CN109437171A - 石墨烯改性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于接纳生物样品的支持体，该支持体包括至少一个支持部件，并且包括附接至该至少一个支持部件的石墨烯，其中该石墨烯是部分氢化的石墨烯。本发明还涉及部分氢化的石墨烯表面用于支持用于电子显微术的生物分子的用途。本发明还涉及一种用于制造部分氢化的石墨烯的方法，该方法包括向石墨烯的表面施加氢离子或氢原子，其中以在1至21eV范围内的能量施加所述氢离子或氢原子。本发明还涉及一种传感器，该传感器包括能够吸附生物分子的表面，其中该表面包含部分氢化的石墨烯。本发明还涉及一种用于清洁石墨烯表面的方法，该方法包括将所述石墨烯表面与氢等离子体或氦等离子体或氖等离子体接触足以除去表面杂质的时间。

Description

石墨烯改性
本申请是申请日为2014年8月7日、国际申请号为PCT/GB2014/052423，国家申请号为201480055929.2且发明名称为“石墨烯改性”的申请之分案申请。
技术领域
本发明处于用于生物样品的支持体的领域，如用于生物分子的支持体。
背景技术
近来，改进的电子显微镜、更加稳定的低温阶段以及具有高量子效率的直接电子探测器已经导致了生物电子显微术(EM)的革命，使得对于大分子和病毒来说接近原子分辨率3D结构成为可能1-3。电子低温-显微术(cryo-EM)用于确定蛋白质结构。它是一种尚在发展的方法，并且所得的3D重构的分辨率已平稳地增加。利用目前的方法学，可以获得接近原子的分辨率。随着分辨率进一步提高，制药工业将希望，可能与x射线晶体学平行地，利用此技术，来理解药物如何结合至它们的蛋白质靶。然而，栅格设计和制备，自从几乎三十年前最初对它们对于电子低温-显微术(低温-EM)进行了发展之后，在很大程度上保持不变4-6。
目前用在生物试样的低温-EM中的栅格存在若干问题。第一，使电子偏转的表面电荷的累积和电子束诱导的样品的运动导致了不是最佳的图像7-10。其次，恰在玻璃化冷冻前存在的薄的水膜的表面积与体积的大的比率导致蛋白质在空气-水界面累积，导致变性和强优选的取向5，11。石墨烯和更近来的石墨烷(graphane)12，13的出现允许着手解决这些长期存在的问题。
目前，通常使用无定形碳作为用于电子显微术的支持体。典型地，将薄的碳膜(厚)悬置在较厚的有洞的无定形碳的层上，所述层跨过在典型的金属网格中的间隙14。据认为，这些薄碳膜减少带电，由于到表 面的蛋白质吸附而增加粒子浓度，并且改变分子的取向分布。辉光放电是一种使得碳支持体层亲水的方法，其使用通过将在将栅格泵抽至毫托压力之后存在的残留空气气体离子化所制得的不受控的等离子体。这给予它吸附性，以有助于形成蛋白质在薄冰层中的均匀分布，用于后续的通过低温-EM的成像4。
无定形碳基板具有若干缺点。第一，它们显著地对图像中的噪声有贡献，对于较小的分子(小于500kDa)特别有害，在较小的分子中，信噪比(SNR)对于准确的粒子对准是关键性的。第二，蛋白质经常由于与支持碳的相互作用而采用取向的优选，并且使用目前的方法很难控制这些取向。第三，薄的无定形碳是不良导体，其累积明显的可以使电子束偏转并且在样品上施加强静电力的移动表面电荷。最后，因为复制辉光放电条件的困难，并且因为污染在碳表面上取决于它们的时期和储存条件逐步建立，难以控制蛋白质向表面上的吸附。
石墨烯是一种引人注目的材料，由仅仅一个原子厚的、以六方晶格结合在一起的碳原子层构成。键合的结构与石墨中一样，包含共用离域电子的sp2键合的碳的网络。作为结果，石墨烯具有引人注目的传导性和机械强度，使得石墨烯成为出色的用于电子显微术的支持膜。石墨烯是机械鲁棒的导体，其对于电子在高达的全部空间频率是透明的，并且因此对于在电子显微镜中将纳米尺度的试样成像来说是可能的基板。石墨烯可以是悬置的石墨烯，将电荷弹道地传导过跨过典型的用于将冰中的分子成像的孔洞的亚微米的距离，所以它很有可能在电子束暴露期间显著地减少表面电荷的积累。相反，无定形碳是其性质和传导性(对于蒸发的无定形碳来说～10-3S/cm)可以取决于沉积期间的条件广泛变化的半导体，在用于它们的制备的典型的热蒸发器中，所述性质和传导性不好控制。这使得无定形碳倾向于表面带电并且对束诱导的其组分的化学变化强烈敏感，即使在非常低的电子暴露剂量下也是如此。石墨烯的面内机械强度(杨氏模量～1TPa)进一步推荐它作为稳定的且鲁棒的基板。
尽管石墨烯的巨大的潜在优势，以及使用化学气相沉积(CVD)的大规模制造的容易性，但石墨烯尚未广泛用于生物材料的用途。对此有两个主要原因：石墨烯是疏水的，这在很大程度上阻止蛋白质从水溶液中沉积， 而且它对表面污染(在生长期间形成的或在随后的处理和储存期间吸附的)是敏感的。此前已经作出了使用石墨烯作为用于将生物分子成像的基板的尝试，但是使得石墨烯表面亲水需要使用与大部分蛋白质不相容的苛刻的溶剂(DMP-30)，或需要将石墨烯转化为氧化石墨烯。
低温-EM的主要问题是对蛋白质在玻璃体冰的薄层中的分布的精确控制。在印迹(blotting)或玻璃化冷冻期间，蛋白质经常偏析至空气/水界面或偏析至碳支持体膜。
已经使用氧化石墨烯用于类似的目的22-24，但是氧化石墨烯存在问题，因为氧比碳或氢更强地散射电子，并且因此贡献几乎和薄无定形碳一样多的背景信号。此外，氧化石墨烯是绝缘体，并且含有与原始的石墨烯相比降低其机械强度的晶体缺陷，使得它较不能够中和累积的表面电荷并且作为用于冰薄膜层的支持体较不稳定。
石墨烯不与生物分子一起使用，因为它的疏水性质阻止它们的可靠的沉积，且因为它容易被污染。这些缺点意味着石墨烯尚未用于生物分子的EM中或涉及生物分子的吸附或其他附接的应用中，如传感器或类似的应用中。
在半导体物理的无关领域中，已经证明暴露至低能量氢等离子体可以将石墨烯转化为石墨烷，即其完全氢化的形式13，26。氢化的石墨烯尚未与生物样品一起用于EM。
本发明寻求克服与现有技术相关的一个或多个问题。
发明内容
如上指出的，石墨烯膜已经用作用于电子显微术的支持膜。然而，石墨烯支持膜目前不用于生物分子的电子显微术。原因是石墨烯片是强烈疏水的。这导致了无法克服的阻止生物分子如蛋白质向石墨烯上可靠沉积的问题。此外，原始的石墨烯表面容易受到污染，这使得它们并不比普通的无定形碳更好。使得石墨烯可用作EM支持体的现有技术尝试已经导致了石墨烯转化成氧化石墨烯。然而，氧化石墨烯由于氧原子的存在具有强的电子散射性质。实际上，氧化石墨烯作为EM支持膜的用途贡献几乎与薄无定形碳一样多的背景信号。氧化石墨烯具有另外的缺点，缺点包括降低 的机械强度以及中和累积的表面电荷的问题。因此，石墨烯和石墨烯衍生物如氧化石墨烯对于生物分子的电子显微术而言一直并不优于普通的无定形碳。
与之相比，本发明的发明人发现了，石墨烯的部分氢化可以用于改善石墨烯的强疏水性质。值得注意的是，可以在保持对于石墨烯的性质而言是至关重要的碳原子的六方晶格的同时完成该部分氢化。此外，非常出人意料的是，低比例的、显著地低于石墨烷中的完全氢化的氢化，在允许生物分子可靠沉积的亲水的石墨烯表面的制备中是难以置信地有效的。
发明人也教导了其中可以在使用前清洁石墨烯表面的方法。发明人教导了，小原子等离子体(如氢或氦或氖)的使用可以以低能量使用，在该能量它们将选择性地除去杂质(即清洁石墨烯)而不伤害它的晶态结构。
因此，一方面本发明提供一种用于接纳生物样品的支持体，所述支持体包括至少一个支持部件，并且包括附接至所述至少一个支持部件的石墨烯，其特征在于所述石墨烯是部分氢化的石墨烯。
适宜地，所述石墨烯是0.01％至50％氢化的石墨烯。
适宜地，所述石墨烯是3％至10％氢化的石墨烯，优选5％氢化的石墨烯。
适宜地，本发明的石墨烯(部分氢化的石墨烯)具有在68°至90°范围内的水-石墨烯(空气-水-石墨烯)接触角；更适宜地，在78°至87°范围内；更适宜地，在82°至84°范围内；更适宜地，约或大约83°；最适宜地，83°。在下文更详细地讨论接触角的测量；参考图1。
适宜地，该至少一个支持部件附接至支持膜，并且所述石墨烯附接至所述支持膜。
适宜地，所述支持膜包含传导性材料，适宜地，导电材料。
适宜地，所述支持膜包含碳。
适宜地，该支持体包含多个支持部件。
适宜地，该石墨烯附接至所述支持部件的每一个。
适宜地，该支持体是传感器支持体。
适宜地，该支持体是EM支持体。
在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的电子显微术支持体，其中 所述部分氢化的石墨烯包含石墨烯的至少第一区域和石墨烯的至少一个另外区域，其中所述第一区域被氢化至第一氢化值，并且所述至少一个另外区域被氢化至不同的氢化值。
