JP4523408B2 - マクロ多孔性架橋ポリマー粒子 - Google Patents

Description

本発明はクロマトグラフ法における充填材又はリガンド用担体として有用なマクロ多孔性架橋ポリマー粒子の製造、並びにマクロ多孔性架橋ポリマー粒子自体に関する。

現在利用可能なクロマトグラフィー法としては、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過など、数多くの方法がある。他の大半の理化学的分離法と区別されるクロマトグラフィーの特徴は、混和性の２つの相を接触させ、一方の相を固定相とし、他方を移動相とすることである。移動相に導入された試料混合物は一連の相互作用を受ける。つまり、試料混合物が移動相によって系内を運搬される際に固定相と移動相の間で何度も分配される。相互作用は試料中の化合物の理化学的性質の差異を利用する。こうした差異が、固定相中を移動する移動相の影響下での各成分の移動速度を支配する。分離された成分は、固定相との相互作用に応じて一定の順序で流出する。最も保持されにくい成分が最初に溶出し、最も強く保持された物質が最後に溶出する。分離は、試料成分がカラムから溶出する際に、隣接する溶質のゾーンとの重なりが防がれるようにある成分の流出速度が十分に遅くなった場合に達成される。

クロマトグラフィー分離法は、例えば、核酸やタンパク質などの生体分子、及び液体からの小さな有機分子の回収に有用である。さらに、クロマトグラフィー分離法は液体の回収にも有用であり、その場合有機又は無機分子などの不純物が除かれて高純度の液体が得られる。

クロマトグラフィーに用いられるマトリックスは担体材料からなり、通常は粒子、モノリシックマトリックスなどの形態である。ＲＰＣなど、用途によっては、担体自体の表面が目標分子との相互作用を与える。イオン交換又はアフィニティクロマトグラフィーなどの他の用途では、担体は、目標分子との相互作用のための荷電基又は親和性基を含むリガンドを備える。いずれの場合も、使用される担体材料は、シリカなどの無機材料、又はポリ（ジビニルベンゼン）（ＤＶＢ）及びポリ（ジビニルベンゼン／スチレン）などの合成ポリマー及びアガロースなどの天然高分子を始めとする有機材料として分類できる。

シリカはクロマトグラフィービーズとして長年使用されている。しかし、シリカの一般的問題は、塩基性条件下で加水分解を受けやすく、そのため水酸化ナトリウムを用いる従来の現場洗浄（ｃｉｐ）法には適さない。同じ理由で、シリカマトリックスは高ｐＨ条件下でのクロマトグラフィーが行えず、広範な用途での使用が大幅に制限される。最近、逆相液体クロマトグラフィー用にアルキル結合シリカ粒子が示唆されている。しかし、アルキル結合シリカは残留シラノール基又は不純物を含んでおり、そのためピークテーリングを起こすことがあるため、全般的なクロマトグラフィー性能に劣る。

多糖類、特にアガロースのような天然有機高分子に基づくマトリックスは、多くのクロマトグラフィーに用いられており、その表面で利用可能な水酸基によって誘導体化が容易なことから、特に誘導体化された形態で用いられている。アガロース粒子は化学架橋剤の添加によって架橋させることができ、ゲル化処理の結果、多孔質となる。かかる粒子の性状は一般にゲル多孔性といわれるものであり、かかるゲル多孔性粒子は、高圧が用いられる方法には概して向いていない。

ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）及びスチレンなどの合成有機ポリマーに基づくマトリックスは現場洗浄に耐えるものの、その芳香族基はクロマトグラフィーに望ましくない影響を与える原因となりかねない。具体的には、かかるマトリックスを同じく芳香族基を有する分子の吸着に使用すると、各々のπ電子間で相互作用が起こり、ピークテーリングを起こし、保持時間が長くなる。ＤＶＢ系マトリックスの短所は、不都合なミクロポア（微小孔）の比率を高めることが多々あり、そのためクロマトグラフィーでの物質移動を損なう結果となることである。こうしたミクロポアは、ＲＰＣにおいて特に問題となるが、懸濁重合でＤＶＢモノマーが急速に重合するためであると考えられている。スチレン系マトリックスの別の短所は、その性質を変えるために粒子の表面を誘導体化することが望まれる場合にみられる。この種のマトリックスは化学的に不活性であり、所望の改質をなすには数段階の表面修飾工程を必要とするからである。スチレン及びＤＶＢなどの有機ポリマー系のポリマーのさらなる短所は、高速分離法に用いられる高圧条件下で若干の圧縮性を示すことである。

