CN113891854A - 石墨烯官能化方法、设备和官能化石墨烯产品 - Google Patents

石墨烯官能化方法、设备和官能化石墨烯产品 Download PDF

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Abstract

提供了一种在基底上对石墨烯进行官能化的方法，所述方法包括以下步骤：将具有石墨烯层的基底暴露于包含氦气和至少一种官能化化合物的等离子体中；以及用于进行所述方法的设备和由所述方法形成的产品。

Description

石墨烯官能化方法、设备和官能化石墨烯产品
技术领域
本发明涉及一种使石墨烯官能化的方法，一种进行这种官能化的设备，以及一种具有这种官能化的产品，具体地但不排他地，涉及那些在电子显微镜领域的应用，特别是低温电子显微镜领域(也称为低温电子显微镜，cryoEM)。
背景技术
随着近年来的技术进步，任何纯化的生物分子复合物的原子分辨率结构原则上都可以通过单颗粒低温电子显微镜(cryoEM)来确定。在实践中，结构测定的主要障碍是制备适合高分辨率成像的冷冻样品。
通过cryoEM进行高分辨率结构研究需要将生物样品嵌入无定形水冰薄层中1,2。在制备和冷冻过程中，样品暴露于这种薄膜水的表面，因此在玻璃化之前与空气-水界面发生潜在的有害的相互作用1,3。覆盖在样品载体上的薄膜为样品提供了一个粘附的表面，可以改善上述相互作用4，但通常会带来背景噪音、成像过程中的移动、污化和标本-表面力不可控等问题。
单层石墨烯可以作为一种支持膜5,6,7,8。然而，原始的石墨烯，由于其疏水性，并不是制备cryoEM的合适基底。有报道介绍了用低能量等离子体进行部分氢化的方法，能在不破坏石墨烯晶格的前提下使其具有亲水性，使其适用于cryoEM8。
仍然需要用于cryoEM样品的改进载体或基底，以及制作它们的合适方法。
本发明是基于上述考虑而设计的。
发明内容
本发明的基本原理是：通过将石墨烯或氧化石墨烯薄膜官能化，调整其表面特性，满足其在电子显微镜或cryoEM领域的应用。此外，发明人发现，使用氦气等离子体作为官能化化合物的载体，可以提供相对温和的条件，避免在等离子体处理/官能化过程中对石墨烯的损害。
因此，本发明提供了一种新的用于电子显微镜(例如cryoEM)的多官能化样品载体，其可包括例如悬浮在超稳定的金质样品载体的表面的大晶体单层石墨烯或氧化石墨烯。使用低能量等离子体表面修饰系统，该载体的表面可以通过在单个网格上的石墨烯或氧化石墨烯层上图案化一系列的共价官能化来调整样品。这种载体设计减少了成像过程中的样品移动，提高了图像质量，并能够用最少的材料和数据进行高分辨率的结构测定。
因此，本发明还提供了用于实现上述官能化的设备，以及上述官能化的方法。
一方面，本发明提供了一种用于电子显微镜(例如低温电子显微镜)的基底上将石墨烯或氧化石墨烯进行官能化的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底暴露于包含氦气和至少一种官能化化合物的等离子体中。
另一方面，本发明提供了一种在用于电子显微镜(例如低温电子显微镜)的基底上将石墨烯或氧化石墨烯进行官能化的方法，该方法包括以下步骤：
(a)遮蔽具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底的一个区域；
(b)将未遮蔽的区域暴露于包含氦气和至少一种官能化化合物的等离子体中，形成官能化区域；
可选地，(c)揭开基底的遮蔽；
(d)重复步骤(a)至(c)，每次重复使用不同的官能化化合物，以形成具有石墨烯层的基底，每个区域具有不同的官能化。
因此，本发明的方法可包括如本文所定义的官能化，以及在电子显微镜(例如低温电子显微镜)中使用官能化的基底。
在所述的方法中，基底暴露于等离子体的时间可以通过使用固定在基底上的快门来控制，该快门可在基底暴露的打开位置和基底隐藏的关闭位置之间移动。这使得用户可以更好地控制曝光时间，从而控制官能化程度等因素。
在所述的方法中，所述的官能化化合物可以是选自以下通式(I)所示的化合物中的一个或多个；
Figure BDA0003378432880000021
其中R1和R2独立地选自H、卤素(例如-F、-Cl、-Br)、硫醇(-SH)、氨基(-NH2)、羧基(-COOH)和羟基苯基(-C6H4OH)；R1和R2不同时为H；n为1-10的整数。
在所述的方法中，所述的官能化化合物可选自戊胺、己酸、1-戊硫醇和4-戊基苯酚中的一个或多个。
所述的方法可进一步包括以下步骤：将具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底暴露于包含氢气的等离子体中，以实现石墨烯或氧化石墨烯层的氢化或部分氢化。这可以在石墨烯或氧化石墨烯的官能化之前或之后进行；以提供或补充石墨烯或氧化石墨烯层的亲水性。
在一些实施方案中，所述的基底是金质cryoEM网格。
本发明提供了一种用于实现所述方法的设备。
另一方面，本发明提供了一种用于石墨烯或氧化石墨烯官能化的设备；任选地通过本文所述的方法，所述的设备包括：
等离子体发生器；
与等离子体发生器相连的处理室；
基底支架，其被定位以固定用于电子显微镜的基底，例如所述电子显微镜优选为低温电子显微镜，所述基底支架具有石墨烯或氧化石墨烯层，并具有配置为在其中安装基底的安装区域；
注射器，用于将官能化化合物注入处理室中；
氦气源，用于向等离子体发生器提供氦气；并且
可选地，快门，所述快门可在开放位置和关闭位置之间移动，在所述开放位置中，基底支架的安装区暴露在处理室中，在所述关闭位置中，基底支架的安装区被遮蔽起来。
所述的设备可被配置为：在使用状态下，向等离子体发生器提供氦气，生成氦气等离子体，并向其中注入官能化化合物形成混合物，在处理室中由基底支架支撑的基底暴露于所述混合物。
在一些实施方案中，上述设备进一步包括掩膜，所述的掩膜用于掩盖基底的某一区域。这允许具有官能化的基板的更复杂的图案化。
所述的掩膜是可移动的，例如在处理室中存在等离子体的期间。这进一步提高了图案化的复杂性，例如，通过在特定方向上以特定的速度移动掩膜，产生官能化的“梯度”。
所述的掩膜可从设备的其余部分移除。这允许将其安装在设备其余部分之外的基底上，例如在更宽敞的环境中。
上述设备优选的配置方案为：当基底被固定在基底支架上时，掩膜不与基底的石墨烯或氧化石墨烯层接触。掩膜不会损坏基底。例如，上述设备可以被配置为，当基底被固定在基底支架上时，掩膜位于基底表面上方小于200μm的位置。
上述设备可进一步包括氢气源，所述的氢气源可以向等离子体发生器提供氢气。这允许所述设备可以对石墨烯或氧化石墨烯进行部分氢化，同时进行官能化。
上述设备可进一步包括开向处理室的视窗和紫外-可见光谱仪；所述紫外-可见光谱仪可分析从处理室通过视窗发出的辐射。
上述设备可进一步包括一种或多种官能化化合物源，每个所述的官能化化合物源与注射器相连，可用于向注射器提供官能化化合物。
上述设备可包括多个注射器，每个所述注射器与对应的官能化化合物源相连，可用于向各自的注射器提供官能化化合物。
所述注射器可为气体注射器。
本发明还提供了一种电子显微镜(例如低温电子显微镜)样品载体，包括：金属箔，例如金，基底；和基底上的官能化石墨烯或氧化石墨烯层；所述石墨烯或氧化石墨烯具有多种不同的官能化。所述石墨烯或氧化石墨烯也可以部分氢化。
除非明确不允许或明确避免这种组合，本发明包括所描述的方面和特征的组合。
附图说明
以下将参照附图讨论说明本发明原理的实施例和实验，其中：
图1为残余空气辉光放电和氦气等离子体对单层悬浮石墨烯的影响。
图2为与控制官能化石墨烯的润湿性和20S蛋白酶体的取向分布有关的实验数据。
图3为用无定形碳覆盖的网格方块进行电子显微镜排列的多官能石墨烯-金载体的TEM分析。
图4为己酸(图4(a))、1-戊硫醇(图4(b))、戊胺(图4(c))、4-戊基苯酚(图4(d))官能化的石墨烯上的30S核糖体摩尔威德投影方向分布图，均由氦气等离子体携带并在部分氢化之前，在部分氢化的石墨烯(图4(e))和无支撑的冰(图4(f))上。
图5为(a)石墨烯-金载体上的样品图；和(b)在玻璃体冰中带有30S核糖体的通过断层扫描重建官能化石墨烯覆盖的孔的垂直切片。冰的厚度为