适宜地，如上所述的所述电子显微术支持体还包含吸附至所述部分氢化的石墨烯的生物分子。
适宜地，所述生物分子是亲水的生物分子。
另一方面，本发明涉及部分氢化的石墨烯表面用于支持用于电子显微术的生物分子的用途。
另一方面，本发明涉及一种用于制造部分氢化的石墨烯的方法，所述方法包含对石墨烯的表面施加氢离子或氢原子，其特征在于以高达21eV、更适宜地在1至21eV范围内的能量施加所述氢离子或氢原子。适宜地，该能量在1至14eV范围内。
适宜地，在所述石墨烯的氢饱和之前停止所述氢的施加。
适宜地，以氢等离子体的形式施加所述氢离子或氢原子。
适宜地，将所述石墨烯与所述氢等离子体接触11至80秒。
适宜地，将所述石墨烯与所述氢等离子体接触18至22秒。
适宜地，所述石墨烯是安装在支持体上的石墨烯。适宜地，所述支持体是电子显微术支持体。
另一方面，本发明涉及通过如上所述的方法获得的部分氢化的石墨烯。
另一方面，本发明涉及一种用于清洁石墨烯表面的方法，所述方法包含将所述石墨烯表面与氢等离子体或氦等离子体或氖等离子体接触足以除去表面杂质的时间。
适宜地，所述等离子体原子处于在1至14eV范围内的能量。
适宜地，所述等离子体是惰性等离子体。例如，所述等离子体适宜地由惰性气体构成，惰性气体具有它不诱发石墨烯中稳定化学变化的优点。
适宜地，所述等离子体是氖等离子体。最适宜地，所述等离子体是氦等离子体。
适宜地，将所述石墨烯表面与所述等离子体接触1至30秒。
适宜地，将所述石墨烯表面与所述等离子体接触1至10秒。
适宜地，所述石墨烯是部分氢化的石墨烯。
另一方面，本发明涉及通过如上方法获得的清洁过的石墨烯。
另一方面，本发明涉及处于在1至14eV的范围内的能量的氢等离子体用于制备用于电子显微术的石墨烯的用途。适宜地，该石墨烯是通过部分氢化制备的。适宜地，该石墨烯是通过除去杂质制备的。
另一方面，本发明涉及一种将生物样品成像的方法，所述方法包括：
将所述生物样品配置在如上所述的支持体上，将所述支持体布置在电子显微镜的电子束中，并且收集图像数据。所述图像数据可以是用于分析的图像数据。
另一方面，本发明涉及一种可操作以提供生物样品的电子显微术图像的成像设备，所述设备包括：
安装在如上所述的支持体上的生物样品，布置为入射在所述支持体上的电子显微镜的电子束，和可操作以收集图像数据的收集装置。所述图像数据可以是用于分析的图像数据。
发明详述
石墨烯不与生物分子一起用在现有技术中，因为它的疏水性阻止了它们的可靠沉积，并且它容易受到污染。
本发明涉及使用低能量氢等离子体调整石墨烯的表面性质，而不降解石墨烯晶格。这改变了石墨烯的性质，以允许蛋白质向它的表面的沉积，以及精确地控制它们的分布。此外，它通过非破坏性地除去污染物而清洁石墨烯表面。因此，本发明可以用于精确控制蛋白质在石墨烯表面上的分布。我们说明了它在使用单粒子电子低温-显微术(singleparticle electron cryo-microscopy)的成像和三维重构中的有用性。本发明也可用在其他涉及病毒、蛋白质或其他生物分子向石墨烯如石墨烯表面上的受控吸附的生物应用中。这些应用包括基于石墨烯的传感器，例如用于探测与石墨烯表面接触的分子的存在、浓度和/或其他性质。
我们教导了使用低能量氢等离子体调整石墨烯的表面性质，而不降解石墨烯晶格。这改变了石墨烯的性质，以允许蛋白质向它的表面的沉积，以及精确地控制它们的分布。这也通过非破坏性地除去污染物而清洁石墨烯表面。
我们教导了用低能量氢等离子体低水平地氧化石墨烯，这可以解决上述的现有技术的问题：除去表面污染和/或使石墨烯适宜地亲水，用于作为用于生物分子如蛋白质的基板。通过使用其能量大大低于对于石墨烯的溅射器阈值的氢等离子体，我们观察到没有对悬置的晶格的显著破坏。此外，我们能够调制在石墨烯上的蛋白质分布，在那里氢等离子体剂量直接关系到蛋白质的表面密度。这对于EM应用如低温-EM应用和/或传感器应用如生物传感器应用特别有利。
生物样品的电子显微术典型地在至的分辨率上操作。因为基板如石墨烯具有大约的相对最小分辨率，可以认为它们为对于生物分子的研究来说是“不可见的”。
我们说明了，通过确定在用氢等离子体处理过的石墨烯上成像的70S和80S核糖体的3D重构，在电子显微术中使用此方法。
我们示出了，石墨烯晶格的部分氢化可以导致蛋白质从水溶液的吸附，使得能够与其他变量无关地控制粒子表面密度。在低温-EM样品制备中，其他变量可能包括湿度、印迹时间等。通过调制它们的向石墨烯的吸附，我们解决了与蛋白质在空气/水界面的聚集和变性相关的现有技术的问题。我们示出了，部分氢化的石墨烯减轻了与无定形碳相关的问题，包括不可复制性、带电以及增加的背景噪音。
而且，我们示出了，低能量氢等离子体可以选择性地除去表面污染物，与它可以还原石墨烯晶体本身相比快得多。这有利地允许在避免或最小化石墨烯的氢化状态的进一步改变的同时移除杂质(清洁)。
石墨烯，当用低能量氢等离子体处理时，是可重现的且可调制的用于吸附蛋白质的表面。在此基础上，我们预见，用于电子显微术的生物试样的制备将从试错方式移动到在不损害蛋白质的结构完整性或图像品质的情况下的表面条件的筛选的系统过程。
此外，本发明提供在低温-EM中的优点，如增加的冰的稳定性，和/或减小的粒子的运动-这些在下文更详细地讨论。
重要地，此方法取决于对石墨烯晶格来说的能量阈值的概念，在此如本文教导地，控制等离子体，使得等离子体内的有能量的离子不具有直接从石墨烯晶格移除原子或损坏石墨烯晶格的能量。因此，唯一可以发生的 对石墨烯晶格的改性是经由与等离子体的物种的化学反应。对于直接从石墨烯晶格移除碳原子来说的阈值能量已经估计为在大约21eV。适宜地，使用大大低于此能量的等离子体，以确保没有石墨烯的溅射。
在实施例中，我们说明了使用氢用于清洁的本发明。然而，其他其能量不足以从石墨烯晶格经由直接反冲事件移除碳原子的离子物种也将是可用的，因为它们的行为也将限制在于表面的化学反应，如关于氢所解释的。这些将包括例如氦，如在5-10eV范围内的氦。氦是特别令人感兴趣的，因为它将不与石墨烯表面反应，但将除去污染。
使疏水石墨烯可用于电子显微术的现有技术尝试包括了非常苛刻的处理。在一些情况下，已经将石墨烯转化成氧化石墨烯。氧化石墨烯具有许多缺点，包括：它的作为绝缘体的行为，中和累积的表面电荷的问题，以及降低作为用于低温-EM所需的薄冰层的支持体的机械强度/稳定性。
现有技术未能成功使得石墨烯用作用于生物分子的EM研究的基板。
本发明的关键优点在于，通过用于处理石墨烯的原子/条件的选择，可以将其化学改性，同时在物理上不变化。换言之，发明人能够改变石墨烯中的键结构，但是不从石墨烯晶格移除原子，这将破坏对它在EM中的使用来说至关重要的物理性质。
发明人教导了，甚至是非常低的氢化比例(如0.1至20％氢/碳)也可以足以恢复充足的亲水性，以允许生物分子向用于EM的表面的可靠沉积。
在材料科学领域，已经制备了称作石墨烷的物质。石墨烷是完全氢化的碳片。在石墨烷中，每个碳sp3键合至3个碳，加上氢。相对地，发明人教导了石墨烯的部分氢化。以此方式，保持了石墨烯的特性，同时有利地为允许生物分子横跨石墨烯表面的分布提供足够的氢化，促进了EM研究中的出色结果。本发明的优点在于，完全保持了晶体结构。不希望受理论束缚，本发明的部分氢化的石墨烯中的键合了氢的碳的精确键长当然可以相对于完全未氢化的石墨烯的键长变化。然而，重要的是，根据本发明，保持了石墨烯的六方晶格结构。
在此研究过程中，发现非常出人意料的是，亲水性对于部分氢化的石墨烯片来说可以在远远低于可能已预期的氢化值处饱和。在此工作之前，会预期的是，亲水性将在100％氢化(即石墨烷)处达到饱和。然而，根据 本发明呈现的数据，亲水性实际上在大约20％氢处于或接近饱和。
尽管在现有技术中已经将某些物质如石墨烯或石墨烷置于电子显微术下，但重要的是注意到，已主要在材料科学领域中研究了这些。石墨烯在电子领域中对于材料科学家来说是令人感兴趣的，因为石墨烯膜可以通过化学气相沉积生长，用于半导体计算机芯片。由于对于石墨烯的导电性的兴趣，在材料科学领域中将它作为对经典半导体如硅来说可能的未来的竞争者来研究。在这些研究中，已经将石墨烯与电子显微术组合，单纯地作为待研究的样品。已经对一些已经制得的新材料进行了EM，目的是辨别它们的结构。在现有技术中还不存在将部分氢化的石墨烯作为用于生物样品如生物分子的支持体基板的教导。这是由本发明作出的直接贡献。
在广阔的方面，本发明涉及一种部分氢化的石墨烯，其包含向其吸附的生物分子。
