所定の条件で付加重合反応を行うことにより、乳化物中の、個々の原料混合液の乳化粒子中で、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物との反応系とポロゲンとの間に共連続構造が形成された状態で付加重合反応が進行することで、非粒子凝集型の三次元網状骨格構造の粒子状の多孔性エポキシ樹脂を生成させることができる。

　付加重合反応後は、生成した粒子状の多孔性エポキシ樹脂を濾別し、界面活性剤及びポロゲン、未反応物を水等により洗浄除去して本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子を得ることができる。
　本発明の多孔性エポキシ樹脂粒子は、粒状の中でも球状であることが好ましい。特に真球に近いほど好ましい。球状であることによりカラム充填において理論段数が高くしやすく、分離特性が向上する。真球に近いほど更に理論段数は高くなり分離特性も更に向上する。上述の方法で作製された多孔性エポキシ樹脂粒子は、撹拌下の乳化物中に生成したものであるため、通常、真球に近い粒状粒子である。また、この多孔性エポキシ樹脂粒子の平均細孔径は好ましくは１０ｎｍ～２０００ｎｍで、平均粒径は好ましくは１μｍ～１０００μｍである。

［多孔性エポキシ樹脂粒子の処理］
　本発明の第一態様の分離剤は、上記のようにして製造された多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなることを特徴とする。
　ここで、多孔性エポキシ樹脂粒子の処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子の目的物の分離性（選択的吸着性）を向上させると共に、非特異吸着性を低減させるような処理が好ましく、例えば、表面親水化、表面疎水化、官能基導入、生体分子導入、分級、有機溶媒洗浄、アルカリ洗浄などの処理が挙げられる。
　これらの親水化や疎水化、官能基導入などは、粒子の表層に何らかの異なる化学構造のものを付与することにつながるため、表層と断面との化学構造を比較することで処理の有無を確認することができる。例えば、固体核磁気共鳴法（固体ＮＭＲ）や赤外分光法（ＩＲ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）などにより測定することで、処理の有無を確認することができる。これらの処理のうち、１種のみを行ってもよく、複数の処理を選択して組み合わせて行ってもよい。

＜表面親水化処理＞
　表面親水化処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基に、水酸基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを有する化合物を付加させることによりエポキシ基を開環する処理が挙げられる。この親水化処理に用いる水酸基及び／またはアミノ基を有する化合物としては、硫酸、リン酸、水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、エタノールアミン、アミノメチルプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール等の１種又は２種以上が挙げられる。親水化処理は、これらの化合物を多孔性エポキシ樹脂粒子に接触させることにより行うことができる。また、親水化処理にて導入された官能基に更に同様の親水化処理を行うこともできる。またそれらを複数組み合わせて実施することもできる。具体的には、後述の実施例に示されるように、多孔性エポキシ樹脂粒子を１～５０重量％程度の親水化処理用化合物の水溶液に投入し、１０～９０℃で１～２４時間程度加熱撹拌する方法が挙げられる。親水化処理後は多孔性エポキシ樹脂粒子を濾別し、水洗を行って、残留する親水化処理用化合物を除去する。
　親水化処理を行うことで、粒子の水への分散性向上や、疎水性を有する物質の非特異的な吸着が抑制される。
　表面親水化の指標としては、後述する非特異吸着量などにて評価できる。

＜表面疎水化処理＞
　表面疎水化処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基やアミノ基などに疎水性基を有する化合物を付加することにより疎水化処理する方法が挙げられる。この疎水化処理に用いる化合物としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、メチルクロライド、エチルクロライド、ブチルクロライド、ベンジルクロライドなどのアルキルクロライド類等の１種又は２種以上が挙げられる。疎水化処理は、例えば多孔性エポキシ樹脂粒子を疎水化処理用化合物を含む溶液中に分散させ、１０～９０℃で１～６時間程度加熱撹拌することにより行うことができる。疎水化処理後は多孔性エポキシ樹脂粒子を濾別して水洗を行って、残留する疎水化処理用子化合物を除去する。
　疎水化処理を行うことで、疎水性を有する物質の吸着を促進することができる。一般的な逆相クロマトグラフィーの評価条件において、分離対象の保持を強くすることができるため、疎水性の高い物質を分離する際などには有用である。
　表面疎水化の指標としては、ジプロピルフタレートのような疎水性物質の保持時間として評価できる。

＜官能基導入処理＞
　官能基導入処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子表面に残存するエポキシ基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを介して、イオン性官能基を有する水溶性ポリマーを付加するグラフト処理などが挙げられる。

　上記グラフト処理において、多孔性エポキシ樹脂粒子に付加するイオン性官能基を有する水溶性ポリマー（以下、「イオン性水溶性ポリマー」と称す場合がある。）としては、一級水酸基を有するものが好ましく、天然ポリマーおよび合成ポリマーの何れも用いることができる。多孔性エポキシ樹脂粒子にイオン性水溶性ポリマーを付加した後、更に相互作用性官能基を導入してもよく、この場合、このイオン性水溶性ポリマーは、多孔性エポキシ樹脂粒子と共有結合で結合する一級水酸基の他に、相互作用性官能基と結合し得る官能基を有することが好ましい。このような相互作用性官能基と結合し得る官能基としては、二級水酸基、三級水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン基、イソシアネート基、クロル基等のハロゲン基およびエポキシ基等が挙げられる。
　導入された官能基は、上述の固体ＮＭＲ、ＩＲ、ＸＰＳなどにより分析することができる。また、酸やアルカリなどによる滴定によっても官能基の導入を確認することができる。

　イオン性水溶性ポリマーとしては、より好ましくは水酸基を複数有する天然ポリマーまたは合成ポリマーである。天然ポリマーとしてはアガロース、キトサン、グルコマンナン等やヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の改質セルロース等が挙げられる。また、合成ポリマーとしては、ポリグリセリン、ポリグリシドール、アリルグリシジルエーテル－グリシドール共重合体等のポリエーテルポリオール類、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸２，３－ジヒドロキシプロピル等の（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル類、ヒドロキシエチルビニルエーテル、ヒドロキシブチルビニルエーテル等のヒドロキシアルキルビニルエーテル類、メチロールアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド等のアルキロールアクリルアミド類等の一級水酸基を含むモノビニル単量体の１種又は２種以上の（共）重合体またはこれらの一級水酸基を含むモノビニル単量体の１種又は２種以上とその他の官能基を含むモノビニル単量体の１種又は２種以上との共重合体等が挙げられる。なお、その他の官能基を含むモノビニル単量体については相互作用性官能基、または相互作用性官能基を後反応にて導入し得る官能基を含むものも好ましい。

