JP6831054B2 - グラフェン改変 - Google Patents
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Description
こし、大きな分子及びウイルスの近原子分解能3D構造を可能にしてきた(Grigorieff, N. & Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral virusesfrom electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21, 265-273 (2011)、Campbell, M. G. et al. Movies of ice-embedded particles enhanceresolution in electron cryomicroscopy. Structure 20, 1823-1828 (2012)、Bai, X.-C., Fernandez, I.
S., McMullan, G. & Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution
from thirty thousand cryo-EM particles. eLife 2, e00461 (2013))。電子低温顕微
鏡法(クライオ−EM)は、タンパク質構造を決定するために使用されている。それは、なお開発中の方法であり、得られる3D再構成の分解能は、着実に増大してきている。現行の方法論によって、近原子分解能を得ることができる。分解能がさらに増大するにつれて、製薬業界は、恐らくはx線結晶学と並行して、この技術を利用して、薬物のそれらのタンパク質標的への結合の仕方を理解することを期待している。依然として、グリッド設計及び調製は、それらが初期にほとんど30年前に電子低温顕微鏡法(クライオ−EM)用に開発されたので、大部分は変わらないままである(Dubochet, J., Groom, M. & Mueller-Neuteboom, S. in Advances in Optical and Electron Microscopy (Barer, R. & Cosslett, V. E.) 8, 107-135 (Academic Press, 1982)、Dubochet, J. et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228(1988)、Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. & McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature 308, 32-36 (1984))。
J. & Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryoelectron microscopy. Nat Protoc 2, 3239-3246 (2007))。これらの薄い炭素膜は、帯電を減少させ、表面へのタンパク質の吸着のために粒子濃度を増加させ、分子の配向分布を変化させると考えられる。格子をポンプでmTorr圧にした後に存在する残存空気ガスをイオン化することにより作られる不十分に制御されたプラズマを使用する方法であるグロー放電は、炭素支持層を親水性にさせる。これは、それに吸着性を与えて、その後のクライオ−EMによる画像化のために氷の薄層中にタンパク質の一様分布を作り出すのを助ける(Dubochet, J., Groom, M. & Mueller-Neuteboom, S. in Advances in Optical and Electron Microscopy (Barer, R. & Cosslett, V. E.) 8, 107-135 (Academic Press, 1982))。
い分子(500kDa未満)にとって有害である、画像中のノイズに著しく寄与する。第2に、タンパク質は、支持炭素との相互作用によって配向優先傾向をしばしば取り、これらの配向は、現行方法を使用して十分には制御されない。第3に、薄い非晶質炭素は、電子ビームを偏向させ、試料上に強い静電気力を及ぼし得るかなりの移動性表面電荷を蓄積する不良伝導体である。最後に、表面上へのタンパク質の吸着を制御することは、グロー放電状態を再現することの困難性のために、及びそれらの年数及び保存環境に依存して汚染が炭素表面上に蓄積するので、困難である。
用する大規模製造の容易さにもかかわらず、グラフェンは、生体物質と一緒の使用に広くは採用されてこなかった。これには2つの主な理由があり、すなわち、グラフェンが疎水性であり、これは水溶液からのタンパク質の堆積をおおむね妨げており、及び表面汚染物(成長の間に形成されるか又はその後に取扱い及び保存の間に吸着される)の影響を受けやすいことである。生体分子の画像化のための基材としてグラフェンを使用する従来の試みがなされてきたが、グラフェン表面を親水性にさせることは、ほとんどのタンパク質(DMP−30)と相溶性でない過酷な溶媒の使用を必要としたか、又はグラフェンの酸化
グラフェンへの変換を必要とした。
