CN105531792A - 包括多孔金属箔的电子显微镜样品支架 - Google Patents

Abstract

一种电子显微镜样品支架，包括：支架部件；和包括多孔区域的金属箔。支架部件被配置成提供结构稳定性给金属箔，并且金属箔的多孔区域配置成接收电子显微样品。还提供了一种制造此类电子显微镜样品支架的方法，一种使用此类电子显微镜样品支架成像的方法和一种可操作用于进行此类成像的设备。根据多个方面和多个实施方案的电子显微镜样品支架可以减少电子显微镜中的粒子运动和/或样品充电，并因此改善可获自电子显微图像的信息内容。适当设计和构造的支架可以导致提高的每个粒子的分辨率和提高的(例如生物样品的)3D重建中角取向的精确度。这可以使比之前使用EM技术可能的更小且更困难的蛋白质结构的确定成为可能。

Description

包括多孔金属箔的电子显微镜样品支架

发明领域

本发明涉及一种电子显微镜样品支架；一种制造此类电子显微镜样品支架的方法；一种使用此类电子显微镜样品支架成像的方法和一种可操作用于进行此类成像方法的设备。

背景

可以将电子显微镜技术用以样品成像。根据此类技术，将电子束用以“照射”样品。样品在电子束中的存在导致电子束的变化。可以检查由样品导致的电子束的变化以产生样品的放大的图像。

为了通过电子束照射，必须将样品恰当支撑在所述束中。通常形成电子束的电子具有高的能量，并且要理解的是，在电子束内将目标物(例如用于检查的样品)与保持样品在适当位置的支架一起轰击可能导致支架和/或样品的物理、化学和/或电变化。这种变化可能影响通过使用电子显微镜技术得到的结果，包括图像分辨率。

期望提供一种用于电子显微镜技术中的样品支架，所述支架可以解决一些已知样品支架的特征。

概述

因此，第一方面提供一种电子显微镜样品支架，所述电子显微镜样品支架包括：支架部件；和包括多孔区域的金属箔；所述支架部件被配置成提供结构稳定性给所述金属箔，并且所述金属箔的所述多孔区域被配置成接收电子显微镜样品。

第一方面认为，包括例如纳米级粒子的样品的电子显微图像中的信息内容可以由以下各项限定：单独的粒子的电子束诱导的运动；由电子束和/或样品支架(例如碳基底)的化学变化诱导的样品上的电荷积累。在图1至3中示意性说明这种现象。

以上描述的现象可能是与电子低温显微镜特别相关的，电子低温显微镜也被称为低温电子显微镜，其中使用透射电子显微镜在低温下研究样品。电子低温显微镜技术可能特别有用于冷冻的、与水结合的生物学样品的研究。作为例如先前提到的那些现象之类的现象的结果，信息内容的损失可能限制由电子低温显微镜收集的涉及此类冷冻的水合的生物学样品(特别涉及此类样品的图像的3D重建)的图像的分辨率。作为可获得的受限信息的结果，已知的技术对单独的粒子的角取向的精确度施加限制，使得不能可靠地使更小的粒子，例如那些小于～500kDa的粒子。

第一方面认为，在电子显微镜中金属栅格支架的使用是已知的并且多孔碳膜的使用是已知的同时，支撑样品用于分析的精细多孔金属箔的使用可以具有优点，尽管在第一个实例中看来是可能有损于所得图像的结构。具体地，可以认为将样品放置在提供于金属箔中的孔(hole)的区域中将导致更差的图像，因为金属箔对于电子束是不透明的并且可能导致对入射电子束的不当干涉。结果，典型地已经使用多孔碳基底，那些基底被例如金属栅格支撑，金属栅格可操作以增加力学稳定性给样品支架并如所需的将电子从样品“传导”离开。

根据第一方面的样品支架包括金属箔，所述金属箔具有这样的性质：选择所述性质以允许其提供例如足够的二次电子给位于金属箔中小孔(pore)区域的样品，条件是金属箔在入射电子束内被正确地对齐。这种二次电子可以随后将暴露给入射电子束期间积累在样品中的正电荷中和。适当地选择的金属的电子产率可能起到将由箔的小孔区域中的样本(sample)或样品(specimen)经历的充电效应最小化的作用。此外，可以选择金属使得其在电子束的存在下是基本上惰性和不反应的。适当选择的金属的不反应的性质可以使箔的力学变形最小化。

尽管措辞金属已被用于描述第一方面的多孔箔，但是要理解的是，也可以使用具有以下进一步列出的实质上金属性质的材料，例如适当选择的半导体材料。通常可以认为金属是具有大于10e21/cm³的自由载流子浓度的任何材料。