　イオン性水溶性ポリマーとしては、これらのうち合成ポリマーがより好ましい。これは合成ポリマーの方が通常、天然ポリマーよりも純度が高く、多孔性エポキシ樹脂粒子への付加反応が制御しやすいことなどの理由による。

　イオン性水溶性ポリマーの分子量については特に制限はないが、通常１００以上、好ましくは２００以上、より好ましくは２５０以上であり、一方、通常５，０００，０００以下、好ましくは１，０００，０００以下、より好ましくは６００，０００以下である。イオン性水溶性ポリマーの分子量が小さ過ぎると、多孔性エポキシ樹脂粒子に付加することによる吸着量向上効果が低減する傾向にあり、一方で大き過ぎると付加されたイオン性水溶性ポリマーが多孔性エポキシ樹脂粒子の細孔内空間の大多数を占めることによりタンパク質等の高分子量の分離対象物が細孔内空間に拡散浸透する余地が少なくなることとなる。

　また、多孔性エポキシ樹脂粒子へのイオン性水溶性ポリマーの付加量については、イオン性水溶性ポリマーを付加する前の多孔性エポキシ樹脂粒子の重量Ｗ_０と、これにイオン性水溶性ポリマーを付加して得られる分離剤を減圧乾燥法等の方法により恒量とした重量Ｗ_１から下記式で算出される付加率として、通常０．１～３０％、特に０．５～２０％であることが好ましい。
　　付加率＝｛（Ｗ_１－Ｗ_０）／Ｗ_０｝×１００

　付加率が少な過ぎると、多孔性エポキシ樹脂粒子にイオン性水溶性ポリマーをグラフトすることによる吸着量向上効果を十分に得ることができず、多過ぎると付加されたイオン性水溶性ポリマーが多孔性エポキシ樹脂粒子の細孔内空間の大多数を占めることによりタンパク質等の高分子量の分離対象物が細孔内空間に拡散浸透する余地が少なくなることとなる。

　多孔性エポキシ樹脂粒子に対し、イオン性水溶性ポリマーを付加する方法として、例えば、エポキシ基を表面に有する多孔性エポキシ樹脂粒子に対し、イオン性水溶性ポリマーを共有結合にて付加する場合には、アルカリ触媒或いは酸性触媒を用いて、又は無触媒のいずれの方法でも付加反応を行うことができる。

　付加反応に用いる溶媒についても、イオン性水溶性ポリマーを溶解することができる範囲において有機溶媒系、有機溶媒／水混合溶媒系および水系いずれのものも用いることが可能であり、反応温度および反応時間についても公知の反応条件に基いて適宜選択することができるが、例えばエポキシ基を表面に有する多孔性エポキシ樹脂粒子の場合には反応温度は通常０～２００℃、反応時間は通常１分～６０時間である。

　なお、多孔性エポキシ樹脂粒子にイオン性水溶性ポリマーを付加した後は、多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存する水酸基と共有結合し得る官能基を加水分解等により相互作用性官能基と結合し得る基に変換してもよい。

　多孔性エポキシ樹脂粒子にイオン性水溶性ポリマーを付加した後、更に相互作用性官能基を導入してもよいが、予め相互作用性官能基が導入されたイオン性水溶性ポリマーを用いてもよい。

　ここで、相互作用性官能基としては、本発明の分離剤の用途に応じて適宜決定され、例えば液体クロマトグラフィー用分離剤としての用途においては、各種のイオン交換基、疎水性相互作用基の中から適宜選択される。本発明の分離剤を用いてタンパク質を分離する場合には、これらの相互作用性官能基を、分離対象物のタンパク質に合わせて適宜選択することにより、タンパク質の吸着能が特に優れたものとなる。

　イオン交換基としては、例えば、カルボキシメチル基等のカルボキシル基、ホスホノエチル基等のホスホノアルキル基、スルホエチル基、スルホプロピル基、２－メチルプロパンスルホン酸基等のスルホアルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基等の各種アルキルアミノ基、ピリジン基等が挙げられる。

　疎水性相互作用基としては、炭素数１～４０のアルキル基、フェニル基、アルキル基の炭素数が１～１０で繰り返し数が２～１００のポリアルキルエーテル基等が挙げられ、好ましくは炭素数４～１８のアルキル基、フェニル基、アルキル基の炭素数が２～４で繰り返し数が２～２０のポリアルキルエーテル基等が挙げられる。

　本発明の分離剤は、これらの相互作用性官能基のうちの１種のみを有するものであってもよく、２種以上を有するものであってもよい。

　相互作用性官能基を導入する方法としては、前述の相互作用性官能基を有する化合物を、イオン性水溶性ポリマーを付加した多孔性エポキシ樹脂粒子に反応させればよい。イオン性水溶性ポリマーを付加した多孔性エポキシ樹脂粒子に反応させる相互作用性官能基を有する化合物としては、イオン性水溶性ポリマーを付加した多孔性エポキシ樹脂粒子の水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン基、イソシアネート基、クロル基等のハロゲン基およびエポキシ基等と反応する化合物が好ましい。
　これらは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。

　これらの相互作用性官能基を有する化合物をイオン性水溶性ポリマーを付加した多孔性エポキシ樹脂粒子に反応させて相互作用性官能基を導入する反応方式には特に制限はなく、一般的には、相互作用性官能基を有する化合物を溶解し得る溶媒に当該相互作用性官能基を有する化合物を溶解させた反応液に、イオン性水溶性ポリマーを付加した多孔性エポキシ樹脂粒子を加えて所定の温度で所定の時間加熱して反応させればよい。

　このようにして製造される本発明の分離剤の相互作用性官能基導入量としては、例えば、相互作用性官能基がイオン交換基である場合、イオン交換容量として０．００１～４当量／Ｌ－分離剤粒子が好ましく、特に０．０１～２当量／Ｌ－分離剤粒子が好ましい。

　また、相互作用性官能基が疎水基の場合は０．００１当量／Ｌ－分離剤粒子～２当量／Ｌ－分離剤粒子が好ましい。

＜生体分子導入処理＞
　生体分子導入処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子表面に残存するエポキシ基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを介して、タンパク質及びタンパク質誘導体のうちの少なくとも１つを付加するカップリング処理などが挙げられる。カップリング処理は、上記グラフト処理後にタンパク質及びタンパク質誘導体のうちの少なくとも１つを付加することにより行うこともできる。
　導入する生体分子としては、タンパク質及び／またはタンパク質誘導体や核酸、多糖、脂質、ビタミン等が挙げられ、特にタンパク質及び／またはタンパク質誘導体が好ましい。また、これらの生体分子の中でも、ある特定の物質と特異的に結合するアフィニティーリガンドがより好ましい。
　導入された官能基は、上述の固体ＮＭＲ、ＩＲ、ＸＰＳなどにより分析することができる。また、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法やＢｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質の定量などによっても導入された官能基を分析可能である。