石墨烯片的清洁
发明人研究了用本文所述小原子等离子体处理石墨烯的阈值效果。令人非常感兴趣的是，可以在氢化发生之前很好地观察到清洁效果。不希望受理论束缚，据信，用于处理石墨烯的等离子体中的高能量的小原子可以在比对于石墨烯的化学反应性(如氢化)会需要的低得多的能量和/或短得多的时间尺度下容易地破坏或除去石墨烯表面的污染物。因此，通过使用较低的能量或较短的时间尺度用小原子等离子体对石墨烯的处理，可以在不改变石墨烯片的化学或物理组成的情况下完成有效的对石墨烯的去污染或清洁。
适宜地，该等离子体是氢、氦或氖等离子体。适宜地，该等离子体是惰性等离子体如氦或氖等离子体。适宜地，该等离子体是氖或氦等离子体。适宜地，该等离子体是氖等离子体。最适宜地，等离子体是氦等离子体。
氦等离子体适宜于根据本发明的石墨烯如石墨烯片的处理。氦等离子体适宜地与打击表面的离子一起使用，其能量高达21eV，更适宜地在1至21eV范围内，更适宜地1至14eV，更适宜地14.0eV以下，最适宜地5至10eV。
氢等离子体特别适宜于根据本发明的石墨烯如石墨烯片的处理。氢等 离子体适宜地与打击表面的离子或原子一起使用，其能量高达21eV，更适宜地在1至21eV范围，更适宜地1至14eV，更适宜地14.0eV以下。
氖等离子体可以用于处理根据本发明的石墨烯。当使用氖等离子体时，由于氖原子的较大的尺寸，较低的能量是更适宜的。在这方面，必须特别注意等离子体鞘电压和打击表面的离子的最终能量，使得在仍然保持氖处于等离子体状态的同时避免对石墨烯的损坏。
氩等离子体用于石墨烯的清洁的可能性小得多，除非是以非常低的能量和/或暴露时间，因为氩原子的大尺寸有对石墨烯晶格造成破坏的危险。
对于石墨烯的非破坏性清洁的能量选择
对于低能量离子和原子，在单碰撞中的最大发射能量Tmax为
其中m是等离子体中的离子/原子的质量。M是靶原子(在这种情况下是碳)的质量，并且E是等离子体中的离子/原子的能量。所以对于打击碳的氖，我们有
所以如果我们想要Tmax＜21eV，则打击石墨烯的表面的离子的能量应当是
或者对于Tmax＜14.1eV，则Emax＜13.1eV
然而，在等离子体中的粒子的实际能量将包含能量分布，其通常遵循玻尔兹曼统计(Boltzmann statistics)。此外，在接近表面的等离子体的边缘，通常有一个区域，其是电子耗尽的，称为等离子体鞘(plasma sheath)。该鞘包含能够将来自等离子体的离子以可观的能量(若干eV)加速进入样品表面的电场。所以为了确保最小的损坏或没有损坏，操作者应当适宜地选择等离子体温度(能量)和配置，使得打击石墨烯表面的原子和离子大大低于得自上文的Emax值；选择较低的能量具有以下优点：将有非常少的离子/原子处于能量分布的超过阈值Tmax的高能量尾部中。
因此，考虑到上述指导，技术人员可以根据本发明选择合适的能量和等离子配置。例如，当使用氖时，5-10eV会是最佳的。
可以对于其他原子(原子等离子体)如H、He、Ne、F、N进行类似的计算。最适宜地，在本发明中所用的等离子体是H、He或Ne。
对于本发明的清洁石墨烯的方面，适宜地，使用He、Ne和/或其他稀有气体-这些的优点是允许在不对石墨烯化学改性的情况下除去污染物(即清洁石墨烯)。
因此，对氖来说最适宜的等离子能量是5至10eV。
不希望受理论束缚，在本发明中，用于等离子体处理的原子的适宜性的主要考虑是打击石墨烯表面的原子(不是电子)物种的能量以及它们对石墨烯晶格化学改性的能力。特别地，较大的原子需要较大的能量以将它们保持在等离子体态。在这些较大的能量，存在超过对于从石墨烯片移除碳原子的阈值的风险。任何含有能量超过上述对于将碳原子从石墨烯片移除所需的水平的原子的等离子体都是不适宜用于本发明的。含有氧的等离子体也倾向于与晶格化学反应，因此将它转化成氧化石墨烯或将它完全破坏，两者都对本发明是不想要的，因此含有氧的等离子体不适宜用于本发明。
最适宜地，根据本发明的等离子体是氖或氦或氢等离子体。最适宜地，根据本发明的等离子体是氦或氢等离子体。优选将氢等离子体用于石墨烯的调制或氢化。优选将氢或氦或氖等离子体用于清洁石墨烯或从石墨烯除去杂质，最适宜地将氦等离子体用于清洁石墨烯或从石墨烯除去杂质。
为了清洁石墨烯或从石墨烯除去杂质，适宜地，使所述石墨烯与所述等离子体(如氢等离子体或氦等离子体或氖等离子体)接触1至30秒，优选1至10秒。
通过等离子体中有能量的物种与石墨烯表面上的污染物分子的化学反应，从而使它们挥发并使它们移除，来达到此清洁效果。
如下，认为‘干净的石墨烯’或‘清洁过的石墨烯’是干净的或清洁过的：
‘干净的’＝污染物的质量/单位面积＜石墨烯的质量/单位面积/100或污染物的表面积＜石墨烯的表面积/100；更适宜地‘清洁的’＝污染物的质量/单位面积＜石墨烯的质量/单位面积/1000或污染物的表面积＜石墨烯的表面积/1000。
氢化
可以通过本领域已知的任何适宜的方法完成石墨烯的氢化。最适宜地，通过用氢等离子体处理，完成氢化。然而，可以同样地通过使用离子束向石墨烯表面递送氢原子来完成它。关键教导是，以正确的能量水平，向石墨烯的表面施加氢离子或氢原子。
石墨烯晶体晶界
关于能量水平，根据本发明应当使用的最大能量水平是21电子伏(eV)。在超过21eV的能量水平，存在可能将碳原子从石墨烯晶格敲击出来的可能性。清楚地，这是高可能性的，因为它会破坏石墨烯的重要晶格结构。出于这一原因，21eV以下的打击晶格的原子或离子的能量是优选的。
单片的石墨烯经常由多个石墨烯晶体的拼凑组成。在这些晶体之间的晶界处，存在着称为“5-7缺陷”(有时称为“Stone-Wales缺陷”)的交替的键合排布。在5-7缺陷中的碳原子仍是sp2键合的，但是由于在键合图案中的这些边缘缺陷导致用于移除它们的能量低于上文规定的21eV。可以用15eV那么低的能量破坏这些边缘缺陷碳原子。因此，适宜地，根据本发明，有利地使用14eV(如14.0eV)以下的能量。当待处理的石墨烯的区域包括晶界时，这是特别有利的。
通常，较低能量等离子体可能更难以保持。因此，尽管为了避免石墨烯晶格中碳的破坏需要较低的能量水平，适宜地，能量水平在安全避免石墨烯晶格的破坏的同时尽可能高。这提供了更容易的管理/维持用于处理的等离子体的优点。这也提供了较短的暴露时间的优点。
适宜地，用于氢化的等离子体能量在1eV至14eV范围内。
适宜地，用于氢化的等离子体能量＜14eV。适宜地，用于氢化的等离子体能量在1eV至＜14eV范围内。
对于氢化，例如使用如下文所述的可商购的设备，适宜地，使所述石墨烯与氢等离子体接触11至165秒，适宜地11至120秒，适宜地11至80秒，适宜地11至40秒，适宜地15至25秒，适宜地18至22秒，最适 宜地20秒。这些值对于核糖体吸附是特别有利的；对于本申请，20秒是特别有利的，并且提供被研究的分子如核糖体的特别均匀的分布的特别的优点。
适宜地，所述石墨烯与氢等离子体接触10至40秒。
制造和维护等离子体对于技术人员来说是常规的，并且可以使用可商购的等离子体发生器完成。
不希望受理论束缚，低能量等离子体可以具有不同的密度，并且它们的几何以及对样品的电控制以及室壁以及发生方法可以强烈地影响每单位时间、每单位面积被电子或离子“打击”的数目，以及离子或电子的能量。这有时称为施加的(例如)氢的“剂量”。因此，等离子的密度或其他如上提到的因素可以影响每单位时间施加的氢的“剂量”。因此，对于给定的等离子体的密度，增加的暴露时间导致增加的剂量。如本文所教导的用等离子体的处理的时机提供了如说明的示例性施加。如果本领域技术人员使用不同密度能量或电的等离子体，调节所述时机从而达到如本文教导的氢化或清洁的水平完全是在他们的能力之内。如果需要任何另外的指导，可以简单地如本文所述估定或评估处理过的石墨烯(部分氢化的石墨烯)的氢化的水平(例如经由对石墨烯晶格参数中的变化的接触角测量或衍射测量)和调节为获得想要的氢化水平的“剂量”。
优点
本发明的关键优点是促进了生物分子如蛋白质向石墨烯上的吸附。换言之，本发明的优点是现在可以控制蛋白质向石墨烯表面上的沉积。
当制得部分氢化的石墨烯EM支持体后，正如任何其他石墨烯EM支持体一样处理和使用它。例如，可以通过标准机器人技术制备低温-EM样品。
部分氢化的石墨烯可以通过将石墨烯片部分氢化制造，或可以通过制备部分氢化的石墨烯并随后将它排布到支持体上来制造。以无论哪种方式制造这些典型地是操作者选择的问题。可能有利的是，制备一个或多个石墨烯支持体并且随后将它们氢化至所需的程度，从而避免可能在将部分氢化的石墨烯转移到支持体的横杆或壁或周缘上期间可能产生的污染的问 题。因此，在一个实施方案中，优选的是当石墨烯在EM支持体上存在时对其清洁或部分氢化。