上述の一群のマトリックス材料を改良すべく、新たな代替法が提案されている。例えば、機械的及び化学的安定性の向上した調製用イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを製造するために、Ｂｒｉｔｓｃｈ他（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、親水性ビニルエーテルと二官能性アクリルアミドモノマーとの混合物から合成されるコポリマーについて示唆している。得られる製品はアミド型架橋に基づくものである。しかし、周知の通り、アクリルアミドの取扱いには、健康への悪影響を避けるため、慎重さが必要とされ、そのため面倒で不便な方法となる。さらに、アミド全般が加水分解に感受性であることから、用途によってはこの種のマトリックスは不向きとなる。

Ｅｒｉｃｓｓｏｎ他（国際公開９５／１３８６１号パンフレット）は、支持体に付着させた親水性ビニルエーテルポリマーをマトリックスとして使用する分離法を開示している。具体的には、開示されたポリマーは同一又は異なるビニルサブユニットを含むポリ（ビニルエーテル）鎖を含むもので、支持体としてアガロース粒子が例示されている。ポリマーはカチオン重合法を用いて合成される。

さらに、逆相液体クロマトグラフィーでのアルキル結合シリカマトリックス及びポリマーマトリックスの問題を避けるため、Ｈｉｒａｙａｍａ他（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１／２，Ｊａｎｕａｒｙ，１９９２，１９−２４）はアルキルビニルエーテルとトリエチレングリコールジビニルエーテルの懸濁共重合を示唆している。従って、この方法では、有機相は２種類の異なる反応性ビニルエーテルモノマーからなり、それらの比を利用して、得られる製品の疎水性を特定の値に設定する。

米国特許第５３３４３１０号には、マクロ多孔性ポリマープラグ（モノリスとしても知られる）の形態の分離媒体を含む液体クロマトグラフィーカラムが開示されている。プラグの製造原料となる重合混合物は、１種以上のポリビニルポリマーとラジカル発生型開始剤とポロゲンを含む。こうして製造されたプラグは直径２００ｎｍ未満の小さな細孔と直径約６００ｎｍを超える大きな細孔を含む。かかる幅広い細孔径範囲はモノリスで高流速を可能するには有利であるが、クロマトグラフィー用のポリマー粒子の有用な細孔径範囲を明らかに超える。

欧州特許出願公開第１１７９７３２号には、所定の多孔度と浸透特性を有するポリマー吸着剤をどのように製造するかについての解決策が示されている。これは、モノマーに関して所定の比率の所定の混合ポロゲンを使用するという方法、好ましくは懸濁重合法によって達成される。こうして製造した吸着剤は、その剛性ゆえに高圧条件下でのＲＰＣ固定相としての使用に特に適している。
国際公開９５／１３８６１号パンフレット 米国特許第５３３４３１０号明細書 欧州特許出願公開第１１７９７３２号 Ｈｉｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１／２，Ｊａｎｕａｒｙ，１９９２，１９−２４

このように、各種クロマトグラフィーマトリックスには一長一短があり、使用するマトリックスを目標分子の種類、分離の目的などによって選択することが多々ある。或いは、場合により、２種以上の異なるクロマトグラフィー原理及び／又は異なるマトリックス材料を組み合わせて一連のクロマトグラフィー段階（ポリッシング、キャプチャーとも呼ばれる。）とすることがある。そこで、各々の分離原理は道具箱の中の有用な一つの道具とみなすことでき、新たな道具に対する必要性は常に存在する。従って、上述のような公知のマトリックス材料が存在するものの、補助手段として、つまり道具箱の中の追加の道具として用いるための新規方法が依然として必要とされている。

従って、本発明の一つの目的は、クロマトグラフ分離法におけるマトリックスとして有用な、公知の材料とは異なる性質を有する新規材料を提供することである。この目的は、エーテル及び／又はポリエーテル類を含む不活性溶媒中でジビニルエーテルモノマーから重合したマクロ多孔性架橋ポリマー粒子を提供することによって達成される。

本発明の別の目的は、かかるポリマー粒子であって、タンパク質分離用ＰＲＣなどのクロマトグラフィーマトリックスとして使用したときに新たな選択性パターンを示す粒子を提供することである。

本発明の別の目的は、上記のポリマー粒子であって、その表面が、例えばイオン交換又はアフィニティクロマトグラフィー用の官能基、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用の疎水性基、その他所望の方法で粒子表面の性質を改質する基によって、容易に誘導体化される粒子を提供することである。この目的は、反応に利用可能な十分な数のビニル基を表面に有するマクロ多孔性架橋ポリマー粒子を提供することによって達成される。

本発明の別の目的は、ミクロポアが実質的に存在せず、細孔径分布の狭いポリマー粒子を提供することである。

本発明の別の目的は、平均細孔径が慎重に制御されたポリマー粒子を提供することである。この目的は、本発明の方法において不活性溶媒として分子量の異なる各種ポリエーテルを使用することによって達成される。