在一个实施方案中，金属箔被布置成与支架部件欧姆接触。换句话说，金属箔和支架部件之间的接触起着非整流结(non-rectifyingjunction)的作用，从而允许箔之间的任何自由电子到支架的移动的不拘束，并且改善可以导致作为支架暴露给电子束的结果的充电效应。

在一个实施方案中，金属箔包括金属，所述金属具有大比例的不紧密结合到材料中任何特定原子的可移动的电子。这种材料比典型的无定形碳更有传导性。也就是说，在一些实施方案中，金属可以包括高传导性金属。因此，用于箔的高传导性金属的供应允许电子在箔内相对自由的移动，其可以改善可以导致作为支架暴露给电子束的结果的电荷效应。

在一个实施方案中，金属箔包括这样的金属：对于在所述箔上的电子入射而言，所述金属具有高总产率的由箔发射的电子。从而，暴露于高能电子束可以允许可以落在样品或样本区域上的电子的产生，因此改善可以导致作为支架暴露给电子束的结果的电荷效应。

在一个实施方案中，金属箔包括具有高力学稳定性的金属。金属箔可以包括在所选择的厚度具有一定力学强度的金属，所述一定力学强度足以将在暴露到入射电子束期间样品的运动减少到小于所得图像需要的空间分辨率的倒数。从而，箔可以配置为当延伸穿过支架部件时是自支撑的。如果被选择以具有合适的杨氏模量，则金属箔可以是支架部件侧面之间横向跨度的强度相对较大的，尽管其本来是相对薄的。此外，通过选择具有合适力学稳定性的箔材料，可以解决任何由化学变化或电荷失衡导致的多孔金属箔的力学变形的影响。也就是说，材料越硬，电荷失衡越不可能导致箔的物理翘曲。改善物理翘曲可以有助于改善样品显微图像中由移动导致的模糊。

在一个实施方案中，金属箔包括非反应性金属。从而，暴露到高能电子束可以造成金属箔中更少的化学变化，并且因而可以改善任何由化学变化导致的多孔金属箔的力学变形的影响。

在一个实施方案中，金属箔包括与生物学电子显微镜样品相容的金属。从而，材料的选择可以是使得与样品的反应最小化。具体地，在一些实施方案中，可以选择金属箔以显示很少的与生物学物质的反应。

在一个实施方案中，金属箔包括以下各项中的至少一种：金、铂、钯、铪或铑的金属箔。从而，可以选择此类物质和相似的物质，因为它们具有合适的：粒径尺寸，是非氧化物形式，具有所需的杨氏模量、二次电子产率或其他类似的期望的和/或可调的性质。

在一些实施方案中，金属箔中单独小孔的尺寸被确定为使得它们与要被电子显微镜的入射电子束询问(interrogated)的区域是相当。从而，电子显微镜束可以是可操作的以观察单个小孔的全部。在一些实施方案中，确定每个小孔或小孔的尺寸以允许在单个的小孔中同时成像多个感兴趣的电子显微镜样品。在一些实施方案中，确定每个小孔的尺寸小于入射电子显微镜电子束的尺寸。从而，入射束可以被布置成覆盖放置在孔中的样品，并延伸到孔或小孔周围的金属箔区域上，或与孔或小孔周围的金属箔区域重叠。束在金属箔上的重叠可以有助于确保由二次电子产生的作为在箔上的入射电子束的结果的样品的均匀电荷平衡。在一个实施方案中，金属箔的多孔区域包括包含多个孔的金属层。多孔区域可以延伸穿过基本上所有被支架部件保持在适当位置的金属箔。在一些实施方案中，仅箔的区域可以包括孔。这些孔可以规则地或不规则地布置在多孔区域中。在一些实施方案中，这些孔可以是基本上尺寸均匀的。在一些实施方案中，孔的尺寸可以在箔的横向上变化。也就是说，可以在金属箔上提供多个多孔区域，每个多孔区域具有不同的小孔尺寸。备选地，可以在金属膜的多孔区域的横向上提供不同尺寸的孔。从而，可以在单个栅格上测试大量条件。

在一个实施方案中，孔的尺寸被定制为接收至少一个电子显微镜样品。从而，当照射由支架保持在适当位置的样品时，通过询问的电子束可以看到至少一个样品。也就是说，在一个实施方案中，金属箔的厚度被选择为至少是电子显微镜样品的最小尺寸。

