CN110010434B - 一种复合载网及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复合载网及其制备方法。该复合载网包括一钼环作为支持基底，基底之上依次为导电胶、坐标铜网、方华膜、导电碳膜、氮化硅膜、导电碳膜。本发明所述复合载网具有良好的支持强度及导电性能，并可以提供样品中感兴趣区域的定位信息，因此可以成功实现IEM、STXM‑XANES以及Nano‑SIMS三种技术联用，对70‑100nm厚度电镜切片样品中的感兴趣区域进行蛋白信息、元素化学形态信息以及同位素信息的原位分析；同时可以降低IEM制样标记操作过程中破损的概率及程度，有效提高观察范围，实现STXM和Nano‑SIMS分析的准确定位，并大幅度提高Nano‑SIMS的检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及显微镜载网制备技术领域，尤其涉及一种复合载网及其制备方法。
背景技术
目前，新型药物在医学领域具有巨大的应用前景，可用于造影诊断、组织修复、光热治疗、药物载体等方面。目前研究结果表明，一般新型药物进入生物体内后主要会被网状内皮系统(肝、脾等)摄取，而一些经特殊修饰的新型药物则会靶向运输至特定组织(主要是肿瘤部位)。在不同的细胞微环境下，新型药物的理化性质会发生变化，经过复杂的降解及代谢过程，进而可能会造成不同生物效应。探明新型药物的这一系列体内行为，尤其是原位信息，对其在生物医学领域的安全性评价有十分重要的指导意义。
免疫电子显微镜(Immunoelectron microscopy,IEM)是利用对特定蛋白进行免疫标记(胶体金颗粒或铁蛋白)，在超微结构水平研究和观察，从而获取对其定位信息的一类电子显微镜技术，可用于观察新型药物在亚细胞水平的分布及形貌变化，研究其降解代谢相关蛋白的表达水平及分布信息。扫描透射X射线显微成像(Scanning transmission X-ray microscopy,STXM)技术将其30nm的高空间分辨率与近边X射线吸收精细结构(Nearedge X-ray absorption fine structure,NEXAFS)的高能量分辨率结合，可用于分析新型药物及其降解产物的原位化学形态及分布信息。纳米离子探针(Nano secondary ion massspectrometry,Nano-SIMS)是基于二次离子检测的具有纳米尺度分辨率的质谱成像技术，可用于原位分析新型药物的分布、同位素信息。
将以上三种技术联用可以对新型药物在组织细胞层面的原位化学形态及降解过程进行深入研究。然而由于三种技术对载网的要求有所不同，给实验的设计带来了较大困难。IEM与STXM所需的载网一般为镀有方华膜及碳膜的铜网；而Nano-SIMS则一般使用导电硅片。然而要实现三种技术对样品的原位分析，目前尚没有合适载网。
目前，与本发明最为接近的已有载网为一种坐标氮化硅窗格(品牌：中镜；货号：BSN100-A50MP2Q05；生产厂商：北京莱科百奥生物技术有限公司)，其窗格框架厚度为100μm，直径为3mm，中心窗格处厚度为50nm，窗格尺寸为500x 500μm，窗格中有栅格矢量分布的2μm的孔隙，其形貌图可见于图1。现有的坐标氮化硅窗格的主要缺点如下：
1)其中心氮化硅窗格下无支持系统，由于IEM制样需要进行复杂的免疫标记操作，过程中易造成中央窗格的破损，严重时整个氮化硅窗格框架会发生碎裂，以致部分窗格甚至样品切片脱落；
2)窗格尺寸为0.5x 0.5mm，可放置的生物切片量较少，相对降低了感兴趣区出现的概率，影响实验效率；
3)其坐标标记于边缘，对样品切片中感兴趣区进行定位时操作复杂且耗时较长；
4)进行Nano-SIMS分析时，由于中心窗格区域存在2μm的孔隙，造成对二次粒子信号检测的效率差异。
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷与不足，本发明提供了一种复合载网及其制备方法，可以成功实现IEM、STXM-XANES以及Nano-SIMS三种技术联用，对70-100nm厚度电镜切片样品中的感兴趣区域进行蛋白信息、元素化学形态信息以及同位素信息的原位分析。