Figure BDA0003378432880000041
仅比颗粒的大小略大。所有的颗粒都处于同一层。
图6为通过优化30S核糖体亚单位在官能化石墨烯上的取向分布而提高效率和分辨率的相关数据。
图7为石墨烯-金载体上的去铁蛋白的高分辨结构测定。图7(a)是戊胺官能化石墨烯上玻璃体冰中的去铁蛋白颗粒的代表性显微照片。比例尺为
Figure BDA0003378432880000042
图7(b)是图7(a)的运动校正后的显微照片的傅里叶变换。
图8为碳网格上无支撑的冰中和石墨烯-金上的去铁蛋白颗粒在辐照期间的均方根(RMS)位移。
图9说明了在石墨烯涂层的全金网格上生物样品移动的减少。绘制了分子量为2MDa的核糖体的均方根(RMS)位移与电子通量的关系曲线。
图10显示了纳米颗粒在石墨烯涂层的全金网格上的移动减少。
图11为(a)其上具有石墨烯层的金-金基底；(b)由悬浮石墨烯薄膜覆盖的网格方块；和(c)批量生产的石墨烯涂层的全金网格的示意图。
图12为(a)用于石墨烯共价官能化的电感耦合等离子体仪器的设计；(b)带槽的网格支架；(c)用于等离子体辅助官能化石墨烯网格图案化的非接触刀口掩膜设计；(d)纯氦气载体等离子体(黑色)并引入官能化的化学品蒸气；(e)化学修饰的官能化石墨烯的XPS光谱的示意图。
图13为(a)-(b)30S核糖体亚单位在摩尔威德投影上绘制的单个图案网格的两种不同的石墨烯官能化的取向分布；(c)-(f)被库仑静电势遮蔽的30S核糖体亚单位的表面。
图14包括(a)去铁蛋白的等高线密度图，显示了结构内部的氨基酸侧链；(b)去铁蛋白结构的傅里叶壳相关图(FSC)；(c)无载体的金纳米颗粒在冰中(较浅的圆圈)或在石墨烯上的冰中(较深的十字)在全金载体上的均方位移；(d)计算出的B因子作为去铁蛋白数据集的电子通量函数。
发明的详细说明
以下内容为参照附图讨论本发明的方面和实施方案。对于本领域的技术人员来说，进一步的方面和实施方案将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
石墨烯
石墨烯材料及其制备在本领域是众所周知的。已知的方法主要有“自上而下”或“自下而上”的合成，是通过从石墨上玻璃层或者沉积碳结构来合成石墨烯结构，例如化学气相沉积(CVD)法。
上述石墨烯层包括单层或多层石墨烯。例如，石墨烯层可以是单层石墨烯，也可以是由2-5片石墨烯结构组成的。
优选石墨烯是单层的。单层石墨烯在cryoEM的分辨率范围内接近不可见。
如本发明所述，官能化石墨烯层在基底上，而基底本身可能有孔，例如金网或网格上的带孔金箔。在这种情况下，所述石墨烯层中的石墨烯晶体优选每个都大于网状/网格的开口或方格。例如，每个石墨烯晶体的最小二维尺寸(不是厚度)至少为50μm左右。每个石墨烯晶体可以是六边形。
当基底上有孔时，石墨烯当然不是直接在这些孔的基底“顶部/上部”。在这种情况下，石墨烯可以被称为是悬浮的。也就是说，它在某些地方与基底接触，而在其他地方不接触，在基底有孔的地方，石墨烯层横跨该孔。
减少石墨烯层中石墨烯晶体的晶界的数量可能是有益的，例如，可以提高石墨烯层在官能化过程中(本发明所述)和cryoEM成像过程中的机械和化学稳定性。
本发明的方法、设备、用途和产品可以使用氧化石墨烯层替代石墨烯层。也就是说，本方法可用于使基底上的氧化石墨烯层官能化；本发明的产品可包括官能化的氧化石墨烯层，等等。所有针对石墨烯讨论的优选方案都可以适当地应用于氧化石墨烯的实施方案。
官能化
本文所述的石墨烯层是经过官能化的。发明人发现与这种官能化相关的许多优势。
由于原始石墨烯具有疏水性，不适合作为制备cryoEM样品的基底；之前的工作引入了低能量等离子体进行部分氢化，作为在不破坏其晶格的情况下使石墨烯具有亲水性的一种方式，使其适用于cryoEM。尽管如此，本发明人发现，部分氢化的石墨烯只提供单一类型的粘附表面，不适用于所有样品。通过引入和控制官能化，可以各种空间方向上支持一系列样品，大大提高了cryoEM分析过程的效率。
此外，了解纯化的蛋白质如何与其他定义明确定义的表面(如离子交换柱中存在的表面)相互作用，将有助于指导特定cryoEM样品所需的适当的官能化和缓冲条件。除了作为可调整的表面来改善cryoEM中的样品方向，官能化的石墨烯还提供了绘制和量化特定生物分子的相互作用表面的新方法。
官能化的石墨烯表面可用于在玻璃质冰薄膜内定向和分布生物分子，并且它们减少了样品的位移，提高了图像质量。
当在本文中讨论时，“官能化”石墨烯是指含有一个或多个除氢以外的化学基团与其结构共价键合的石墨烯。所述基团可被称为官能化。所述基团通常来自碳氢化合物，所述化合物中在链接/键合到石墨烯结构的位点上的氢原子已被移除。也就是说，官能化化合物通常是与所需的官能化相对应的，在石墨烯键合的位点具有-H。
当在本文中讨论时，所述的官能化化合物和与其对应的官能化并没有特别的限制，可以根据官能化石墨烯的预期效果和官能化化合物的蒸气压来进行选择。
在使用文本描述的所述的等离子体官能化技术的情况下，原则上可以用任何小分子化合物进行官能化，只要它有足够的蒸气压注入腔体。需要注意的是，在这里没有具体控制官能团的取向和长度，这意味着表面上可能会有混合的官能片段。也就是说，即使在使用单一官能化化合物的情况下，特定的官能化也可能不均匀。
如下表1列出了可能的官能化化合物，也可以预测到这些例子的变化。
表1：官能化化合物的和相应的典型官能化11
Figure BDA0003378432880000071
在表1中，与石墨烯结合的位置如下：
Figure BDA0003378432880000072
例如，官能化化合物是在一个或多个位置任选地被官能团取代，优选为活性官能团。
例如，官能化化合物可以是C1-10烷基，合适地C3-6或C5烷基，任选地被卤素(例如-F、-Cl、-Br)、硫醇(-SH)、氨基(-NH2)、羧酸(-COOH)或羟基苯基(-C6H4OH)基团中的一个或多个取代。所述化合物可为一种在25℃时蒸气压为0.01至50托的化合物。
实际上，可以通过加热或冷却化合物和/或注射系统，将化合物的蒸气压提高或降低到一个适当的水平。所述化合物和/或注射系统被冷却的合适温度范围是-60℃～+200℃。
在关注cryoEM的实施方案中，合适地官能化化合物包括具有与生物分子在体内可能遇到的氨基酸侧链性质类似的末端第一官能团的化合物。所述的官能团包括胺、硫醇、羧基、磷酸盐、糖和其他存在于细胞天然水环境中的官能团。所述化合物也可具有第二官能团，它可以与石墨烯反应形成SP3(共价)键。所述第二官能团也不太可能与第一官能团反应。所述第二官能团可为末端的。
上述两个官能团如果都存在的话，可以由一条烃链分开，优选饱和烃链，所述烃链将第一官能团与石墨烯表面分开，但在其他情况下不反应。上述链的长度受到蒸气压的限制，随着链的长度增加，蒸气压下降，最终变得非常低，甚至在加热条件下也无法注入腔室。因此，最佳的链长是可使其于石墨烯表面分离，同时使化合物的蒸气压在可注入等离子体室的合理范围内，。
官能化化合物可选自以下通式(I)所示化合物的一个或多个：
Figure BDA0003378432880000081
其中R1和R2各自独立地选自H、卤素(例如-F、-Cl、-Br)、硫醇(-SH)、氨基(-NH2)、羧酸(-COOH)和羟基苯基(-C6H4OH)；
R1和R2中的一个不为H；
n为1至10的整数。
在一些实施方案中，n为3至6的整数，例如5。
在一些实施方案中，R2为H，且R1选自卤素(例如-F，-Cl，-Br)、硫醇(-SH)、氨基(-NH2)、羧酸(-COOH)和羟基苯基(-C6H4OH)。
在一些实施方案中，R2为H。
在一些实施方案中，R1选自羧基或硫醇。在一些实施方案中，R1为硫醇。
在官能化石墨烯中，例如，石墨烯结构中0.001-10％的碳原子与官能化结合；也就是说，所述石墨烯可为0.001-10％的官能化，例如0.1-1％的官能化。
官能化的密度可为每平方纳米的石墨烯约有0.5-5个官能化，例如1-2个。
优选使用含活性基团的化合物，如含硫醇的化合物进行官能化，因为硫醇基团可以很容易地发生进一步反应，将更复杂的结构连接到官能化的石墨烯。例如，可使用上述的短柔性烃链将某些配体或已知的键合基团连接到石墨烯表面。