在一个实施方案中，支架部件包括基本上环形的元件。其环面的横截面形状可以例如是基本上圆形、椭圆形、矩形或三角形。从而，金属箔可以延伸穿过所述环形元件。

在一个实施方案中，支架部件包括多个隔开的支架元件。在一个实施方案中，多个隔开的支架元件被布置成形成网。从而支架部件可以包括支撑栅格状结构的环状元件。随后该栅格状结构可以在邻近的网元件之间支撑金属箔。这种栅格可以提供额外的结构稳定性给金属箔。在一个实施方案中，金属箔的多孔区域被布置成延伸穿过网的区域。

在一个实施方案中，支架部件和支架元件包括金属。在一个实施方案中，金属包括以下各项中的至少一项：金、铂、钯或铪。从而，支架可以是金属或具有金属性质，可以选择金属性质以最小化支架结构暴露到高能电子束时可能发生的充电、化学和/或其他类似的运动-诱导的过程。

在一个实施方案中，支架部件、支架元件和金属箔全部由相同的金属形成。从而，形成样品支架的主要成分由具有基本上相同的热膨胀系数(TEC)的材料形成。作为结果，可以减轻在金属箔中引起的应力、应变、拉伸或撕裂，当通过温度变化引起这些变化时，例如其经历当将样品支架降温至例如液氮温度时。如果构造支架使得箔处于拉伸下，则样品支架和/或支架元件(一个或多个)的导热系数与金属箔的导热系数的匹配可以有助于减轻对箔的损坏的可能性以及箔与样品支架和/或支架元件(一个或多个)之间的相对移动。此外，要理解的是，支撑零件之间的这种热匹配可能对于维持冷却期间金属箔膜中规定量的拉伸是理想的，从而在整个温度范围内保持膜的抗挠刚度。

在一个实施方案中，支架还包括石墨烯层。在一些实施方案中，该石墨烯层可以包括薄膜。从而，提供可以基本上透明于入射电子束的石墨烯层。

在一个实施方案中，石墨烯层被配置成延伸穿过金属箔的多孔区域中的小孔。作为石墨烯透明特性的结果，在所述样品支架中此种层的提供可以允许额外的结构稳定型，同时不劣化所得图像的质量。

在一个实施方案中，石墨烯层被配置成与金属箔欧姆接触。从而，可以最小化样品支架中石墨烯层的提供的影响，并保持多孔金属箔的好处。

在一个实施方案中，石墨烯层被配置为支撑电子显微镜样品。从而，可以延伸穿过金属箔中的小孔的石墨烯层可以被用作在其上支撑样品或形成包含样品的薄层的表面，使得石墨烯环绕或封闭样品。连续的石墨烯层可以允许更均匀的包含样品的结构的产生。

在一个实施方案中，金属箔的多孔区域中的孔被配置成接收将要被使用电子显微镜检查的辐射敏感材料。将要被检查的样品可以位于多孔金属箔的上面、下面或之中。辐射敏感材料可以包括蛋白质。蛋白质可以被电子显微镜基本上破坏。在一个实施方案中，辐射敏感材料包括生物学材料。在一个实施方案中，生物学材料被支撑在处于透明性冰中的所述金属箔的所述多孔区域中。从而，冰的结构可以不干扰所感兴趣的样本或样品的图像。

在一些实施方案中，样品支架包括电子低温显微镜样品支架。本文描述的某些问题在电子低温显微镜领域可能是特别相关的，并且因此多个方面和多个实施方案的样品支架可以在这类领域中发现特别的应用性。

第二方面提供一种制造电子显微镜样品支架的方法，所述方法包括：提供支架部件；和包括多孔区域的金属箔；配置所述支架部件以提供结构稳定性给所述金属箔，并且配置所述金属箔的所述多孔区域以接收电子显微镜样品。

