CN110799824A - 用于冷冻电子显微镜的气相样品制备 - Google Patents
用于冷冻电子显微镜的气相样品制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供在基体上可控地形成无定形冰和其他无定形固体的层的方法,还提供利用真空下无定形的冰和其他固体形成的冷冻电子显微镜(cryo‑EM)样品制备方法和系统。无定形固体层的形成可独立于待使用电子显微镜分析的样品分子的沉积,并允许产生均匀厚的层。任选地,质谱仪器用于产生和纯化沉积于所产生的无定形固体层上的分子。本文所述的技术和系统可实现接近理想的cryo‑EM样品制备,从而大幅提高cryo‑EM蛋白成像的分辨率、灵敏度、范围和通量,因此极大地影响结构生物学领域。
Description
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的GM118110的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月7日提交的美国临时专利申请编号62/529,778的优先权,在不与本公开内容相抵触的程度上通过引证将其纳入本文。
发明背景
X射线晶体学传统上是为生物学研究提供结构分析的标准,虽然X射线晶体学仍提供高分辨率的结构信息,但是该技术具有一些缺点。其局限之一为X射线晶体学需要大量的样品。这使得X射线晶体学在难以产生大量、高纯度目标分子的情况下并不实用。
单颗粒冷冻电子显微镜(cryo-EM)正在成为对真核细胞、蛋白质(>150kDa)和大分子复合物(例如脂质体、细胞器和病毒)结构研究的有力替代方法(Stark等人,Microscopy,2016,65(1):23-34))。冷冻电子显微镜是独特的,提供非晶体样品的3D结构信息,同时也常常需要比X射线晶体学更少的样品量。随着新型电子检测器的发展和软件图像重建的进步,冷冻电子显微镜已接近原子级分辨率,使得许多新的生物学发现成为可能。这项技术引起了人们相当大的兴趣,但它仍然存在许多局限性,包括仍然比理论上可行的低四倍的分辨率(Glaeser,R.M.,Nature Methods,2016,13(1):28-32)。大多数局限是由于样品制备导致,样品制备通常需要纯化和玻璃化。将样品包裹于玻璃态冰(即无定形冰)中有助于保护样品免受电子显微镜带来的辐射损伤。理想的样品玻璃化包括使用无定形冰层,其厚度刚好足以容纳感兴趣的颗粒。
然而,实际上,样品玻璃化的过程远非理想。典型的样品制备技术包括蛋白质分析物于水中的溶解,然后将其移液至亲水性EM网格上。用滤纸将网格吸干(除去>99.99%的样品),然后将其插入冷冻剂浴中,从而将剩余的水/样品玻璃化。从电子显微镜结构中获得正确的3D数据的关键部分为,所述颗粒必须全部具有相同的结构构象,但必须在无定形冰中随机取向。正确的3D分析通过大量图像的重建来完成,因此需要以相同结构构象随机取向的大量颗粒。遗憾的是,当前现有的样品制备技术赋予了优选的颗粒取向(很大程度上是由于颗粒向空气/水交界面的迁移),并且颗粒经常在空气-水交界面处变形/拉伸,从而破坏了所需的结构异质性。样品对EM网格基体的吸收也会产生类似的变形。在许多情况下,成像的结构异质性在自然界中是不存在的,并且在没有分离多个构象的方法的情况下,常常无法使用冷冻电子显微镜来获得3D信息(Glaeser,R.M.,Nature Methods,2016,13(1):28-32;和Yu等人,J.Structural biology,2014,187:1-9)。
理想地玻璃化的样品的另一个要求为具有高密度的位于冷冻电子显微镜网格孔内的随机取向的相同分子。这提出了一个重要的问题,因为传统的制备技术每个网格孔仅产生非常少的颗粒。有几个因素导致此问题。首先是大部分样品在吸干过程期间被去除。高度浓缩的样品可以帮助弥补这一问题。但是,即使在最高浓度下,每个网格孔内观察到的颗粒也非常少,因为它们优先吸附到EM网格,从而较少地占用孔。第二,常规方法中的冰的形成导致网格中孔中心的冰比边缘附近的冰更薄,从而迫使颗粒移至外边缘。该方法还可赋予优选的取向,尤其是如果分子在一个维度上比另一个维度更厚的话。在每个孔仅有很少的分析物颗粒的情况下,必须延长数据采集时间,并且数据文件变得非常大(即大于5Tb),因为必须对许多EM网格进行成像以产生足够的信号用于分析。除了限制可被分析的蛋白质的范围和类型外,常规方法还给分析数据所需的计算资源带来了很大压力(Cheng等人,Cell,2015,161(3):438-449)。
出于这些原因,期望获得改进的冷冻电子显微镜样品制备方法和系统,以便改进冷冻电子显微镜的适用性和准确性。
发明内容
本发明提供了用于在基体上可控地形成无定形冰和其他冷冻无定形固体的层的新方法,并且还提供了利用真空玻璃化的冷冻电子显微镜样品制备方法和系统。在本发明的某些方面,无定形固体层的形成与待分析样品的沉积无关,因此允许均匀地厚的层的产生。此外,可以在形成过程中监测无定形固体层的形成,并且固体层中的任何缺陷均可以使用离子研磨或相关技术来校正。在某些方面,本发明还能够提供冷冻电子显微镜样品制备,从而导致提高的图像分辨率、减少的图像采集时间和提高的灵敏度。
本发明的某些方面还包括使用质谱纯化气相中的分析物颗粒(包括但不限于蛋白质、蛋白质复合物和细胞)以用于随后的玻璃化。以此方式制备的样品可使用冷冻转移样品支架从质谱中提取,并可以直接放入电子显微镜中成像。该方法的一种实施方式使用修改的允许分析物离子气相纯化的质谱。所述离子将通过冷却的样品探针,在其中沉积于EM样品支架上并玻璃化。