本発明のさらに別の目的は、上述のポリマー粒子であって、上述の基準の１以上を満足するとともに有益な機械的安定性を示し、クロマトグラフィー用カラムに充填したときに高圧に耐えるポリマー粒子を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、上記の新規材料の製造方法であって、最終製品の平均細孔径を注意深く制御する方法を提供することである。この目的は、適当な分子量のエーテル及び／又はポリエーテル類を含む不活性溶媒中でジビニルエーテルモノマーのラジカル重合を実施することにより達成され、ここでは、溶媒はポロゲンとしても作用する。

本発明のもう一つの目的は、マクロ多孔性架橋ポリマー粒子の製造方法であって、ジビニルベンゼンとスチレンの重合速度が従来技術におけるよりも遅い方法を提供することである。これは様々な理由で望まれているが、その理由の一つはミクロポアの少ないマクロ多孔性構造が得られるからである。

上述の１以上の目的は、各請求項に規定した事項によって達成できる。本発明のその他の目的及び利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。

定義
「クロマトグラフィー」という用語は、本明細書では、動的手法のみならず、回分法も含めた意味で用いられる。

「マトリックス」という用語は、本明細書では、クロマトグラフィーの固定相として有用な材料をいうのに用いる。従って、例えばＲＰＣマトリックスは普通各ビーズ全体が１つの材料からなるが、イオン交換マトリックスは目標分子を結合させるための官能基を有するリガンドを備える担体をいう。

用語「マクロ多孔性」粒子は、湿潤状態においてのみ多孔性となるゲル多孔性粒子と対比して、乾燥状態でも湿潤状態でも多孔性である粒子を意味する。

「粒子」という用語は、本明細書では、実質的に球状のクロマトグラフィー担体をいう。

「ジビニルエーテル」という用語は、本明細書では、二官能性ビニルエーテルを意味し、その２つの官能基は２つのビニル基である。従って、ビニルエーテルに関して、二官能性という用語は不飽和炭素−炭素結合の官能性をいう。

「ポロゲン」という用語は、重合反応時に存在する不活性溶媒（低分子量又は高分子）であって、重合反応のある段階でマクロ多孔性ポリマーの形成を生起させるものをいう。

「不活性」という用語は、非反応性であること、すなわち、重合などの化学反応に関与し得ないことをいう。

ポリエーテルという用語は、次の一般式（Ｉ）の１以上のエーテル基を有するポリマーをいう。

Ｘ−（Ｏ−Ｒ−Ｏ）_n−Ｙ （Ｉ）
式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なる末端基であり、例えばアルキル、アリール又は水素基、例えば、水素、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル又はフェニル基である。Ｒは線状又は枝分れアルキル又はアリール基であり、他の官能基（例えばカルボン酸基、水酸基又はアミンなど）を含んでいてもよい。ｎは２〜１００００の整数、例えば３〜５０００、好ましくは５〜１００である。

発明の詳細な説明
本発明の第一の態様は、１種以上のマクロ多孔性架橋ポリマー粒子の製造方法であって、エーテル類を含む不活性溶媒中でのジビニルエーテルモノマーの重合及び架橋反応を含み、当該方法における重合がラジカル開始剤によるものである方法である。溶媒はエーテル類だけでなく、ポリエーテル類を含んでいてもよく、例えば混合物でもよい。そこで、一実施形態では、溶媒はポリエーテル類を含む。別の実施形態では、溶媒はエーテル及び／又はポリエーテル類とアルコール系溶媒との混合物であり、好ましくはエーテル及び／又はポリエーテル類が実質的な割合をなす。

本発明のマクロ多孔性架橋ポリマー粒子では、ポリマーは例えば従来の懸濁重合の基本原理に従って調製できる（例えば、Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｗｏｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉ．，１９８４、２２、３８６参照）。簡単に説明すると、所望のジビニルエーテルモノマーを含む有機溶液をエーテル溶媒（本明細書ではポロゲンともいう。）及び熱開始剤と混合し、次いで水と乳化剤と適宜他の添加物を含む水性相と接触させる。有機相と水相は懸濁液を形成し、液滴が所望の大きさとなるまで攪拌（好ましくは機械的に）する。次いで、懸濁液を昇温（通例６５℃）して開始剤の熱分解を起こし、重合を開始させる。懸濁液は重合が完結したと考えられるまで昇温に保つが、重合の完結は典型的には約２４時間後に起こり得る。得られるマクロ多孔性粒子は水相から例えばガラス濾過器で容易に分離でき、次いで水及び／又は有機溶媒で洗浄して、それぞれ乳化剤及びポロゲンを除去すればよい。

