CN108892803B - 一种耐盐阴离子交换层析介质及其制备方法 - Google Patents

一种耐盐阴离子交换层析介质及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种耐盐阴离子交换层析介质，所述耐盐阴离子交换层析介质是交联化多胺聚合物多孔微球；所述耐盐阴离子交换层析介质的骨架主体结构为多胺聚合物，在所述多胺聚合物上带有高密度的伯胺配基。由于本发明的多孔交联多胺聚合物微球的固有组成是多胺聚合物，它的表面伯胺基团密度比现有产品中的阴离子交换树脂高。因此它不仅有耐盐性阴离子交换吸附功能，而且吸附载量会更高。

Description

一种耐盐阴离子交换层析介质及其制备方法
技术领域
本发明属于层析介质领域，具体涉及一种耐盐阴离子交换层析介质。
背景技术
在设计用于生物制药药物生产的大多数下游纯化过程中，稀释和渗滤顺序是不可避免的前期工作。这些操作通常用于将料液调节至最佳工艺性能所需的最佳条件。然而，这些步骤通常耗费大量时间、水和劳力。由于生物制药生产越来越多地受成本降低的驱动，因此提高工艺经济性的一种可能方法是通过尽可能在层析步骤之前或之间消除这些单元操作来简化纯化。
在很多治疗性重组蛋白、核酸或者病毒颗粒等生物制造纯化工艺中，阴离子交换吸附剂经常用于第一步的捕获纯化步骤。然而，使用常规阴离子交换层析介质需要较低的离子强度以获得足够的载量。因此，通常需要将料液稀释或渗滤以使进料电导率降低到适合常规阴离子吸附剂。使用“耐盐”(salt-tolerant)阴离子交换吸附则可以直接从未稀释的原料中捕获并显著提高工艺经济性。另外，在很多抗体生物制造纯化工艺中，阴离子交换则经常用于Protein A捕获之后，或者阳离子精纯(polish)之后的流穿模式除杂(DNA、病毒、HCP、多聚体等)。这两种情况下料液经常含有中等到高浓度盐，常规阴离子层析树脂在这种高电导率下几乎无法吸附除杂，因此通常也需要将料液稀释或渗滤以使进料电导率降低。若使用“耐盐”阴离子交换吸附则可以不稀释料液直接流穿除杂，提高工艺经济性。
具有“耐盐”效果的阴离子层析介质通常含有高密度的伯胺或仲胺配基。常规的Q季胺强阴或者DEAE叔胺弱阴离子交换层析树脂在电导率大于18s/cm时几乎没有离子交换吸附，而含有伯胺或仲胺配基的层析介质却能在较高盐浓度(电导率大于20s/cm)下实现离子交换吸附，这可能是因为伯胺或仲胺除了电荷作用外还能通过氢键和蛋白质发生作用(参考文献：J Chromatogr A.1016(1)：21-33)。现有技术中耐盐阴离子交换层析介质都是通过键和带高密度伯胺的聚乙烯胺或聚丙烯胺等多胺聚合物到固定相制备而成。
Figure BDA0001773470310000021
美国专利US 5304638报导了将聚丙烯胺接枝到琼脂糖凝胶层析介质表面制备阴离子交换层析介质。
美国专利US 20110065900A1以及”J.Chromatogr.A 1305(2013)，85-93”报导了表面键合了聚丙烯胺的Sepharose FF层析树脂比常规Q Sepharose在高盐条件下(0.25M氯化钠)阴离子交换吸附载量要显著地高。
美国专利US8435406报导了将聚丙烯胺包覆(coating)在层析膜上制备耐盐阴离子交换层析膜。
美国专利申请US 20140336355A1报导了键合并交联聚乙烯胺在聚苯乙烯微球固定相上面制备耐高盐阴离子交换层析介质。