无定形固体,或非结晶固体,是指缺乏晶体的长程分子有序特征的固体。例如,使用本文描述的方法和系统形成的冰优选为玻璃态冰(本文中也称为无定形冰)。常见的H2O冰为六边形的晶体材料,其中分子规则地排列成六边形的晶格。相反,玻璃态冰缺乏规则有序的分子排列。可用于本发明的玻璃态冰和其他无定形固体通过液相的快速冷却(因此分子没有足够的时间形成晶格)或通过在非常低的温度下压缩普通冰(或普通固体形式)来制备。
本发明的一个实施方案提供了一种制备用于冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品的方法,所述方法包括以下步骤:形成原子或分子的蒸汽流,并将所述蒸汽流导向基体表面,从而使原子或分子在真空下撞击于基体表面上。基体表面处于-100℃或更低的温度(任选地为-150℃或更低、-175℃或更低,或-195℃或更低的温度)。结果,无定形固体层形成于基体表面上。所述方法还包括形成含有带电或不带电的待使用EM的分析物颗粒的分析物束(analyte beam);以及使无定形固体层与分析物束接触。将被分析物颗粒嵌在沉积的无定形固体层之上或之内,从而形成适合用于EM分析的样品。
如本文所述实施方案中所使用的,“在真空下”是指压力为10-4Torr或更少、压力为10-5Torr或更少,或压力为10-6Torr或更少。在实施方案中,蒸汽流的原子或分子接触基体表面,并且使无定形固体层与分析物束接触的步骤在等于或小于10-4Torr、10-5Torr,或10- 6Torr的压力下进行。
取决于用于将分子沉积于冰层上的沉积方法,形成分析物束的分析物颗粒可为带电或不带电的颗粒。优选地,当沉积于诸如膜、薄膜或EM网格之类的基体上时,分析物颗粒和制备无定形固体层的分子基本上是随机取向的。分析物束可为离子束、分子束、或颗粒束。在一个实施方案中,分析物颗粒是使用技术形成的离子,所述技术包括但不限于电喷雾电离和激光解吸(例如基质辅助激光解吸/电离(MALDI))。优选地,在非变性电喷雾条件(native electrospray conditions)下将分析物颗粒电离,以免扰乱颗粒的结构构象。在另一个实施方案中,使用任选地分离或纯化分析物离子的质谱形成分析物离子。或者,颗粒束为分子束。在另一个实施方案中,分子束通过生成含有分析物颗粒的溶液的气溶胶并将气溶胶引入真空系统中来产生。
在某些实施方案中,分析物束的特征在于强度选自以下范围:每秒每1μm20.025至25个颗粒、每秒每1μm20.05至10个颗粒,或每秒每1μm20.1至5个颗粒。在某些实施方案中,分析物束的特征在于光斑尺寸(spot size)选自800μm2至3.8E7μm2的范围。
在沉积于无定形固体上之前,可以纯化或分离分析物颗粒,例如通过质谱设备。优选地,分析物束的特征在于至少85%、90%、95%,或99%的纯度。对于可具有显著构象结构的分析物颗粒,例如蛋白质,需要分析物束的特征在于至少85%、90%、95%或99%的构象纯度。例如,可能需要分析在细胞中表达的特定蛋白质的结构。因此,有必要提供一种EM样品,其中所有或大多数蛋白质分析物分子保持相同的构象结构。
可用于本发明的分析物颗粒包括但不限于蛋白质分子、多蛋白质复合物、蛋白质/核酸复合物、核酸分子、病毒颗粒、微生物、亚细胞成分(例如,线粒体、细胞核、高尔基体等)和整个细胞。在一些实施方案中,分析物颗粒为通过非共价相互作用(例如氢键或离子键)复合在一起的分子实体、单个分子或多个分子。在实施方案中,分析物颗粒具有超过1,000道尔顿、10,000道尔顿、50,000道尔顿、100,000道尔顿或150,000道尔顿的分子量。
沉积的分析物颗粒可嵌入无定形固体层内、沉积在表面上或两者。由于对于EM而言,优选使分析物颗粒完全包裹于无定形固体中,另一个实施方案包括在分析物颗粒沉积于无定形固体层上之后,使无定形固体层与来自蒸汽流的原子或分子额外接触。这将在沉积分子的顶部提供额外的固体层。或者,另一种方法包括在使基体表面与来自蒸汽流的原子或分子接触的同时,使无定形固体层与分析物束接触。在另一个实施方案中,在接触基体表面之前,蒸汽流(或分子水束)从一个或多个反射表面进行反射。这确保了原子或分子在接触基体之前被分解并具有随机取向。
在一个实施方案中,蒸汽流是使用克努森(Knudsen)型渗出池、分子束计量计或基质与分析物向系统中的共渗入而生成的。任选地,蒸汽流的特征在于强度选自每秒每℃m24.8E9至2.8E11分子的范围和/或斑点尺寸选自800μm2至3.8E7μm2的范围。在一个实施方案中,蒸汽流包含于7mm2面积上具有98%以内均匀度的分子通量。在某些实施方案中,蒸汽流为分子束。分子束为沿相同或相似方向运动的分子流,并且可以通过允许较高压力下的气体经小孔膨胀至较低压力下的腔室中以形成束而产生。优选地,与基体表面接触的蒸汽流颗粒的入射轨迹在垂直于基体表面1度以内。
优选地,控制蒸汽流,或研磨、蚀刻或以其他方式精制沉积的无定形固体层,从而使无定形固体层具有2微米或更小、150nm或更小、或100nm或更小的厚度。优选地,无定形固体层具有在整个基体上的变化不超过5%的均匀厚度。优选地,无定形固体层具有小于或等于1%的结晶度。优选地,无定形固体层具有至少85%、90%、95%或99%的纯度。