在一个实施方案中，形成金属箔可以包括在模板上的金属沉积。

在一个实施方案中，形成金属箔可以包括在金属沉积之后模板的移除。

在一个实施方案中，所述方法包括将金属箔布置成与支架部件欧姆接触。

在一个实施方案中，金属箔包括具有高传导性的金属。

在一个实施方案中，金属箔包括具有高二次电子产生产率的金属。

在一个实施方案中，金属箔包括具有高力学稳定性的金属。

在一个实施方案中，金属箔包括非反应性金属。

在一个实施方案中，金属箔包括与生物学电子显微镜样品相容的金属。

在一个实施方案中，金属箔包括以下各项中的至少一项：金、铂、钯或铪的金属箔。

在一个实施方案中，金属箔的多孔区域包括包含多个孔的金属层。

在一个实施方案中，所述方法包括提供尺寸被确定为接受至少一个电子显微镜样品的孔。

在一个实施方案中，所述方法包括选择厚度至少为电子显微镜样品的最小尺寸的金属箔。

在一个实施方案中，支架部件包括基本上环形的盘。

在一个实施方案中，支架部件包括多个隔开的支架元件。

在一个实施方案中，所述方法包括布置多个隔开的支架以形成网。

在一个实施方案中，所述方法包括布置金属箔的多孔区域以使得其延伸穿过网的区域。

在一个实施方案中，支架部件和支架元件包括金属。

在一个实施方案中，金属包括以下各项中的至少一项：金、铂、钯、铑或铪。

在一个实施方案中，支架、支架元件(一个或多个)和金属箔中的两个或多个包括：一种或多种具有基本上匹配的热膨胀系数的材料。在一个实施方案中，支架、支架元件(一个或多个)和金属箔中的两个或多个包括：相同的材料并具有基本上匹配的热膨胀系数。

在一个实施方案中，所述方法还包括提供石墨烯层。

在一个实施方案中，所述方法包括将石墨烯层配置成延伸穿过金属箔的多孔区域中的小孔。

在一个实施方案中，所述方法包括将石墨烯层配置成与金属箔欧姆接触。

在一个实施方案中，所述方法包括将石墨烯层配置成支撑电子显微镜样品。

在一个实施方案中，所述方法包括配置金属箔的多孔区域中的孔以接收将要使用电子显微镜进行检查的辐射敏感材料。

在一个实施方案中，辐射敏感材料包括生物学材料。

在一个实施方案中，所述方法包括将生物学材料支撑在透明性冰中的所述金属箔的所述多孔区域中。

第三方面提供一种成像电子显微镜样品的方法，所述方法包括：将所述电子显微镜样品配置在根据第一方面的所述支架上；将所述支架布置在显微镜的电子束中；并收集用于分析的图像数据。

第四方面提供可操作用于提供样品的电子显微镜图像的成像设备，所述成像设备包括：电子显微镜样品，所述电子显微镜样品安装在根据第一方面的支架上；显微镜的电子束，所述显微镜的电子束被布置成入射在所述支架上；和收集设备，所述收集设备可操作用于收集分析用的图像数据。

进一步具体和优选的方面在所附的独立和从属权利要求中列出。从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征适当组合，并且与除了清楚地在权利要求中列出的那些组合。

当一种设备特征被描述作为可操作用于提供一种功能时，要理解的是，这包括一种提供该功能或适合于或配置以提供该功能的设备特征。

附图简述

现在将参考附图进一步描述本发明的实施方案，其中：

图1示例性说明在透明性冰中电子束-诱导的粒子的运动；

图2示例性说明电子束-诱导的样品电荷积累；

图3示例性说明电子束-诱导的支架基底的化学转变；

图4a示例性说明根据一个实施方案的电子显微镜支架的剖视图、平面图和侧视图；

图4b更详细地示例性说明示于图4a中的电子显微镜支架的一部分；

图5a至5c示出根据一个实施方案的设备的光学和电子图像；

图6示出一个实验的结果，该实验是测试实例电子显微镜支架中金粒子在透明性冰中的运动；

图7a和7b示出使用根据一个实施方案的支架成像的样品的比较例；

图8a和8b示出实验结果，所述实验结果说明与常规无定形碳栅格支架相比，根据一种布置的金栅格支架的运动减少；和

图9a至9d示出实验结果，所述实验结果说明对于使用不同的显微镜支架结构在冰中收集的数据，用时间/电子通量所作的图中，与初始位置的平均80S核糖体位移。

具体实施方式

已经认为，包括例如纳米级粒子的样品的电子显微图像中的信息内容可以由以下各项限定：单独的粒子的电子束诱导的运动；由电子束和/或样品支架(例如碳基底)的化学转变所诱导的样品上的电荷积累。在图1至3中示意性说明这种现象。

图1示例性说明透明性冰中电子束-诱导的粒子的运动。图1说明装入透明性冰中的粒子，在这个实例中为蛋白质。用电子束辐射样品。形成束的电子具有当碰撞或经过蛋白质样品时被施加到那些蛋白质样品的能量。要理解的是，成像期间，被研究的粒子在用电子束辐射之后可以旋转和平移，造成所得捕获图像的模糊。