　このようにして製造される本発明の分離剤の生体分子導入量は、アフィニティーリガンドの場合は１マイクロ当量／Ｌ－分離剤粒子～２当量／Ｌ－分離剤粒子が好ましい。

　アフィニティーリガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬおよびこれらの機能性改変体、各種抗体、もしくはこれらの疑似ペプチドリガンド類、各種色素類、レクチン類、オリゴ核酸等の核酸類等が挙げられるが、タンパク質の分離用途においては、タンパク質に親和性のある生化学活性を有する物質で多孔性エポキシ樹脂粒子及び／又はイオン性水溶性ポリマーに付加可能なものであれば特に限定されない。
　特に、抗体の分離を主目的とする場合、リガンドとしては免疫グロブリンの一部と特異的に結合可能なものが好ましく、その中でもプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬおよびこれらの改変体、とりわけプロテインＡの改変体が抗体の分離に用いる際の選択率が高く好ましい。

　以下に、多孔性エポキシ樹脂粒子に前述のアフィニティーリガンドを導入する方法についてより詳細に説明する。

　多孔性エポキシ樹脂粒子にアフィニティーリガンドを導入する方法としては、多孔性エポキシ樹脂粒子に反応性官能基付与性を有する重合性単量体を共重合等の形で取り込ませておいた上で、この反応性官能基と、リガンドの有する官能基とを直接反応させる方法、
多孔性エポキシ樹脂粒子の構成成分の有する官能基及び前記リガンドの有する官能基とそれぞれ反応可能な官能基を分子内にそれぞれ１個以上有する低分子又は高分子化合物（以下このような化合物をまとめて「スペーサー」と記す。）を介して結合させる方法を採用することができる。

　例えばプロテインＡのようなアミノ基を有するリガンドを固定化する場合、前者の方法としては、多孔性エポキシ樹脂粒子にエポキシ基、カルボキシル基などのアミノ基と共有結合を形成する官能基を含有させておき、これとプロテインＡを直接反応させて固定化する方法が例示できる。また、多孔性エポキシ樹脂粒子に残存しているエポキシ基を使って固定化することもできる。
　また、後者の方法としては、スペーサーとしてアミノ酸（アミンカルボン酸）類を用い、そのアミノ基部位と多孔性エポキシ樹脂粒子のエポキシ基とを反応させた上で、他の末端のカルボキシル基によってプロテインＡのアミノ基と反応させる方法や、スペーサーとしてジアミンやジオールと（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエーテル等のジグリシジル化合物を逐次的に用いて、多孔性エポキシ樹脂粒子のエポキシ基とジアミン又はジオールの一方の末端を結合させ、他の末端にジグリシジル化合物の一方のエポキシ基を結合させて、残る末端のエポキシ基をプロテインＡと結合させる方法などが挙げられる。

　なお、上記方法でスペーサーの一部の成分として用いられるジアミンとしては、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等の脂肪族ジアミン類が挙げられ、ジオールとしては、プロピレングリコール、ブタンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール等の脂肪族ジオールやポリエチレングリコール類が挙げられる。
　スペーサーとしてはリガンドとの反応性や固定化時の多孔性エポキシ樹脂粒子との立体障害の関係を考慮すると、直鎖状の構造を有していることが好ましい。分岐鎖状の構造のスペーサーを用いると、立体障害が大きくなって、リガンドと抗体とのアフィニティ結合の形成を抑制するためか、吸着量が低下する傾向となる。

　分離対象となる抗体の選択性には、多孔性エポキシ樹脂粒子の細孔内部に結合するプロテインＡ等のリガンドの細孔壁からの距離が関係するものと考えられているが、前者の方法では多孔性エポキシ樹脂粒子を製造する段階で、共重合させる単量体反応性官能基付与性を有する重合性単量体の種類によって上記距離が決まってしまうのに対して、後者の方法ではスペーサーの種類や組み合わせを選ぶことによって、リガンドの固定化段階で上記距離の調整ができる点、好ましい方法である。

　リガンドの固定化反応に際しては、例えばプロテインＡ等を水溶液として多孔性エポキシ樹脂粒子上に供給し、反応を行わせる。
　固定化反応の温度は常温～３０℃程度が好ましい。温度が高くなるとプロテインＡ等が不活性化することがあり、一方温度が低いと反応に長時間を要することとなる。
　リガンドの固定化密度は、分離剤１リットル当たり１ｇ以上であることが好ましい。またその上限は特に限定されないが、通常５０ｇ／Ｌ以下である。
　リガンドの固定化密度が１ｇ／Ｌ未満では抗体の吸着量が低下し、分離剤の効率が低くなる。一方、５０ｇ／Ｌを超えてリガンドを固定しても、リガンドの利用効率が低くなる。

　このリガンドの固定化密度は、リガンドの固定化を行う官能基（例えばエポキシ基）の含有量は、多孔性エポキシ樹脂粒子１ｍＬ当たり０．０１～１００μ（エポキシ）当量であることが好ましい。この値が、０．０１μ当量未満ではリガンドの固定量が少なくなるとともに、リガンドの固定が弱体化してリガンドの脱離・脱落が起きることがある。一方、この含有量が１００μ当量を超えて多くなると、リガンドの易動性が阻害されるためか、抗体吸着量が低下する傾向となる。
　より好ましい固定化密度としては、多孔性エポキシ樹脂粒子１ｍＬ当たり０．０５～５０μ（エポキシ）当量が挙げられる。

　上記のように固定化反応を行った後、多孔性エポキシ樹脂粒子側に残存する反応性官能基は、後処理により不活性化しておくことが好ましい。不活性化せずに残った反応性官能基は、徐々にプロテインＡ等のリガンドの活性基と反応し、分離剤の吸着容量を低下させたり、選択率を悪化させたりする場合がある。

　このような後処理としては、例えば反応性官能基としてエポキシ基を例に取れば、エタノールアミン等のアミン類の水溶液と反応させて不活性化する方法が例示できる。このときのエタノールアミンの濃度やｐＨ等の処理条件は、特に制限されるものではないが、通常、濃度０．１～５モル／Ｌ、ｐＨ７～１４の条件で実施することができる。この範囲の条件とすることで、エタノールアミンの反応速度が実用的な範囲となり、またプロテインＡの失活も抑えられるので好ましい。さらに好ましい処理条件は濃度１～２モル／Ｌ、ｐＨ８～９の条件である。

　リガンド固定化反応後の分離剤、または固定化反応に加えて後処理を加えた分離剤は、未反応物を除去するために水で洗浄するのが好ましい。洗浄に際しては、酸性の洗浄水と塩基性の洗浄水とを交互に用いて洗浄することがより好ましい。このとき、ｐＨ０～５の酸性緩衝液とｐＨ８～１５の塩基性緩衝液との２種類を交互に用いて洗浄すると過剰のプロテインＡ等の除去と、固定化されたプロテインＡの活性化を行うことができてさらに好ましい。