従って、ジビニルエーテルモノマーは重合時だけでなく、架橋の際のモノマーとしても作用する。以下の実験の部でさらに具体的に述べる通り、低分子量又は高分子量の溶媒を注意深く選択すれば、それに応じて平均細孔径の小さい又は大きいものが得られる。そこで、特定の実施形態では、例えば、上述の欧州特許出願公開第１１７９７３２号で解決しようとした課題の別の解決手段も提供する。

本方法の最も好適な実施形態では、重合はラジカル開始剤による。ラジカル開始剤は、ジアセチルペルオキシド、ジベンゾイルペルオキシド、ジラウロイルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオクトエート、ｔ−アミルペルオキピバレート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルへキサノエート、ジ−（４−ｔ−ブチルシクロヘキシル）ペルオキシジカーボネート、２，２′−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２′−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１′−アゾ−ビス（シアノシクロヘキサン）、これらの混合物のような市販品として入手可能な開始剤であれば、どんなものでもよい。具体例として、Ｖ６５（すなわち、２，２′−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル、和光純薬工業）やＡＩＢＮ（すなわち、２，２′−アゾビス（イソブチロニトリル）、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）の製品がある。ラジカル開始剤の選択は、残りの他の条件と用いる試薬を考慮して当業者が容易に決定でき、これについては以下さらに詳しく述べる。その量は、余りに過剰で重合に悪影響をもたらすと考えられない限り、さほど重要でないが、少なすぎると望ましい結果が得られないことがある。従って、ラジカル開始剤の例示的な量は１〜１０モル％（モノマー当たり）の範囲であり、例えば１〜２モル％である。

１種以上のエーテルを含む不活性溶媒中でのジビニルエーテルの重合による架橋マクロ多孔性ポリマーの製造法について記載したのは本発明が最初である。ジビニルエーテルは表面塗装用など他の目的のため重合されてはいるが、マクロ多孔性ポリマー粒子を得るための方法において架橋剤として適性をもつことは、これまではよく認識されていなかった。ビニルエーテルはカチオン重合機構ではうまく重合して、高分子量ポリマーを得ることができる。これに対して、ビニルエーテルは、伝統的な低分子量溶媒中でのラジカル重合機構ではうまく重合しない。こうした理由から、懸濁重合によるマクロ多孔性ポリマー粒子の合成にビニルエーテルを用いることはこれまで考慮されていなかった。さらに、懸濁重合はカチオン重合に適した重合法であるとは思われていなかった。懸濁重合は水の存在下で実施されるが、カチオン重合は水分に極めて鋭敏であることが知られていたからである。

これに対して、本発明者は、今回、ポリエーテル溶媒を使用し、ラジカル開始剤で開始される方法においてジビニルエーテルを架橋剤として使用すると、上述のような粒子を成功裏に製造できることを開示する。さらに、本発明で製造した粒子は、以下の実験の部で例示する通り、クロマトグラフ分離法のマトリックスとして用いると、新たな種類の選択性パターンを呈することが判明した。

このように、ジビニルエーテルの懸濁重合に不活性エーテル溶媒を使用することは、本発明以前には示唆されていなかった。これに関して、溶媒は、反応性モノマーを溶解すること以外は、重合プロセスに積極的に関与できないものであると理解される。従って、本方法で用いる不活性溶媒はビニル基を一切含んでいない。つまり、重合性の炭素−炭素二重結合を全く含んでいない。従って、本発明は、上述のＨｉｒａｙａｍａ他に記載された２種の反応性モノマーを使用するが、溶媒は使用しない方法とは明らかに異なる。さらに、クロマトグラフィーのマトリックスとして使用されるＤＶＢやスチレンのようなポリマー粒子の従来の重合法では、トルエン、ヘプタン、ヘキサノールその他の低分子量化合物を始めとする溶媒が使用されている。細孔径を大きくするため、かかる従来の溶媒に少量のポリマーを添加することが示唆されているが、そうして得られる混合物はかなりの割合の低分子量成分を含むように構成される。こうした低分子量化合物又は混合物は所望の細孔径を得るための便利な手段であった。エーテル類を含む比較的高分子量の溶媒が、ジビニルエーテルを原料とするマクロ多孔性架橋ポリマー粒子の製造に好適に使用できることを示したのは、本発明が始めてである。従って、一実施形態では、本発明の方法ではポリマー溶媒を使用するが、そのポリマーの平均分子量は６０ｇ／モル以上（例えば、約１００ｇ／モル超）、又は約１０００ｇ／モル以上である。

別の実施形態では、ポリエーテル溶媒はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）及びポリ（テトラヒドロフラン）からなる群から選択される。これらの溶媒はすべて、Ａｌｄｒｉｃｈ社のような供給元から市販されている。好適な実施形態では、本発明の方法では溶媒としてポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を使用する。これに関して、上述の２種類以上の溶媒の混合物も本発明に属する。