图2示例性说明电子束-诱导的样品电荷积累。图2示例性示出保持在透明性冰中适当位置的样品(还是蛋白质)，所述透明性冰形成在金属栅格的棒之间支撑的无定形碳基底中的孔中。用形成电子束的高能电子辐射样品和支架(在这种情况下由金属栅格和无定形碳基底形成)可能导致样品和/或支架的电子形成部分的释放或移动。造成的电子移动或位移可以导致样品充电，这可以引入作用在样品和基底上的电力，从而导致由电子束偏折所造成的粒子移动和图像模糊。

图3示例性说明支架基底的电子束-诱导的化学变化。在示于图3中的布置中，粒子(在这个实例中是蛋白质)被装入透明性冰中。该透明性冰在形成在碳基底中的孔中形成。用电子束辐射样品。具有高能电子束的辐射可以导致形成束的电子起破坏碳基底中化学键的作用，其进而可以改变基底的密度和形状。基底密度和形状的变化可以导致力学应力和运动，并导致冰层的“穹形拱起(doming)”。支撑粒子的冰层的穹形拱起可能造成所得电子显微镜图像中的模糊。

用于低温-EM的现有的样品支架和基底典型地包括由适当的材料形成的金属网盘，称为“栅格”。该适当的材料可以包括金属。栅格典型地用有孔的无定形碳的薄层覆盖。栅格可以具有规则排列的孔。有孔的无定形碳的薄层可以包括规则排列的孔。还可以使用不规则的“花边形”碳基底。要理解的是，在低温-EM的情况下，通常使用透明性冰将样品封装在形成在无定形碳中的孔中。因为冰是绝缘体并且无定形碳是不良且高度可变的导体，二者都累积大量移动的表面电荷，这可以使电子束偏转并施加强静电力在样品上，这如图2和图3中所示。此外，如果通过高能电子束辐射无定形碳，则无定形碳可能经受可以改变密度并因此改变无定形碳支撑材料的形状的化学变化，从而导致样品中单独的粒子的移动。

概述

在任何更详细的讨论实施方案之前，首先将提供一个概述。本文描述的多个方面和多个实施方案可以提供超稳定样品支架，所述样品支架可以改善、减轻或消除以上描述的用于电子显微镜的支架具有的每个问题。

图4a示例性说明根据一个实施方案的电子显微镜支架的剖视图、平面图和侧视图。图4a说明一种电子显微镜样品支架，所述电子显微镜样品支架包括：支架元件，在这个实例中，是一种连同金属栅格和金属箔一起的基本上环形的部件，所述金属箔在金属栅格的相邻桁架之间延伸。金属箔包括多孔区域。支架元件被配置成提供结构稳定性给多孔金属箔。金属箔的多孔区域被配置成接收电子显微镜样品。在某些实施方案中，电子显微镜支架包括安装在金网栅格上的穿孔的金箔。

图4b更详细地示例性说明示于图4a中的电子显微镜支架的一部分。具体地，图4b示出栅格上悬浮的有孔箔膜的近视图。图4b的插入图详细地显示支架结构。

图5a至5c示出根据一个实施方案的设备的光学和电子图像。显示了每张图像的比例尺。图5a示出根据一个实施方案的设备的区域的低倍光学图像。示出的实施方案包括被覆盖在悬浮的有孔金的薄箔中的3mm金的金属网“栅格”。

图5b是示于图5a中的设备的更高倍的图像，并示出单独的栅格正方形。可以在栅格支架之间的薄金箔中看到规则排列的孔。

图5c是图5a实施方案的箔中单独的孔的透射电子显微图像。所示出的孔含有包括包埋在薄冰层中的70S核糖体的样品。

要理解的是，为了构造适合感兴趣的一些列电子显微镜的支架，可以改变根据多个方面和多个实施方案的支架的各个的参数。具体地，可以调整包括本文列出的那些的参数以提供适合感兴趣的样品的支架。

材料的选择

在示于图4和图5中的实施方案中，选择金作为用于多孔金属箔和支架结构这二者的合适的金属材料。图4和图5的实施方案的支架结构采取栅格的形式，其自身被安装在环形支架上。金是高传导性的(电阻系数2.3μΩcm，相比与无定形碳的～1400μΩcm)，并且穿孔的金箔在金栅格上部上的放置产生没有不连续热膨胀系数的连续电接地平面。

此外，产生自金基底的二次电子的数量远大于来自碳基底或确实来自许多其他候选金属的数量。所产生的二次电子的数量在支架设计中可以是重要的考虑因素，因为当电子显微镜的电子束撞击基底时产生的二次电子起到将样品上任何正的表面电荷中和的作用。