结构上具有共价键合的氢的石墨烯可被称为氢化石墨烯。一般来说，不是每个位点都与氢键合，因此所述氢化是部分氢化。部分氢化的石墨烯在本领域中是已知的。本发明所述的石墨烯的部分氢化，是指将石墨烯结构中约0.001-10％的碳原子与氢键合；也就是说，石墨烯可以是0.001-10％的氢化，例如0.1-1％的氢化。
在某些情况下，部分氢化是优选的。部分氢化的石墨烯比原始石墨烯更具亲水性。上述亲水性行为可能是最优选。因此，如果石墨烯至少有一种非亲水性官能化(即疏水性)，可能优选还具有部分氢化。
例如，所述石墨烯的官能化源自羧基或硫醇时，所述石墨烯通常是疏水的，因此部分氢化可以促使官能化石墨烯具有亲水性。
上述亲水性石墨烯在cryoEM领域分析水中样品时特别有用。
官能化石墨烯可有一种或多种类型的官能化，也可任选地被部分氢化。具有一种以上类型的官能化石墨烯可被称为多官能或多官能化。官能化的石墨烯也可部分氢化或不部分氢化。
例如，官能化的石墨烯可以被一个或多个(或正好一个)、两个或多个(或正好两个)、三个或多个(或正好三个)或四个或多个(或正好四个)官能化进行官能化。所述官能化选自上述表1所列的官能化。
将官能化石墨烯分为若干分区或区域可能是优选的，每个分区或区域都有不同级别、类型或官能化的组合。这样，例如，具有官能化石墨烯层的单个基底就可以通过在不同区域适当选择不同的官能化和氢化用于“固定”各种配置的生物样品。
例如，具有石墨烯层的基底可分为四个分区或区域，具有第一级别和类型的官能化和(部分)氢化的第一分区；具有第二级别和类型的官能化和(部分)氢化的第二分区；具有第三级别和类型的官能化和(部分)氢化的第三分区；以及具有第四级别和类型的官能化和(部分)氢化的第四分区。
应当理解，在这样的区域布置中，所有上述的官能化和氢化的选择和可能性在每个独立区域或在整体的官能化石墨烯上仍然适用。
上述多官能化，特别是分区官能化是有益的，这意味着网格上的每个方格都有独特的官能化和表面特性或连接剂化学是可能的。例如，可以在单个网格上同时测试同一生物样品的多种条件。
基底
一方面，本发明涉及具有官能化石墨烯(或氧化石墨烯)层的基底，例如，含上述官能化石墨烯(或氧化石墨烯)层的金属，特别是金基底。所述官能化石墨烯(或氧化石墨烯)层及其官能化可以变化，对基底没有特别的限制。
【此处，“载体”一词是指基底+石墨烯层的组合；在一些实施方案中，是指放置cryoEM分析的样品的物品。】
在本发明的实施方案中，基底可为金属制品，所述金属可为镍、铜或金，所述金属制品可为金属箔。优选为金基的基底。
如本文所述，可特别优选用于支撑cryoEM样品的已知基底。本领域中已有实例，但本文描述的是金基基底。所述金基基底因其稳定性10、结构完整性和拉伸强度而受到青睐，并且它们在低温下也能为石墨烯提供良好的电接触。
上述基底可以是“金-金”或“全金”类型。所述基底包括金网，形状任意(但通常是平的)，例如圆盘或方形板。每个这样的网可为直径为1-5mm的圆盘，或边长为1-5mm的板。例如网可为100-500线/英寸。所述网具有一系列，例如，约为正方形或六边形的开口。所述网可被称为“网格”。
金网的顶部进一步为金箔(因此术语为金-金)。金箔本身横跨网的每个开口。金箔内本身有孔，每个孔的尺寸为1μm或更小，例如直径为0.01-0.5μm。所述箔片很薄，例如厚度为
Figure BDA0003378432880000101
上述基底在本领域是众所周知的。本发明在金箔上面或下面增加了一层官能化石墨烯或氧化石墨烯，可以将用于cryoEM分析的样品放在上面。
如图11所说明的实施例。在(a)部分中，结果表明，金加金基底包括一个3mm的金网盘(“Au网格”)，所述金网为300线/英寸，并且含规则亚微米孔阵列的a约为
Figure BDA0003378432880000102
厚的金箔(“Au foil”)，悬浮在网盘的方形开口处。石墨烯层(这里是单层)被沉积在金箔的顶部，覆盖所有的孔(“hole”)。如本发明所述，石墨烯可以通过暴露在含有烃前体分子(“石墨烯”，点代表不同的官能团)的低能量氦气等离子体中而被共价官能化。样品(用于cryoEM分析的材料)应用于网格的石墨烯一侧并且被玻璃化，从而形成可以通过孔成像的连续的冰层。
图11的(b)部分显示了网格方块是如何被悬浮的石墨烯薄膜覆盖(二次电子显微镜照片)。比例尺为10μm。图片显示一个完全覆盖的孔(上部)和一个有破损石墨烯的孔(下部)，均放大了5倍(比例尺是1μm)。如图11(c)所示，单个生长和转移批次产生了超过150个覆盖率>95％的石墨烯涂层的全金网格(比例尺为10mm)。
官能化方法和设备
发明人开发了一种制备具有官能化石墨烯(或氧化石墨烯)层的基底的方法，以及用于进行所述方法的设备。基底、石墨烯和官能化如本文所述。
特别地，发明人发现，使用氦气(惰性且原子序数低)作为远程等离子体发生器的主要等离子体气体，在石墨烯和化学前体(官能化化合物)之间发生化学反应时可以防止溅射损伤和石墨烯的其他变化。这与传统的用于cryoEM的残余空气辉光放电系统形成对比，后者产生足够的能量的等离子体，即使短时间曝光也能破坏悬浮的单层石墨烯。
上述情况在图1中得到了证明。图1说明了残余空气辉光放电和氦气等离子体对单层悬浮石墨烯的影响。该图显示，石墨烯涂层全金网格在暴露于残余空气辉光放电45秒(负偏压，PELCO easiGlow中0.3托下，15mA，)(图1(a))；暴露于低功率氦气等离子体45秒(9W正向功率，Fischione 1070中1托)(图1(b))；以及暴露于相同氦气等离子体4500秒(图1(c))之后的扫描电子显微图。比例尺为10μm。
在曝光过程中，网格被非接触式的刀锋状半掩膜覆盖，掩膜边缘的大致位置用虚线表示。暴露在辉光放电的石墨烯被破坏，金箔上未被覆盖的孔呈现黑色(见图1(a)，右)。即使曝光时间比典型官化时间长100倍以上，氦气等离子体也不影响石墨烯薄膜的结构完整性。在图1(a)中，中间的方块上可以看到掩膜边缘的阴影，表明这种掩膜方法的图案化分辨率<50μm。该图显示了方形区域的5倍放大图。该图的比例尺是2μm。
因此，发明人确定了氦(He)作为石墨烯官能化化合物的优良等离子体载体，特别是在用于cryoEM基底的石墨烯层的官能化。所述等离子体不损坏石墨烯层或不与石墨烯层发生反应，同时又有足够高的能量来实现官能化化合物的官能化，所以相对温和，
单独的官能化化合物的等离子体过于激烈，有可能破坏石墨烯层的完整性，甚至可能替代所需的官能化。此外，使用这种等离子体会使聚合物副产物沉积在反应室中(取决于存在的官能化化合物)。同样地，氢气等离子体可与石墨烯层发生反应，使其氢化，因此氢气等离子体也不适合。
因此，在本文所述的官能化处理中，优选氦气为主要的等离子体成分。也就是说，用于处理基底上的石墨烯层的气体氛围可为50％及以上、60％及以上、70％及以上、80％及以上、90％及以上或95及以上的氦气等离子体。
用于该官能化处理的等离子体的功率可以是，例如，0.1-100W，例如1-20W或5-15W。
其余成分可包括，例如，影响部分氢化的氢气等离子体和所述官能化化合物中的一种或多种。所述化合物可为蒸气、气体或等离子体形式。在这种情况下，氦气等离子体有效地稀释了其他反应性成分。
处理时间和条件可根据所需的官能化级别进行适当选择。例如，暴露于官能化等离子体(He等离子体+一种或多种官能化化合物)的时间为10-60秒可能是合适的。
对于部分氢化，可以使用氢气等离子体8。氢气等离子体可以单独使用或与氦气等离子体结合使用。同样，处理时间和条件可根据所需的氢化等级进行适当选择。例如，要使石墨烯层具有亲水性，暴露于氢气等离子体的时间为30-300秒，例如150-210秒，可能是合适的。
典型的等离子体压力可为0.1-10托，又可为0.5-1托。这适用于本文所述的任何等离子体，也可根据所使用的等离子体和添加的官能化化合物、预期的石墨烯层的效果等来选择合适的压力。
这种含氢气等离子体的氢化处理可以在使用氦气等离子体和官能化化合物的官能化处理之前或之后进行。在一些实施方案中，其在氦气等离子体处理之前进行的。