　洗浄に使用することができる緩衝液のうち、酸性緩衝液としては、塩酸／塩化カリウム、酒石酸、クエン酸、グリシン、ギ酸、酢酸、コハク酸、リン酸、またはそれらの塩が、塩基性緩衝液としては、トリエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ジエタノールアミン、ホウ酸、アンモニア、炭酸、またはそれらの塩を含むものが使用できる。

　使用する緩衝液のイオン強度は、０．００１Ｍ～１０Ｍが好ましく、より好ましいイオン強度は０．０１Ｍ～２Ｍである。この範囲のイオン強度の緩衝液を使用すると、固定化されたプロテインＡの失活を少なくすることができるので好ましい。また用いる緩衝液には、塩化ナトリウムや塩化カリウムのような塩を含有していてもよい。これらの塩が存在すると過剰のプロテインＡ等の除去と、固定化されたプロテインＡの活性化を効果的に行うことができて好ましい。塩化ナトリウムや塩化カリウムの濃度は通常０．１～２Ｍ、好ましくは０．５～１Ｍである。

　得られた分離剤は、そのまま使用する場合を除いて一時的に保管される。保管時の媒体としては、濃度１～５０重量％のエタノール水溶液を用いるのが好ましい。エタノールの濃度をこの範囲とすることで、固定化されたプロテインＡの失活を少なくすることができる。
　また、多孔性エポキシ樹脂粒子の多孔性粒子を用いた上記分離剤を該保管媒体中で保管した時に、該分離剤の膨潤度が適切になり、かつ該分離剤に対する保管媒体への親和性が良好である。したがって細菌類の繁殖が抑制する効果や細孔内に固定されたプロテインＡの保存安定性が良くなる効果が発現するので好ましい。より好ましいエタノールの濃度は１０～３０重量％、さらに好ましい濃度は１５～２５重量％である。

＜分級処理＞
　多孔性エポキシ樹脂粒子の分級処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子を、重力分級、慣性分級などの乾式分級、沈降分級や水力分級などの湿式分級、篩による篩分け分級など公知の方法により分級して、所望の粒径及び粒度分布のものを得る方法が挙げられる。
　多孔性エポキシ樹脂粒子を分級処理して得られる分離剤としては、平均粒径が１μｍ～１０００μｍであることが好ましく、均一係数（累積残留百分率が４０％となる粒径／累積残留百分率が９０％となる粒径）が１．６以下であることが好ましい。より好ましくは、均一係数が１．４以下、更に好ましくは１．２以下である。

＜有機溶媒洗浄＞
　多孔性エポキシ樹脂粒子の有機溶媒の洗浄に用いる有機溶媒としては、メタノールやエタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、トルエンやキシレンなどの芳香族類等の１種又は２種以上が挙げられる。有機溶媒洗浄は、例えば、多孔性エポキシ樹脂粒子を１～１０容量倍の有機溶媒に投入して１～５時間程度撹拌することにより行うことができる。この洗浄時には、必要に応じて４０～１００℃程度に加熱してもよい。また、有機溶媒洗浄は複数回繰り返し行ってもよく、その際、異なる有機溶媒を用いてもよい。有機溶媒による洗浄後は、水洗を行って有機溶媒を除去することが好ましい。
　有機溶媒洗浄により、多孔性エポキシ樹脂粒子の合成時に使用した界面活性剤（分散剤）やポロゲンなどを除去することが可能である。これらが残存していると、多孔性エポキシ樹脂粒子を分離剤として使用した際に非特異吸着が起きたり、分離対象を溶離する際に不純物として混入したりするため、あらかじめ洗浄除去しておくことが好ましい。

＜アルカリ洗浄＞
　多孔性エポキシ樹脂粒子のアルカリ洗浄に用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機アルカリが好ましく用いられる。これらのアルカリは０．１～１０重量％程度の濃度の水溶液として用いることができる。アルカリ洗浄は、例えば、多孔性エポキシ樹脂粒子を１～１０容量倍のアルカリ水溶液に投入して１～５時間程度撹拌することにより行うことができる。この洗浄時には、必要に応じて４０～１００℃程度に加熱してもよい。また、アルカリ洗浄は複数回繰り返し行ってもよく、その際、異なるアルカリを用いてもよい。アルカリによる洗浄後は、水洗を行ってアルカリを除去することが好ましい。
　多孔性エポキシ樹脂粒子をアルカリで洗浄することにより、エステル結合や水素結合など、耐アルカリ性が低い不完全な結合を形成している箇所を加水分解することができ、分離剤としての性能を安定化させることができる。一般に、分離剤として使用する場合にはアルカリ洗浄工程があるため、あらかじめアルカリ洗浄を実施しておくことで、分離剤として繰り返し使用する際に安定した性能を示すため好ましい。

＜乾燥処理＞
　分離剤を製造するにあたって必須ではないが、多孔性エポキシ樹脂粒子に乾燥処理を施してもよい。乾燥処理としては、多孔性エポキシ樹脂粒子を真空乾燥機やセーフベンドライヤー、凍結乾燥機等により、温度－２０～１２０℃、圧力１～１００ｋＰａで、１～１２時間程度処理して乾燥させることにより、多孔性エポキシ樹脂粒子が保存する水分の９５％以上を除去する方法が挙げられる。

［分離剤の物性］
　本発明の第一態様の分離剤は、少なくとも下記（ｉ）、（ｉｉ）の何れかを満たす。これらの特性は、分離剤を構成する多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に液体クロマトグラフィー用途として十分な細孔が存在していることを意味しており、いずれか一方を満たしていても、両方を満たしていてもよい。
　（ｉ）　平均細孔径が１０ｎｍ～２０００ｎｍである。
　（ｉｉ）　水分含有量が５０重量％以上である。

＜平均細孔径＞
　本発明の分離剤は、粒子表面にまで貫通する細孔を有していることを特徴とする。このことは、粒子表面及び断面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察を行うことによって確認できる。また、水銀圧入法で細孔径を測定可能である場合には、粒子表面にまで達する細孔を有することが確認できる。さらに、これらの顕微鏡観察及び細孔径測定を組み合わせることで更に正確に確認できる。なお、水銀圧入法は、圧力をかけて水銀を開孔部に侵入させ、圧力値と対応する侵入水銀体積とを用いて、円柱状と仮定した細孔の径をＷａｓｈｂｕｒｎの式から算出する方法であり、セラミックス成形体について規定されたＪＩＳ　Ｒ１６５５を準用することができる。