金具有与碳相似的力学稳定性。金的杨氏模量与无定形碳的相当：金79GPa，而碳为～100GPa)。相反，金不容易经受化学转变并且因此在电子束中更稳定。

要理解的是，材料性质的这种组合使得金成为特别适合的金属，以用于形成样品支架的穿孔箔。其他具有相似性质的金属也是合适的基底，例如铂、钯、铑或铪。

金箔的厚度

穿孔的金属箔层的厚度(图4b中的t)是根据本文描述的多个方面和多个实施方案的支架的可调参数。金属箔的最小厚度由被蒸发的金属颗粒的尺寸确定。以金箔为例。样品支架的金箔必须比金颗粒更厚以提供足够的力学稳定性和均匀的电导性。穿孔的金属(例如金)箔的厚度也影响例如填充箔中的孔并将样品保持在那些孔中合适的位置的冰的厚度。可以根据期望的冰的厚度选择最大的金属箔厚度，期望的冰的厚度进而由样品粒子尺寸确定。考虑这些因素，在一个实例中提供穿孔的金箔应当是或所感兴趣的样品粒子的尺寸，以更大的为准。

孔的纵横比

当设计支架时，对于金属箔中孔的纵横比(图4中t/d)可能有实际的限制。那些限制可以由例如构造中的实际约束和所感兴趣的电子显微镜的视场的尺寸决定。在一些实施方案中，可以选择孔的直径(d)与所感兴趣的电子显微镜的视场匹配，以使得显微镜电子束可以布置成均匀照射金属箔中的孔，该容纳有可以将样品封装在其中的冰的孔与金属(例如金)的“环”一起包围并环绕金属箔中穿孔的边缘。在一个实施方案中，通过在选择的图像放大倍数下满足以上标准的最小尺寸给出最优直径。更大的孔可能典型地遭受增加的充电和束诱导的运动，因为它们包含更大的绝缘冰区域。例如，对于在现有电子显微镜中典型的成像条件，在39,000X放大倍数下并具有1.2μm的束直径，可以计算最优箔穿孔孔尺寸为d约等于1μm。

石墨烯装置

根据一些实施方案，样品支架还可以包括石墨烯层。在这些实施方案中，可以将石墨烯层结合到支架基底中。这种石墨烯层可以被布置成使得将其位于穿孔的金属箔的上部上。在一些实施方案中，石墨烯层可以布置为位于支架栅格和穿孔的金属箔之间。

石墨烯层在支架中的提供可以使得石墨烯层可以起到进一步降低积累的表面电荷的作用。那种进一步降低可能是作为石墨烯传导性质的结果产生的。根据其中结合石墨烯的实施方案，石墨烯被布置成与金属箔欧姆接触。石墨烯还可以与支架欧姆接触。石墨烯层在支架中的提供可以使得其起到提高基底力学强度的作用。

在其中将石墨烯层提供在金属箔之上的支架布置中，该石墨烯层的提供可以使得基本上均匀的涂层可以被布置成延伸穿过所述石墨烯层，所述涂层包含一种或多种用于分析的样品或样本。这种布置可以允许控制包含一种或多种样品的涂层的厚度。在这种布置中，可以独立于金属箔的厚度而控制涂层(例如包含蛋白质样品的冰层)的厚度。

在其中将石墨烯层提供在金属箔之下的支架布置中，石墨烯层可以被布置使得含有一种或多种用于分析的样品的基底可以被石墨烯支撑在金属膜中的孔或小孔中。

石墨烯层在根据一些实施方案的支架中的设置可以使得提高支架和/或用于分析的样品的力学稳定性。

此外，合适的石墨烯的选择可以使得当检查生物学样品时这种层的加入可以是有用的，因为其可以允许蛋白质在支架上可控的沉积。

生产方法

要理解的是，可以使用多种生产方法构建根据本文描述的多个方面和多个实施方案的样品支架。仅以举例的方式，为了生产根据一个实施方案的设备的一个实施方案，可以使用在顶部具有悬浮的穿孔无定形碳层的金栅格作为模板。要理解的是，可以使用其他类型的模板，包括：花边碳(laceycarbon)、纳米孔聚碳酸酯和其他图案化塑料。然后将金蒸发到悬浮的模板上。随后通过将装置暴露到低能氧/氩等离子体而将模板移除。可以调整等离子体使得其与所有含碳材料有非常强烈的反应但对金没有影响。这种布置允许用于选择性移除基本上所有的模板层，留下直接附着到纯金网栅格上的穿孔的纯金箔。