发明人发现，通过选择性地遮蔽和暴露基底的区域，容易实现多重官能化，并能准确控制不同的官能化区域。在用等离子体进行特定处理之前对某一区域进行遮蔽，未被遮蔽的区域会受到影响。随后去掉掩膜，即对于未遮蔽的基底进行不同的遮蔽，并用等离子体进行不同的处理。可以使用相同或不同的掩膜。另外，还可以在前一个掩膜上再加一个掩膜，然后用等离子体进行不同的处理，根据所用掩膜的顺序进行不同的处理。
另一种可能性是掩膜在官能化过程中是可移动的。根据掩膜的设计，这可允许在限制的区域或图案中进行特定的官能化(例如，掩膜实际上是一个穿过基底移动的孔，则选择性地暴露出基底上的路径来进行官能化)。这使得能够在基底上“写入”一个或多个官能化的一个或多个路径或图案。
在官能化过程中，在基底上移动的其他掩膜形状可以使基底上的官能化形成渐进的变化。最初被掩膜覆盖的区域比暴露时间较短的区域暴露于官能化处理中的时间更久，从而形成官能化程度的梯度。由此很容易想到类似的其他变化。
在整个官能化处理过程中，掩膜的移动可以连续进行；或者，掩膜的移动可以逐步进行，获得更明显的官能化变化。
因此，本文描述了一种在基底上将悬浮石墨烯或氧化石墨烯进行官能化的方法，该方法包括以下步骤：(a)遮蔽具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底的一个区域；(b)将未掩蔽的区域暴露于包含氦气和至少一种官能化化合物的等离子体中，形成官能化区域；(c)改变基底的掩蔽，例如通过移动、添加或更换掩膜。步骤(c)可以在步骤(b)完成期间或之后进行。进一步地，可以用不同的官能化化合物重复步骤(b)。
通过重复上述方法，根据需要使用简单或复杂的掩膜，可以用不同的官能化和/或氢化构建一系列所需的区域。多次曝光允许具有多种官能化的同一区域的多轴图案化和连续图案化。
上述相同的图案化方法也使直接将，例如非晶碳，蒸发到例如基底中心100μm直径的区域上。这可能有助于在高分辨率数据收集前在多官能化网格上进行污化处理(stigmation)和慧差排列(coma alignments)。
掩膜本身可具有任何为实现目标遮蔽效果而选择的形状。例如，掩膜可为覆盖了基底的50％的半掩膜，例如一个完整的半面。一个掩膜可以使用、移除、然后改变方向重新应用；或者使用一个新的或不同形状的掩膜。
掩膜可包含至少一个“刀锋”，也就是说，掩膜从主要厚度锐化到其边缘逐渐变薄的厚度。所述刀锋位置对应于基底上或上方的边缘。图12(c)为示例。
所述掩膜可略高于基底表面，例如高于基底表面的距离约为小于200μm，又例如约20-100μm。距离越大，等离子体处理的边界就越不明确，因此，可以增加从基底到掩膜的距离，从而获得更平滑的表面图案过渡或梯度官能化。当然，如果需要处理区和非处理区之间有边界更清晰，也可以减小距离。
在典型的等离子体工艺压力约1托下，且掩膜到表面的距离为约为50μm；这种图案化方法的分辨率约为50μm或1个方格。
所述掩膜在使用时最好不与基底上的石墨烯层接触，将损坏风险降到最低。
所述掩膜的形式可为平板、含有一系列孔或设计或以其他方式在掩膜上做了图案。使用时，所述的孔位于基底上提供目标遮蔽图案。所述的孔部分或全部含有刀锋。
例如，如图12(b)和(c)所示，含有10个半月形(半圆形)孔的掩膜，为10个圆盘形基底提供了10个半遮蔽。
图12为用低能量氦气等离子体进行共价石墨烯官能化和图案化的示意图。图12(a)为用于石墨烯共价官能化的电感耦合等离子体仪器的设计示意图。图12(b)为带槽的网格支架在单个掩膜板下精准定位多达10个网格。曝光时间由可伸缩的快门控制，而不依赖等离子体室中建立稳定的反应条件。图12(c)为用于通过等离子体辅助官能化的石墨烯网格的图案化的非接触的刀锋掩膜设计的设计图。掩膜的形状可为任意形状。图12(d)为纯氦气载体等离子体(最低光谱)和引入化学品蒸气的官能化的光谱图。氦的光谱线是饱和的以使其它峰可见，对应于来自前体的原子种类。656纳米处的Hα谱线可用于实时监测碳氢化合物前体的分解。图12(e)为化学修饰的官能化石墨烯的XPS光谱图。
图12(a)的合适的官能化设备可进一步描述如下。在最广泛的意义上，所述设备包括等离子体发生器；与等离子体发生器相连的处理室(“等离子室”)；基底支架(“网格支架”)，其被定位成将其上具有石墨烯层的基底保持在处理室内，并且具有配置为在其中安装基底的安装区域；注射器(“气体注射歧管”)，用于将官能化化合物注入处理室；以及氦气源，用于向等离子体发生器供应氦气。本发明还提供了一种上述设备(如本文所述)在石墨烯(或氧化石墨烯)官能化中的应用，优选为本文所述的基底或如本文所述的载体上的石墨烯(或氧化石墨烯)层的官能化。
因此，本文描述了用于官能化石墨烯的设备的应用，所述设备包括：等离子体发生器；与等离子体发生器相连的处理室；基底支架，其被定位以将其上具有石墨烯层的基底保持在处理室内，并且具有配置为在其中安装基底的安装区域；注射器，用于将官能化化合物注入处理室；以及氦气源，用于向等离子体发生器供应氦气。
所述设备被配置为：在使用中，氦气进入等离子体发生器，在处理室中形成氦气等离子体；官能化化合物被注入处理室，由基底支架固定的基底上的石墨烯层被官能化。
所述设备也可包括其他不同的特征。例如，在适当情况下，所述设备可包括氢气源，用于向等离子体发生器提供氢气。所述氢气源可以与等离子体发生器相连，所述氢气可通过与来自氦气源的氦气同样的途径进入处理室，或者，可配置有各自的流入点。所述氢气或氦气源各自可用质量流量控制器(“MFC”)来控制。
优选地，所述设备可任选地进一步包括氧气源，用于向等离子体发生器提供氧气。这可用于产生氧气等离子体以在官能化处理间隔期清洁处理室和设备。理想情况下，当氧气被供应给等离子体发生器时，基底不在处理室中。
所述氧气源可与等离子体发生器相连，所述氧气与来自氦气源的氦气和/或来自氢气源的氢气(如果有的话)通过相同的途径进入；或者，可配置有各自的流入点。所述的氧气源各自可用质量流量控制器(“MFC”)来控制。
所述等离子体发生器可为，例如，已知类型的电感耦合等离子体发生器，例如，射频等离子体发生器。所述注射器可为，例如，气体注射器，或其他适合于待注入的官能化化合物类型的注射器。
所述设备可被配置为注入多种不同的官能化化合物。所述设备可包括每个官能化化合物源。每个官能化化合物源可以使用共同的注射器，也可以各自分别配备注射器进入处理室。如果使用共同的注射器，每个官能化化合物源可配备一个控制装置来调整官能化化合物流向所述共同的注射器。上述设备可以很好地控制各种官能化化合物的流量，从而实现官能化。
在本文所述的方法、设备和应用中，进入处理室或进入等离子体的每种官能化化合物的合适流速可为1-1000sccm，优选10-100sccm。
也就是说，在0℃和100kPa的条件下，每种官能化化合物的流速可为1-1000cm3/min，可选地10-100cm3/min，即0.1667cm3/s-16.667cm3/s，可选地0.1667cm3/s-1.667cm3/s。
所述设备可包括紫外-可见光谱仪，通过视窗(例如蓝宝石视窗)可观察处理室。这样可以监测处理室中的等离子体状况。
所述处理室也可包括已知的特征，如闸阀和排气，例如泵驱动排气。等离子体室的排气可用“蝶阀”或蝶阀类似装置来限制泵的速度，并控制等离子体(处理室)的压力不受输入气体流速和成分的影响。该设备和/或排气系统还可包括实时的压力反馈回路，用于控制排气流速独立于输入流速。也就是说，根据进入处理室的等离子体源(氦气和/或氢气，或氧气)和官能化化合物源的流速，排气流速可以自动增大或减小，以保持处理室的理想压力。
所述设备还可包括快门，可相对于基底支架的安装区域在开放位置(基底支架安装区域暴露于处理时)和关闭位置(基底支架的安装区域被遮蔽)之间移动。图12(b)为所述快门的一个示例。
也就是说，所述快门本身可以被移动从而暴露或遮蔽基底支架的安装区域，或者基底支架本身可以被移动用于实现同样的暴露和遮蔽。快门和/或基底支架的所述移动可以从处理室外部控制。
如本文所述，所述基底支架本身可容纳多个基底。例如，图12(b)中的示例为容纳10个基底。基底支架本身可包括用于接收基底的部分(安装区域)，用于接收掩膜的部分，以及用于接收快门装置的部分。当然，基底支架可以与快门、和/或本文所述的掩膜一体形成。