蒸汽流可以包含能够在暴露于极低的温度和压力的情况下形成无定形固体的任何分子或原子。这样的分子和原子包括但不限于环己醇、甲醇、乙醇、异戊烷、水、O2、Si、SiO2、S、C、Ge、Fe、Co、Bi及其混合物。任选地,蒸汽流包含带电分子。
在一个实施方案中,蒸汽流包含水分子。因此,本发明的一个实施方案提供了一种制备用于冷冻电子显微镜(cryo-EM)的样品的方法,所述方法包括以下步骤:形成水分子的分子束,并在真空下,使基体表面与分子水束接触。基体表面处于-100℃或更低的温度(任选地-150℃或更低、-175℃或更低或-195℃或更低的温度)。结果,在基体的表面上形成无定形冰层。所述方法还包括形成含有待使用EM分析的带电或不带电的分析物颗粒的分析物束;以及使沉积的冰层与分析物束接触。控制分子束,或研磨、刻蚀或以其他方式精制沉积的冰层,从而使具有分析物颗粒的沉积的冰层的厚度为2微米或更小,优选为150nm或更小、或100nm或更小。优选地,冰层具有在整个基体上的变化不超过5%的均匀厚度。
在一个实施方案中,分析物颗粒为离子,并且分析物源能够产生含有带电的分析物离子的可控离子束(例如电喷雾离子沉积)并且引导离子束接触冷冻电子显微镜探针的接收面。在另一个实施方案中,所述系统还包含修改的可为分析物源提供纯化离子的质谱。在另一个实施方案中,所述系统包含电子显微镜,其中冷冻电子显微镜探针从仪器的沉积部分直接转移至仪器的显微镜部分以进行分析。
在某些实施方案中,监测玻璃态冰层或其他无定形固体层的形成(单独或与分析物颗粒的沉积结合),以确保获得适当的厚度并确保沉积于基体上的层为无定形的,而不是晶态的。例如,使用微尺(microscale)来确认固体(例如冰)均匀地沉积于基体、连续薄膜、连续膜、冷冻电子显微镜网格或探针上。类似地,真空室含有窗口或其他装置,以允许可见光或红外线照射样品。然后使用能够接收从沉积的固体层透射或反射的光的可见光或红外线检测池以确定固体是无定形的还是结晶的。优选地,无定形固体形成的监测为实时进行的。
在一个实施方案中,本发明提供了一种冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品制备系统,其包含:a)真空室;b)与真空室一起安装的冷冻电子显微镜探针,其中冷冻电子显微镜探针包含接收面;c)束剂量计,能够产生可控的分子束(或蒸汽流)并引导分子束(或蒸汽流)接触冷冻电子显微镜探针的接收面;d)温度控制装置,能够为冷冻电子显微镜探针的接收面提供-100℃或更低的温度;和e)与真空室流体连通的分析物源,其中分析物源能够产生包含带电或不带电分析物颗粒的可控分析物束,并引导分析物束接触冷冻电子显微镜探针的接收面。在一个实施方案中,分子束包含环己醇、甲醇、乙醇、异戊烷、水、O2、Si、SiO2、S、C、Ge、Fe、Co、Bi或它们的混合物。在一个实施方案中,束剂量计能够产生可控的分子水束。任选地,真空室能够提供10-4Torr的压力、10-5Torr的压力或10-6Torr的压力。任选地,温度控制装置能够提供-150℃或更少、-175℃或更少或-195℃或更少的温度。在低温下提供真空室或其他类型表面的设备和方法在本领域中是众所周知的。例如,在一个实施方案中,温度控制装置包含能够提供冷冻电子显微镜探针接收面的局部温度控制的冷指(coldfinger)。
任选地,本文提供的实施方案中描述的基体是本领域已知的电子显微镜(EM)网格。如本领域中已知的,电子显微镜网格可以包含金属,包括但不限于铜、铑、镍、钼、钛、不锈钢、铝、金或它们的组合。另外,EM网格可包含跨越网格的顶部表面或底部表面或位于网格的孔内的连续的薄膜或隔膜,以便为无定形固体的形成提供固体支撑。优选地,EM网格被薄的薄膜或隔膜覆盖,所述薄膜或隔膜包括但不限于包含石墨烯、氧化石墨烯、氧化硅、氮化硅、碳及它们的组合的薄膜或隔膜。对于不含薄膜或隔膜的网格,旨在形成无定形固体的分子束可穿过网格中至少一部分的孔,而不会产生合适的层。薄膜或隔膜应足够薄,以免散射电子。优选地,薄膜或隔膜具有大约15nm或更小、10nm或更小、5nm或更小、2nm或更小或1nm或更小的厚度。在一个实施方案中,基体为包含跨越网格表面的石墨烯或氧化石墨烯单层薄膜或隔膜的EM网格。
本发明的实施方案提供了一种在基体上形成玻璃态冰层的方法,所述方法包括以下步骤:a)形成水分子的分子束;b)在真空下(即,在10-4Torr或更低的压力下、10-5Torr或更低的压力下或10-6Torr或更低的压力下),使基体与分子水束接触,其中基体处于-100℃或更低的温度(任选地处于-150℃或更低、-175℃或更低或-195℃或更低的温度),从而于基体上形成玻璃态冰层。优选沉积的冰层具有2微米或更小、150nm或更小或100nm或更小的厚度。
附图说明
图1示出了本发明一个实施方案中的冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品制备系统。
图2示出了图1系统的局部横截面,并且进一步描绘了运送分析物束和分子水束的路径。
图3示出了本发明一个实施方案中使用的离子分析物源,其中分析物源包含离子光学器件(例如和截取锥(skimmer))以聚焦和引导离子束。
图4,图a)示出了在本发明一个实施方案中能够产生可控分子水束的束剂量计。图b)示出了束剂量计的横截面。
图5示出了包括束剂量计和样品支架以及用于监测形成于探针上无定形冰的红外光束和微尺的仪器的横截面。