图6示出测试实例电子显微镜支架中金粒子在透明性冰中的运动的一个实验的结果。通过成像金粒子可以看出，当在根据一个实施方案的超稳定样品支架上成像时，样品运动减少。图6的左边说明，在通常基底上的冰中的样品典型的运动轨迹(红色曲线)对在我们的超稳定栅格上的冰中的样品的典型的轨迹(黑色曲线)。图6的右边显示，当使用根据一个实施方案的支架时所确定的五个独立的样品的轨迹。可以看出，运动比可以用于定位样品的精确度小，也就是说，小于每个时间点一埃注意图6右边的刻度是以像素计的位移。

支架的实验使用

已经发现，当放置在电子束中时，在根据一个实施方案的超稳定样品支架上制备的样品和样本显示电荷减少。“蜂群效果”是低放大倍数下图像粒度的波动并且是表面充电的结果。已经将通常的支架的“蜂群效果”与当使用根据一个实施方案的超稳定基底时经历的效果相比较，并且发现该效果被大大降低，表明当使用根据本文描述的多个方面和多个实施方案的支架时，可能减少了样品/样本的充电。

可以设计实施方案使得在成像期间电子显微镜的电子束照射金属，所述金属在容纳有样品(在一些情况下，包封在透明性冰中)的多孔性孔的整个周边的附近。这种布置可以允许用于通过金属箔均匀产生二次电子。那些二次电子可以将箔的小孔中的冰内或冰的表面上产生的正电荷中和。当电子束布置成相对于孔偏心时，电子束不接触小孔整个周边的金属(例如金)，并且可以观察到所得图像中的模糊。这种模糊可以表明来自金属(例如金箔)的二次电子在将由样品经历的任何充电现象中和方面是重要的。

与标准EM基底相比，在根据某些实施方案的超稳定支架上制备的样本和样品似乎具有减少的粒子运动并且遭受降低的充电效应。减少的粒子运动由于减少模糊而增加了每个所得图像中的对比度。减少的粒子运动可能是例如以下各项的结果：高力学稳定性、由于降低的电荷累积所致的冰上减弱的力、和将要诱导穿孔的箔膜中的应力的支架中化学变化的消除。降低的充电效应还可以通过减少电子束透镜化诱导的电荷而改善图像的对比度。

图7a和7b示出使用根据一个实施方案的支架成像的样品的比较例。具体地，图7a和7b示出使用在(a)标准有孔碳栅格和(b)根据一个实施方案的支架上的相同蛋白质样品的相同倍数的图像做出的3D电子密度图。在图7b中清楚地分辨出蛋白质样品的α螺旋作为电子密度的圆柱区域。在图7a和7b中成像的分子量450kDa的八面体蛋白质脱铁铁蛋白的直径是用于构建3D图像的多个脱铁铁蛋白图像的取向需要大于分辨率的信息。在常规栅格上使用低温-EM，还不可能确定脱铁铁蛋白的3D结构(图7a)。采用通过使用根据一个实施方案的支架得到的图像，已经生成脱铁铁蛋白的3D重建(图7b)。这样的图像表明根据本文描述的多个方面和多个实施方案的样品支架可以使得明显改善电子显微图像中的信息内容，所述电子显微图像中空间信息的频率大于

根据多个方面和多个实施方案的样品支架可以减少电子显微镜中的粒子运动和/或样品充电，并因而改善由电子显微图像可得的信息内容。适当设计和构造的支架可以导致提高的每个粒子的分辨率以及提高的例如生物学样品的3D重建中角度取向的精确度。这可以使得比之前使用EM技术可能的更小且更困难的蛋白质的结构的确定成为可能。

图8a和8b示出实验结果，所述实验结果说明与常规无定形碳栅格支架相比，根据一种布置的金栅格支架的减少的垂直运动。总的来说，图8a和8b图示说明了在高能电子辐射下，当与常规无定形碳栅格相比时减少的金栅格的运动。示于图8a和8b的曲线中的每个点表示例如碳基底(上面的点和线)或金基底(下面的点和线)中特定孔相对于电子辐射之前其初始位置的r.m.s.垂直位移。每个实线是一个栅格的多个方块中多个孔的平均位移。从图8a可以看出，常规无定形碳栅格在通常低温-EM照射条件(300keV，16e/°A2/s和80K)下展示很大程度的垂直于栅格平面的位移。示于图8a中下面的点和曲线表示关于金栅格的相同的测量。

图8b包括当透明性冰的通常薄层存在时，对于无定形碳栅格支架(上面的点和线)和金支架(下面的点和线)进行的类似的测试和分析。可以看出，相对于不使用冰的栅格，垂直运动降低了约两倍，且通常该运动变得实质上更复杂。在两种情况下，在第一个16e/°A2的辐射期间，与使用常规无定形碳栅格相比，金栅格的栅格垂直位移有平均50倍的降低。