一种复合载网，包括一钼环作为支持基底，基底之上依次为导电胶、坐标铜网、方华膜、导电碳膜、氮化硅膜、导电碳膜。
进一步地，所述复合载网的直径约为3-3.2mm，厚度为80-100μm。
进一步地，所述钼环为内径1.4-1.6mm的圆形孔。需要说明的是，前期实验分别使用1.0/1.2/1.5/1.8/2.0±0.1mm尺寸钼环进行测试，结果证明钼环孔径偏大会导致环易变性，孔径偏小会导致导电胶轻微内渗影响观察区域；经同样操作对比，钼环内径为1.5mm时效果最佳，其他内径的钼环均会造成操作上或后期观察上的困难。
进一步地，钼环为内径1.5mm的圆形孔时，可观察区域约为1.77mm2，厚度为28-32μm。
进一步地，所述钼环的机械强度高于所述纯坐标铜网，韧性高于氮化硅窗格不易扭曲变形，与氮化硅窗格相比具有一定的韧性，不会发生碎裂，因此降低了IEM制样复杂标记操作过程以及后续实验过程中破损的概率及程度。
进一步地，所述导电胶用于实现所述钼环与所述坐标铜网的组合，提高整体复合载网的导电性，可避免电荷过载对样品的损伤，进而提高后续多种检测过程中的数据质量。需要说明的是，所述导电胶选取原则为需使钼环与坐标铜网组合稳固，尽量粘合全部钼环区域，操作过程应为在钼环上涂胶后扣于坐标铜网，并用玻片按压平整，以避免铜网表面发生褶皱影响后续氮化硅膜生成的平整性与均一性。
进一步地，所述坐标铜网为200目孔径为95-105μm的坐标铜网，孔中心距约为115-135μm，肋宽为25-35μm，厚度约为28-32μm，观测区域由位置标记(如：A1，A2……)将载网分割为若干个九宫格，标记位于九宫格中心格，每个标记可对周围8个窗孔中的样品进行定位(偏差值<100μm)，根据孔径尺寸及电镜观察图片中的比例尺等可以对所选窗孔内的感兴趣区域进行精确定位(偏差值<5μm)。
进一步地，所述方华膜与所述导电碳膜为软性材质，二者为电镜观察常用的复合支持膜体系，其中所述方华膜的厚度为15-20nm，所述导电碳膜的厚度为9-20nm。该复合支持膜体系具有一定的支持强度和良好的导电性，可以耐受电子束的轰击，可避免电荷过载对样品的损伤，电镜下观察无任何结构，且不会与样品发生化学反应。同时对上层的结构具有一定的支持作用，使在上层氮化硅出现裂痕的情况下也不致脱落，提高对样品观察的可靠性。
进一步地，所述氮化硅膜由NH3(氨气)和SiH4(硅烷)通过化学气相沉积反应并在上述的复合载网基板上生成，厚度为50-55nm。所述氮化硅膜具有较大的机械强度和极稳定的化学性能，可以承受高强度离子束对样品的轰击，且为均一无孔隙的薄膜窗格，避免对二次粒子信号检测的效率差异，提高仪器的检测效率。
进一步地，所述导电碳膜厚度为9-20nm，为本身导电性相对较低的氮化硅薄膜提供一个导电的基质，使样品与整个复合载网之间形成具有良好导电性的整体结构，避免电荷过载对样品的损伤。
一种复合载网的制备方法，包括以下步骤：
1)选用一钼环作为支持基底；
2)将导电胶涂于上述钼环任一侧，之后将该侧扣于坐标铜网，并用玻片按压平整，自然干燥；
3)将方华膜置于盛有蒸馏水的烧杯中，方华膜会漂浮在水面上，将未涂有导电胶的坐标铜网面朝下均匀地摆放在方华膜上，按压坐标铜网使其与方华膜贴紧，用滤纸覆盖整个膜，当滤纸刚湿透时提起，坐标铜网与方华膜一起粘附在滤纸上离开水面，并进行烘干；
4)使用真空镀膜系统在方华膜表面镀上一层导电碳膜；
5)由NH3和SiH4通过化学气相沉积在未与方华膜连接的导电碳膜表面生成一层氮化硅膜；
6)再次使用真空镀膜系统在氮化硅膜表面镀上一层导电碳膜。
进一步地，步骤1)中所述钼环为内径1.4-1.6mm的圆形孔。需要说明的是，钼环孔径偏大会导致环易变性，孔径偏小会导致导电胶轻微内渗影响观察区域；经同样操作对比，钼环内径为1.5mm时效果最佳，其他内径的钼环均会造成操作上或后期观察上的困难。
进一步地，步骤2)中所述导电胶选取原则为需使钼环与坐标铜网组合稳固，尽量粘合全部钼环区域。
进一步地，步骤3)中所述烘干温度为58-62℃。