图6示出了在由铜/金网格支撑的氧化石墨烯支撑膜上形成的无定形冰的透射电子显微镜(TEM)图像。氧化石墨烯支撑膜具有小于1nm的厚度。可以清楚地区分开支撑网格中具有无定形冰的孔与网格中没有形成无定形冰的孔或区域。
图7示出了在氧化石墨烯支撑薄膜上形成的无定形冰的另一TEM图像,其中冰层的一部分在其自身上折回。
图8示出了在氧化石墨烯支撑薄膜上形成的无定形冰的另一TEM图像。该图像还示出了用电子束钻透无定形冰的孔,以及不具有冰和结晶态冰的区域。
图9示出了形成于网格上的结晶态冰的TEM图像,该网格具有使用电子束钻透结晶态冰的孔。
图10示出了在不使用覆盖网格的支撑膜的情况下于支撑网格上无定形冰的形成的TEM图像。
图11,顶部图示出了在T<70K(虚线)和T>70(实线)下沉积的无定形H2O冰的IR光谱。底部图示出了在20K(实线)、80K(点划线)和150K(虚线)下沉积的结晶态H2O冰的光谱。这些光谱从Mastrapa等人,Icarus,2008,197:307-320中获得。
图12示出了使用本发明获得的结晶态六角形冰(底线)和无定形冰(顶线)的IR光谱。
图13通过测量频率图解说明了无定形冰的生长速率。所使用的石英晶体的物理特性导致对于其表面上每形成1nm厚的冰,共振频率就会降低21Hz。从20分钟至50分钟间,该实验中冰的形成速率为1.94nm/min。
图14示出了类似于图1中所示实施方案的冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品制备系统的示意图。该实施方案包含用于制备蒸汽流的二次泵送系统和能够在样品表面上已经形成无定形固体之后直接存储样品的储罐。
图15图解说明了安装以用于真空室内的冷冻探针,其位于用以接收来自剂量计的分析物束和分子束的位置。
图16图解说明了如图15所示的真空室内的冷冻探针的横截面。
具体实施方式
在某些实施方案中,本发明提供了新颖的冷冻电子显微镜样品的制备方法,其利用真空中的玻璃化,能够:(1)提高图像分辨率,(2)减少图像采集时间,并且(3)允许灵敏度提高许多数量级。任选地,可以使用容易获得的质谱仪器来纯化气相中的蛋白质和蛋白质复合物,以用于随后的真空中的玻璃化。以此方式制备的样品可从质谱中提取——使用冷冻转移样品支架并且直接放置在EM中以便成像。
实施例1-Cryo-EM样品制备仪器
图1-5和14-16示出了根据本发明某些实施方案的示例性冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品制备系统25。能够容纳或包含样品的冷冻电子显微镜探针2插入至真空室1中。系统的温度使用冷却剂(例如液氮)来保持,冷却剂存储于罐8中并通过冷指5转移,同时使用一个或多个涡轮泵9来保持真空。
将分析物颗粒收集于分析物源6中,在其中将它们聚焦成分析物束13(例如通过电喷雾离子沉积),并引导其接触被冷冻电子显微镜探针2容纳的样品板(见图2)。图3示出了一种类型的分析物源6,其中分析物离子或分子通过毛细管16被引入分析物源6中。一个或多个离子光学器件(例如截取锥17),用于将分析物离子聚焦成束13,并控制离子通过出射孔18的释放速度。
束剂量计4用于产生一个或多个分子束14(例如分子水束),并将分子束向下引导至冷冻电子显微镜探针2。用于产生分子束14的蒸汽34(例如水蒸气)通过加热传输线19传输,然后沿着与分析物束13运动相同的轴传输。任选地,将分子束14从一系列反射表面26反射,这使分子分解并使它们的取向随机化(参见图4,图b)。如果使束沿正确的方向(即,与分析物束13同轴的方向)取向,微通道板20仅允许反射的分子束14通过。应注意,虽然这些实施例列举了水蒸气和
冷冻电子显微镜探针2用于根据需要横向移动样品。例如,样品支架21可将探针2移动至石英晶体微尺10,该石英晶体微尺10用于监测在冷冻电子显微镜探针2上的冰层的堆积(build-up)(见图1和5)。另外,样品可移动至被通过光纤IR光源7提供的IR光束22照射的红外(IR)样品板15。透射的光由光学检测池11收集并透射至光纤IR光谱仪23,以监测沉积的冰层是包含玻璃态冰还是结晶态冰。
在另一个实施方案中,图14-16图解说明了冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品制备系统25,其中所述系统包含用于制造蒸汽流34的二次泵送系统27,以及能够在样品上形成玻璃态冰之后直接储存来自真空室1的样品的储罐28。将储罐保持低温,且储罐也可使用冷却剂例如液氮。
实施例2-气相分析物纯化
蛋白质离子可在气相中纯化,在真空中收集,并且一旦从真空中移出,还保有其酶促的功能(Blake等人,Analytical Chemistry,2004,76(21):6293-6305)。在这些实验之后,对质谱进行修改,从而可纯化分析物蛋白质离子并使其直接沉积于样品探针上。探针表面最初在不锈钢上包含丙三醇;然而,使用所要求的冷冻转移探针,纯化的蛋白质离子会直接沉积于先前已被玻璃态冰覆盖的冷冻EM网格上。与样品无关的冰层的形成允许均匀地厚的冰的产生。冰中的任何缺陷均可使用离子研磨或相关技术进行校正。独立地形成冰还允许在提交样品之前采取适当的质量控制措施。
玻璃态冰经历了从在其形成的大气压下的高密度无定形(HDA)冰到质谱低压下的低密度无定形(LDA)冰的相变(Mishima等人,Nature,1998,396(6709):329-335)。至关重要的是,纯化的蛋白质离子必须具有能反映其在溶液中结构的结构。离子迁移率实验表明,这在非变性喷雾条件下实现(Seo等人,Angewandte Chemie-International Edition,2016,55(45):14173-14176)。另外,离子/离子化学反应还用于减少沉积前纯化蛋白质总体的电荷,从而恢复溶液相结构。