当快门关闭，安装区域(以及因此基底或基底的部分或全部)被遮蔽，被遮蔽的基底不能再受到等离子体气氛的影响。通过有控制地打开快门，露出一个或多个基底(即部分或完全露出或暴露安装区域)，在露出部分的官能化或氢化可以按需要开始进行。上述操作使得官能化或其他等离子体处理的时间可以得到精确控制。例如，某些基底可以比其他基底暴露更长的时间。上述操作为快速创建若干具有不同官能化或氢化程度或类型的基底提供了进一步的选择。
所述设备本身可以包括一个或多个如本文所述的预制掩膜。在这种情况下，只需将基底装入基底支架或基底安装区域中，然后将设备的掩膜，和可选地快门，应用于所述基底和基底支架中以便在处理室中使用。
在所述设备包括掩膜的情况下，所述设备可进一步包括在官能化处理期间或在官能化处理间隔期移动掩膜的装置。
***
在前面的描述中，或以下权利要求中，或在附图中公开的特征以其特定形式、或进行所述官能化时使用的方法、或为获得目标产品的使用的方法或过程，可视情况而定，可单独或以此特征的任意组合，用于以多种形式实现本发明。
虽然本发明已经结合上述的示例进行了说明，但对于本领域的技术人员来说，根据本公开的内容，许多等同的修改和调整是显而易见的。因此，上述的本发明的示例性实施方案是说明性的而不是限制性的。在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对所述的实施方案进行各种调整。
本文提供的所有理论解释都是为了为避免疑问提高读者的理解。发明人不希望受任何上述理论解释的限制。
本文中的所有章节标题仅用于组织，不是对发明内容的主题限制。
在本说明书中和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括”和“包含”，以及“包括”和“包含”的变体，是指包括规定的整数或步骤或者整数组或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数组或步骤组。
必须注意的是，在说明书和权利要求书中，“一”和“该”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。范围在本文中可表述为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。同样，当数值表示近似值时，通过使用前置词“约”，可以理解为该特定值构成了另一个实施方案。与数值有关的术语“约”是可选的，并且意味着例如+/-10％。
实施例
在所有实施例中，使用如本文所述的具有石墨烯层的基底。用来进行官能化的基底为孔径为800纳米的全金载体或基底(超金箔R 0.6/1,300-目,定量箔)，基底上有单层石墨烯层。所述载体或基底也可以被称为网格。
含这种具有石墨烯层的基底的支架可以通过本领域现有的技术来制备，例如通过石墨烯在铜箔上的CVD生长，然后将石墨烯层转移到金基底上。
实施例1石墨烯的官能化
(a)使用低能量的氦气载体等离子体的共价官能化
等离子体处理是在改进的商业等离子体净化器(Fischione 1070)中进行的，该净化器配置有定制的网格和掩膜支架、定制的气体注入系统以及连接到紫外-可见光谱仪(Thorlabs)的定制光纤耦合蓝宝石视窗。上述改进的仪器属于本发明，大致如图12(a)所示。
真空室用涡轮泵抽空到<10-5托。以28sccm的流速和5x 10-1托的典型压力产生N6.0级氦气载体等离子。18MHz的射频线圈运行条件为40％的功率，通常产生9W的正向功率和0.6W的反向功率。
用于官能化的化学品的蒸气是通过真空的五通道歧管引入的。化学品储存在密封的、抽真空的1毫升不锈钢小瓶中，所需化学品的蒸气通过精密的测微针阀和截止阀供应到等离子体室。在等离子体的实时光谱中观察引入的化学品的效果。光谱是在6秒的曝光时间内获得的，这使得氦气线饱和，前体的附加峰可见。
由于有机分子的引入，光谱中最突出的特征是656纳米处的Hα峰(图12(d))。该峰很可能是由于从分子中断开末端氢而产生；较大的片段或非末端部分的分离，如硫醇中的硫原子，需要两个或更多的键被打破，因此可能性较小。
存在于等离子体中的化学品的实际数量取决于每种化合物的蒸气压；这可以通过控制液体容器的温度和设置泄漏阀来调整。
一旦确定了所需的等离子体成分，就用覆盖了网格和掩膜支架的快门来控制曝光时间。图12(b)和(c)为所述快门和掩膜的示意图。在使用不同的化学品间隔期，用70％功率的纯氦气等离子体清洗反应室30-60分钟，直到在光谱中观察不到微量氢的存在。
上述操作中使用的官能化化学品是戊胺、己酸、1-戊硫醇和4-戊基苯酚。图12(e)为显示化学修饰的官能化石墨烯的XPS光谱图。
(b)官能化石墨烯的XPS
X射线光电子能谱(XPS)用来研究对石墨烯的共价修饰，如按照上述(a)修饰。来自Al-Kα源(1486.68eV，ESCALAB 250Xi)的光束聚焦样品上的900μm直径的探针。铜上的石墨烯(生长的)和转移到超金箔(UltrAuFoil)金网格上的石墨烯(根据实施例2)用于这些测量，并用于电荷补偿。部分氢化和未处理的石墨烯样品作为官能化石墨烯的对照品。在数据采集期间，XPS室的压力为5x 10-9毫巴。
首先，在136eV-1361eV范围内，以200eV的通过能量获得1eV采样的光谱扫描，然后在目标区域周围以0.1eV采样，以30-50eV通过能量扫描30-50次，并取平均值，产生图12(e)中的光谱。使用NIST XPS数据库27的数据对这些峰进行了识别。某些观察到的峰被列为来自支撑石墨烯的金属基底的信号。
(c)接触角测量
使用定制的仪器28对悬浮在全金网格上的等离子体处理的石墨烯进行接触角测量。简而言之，将1-2μL的去离子18MΩ的水滴移到固定的网格中心，并在漫射照明的背景下平行于表面进行成像。任何网格出现弯曲或液滴不对称扩散的图像都被弃用。在等离子体处理结束和测量之间的通常时间为1分钟；对每个数据点进行3-5次重复测量。接触角在ImageJ29中进行了量化。
(d)官能化石墨烯的图案化
为了在每个网格的不同区域对具有多个官能化的网格进行图案化，在每个等离子体处理步骤中，在每个网格的顶部表面上方精确地放置一个刀锋掩膜(上述(a))。上述操作用一套精密加工的掩膜来完成，所述掩膜的安装在网格对齐支架的上方的定义位置。该设备能够一次图案化2x 10个网格。
图案的锐度取决于，并可以通过调整以下因素来进行控制：掩膜和石墨烯表面之间的距离、掩膜边缘的锐度以及等离子体中物种的平均自由程。此处使用的典型条件下(1托，非热远程等离子体)，腔室中的平均自由程比其他相关的长度尺度大得多；因此认为图案化的分辨率大约等于网格和掩膜之间距离的两倍，即50μm。图1(a)中的过渡区域的宽度证实了这一点，该区域是放置在箔片表面上方20μm的刀锋掩膜。
(e)石墨烯-金载体上的无定型碳沉积
在抽真空至10-6毫巴的Edwards 306A蒸发器中，将无定形碳直接沉积到涂有石墨烯的金网格上。网格放置在定制的槽形支架上，类似于用于等离子体处理的支架，并由掩膜板覆盖。孔径为100μm的单槽孔(EMS GA100-Au)的用于掩膜，仅将网格的中心暴露在碳蒸气中。网格到掩膜的距离约为100μm。连续无定形碳膜的局部沉积已通过TEM成像验证(图3)。
图3显示多官能化石墨烯-金载体，带有用于电子显微镜对准的无定形碳覆盖的网格。图3(a)是在碳蒸发过程中使用的孔径掩膜的示意图，用薄的非晶碳膜覆盖石墨烯-金网格的约1个方格。蒸发是在所有等离子体处理之前进行的。图3(b)是修饰后的多官能化网格的低倍率透射电子显微照片，显示了不对称的中心标记和它周围的较暗的区域被约
Figure BDA0003378432880000181
Figure BDA0003378432880000182
厚的无定形碳膜覆盖。比例尺为80μm。图3(c)显示了来自碳涂层区域的Thon环(155,000倍标称放大率下的透射电子显微照片的傅立叶变换，散焦0.4μm，
Figure BDA0003378432880000183
的刻意污化)可用于校正散光和彗形像差。
Figure BDA0003378432880000184
处的石墨烯晶格反射仍然可见。相比之下，在被掩膜保护的区域，洁净的单层石墨烯不会产生Thon环。
上述图案化方法能够直接将无定形碳蒸发到涂有石墨烯的金网格中心的直径为100μm的区域上，以便在获取高分辨率数据之前，在同一个多官能化网格上进行柱状排列和慧差排列。