以上现有技术都是将多胺聚合物(聚乙烯胺或者聚丙烯胺)键合或者包覆在固定相上来制备耐盐阴离子交换层析介质。这样的制备方法所制备的产品会有如下缺点：1)其制备方法都是将多胺聚合物键合或者包覆在层析介质上，引入的伯胺数量是有限的；2)通过键合或者包覆的方法将多胺聚合物引入到层析介质孔道内，在引入的过程中会降低层析介质的孔径和载量，甚至由于不可控性会导致部分层析介质孔道阻塞。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种耐盐阴离子交换层析介质及其制备方法，该耐盐阴离子交换层析介质不仅有耐盐性阴离子交换吸附功能，而且吸附载量更高。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是：一种耐盐阴离子交换层析介质，所述耐盐阴离子交换层析介质是交联化多胺聚合物多孔微球；所述耐盐阴离子交换层析介质的骨架主体结构为多胺聚合物，在所述多胺聚合物上带有伯胺配基。
其中，所述耐盐阴离子交换层析介质是交联化多胺聚合物多孔微球，指的是所述多胺聚合物以交联的方式固定到层析介质上。
其中，在所述多胺聚合物上带有高密度的伯胺配基。
其中，所述耐盐阴离子交换层析介质的粒径为5-100um；所述耐盐阴离子交换层析介质为多孔介质，孔径为
Figure BDA0001773470310000041
优选的，所述耐盐阴离子交换层析介质为多孔介质，孔径为
Figure BDA0001773470310000042
其中，所述多胺聚合物是聚乙烯胺和/或聚丙烯胺。
本发明还提供一种耐盐阴离子交换层析介质的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将多胺聚合物吸附到多孔硅胶的孔隙内；2)引入交联剂，将多胺聚合物交联固定在多孔硅球里面，形成交联化多胺聚合物/硅胶复合微球；3)将所述交联化多胺聚合物/硅胶复合微球中的多孔硅胶通过强碱溶解，形成骨架主体结构为多胺聚合物、多胺聚合物上带有伯胺配基的耐盐阴离子交换层析介质。
其中，步骤1)中多胺聚合物分子量大于1000。
优选的，步骤1)中多胺聚合物分子量大于10000。
其中，所述多胺聚合物是聚乙烯胺和/或聚丙烯胺。
其中，步骤2)中所述交联剂为双官能团或者多官能团环氧化合物。
优选的，所述双官能团或多官能团环氧化合物包括环氧氯丙烷、环氧氯丁烷、环氧溴丙烷、环氧溴丁烷、丁基双缩水甘油醚、乙二醇双缩水甘油醚中任一种或混合物。
其中，在所述多胺聚合物上带有高密度的伯胺配基。
所述多胺聚合物是具有高密度伯胺的高分子化合物。
本发明用多孔硅胶微球为模板，多孔硅胶表面的硅羟基带有负电荷，多胺聚合物带正电荷，因此多孔硅胶微球极易吸附多胺聚合物到它的孔道里面。同时，本发明使用过量的多胺聚合物，使多孔硅胶微球的孔道被填充完全。加入少量小分子交联剂将孔道内的多胺聚合物交联固定在多孔硅胶微球的孔道里面，形成交联化多胺聚合物/硅胶复合微球。然后，将这种复合微球用氢氧化钠强碱溶液处理溶解掉多孔硅胶模板成分，得到多孔交联多胺聚合物微球。由于本发明的多孔交联多胺聚合物微球的固有组成是多胺聚合物，因此，本发明不仅能提供耐盐的伯胺配基，微球表面的伯胺基团密度也比现有产品中的阴离子交换树脂高很多，非常适合在高盐浓度下进行富集使用。
本发明以交联的方法将多胺聚合物引入到层析介质孔道内，从而能够引入高密度的伯胺数量；并且，交联法引入多胺聚合物时，不会降低层析介质的孔径和载量，也不会阻塞孔道。因此，本发明的耐盐阴离子交换层析介质不仅有耐盐性阴离子交换吸附功能，而且吸附载量更高。
本发明耐盐层析介质的制备方法是采用模板法，即通过具有多孔结构的硅胶作为模板，在制备过程中，可以选用不同孔径的硅胶作为模板，即可得到不同孔径和粒径的多胺聚合物层析介质。而层析介质的孔径与待分离物的分子大小息息相关，通过本发明方法可以制备出多种不同孔径、粒径的层析介质，适用于多种不同分子量大小的物质分离。
附图说明
图1为采用本发明方法制备耐盐阴离子交换层析介质的步骤示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
一种耐盐阴离子交换层析介质，所述耐盐阴离子交换层析介质是交联化多胺聚合物多孔微球；所述耐盐阴离子交换层析介质的骨架主体结构为多胺聚合物，在所述多胺聚合物上带有伯胺配基。