实施例3-无定形冰的形成
本发明提供了用于制备在冷冻电子显微镜(Cryo-EM)中使用的具有无定形固体的分析物的样品的方法和仪器。无定形固体——其用于保护被分析物在成像过程中免于辐射损伤和脱水——在电子显微镜期间必须对电子束保持透明。这要求无定形固体层(例如,冰层)是薄的,与待分析分子的相同厚度相近,并且固体必须是无定形的。如果无定形固体变得太厚,则电子可能会被散射,从而造成散焦和图像对比度的降低。如果有序晶体(例如结晶态冰)开始形成,则电子将被衍射,并且所产生的衍射图将使图像变模糊(Cheng等人,Cell,2015,161(3):438-449)。如上所述,与形成玻璃化样品相关的困难是本领域众所周知的。
可能不太为人所知的是玻璃态冰在外太阳系和星际空间中的重要性(Fama等人,Surface Science,2008,602(1):156-161;和Cleeves等人,Science,2014,345(6204):1590-1593)。太空的高真空和寒冷为玻璃态冰的自然形成提供了基础。实际上,这是我们太阳系外最常见的冰的形式(Guillot等人,J.Chemical Physics,2004,120(9):4366-4382)。研究玻璃态冰的显著困难需要开发技术以在实验室内在星际条件下、特别是在低温真空室中形成无定形冰。许多模拟条件要求形成非常薄的无定形冰层。这已通过使用放置于真空系统内的克努森型渗出容器和分子束计量器而实现(Moeller等人,Optical Engineering,2012,51(11):115601;和Huffstetler等人,Journal of Vacuum Science&Technology a-Vacuum Surfaces and Films,2001,19(3):1030-1031)。但是,这些方法没有描述如何制备连同待分析样品一起的无定形固体。
与本文所述的质谱和技术结合的无定形固体的形成提供了一种新颖的制备用于冷冻电子显微镜的玻璃态样品的手段,其消除了与当前采用的急速冷冻方法相关的所有局限性。在一个实施方案中,将保持在液氮温度下的未覆盖的冷冻电子显微镜网格或被连续的薄膜或隔膜覆盖的冷冻电子显微镜网格用作质谱中的着陆表面。在网格表面上具有连续的薄膜或隔膜的EM网格的实施例可由Quantifoil Micro Tools GmbH(Germany)和Electron Microscopy Sciences(Hatfield,Pennsylvania,USA)中获得。利用上述气相分析物纯化技术,在网格(被覆盖或未被覆盖)中装入生物分子。在同一真空室内有一个对准着陆表面的分子束剂量计。剂量计的工作是产生可控的水分子束,该水分子束会影响冷冻表面/网格,形成玻璃态冰(剂量计的一般性描述,参见Guillot等人,J.Chemical Physics,2004,120(9):4366-4382;Moeller等人,Optical Engineering,2012,51(11):115601;和Westly等人,J.Chemical Physics,1998,108(8):3321-3326)。
最初,在基底上产生非常薄的冰层。随后是直接来自于分析物源或在使用质谱进行气相纯化后的分析物颗粒的沉积。伴随分析物颗粒的收集,使用分子水束将分析物颗粒包裹于无定形冰中。或者,使分析物颗粒着陆于初始无定形冰表面上,然后使用蒸汽流用无定形冰覆盖/包裹。使用石英晶体微量天平实时监测冰的堆积(Moeller等人,OpticalEngineering,2012,51(11):115601;和Gutzler等人,Review of ScientificInstruments,2010,81(1):015108)。收集/样品制备完成后,将探针和基体从设备中取出并直接转移至冷冻电子显微镜中。
图6-9示出了在由铜和/或金网格支撑的氧化石墨烯支撑薄膜上形成的无定形冰的透射电子显微镜(TEM)图像。在-175℃的温度下在真空下暴露于分子束剂量计15分钟的情况下收集玻璃态冰。所得的冰层约15微米厚。除了温度为-155℃,以相同的方式得到六角形冰。如附图所示,可以清楚地区分被无定形冰区域41覆盖的支撑网格中的孔40与无冰的任何形成的情况下网格42中的区域或孔。孔47还使用电子束钻透无定形冰区域41和结晶态冰区域43。
如图8和9所示,无定形冰区域41看起来与结晶态的六角形冰43的区域非常不同。总体而言,这些图表明在网格中的孔上形成了一层固体,其中该层不是固体的典型结晶态形式。
通过红外(IR)光谱进一步证实了这些观察结果。图11示出了沉积于基体上的无定形H2O冰和结晶态H2O冰的IR光谱(Mastrapa等人,Icarus,2008,197:307-320)。从这些光谱中可以看出,与来自结晶态冰的峰相比,来自无定形冰的峰移动至更短波长。图12示出了使用本发明的结晶态六角形的冰(底部的线)和无定形冰(顶部的线)的IR光谱。与结晶态冰相比,在本发明下获得的无定形冰的峰移动至更短的波长,类似于Mastrapa等人报道的内容。因此,据信这些结果清楚地表明无定形冰已成功沉积于样品上。