Kaiser, U., Baumeister, W. & Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology 170, 152-156 (2010)、Pantelic, R. S. et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology 174, 234-238 (2011)、Pantelic, R. S., Suk, J. W., Hao, Y., Ruoff, R. S. & Stahlberg, H. Oxidative Doping Renders Graphene Hydrophilic, Facilitating Its Use As a Support in Biological TEM. Nano Lett. 11, 4319-4323 (2011))、酸素が炭素又は水素よりも強く電子を散乱させ、したがって、薄い非晶質炭素とほとんど同じくらいにバックグラウンド信号を与えるので、酸化グラフェンは問題を提示する。さらに、酸化グラフェンは、絶縁体であり、汚染のないグラフェンと比較してその機械的強度を低下させる結晶欠陥を含み、それが蓄積表面電荷の中和をあまりできなく、及びそれを氷の薄層のための支持体としてあまり安定でなくさせる。
好適には、前記支持膜は炭素を含む。
好適には、グラフェンは、前記支持部材のそれぞれに付着されている。
好適には、支持体は、センサ支持体である。
好適には、支持体は、EM支持体である。
好適には、前記生体分子は、親水性生体分子である。
好適には、前記水素の適用は、グラフェンの水素飽和前に終了される。
好適には、前記水素イオン又は水素原子は、水素プラズマの形態で適用される。
好適には、前記グラフェンは、前記水素プラズマと11〜80秒間接触する。
好適には、前記グラフェンは、前記水素プラズマと18〜22秒間接触する。
好適には、前記グラフェンは、支持体上に取り付けられたグラフェンである。好適には、前記支持体は、電子顕微鏡法支持体である。
好適には、前記プラズマ原子は、1〜14eVの範囲のエネルギーにある。
好適には、前記プラズマは、不活性プラズマである。例えば、前記プラズマは、好適には不活性ガスからなり、これは、それがグラフェンにおいて安定な化学変化を誘導しないという利点を有する。
好適には、前記プラズマは、ネオンプラズマである。最も好適には、前記プラズマは、ヘリウムプラズマである。
好適には、前記グラフェン表面は、前記プラズマと1〜30秒間接触する。
好適には、前記グラフェン表面は、前記プラズマと1〜10秒間接触する。
好適には、前記グラフェンは、部分水素化グラフェンである。
前記生体試料を上に記載されたとおりの支持体上に構成し、前記支持体を電子顕微鏡の電子ビーム中に配置し、画像データを収集することを含む方法に関する。画像データは、分析用の画像データであってもよい。
品質を損なうことなく表面状態の選別の系統的方法に移ることを想定する。
本発明者らは、本明細書で記載されるとおりの小原子プラズマによるグラフェンの処理の閾値効果を研究した。水素化が行われるよりもかなり前に清浄化効果が観察され得ることは相当に所望のものである。理論に拘束されることを望まないが、グラフェンを処理するために使用されるプラズマ中の高いエネルギーの小原子は、グラフェンの化学反応性(水素化など)に必要とされるよりもはるかに低いエネルギー及び/又ははるかに短い時間尺度で汚染物を容易に破壊及び除去し得ると考えられる。したがって、小原子プラズマによるグラフェンのより低いエネルギー又はより短い時間スケールを使用することによって、グラフェンの有効な汚染除去又は清浄化が、グラフェンシートの化学的又は物理的構成を変えることなく行われ得る。
ンへの損傷が回避されるように、プラズマシース電圧及び表面に当たるイオンの究極エネルギーに特別の注意が払われなければならない。
低エネルギーイオン及び原子の場合、一回衝突における最大伝送エネルギーTmaxは、
「清浄」=汚染物の質量/単位面積<グラフェンの質量/単位面積/100、又は汚染物の表面積<グラフェンの表面積/100;より好適には、「清浄」=汚染物の質量/単位面積<グラフェンの質量/単位面積/1000、又は汚染物の表面積<グラフェンの表面積/1000。
グラフェンの水素化は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって行われてもよい。最も好ましくは、水素化は、水素プラズマで処理することによって行われる。しかしながら、水素原子をグラフェン表面に送達するためにイオンビームを使用することによって同様に行なわれてもよい。重要な教示は、水素イオン又は水素原子をグラフェンの表面に正しいエネルギーレベルで適用することである。
エネルギーレベルに関して、本発明によって使用されるべき最大エネルギーレベルは、21電子ボルト(eV)である。21eVを超えるエネルギーレベルでは、炭素原子がグラフェン格子から叩き出され得る可能性がある。明らかに、これは、それが重要なグラフェンの格子構造を破壊するので非常に望ましくない。このために、格子に当たる21eV以下の原子又はイオンのエネルギーが好ましい。
好適には、水素化のためのプラズマエネルギーは、14eV未満である。好適には、水素化のためのプラズマエネルギーは、1eV〜14eV未満の範囲である。
グラフェン上へのタンパク質などの生体分子の吸着が容易化されることは、本発明の重要な利点である。言い換えれば、グラフェン表面上へのタンパク質の堆積が、今や制御され得ることは、本発明の利点である。
を向上させることを実証する。
