JP7056859B2 - 低温電子顕微鏡の気相試料調製 - Google Patents
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Description
[0044]図1~5及び図14~16は、本発明のいくつかの実施形態による例示的な低温電子顕微鏡(低温EM)試料調製システム25を示す。試料を保持又は収容できる低温EMプローブ2が真空チャンバ1に挿入されている。システムの温度は、タンク8に貯蔵されコールドフィンガ5を通して移送される液体窒素などの冷却剤を使用して維持され、1つ又は複数のターボポンプ9が真空を維持するために使用される。
[0049]タンパク質イオンは、気相で精製すること、真空中で収集すること、及び、真空から取り出した後に、その酵素の機能を保持することができる(Blake他、Analytical Chemistry、2004、76(21):6293~6305頁)。これらの実験に倣って、質量分析計が、分析物タンパク質イオンを精製し試料プローブの上に直接堆積できるように修正された。プローブ表面は当初、ステンレス鋼の上にグリセロールを備えていたが、要望された低温移送プローブを用いて精製タンパク質イオンが、ガラス氷で前もって覆われている低温EMグリッドの上に直接堆積される。試料と無関係に氷層を形成することにより、均一な厚い氷の生成が可能になる。氷に不完全さがもしあれば、イオンミリング又は関連する技法を用いて補正することができる。独立して氷を形成することにより、適切な品質管理尺度が試料を引き渡す前に可能にもなる。
[0051]本発明は、低温電子顕微鏡(低温EM)に使用するためのアモルファス固体を用いて、分析物の試料を調製する方法及び機器を提供する。撮像中に放射線損傷及び脱水から分析物を保護するアモルファス固体は、EMの間、電子ビームに対し透過性のままでなければならない。このことにより、アモルファス固体層(たとえば、氷層)は、分析されるべき分子の厚さと同じ程度に薄いことが必要とされ、また固体はアモルファスでなければならない。アモルファス固体が厚くなりすぎた場合、電子が散乱して、焦点はずれ及び画像コントラスの低下が生じ得る。結晶氷などの規則的に配列した結晶が形成し始めると、電子が回折することになり、その結果生じる回折パターンが画像を不明瞭にする(Cheng他、Cell、2015、161(3):438~449頁)。上述のガラス化試料を形成することに伴う難題は、当技術分野でよく知られている。
[0060]撮像中に放射線損傷及び脱水から分析物を保護するガラス氷は、EMの間、電子ビームに対し透過性のままでなければならない。このことにより、氷層は、分析されるべき分子の厚さと同じ程度に薄いことが必要とされ、また氷はアモルファスでなければならない。アモルファス氷が厚くなりすぎた場合、電子が散乱して、焦点はずれ及び画像コントラスの低下が生じ得る。結晶氷が形成し始めると、電子が回折することになり、その結果生じる回折パターンが画像を不明瞭にする(Cheng他、Cell、2015、161(3):438~449頁)。
Claims (30)
- a)原子又は分子の蒸気流を形成するステップと、
b)真空下にある間に、前記蒸気流を基板表面に向けて、前記原子又は分子が前記基板表面に衝突するように誘導するステップであって、前記基板表面が-100℃以下の温度であり、以て前記原子又は分子のアモルファス固体層が前記基板表面に形成され、前記アモルファス固体層が2マイクロメートル以下の厚さを有するステップと、
c)荷電又は非荷電分析物粒子を含む分析物ビームを形成するステップと、
d)前記アモルファス固体層を前記分析物ビームと接触させて、前記分析物粒子を前記堆積されたアモルファス固体層の上又は中に埋め込むステップと
を含む、低温電子顕微鏡(低温EM)の試料を調製する方法。 - 前記分析物粒子が前記アモルファス固体層に埋め込まれた後に、前記アモルファス固体層を前記蒸気流からの原子又は分子と追加的に接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記基板表面を前記蒸気流からの前記原子又は分子と接触させるのと同時に、前記基板表面を前記分析物ビームと接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記蒸気流が、アモルファス固体を形成できる分子又は原子を含み、前記分子又は原子が、シクロヘキサノール、メタノール、エタノール、イソペンタン、水、O2、Si、SiO2、S、C、Ge、Fe、Co、及びBiのうちの1つ又は複数を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基板が電子顕微鏡(EM)グリッドであり、前記EMグリッドは、上面又は底面の全体にわたって連続フィルム又は膜を備える、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蒸気流の前記原子又は分子が、10-4トル以下の圧力において前記基板表面に接触する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アモルファス固体層を前記分析物ビームと接触させる前記ステップが10-4トルの圧力において実行される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アモルファス固体層の上又は中の前記分析物粒子を、低温電子顕微鏡を使用して分析するステップをさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析物ビームが、エレクトロスプレーイオン化又はレーザ脱離を用いて生成されるイオンビームである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析物ビームが分子ビーム又は粒子ビームである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析物分子ビームが、溶液を含む分析物粒子のエアロゾルを生成することによって、及び前記エアロゾルを真空システムの中に導入することによって生成される、請求項10に記載の方法。