图9a至9d示出实验结果，所述实验结果说明对于使用不同的显微镜支架结构在冰中收集的数据，用时间/电子通量所做的图中，与初始位置平均80S核糖体位移。具体地，图9a涉及由无定形碳的连续层支撑的样品；图9b涉及在无定形碳穿孔支撑膜上没有任何支撑层的样品；图9c涉及支撑在石墨烯基底上的样品；和图9d涉及在金基底上无支撑的冰上的样品。所有的曲线(图9a至9d)具有相同的比例尺。每个点(虚线)表示来自单个栅格的数千个粒子的均方根(RMS)位移，在恒定电子束辐射(300keV；)下使用五帧运行(five-framerunning)的平均值测量所述粒子的位置。图9a至9d的实线是对两个运动相的线性拟合。误差线表示重复试验(对于图9a、b、d是3个独立的栅格，而对于图9c是4个)的平均标准误差。

尽管本文已经参考附图详细公开了本发明的示例性实施方案，但是应理解的是，本发明不限于确定的实施方案，并且可以由本领域技术人员在那里实现不同的变化和修改，而不脱离如通过所附权利要求及他们的等价形式限定的本发明的范围。

本发明的工作接受了来自欧洲研究理事会(EuropeanResearchCouncil)以欧盟第七框架计划(EuropeanUnion′sSeventhFrameworkProgramme)(FP7/2007-2013)/ERC捐赠协议n°261151的资助。

Claims (24)

1.一种电子显微镜样品支架，所述电子显微镜样品支架包括：

支架部件；和

包括多孔区域的金属箔；

所述支架部件被配置成提供结构稳定性给所述金属箔，并且所述金属箔的所述多孔区域被配置成接收电子显微镜样品。

2.根据权利要求1所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔被布置成与所述支架部件欧姆接触。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔包括具有高传导性的金属。

4.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔包括具有高的二次电子产生产率的金属。

5.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔包括具有高力学稳定性的金属。

6.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔包括非反应性金属。

7.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔包括与生物学电子显微镜样品相容的金属。

8.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔包括以下各项中的至少一项：金、铂、钯、铑或铪的金属箔。

9.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔的所述多孔区域包括金属层，所述金属层包括多个孔。

10.根据权利要求9所述的电子显微镜样品支架，其中每一个所述孔中的尺寸被定制为接收至少一个所述电子显微镜样品。

11.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔的厚度被选择为至少是所述电子显微镜样品的最小尺寸。

12.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述支架部件包括多个隔开的支架元件。

13.根据权利要求12所述的电子显微镜样品支架，其中布置所述多个隔开的支架元件以形成网格。

14.根据权利要求11或权利要求12所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属箔的所述多孔区域被布置成延伸穿过所述多个隔开的支架元件的区域。

15.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述支架部件包括金属。

16.根据权利要求15所述的电子显微镜样品支架，其中所述金属包括以下各项中的至少一项：金、铂、钯、铑或铪。

17.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述支架还包括石墨烯层。

18.根据权利要求17所述的电子显微镜样品支架，其中所述石墨烯层被配置成延伸穿过所述金属箔的所述多孔区域中的小孔。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的电子显微镜样品支架，其中所述石墨烯层被配置成与所述金属箔欧姆接触。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的电子显微镜样品支架，其中所述石墨烯层被配置成支撑所述电子显微镜样品。

21.根据任一前述权利要求所述的电子显微镜样品支架，其中所述多孔区域中的小孔被配置成接收将要使用电子显微镜进行检查的辐射敏感材料。

22.一种制造电子显微镜样品支架的方法，所述方法包括：

提供支架部件；和包含多孔区域的金属箔；

配置所述支架部件以提供结构稳定性给所述金属箔；以及

配置所述金属箔的所述多孔区域以接收电子显微镜样品。

23.一种使电子显微镜样品成像的方法，所述方法包括：

将所述电子显微镜样品配置在根据权利要求1至21中任一项所述的支架上；将所述支架布置在显微镜的电子束中；以及，收集分析用的图像数据。

24.可操作用于提供样品的电子显微镜图像的成像设备，所述设备包括：

电子显微镜样品，所述电子显微镜样品安装在根据权利要求1至21中任一项所述的支架上；显微镜的电子束，所述显微镜的电子束被布置成入射在所述支架上；以及收集设备，所述收集设备可操作用于收集分析用的图像数据。