　本発明の分離剤の平均細孔径は、１０ｎｍ～２０００ｎｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ～１０００ｎｍ、更に好ましくは２００ｎｍ～５００ｎｍである。
　平均細孔径が上記下限値以上であると、分離対象のタンパク質等が粒子の細孔内に入りやすくなり、結果的に吸着量が向上する傾向にある。一方、平均細孔径が上記上限値以下であると、細孔内部の吸着に寄与しない空間を低減することが可能であり、吸着量が向上する傾向にあり、更に粒子の機械的な強度も向上する傾向にある。
　なお、本発明の分離剤の平均細孔径は、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。
　分離剤の平均細孔径は、前述の多孔性エポキシ樹脂粒子の製造に当たり、多孔性エポキシ樹脂粒子の各構成単位及びポロゲンとの混合比率や、撹拌時の加熱温度等を調整することにより制御することができる。

＜水分保持量＞
　本発明の分離剤の水分保持量は、好ましくは５０重量％以上であり、より好ましくは６０重量％以上、さらに好ましくは７０重量％以上、分子サイズが大きな分離対象の分離に用いる場合には７５重量％以上であることが特に好ましい。なお、分離剤の水分保持量とは、分離剤が細孔内などの空間を含めて保持可能な水の量を意味しており、水分保持量が大きいほど、分離剤が有する細孔容積が大きいことを意味する。細孔径が一定の場合、水分保持量が多いほど有効な表面積が大きくなるため、吸着容量の増大や分離性向上の点で水分保持量は大きい方が好ましい。物理的な強度の観点から、水分保持量は９５重量％以下が好ましい。また、表面処理において、高分子量のポリマーなどを導入すると、細孔内の空間を占有し水分保持量が低下する傾向がある。
　なお、本発明の分離剤の水分保持量は、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。

＜平均粒径＞
　本発明の分離剤の平均粒径は、１μｍ～１０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１０μｍ～１００μｍ、更に好ましくは３０μｍ～６０μｍである。平均粒径が上記下限値以上であると、カラムに充填して通液した時の圧力損失が大きくなることが防止され、通液速度を高くすることができ、処理効率を高めることができる傾向にある。一方、上記上限値以下であると、吸着量や分離性能を高く維持することができる傾向にある。
　なお、本発明の分離剤の平均粒径は、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。

　分離剤の平均粒径は、前述の通り、多孔性エポキシ樹脂粒子の製造に当たり、乳化物の撹拌速度、撹拌時の加熱温度、用いる乳化剤の種類及び量、撹拌翼や反応釜の形状等を調整することにより制御することができる。なお、分離剤の平均粒径は、用いる多孔性エポキシ樹脂粒子の平均粒径と略同一の範囲となる。

＜１０％圧縮変形強度＞
　分離剤は、クロマトグラフィーカラムの通液時の変形を防止して、適当な通液速度での処理が可能な十分な強度を有することが好ましく、本発明の分離剤は、乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により１０％圧縮変形させた時の強度が２．０ＭＰａ以上であることが好ましい。１０％圧縮変形強度は大きい程好ましく、４．０ＭＰａ以上であることがより好ましいが、好適な細孔径及び分離挙動との両立の面から、通常その上限は２０ＭＰａである。
　なお、本発明の分離剤の１０％圧縮変形強度は、具体的には、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。

　本発明の分離剤は、上述の通り、樹脂粒子表面にまで貫通する細孔を有し、細孔径や細孔容積を一定以上の値とすることができ、分離剤として種々の対象物を大量に処理することが可能である点で優れている。一般的に、細孔径や細孔容積が大きくなると粒子の機械的な強度が低下する傾向にあるが、本発明の分離剤は、細孔径や細孔容積が十分に大きかったとしても、１０％圧縮変形強度に代表される機械的な強度が高いため、分離剤として特に優れている。

＜圧力損失＞
　本発明の分離剤は、下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が７．０ＭＰａ以下、特に３．０ＭＰａ以下であることが好ましい。
＜圧力損失測定方法＞
　前記分離剤を内容積４ｍＬ（内径０．５ｍｍ、層高２０ｃｍ）のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＬＣ　ＥＬＩＴＥ　ＬａＣｈｒｏｍ、カラムオーブンＬ－２３５０、ＲＩ検出器Ｌ－２４９０、オートサンプラーＬ－２２００）に接続し、純水を流速１．３ｍｌ／ｍｉｎ（線速度４００ｃｍ／ｈ）で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。

　圧力損失が大きいと、高流速での通液により分離剤が圧縮されてしまい分離挙動が悪くなることや、高流速で通液するためにはクロマトグラフィーカラムとして耐圧容器が必要となり、通液のための動力も大きくなり好ましくない。圧力損失は小さい程好ましいが、好適な１０％圧縮変形強度との両立の面から、通常その下限は０．５ＭＰａである。
　なお、本発明の分離剤の圧力損失は、具体的には、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。

　本発明の分離剤は、下記非特異吸着試験により求められる非特異吸着性（％）が５％以下であることが好ましく、特に３％以下であることが好ましい。
＜非特異吸着試験＞
　水に分散した前記分離剤を２．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）水溶液に浸漬し、２５℃で３時間吸着させる。吸着前後の上清の２８０ｎｍの吸光度より、ＩｇＧの回収率を評価する。さらにＩｇＧ吸着後遠心分離で分別した分離剤を０．１Ｎ　ＮａＯＨ水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のＢＣＡ測定（ビシンコニン酸タンパク質定量法）により、ＮａＯＨ処理によるＩｇＧの回収率を求める。ＩｇＧ水溶液中のＩｇＧに対する上清のＩｇＧ回収率（％）とＮａＯＨ処理によるＩｇＧ回収率（％）の合計を１００％から差し引いた値を非特異吸着性（％）の評価値とする。

　非特異吸着性が大きいと、目的物質の溶出時に完全に溶離してこないことにより目的物質の回収率が低下したり、目的物質以外の不純物も吸着して目的物質の純度が低下したりするため好ましくない。非特異吸着性は小さい程好ましいが、評価条件の精度の観点から、通常その下限は０．１％である。
　なお、本発明の分離剤の非特異吸着性は、具体的には、後述の実施例の項に記載される方法で測定される。

〔第二態様の分離剤〕
　本発明の第二態様の分離剤を構成する多孔性樹脂粒子としては、第一態様の分離剤の多孔性エポキシ樹脂粒子以外であって、スチレン、エチルスチレン、メチルスチレン、ヒドロキシスチレン、クロロスチレン等のスチレン系単量体などの芳香族モノビニル化合物；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２－エチルヘキシル、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類；（メタ）アクリロニトリルのようなニトリル類；グリシジル（メタ）アクリレート、４，５－エポキシブチル（メタ）アクリレート、９，１０－エポキシステアリル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有化合物；その他のビニルエステル類、ビニルエーテル類等のモノビニル単量体の１種又は２種以上を（共）重合した後、得られた（共）重合物に対してエピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入することにより多孔質架橋粒子としたものや、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリル酸エステル、グリセロールジ（メタ）アクリル酸エステル等のポリ（メタ）アクリル酸エステル類、ポリカルボン酸ポリビニルエステル類、ポリカルボン酸ポリアリルエステル類、ポリオールポリビニルエーテル類、ポリオールポリアリルエーテル類、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物の１種又は２種以上を（共）重合させたもの、もしくはこのようなポリビニル化合物の１種又は２種以上と、上述のモノビニル単量体の１種又は２種以上とを共重合して得られる多孔質架橋粒子などが挙げられる。