另外,图13图解说明了通过测量石英晶体微量天平频率而得的无定形冰的生长速率。石英晶体微量天平的物理特性导致其表面每形成1nm厚的冰,共振频率就会降低21Hz。因此,从20分钟至50分钟,该实验中冰的形成速率为1.94nm/min。
尽管上述实验使用了在铜或金支撑网格上的薄的连续氧化石墨烯层,但在没有使用网格上隔膜或薄膜的网格中也观察到无定形冰的成功形成。例如,图10示出了在没有使用连续的薄膜或隔膜的情况下的网格44。水分子可轻易地穿过网格中至少一部分孔。结果,可能很少或没有冰来桥接空的孔46。然而,仍然看到跨越几个孔45的冰层。
实施例4-其他无定形固体的形成
玻璃态冰——其保护分析物免于成像期间的辐射损伤和脱水——必须在电子显微镜期间对电子束保持透明。这要求冰层是薄的,与待分析分子的相同厚度相近,并且冰必须是无定形的。如果无定形冰变得太厚,则电子可能会散射,造成散焦和图像对比度的降低。如果结晶态冰开始形成,则电子将被衍射,并且所产生的衍射图将使图像变模糊(Cheng等人,Cell,2015,161(3):438-449)。
除水外,还有其他物质在低温下会形成无定形固体。这些物质包括但不限于环己醇、甲醇、乙醇、异戊烷、O2、SiO2、S、C、Ge、Fe、Co和Bi,等等。与水一样,无定形态通过气相冷凝而得。与可通过若干技术转化为无定形固体的水不同,而这些元素则需要进行蒸汽-冷凝以形成非结晶态(Zallen R.,The Physics ofAmorphous Solids,1983,8-10)。简而言之,所述基质的蒸汽流通过加热(热汽化)、电子束汽化、离子轰击汽化,或等离子体诱导分解——全部在真空中进行——而形成。真空室含有冷表面,原子在其上凝结。在它们迁移至结晶构象前,将它们的热能提取出来。结果得到无定形固体的薄膜(<50微米厚)。
鉴于诸如(但不限于)Si、Ge、Fe、Co和Bi之类的物质需要蒸汽冷凝来形成的事实,这些化合物与实施例1仪器的结合提供了一种新颖的使用除冰以外基质制备用于冷冻电子显微镜的玻璃态样品的手段。除了所用的基质材料外,形成的无定形材料的孔隙率/密度可通过采用的沉积角度以及沉积基质分子的能量来控制(Dohnalek等人,Journal ofChemical Physics,2003,118(1):364-372)。这种新颖的能力将使得能够对无定形材料进行微调,以在冷冻电子显微镜分析中为生物分子提供最大保护。在一种情况下,使用保持在液氮温度下的冷冻电子显微镜网格(未覆盖的网格或被薄膜或隔膜覆盖的网格)作为样品制备仪器内的着陆表面(实施例1)。使用电喷雾沉积将生物分子装入网格中。在同一真空室内有对准着陆表面的汽化源。该源可离轴放置以实现基质分子在表面上的入射角度。汽化源的工作是产生会影响冷冻表面/网格、成形和无定形固体的可控的材料(包括但不限于H2O、Si、Ge、Fe、Co、Bi)的蒸汽流。
最初,在网格上产生非常薄的材料层。然后是收集通过ESI沉积源分离后的大分子。伴随这些分子的收集,使用蒸汽束包裹样品。当收集/样品制备完成时,将探针和电子显微镜网格从样品制备仪器中取出并直接转移至冷冻电子显微镜中。
为了便于清晰的理解,现在已经通过图解说明和实施例稍为详细地描述了本发明,对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是,在不影响本发明或其任何具体实施方式的情况下,通过在宽且等同的条件、配方和其他参数内修改或改变本发明可实施相同的操作,并且这些修改或改变旨在包含于所附权利要求的范围内。
当本文公开一组材料、组合物、组分或化合物时,应理解为分别公开那些组的所有单独组分及其所有子组。除非另有说明,否则本文所述或例示的每种制剂或组分的组合均可用于实施本发明。每当在说明书中给定范围时,例如温度范围、时间范围或组合物范围,给定范围所包括的所有中间范围和子范围以及所有单个值均意在包括于本公开中。另外,给定范围内的端点应包括于所述范围内。在本公开和权利要求中,“和/或”意指附加地或替代地。此外,任何以单数形式使用的术语也涵盖复数形式。
如本文所用,“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义,并且是包括性的或无限制的,并且不排除另外的、未叙述的要素或方法步骤。如本文所用,“由……组成”排除未在权利要求要素中指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用,“基本上由……组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本特征和新颖特征的材料或步骤。本文中对术语“包含”的任何叙述,特别是在组合物的组分的描述中或在设备的元件的描述中,应理解为涵盖基本上由所述组分或元素组成和由所述组分或元素组成的那些组合物和方法。
本领域的普通技术人员将理解,除了明确示例的那些之外,起始材料、设备元件、分析方法、混合物和组分的组合可用于本发明的实施中,而无需过多实验。所有本领域已知的任何这样的材料和方法的功能等同物都意在包括于本发明中。已经采用的术语和表达作为描述性而非限制性的术语使用,并且不意在使用这些术语和表达时排除所示和描述的特征或其部分的任何等同形式,但应认识到,在所要求保护的本发明的范围内可进行各种修改。本文以图解说明的形式适当地描述的本发明可在缺乏本文未明确公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实施。