我们教导使用氢化的石墨烯，以精确控制生物分子如蛋白质在冰中的分布。以此方式吸附的蛋白质保持它们的结构完整性，正如通过70S&80S核糖体的三维重构验证的(见实施例)。本发明使得可以系统地筛选用于蛋白质吸附的表面条件，并且致力于用于生物电子显微术的样品制备的最不受控制的方面。
此外，我们追踪冰中的核糖体，并且发现在根据本发明的部分氢化的石墨烯上，它们的束诱导的运动有利地降低接近五倍。用部分氢化的石墨烯支持体增强由冰包埋的粒子改善了生物电子显微术中的样品制备和图像质量两者。因此，我们说明了，用氢等离子体处理过的石墨烯通过基本上减少束诱导的运动改善了低温-EM图像。
本发明提供了减少样品运动的优点。本发明提供了增加的图像质量的优点。
其他应用
生物传感器是已知的，其包括栅极被设计为与流体接触的晶体管。这样的装置被配置为使得当感兴趣的粒子来到栅极附近时，改变晶体管的传导性质，允许读出信号。结合到传感器的(即检测到的)实体可以是任何感兴趣的小粒子，例如蛋白质、病毒粒子或任何其他感兴趣的小部分。
使用根据本发明的可调制的石墨烯如部分氢化的石墨烯，可以制备根据感兴趣的部分(例如蛋白质、病毒粒子或其他实体)是否结合而改变它的传导性质的晶体管型生物传感器。本发明提供的关键的益处是，使用对于在这样的晶体管型装置中的集成(integrating)来说理想的材料(石墨烯)，形成和/或调制用于粒子的特殊结合的表面的能力。
可以根据本发明制备用于分子如生物或化学分子的探测器(传感器)。例如，可以在传感器如生物传感器的制备中使用部分氢化的石墨烯，使用部分氢化的石墨烯作为感知元件，例如作为在纳米尺度场效应装置中作为感知平面元件。
可以使用半导体纳米线(描述于参考文献46-48)、碳纳米管(描述于参 考文献49)或石墨烯(描述于参考文献50-51)制造这样的装置。根据本发明，传感器(例如系统)中的感知元件包含部分氢化的石墨烯，如部分氢化的石墨烯的区域。这样的感知元件典型地构造为将与样品接触，使得当粒子分子结合至表面或结合至一个或多个结合到表面的分子时，部分氢化的石墨烯的电子学性质改变。随后可以从装置作为电信号读出该电子学特性的改变。例如，本发明可以涉及一种如在参考文献47中所述的探测单一病毒的装置，通过用本发明的部分氢化的石墨烯取代Patolsky的硅纳米线。
在另一个实施方案中，本发明提供用于癌症生物标记剂如Prostate SpecificAntigen(PSA)的传感器，在此针对标记剂的抗体结合至部分氢化的石墨烯。在此实施方案中，可以如在参考文献52中所述构建传感器，将本发明的部分氢化的石墨烯取代到传感器阵列的感知/传导性部分中，例如，通过用部分氢化的石墨烯替代或增大纳米线。
在另一个实施方案中，可以通过Calmodulin(例如如参考文献46中所述)探测Ca2+；在此实施方案中，可以将Calmodulin偶接至，如结合至部分氢化的石墨烯(替代或附加至参考文献52的纳米线)。
本领域技术人员使用根据本文提供的教导的部分氢化的石墨烯可以实施许多其他传感器。与已经在已知的生物传感器中使用的硅纳米线不同，石墨烯(例如根据本发明的部分氢化的石墨烯)提供了超常水平的电子灵敏性并且可以允许探测小分子到单个蛋白质的甚至是单一结合事件。部分氢化的石墨烯的使用允许对到基于石墨烯的传感器的生物分子吸附如蛋白质吸附的具体控制，从而使得能够进行大倍数的可能的探测策略。而且，因为本发明的方法(如等离子体过程)易于顺从在单一装置或芯片上的大规模制造，本发明使得能够制备多种这样的调制为检测特殊分子的传感器。
适宜地，本发明的传感器是生物传感器。
另一方面，本发明涉及一种传感器如生物传感器，其中传感器的感知元件包含部分氢化的石墨烯。适宜地，通过如上所述的方法获得部分氢化的石墨烯。
另一方面，本发明涉及一种传感器，所述传感器包含能够吸附生物分子的表面，其中所述表面包含部分氢化的石墨烯。
适宜地，所述石墨烯是0.01％至50％氢化的石墨烯。
适宜地，所述石墨烯是3％至10％氢化的石墨烯，优选5％氢化的石墨烯。
另一方面，本发明涉及包含如上所述的支持体的传感器。
本发明发现了在采用如本文所述制备的石墨烯的可调制的性质的这些和其他用途中的应用。关键优点是，发明人现在教导了控制亲水的分子(如蛋白质)向石墨烯表面上的吸附的方法，根据操作者选择，这可以用在任何数量的方式中。
石墨烯表面的调制
生物样品表示任何来自或源自生物体的样品。样品可以是粗制样品或纯化的或部分纯化的样品。样品可以是流体或体液，例如血液、血清、血浆、脑脊髓液、唾液、精液、尿液或任何其他体液。样品可以甚至包含完整的生物如细菌、病毒或其他微小的生物。样品可以包含来自生物的一个或多个细胞。样品可以包含从生物体中提取或纯化的一个或多个生物分子，如下文所述。
适宜地，该样品是体外样品。
生物分子表示由活的生物生产的分子，如蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质。适宜地，生物分子是蛋白质或蛋白质配合物。适宜地，生物分子是亲水的生物分子。蛋白质或其他生物分子向石墨烯表面的结合可以根据带电状态、结合的部分的亲水性/疏水性变化，或取决于主要的盐/缓冲剂/溶液条件变化。本发明的优点是现在可以通过调节表面的氢化的比例来调制石墨烯表面的亲水性。
适宜地，该生物分子是体外生物分子。
氢化值可以表示为％氢化。这表示转化成sp3H-键合的碳原子的sp2-键合的碳原子的比例。换言之，它是石墨烯中的碳原子的多大比例累积了相连的氢原子的量度。如果每个碳原子都是H-键合的，这会是100％氢饱和(石墨烷)；如果没有碳原子是H-键合的，这会是0％氢饱和(石墨烯)；本发明涉及大于0％且小于100％的值，即部分氢化的石墨烯。
可以使用本领域已知的任何适宜的方法测量氢化。用于评估氢化的示例性技术说明在实施例中。例如，可以通过如图1中所说明的，测量水- 石墨烯接触角，可以评估氢化。在这种情况下，20秒氢等离子体暴露时间对应于大约5％氢化；80秒氢等离子体暴露时间对应于大约20％氢化等。类似地，参照图3，20秒氢等离子体暴露(图3c)为大约5％氢化；40秒氢等离子体暴露(图3d)为大约10％氢化等。备选地，可以通过如下计算石墨烯-水界面能来评价氢化。
石墨烯-水界面能的计算
对于在气体环境中在固体表面上的液体液滴，液体-固体界面能W与通过Young-Dupré等式计算的在液滴与表面之间的平衡接触角有关：
W＝γw(1+cosθ)
其中γu是水表面张力，72mJ/m2，(参考文献44)。使用来自生长的石墨烯样品的接触角值(θgr＝91±1.7°)和来自对数据的指数拟合的饱和值(θgrh＝66±1.3°)，则由于氢等离子体处理导致的表面能的变化正是两个表面中的界面能的变化：
ΔW＝cosθgr-cosθgrh
其对于测量的值为-0.19±0.02eV/nm2。尽管铜基板的存在对于原生石墨烯来说可以导致测量的角度的小的减少45，但它对于用于计算界面能中的变化的角度变化具有可忽略的减少，因为基板将在全部测量中具有相同的效果。
备选地，可以测量晶格常数的变化(晶格中碳原子之间的平均距离)作为石墨烯的氢化的评价。这可以例如使用电子衍射完成，例如如参考本文图如图6所描述的那样进行。
出人意料地，低水平的氢化足以促进亲水的分子向部分氢化如0.1至20％氢化的石墨烯表面的吸附。
适宜地，本发明的部分氢化的石墨烯可以包含0.01至50％氢/碳；或可以含有0.01至10％氢/碳；或可以含有1至10％氢/碳；或可以含有3至10％氢/碳；或可以含有3至5％氢/碳。
图案化的石墨烯
有利地，可以在同一物理石墨烯片中的不同的空间位置(区域)处提供不同的氢化程度。这可以通过在氢化期间将片的不同区域遮蔽从而将一些区域氢化至较高程度且其他区域氢化至较低程度来完成。理想地，适宜的是制备在一端具有高氢化值的石墨烯EM支持体，并且在氢化过程期间抽回遮蔽物，使得同一石墨烯支持体的相反端具有低氢化值。以此方式，可以对于特别的意在沉积在石墨烯表面上的生物分子决定最佳的氢化值。这些具有可变的氢化的有梯度的石墨烯支持体特别用于对本发明的部分氢化的石墨烯的最佳氢化水平的标定或选择中。
在氢化期间的遮蔽可以通过任何本领域已知的适宜的方式完成。例如，可以使用在石墨烯附近的电极，其当它就位时将氢原子从石墨烯表面掩蔽或偏折开。可以经过特定的时间过程将这样的电极抽回跨过石墨烯表面(例如正在石墨烯表面上方)，使得首先暴露的石墨烯将享受最长的氢化处理(并且因此有最高的氢饱和程度)，并且被遮蔽最久的石墨烯的区域将享有最低的对氢的暴露(并且因此有最低的氢/碳值)。备选地，可以使用多于一个电极，以建立跨过石墨烯的场，使得碰撞在表面上的离子在电极附近比其他减缓得更多。因此，可以有利地得到跨过石墨烯基板的剂量上的渐变，而无需直接向石墨烯表面施加遮蔽材料。