　工業的な生産性を考慮すると、ポリビニル化合物の１種又は２種以上とモノビニル単量体の１種又は２種以上を共重合させたものが好ましい。

　第二態様の分離剤における「処理」としては、前述の第一態様の分離剤における処理と同様のものが挙げられる。
　第二態様の分離剤の平均粒径や平均細孔径の好適範囲についても、第一態様の分離剤と同様である。
　第一態様の分離剤と同様の理由から、第二態様の分離剤１０％圧縮変形強度は２．０ＭＰａ以上で、好ましくは４．０ＭＰａ以上であり、通常２０ＭＰａ以下である。
　また、非特異吸着性についても、第一態様の分離剤と同様の理由から、５％以下、好ましくは３％以下であり、通常０．１％以上である。

〔用途〕
　クロマトグラフィー分離剤には、その分離モードから、大分子量不純物を排除し、目的物を細孔内に拡散して分離するサイズ排除分離剤、核酸などの小分子量不純物のみを吸着除去するフロースルー型分離剤、リガンドにより目的物を吸着分離するリガンド型分離剤とに分類されるが、本発明の分離剤は、これらのいずれの分離剤にも適用することができる。

　本発明の分離剤は、生体分子精製用分離として好ましく、特にタンパク質、とりわけ抗体、例えば全長抗体、低分子抗体、プロテインＡ及び改変体を標的分子とし、これらを分離するためのタンパク質精製用分離剤として好適に使用される。
　特に好ましい標的分子としては、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質もしくはその化学変性物が挙げられ、中でも免疫グロブリンがモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が好ましい。
　標的分子の分離処理は、以下の工程を含むように行うのが好ましい。

　（ａ）標的分子を含む溶液を上記の分離剤に接触させて、標的分子を分離剤に吸着させる工程。
　（ｂ）前記標的分子を吸着した分離剤から該標的分子を溶離する工程。
　このような方法により、上記のような各種タンパク質を選択性良く分離することが可能である。

　本発明の分離剤はまた、ワクチン精製用分離剤としても好適に用いられる。この場合、ワクチンは抗体などのタンパク質と比べて大きいことが多いため、細孔内にワクチンを拡散させない方法や、大きな細孔を利用して細孔内にワクチンを拡散させる方法などが挙げられる。また、フロースルー型やリガンド型などがｐＨなどを調整することにより好適に条件を設定できる。精製の純度を高めることができる点において、細孔内にワクチンを拡散させる方法がより好ましい。

　更に本発明の分離剤は、アミノ酸や単糖、オリゴ糖、有機酸、アミン類、生体液等の分離剤として用いることもできる。

　本発明の分離剤による分離処理に際しては、本発明の分離剤を含み、この分離剤が充填された少なくとも１つの容器を備えた液体クロマトグラフィー用カラムが好ましく用いられる。

　以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。

［評価方法］
　以下の製造例、実施例及び比較例で得られた多孔性樹脂粒子を処理してなる分離剤の評価方法は以下の通りである。

＜平均粒径＞
　堀場製作所社製レーザー回析／散乱式粒度分布測定装置ＬＡ－９２０を用いて、粒度分布を測定した。具体的には、水に分散した少量の試料樹脂粒子をフローセル水に分散させ、これにレーザー光を照射し、回析、散乱光の強度パターンから作成した粒度分布のメディアン径（５０％径）値を平均粒径とした。

＜平均細孔径＞
　平均細孔径は、水銀圧入法により測定した。水銀圧入法は、圧力をかけて水銀を開孔部に侵入させ、圧力値と対応する侵入水銀体積とを用いて、円柱状と仮定した細孔の径をＷａｓｈｂｕｒｎの式から算出する方法であり、セラミックス成形体について規定されたＪＩＳ　Ｒ１６５５を準用することができる。
　乾燥処理した試料樹脂粒子を秤量し、専用セルに入れ、真空下（５０μｍＨｇ×１０分）で脱気による前処理を行った後、マイクロメリテックス社製オートポアＩＶ９５２０型を用いて、水銀圧入退出曲線を測定した。細孔容積、細孔径をそれぞれ縦軸、横軸とした細孔の分布を示すヒストグラムにより、細孔容積の合計が最も多い部分の細孔径を平均細孔径とした。

＜非特異吸着試験＞
　水に分散した試料樹脂粒子をそれぞれ２．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）水溶液に浸漬し、２５℃で３時間吸着させた。吸着前後の上清の２８０ｎｍの吸光度より、ＩｇＧの回収率を評価した。さらにＩｇＧ吸着後遠心分離で分別した樹脂粒子を０．１Ｎ　ＮａＯＨ水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のＢＣＡ測定により、ＮａＯＨ処理によるＩｇＧの回収率を評価した。ＩｇＧ水溶液中のＩｇＧに対する上清のＩｇＧ回収率（％）とＮａＯＨ処理によるＩｇＧ回収率（％）の合計を１００％から差し引いた値を非特異吸着性（％）の評価値とした。この値は小さい程好ましい。

＜水分保持量＞
　水に分散した試料樹脂粒子をメンブレンフィルター（メルクミリポア社製親水性デュラポアＳＶＬＰ０４７００（５μｍ））を用いて吸引濾過により水分が落ちなくなるまで５分以上濾過し、得られた樹脂粒子のウエット重量（Ｗｇ）を測定した。このウエット樹脂粒子をヤマト科学社製角型真空定温乾燥器ＤＰ２００を用い、５０℃で９時間真空乾燥し、真空乾燥後のドライ重量（Ｄｇ）を測定した。（Ｗ－Ｄ）で水分量を求め、水分量／樹脂粒子のウエット重量×１００＝（Ｗ－Ｄ）／Ｗ×１００を水分保持量とした。

＜１０％圧縮変形強度＞
　島津製作所社製　微小圧縮試験器「ＭＣＴ－Ｗ５００」を用いて、減圧下で加熱（５０℃、８時間）することにより乾燥させた試料樹脂粒子から任意に選んだ１０個以上の粒子の１０％変位強度を測定し、その平均値を１０％圧縮変形強度とした。