そのゲートが流体と接触するように設計されるトランジスタを含むバイオセンサは公知である。このようなデバイスは、所望の粒子がゲートに近づいて来ると、トランジスタの伝導性が変わり、信号が読み出されることを可能にするように構成される。センサに結合している(すなわち、検出される)実体は、所望の任意の小粒子、例えば、所望のタンパク質、ウイルス粒子又は任意の他の小部分であり得る。
んバイオマーカーのためのセンサを提供する。この実施形態において、センサは、例えば、ナノワイヤを部分水素化グラフェンに置き換える又はそれで増強することによって、本発明の部分水素化グラフェンをセンサアレイの高感度/伝導性部品の中に代用して、参考文献52に記載されたとおりに構築されてもよい。
れたレベルの電子感度の利点を与え、小分子の個別タンパク質への単一結合事象でさえも検出を可能にし得る。部分水素化グラフェンの使用は、グラフェンベースのセンサへのタンパク質の吸着などの生体分子吸着の特異的制御を可能にし、それにより、大多数の可能性のある検出戦略を可能にする。さらに、本発明の方法(例えば、プラズマ法)は単一デバイス又はチップ上の大規模製作に容易に受け入れやすいので、特異的分子を検出するように調整された複数のこのようなセンサの製作を可能にする。
好適には、前記グラフェンは、0.01%〜50%水素化グラフェンである。
好適には、グラフェンは、3%〜10%水素化グラフェン、好ましくは5%水素化グラフェンである。
生体試料は、生物からの、又はそれに由来するいかなる試料も意味する。この試料は、粗試料であっても、又は精製若しくは部分精製試料であってもよい。試料は、体液などの流体、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、精液、尿又はいかなる他の体液であってもよい。試料はさらには、細菌、ウイルス又は他の微生物などの全生物を含んでもよい。試料は、生物からの細胞を含んでもよい。試料は、以下に記載されるような、生物から抽出又は精製された1又は2以上の生体分子を含んでもよい。
好適には、試料はインビトロでの試料である。
好適には、生体分子は、インビトロでの生体分子である。
固体表面上のガス環境における液滴の場合、液−固界面エネルギーW、は、ヤング−デュプレの式:
W=γω(1+cosθ)
(ここで、γωは、水の表面張力72mJ/m2である(参考文献44))
により、液滴と表面の間の平衡接触角に関係する。成長させられたままのグラフェン試料からの接触角(θgr=91±1.7°)及びデータへの指数適合からの飽和値(θgrh=66±1.3°)を使用すると、水素プラズマ処理による表面エネルギーの変化は、ちょうど2つの表面についての界面エネルギーにおける変化:
ΔW=cosθgr−cosθgrh
であり、これは、測定された値について、−0.19±0.02eV/nm2である。銅基材の存在は、ネイティブなグラフェンについて測定された角度で小さい減少を生じさせ得るが(Shih, C.-J. et al. Breakdown in the wetting transparency of graphene. Phys. Rev. Lett. 109, 176101 (2012))、それは、基材がすべての測定値に同じ効果を有
する場合、界面エネルギーの変化を計算するために使用される角度の変化に対して無視できる効果を有する。
有利には、水素化の異なる度合いが、同じ物理的グラフェンシート内の異なる空間的位置(領域)で与えられてもよい。これは、一部の領域が比較的高い度合いに水素化され、他の領域が比較的低い度合いに水素化されるように、水素化の間にシートの異なる領域をマスキングすることにより行われてもよい。理想的には、一端に高い水素化値を有するグラフェンEM支持体をもたらすことが望ましくあり得、水素化プロセスの間にマスキングを引き上げ、その結果、同じグラフェン支持体の他端は低い水素化値で残される。このように、最適水素化値は、グラフェン表面上に堆積されることが意図される特定の生体分子について決定される。可変の水素化を有するこれらの段階的グラフェン支持体は、本発明の部分水素化グラフェンのための較正又は最適水素化レベルの選択にとりわけ有用である。
値に水素化される。
好適には、支持体は、電子顕微鏡法支持体又はバイオセンサ支持体などのセンサ支持体である。最も好適には、支持体は、電子顕微鏡法支持体である。電子顕微鏡法支持体は、電子顕微鏡法により調べられる試料の電子顕微鏡中への又はそれから外への運搬を可能にする装置である。機械的強度の度合いは、支持体の周辺壁又は周縁又は部材(バーなど)によって支持体に与えられる。調べられる試料は、支持体の周辺により規定される領域内の支持体の上に取り付けられる。試料それ自体は、典型的には支持体によって運ばれる格子又は膜の上に取り付けられる。
Mにおける使用の「ために」は、EMにおける使用に「適する」ことを意味する。半導体科学の分野における実験用グラフェンシートは、純粋にその用途に使用され得る配置に形成されていない限り、生体分子のEMに「適さない」。
EM用途の寸法に作られては、3mm直径グリッドを意味してもよい。
最も好適には、支持膜が非晶質炭素を含む場合、使用される穴の寸法は、0.05〜10μmの範囲である。
好適には、支持膜は、非晶質炭素を含む。
り生成された、300メッシュ金グリッド上にホーリー炭素支持膜を含む。
生体分子と相互作用するように部分水素化により調整されたグラフェンは、グラフェンベースのセンサを含めて、様々な用途で使用され得る。
グラフェン成長
グラフェンは、銅箔基材上で化学蒸着(CVD)により成長させた(Reina, A. et al.