任选地，可以使用定向的氢离子束，以对同一石墨烯片的不同区或区域施加变化量的氢化，以形成图案化的石墨烯。
在一个实施方案中，石墨烯上的不同区域(空间位置)被氢化至不同的水平或值。
在一个实施方案中，石墨烯可以从石墨烯上的第一位置处的第一氢化值均匀地渐变至在石墨烯上的第二位置处的第二氢化值。
适宜地，本发明的EM支持体不包含氧化石墨烯。
适宜地，本发明的EM支持体不包含石墨烷。
石墨烷不是石墨烯。石墨烷是完全氢化的碳片。石墨烷片中的碳每个键合一个氢。换言之，石墨烷中的碳氢比是1比1-每个存在的碳原子都具有相联系的氢原子。这是完全或彻底(100％)氢饱和。此物质是石墨烷。本发明关心部分氢化的石墨烯。部分氢化表示小于100％(即小于1比1)饱和的带有氢原子的碳原子。部分氢化的石墨烯包含没有键合氢原子或与氢原子联系的碳原子。因此，部分氢化应当具有它在本领域的普通意义。部分氢化的石墨烯具有至少一些与键合的氢原子联系的碳原子，但是并非它们全部都是。这是本发明所基于的此中间的部分氢化的石墨烯物质的出人意料的性质。
支持体构造
适宜地，该支持体是电子显微术支持体或传感器支持体如生物传感器支持体。最适宜地，支持体是电子显微术支持体。
电子显微术支持体是允许要被电子显微术检查的样品的托架进入和离开电子显微镜的设备。通过支持体的周缘壁或边缘或部件(如横杆)向支持体提供一定程度的机械强度。将待检查的样品安装到支持体上，在由支持体的周缘限定的区域内。典型地，将样品本身安装到被支持体承载的晶格或膜上。
支持体的晶格或膜部分典型地具有网眼或“有洞的膜”结构。在现有技术中，典型地用两个数字来描述这些膜，例如“2/1”-这表示一个箔，具有间距为一微米的两微米的孔隙或孔。类似地，指明2/4的箔具有间距为四微米的两微米的孔或孔隙等。
适宜地，所述支持部件是横杆。适宜地，所述支持体横杆排布成栅格。有时，EM支持体被称为EM栅格。
支持膜可以被称为支持体箔。
适宜地，石墨烯当安装到电子显微术支持体上时氢化。
适宜地，清洁过的石墨烯表面是安装在电子显微术支持体上的石墨烯的表面。
当描述石墨烯支持体用于电子显微术例如生物分子的电子显微术中时，这具有它在本领域中的普通含义。特别地，“用于”在EM中使用表示“适宜用于”EM中使用。在半导体科学领域中的实验石墨烯片并不“适宜用于”生物分子的EM，除非已经将它形成为真正可以用于该应用的排布。
适宜地，将支持体大小调节为用于EM应用。
调节为用于EM应用可以表示3mm直径的栅格。
适宜地，将支持体配置为接受薄层的玻璃状的冰。
适宜地，支持体是传导性的。
适宜地，支持体是，或适应于，操作性地连接至电控制设备，例如，在EM期间促进电荷消散。
适宜地，支持体适应于使得用于EM的机器人处理和/或机器人采样制备成为可能。
适宜地，支持体密封在真空室中。
适宜地，支持体密封在保护性环境中，例如为了促进传输或储存。
适宜地，为了在传输和/或处理期间的机械保护，封装支持体。
在一些实施方案中，支持体可以包含铝或不锈钢或钛。
适宜地，支持体包含钼、金、铜或镍中的一种以上。最适宜地，支持体包含金。
适宜地，支持体是不含硅氧烷的。
石墨烯片可以用于支持体的任一侧或同时两侧。
当支持体包含有洞的碳的层时，例如在金栅格上的有洞的碳的层，适宜地，向有洞的碳那侧施加石墨烯。
适宜地，支持体可以在支持体的周缘处包含一个以上机械标记，如切 口。这具有帮助支持体的定向的优点。
适宜地，支持体是QuantifoilTM栅格。
适宜地，支持体包含贯穿的支持膜。适宜地，该贯穿的支持体可以具有一个或多个孔。适宜地，该贯穿的支持体具有预先限定的孔尺寸。
适宜地，该支持膜安装在支持体本身的壁或边缘或横杆上。
孔可以是任何形状的。适宜地，孔可以是圆形的或方形的。
适宜地，孔可以以规则重复的图案排布。
适宜地，孔尺寸是通过操作者选择确定的。
适宜地，在一个或多个支持膜中所用的孔具有0.05-10um的尺寸。
最适宜地，当支持膜包含无定形碳时，所用的孔的尺寸在0.05-10um范围内。
适宜地，横杆宽度由操作者选择决定。
适宜地，支持膜是实心的、导电的薄膜。
适宜地，该支持膜为100-500埃厚。
适宜地，该支持膜包含无定形碳。
适宜地，该支持膜包含100-500埃厚的无定形碳支持膜层。
适宜地，该支持体可以包含在碳膜、自制的碳膜、或来自其他源的一个以上贯穿的膜中的不规则的孔。
适宜地，支持膜是碳膜。
最适宜地，支持体包含在300目金栅格上的有洞的碳支持膜，如由德国耶拿的Quantifoil Microtools GmbH制备的。
在后附的独立和从属权利要求中陈述了更加具体和优选的方面。当合适时，从属权利要求的特征可与独立权利要求的特征组合，并且与除了在权利要求中明白陈述的那些之外组合。
在将设备特征描述为可操作为提供一种功能的情况下，将理解的是，这包括提供那种功能或适应于或配置为提供那种功能的设备特征。
其他应用
通过部分氢化调制以与生物分子相互作用的石墨烯可以用于一系列应用中，包括基于石墨烯的传感器。
本发明在电子显微术(EM)如低温-EM中有特别的应用。本发明特别用于生物分子的电子显微术中。
本发明的方法可以用于精确地控制蛋白质在石墨烯表面如悬置的石墨烯表面上的分布。我们说明了它在使用单粒子电子低温-显微术的成像和三维重构中的利用。将理解的是，本发明的方法可以用于涉及石墨烯的其他生物应用。
根据本发明的制备的基于石墨烯的支持体(栅格)在如所述支持体的制造、销售和使用的行业中有应用。
本发明的方法在石墨烯制品的制备和/或清洁中有应用。
本发明在基于石墨烯的装置和传感器的制造中以及在如本文教导的以非破坏性的方式清洁石墨烯中有应用。本发明可以用于石墨烯传感器的阵列的制备中，所述石墨烯传感器的表面调制为与用于探测或分析的特别的蛋白质或生物分子相互作用。本发明提供直接的和高度可规模化的方式来完成它。
我们提供具体地将石墨烯表面调制为与蛋白质相互作用的能力。这表示，可以为了特别的应用设计依赖于石墨烯与蛋白质的相互作用的任何传感器或装置。
附图说明
现在将参照附图进一步描述本发明的实施方案，其中：
图1显示了在低能量氢等离子体处理后的石墨烯的特征。
图线显示了空气-水-石墨烯接触角对暴露时间，具有含有用于测量角度的光学显微镜的实例的插图。曲线是用1/56秒的速率常量对数据的指数拟合。在y中每个剂量处，误差条是3-5次测试的标准差，并且在x中，是暴露时间的估计精确度，±1秒。衍射图(b-d)：对于同一悬置的石墨烯样品的选区电子衍射图案：在等离子体暴露前(b)；之后20秒(c)；和之后40秒(d)。对于全部三张衍射图，箭头指向处的0-110反射，并且设置了比例尺。对于c&d，相对于b的晶格常数的变化小于测量中的误差，≈0.9％(图6)。
图2显示了悬置的石墨烯的电子显微图，在氢等离子体处理之前(a) 和之后(b)30秒。比例尺条为标称散焦(nominal defocus)为-2.0μm且计量为c中的图线显示在各完整显微图中的功率图谱(图7a-c)，在各显微图中对总的图像强度归一化，其中上方的黑色曲线是对于28± 厚的无定形碳，红色曲线(a)是等离子体之前的石墨烯(图像a)，且蓝色曲线(b)是等离子体之后的石墨烯(图像b)。
图3显示了在氢等离子体处理过的石墨烯上的核糖体。方格a-d显示了在80K的玻璃化的冰中的70S核糖体的电子显微图。方格a是用10s H等离子体计量处理过的标准Quantifoil栅格。方格b-d是被单层石墨烯覆盖并且分别用H等离子体处理10、20和40s的Quantifoil栅格。所有其他印迹和玻璃化冷冻条件对于全部四个样品是相同的。插图是从各个图像的选区放大，显示了粒子的典型分布。比例尺条对于主图像为且对于插图为
图4显示在等离子体处理过的石墨烯上的核糖体结构数据的分析。方格a显示了T.thermophilus 70S核糖体的电子密度图的3D透视图，其由三张石墨烯上的粒子的显微图重构至覆盖的带状图(ribbon diagram)是晶体结构对图的刚性体拟合。方格b是2061个核糖体相对于石墨烯基板(红点)和无定形碳基板(黑点)的等面积投影图(equalarea projection map)。图像c是通过在石墨烯上重构至的S.cerevisiae 80S核糖体的未锐化的电子密度图的切片。40S亚单位的模糊(箭头)是由于样品的保形异质性(conformational heterogeneity)；这个和非最优的在傅里叶空间中的取向的覆盖限制了图的分辨率。方格d是20050个80S核糖体在石墨烯上(红点)和无定形碳上(黑点)的取向的投影图。