＜圧力損失＞
　試料樹脂粒子を内容積４ｍＬ（内径０．５ｍｍ、層高２０ｃｍ）のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＬＣ　ＥＬＩＴＥ　ＬａＣｈｒｏｍ、カラムオーブンＬ－２３５０、ＲＩ検出器Ｌ－２４９０、オートサンプラーＬ－２２００）に接続し、純水を流速１．３ｍｌ／ｍｉｎ（線速度４００ｃｍ／ｈ）で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。

＜分離挙動評価（ｉＳＥＣ）＞
　分離剤１～３をそれぞれ内容積４ｍＬ（内径０．５ｍｍ、層高２０ｃｍ）のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＬＣ　ＥＬＩＴＥ　ＬａＣｈｒｏｍ、カラムオーブンＬ－２３５０、ＲＩ検出器Ｌ－２４９０、オートサンプラーＬ－２２００）に接続した。ここへエチレングリコール（ＥＧ、分子量６２）と分子量の異なるデキストランを含む水溶液をオートサンプラーで注入し、流出液の分析結果より、分子量と保持体積の関係を評価した。流速は、０．１２５ｍＬ／ｍｉｎ、サンプル量は１０μＬ、カラム温度は３０℃で実施した。測定に使用したデキストランの分子量は、４×１０^４、６×１０^４、１．５×１０^４、１．５×１０^５（１００～２００×１０^３）、２．５×１０^５（２００～３００×１０^３）、５×１０^５、２．２×１０^６（１．５～２．８×１０^６）、５×１０^６（３～７×１０^６）、２．３×１０^７（５～４０×１０^６）である。

［製造例１］
（原料混合液の調製）
　エポキシ当量が９９である下記式（ａ）で表される多官能エポキシ基含有化合物「トリグリシジルイソシアヌレート」（商品名「ＴＥＰＩＣ－Ｓ」、日産化学工業社製）１．６重量部と、硬化剤として、アミン価が５２０～５５０である下記式（ｂ）で表される多官能アミノ基含有化合物「ビス（４－アミノシクロヘキシル）メタン」（東京化成工業社製）０．３７重量部と、ポロゲンとして、平均分子量が２００である「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）」（商品名「ポリエチレングリコール２００」、和光純薬工業社製）７重量部を用い、あらかじめＴＥＰＩＣ－ＳとＰＥＧ２００を１１０℃に加熱溶融し、別途８５℃で加熱溶融したビス（４－アミノシクロヘキシル）メタンを合わせてボルテックスミキサー３０００ｒｐｍで数分間混合して原料混合液を得た。

（分散液の調製）
　円筒状のガラス製サンプル瓶（内径１９ｍｍ、高さ６０ｍｍ）に分散媒としてドデカン１０ｇにブロックコポリマー（分散剤）Ｋ－１を０．６ｇ溶解したものを準備し、上記で得られた原料混合液８．９７ｇを加え、ボルテックスミキサーで外見上の乳化状態が安定するまで撹拌（６～１０分）して分散液を調製した。なお、分散媒は、分散液調製に先立ち、予め５０℃以上に加温した。また、前記ブロックコポリマーＫ－１は、ラウリルメタクリレート（以下、ＬＭＡと略記）５重量部とポリエチレングリコールメタクリレート（以下、ＰＥＧＭＡと略記）９．３４重量部とのリビングラジカル重合により合成された数平均分子量１８，７００、ＰＤＩ１．２７のブロックコポリマーである。

（重合工程および後処理）
　前記分散液を、撹拌翼で毎分回転数を５０回転として高温浴槽中温度９０℃で１８０分間重合した。重合して得られたものをテトラヒドロフランに入れ十分撹拌した後、遠心分離機を用いて生成した多孔性エポキシ樹脂粒子を分離した。このテトラヒドロフランによる洗浄工程を１０回繰り返してポロゲンや残存する原料化合物等を十分に除去した後、減圧乾燥してエポキシ樹脂からなる球形の多孔性粒子を１．７５ｇ得た。これを多孔性エポキシ樹脂粒子１という。得られた多孔性エポキシ樹脂粒子１は、柱状骨格の三次元網状骨格構造であり、平均粒径は２９μｍの球状粒子であった。

［製造例２］
　製造例１の（重合工程および後処理）において、重合温度を８０℃とした以外は製造例１と同じ条件で多孔性粒子を製造し、球形の多孔性粒子を１．８３ｇ得た。これを多孔性エポキシ樹脂粒子２という。得られた多孔性エポキシ樹脂粒子２は、柱状骨格の三次元網状骨格構造であり、平均粒径は２６μｍの球状粒子であった。

［製造例３］
　製造例１の（原料混合液の調製）において、ＰＥＧ２００を８．４重量部、分散剤を０．６７重量部、分散媒を９重量部として重合した以外は製造例１と同じ条件で多孔性粒子を製造し、球形の多孔性粒子を１．８５ｇ得た。これを多孔性エポキシ樹脂粒子３という。得られた多孔性エポキシ樹脂粒子３は、柱状骨格の三次元網状骨格構造であり、平均粒径は３８μｍの球状粒子であった。

［実施例１］
　撹拌翼付フラスコにて、製造例１で得られた多孔性エポキシ樹脂粒子１に５重量％硫酸水溶液を加え、５０℃で５時間加熱撹拌することで親水化処理した。処理後の多孔性エポキシ樹脂粒子をフィルターにより濾別し、硫酸を水洗除去し、分離剤１を得た。

［実施例２］
　実施例１と同様にして、製造例２で得られた多孔性エポキシ樹脂粒子２を硫酸で親水化処理し、分離剤２を得た。

［実施例３］
　実施例１と同様にして、製造例３で得られた多孔性エポキシ樹脂粒子３を硫酸で親水化処理し、分離剤２を得た。

［比較例１］
　水１００重量部にポリビニルアルコール０．５重量部を溶解した水中に、グリシジルメタクリレート８０重量部、エチレングリコールジメタクリレート２０重量部，２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）１重量部、及びジクロルプロパン１００重量部の混合物を加え、撹拌して懸濁状態とした。このとき、撹拌速度を調整して液滴の平均直径が約４５μｍになるようにした。この懸濁液を７０℃に昇温し、６時間反応させた。冷却後、濾別、水洗して多孔性メタクリル樹脂粒子を得た。得られた多孔性メタクリル樹脂粒子は、微小な樹脂粒子からなる凝集体であった。