Large area, few-layer graphene films on arbitrary substrates by chemical vapordeposition. Nano Lett. 9, 30-35 (2009)、Li, X. et al.Large-Area Synthesis of High-Quality and Uniform Graphene Films on Copper Foils. Science 324, 1312-1314 (2009))。簡潔には、25μmの銅箔(Alfa社製Aesar#13382)の約18cm2の一片を乾燥−ポンプ吸い込みCVD炉の25mm直径の石英管に入れ、20mTorr未満に排気し、次いで、反応管中の圧力を500mTorrにもっていき、20sccmの流量で水素(99.999%)ガスの連続流に曝露した。オーブンの温度を熱電対制御下で約15分の経過をかけて1000℃に上昇させた。温度が到達するとすぐに、追加の20sccmのメタン(99.999%)を15分の間反応チャンバーに加え、合計圧力を700mTorrにもっていった。メタン添加が終わった後、加熱を切り、反応管を2時間をかけて連続水素流下で周囲温度にゆっくりと冷却した。冷えるとすぐに、水素流を止め、チャンバーを乾燥窒素で通気し、銅箔上のグラフェンを成長管から取り出し、使用前に清浄な低湿度貯蔵ボックス内の厳密に清浄化されたFluorwareウェーハ容器に保存した。
グラフェン水接触角を測定するために、特注ディスクパンチを使用して個別の3.2mm直径のディスクを銅箔上のグラフェンから打ち抜いた。ディスクを、最初にCMOSグレードイソプロピルアルコール(Sigma社製)にそれらを10秒間浸すことにより清浄化
し、次いで、残存溶媒が蒸発した後、グリッドがRFコイルのエッジから15±1cmに位置する市販のプラズマ反応チャンバー(Fischione社製Model 1070)内の硝酸清浄化ガ
ラススライド上に置いた。水素の供給源は、高純度電気分解水素発生器(Dominik社製Hunter model 20HMD)であった。ゼロ時間露出線量の制御は、様々な溶媒清浄化処理と一緒
及び一緒でないものを含み;本発明者らは、接触角が実験誤差内に両方ともについて同じであることを見出した。各ディスクを光学顕微鏡(Zeiss社製Axiophot)に取り付け、1
8MOhmの脱イオン水1μLの液滴を適用し、顕微鏡に付属の較正デジタルカメラ(Zeiss社製ERc5s)を使用してピペット先端で引き抜き後直ちに(5秒以内に)画像化した。本発明者らは、液滴蒸発速度(1.4nL/秒)を測定し、それが、水適用と画像取得の間の遅れの間の角度の無視できる変化(0.5°未満)を与えることを見出した。各画像をその後に分析して、基材面と、液滴が表面に会う点における液滴に対する接平面との間の角度をグラフを使って測定することにより接触角を得た。この測定を、プラズマ線量のそれぞれについて3〜6回行い;次いで、画像中で測定した液滴体積とゼロプラズマ線量についての値との比で除すことによって正規化した。本発明者らは、この正規化がこの少量の体積のピベット操作の際の誤差を補正するのに必要であることを見出した。次いで、複数の測定値を平均し、標準偏差を各線量における角度の誤差とみなした。最後に、本発明者らは、以下に記載されるとおりにその後にグラフェンをEMグリッドに移し、次いで、電子顕微鏡でそれらを画像化することにより、打ち抜きディスクを被覆するグラフェン
の存在を確認した。
浮遊単層グラフェンEMグリッドを作製するために、本発明者らは、Regan et al(Regan, W. et al. A direct transfer of layer-area graphene. Appl. Phys. Lett. 96, 113102 (2010))により最初に記載され、参考文献30でさらに発展されたものに基づく方
法を使用する。本発明者らは、アンチキャピラリーピンセットを使用して、それらを個別にそれぞれクロロホルム、アセトン及びイソプロピルアルコール(Sigma-Aldrich社製、