本文所引用的所有出版物均以与本文不矛盾的程度纳入本文。本文提供的一些参考文献通过引证纳入以提供本发明的附加用途的细节。说明书中提到的所有专利和出版物均指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。本文引用的参考文献通过引证整体并入本文,以指示截至其提交日期的技术情况,并且如果需要,意在本文中采用此信息以排除现有技术中的特定实施方案。
Claims (73)
1.一种制备用于冷冻电子显微镜(cryo-EM)的样品的方法,包括以下步骤:
a)形成原子或分子的蒸汽流;
b)引导蒸汽流朝向基体表面,使原子或分子在真空下撞击基体表面,其中基体表面处于-100℃或更低的温度,从而在基体表面上形成原子或分子的无定形固体层,其中无定形固体层具有2微米或更小的厚度;
c)形成含有带电或不带电分析物颗粒的分析物束;和
d)使无定形固体层与分析物束接触,从而将分析物颗粒嵌在沉积的无定形固体层之上或之内。
2.根据权利要求1所述的方法,还包括在所述分析物颗粒已被嵌在无定形固体层上之后使无定形固体层与来自蒸汽流的原子或分子额外接触。
3.根据权利要求1所述的方法,还包括在使基体表面与来自蒸汽流的原子或分子接触的同时使基体表面与分析物束接触。
4.根据权利要求1-3所述的方法,其中蒸汽流包含能够形成无定形固体的分子或原子,所述分子或原子包含环己醇、甲醇、乙醇、异戊烷、水、O2、Si、SiO2、S、C、Ge、Fe、Co和Bi中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4所述的方法,其中蒸汽流包含水分子。
6.根据权利要求1-5所述的方法,其中蒸汽流包含带电分子。
7.根据权利要求1-6所述的方法,其中基体为电子显微镜(EM)网格,其包含跨越EM网格的顶部或底部表面的连续的薄膜或隔膜。
8.根据权利要求1-7所述的方法,其中蒸汽流的原子或分子在等于或小于10-4Torr的压力下接触基体表面。
9.根据权利要求1-7所述的方法,其中所述使无定形固体层与分析物束接触的步骤在10-4Torr的压力下进行。
10.根据权利要求1-9所述的方法,还包括使用冷冻电子显微镜分析无定形固体层之上或之内的所述分析物颗粒的步骤。
11.根据权利要求1-10所述的方法,其中分析物束为离子束。
12.根据权利要求11所述的方法,其中离子束是使用电喷雾电离或激光解吸而产生的。
13.根据权利要求11所述的方法,其中分析物颗粒在非变性电喷雾条件下被离子化,以便不扰乱颗粒的结构构象。
14.根据权利要求1-10所述的方法,其中分析物束为分子束。
15.根据权利要求14所述的方法,其中分析物分子束通过生成含有分析物颗粒的溶液的气溶胶并将所述气溶胶引入真空系统中而产生。
16.根据权利要求1-10所述的方法,其中分析物束为颗粒束。
17.根据权利要求1-16所述的方法,其中分析物束的特征在于强度选自每秒每1μm20.025至25个颗粒的范围。
18.根据权利要求1-17所述的方法,其中分析物束的特征在于至少90%的纯度。
19.根据权利要求1-18所述的方法,其中分析物束的特征在于至少90%的构象纯度。
20.根据权利要求1-19所述的方法,其中分析物束的特征在于斑点尺寸选自800μm2至3.8E7μm2的范围。
21.根据权利要求1-20所述的方法,其中沉积的分析物颗粒在无定形固体层内至少基本上随机取向。
22.根据权利要求1-21所述的方法,其中分析物颗粒为通过非共价相互作用而复合在一起的分子实体、单个分子或多个分子。
23.根据权利要求1-22所述的方法,其中分析物颗粒为蛋白质分子、多蛋白质复合物、蛋白质/核酸复合物、核酸分子、病毒颗粒、微生物、亚细胞组分或全细胞。
24.根据权利要求1-23所述的方法,其中蒸汽流是使用克努森型渗出池、分子束剂量计或基质与分析物向系统的共渗入而生成的。
25.根据权利要求1-24所述的方法,其中蒸汽流的特征在于强度选自每秒每μm24.8E9至2.8E11个分子的范围。
26.根据权利要求1-25所述的方法,其中蒸汽流的特征在于至少90%的纯度。
27.根据权利要求1-26所述的方法,其中蒸汽流的特征在于斑点尺寸选自800μm2至3.8E7μm2的范围。
28.根据权利要求1-27所述的方法,其中所述蒸汽流包含在7mm2面积上具有98%以内均匀度的分子通量。
29.根据权利要求1-28所述的方法,其中所述蒸汽流颗粒的入射轨迹为垂直于所述基体表面的1度以内。
30.根据权利要求1-29所述的方法,还包含在接触基体表面之前,使蒸汽流的原子或颗粒从一个或多个反射表面反射。
31.根据权利要求1-30所述的方法,其中基体表面处于-175℃或更低的温度。
32.根据权利要求1-31所述的方法,其中无定形固体层具有小于或等于1%的结晶度。
33.根据权利要求1-32所述的方法,其中无定形固体层具有至少95%的纯度。
34.根据权利要求1-33所述的方法,还包括研磨或刻蚀无定形固体层的表面以去除层中的变形。
35.根据权利要求1-34所述的方法,还包括实时监测无定形固体层的形成。
36.根据权利要求35所述的方法,其中监测步骤使用微尺或可见光或红外线检测池来完成。
37.根据权利要求1-36所述的方法,还包括使用质谱分离分析物颗粒并使用所述分离的分析物颗粒形成分析物束的步骤。
38.一种制备用于冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品的方法,包括以下步骤:
a)形成水分子的分子束;