［比較例２］
　市販のビスフェノールＡジクリシジルエーテルタイプのエポキシ樹脂ｊＥＲ　８２８（三菱化学社製）１０ｇとトリアセチン（東京化成工業社製）２ｇを１００ｍＬのポリカップに取り、混合して均一な液体とした。これにテフロン（登録商標）製半月羽根（３６ｍｍ）を先端に着けた撹拌棒を挿入し１００ｒｐｍで撹拌した。別にポリビニルアルコールＧＬ－０５（日本合成化学社製）１．５ｇを含む水溶液１０ｇを用意しておき、ｊＥＲ８２８とトリアセチンの混合物に２．５ｇずつ３分おきに添加した。
　その結果、ｊＥＲ８２８とトリアセチン混合物はポリカップ内で乳化されて、白色のエマルションが得られた。
　次いでこのエマルションに硬化剤としてピペラジン（東京化成工業社製）１．９ｇを含む８ｇの水を加えた後、室温の静置条件で５日間硬化させたところ、平均粒径約１４μｍの微細な球状粒子が得られた。この粒子を濾過、洗浄後、１００ｍＬの水に再分散させて、４Ｎ　Ｈ_２ＳＯ_４を５ｇ加え、９０℃で２時間処理した。再び濾過、洗浄後、粒子を風乾した。
　ソックスレー脂肪抽出器にこの粒子を入れ、エタノールの沸点で５時間抽出し、エポキシ樹脂粒子を得た。抽出後のエポキシ樹脂粒子は約１６重量％の水分保持量を示した。また、平均細孔径の測定において１０ｎｍ以上の細孔は検出されなかった。

　製造例１～３、実施例１～３及び比較例１，２で得られた多孔性樹脂粒子又は樹脂粒子の平均粒径等の評価結果を表１に示す。
　また、実施例１～３で得られた分離剤１～３と、比較例２で得られた樹脂粒子の分離挙動評価（ｉＳＥＣ）結果を表２に示す。

　表１より次のことが分かる。
　多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる本発明の分離剤１～３は、処理前の多孔性エポキシ樹脂粒子に比べていずれも非特異吸着性が低減され、硫酸による親水化処理でタンパク質の多孔性エポキシ樹脂粒子表面への吸着が抑制され、回収率が向上している。また、本発明の分離剤１～３は、比較例１の多孔性メタクリル樹脂粒子に比べて、１０％圧縮変形強度が十分に高く、圧力損失は非常に小さい。加えて本発明の分離剤１～３は、ＳＥＭ観察により粒子表面にまで貫通する細孔を有していることが確認でき、水銀圧入法で測定した平均細孔径は所望の範囲で調整可能であり、水分保持量は比較例２に比べて十分に高い。
　比較例２の樹脂粒子は１０ｎｍ以上の細孔は検出されず、水分保持量は２０重量％以下と極めて少量であること、さらにＳＥＭ観察によれば表面には有効な孔は開いておらず、また内部に細孔を形成していたとしても少量であることが分かる。
　これらは、重合の過程で本発明の分離剤１～３に用いたエポキシ樹脂粒子が相分離して細孔を形成するのに対し、比較例２の樹脂粒子は合成方法の違いから、相分離することなく重合していることによるものと推察される。
　また、表２より、本発明の分離剤１～３は、分子量と保持体積とに相関があり、サイズ排除分離剤として用いることができることが分かる。ここで、分離剤１、分離剤２、分離剤３の順に保持体積が大きくなっており、平均細孔径の大きい分離剤ほど保持体積が大きくなることが分かる。比較例２の樹脂粒子は、デキストランの分子量範囲においてほとんど保持体積が同じであり分離性を有していない。

　本発明を詳細にまた特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。本出願は、２０１５年８月１０日出願の日本特許出願（特願２０１５－１５８４２０）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。

Claims

　多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、該分離剤の平均細孔径が１０ｎｍ～２０００ｎｍであることを特徴とする分離剤。
　多孔性エポキシ樹脂粒子を処理してなる分離剤であって、水分含有量が５０重量％以上であることを特徴とする分離剤。
　前記分離剤の平均細孔径が１０ｎｍ～２０００ｎｍである、請求項２に記載の分離剤。
　前記多孔性エポキシ樹脂粒子が、多官能エポキシ基含有化合物と多官能アミノ基含有化合物とを含む化合物の付加重合体に相当するエポキシ樹脂の粒子であって、平均粒径が１μｍ～１０００μｍである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の分離剤。
　前記多官能エポキシ基含有化合物が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラグリシジル－ｍ－キシリレンジアミン及びトリグリシジルイソシアヌレートのうちの少なくとも１つである、請求項４に記載の分離剤。
　前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基に、水酸基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを有する化合物を付加させることによりエポキシ基を開環する、親水化処理である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の分離剤。
　前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを介して、イオン性官能基を有する水溶性ポリマーを付加する、グラフト処理である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の分離剤。
　前記処理が、前記多孔性エポキシ樹脂粒子の表面に残存するエポキシ基及びアミノ基のうちの少なくとも１つを介して、タンパク質及びタンパク質誘導体のうちの少なくとも１つを付加する、カップリング処理である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の分離剤。
　下記（１）及び（２）の特性を満たす、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の分離剤。
（１）　乾燥させた分離剤を微小圧縮試験機により１０％圧縮変形させた時の強度が２．０ＭＰａ以上
（２）　下記圧力損失測定方法により測定して求めた圧力損失が７．０ＭＰａ以下
＜圧力損失測定方法＞
　前記分離剤を内容積４ｍＬ（内径０．５ｍｍ、層高２０ｃｍ）のカラムに充填し、このカラムを日立製作所社製ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＬＣ　ＥＬＩＴＥ　ＬａＣｈｒｏｍ、カラムオーブンＬ－２３５０、ＲＩ検出器Ｌ－２４９０、オートサンプラーＬ－２２００）に接続し、純水を流速１．３ｍｌ／ｍｉｎ（線速度４００ｃｍ／ｈ）で通液したときの表示圧力を圧力損失とした。
　下記非特異吸着試験により求められる非特異吸着性が５％以下である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の分離剤。
＜非特異吸着試験＞
　水に分散した前記分離剤を２．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）水溶液に浸漬し、２５℃で３時間吸着させる。吸着前後の上清の２８０ｎｍの吸光度より、ＩｇＧの回収率を評価する。さらにＩｇＧ吸着後遠心分離で分別した分離剤を０．１Ｎ　ＮａＯＨ水溶液で洗浄した後濾過し、濾液のＢＣＡ測定（ビシンコニン酸タンパク質定量法）により、ＮａＯＨ処理によるＩｇＧの回収率を求める。ＩｇＧ水溶液中のＩｇＧに対する上清のＩｇＧ回収率（％）とＮａＯＨ処理によるＩｇＧ回収率（％）の合計を１００％から差し引いた値を非特異吸着性（％）の評価値とする。
　請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の分離剤からなる、ワクチン精製用分離剤。
　請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の分離剤からなる、タンパク質精製用分離剤。
　請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の分離剤と、該分離剤が充填された容器とを備える、液体クロマトグラフィー用カラム。