超高純度半導体グレード溶媒)に約15秒間浸漬することにより300メッシュ金製グリッド(Quantifoil社製Au 300 1.2/1.3)上の市販のホーリー炭素を清浄することによって開始した。本発明者らは、これが、製造後のQuantifoil膜上に残存するいずれかの残留フォトレジスト及び大きな表面汚染物を除去するのに役立つことを見出した。空気中でブロッティング乾燥させた後、本発明者らは、次いで、上に述べたプラズマ反応器内の特注ステンレス鋼サスペンジョンホルダにグリッドを取り付けた。チャンバーを10−5Torr未満に排気し、次いで、超高純度アルゴン及び酸素(BOC99.9999%)を9:1の質量比で21mTorrまで定常圧力に入れた。自動調整RFプラズマを40ワット(3W未満の逆電力)でスパークさせ、特定の時間適用した。次いでQuantifoilグリッドをグラフェン移動のために直ちに使用した。Qunatifoilグリッドをグラフェン単層で被覆するために、銅上のグラフェンの3.2mmディスクをより大きな箔から特注機械式パンチを使用して切断した。このディスクをアセトン、及びイソプロパノール(Sigma社製、CMOSグレード)にそれぞれ10〜15秒間浸漬し、使用前にブロッティング乾燥させた。
次いで、プラズマ清浄化Quantifoilグリッドをディスクに炭素側を下にして適用した。光学顕微鏡(Zeiss社製Axiophot)を使用して、グリッド「サンドイッチ」を検査し、グリ
ッドとディスクの両方ともが平坦であり、粒子状汚染物を含まず、次の工程前に互いと良好な接触状態にあることを確認した。次いで、7μLのCMQSグレードイソプロピルアルコールをグリッドの上部に加え、その液滴を空気中で乾燥させた。アルコールの後退メニスカスは、グラフェン表面と接触状態のQuantifoilの炭素膜を引き、これは、表面からの反射光の色の変化により立証された。次に、グリッド−ディスクサンドイッチを結晶皿中緩衝FeCl3(Sigma社製)の約50mLに20分間浮かせた。次いで、グリッドを
、炎に当てたPt輪によって32%HCl(Sigma社製CMOSグレード)に5分間、次いで
10%HClに5分間移し、続いて18MOhmの脱イオン水中で3回すすぎ洗いした。最終の水ステップ後、その輪を使用してグリッドを酸洗浄化されたガラス製ペトリ皿内のろ紙(Whatmann#1)片に移し、使用まで低湿度ボックス中に保存した。
浮遊グラフェンの制限視野回折研究を、以下の方法で水素プラズマ露出前後に行った:最初に、CVD成長グラフェンを上に記載したとおりの前清浄化Quantifoilグリッドに移した。75%/25%Ar/O2プラズマで50Wにて5分間清浄化したシングル傾斜ホルダ(FEI社製)に取り付けた。その残留カラム圧が公称88nTorr(最接近イオン
ポンプで測定した)であるFEI社製Tecnai F30顕微鏡によって300keV電子で画像化
し、試料を取り囲む汚染防止シールドを、液体窒素で冷却した。制限視野ディフラクトグラムは、約30e/Å2/秒のフルエンス、690mmの公称カメラ長、1秒間の露出時間、及び試料における0.30μm2の検査視野(interrogated area)に相当する10
μm直径の制限視野開口部を使用して、液体冷却2K×2K CCDカメラ(Tietz社製F224HD)で収集した。実カメラ長は、多結晶アルミニウムの薄膜の111〜311格子反
射を使用して較正した。第1のディフラクトグラムを収集した後、試料をカラムから取り出し、直ちに、依然としてホルダに取り付けられていながら密封されて慎重に清浄化された容器で、ホルダ中に取り付けられていながら水素プラズマに露出されるプラズマチャンバーに移送し、次いで、直ちに第2のデータセットの収集のための電子顕微鏡に戻した。この移動プロセスを使用する反復実験の間に、本発明者らは、グラフェン試料の汚染の証
拠を何ら見なかった。最終のディフラクトグラムを白地に黒に反転して、印刷する場合にコントラストを改善した。
V. Ramakrishnan labにより提供された高度好熱菌70Sリボソームの凍結保存品(Voorhees, R. M., Weixlbaumer, A., Loakes, D., Kelley, A. C. & Ramakrishnan, V. Insights into substrate stabilization from snapshots of thepeptidyl transferase center of the intact 70S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol.16, 528-533 (2009))を解凍し、5mM HEPES pH7.5、50mM KCl、10mM NH4Cl、10mM MgOAc、6mM BME中70nMの濃度に、その間ずっと氷上に保ちながら希釈した。グラフェングリッドを、上に記載したとおりの純粋水素プラズマで、使用直前に指示された時間処理した。4℃及び100%相対湿度に平衡にしたクライオプランジャ(FEI社製Vitrobot IV)に入れ;3μLの試料を適用し、60秒間インキュベートさせ、−20の力で2秒間ブロッティングし、次いで、その融点のちょうど上で液体エタン中に押し込んだ。次いで、グリッドを画像化のためにFEI社製Polara電子顕微鏡に移動する