本発明の重合に用いるジビニルエーテルモノマーに関して、一実施形態では、１種以上の線状、枝分れ又は環状アルキル、アリール又は高分子ジビニルエーテルモノマーである。従って、本発明で使用するジビニルエーテルは次の化学式（ＩＩ）で特徴付けられる。

Ｃ＝Ｃ−Ｏ−Ｒ−Ｏ−Ｃ＝Ｃ （ＩＩ）
式中、Ｒは、重合を化学的又は立体的に阻害しない基であればよい。適当なＲ基の幾つかの具体例として、線状、枝分れ又は環状アルキル又はアリール鎖又はポリマーがあり、例えばエチル、ブチル、ヘキシル又はポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリテトラヒドロフランである。

特定の実施形態では、ジビニルエーテルモノマーは、シクロヘキサンジメタノールジビニルエーテル、ブタンジオールジビニルエーテル又はジエチレングリコールジビニルエーテルからなる群から選択される。ジビニルエーテルモノマーの選択がポリマー粒子の性状に影響することは当業者には自明であろう。ＲＰＣのような疎水性粒子が所望される場合はシクロヘキサンジメタノールジビニルエーテルを選択し、もっと親水性の粒子が所望される場合はジエチレングリコールジビニルエーテルが好ましく使用される。

本重合に有用なジビニルエーテルモノマーは数多く市販されており、例えば、シクロヘキサンジメタノールジビニルエーテル、ブタンジオールジビニルエーテル又はジエチレングリコールジビニルエーテルなどがある（すべてＡｌｄｒｉｃｈ社から入手可能）。

或いは、原料として用いるジビニルエーテルモノマーは周知の方法（例えば、ＷＯ９５／１３８６１参照）で合成することによって得ることもできる。

上述の通り、本発明方法は１種以上のジビニルエーテルの重合及び架橋に基づく。ただし、本重合反応で出発原料として使用するモノマー混合物は、他のモノマー、例えばビニル基を１個有する一官能性モノマー及び／又はビニル基を２個有する二官能性モノマーなどを含んでいてもよい。一実施形態では、原料は１種以上のジビニルエーテルモノマーに加えて、上記ビニル基との反応によって重合に関与し得る１個のビニル基とビニル基以外の１個の官能基とを有するモノマーを含む。かかる非ビニル官能基としては、例えば、ヒドロキシル、アミン、塩素又はその他本粒子の架橋ポリマー構造の形成以外の目的に有用となり得る基がある。従って、本発明の方法を用いるに当たり、意図する各々の目的に必要とされる官能基の種類、例えば残留ビニル基を介しての誘導体化以外の誘導体化のための容易に利用し得る化学的手段などは、当業者が容易に決定し得る。代替的な実施形態では、本重合はジビニルエーテルに加えて、１個のビニル基の他は官能性をもたないモノマーの存在下で実施される。かかる他のモノマーとしては、例えば長鎖疎水性脂肪族鎖又は芳香族基を含むものがあり、かかるモノマーを配合すると、粒子表面の疎水性が高まる。そこで、本実施形態では、本発明は、製造しようとする粒子の用途に応じた設計が可能な、非常に幅広い用途の方法を提供する。

一実施形態では、本方法は、上述の通り製造したマクロ多孔性粒子の表面修飾工程も含む。好適な実施形態では、表面は、水酸基のような容易に誘導体化できる官能基である基を含む化合物で修飾され、水酸基などを含む化合物は親水性粒子が所望される場合に適している。水酸基は、例えばグリシドールで誘導体化できる。三フッ化ホウ素エーテル錯体の添加によって、水酸基に複数のグリシドール分子がポリマーとして結合し、多数の水酸基を含むポリマー鎖からなる共有結合コーティングを生じさせることができる。或いは、水酸基を酸化して多数のカルボン酸基を生じさせてもよい。別の実施形態では、水酸基を、エピブロモヒドリンなどのエピハロヒドリンのような化合物と反応させれば、共有結合コーティングの末端をハライドとすることができ、それをアミンと反応させれば四級アミンが得られる。別の好適な表面修飾法はグラフト反応によるものである（例えば、ＰＣＴ／ＳＥ０２／０２１５９号参照）。本明細書では、疎水基（オクタデシルビニルエーテル）でのポリマー表面のグラフトを以下の実施例２で示す。このように、本発明のマクロ多孔性粒子の表面修飾は、周知の方法に従って当業者が容易に実施し得る。

本発明の第二の態様は、架橋ジビニルエーテルポリマーからなるマクロ多孔性架橋ポリマー粒子である。特定の実施形態では、本粒子はジビニルエーテル以外にさらに１以上のサブユニットをもつポリマーからなる。本発明の粒子は、約２〜６００μｍ（例えば約２〜１５０μｍ）、さらに好ましくは約３〜１００μｍ、最も好ましくは約５〜３０μｍの平均粒子径を示す。