其中，在所述多胺聚合物上带有高密度的伯胺配基。
其中，所述耐盐阴离子交换层析介质的粒径为5-100um；所述耐盐阴离子交换层析介质为多孔介质，孔径为
Figure BDA0001773470310000071
其中，所述多胺聚合物是聚乙烯胺和/或聚丙烯胺。
本发明还提供一种耐盐阴离子交换层析介质的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将多胺聚合物吸附到多孔硅胶的孔隙内；2)引入交联剂，将多胺聚合物交联固定在多孔硅球里面，形成交联化多胺聚合物/硅胶复合微球；3)将所述交联化多胺聚合物/硅胶复合微球中的多孔硅胶通过强碱溶解，形成骨架主体结构为多胺聚合物、多胺聚合物上带有伯胺配基的耐盐阴离子交换层析介质。
其中，步骤1)中多胺聚合物分子量大于1000。
优选的，步骤1)中多胺聚合物分子量大于10000。
其中，所述多胺聚合物是聚乙烯胺和/或聚丙烯胺。
其中，步骤2)中所述交联剂为双官能团或者多官能团环氧化合物。
优选的，所述双官能团或多官能团环氧化合物包括环氧氯丙烷、环氧氯丁烷、环氧溴丙烷、环氧溴丁烷、丁基双缩水甘油醚、乙二醇双缩水甘油醚中任一种或混合物。
其中，在所述多胺聚合物上带有高密度的伯胺配基。
所述多胺聚合物是具有高密度伯胺的高分子化合物。
实施方式1
准备步骤：
购买或者自行制备多孔硅胶模板。其制备方法一般以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源，可采用喷雾干燥法、聚合诱导胶体聚集法(堆积硅珠法)、溶胶-凝胶法(可参考Unger K，Schick-Kalb J，Krebs K F.Preparation of porous silica spheres for columnliquid[J].Journal of Chromatography A，1973，83(AUG29)：5.)、及模板法(江必旺，吴俊成，陈荣姬.功能化均粒多孔二氧化硅微球及其制备方法和应用：，CN102070152A[P].2011.)等方法制备。
步骤1：将聚乙烯胺吸附到准备好的多孔硅胶的孔隙中
称取10g多孔硅胶(粒径为10um，孔径
Figure BDA0001773470310000081
表面积为300m2/g，孔容积0.8cm3/g)，真空条件下干燥处理6h。将处理好的硅胶样品加入到质量分数为60％的聚乙烯胺(分子量为20000)水溶液中完全浸渍，混合搅拌12h，后在60℃条件下搅拌干燥，后移入65℃真空干燥箱内至重量不再变化为止，得到硅胶/聚乙烯胺固体复合物。
步骤2：交联聚乙烯胺
将上述干燥后的硅胶/聚乙烯胺固体复合物分散到异丙醇中，搅拌1h后加入10ml环氧氯丙烷，升温60℃进行交联反应。交联反应完成后过滤、水洗，移入65℃真空干燥箱内干燥至重量不再变化为止，得到交联化聚乙烯胺/硅胶复合微球。
步骤3：模板去除
将得到的交联化聚乙烯胺/硅胶复合物分散到500ml 1.0M NaOH溶液中，室温下超声处理60min，，处理溶解掉硅胶模板。
图1为本发明方法制备耐盐阴离子交换层析介质交联多聚胺的步骤示意图。本发明利用单分散的多孔硅胶微球作为模板，通过在孔道内组装多胺聚合物形成交联化多胺聚合物/硅胶复合微球，再通过碱液腐蚀掉多孔硅胶模板，得到交联化多胺聚合物多孔微球，精准制备多胺聚合物阴离子交换层析介质。
实施方式2
准备步骤：
购买或者自行制备多孔硅胶模板。其制备方法一般以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源，可采用喷雾干燥法、聚合诱导胶体聚集法(堆积硅珠法)、溶胶-凝胶法(可参考Unger K，Schick-Kalb J，Krebs K F.Preparation of porous silica spheres for columnliquid[J].Journal of Chromatography A，1973，83(AUG29)：5.)、及模板法(江必旺，吴俊成，陈荣姬.功能化均粒多孔二氧化硅微球及其制备方法和应用：，CN102070152A[P].2011.)等方法制备。