まで、液体窒素中に保存した。ガラス化リボソームを、約80〜90Kの温度で公称倍率23k×にて非常に低い線量条件(2.5e−/Å2/秒;low MAGモードで0.2e/Å2未満の前露出)下に300KeV電子で画像化した。露出はCMOS直接電子検出器(FEI社製back-thinned Falcon II)上で1秒であり、較正ピクセルは、試料にお
いて(4.58Å)2に相当する。
2282個の粒子を、半自動群法(semiautomated swarm method)によるEMAN2のボク
サープログラムを使用して3枚の顕微鏡写真から選択した(Tang, G. et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural
Biology 157, 38-46 (2007))。次に、粒子を前処理し、Relion(Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach tocryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology 180, 519-530(2012))で76×76ピクセルボックス
(スケールは、4.58Å/px)に抽出し、これは、CTFFIND3を使用してのCTFフィッティングを含んだ(Mindell, J. A. & Grigorieff, N. Accurate determination of localdefocus and specimen tilt in electron microscopy. Journal of Structural Biology142, 334-347 (2003))。18クラスの2D分類の1ラウンド後に、221個の粒子
を捨て、残りの2061個を3Dリファインメント(3D refinement)に使用した。3D
リファインメントは、50Åに低域濾波した、参考文献33からの結晶構造から生成した初期モデルを使用してRelionで行った。3Dリファインメントは、3.6°の推定角度正確度及び19.3Åの分解能で収束した。最終マップを19.3Åに低域濾波した。最終リファインメント反復(Relionにおける回転及び傾斜)で画像化した各粒子に割り当てた角度を使用して、配向のプロットを生成した。UCSF Chimera剛体フィッティングアルゴリズム(Pettersen, E. F.et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research andanalysis. J Comput Chem 25, 1605-1612 (2004))を使用して、2WDK及び2WDLからの合わせたPDBをマップに適合させた。マップ及びモデルの3DレンダリングをChimeraで作成した。
この実施例で、本発明者らは、部分水素化グラフェンを作製する方法を実証する。
sp2C+H<−>sp3CH
を介したグラフェン格子の直接水素化であることを予期する。
この実施例で、本発明者らは、水素プラズマ処理などの小原子プラズマ処理が、グラフ
ェン上の表面汚染物を除去することを実証する。
この実施例で、本発明者らは、本発明によるグラフェンの部分水素化によるグラフェンへのタンパク質の吸着の制御を示す。本発明者らはグラフェンの疎水性を制御し得ることを示してきたが、本発明者らは、次いで、70Sリボソームを使用してクライオ−EMのための基材としての水素プラズマ処理グラフェンを試験した。本発明者らは単層グラフェンをQuantifoilEMグリッド上に移し、それらを様々な線量の水素プラズマをかけ、それらを使用して、70Sリボソームのガラス化試料を調製した。図3aは、グラフェンのないグリッド上で、70S粒子が非常に少ししかガラス状氷中に目視できないことを示すが、大部分は、Quantifoil炭素の表面及び穴のエッジに結合しているからである(穴のエッジにおけるリボソームの環に留意されたい)。10秒の水素プラズマで処理したグラフェングリッドと同一の凍結及びブロッティング条件を使用すると、ガラス状氷の小パッチのみが目視できた(図3b)。これは、グラフェン表面の不完全な濡れを示し、この線量での接触角の小さい変化と一致する(図1a)。20秒の水素プラズマ後、グラフェン表面は、より一様に濡れ、氷品質は非常に改善され、顕微鏡写真1枚当たりおよそ600個のリボソーム粒子である(1.2μmの直径穴、図3c)。この粒子密度(607個選択粒子/μm2)は、グラフェンのないグリッド上のもの(57個選択粒子/μm2、図3a及び図3cを比較されたい)よりもはるかに大きく、70Sリボソームがグラフェン表面に吸着することを示す。穴のエッジの周りの粒子の輪は、もはや存在せず、リボソームが