图5显示了石墨烯基板上的蛋白质的减少的运动。被高能电子照射的在石墨烯上的冰中的蛋白质粒子显示两个清楚的运动的阶段。相对于时间(剂量)绘制80S核糖体从它的初始位置的平均位移，针对无定形碳基板(黑色\)和石墨烯基板(红色-)两者。每个点表示20050个粒子的RMS位移，所述粒子的位置在恒定电子束照射(300keV；)下使用五帧移动平均测量。对于拟合的点的误差条是名义的标准差，并且对于临界各端点的两个点的误差条是由拟合截距计算的(参见方法)。插图显示对于七个随机选择的粒子的单独的轨线，其中点表示粒子的初始和最终位置(水平和数值尺 度是相同的，各个轨线原点水平偏开)。
图6显示来自选区衍射图的方位角积分强度。图线是按方位角积分的在氢等离子体处理之前和之后80s取得的衍射图，用于测量晶格常数关于关于向石墨烷的转化的变化。用箭头示出的0-110峰位处的区别为 这对应于晶格常数-0.4％的移动。这小于样品与样品间测量的精度，所述精度受由于石墨烯膜在栅格上的拉伸导致的晶格常数的变化的限制(标准偏差＝0.9％)。
图7显示了碳基板的低剂量图像。方格a显示未处理的石墨烯，方格b是在30秒氢等离子体处理之后的与a相同的样品。方格c示出了厚的无定形碳，用于比较。插图是每个图像的功率图谱(FFT)，简化至(1024px)2，并且比例尺条都是方格d是在云母基板上的来自c的碳层的边缘的接触模式AFM形貌图像，其用于准确测量碳层的厚度(比例尺条为)。箭头(a)指向在云母基板上劈裂的碳层的边缘。方格e含有来自d的高度值的柱状图，利用高斯拟合确定厚度。较小的红色峰是云母基板的高度且较大的蓝色峰是无定形碳层上的高度，并且差别为
图8显示了冰中的核糖体的电子衍射图。方格a显示了来自在图3a中的悬置的冰的选区衍射图案，其中前两个在和处的对于非晶态冰的弥散的Debye-Scherrer环用箭头表示5。在中心的白色圆盘是主束障碍(stop)的阴影，该障碍是自制的线上铂球。方格b显示了对于在图3c中的悬置的石墨烯上的冰中的核糖体的衍射图案，其中指明了单层石墨烯的在处的0-110反射，并且对于全部三个衍射图设定了放大倍数。类似地，方格c显示了对于图3d在悬置的石墨烯上的冰中的核糖体的衍射图，指明了0-110峰。附加的衍射峰来自在薄膜表面上的小的污染的冰晶体，其在显微图中是可见的。对于各衍射图，相机长度是相同的，标称47cm。
图9显示了傅里叶壳相关系数。使用重构的电子密度图对70S(a)和80S(b)核糖体计算，所述电子密度图由两个随机的半数据组精修，保持在重构过程中各自独立(“黄金标准”)41。使用0.143判据47，对于使用3张显微图的来自2061个在石墨烯上的粒子的70S图的分辨率为来自石墨烯上的20,050个粒子的80S图的分辨率为并且随着运动修正(b，红色曲线)显示到的小改进。我们将这与使用同样数量的粒子的重构比较，所述粒子随机选自对相同的核糖体样品此前公布的数据组，其中在运动修正前分辨率为并且在运动修正后为(黑色曲线)3。
图10显示了通过70S核糖体电子密度图的76个切片的混合画(montage)。每个切片是厚且比例尺条为
具体实施方式
实施例
在此参考附图详细公开本发明的实例实施方案。将理解的是，本发明不限于公开的精确实例，并且本领域技术人员可以在不脱离如由后附权利要求和其等价物限定的本发明的范围的情况下完成各种改变和变化。
方法
石墨烯生长
通过在铜箔基板上化学气相沉积(CVD)生长石墨烯36，37。简要地，将～18cm2截面的25μm铜箔(Alfa Aesar#13382)安放在干燥抽气的CVD炉的25mm直径石英管中，抽真空至＜20毫托，并随后暴露至以20sccm流动的氢(99.999％)气的连续流，使反应管中的压力至500毫托。将炉温在热电偶控制下经过～15分钟的过程升高至1000℃。一旦达到所述温度，就在15分钟的持续时间内向反应室中加入另外的20sccm的甲烷(99.999％)，使总压力到达700毫托。在加入甲烷完成之后，关闭加热，并且在连续氢流下将反应管经过2小时的时间段缓慢冷却至环境温度。一旦冷却，将氢流停止，用干燥氮将室排气，并且将铜箔上的石墨烯从生长管移除，并直到使用为止储存在清洁、低湿度储存盒内部的临界地清洁的Fluorware晶片容器中。
接触角测量
为了测量石墨烯水接触角，使用定制的圆盘冲孔机从在铜箔上的石墨烯冲孔得到单独的3.2mm直径圆盘。首先通过将圆盘在CMOS级异丙醇(Sigma)中浸泡10秒将其清洁，随后在蒸发残余溶剂后，置于在商业等离 子体反应室(Fischione Model 1070)内的硝酸清洁过的载玻片上，在那里将栅格定位在从RF线圈的边缘起15±1em。氢源是高纯度的电解氢产生器(Dominik Hunter model 20HMD)。用于零时刻暴露剂量的对比物包括使用和不使用各种溶剂清洁处理的那些；我们发现，对于两者接触角是相同的，均在实验误差内。将各个圆盘安装在光学显微镜(Zeiss Axiophot)中，将18MOhm去离子水的1μL液滴涂敷并在撤去移液管尖端后立即(在5秒内)使用附接至显微镜的有标度的数码相机(Zeiss ERc5s)成像。我们测量了液滴蒸发速率(1.4nL/sec)，并且发现它在涂敷水和图像取得之间的延迟期间对角度的变化的贡献可以忽略(＜0.5°)。随后分析每个图像，以通过图形上测量基板面和液滴在它接触表面的点处的切线之间的角度来获得接触角。对于每个等离子体剂量进行此测量3-6次；随后通过图像中测得的液滴体积除以零等离子体剂量的值来归一化。我们发现，此归一化对于修正这样小容量移液中的误差是必须的。随后将多次测量平均，并且取标准差作为各剂量下角度的误差。最后，我们通过如下所述后续地将石墨烯转移至EM栅格并随后用电子显微镜对它们成像，确认了覆盖冲制的圆盘的石墨烯的存在。
石墨烯栅格制备
为了形成悬置的单层石墨烯EM栅格，我们使用基于一种首先由Regan等38描述并随后在参考文献30中进一步发展的方法。我们由通过以下步骤清洁商购的在300目金栅格上有洞的碳(Quantifoil Au 3001.2/1.3)开始：使用抗毛细镊子将它们各自在氯仿、丙酮和异丙醇中浸泡各～15秒(Sigma-Aldrich，超高纯半导体级溶剂)。我们发现，这有助于移除任何在制造后留在Quantifoil膜上的残留的光致抗蚀剂和大的表面污染物。在空气中印迹干燥后，我们随后将栅格安装在定制的在上述等离子体反应器内的不锈钢悬置支架中。将室抽真空至＜10-5托，并随后接纳质量比为9∶1的超高纯氩和氧(BOC 99.9999％)，到达21毫托的稳定态压力。将自动调制的RF等离子体在40瓦特(＜3W逆功率)打火，并施加特定的时间。随后立即将Quantifoil栅格用于石墨烯转移。为了用石墨烯单层覆盖Quantifoil栅格，使用定制的机械冲孔机从较大的箔切割在铜上的石墨烯的3.2mm 圆盘。将圆盘在丙酮和异丙醇(Sigma，CMOS级)中各浸泡10-15秒，并且在使用前印迹干燥。随后将用等离子体清洁的Quantifoil栅格用于圆盘，碳面朝下。使用光学显微镜(Zeiss Axiophot)检查栅格“夹心结构”，确保在下一步骤前栅格和圆盘两者是平的、没有粒状污染物、并且相互良好接触。随后向栅格顶部添加7uL的CMOS级异丙醇，并且允许液滴在空气中干燥。醇的后退的半月面拉扯Quantifoil的碳膜与石墨烯表面接触，这通过来自表面的反射光的颜色的变化验证。接着，在晶体盘中，将栅格-圆盘夹心结构在～50mL的缓冲FeCl3(Sigma)中漂浮20min。随后将栅格用烧过的Pt环转移至32％HCl(Sigma CMOS级)5min，随后10％HCl 5min，接着在18MOhm去离子水中3次漂洗。在最终的水步骤后，使用环将栅格转移至在酸洗过的玻璃皮氏培养皿中的一片滤纸(Whatmann#1)，并且在低湿度箱中保存直至使用。
氢处理的悬置的石墨烯的衍射研究