特定の実施形態では、本発明のマクロ多孔性架橋ポリマー粒子は上述の通り製造したものである。従って、この実施形態についての詳細は上述の通りである。

本発明の第三の態様は、液体からの、例えばタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド又は他の小さな有機分子の分離に架橋ジビニルエーテルからなる１種以上のマクロ多孔性ポリマー粒子を使用する逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）である。ＲＰＣの原理は当業者に周知である。

上記から明らかな通り、本発明の第四の態様は、架橋ジビニルエーテルからなるマクロ多孔性ポリマー粒子を、一官能性ビニルエーテル又はスチレンのような疎水性又は親水性の一官能性ビニル化合物によって化学的に誘導体化することである。

本発明の第五の態様は、ラジカル反応で開始される懸濁重合におけるジビニルエーテルモノマーの使用である。好適な実施形態では、懸濁重合は上記で詳細に説明した通り、エーテル又はポリエーテル類を含む不活性溶媒中で実施される。

図面の詳細な説明
図１は、オクタデシルビニルエーテルでの化学修飾によって疎水性を高めた本発明のマクロ多孔性シクロヘキサンジメタノールジビニルエーテル粒子（ポリマー２）での４種の異なるペプチドの分離を示し（上図）、誘導体化していない同じマクロ多孔性粒子（ポリマー２）でのペプチドの分離を示す（下図）。本発明のポリマー２は以下の実施例１に記載の通り調製した。

クロマトグラフ評価は実施例３に従って実施した。上図のクロマトグラムでは、左から右に、Ｉｌｅ⁷−アンジオテンシンＩＩＩ（２．９６）、Ｖａｌ⁴−アンジオテンシンＩＩＩ（３．２９）、アンジオテンシンＩＩＩ（４．４１）及びアンジオテンシンＩ（７．９４）を示し、４つの明瞭なピークが認められる。明瞭に出現することから、Ｖａｌ⁴−アンジオテンシンＩＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ及びアンジオテンシンＩの分離に優れている。ただし、非誘導体化材料（下図クロマトグラム）ではそうとはいえず、Ｉｌｅ⁷−アンジオテンシンＩＩＩとＶａｌ⁴−アンジオテンシンＩＩＩとアンジオテンシンＩＩＩは同時に溶出され（２．２９）、アンジオテンシンＩ（４．６３）だけ保持時間が分かれる。

図２は実施例３に記載の６種のタンパク質の分離を示し、本発明のシクロヘキサンジメタノールジビニルエーテル粒子（ポリマー２）（下図）及び従来技術のＤＶＢ／スチレン粒子（Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５ＲＰＣ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン国ウプサラ）から市販）（上図）との選択性の差を例示する。なお、ポリマー２の粒子径はＳｏｕｒｃｅ（商標）１５ＲＰＣ（平均径１５μｍ）よりも大きく（平均径２５μｍ）、ピーク幅が幾分広くなる。

左から右に、上図クロマトグラムは、リボヌクレアーゼ（１９．４５）、インスリン（２２．２２）、リゾチーム（２５．１６）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びα−キモトリプシン（２７．６６）、及び卵白アルブミン（３３．１８）を示し、下図のクロマトグラムは、リボヌクレアーゼ（１４．０６）、インスリン（１８．１８）、リゾチーム（２０．４３）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（２２．５６）、α−キモトリプシン（２３．７５）、及び卵白アルブミン（２８．３６）を示す。保持時間はＳｏｕｒｃｅ１５（商標）ＲＰＣに比べてポリマー２の方が概して短い。これは、分離に必要な溶媒量が少なくて済むので、有利な特徴である。これによってプロセスの経済性が向上するが、このことは大規模分離では特に重要である。

さらに、分離パターンがポリマー２とＳｏｕｒｃｅ（商標）１５ＲＰＣとで明らかに異なる。例えば、α−キモトリプシンからの卵白アルブミンの分離は、ポリマー２よりも、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５ＲＰＣの方が優れている。

ただし、ＢＳＡとα−キモトリプシンとのベースライン分離は、ポリマー２ではほぼ達成されるが、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５ＲＰＣではこれら２種類のタンパク質が同時に溶出する。もう一つの相違点として、リボヌクレアーゼとインスリンの分離はＳｏｕｒｃｅ（商標）１５ＲＰＣよりもポリマー２の方が優れている。

図３Ａ〜Ｃは、実施例４に記載した本発明の３種のマクロ多孔性ポリマー粒子（それぞれ、ポリマー１、ポリマー２及びポリマー３）の細孔径分布を示す。平均細孔径に対するポリプロピレングリコールの平均分子量の影響がはっきりと認められる。ポリプロピレングリコールの分子量が高いほど、平均細孔径は大きくなる。