水素処理グラフェン表面に一様に吸着することを示す。40秒へのプラズマ線量のさらなる増加は、非常に高密度に充填されたリボソームをもたらす(およそ1900個粒子/μm2、図3d)。図3a、図3c及び図3d中の浮遊氷の場合、制限視野ディフラクトグラムは、氷のガラス状の性質を実証し、及びグラフェン層の存在を立証するために最初の低い線量画像後に取得した(図8)。全体として、これらの結果は、他の条件(ブロット時間、湿度など)を一様に保ち、それにより実験者が氷中の粒子分布を調整するためにグラフェン表面を使用することを可能にする場合、水素プラズマ線量と表面粒子密度との間の単調な関係があることを示す。
生体試料を受容するための電子顕微鏡法支持体は、上に記載したとおりに生成する。支持体は、上記方法の項に記載したとおりに、支持バーを備え、前記支持バーに付着されたグラフェンを含み、前記グラフェンは、部分水素化グラフェンであることを特徴とする。ここで、本発明者らは、この部分水素化グラフェンのクライオ−EMのための基材としての使用を実証する。グラフェン表面に吸着された生体分子の構造的一体性を立証するために、本発明者らは、図3cに示されたものを含めて、グラフェン支持層の存在がその後の電子回折により立証される3枚の顕微鏡写真から70Sリボソームの3次元構造を決定した。3枚の顕微鏡写真から選択した2061個の粒子を使用して、本発明者らは、19Åの分解能で再構成電子密度マップを得(図9a)、これを、図4a〜図4c及び図10に示す。本発明者らは、剛体フィッティングを使用して参考文献33からの70Sリボソームの結晶構造を適合させ、それが分子中にほとんどゆがみをもたないモデルとよく一致することを見出した(図4d)。最後に、本発明者らは、再構成の間に各粒子に割り当てた角度を使用してグラフェン基材上のリボソームの配向分布を評価した。結果を図4eにモルワイデ(Molleweide)等積図法を使用してプロットする。リボソームはグラフェン上で優先的配向を示す一方で、配向分布は、グロー放電非晶質炭素上で最適条件下に得た同様のデータと比べて遜色がない(図4bの射影に黒色で示す)(Bai, X.-C., Fernandez, I. S., McMullan, G. & Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife 2, e00461 (2013))。
粒子画像における欠陥は、しばしば短距離運動の経験的モデルを使用して特徴付けられる。モデルは、ガウシアン関数を使用して、経験的に決定されたフィッティングパラメータ(Debye-Waller熱パラメータ又はB因子)が画像品質の尺度を与える高分解能情報の喪失を特徴付ける(Voorhees, R. M., Weixlbaumer, A., Loakes, D., Kelley, A. C. & Ramakrishnan, V. Insights into substrate stabilization from snapshots of the peptidyl transferase center of the intact 70S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol.16, 528-533 (2009))。多くの可変要素が、ビーム誘導粒子移動、試験片荷電、照射損傷及び
試料不均一性を含めて、B因子の一因となり得る。画像のゆがみ及び粒子運動の複雑な性質は、簡単なガウシアン関数によって数学的に十分にはモデル化されないが、B因子の変化は、所与の方法の改善を特徴付けるために有用である。本発明者らは、非晶質炭素と比較してグラフェン上の80SリボソームのB因子の約35%(82Å2)の減少を観察した。したがって、グラフェンは、いかなる粒子画像の情報内容も改善すると予期することができる。