实施例2使用金纳米颗粒在玻璃体冰中进行位移追踪
(a)网格制备
样品是在4℃下通过手动快速冷冻制备的。使用具有800纳米孔径的全金载体(超级金箔R 0.6/1,300-目,定量箔)，含石墨烯的和不含石墨烯。在玻璃化之前，对样品载体进行了等离子体处理，使其具有足够的亲水性，处理方法如下：全金网格9:1Ar:O2等离子体处理60秒，石墨烯涂层的网格氢气等离子体处理60秒。然后将3μL OD值为100的10纳米非共轭金胶体溶液(BBI溶液)施加到网格的箔面一侧，并从同一侧吸干15秒，然后浸入保持在93K的液体乙烷中30。
(b)成像
在Titan Krios上收集石墨烯支撑的冰的数据，在Tecnai Polara上收集无支撑的冰的数据，以上两种情况都使用Falcon 3探测器的积分模式和成像条件，单颗粒数据收集(300keV，1e-/像素/帧，样品温度80K)。照明在每个暴露的孔的中心，设置光束直径为比孔稍大，从而尽量减少光束引起的位移31。放大率的选择依据是将孔的边缘包括在显微照片中，以便进行漂移跟踪。即Krios为
Figure BDA0003378432880000191
(47,000x标称)和Polara为
Figure BDA0003378432880000192
(59,000x标称)。影片的采集持续时间时间为5-8秒，累积通量为
Figure BDA0003378432880000193
只对金箔上没有缺陷的方孔进行成像。
(c)位移分析
在MotionCorr20中对整个显微照片进行位移校正，以消除平台漂移。位移校正后的堆栈丢弃以提供每帧
Figure BDA0003378432880000194
的通量。在EMAN221中手动挑选颗粒，并从位移校正的堆栈中提取128x 128像素的帧。然后在MotionCorr中对每个颗粒影片再次进行移位校正。对校正后的颗粒影片进行目视检查。在最初的
Figure BDA0003378432880000195
辐照期间，所有颗粒的轨迹被用来计算颗粒在集合中的均方位移和均方根位移。
实施例3嗜热菌(T.thermophilus)30S核糖体亚单位的CryoEM
本实施例以30S核糖体亚单位为测试样品12,13，证明了多官能化石墨烯载体在优化样品取向分布方面的潜力。通过将这些化学品中的每一种应用于部分氢化的石墨烯涂覆的金网格的一半，制备了用戊胺、己酸、1-戊硫醇和4-戊基苯酚官能化的石墨烯。分析每个表面上30S颗粒的取向分布(图13(a)-(b)，图4(a)-(d))。上述分布与部分氢化石墨烯和无支撑的冰上的分布不同(图4(e)-(f))。确定了官能化表面的组合，该组合将取向分布的效率提高到了0.814，使得能够单独计算30S亚单位的高分辨率重建(图6)。断层扫描重建证实了所有观察到的分布之间的明显差异，表明颗粒与官能化的石墨烯相互作用，这表明颗粒在石墨烯表面的单层中位于仅比颗粒直径厚的冰层中15(图5)。
(a)网格制备
提供纯化的嗜热菌30S核糖体亚单位(在5mM HEPES、50mM KCl、10mM NH4Cl、10mMMg(OAc)2中，由MRC分子生物学实验室的Ramakrishnan实验室提供；此类样品也可市售获得，例如Sigma)。
所有样品浓度调整为8mg/mL，除了部分氢化的石墨烯上的样品浓度为1.7mg/mL。所有使用的石墨烯涂层网格首先暴露在H2等离子体中180秒，使整个表面亲水，然后用带有相应官能化化学品(戊胺、己酸、1-戊硫醇或4-戊基苯酚)蒸气的He等离子体对一半的网格进行处理30秒，再对另一半网格进行处理30秒。不含石墨烯的对照实验中的普通超金箔网格用9:1的Ar:O2等离子体混合物处理60秒。将3-4μL的蛋白质溶液移到网格的石墨烯涂层一侧，双倍印迹5秒，然后立即投入乙烷中。通常情况下，等离子体处理和玻璃化的时间间隔不超过10分钟。在网格进入电子显微镜中进行成像前，将网格储存在液氮中。
(b)成像和数据收集
冰中的30S核糖体在官能化石墨烯上的显微照片是在Tecnai Polara显微镜上获得的，该显微镜在300kV下使用Falcon 3检测器在积分模式下运行。标称放大率为93,000倍，相当于
Figure BDA0003378432880000201
(使用
Figure BDA0003378432880000202
的石墨烯反射进行校准)。30S核糖体在无支撑的冰中和在部分氢化石墨烯上的冰中的显微照片是在Titan Krios显微镜上获得的，在积分模式下使用Falcon 3检测器，标称放大率为59,000倍，相当于
Figure BDA0003378432880000203
(c)单颗粒数据分析
使用不对称的中心标记来识别官能化网格的分区(见图2(e))。在Relion 317中对显微照片进行位移校正，用Gctf22拟合CTFs，在EMAN2中手动挑选颗粒，在Relion 3中进行2D分类和3D细化。所有来自官能化网格的颗粒一起进行处理，根据显微照片的名称和网格上的相应坐标，将每个表面的最终方向角分类。由于像素大小不同，来自对照实验的颗粒单独进行处理。使用cryoEF14分析颗粒的取向分布，并在等面积的Mollweide投影上绘图，阴影部分代表每个采样取向分布的局部高斯核密度(即概率分布函数，PDF)(见图13(a)-(b)，图6)。核密度的带宽被设定为5°。上述图也代表了颗粒在特定方向与表面相互作用的归一化概率，从而量化了上述相互作用的强度。在指定方向上的一些扩散可能是由于箔的局部弯曲、石墨烯的起皱、冰的膨胀或核糖体亚单位的可弯曲部分的弯曲，上述弯曲都约<5°。30S核糖体的高分辨率晶体结构(1J5E12)被转换为一个表面并以UCSF Chimera23中计算的表面库仑电位进行遮蔽，从而说明颗粒在石墨烯上的主要取向，并分析相互作用界面(见图13(c)-(f))。使用效率指标评估每个方向的分布潜力，从而提供统一的傅里叶空间采样，实现高分辨率的重建14。从大约一万个颗粒中计算出每个独立的取向分布的效率；然后可以参考这些效率来决定进一步收集数据的最理想的表面或表面组合。
在本实施例中，选择的表面是胺和苯酚官能化的石墨烯，具有0.8的组合效率，从而实现近原子结构的测定，比从冰中无支撑的30S核糖体(效率0.3)的数据集的颗粒少100倍14(见图6)。
图6显示通过优化官能化石墨烯上的30S核糖体亚单位取向分布来提高效率和分辨率。图中显示的是在无支撑的冰中重建30S的金标准FSC图(虚线)，从12,600个颗粒中得到
Figure BDA0003378432880000211
的分辨率，以及在胺/酚官能化石墨烯上重建30S(实线)，从26,483个颗粒中得到
Figure BDA0003378432880000212
分辨率。
根据预测，这些官能化的组合可以最大限度的提高取向分布的效率。分辨率的差异并不是由于颗粒数量的两倍差异造成的，正如从高效数据集的12,600个颗粒的子集(虚线)中进行的重建所证明的，分辨率达到了
Figure BDA0003378432880000213
插图显示了每个取向分布的相应点扩散函数(PSF)；PSF在最弱的分辨方向上被拉长。
(d)断层扫描
在Titan Krios上使用Falcon 3直接电子探测器在积分模式下运行，收集同一样品的单轴双向倾斜系列，范围跨越-50同至+50同，增量为5增。在37,000倍的标称放大率下，每张图像的曝光量为
Figure BDA0003378432880000214
持续1秒(40帧)。在MotionCorr20中将影片进行了位移校正，在没有参照物的情况下将断层图像对齐，并在Etomo(IMOD)24中使用SIRT进行重建。
(e)讨论