さらに、半径５０Å未満の細孔の量は極めて少なく、クロマトグラフィー用途に極めて適していると考えられる。

実験
以下の実施例で本発明を例示する。しかし、これらの実施例は例示を目的とするものにすぎず、請求項に規定した本発明の技術的範囲を限定するものではない。本明細書中で引用した文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。

本発明のマクロ多孔性ポリマー粒子の調製
５０ｍＬビーカー中で以下の成分を混合して有機モノマー相を調製した。１０ｍＬの１，４−シクロヘキサンジメタノールジビニルエーテル（ＣＨＤＶＥ）（９８％）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、６．７ｍＬのＰＰＧ（Ｍｗ４２５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び２００ｍｇのＶ６５を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。

冷却管、機械式撹拌機及び窒素導入口を備えた２５０ｍＬ三首丸底フラスコで、以下の成分：１６０ｍＬの蒸留水、８ｇのＭｏｗｉｏｌ ４０−８８（ポリ（ビニルアルコール）、８８％加水分解、Ｃｌａｒｉａｎｔ社製）及び４．８ｇのＮａＣｌを混合して水相を調製した。溶液を２５０ｒｐｍで撹拌し、その間に温度を６５℃に急速に昇温し、５時間維持した。次いで、溶液を２時間空冷した。固体成分が完全に溶解した後、撹拌を止め、有機相（上述の通り調製）を丸底フラスコに加えた。

反応混合物（水相と有機相の混液）を窒素雰囲気下５４０ｒｐｍで３０分間撹拌した。平均直径約２０μｍの有機液滴が得られた。次いで丸底フラスコを６５℃で２０分間加熱した。反応混合物を６５℃に２４時間維持して、反応体を重合させた。

重合反応終了後、反応混合物を窒素雰囲気下で室温まで放冷した。懸濁液をガラス濾過器に移し、水相をポリマーから濾別した。ポリマーを蒸留水５００ｍＬ、エタノール５００ｍＬ及びアセトン５００ｍＬで洗浄し、最後に２３％エタノール／水（ｖ／ｖ）１００ｍＬで洗浄した。

本発明に係るマクロ多孔性ポリマー粒子の表面修飾
本実施例では、本発明のマクロ多孔性ポリマー粒子の表面修飾について記載する。

５０ｍＬガラスビーカー中、オクタデシルビニルエーテル（工業グレード８５％；Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２０ｇを６５℃で３０分間溶融して完全に液状とした。

窒素導入口及び機械式撹拌機を備えた５０ｍＬ三首丸底フラスコ中、以下の成分：１．４ｇの乾燥ポリマー２（６５℃で一晩乾燥）、１４ｍＬの液体オクタデシルビニルエーテル及び３５０ｍｇのＶ−６５を混合した。フラスコを６５℃に急速に加熱した。反応混合物をこの温度に保ち、窒素雰囲気下２５０ｒｐｍで１９時間撹拌した。

反応混合物を室温に放冷し、ガラス濾過器に移し、メタノール５００ｍＬ及びエタノール５００ｍＬで洗浄した。

クロマトグラフィー評価
本実施例では、ペプチド及びタンパク質分離に関して、本発明のマクロ多孔性ポリマー粒子のクロマトグラフィー評価について記載する。

約２．５ｍＬポリマー試料を分析用スチールカラム（内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍ）に充填し、４種のペプチド及び６種のタンパク質につき、それぞれ水溶液中で２回の分離を実施した。

これらの試験は、ポリマーマトリックスで効率的な物質移動が可能であったか否かを判定し、ペプチド及びタンパク質分離能を評価し、その選択性が従来のポリスチレン／ジビニルベンゼンポリマーとどのように異なるかを調べるために設計した。

乾燥ポリマー樹脂２ｇをエタノール３５ｍＬと混合し、最小限２時間放置した。次いで、ポリマースラリーをステンレススチールカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ社製；サイズ：内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍ）にエタノール中２１５０ｃｍ／ｈの線速度で圧力が安定するまでフロー充填法で充填した。カラム充填の質は脱イオン水中１Ｍ塩化ナトリウム溶液を５０μｌのパルスで注入し、脱イオン水を線速度３６１ｃｍ／ｈで流すことによって確認した。クロマトグラフィー評価すべてでＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ＳＨＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン国ウプサラ））を使用した。カラムの効率（段数／ｍ）及び非対称性は、Ｕｎｉｃｏｒｎ（商標）３．１ソフトウエア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン国ウプサラ））を用いて評価した。許容し得るカラム充填パラメーターの目標値は、最低６０００段数／ｍとし、０．８〜１．３の非対称性とした。