各データセット中の20050個粒子すべての各フレームについてアンサンブル平均を計算し、図5にその軌道をプロットする。80S粒子のビーム誘導移動は2つの線形位相を有し、これを本発明者らはプロットにおいて別個に適合する。直線の勾配は、移動の速度であり、図5は、このために場合によって「速度プロット」と称されてもよい。1秒当たり16画像を捕獲した。この実施例におけるグラフェンは、20秒水素処理されており、図3(c)で使用した材料に相当する。初期の速い位相は、本発明によって調製したグラフェン上で4.4±0.2Å/秒(χ2=0.0018)及び非晶質炭素上で6.5±0.2Å/秒(χ2=0.0027)の速度を有する。第2の位相の速度は、本発明によって調製したグラフェン上で0.91±0.02Å/秒(χ2=0.00051)及び非晶質炭素上で4.18±0.04Å/秒(χ2=0.0014)である(非晶質炭素は、本発明の優れた性能を示す比較情報として含まれた従来技術の材料である)。本発明者らは、最初と最後の2つの点を適合から省略するが、それらが、3又は4フレーム平均からであり、したがって、示されたとおりに有意により多くの誤差を有するからである。さらに、最初のフレームについて計算した粒子の位置に対するゼロ変位の点の割当てはいくらか任意である。真の初期粒子の位置は、運動の第1相への適合からy−切片として取得することもでき、合計粒子変位のより低い推定をもたらす。
これらの実施例で、本発明者らは、部分水素化(例えば、低エネルギー水素プラズマを使用して)が、グラフェン疎水性を非破壊的に改変して、生体分子の相互作用を可能にし得ることを実証してきた。炭素原子20個ごとに約1個の水素原子の付加でさえも、疎水性にかなりの変化をもたらし、表面へのタンパク質の吸着をもたらす(例えば、20秒の線量、図3c)。格子の部分水素化のみによる界面エネルギーの大きな変化及び接触角の飽和を理解するために、本発明者らは、以下のモデルを提案する。水−グラフェン界面エネルギーは、水と非極性グラフェン格子との間の疎水性相互作用によって支配されている。格子への水素の付加は、グラフェン表面の近くの水分子の秩序を破壊する。それぞれの
水素付加は、水素間の距離間隔が疎水性表面の近くの水の配位の長さスケールと同等になるまで界面エネルギーを減少させる。本発明者らが300Kにおける水中の水素結合の平均エネルギー(Pauling, L. General Chemistry. (W.H. Freeman and Co., 1970))を約
0.21eV又は0.21eVに等しいとみなすとすると、本発明者らが測定する界面エネルギーの変化は、界面に対する1nm2当たりのエネルギーに値する約0.90の水素結合の付加に相当する。この距離は、水中の疎水性相互作用の長さスケールに相当し(Israelachvili, J. & Pashley, R. The hydrophobic interaction is long range, decaying exponentially with distance. Nature 300, 341-342 (1982))、これは、1.0±0
.1nmの減衰定数で指数関数的に減衰する。これは、水素プラズマ処理が主として、溶液中の水分子の局所秩序化を破壊する水素の付加によってグラフェン格子を親水性にすると本発明者らが結論することに導く。
従来技術から、タンパク質の構造的一体性及び画像の品質を保存するのに役立つ表面状態の調整の系統的プロセスへと改善される、電子顕微鏡法のための生体試験片の調製を提供する。
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Claims (11)
- 単層グラフェン表面を清浄化する方法であって、前記グラフェン表面を水素プラズマ又はヘリウムプラズマ又はネオンプラズマと、前記グラフェン表面の化学的又は物理的構成を変えることなく表面不純物を除去するのに十分な時間接触させることを含み、前記プラズマが21eVまでのエネルギーである、前記方法。
- プラズマが、1〜14eVの範囲のエネルギーである、請求項1に記載の方法。
- プラズマが、水素プラズマである、請求項1又は2に記載の方法。
- プラズマが、不活性プラズマである、請求項1又は2に記載の方法。
- プラズマが、ネオンプラズマである、請求項4に記載の方法。
- プラズマが、5〜10eVの範囲のエネルギーである、請求項5に記載の方法。
- プラズマが、ヘリウムプラズマである、請求項4に記載の方法。
- グラフェン表面が、プラズマと1〜30秒間接触する、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- グラフェン表面が、プラズマと1〜10秒間接触する、請求項8に記載の方法。
- グラフェンが、部分水素化グラフェンである、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の方法により単層グラフェン表面を清浄化する清浄化グラフェンの製造方法。
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