以以下方式，在氢等离子体暴露之前和之后，进行悬置的石墨烯的选区衍射研究：首先，如上所述，将CVD生长的石墨烯转移至预先清洁过的Quantifoil栅格。将栅格安装在已经用75％/25％Ar/O2等离子体在50W清洁了5min的单倾斜支架(FEI)上。在FEI TecnaiF30显微镜中，用300keV电子对栅格成像，所述显微镜的残余柱压力标称为88纳托(在最近的离子泵处测得)，并且具有围绕由液氮冷却的样品的防污染罩。在液体冷却的2Kx2K CCD相机(Tietz F224HD)上收集选区衍射图，使用的注量(fluence)，690mm的标称相机长度，1秒的暴露时间，和对应于样品处0.30μm2询问面积的10μm直径选区光圈。使用多晶铝薄膜的111至311晶格反射标定实际相机长度。在收集第一衍射图后，将样品从柱移出并且立即输送至密封的、仔细清洁过的容器，同时仍然安装在支架上，到等离子体室，在安装在支架上的同时暴露至氢等离子体，并且随后立即返回电子显微镜以收集第二数据组。在使用此转移过程重复实验期间，我们没有看到石墨烯样品的污染的证据。将最终衍射图反转成白底黑图，以提高打印时的对比度。
使用用氢等离子体处理过的石墨烯栅格的玻璃化冷冻和低温-电子显微术
将由V.Ramakrishnan lab提供的Thermus thermophilus 70S核糖体的冷冻原料33解冻，并且在5mM HEPES pH 7.5、50mM KCl、10mM NH4Cl、10mM MgOAc、6mM BME中稀释至70nM的浓度，始终保持在冰中。恰在使用前，用如上所述的纯氢等离子体处理石墨烯栅格指明的次数。将栅格放置在平衡至4℃和100％相对湿度的低温活塞(FEI Vitrobot IV)中；施加3μL的样品，允许其温育60秒，用力印迹-2秒20次，并随后插入恰在其熔点之上的液体乙烷中。随后将栅格储存在液氮中，直至将它们转移至FEI Polara电子显微镜用于成像。用300keV电子在非常低剂量条件下(在低放大模式下预暴露)，在23kX标称放大倍数，在～80-90K的温度，对玻璃化核糖体成像。暴露为1秒，在CMOS直接电子探测器(FEI back-thinned Falcon II)上，在那里标定的像素对应于样品上的
单粒子数据分析和模型拟合
使用利用半自动游动法(semiautomated swarm method)39的EMAN2’s boxer程序从三张显微图拾取2282个粒子。接着将粒子预处理，并提取在包括使用CTFFIND341CTF拟合的Relion40中的76x76像素盒中(尺度是 )。在用18个级别进行一轮2D分级后，弃去221个粒子，并将剩余的2061个粒子用于3D精修。在Relion中使用由来自参考文献33的晶体结构生成的初始模型进行3D精修，低通滤波至3D精修会聚在3.6°的估算的角精度和的分辨率。将最终的图低通滤波至指派给最终精修迭代(Relion中的旋转和倾斜)中成像的各个粒子的角度用于生成取向的图线。使用UCSF Chimera的刚性体拟合算法43，将从2WDK和2WDL的组合的PDB拟合成图。在Chimera中形成图和模型的3D透视图。
实施例1：石墨烯的氢化
在此实施例中，我们说明用于制备部分氢化的石墨烯的方法。
我们向石墨烯的表面施加氢离子或氢原子(在此实施例中通过氢等离 子体)。
氢等离子体以在1至21eV范围内的能量施加。
为了测量响应于氢化(在此实施例中通过氢等离子体)的石墨烯表面疏水性改变，我们测量了水、空气和原样的在铜基板上通过CVD生长的石墨烯之间的静态接触角。将1ul水滴涂敷至铜上的石墨烯，并且使用附接至数码相机的带刻度的光学显微镜成像(图1a插图)。对于后续不断增加的暴露至在50毫托并且具有估计为约10-15eV的能量(电子温度)的纯氢等离子体的剂量，重复各个测量，正如在方法中详述的。这些测量的结果示于图1a中。我们发现，随着1/56秒的速率常数，接触角指数地从91±1.7°的值下降至66±1.3°的饱和值。本征的石墨烯的91°的接触角(图1a)良好地处于对石墨烯的报道的宽范围27内，并且在60-80°范围内的接触角与典型地用于在无定形碳基板上的蛋白质沉积的那些4是相当的。
在低能量氢等离子体中的主要物种是H、H+、H2+、H3+以及自由电子 28。基于此事实和石墨烯的延长的氢等离子体处理将其完全转化成石墨烷的观察结果13，我们预期石墨烯与等离子体的主要化学反应是石墨烯晶格经由以下反应直接氢化。
sp2C+H<->sp3CH
为了监测基板晶格向石墨烷的转化，我们使用电子衍射测量晶格常数在等离子体暴露后的变化。结果示于图1b中。在80秒剂量的等离子体处理后，来自石墨烯晶格的0-110反射的峰宽化，并且轻微移向较低的频率(图6)。测量中的误差将精确性限制到约1％。基于此前对石墨烷形成的研究(其中当完全转化成石墨烷后晶格常数降低约5％13)，这对应于在80秒剂量后石墨烯中的碳-碳sp2键向sp3-H键转化的～10％的上限。此外，在等离子体处理之后的衍射图中的锐利的峰(图1c-d)表明保持了在下面的石墨烯晶格。有趣的是，甚至部分石墨烯晶格还原为石墨烷也引起疏水性的显著变化，并且使接触角的减小饱和。使用用于在气体中的液滴在固体表面上的接触角的Young-Dupré等式，我们可以使用上述的接触角测量计算由氢等离子体引起的水-石墨烯表面界面能的变化。结果是，接触角从对于原样的在铜上生长的石墨烯的91°移动到66°的饱和值，该移动对应于0.19±0.02eV/nm2的石墨烯-水界面能的减小。
实施例2：石墨烯清洁
在此实施例中，我们说明了小原子等离子体处理如氢等离子体处理除去石墨烯上的表面污染物。
特别地，我们示例了一种用于清洁石墨烯表面的方法，包括使所述石墨烯表面与氢等离子体接触。接触的时间是足以除去表面杂质的时间，如下所示。
我们研究了在等离子体处理之前和之后作为用于电子显微术的基板的石墨烯性质，并将它与无定形碳比较。随着转移至Quantifoil栅格，当用电子在典型的用于将蛋白质成像的条件下(300ke V，39000X放大)监测时，悬置的石墨烯示出显著的表面污染的量(图2a和图7a)。将石墨烯暴露至30秒的氢等离子体除去了表面污染的大部分(图2b和图7b)，但由于加入了氢和可能一些非挥发性污染物残余物，导致稍微增加图像中的背景信号水平(比较图2c中的红色和蓝色曲线)。与合理地薄的无定形层(图2c和图7c-e)相比，处理过的石墨烯晶格的背景信号是显著地较低的且没有特征的，不具有Thon环(图2c)。
我们注意到，氢等离子体除去或减少石墨烯上的表面污染，与它将石墨烯晶体本身改性相比快得多。这是因为烃污染物容易通过与有能量的等离子体的化学反应降解和挥发。因为石墨烯sp2键对化学改性高度抵抗，所以仅仅缓慢地通过在等离子体中的原子氢将它还原。重要地，在10-15eV的氢物种不具有在晶格中直接将碳原子从它们的sp2键(约21eV)移除碳原子的足够能量30-32，消除了作为可能的损害主体晶格的可能的机制的溅射。
实施例3：石墨烯表面的调制
在此实施例中，我们示出了通过根据本发明的石墨烯的部分氢化对蛋白质向石墨烯的吸附的控制。已经示出了可以控制石墨烯的疏水性，我们随后使用70S核糖体，测试用氢等离子体处理过的石墨烯作为用于低温-EM的基板。我们将单层石墨烯转移到Quantifoil EM栅格上，对它们施加各种氢等离子体的剂量，并且使用它们制备70S核糖体的玻璃化样品。 图3a示出了，在没有石墨烯的栅格上，在玻璃化的冰中可见到非常少的70S粒子，同时大部分是被吸引到Quantifoil碳的表面和孔的边缘(注意核糖体的环在孔的边缘)。利用用氢等离子体处理了10秒的石墨烯栅格，使用同样的冷冻和印迹条件，仅可见到小的玻璃化冰的碎片(图3b)。这表示石墨烯表面的不完全的润湿，并且与在此剂量下的接触角的小的改变一致(图1a)。在20秒的氢等离子体后，石墨烯表面更加均匀地润湿，并且大大提高冰的量，每张显微图有大约600个核糖体粒子(1.2μm直径孔，图3c)。此粒子密度(607个拾取的粒子/μm2)远远大于在没有石墨烯的栅格上(57拾取的粒子/μm2，比较图3a与3c)，说明70S核糖体吸附到石墨烯表面。不再存在围绕孔边缘的粒子的环，说明核糖体均匀地吸附至用氢处理过的石墨烯表面。等离子剂量进一步增加至40秒导致非常稠密填充的核糖体(大约1900个粒子/μm2，图3d)。对于在图3a、c和d中悬置的冰，在第一低剂量图像之后获得选区衍射图，以说明冰的玻璃质性质和验证石墨烯层的存在(图8)。总地来说，这些结果显示，在氢等离子体剂量和表面粒子密度之间存在单调关系，从而当保持其他条件均匀(印迹时间、湿度等)时，允许实验者使用石墨烯表面调制冰中的粒子分布。
实施例4：包含部分氢化的石墨烯的电子显微术支持体