ペプチド分離
濃度０．１２５ｍｇ／ｍＬの４種のペプチド、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、Ｖａｌ⁴−アンジオテンシンＩＩＩ及びＩｌｅ⁷−アンジオテンシンＩＩＩ（ＩＣＮ社から購入したアンジオテンシンＩＩＩを除き、すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の溶液を調製した。水性緩衝液（以下、緩衝液Ａという。）は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（水酸化カリウムでｐＨ３．０に調整）であった。有機調節剤（緩衝液Ｂ）は１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）であったた。線速度は３６１ｃｍ／ｈであった。カラムは１０カラム体積（ＣＶ）の３％（ｖ／ｖ）Ｂで平衡化した（１ＣＶ＝２．４９ｍＬ）。試料混合物１０μｌを線速度３６１ｃｍ／ｈで注入した。３％から４９％Ｂへの勾配を１０ＣＶ以上で実施し、次いで２ＣＶの４９％Ｂ緩衝液とした。４９％から３％Ｂ緩衝液への２ＣＶの勾配で当初の条件に戻し、次いで、２ＣＶの３％Ｂ緩衝液で平衡化を実施した。

クロマトグラフィーの結果を図１に示す。

タンパク質分離
タンパク質分離検定の目標分子として、６種のタンパク質（リボヌクレアーゼ、インスリン、リゾチーム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、α−キモトリプシン及び卵白アルブミン、すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含めた。

タンパク質溶液はすべてフリーザーに保存した保存液（１０ｍｇ／ｍｌ）から調製する。タンパク質は、溶解に酸性条件（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ２．０）が必要なインスリンを除いて、１種類ずつＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。

水相（以下、緩衝液Ａという。）は脱イオン水中０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなるものであった。有機調節剤（緩衝液Ｂ）は１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）であった。

注入溶液は、既知体積の保存液を最終タンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａで希釈して調製する。

線速度は３６１ｃｍ／ｈであった。カラムは１０カラム体積（ＣＶ）の９７％（ｖ／ｖ）Ａで平衡化した（１ＣＶ＝２．４９ｍＬ）。タンパク質混合物２５μｌを線速度３６１ｃｍ／ｈで注入した。３％から６０％Ｂへの勾配を１５ＣＶ以上で実施し、次いで２ＣＶの６０％Ｂ緩衝液とした。６０％から３％Ｂ緩衝液への１ＣＶの勾配で当初の条件に戻し、次いで、２ＣＶの３％Ｂ緩衝液で平衡化を実施した。

本実施例では、本発明に係るマクロ多孔性粒子の細孔径を分子量の種々異なる高分子ポリエーテルポロゲンを用いて、どのように変更することができるかについて記載する。以下に記載のポリマーはすべて実施例１に記載の方法で合成される。

図１は非誘導体化マクロ多孔性ポリマー粒子、及びオクタデシルビニルエーテルでの化学修飾によって疎水性としたマクロ多孔性ポリマーでの４種類の異なるペプチドの分離を示す。 図２は６種類のタンパク質の分離を示し、本発明のジビニルエーテル粒子と従来技術のＤＶＢ／スチレン粒子との間の選択性の差を例示する。 図３Ａ〜Ｃは本発明の３種類のマクロ多孔性ポリマー粒子の細孔径分布を示す。 図３Ａ〜Ｃは本発明の３種類のマクロ多孔性ポリマー粒子の細孔径分布を示す。 図３Ａ〜Ｃは本発明の３種類のマクロ多孔性ポリマー粒子の細孔径分布を示す。

Claims (8)

1. １種以上のマクロ多孔性架橋ポリマー粒子の製造方法であって、ポリエーテル類を含む不活性溶媒中でのジビニルエーテルモノマーの重合及び架橋反応を含み、当該方法における重合がラジカル開始剤による懸濁重合であり、前記ジビニルエーテルモノマーがシクロヘキサンジメタノールジビニルエーテルモノマー、ジエチレングリコールジビニルエーテルモノマー又はその混合物からなる群から選択される、方法。
2. 前記溶媒がポリエーテル溶媒とアルコール系溶媒との混合物である、請求項１記載の方法。
3. 前記ポリエーテル溶媒の各ポリマーが６０ｇ／モルを超える分子量を有する、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 前記ポリエーテル溶媒がポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、及びＰＥＧ及び／又はＰＰＧを含む混合物からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
5. 前記ポリエーテル溶媒がポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）である、請求項４記載の方法。
6. 得られた粒子の表面を残留ビニル基の誘導体化によって修飾する工程をさらに含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法で製造されるマクロ多孔性架橋ポリマー粒子。
8. 請求項７記載の１種以上のマクロ多孔性架橋ポリマー粒子を、液体からのタンパク質、ペプチド又はオリゴヌクレオチドの分離に使用する逆相クロマトグラフ法（ＲＰＣ）。

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