- 前記蒸気流が、クヌーセン型浸出セル、分子ビーム投与器、又はシステムの中への、分析物と一緒の基質の共浸出を用いて生成される、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アモルファス固体層の形成をリアルタイムで観察するステップをさらに含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基板表面が-175℃以下の温度である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- a)水分子の分子ビームを形成するステップと、
b)真空下にある間に、基板の表面を前記分子水ビームと接触させるステップであって、前記基板表面が-100℃以下の温度であり、以てアモルファス氷の層が前記基板表面に形成され、前記堆積された氷層が2マイクロメートル以下の厚さを有するステップと、
c)荷電又は非荷電分析物粒子を含む分析物ビームを形成するステップと、
d)前記堆積された氷層を前記分析物ビームと接触させて、前記分析物粒子を前記氷層の上又は中に埋め込むステップと、
を含む、低温電子顕微鏡(低温EM)の試料を調製する方法。 - 前記分析物粒子が前記氷層に埋め込まれた後に、前記堆積された氷層を前記分子水ビームと追加的に接触させるステップをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記堆積された氷層を前記分子水ビームと接触させるのと同時に、前記堆積された氷層を前記分析物ビームと接触させるステップをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記基板表面を前記分子水ビームと接触させるステップ及び前記堆積された氷層を前記分析物ビームと接触させるステップが、10-4トル以下の圧力において実行される、請求項15~17のいずれか一項に記載の方法。
- a)真空チャンバと、
b)前記真空チャンバと共に配置された低温EMプローブであり、受け面を備える低温EMプローブと、
c)制御可能な分子ビームを生成し、前記分子ビームを前記低温EMプローブの前記受け面に接触するように誘導できるビーム投与器と、
d)前記低温EMプローブの前記受け面を-100℃以下の温度にすることができる温度制御手段と、
e)前記真空チャンバと流体連通している分析物供給源と、
を具備する低温電子顕微鏡(低温EM)試料調製システムであって、
前記分析物供給源が、荷電又は非荷電分析物粒子を含む制御可能な分析物ビームを生成し、前記分析物ビームを前記低温EMプローブの前記受け面に接触するように誘導することができる、低温電子顕微鏡(低温EM)試料調製システム。 - 前記温度制御手段が、前記低温EMプローブの前記受け面の局部的な温度制御を行うことができるコールドフィンガを備える、請求項19に記載のシステム。
- 前記温度制御手段が、前記低温EMプローブの前記受け面の温度を-175℃以下にすることができる、請求項19又は20に記載のシステム。
- 前記分析物供給源が、荷電分析物イオンを含む制御可能なイオンビームを生成し、前記イオンビームを前記低温EMプローブの前記受け面に接触するように誘導することができる、請求項19~21のいずれか一項に記載のシステム。
- イオンを前記分析物供給源に供給できる修正された質量分析計をさらに備える、請求項19~22のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記低温EMプローブと接触している微量天秤をさらに備え、前記微量天秤が、前記低温EMプローブの前記受け面に堆積された氷を測定することができる、請求項19~23のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記低温EMプローブの前記受け面に堆積された氷層を照射できる光源と、前記氷層から送出又は反射された光を受光できる光検出セル又は赤外光検出セルとをさらに備える、請求項19~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ビーム投与器が、制御可能な分子水ビームを生成することができる、請求項19~25のいずれか一項に記載のシステム。
- a)水分子の分子ビームを形成するステップと、
b)真空下にある間に、基板を前記分子水ビームと接触させるステップであり、前記基板が-100℃以下の温度であり、以てアモルファス氷の層が前記基板に形成され、前記堆積された氷層が2マイクロメートル以下の厚さを有するステップと、
を含む、基板にアモルファス氷の層を形成する方法。 - 前記基板が-175℃以下の温度である、請求項27に記載の方法。
- 前記基板を前記分子水ビームと接触させる前に、前記分子水ビームを1つ又は複数の表面から反射するステップをさらに含む、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記堆積された氷層の前記表面をミリング又はエッチングして前記氷層の変形を除去するステップをさらに含む、請求項27~29のいずれか一項に記載の方法。
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