如上所述制备用于接纳生物样品的电子显微术支持体。支持体包括支持横杆，并且包含附接至所述支持横杆的石墨烯，其特征在于所述石墨烯是部分氢化的石墨烯，如在上文方法部分所述。在此，我们说明此部分氢化的石墨烯作为用于低温-EM的基板的用途。为了验证吸附在石墨烯表面上的生物分子的结构完整性，我们从三张其中通过后续的电子衍射验证石墨烯支持体层的存在的显微图确定70S核糖体的三维结构，所述显微图包括图3c中示出的那一张。使用2061个从三张显微图拾取的粒子，我们获得分辨率的重构的电子密度图(图9a)，其是在图4a-c和图10中描绘的。我们使用刚性体拟合法拟合来自参考文献33的70S核糖体的晶体结构，并且发现它良好匹配模型，在分子中没有显著的畸变(图4d)。最后，我们使用在重构期间分配到各粒子的角度估计了核糖体在石墨烯基板上的取向性分布。使用Mollweide等面积投影，将结果绘制在图4中。尽管 核糖体在石墨烯上显示优选取向，但是取向分布与在辉光放电的无定形碳上在理想条件下获得的类似的数据(在图4b的投影图中以黑色显示)3相比良好。
实施例5-图像质量的改进
经常使用短距运动的经验模型来表征粒子图像中的不完美性。该模型使用高斯函数，以表征高分辨率信息的损失，其中凭经验确定的拟合参数(Debye-Waller热参数或B-因子)提供了图像质量的量度33。大量变量可能对B-因子有贡献，包括束诱导的粒子移动、试样带电、辐射损伤和样品异质性。尽管图像畸变和粒子运动的复杂性质还没有通过简单的高斯函数在数学上良好地建模，B-因子的变化对于表征给出的方法的改进仍是可用的。我们观察到在石墨烯上，相对于在无定形碳上，80S核糖体的B-因子降低了因此，可以预期石墨烯改进了任何粒子图像的信息含量。
为了研究改进的图像质量的起源，我们分析了对每张显微图收集的高速度帧捕捉数据。我们的80S数据是使用/帧的直接电子探测器用16帧获得的。使用五帧移动平均，我们追踪了在暴露期间每个核糖体的运动。我们计算了在每个数据组中对全部20050个粒子对每帧的全体平均，并且绘制图5中的轨线。80S粒子的束诱导的移动具有两个线性阶段，我们在图线中对它们分别拟合。直线的斜率是移动的速度，并且因为这一原因有时候可以将图5称为“速度图线”。每秒捕捉16张图像。在此实施例中，石墨烯经20s氢处理，并且对应于图3(c)中所用的材料。初始快速阶段的速度在根据本发明制备的石墨烯上为并且在无定形碳上为第二阶段的速度在根据本发明制备的石墨烯上为并且在无定形碳上为 (无定形碳是为了显示本发明的较佳性能的比较信息而包括的现有技术材料)。我们忽略了得自拟合的第一点和最后两点，因为它们是得自三帧和四帧平均，并且因此具有比指明的误差明显更大的误差。而且，对于第一帧计算的粒子的位置的零位移点的指派是有点任意的。真实初始粒子位置也可以取作得自对运动的第一阶段的拟合的y截距，并且会导致较低的总粒子位移的估计。
我们假定束诱导的粒子移动的第一阶段是由试样上的电荷和应力的复杂的初始积累导致的，其可以包括跨过受照射区域的大电场的积累以及在冰中由于辐解作用导致的密度变化(“充电阶段”)。相反，第二阶段的平稳态的速度很可能是被基板对于由束诱导的显然恒定的力的机械响应支配的(“机械响应阶段”)。对于两个阶段，对于石墨烯来说粒子速度都更小：在初始充电阶段减小～30％，并且在充电响应阶段减小五倍。这是引人注目和出人意料的，并且比发明人所预期的甚至更好。
我们在3D重构期间也使用新发展的运动修正算法3以修正粒子运动。我们发现，这没有显著改善石墨烯数据的图像，而同样的算法用于在无定形碳上的同样的样品的确导致重构的显著改善(图9b)。这与以下事实一致：根据本发明，我们已经减小了粒子的运动，所以运动修正的效果较小。
因此，我们示出了根据本发明的出色性能，并且是通过与现有技术直接比较。本发明在每张图像中提供了更多的信息。本发明在每张图像中提供了更大的分辨率。本发明在每张图像中提供了更多的信号。本发明允许粒子更容易地对准。因此，根据本发明提供了许多技术益处。
总结
在这些实施例中，我们说明了部分氢化(如使用低能量氢等离子体)可以非破坏性地对石墨烯疏水性改性，以允许生物分子的相互作用。即使每20个碳原子添加约一个氢原子，也引起疏水性的显著变化，并且引起蛋白质向表面的吸附(例如20s剂量，图3c)。为了理解界面能和接触角的饱和随着晶格的仅仅部分氢化的巨大改变，我们提出了以下模型。水-石墨烯界面能受水和非极性的石墨烯晶格之间的疏水相互作用支配。向晶格添加氢破坏了石墨烯表面附近水分子的秩序。每个氢的加入都降低界面能，直至氢之间的间隔变得与疏水表面附近水的配位长度尺度成为可比的。如果我们取氢键在水中的平均能量34在300K为那么我们测量的界面能的变化表示加入约0.90个氢键相当于对界面每nm2能量。此间距对应于水中疏水相互作用的长度尺度35，其以1.0±0.1nm的衰减常数指数衰减。这导致我们作出以下结论：氢等离子体处理主要通过加入破坏溶液中水分子的局域秩序的氢来使得石墨烯晶格亲水。
这些相同的氢也很可能通过提供用于分子向表面的氢键合的位点从而控制在石墨烯表面的蛋白质分布。在低温-EM中的主要问题是在薄层的玻璃质冰内的蛋白质的分布的精确控制。在印迹和玻璃化冷冻期间，蛋白质经常析出到空气/水界面或到碳支持体膜。我们示出，石墨烯晶格的部分氢化可以引起蛋白质从水溶液吸附，使得能够与低温-EM样品制备中的其他变量(湿度、印迹时间等)无关地控制粒子表面密度。通过调制它们的向石墨烯的吸附，我们除去了与蛋白质在空气/水界面的聚集和变性相关的问题。石墨烯在用于结构生物学的分辨率是有效地不可见的，并且它消除了与包括不可复制性、带电和增加的背景噪音在内的与无定形碳有关的问题。而且，我们示出了，低能量氢等离子体可以选择性地除去表面污染物，与它可以还原石墨烯晶体本身相比快得多。石墨烯，当用低能量氢等离子体处理时，是可重现的且可调制的用于吸附蛋白质的表面。
在低温-EM中的另一个主要问题是图像质量的下降，并且这通过以两种方式使用根据本发明的石墨烯基板来改善。第一，石墨烯在结构生物学所用的分辨率下是有效地不可见的，并且当使用它代替无定形碳时，它减少背景信号。第二，石墨烯减小束诱导的粒子运动，并且因此增加在各图像中的高分辨率结构信息。在石墨烯上成像的核糖体显示两个束诱导的运动的阶段，其两者都相对于典型的无定形碳基板显著减小。在初始“充电阶段”中～30％的减少很可能是由于石墨烯膜的高传导性减少了电荷在冰内和冰上的初始积累。并且在第二个“机械响应阶段”期间粒子速度的五倍减小可以通过石墨烯(1TPa)19，20与无定形碳(～50-200MPa)36相比增加的机械强度来解释，但也很可能是关于由于电荷积累的减少所导致的在样品中电诱导的应力的减少。阐明这些粒子运动的详细的动力学和背后的机制的进一步工作将是非常令人感兴趣的。从使得石墨烯经由部分氢化适宜与生物样品一起使用的由本发明作出的关键贡献，这些优点和其他优点都能得到。
基于此，本发明提供了从充满问题和缺乏实际成功预期的试错法现有技术改进的用于电子显微术的生物试样的制备，提供了调制有助于保持蛋白质的结构完整性和图像质量的表面条件的有系统的方法。
导致本发明的工作接受了来自欧盟第七框架计划(European Union′s SeventhFramework Programme)(FP7/2007-2013)下属的欧洲研究委员会/ERC赠款协议n°261151的资助。
参考文献
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Claims (11)

1.一种用于清洁石墨烯表面的方法，所述方法包括将所述石墨烯表面与氢等离子体或氦等离子体或氖等离子体接触足以在不改变所述石墨烯的化学或物理组成的情况下除去表面杂质的时间。
2.根据权利要求1的方法，其中所述等离子体处于在1至14eV范围内的能量。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述等离子体是氢等离子体。
4.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述等离子体是惰性等离子体。
5.根据权利要求4的方法，其中所述等离子体是氖等离子体。
6.根据权利要求5的方法，其中所述等离子体处于在5至10eV范围内的能量。
7.根据权利要求4的方法，其中所述等离子体是氦等离子体。
8.根据权利要求1至7至中任一项的方法，其中将所述石墨烯表面与所述等离子体接触1至30秒。
9.根据权利要求8的方法，其中将所述石墨烯表面与所述等离子体接触1至10秒。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述石墨烯是部分氢化的石墨烯。
11.通过根据权利要求1至10中任一项的方法获得的清洁过的石墨烯。
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