上述实验揭示了30S核糖体亚单位表面的官能化相互作用图。因此我们能够创建颗粒与表面相互作用的物理模型，该模型可说明检测到的取向分布。在羧基化的载体上，主要观点表明30S的富含蛋白质的外侧面向表面(图13(d))。几个带正电荷的氨基酸残基，包括Arg S2226、Lys S1080、Lys S4166,169，都暴露在这一侧，可能会稳定与表面的接触。在硫醇官能化的表面上，由于硫醇基团的低pKa，相同的取向更受青睐(图4(b))。羧基化石墨烯上第二种最常见的取向是30S亚单位的50S面朝向表面(图13(c))。导致这种取向的相互作用可能与活性30S-50S界面发生的相互作用相似。推定的锚点包括靠近30S头部的富含Arg/Lys的S13链和主体表面的16S rRNA 5'结构域。这种取向在部分氢化的石墨烯上是非常有利的(图4(e))。相比之下，由于胺基的高pKa，它在戊胺处理过的部分氢化石墨烯上缺乏代表性。所测试的所有表面中，戊胺/氢官能化的石墨烯最大限度地减少了得测试样品的取向偏差。尽管如此，一些酸性氨基酸残基(Glu S624,31,Glu S1358)可以被认为是30S亚单位与胺-石墨烯表面接触的假定相互作用点(图13(e)-(f))。在所使用的缓冲液中的德拜屏蔽长度为约
Figure BDA0003378432880000215
因此我们只考虑与石墨烯表面接触更紧密的氨基酸侧链的静电相互作用即可。围绕每个优选方向的视图分布取决于颗粒的形状及其如何限制围绕固定相互作用点的旋转。
在图13(a)-(b)的NB中，30S核糖体亚单位在来自单个图案网格的两种不同的石墨烯官能化((a)石墨烯+氢气+羧基，即部分氢化的石墨烯与己酸的羧基官能化和(b)石墨烯+氢气+胺，即部分氢化的石墨烯与戊胺的胺基官能化)的取向分布绘制在摩尔威德投影上。每个点代表一个观察到的颗粒，刻度代表计算出的在特定方向观察到的颗粒的归一化概率密度。E是每个取向分布的效率14。两个最可能的视图的方向和围绕这些方向的变化被标记出来。
图4更完整地显示了30S核糖体在石墨烯上的摩尔威德投影取向分布图，石墨烯官能化来自(a)己酸，(b)1-戊硫醇，(c)戊胺，(d)4-戊基苯酚，其都由氦气等离子体携带，并在部分氢化处理之前；(e)部分氢化的石墨烯；和(f)无支撑的冰。每个点代表了石墨烯表面上观察到的颗粒方向，比例代表了在欧拉角(φ,θ)给出的视图中观察颗粒的归一化概率分布函数(PDF)的计算。所有的图以相同的比例显示，峰值对应于(e)-(f)中饱和的主导视图。图中标注了每个取向分布的效率E。
实施例4人20S蛋白酶体的CryoEM
(a)网格制备
将人20S蛋白酶体(Enzo)样品缓冲液交换到pH 8.3的TBE(89mM Tris，89mM硼酸和2mM EDTA)中，并调整浓度为0.8mg/mL。四象限网格的制备方法是：将一半网格暴露在180秒的氢气等离子体下，然后将掩膜旋转90°，将一半的网格在氦气等离子体下暴露于戊胺中30秒，再将掩膜旋转180°，将另一半网格在氦气等离子体下暴露于己酸中30秒，玻璃化的方法同上。
(b)成像和数据收集
在Titan Krios显微镜上获得显微图像，其使用Falcon 3检测器在积分模式下在300kV下运行。通量为
Figure BDA0003378432880000221
曝光时间为2秒；使用70μm的物镜光圈。标称放大率为59,000倍，相当于
Figure BDA0003378432880000222
使用分散在独立校准网格上的锐钛矿(TiO2)纳米颗粒的反射进行校准。网格的象限是相对于上述不对称网格中心标记的方向确定的(见图2)
图2说明了控制官能化石墨烯的润湿性和20S蛋白酶体的取向分布的实验工作。图2(a)-(d)显示了冰中的石墨烯上20S蛋白酶体的代表性显微照片，取自单个图案化多官能化石墨烯网格的四个象限。收集显微照片的网格的象限在每张图中都突出显示。己酸处理(图2(b))使网格疏水，表现为石墨烯表面湿润度差，蛋白质部分变干。可以通过用氢气等离子体(图2(b))预处理网格使其表面亲水，并形成均匀的薄冰层，不影响随后的官能化。由此可见，最初的氢气等离子体处理使得随后用潜在的疏水化合物对石墨烯表面进行官能化的同时，还保留了形成薄冰层所需的宏观表面润湿性。
将网格划分为四个不同的官能化象限的轴是通过确定网格边缘标记(图2(e)，插图)的方向来定义的，用眼睛也可容易地看到，平行或垂直于掩膜边缘。在TEM的低倍率模式下，找到不对称网格中心标记(图2(e)，插图)的位置和方向来确定象限。图2(e)中的插图显示了边缘标记和中心标记的在其真实相对方向的光学显微照片。图2(a)-(d)的比例尺为
Figure BDA0003378432880000234
图2(e)中插图的比例尺为50μm。如图2(f)所示，对官能化石墨烯的接触角测量可用于监测表面改性的程度并评估所得表面的亲水性。
根据之前的部分氢化实验，可以估计，典型的暴露可使每平方纳米有大约1个官能团被添加到石墨烯上。羧基和硫醇的官能化往往会使表面变得疏水，如较高的接触角所示，这对冷冻样品的cryoEM有潜在的干扰。可以通过在典型的30秒接触官能化化学品之前用180秒的氢气等离子体进行预处理来避免(变暗的数据点)。
官能化之前先对石墨烯进行部分氢化的方法产生了具有足够润湿性的表面，有利于制备低温样品。
实施例5脱铁蛋白的CryoEM
在该实施例中，为了证明所述载体适用于高分辨率的结构测定，使用金载体的戊胺官能化石墨烯来测定马脾脏去铁蛋白的结构。
(a)网格制备
马(Equus caballus)脾脏去铁蛋白(Sigma)在pH 7.4时缓冲交换到100nM磷酸盐缓冲盐水中，浓度调整为11.7mg/mL。使用石墨烯涂层的网格，用携带戊胺的He等离子体处理30秒。玻璃化处理的方法与上述方法相同。
(b)成像和数据收集
在Titan Krios显微镜上，使用Falcon 3探测器在计数模式下以300kV的电压操作，获得影片。标称放大倍数为120,000倍，像素大小为
Figure BDA0003378432880000231
使用在与数据收集相同的条件下拍摄的金基底箔的傅里叶变换中的
Figure BDA0003378432880000232
金反射进行校准。使用100微米的物镜光圈进行数据收集。影片的曝光时间为30.01秒，总帧被分为38部分(每部分31帧)。通量为0.53e-/pix/s，相当于每部分中的总通量为
Figure BDA0003378432880000233
图7(a)显示了玻璃体冰中的去铁蛋白颗粒在戊胺官能化的石墨烯上的显微照片。在适当的高倍率下，从上述电子显微照片中可以直接看到石墨烯晶格。
(c)单颗粒数据分析和建模
显微照片在Relion 3中进行位移校正，用Gctf拟合CTF，在EMAN2中手动挑选颗粒，2D和3D分类，3D细化，CTF细化，颗粒抛光和后处理都在Relion 3中完成。所得电磁密度图达到了
Figure BDA0003378432880000241
的金标准FSC分辨率，并与相应的高分辨率晶体结构(2W0O25)一致。
表2:去铁蛋白的数据收集统计
Figure BDA0003378432880000242
在Chimera中呈现了带有拟合模型的3D地图的插图。使用cryoEF分析有助于最终重建的颗粒的取向分布，其效率为0.7。对于位移分析，通过从Relion的贝叶斯抛光计算的颗粒位移中减去整个显微照片的位移来计算每个颗粒的位移26。这是必要的，因为在整个30秒的曝光过程中，显微镜台的漂移速率为
Figure BDA0003378432880000243
从而导致了位移。
(d)讨论
图14显示了更多关于使用多官能化石墨烯-金载体进行高分辨率结构测定的信息。图14(a)显示了去铁蛋白的等高线密度图，显示了结构中的氨基酸侧链。图14(b)显示了去铁蛋白结构的傅立叶壳关联图(FSC)。图14(c)显示了无载体在冰中(较浅的圆圈)或在石墨烯上的冰中(较深的十字)，在全金载体上的金纳米颗粒均方位移。石墨烯薄膜的加入使辐照开始时的运动和后期帧中类似扩散的运动都减少了2倍。虚线是对除去第一帧的数据的线性拟合。随着石墨烯加入到全金样品载体中，斜率从
Figure BDA0003378432880000244
下降到
Figure BDA0003378432880000245
图14(d)显示了计算出的B因子与去铁蛋白数据集的电子通量的关系。第一个
Figure BDA0003378432880000246
的B因子对应于初始的非扩散运动阶段。在
Figure BDA0003378432880000247
范围内，B因子以近似
Figure BDA0003378432880000248
的恒定速率下降(虚线表示线性拟合)。
通过标准的数据收集和处理，从41,202个颗粒中重建达到