b)在真空下使基体表面与分子水束接触,其中基体表面处于-100℃或更低的温度,从而在基体表面上形成无定形冰层,其中沉积的冰层具有2微米或更小的厚度;
c)形成含有带电或不带电分析物颗粒的分析物束;和
d)使沉积的冰层与分析物束接触,从而将分析物颗粒嵌在冰层之上或之内。
39.根据权利要求38所述的方法,还包括在所述被分析物颗粒已被嵌在冰层上之后使沉积的冰层与分子水束额外接触。
40.根据权利要求38所述的方法,还包括在使沉积的冰层与分子水束接触的同时使沉积的冰层与分析物束接触。
41.根据权利要求38-40所述的方法,其中所述使基体表面与分子水束接触的步骤在等于或小于10-4Torr的压力下进行。
42.根据权利要求38-41所述的方法,其中所述使沉积的冰层与分析物束接触的步骤在等于或小于10-4Torr的压力下进行。
43.根据权利要求38-42所述的方法,还包括使用冷冻电子显微镜分析在冰层上或冰层内的所述分析物颗粒的步骤。
44.根据权利要求38-43所述的方法,其中基体为电子显微镜(EM)网格,其包含跨越EM网格的顶部或底部表面的连续的薄膜或隔膜。
45.根据权利要求38-44所述的方法,其中分析物束为离子束、分子束或颗粒束。
46.根据权利要求38-45所述的方法,其中分析物束的特征在于强度选自每秒每1μm20.025至25个颗粒的范围。
47.根据权利要求38-46所述的方法,其中分析物束的特征在于90%的纯度和至少90%的构象纯度。
48.根据权利要求38-47所述的方法,其中分析物束的特征在于斑点尺寸选自800μm2至3.8E7μm2的范围。
49.根据权利要求38-48所述的方法,其中沉积的分析物颗粒在冰层内至少基本上随机取向。
50.根据权利要求38-49所述的方法,其中分子水束是使用克努森型渗出池、分子束剂量计或基质与分析物向系统的共渗入而生成的。
51.根据权利要求38-50所述的方法,其中分子水束的特征在于强度选自每秒每μm24.8E9至2.8E11个分子。
52.根据权利要求38-51所述的方法,其中分子水束的特征在于至少90%的纯度。
53.根据权利要求38-52所述的方法,其中分子水束的特征在于斑点尺寸选自800μm2至3.8E7μm2的范围。
54.根据权利要求38-53所述的方法,还包括在使基体表面与分子水束接触之前使分子水束从一个或多个反射表面反射。
55.根据权利要求38-54所述的方法,其中EM网格的表面处于-175℃或更低的温度。
56.根据权利要求38-55所述的方法,其中无定形冰层具有小于或等于1%的结晶度和至少90%的纯度。
57.根据权利要求38-56所述的方法,还包括研磨或刻蚀沉积的冰层表面以去除冰层中的变形。
58.根据权利要求38-57所述的方法,还包括实时监测冰层的形成。
59.根据权利要求38-58所述的方法,其中监测步骤使用微尺或可见光或红外线检测池来完成。
60.根据权利要求38-59所述的方法,还包括使用质谱分离分析物颗粒和使用所述分离的分析物颗粒形成分析物束的步骤。
61.冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品制备系统,包含:
a)真空室;
b)与真空室一起放置的cryo-EM探针,其中所述cryo-EM探针包含接收面;
c)束剂量计,能够产生可控的分子束并引导所述分子束接触cryo-EM探针的接收面;
d)温度控制装置,能够为cryo-EM探针的接收面提供-100℃或更低的温度;和
e)与真空室流体连通的分析物源,其中分析物源能够产生含有带电或不带电分析物颗粒的可控分析物束,并引导所述分析物束接触cryo-EM探针的接收面。
62.根据权利要求61所述的系统,其中温度控制装置包含能够提供cryo-EM探针接收面的局部温度控制的冷指。
63.根据权利要求61-62所述的系统,其中温度控制装置能够为冷冻cryo-EM探针的接收面提供-175℃或更低的温度。
64.根据权利要求61-63所述的系统,其中分析物源能够产生含有带电的分析物离子的可控离子束,并且引导所述离子束接触cryo-EM探针的接收面。
65.根据权利要求61-64所述的系统,还包含修改的能够向分析物源提供离子的质谱。
66.根据权利要求61-65所述的系统,还包含与cryo-EM探针接触的微量天平,其中微量天平能够测量沉积于cryo-EM探针的接收面上的冰。
67.根据权利要求61-66所述的系统,还包含能够照射沉积于cryo-EM探针接收面上的冰层的光源以及能够接收从冰层透射或反射的光的可见光或红外线检测池。
68.根据权利要求61-67所述的系统,其中所述分子束包含环己醇、甲醇、乙醇、异戊烷、水、O2、Si、SiO2、S、C、Ge、Fe、Co、Bi或它们的混合物。
69.根据权利要求61-68所述的系统,其中束剂量计能够产生可控的分子水束。
70.一种在基体上形成无定形冰层的方法,其包括以下步骤:
a)形成水分子的分子束;
b)在真空下,使基体与分子水束接触,其中基体的温度为-100℃或更低,从而在基体上形成无定形冰层,其中沉积的冰层具有2微米或更小的厚度。
71.根据权利要求70所述的方法,其中基体处于-175℃或更低的温度。
72.根据权利要求70-71所述的方法,还包括在基体与分子水束接触之前,使分子水束从一个或多个表面反射。
73.根据权利要求70-72所述的方法,还包括研磨或刻蚀沉积的冰层表面以去除冰层中的变形。
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