步骤1：将聚丙烯胺吸附到准备好的多孔硅胶的孔隙中
称取10g多孔硅胶(粒径为20um，孔径
Figure BDA0001773470310000091
)，真空条件下干燥处理6h。将处理好的硅胶样品加入到质量分数为60％的聚丙烯胺(分子量20000)水溶液中完全浸渍，混合搅拌12h，后在60℃条件下搅拌干燥，后移入65℃真空干燥箱内至重量不再变化为止，得到硅胶/聚丙烯胺固体复合物。
步骤2：交联聚丙烯胺
将上述干燥后的硅胶/聚丙烯胺固体复合物分散到异丙醇中，搅拌1h后加入10ml环氧氯丙烷，升温60℃进行交联反应。交联反应完成后过滤、水洗，移入65℃真空干燥箱内干燥至重量不再变化为止，得到交联化聚丙烯胺/硅胶复合微球。
步骤3：模板去除
将得到的交联化聚丙烯胺/硅胶复合物分散到500ml 1.0M NaOH溶液中，室温下超声处理60min，处理溶解掉硅胶模板。
本发明以交联的多胺聚合物为基质形成的微球作为耐盐阴离子交换层析介质，它表面的伯胺基团密度比现有产品中的阴离子交换树脂高，因此它不仅有耐盐性阴离子交换吸附功能，而且吸附载量会更高。多胺聚合物本身既是介质固定相骨架，也是耐盐阴离子交换配基，因此，介质表面的阴离子交换功能基团的数量也就是最高的，即其耐盐性能是最优越的。
本发明使用过量的多胺聚合物，使多孔硅胶微球的孔道被填充完全，引入足够多的伯胺数量。通过交联的方法将多胺聚合物引入到层析介质孔道内，不会降低层析介质的孔径和裁量。
此外，本层析介质的制备方法是通过模板法制备，即通过具有多孔结构的硅胶作为模板，在制备过程中，可以选用不同孔径的硅胶作为模板，即可得到不同孔径和粒径的多胺聚合物层析介质。而层析介质的孔径与待分离物的分子大小息息相关，通过本法可以制备出多种不同孔径、粒径的层析介质，适用于多种不同分子量大小的物质分离。
除上述实施例以外，本发明还可以有其他方式实现，在不脱离本发明内容的前提下，任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种耐盐阴离子交换层析介质，其特征在于，所述耐盐阴离子交换层析介质是交联化多胺聚合物多孔微球；所述耐盐阴离子交换层析介质的骨架主体结构为多胺聚合物，在所述多胺聚合物上带有伯胺配基；
所述耐盐阴离子交换层析介质的制备方法包括以下步骤：1)将多胺聚合物吸附到多孔硅胶的孔隙内；2)引入交联剂，将多胺聚合物交联固定在多孔硅球里面，形成交联化多胺聚合物/硅胶复合微球；3)将所述交联化多胺聚合物/硅胶复合微球中的多孔硅胶通过强碱溶解，形成骨架主体结构为多胺聚合物、多胺聚合物上带有伯胺配基的耐盐阴离子交换层析介质；
步骤1)中多胺聚合物的分子量大于10000；
所述多胺聚合物是聚乙烯胺和/或聚丙烯胺；
步骤2)中所述交联剂为双官能团或者多官能团环氧化合物。
2.如权利要求1所述的耐盐阴离子交换层析介质，其特征在于，在所述多胺聚合物上带有高密度的伯胺配基。
3.如权利要求1所述的耐盐阴离子交换层析介质，其特征在于，所述耐盐阴离子交换层析介质的粒径为5-100um；所述耐盐阴离子交换层析介质为多孔介质，孔径为
Figure FDA0002756707480000011
4.如权利要求1所述的耐盐阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于，所述双官能团或多官能团环氧化合物包括环氧氯丙烷、环氧氯丁烷、环氧溴丙烷、环氧溴丁烷、丁基双缩水甘油醚、乙二醇双缩水甘油醚中任一种或混合物。
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