Figure BDA0003378432880000249
的分辨率(0.143FSC16)(见表2，图7，图14))。重建图的分辨率相当于迄今为止报道的最高分辨率17，但需要大约一半的数据，图中侧链的清晰密度证明了这一点(图14(a))。这包括完整的天门冬氨酸和谷氨酸残基，超出Cβ以外的密度在EM图中往往是不存在的18。在这个数据集中第一个
Figure BDA0003378432880000251
的辐照后，具有通量的高分辨率信息的衰减率(图14(d))类似于二维蛋白质晶体中辐射损伤的测量19。我们将颗粒在多官能化石墨烯-金载体上的位移与以前在其他几种载体4上的测量结果进行比较(图8，图9)。图8显示了在辐照过程中，碳网格上无支撑的冰(上)和石墨烯-金(下)上的去铁蛋白的均方根(RMS)位移。无支撑的冰中的颗粒来自于之前公布的市售马脾脏去铁蛋白17的最高分辨率结构相对应的数据集。误差线是平均值的标准误差。与多孔无定形碳载体相比，官能化的石墨烯-金载体在辐照期间减少了初始位移、位移率和颗粒位移的差异。图9显示了MW为2MDa的核糖体的均方根(RMS)位移与电子通量的关系图。图9(a)-(d)和(f)是先前描述的工作的复制品4。图9(e)是石墨烯-金载体上的位移，最初是根据本文获得的去铁蛋白数据集测量的，根据斯托克斯-爱因斯坦方程9，有效扩散常数按其分子量(MW1/3)的比例进行比较。除了在辐照的最开始，样品在石墨烯-金载体上的位移是类似扩散的(均方位移与通量成正比)。
在全金载体上添加石墨烯层时，在电子辐照期间，颗粒的运动减少了2倍。与石墨烯-碳载体相比，石墨烯-金载体将颗粒运动减少了三倍。颗粒位移的减少也通过跟踪带有和不带有额外石墨烯层单个金纳米颗粒在全金载体上的运动得到了验证(图14(c)，图10)。图10显示了在石墨烯涂层的全金网格上的纳米颗粒的运动减少。在全金网格上的无支撑玻璃体冰(图10(a))和全金网格上的石墨烯玻璃体冰(图10(d))中，对金纳米颗粒(直径10nm，质量6MDa)进行了成像，放大倍数以将孔的边缘纳入漂移跟踪的视野中为标准。位移校正后的整个显微照片上的颗粒轨迹被放大200倍(图10(b)和图10(e))。虚线方块对应于显微照片的区域，空圆圈是初始颗粒位置，实心圆圈是
Figure BDA0003378432880000252
总通量后的最终颗粒位置。在图10(c)和图10(f)中，金纳米颗粒的均方根(RMS)位移与所示显微照片(上图)和平均n＝19显微照片(金)和n＝8显微照片(石墨烯-金)的平均值(下图)的电子通量有关。
重要的是，除了减少随机颗粒运动的速度，石墨烯层的加入也减少了辐照的前几个电子期间的运动，提高了初始帧的质量(B因子)(图14(c)-(d))，初始帧中分子被光束破坏的程度较低。这种两倍程度的减少可能是由于石墨烯层限制了在开始用电子束辐照时应力释放时每个孔内的冰薄膜的整理运动。
参考文献
为了更全面地说明和披露本发明和本发明相关的现有技术，上文引用了一些出版物。以下提供这些参考文献的完整引文，这些参考文献中的每一个的全部内容并入本文。
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Claims (24)

1.一种用于石墨烯或氧化石墨烯官能化的设备，所述设备包括：
等离子体发生器；
与等离子体发生器相连的处理室；
基底支架，其被定位以固定用于电子显微镜的基底，所述电子显微镜优选为低温电子显微镜，所述基底支架被定位以将具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底保持在处理室内，并具有配置为在其中安装基底的安装区域；
快门，所述快门可在开放位置和关闭位置之间移动，在所述开放位置中，基底支架的安装区暴露在处理室中，在所述关闭位置中，基底支架的安装区被遮蔽起来；
注射器，用于将官能化化合物注入处理室中；
和氦气源，用于向等离子体发生器提供氦气。
2.如权利要求1所述的设备，其中，所述设备进一步包括用于遮蔽基底的一个区域的掩膜。
3.如权利要求2所述的设备，其中，所述掩膜是可移动的。
4.如权利要求2或3所述的设备，其中，所述掩膜可从所述设备的其他部分移除。
5.如权利要求2-4中任一项所述的设备，其中，所述设备被配置为使得当所述基底被放置在基底支架中时，所述掩膜不与基底的石墨烯或氧化石墨烯层接触。
6.如权利要求5所述的设备，其中，所述设备配置为，当所述基底被固定在基底支架中时，所述掩膜位于基底表面上方小于200μm的位置。
7.如权利要求1-6中任一项所述的设备，其进一步包括氢气源，用于向等离子体发生器提供氢气。
8.如权利要求1-7中任一项所述的设备，其进一步包括开向处理室的视窗和紫外-可见光谱仪，所述紫外-可见光谱仪分析从处理室通过视窗发出的辐射。
9.如权利要求1-8中任一项所述的设备，其进一步包括一个或多个官能化化合物源，每个官能化化合物源与注射器相连，所述官能化化合物源向注射器提供一个或多个官能化化合物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的设备，其包括多个注射器，每个注射器与对应的官能化化合物源相连，以将官能化化合物供应至各自的注射器。
11.如权利要求1-10中任一项所述的设备，其中，所述注射器为气体注射器。
12.一种低温电子显微镜样品载体，其包括：
金属箔基底；
和基底上的官能化石墨烯或氧化石墨烯层，所述官能化石墨烯或氧化石墨烯层具有多种不同的官能化。
13.如权利要求12所述的低温电子显微镜样品载体，其中，所述官能化石墨烯或氧化石墨烯层被部分氢化。
14.如权利要求12或13所述的低温电子显微镜样品载体，其中，所述基底具有孔，所述官能化石墨烯或氧化石墨烯层悬浮在所述孔上。
15.一种在用于电子显微镜的基底上将石墨烯或氧化石墨烯进行官能化的方法，所述的电子显微镜优选低温电子显微镜，所述的方法包括以下步骤：
(a)将具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底暴露于包含氦气和至少一种官能化化合物组成的等离子体中。
16.如权利要求15所述的方法，其中，在步骤(a)之前，在具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底上施加掩膜，选择性地只暴露基底的一部分。
17.如权利要求16所述的方法，其中，在步骤(a)期间移动掩膜。
18.一种在用于电子显微镜的基底上将石墨烯或氧化石墨烯进行多官能化的方法，所述的电子显微镜优选低温电子显微镜所述的包括以下步骤：
(a)遮蔽具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底的一个区域；
(b)将未遮蔽的区域暴露于包含氦气和至少一种官能化化合物的等离子体中，形成官能化区域；
(c)除去基底的掩膜；
(d)重复步骤(a)至(c)，每次重复使用不同的官能化化合物，以形成具有多个区域的石墨烯层的基底，每个区域具有不同的官能化。
19.如权利要求15-18任一项所述的方法，其中，通过使用固定在基底上的快门来控制基底暴露于等离子体的时间，所述快门可在基底被暴露的开放位置和基材被遮蔽的关闭位置之间移动。
20.如权利要求15-19任一项所述的方法，其中，所述官能化化合物选自如下通式(I)所示化合物中的一个或多个；
式(I)
其中，R1和R2各自独立地选自H、卤素(例如-F、-Cl、-Br)、硫醇(-SH)、氨基(-NH2)、羧酸(-COOH)和羟基苯基(-C6H4OH)；
R1和R2中的一个不是H；
n为1-10的整数。
21.如权利要求15-20任一项所述的方法，其中，所述官能化化合物选自戊胺、己酸、1-戊硫醇和4-戊基苯酚中的一个或多个。
22.如权利要求15-21任一项所述的方法，其中，所述方法可进一步包括将具有石墨烯或氧化石墨烯层的基底暴露于包含氢气的等离子体中，以实现石墨烯或氧化石墨烯层的氢化或部分氢化。
23.如权利要求15-22任一项所述的方法，其中，所述基底为金质低温电子显微镜网格。
24.一种用于进行如权利要求15-23中任一项所述的方法的设备。
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