进一步地，步骤4)中使用真空镀膜系统在方华膜一侧进行导电碳膜的镀膜。
进一步地，步骤6)中使用真空镀膜系统在氮化硅膜一侧进行导电碳膜的镀膜。
相较现有技术，本发明具有以下特点：
1)为中心窗格下添加具有支持系统，降低IEM制样标记操作过程中破损的概率及程度；
2)窗格为直径为1.4-1.6mm的圆形孔，可观察区域为现有坐标氮化硅窗格的7倍，提高观察的效率；
3)将坐标均匀标记于中心窗格，提高对样品切片中感兴趣区定位的效率；
4)制备均一无孔隙的薄膜窗格，提高仪器的检测效率。
本发明的有益效果如下：
本发明所述复合载网具有良好的支持强度及导电性能，并可以提供样品中感兴趣区域的定位信息，因此可以成功实现IEM、STXM-XANES以及Nano-SIMS三种技术联用，对70-100nm厚度电镜切片样品中的感兴趣区域进行蛋白信息、元素化学形态信息以及同位素信息的原位分析。同时可以降低IEM制样标记操作过程中破损的概率及程度，有效提高观察范围，实现STXM和Nano-SIMS分析的准确定位，并大幅度提高Nano-SIMS的检测效率。
附图说明
图1为现有技术中坐标氮化硅窗格在显微镜下观察到的形貌图；
其中图1A为在100μm尺度下坐标氮化硅窗格形貌图；图1B为在10μm尺度下坐标氮化硅窗格形貌图；图1C为TEM在低倍镜下拍摄带有切片的氮化硅窗格照片；图1D为；高倍镜下孔隙处的组织切片照片。
图2为复合载网结构图；
其中1为钼环层；2为导电胶层；3为坐标铜网层；4为方华膜层；5为导电碳膜层；6为氮化硅膜层；7为导电碳膜层；
图3为IEM观察感兴趣区域；
其中图3A为金标记铁蛋白团簇区域；图3B图为图3A中金标记铁蛋白团簇区域的局部放大图像；
图4为STXM-XANES分析感兴趣区中Fe的价态信息；
其中图4A为感兴趣区定位至视野中心；图4B为衬度成像精确定位；图4C为根据Fe价态比例进行区域划分；图4D为各颜色区域对应的XANES谱图；
图5为Nano-SIMS分析感兴趣区域中57Fe16O/56Fe16O比值；
其中图5A为IEM观察的感兴趣区域；图5B为感兴趣区域中57Fe16O/56Fe16O比值分布热图。
具体实施方式
以下将结合附图及具体实施例对本发明技术方案进行进一步阐述。
一、一种复合载网的制备，该复合载网用于免疫电子显微镜-X射线显微成像-纳米离子探针技术。
制备方法如下：
1)选用一钼环作为支持基底；
2)将导电胶涂于上述钼环任一侧，之后将涂有导电胶的一侧扣于坐标铜网，并用玻片按压平整，自然干燥；
3)将方华膜置于盛有蒸馏水的烧杯中，方华膜会漂浮在水面上，将未涂有导电胶的坐标铜网面朝下均匀地摆放在方华膜上，按压坐标铜网使其与方华膜贴紧，用滤纸覆盖整个膜，当滤纸刚湿透时提起，坐标铜网与方华膜一起粘附在滤纸上离开水面，于58-62
干；
4)使用真空镀膜系统，在上述未与坐标铜网连接的方华膜一侧镀上一层导电碳膜；
5)由NH3和SiH4通过化学气相沉积在未与方华膜连接的导电碳膜表面生成一层氮化硅膜；
6)使用真空镀膜系统，在上述未与导电碳膜连接的氮化硅膜表面再次镀上一层导电碳膜。
在一实施例中，分别使用1.0/1.2/1.5/1.8mm尺寸钼环进行测试，结果证明钼环孔径偏大会导致环易变性，孔径偏小会导致导电胶轻微内渗影响观察区域；经同样操作对比，钼环内径为1.5mm时效果最佳，其他内径的钼环均会造成操作上或后期观察上的困难。
在一实施例中，坐标铜网为200目，孔径为95μm的坐标铜网，孔中心距为115μm，肋宽为25μm，厚度为28μm，观测区域由位置标记(如：A1，A2……)将载网分割为若干个九宫格，标记位于九宫格中心格，每个标记可对周围8个窗孔中的样品进行定位，根据孔径尺寸及电镜观察图片中的比例尺等可以对所选窗孔内的感兴趣区域进行精确定位。
在一实施例中，坐标铜网为200目，孔径为105μm的坐标铜网，孔中心距为135μm，肋宽为35μm，厚度为32μm，观测区域由位置标记(如：A1，A2……)将载网分割为若干个九宫格，标记位于九宫格中心格，每个标记可对周围8个窗孔中的样品进行定位，根据孔径尺寸及电镜观察图片中的比例尺等可以对所选窗孔内的感兴趣区域进行精确定位。
在一实施例中，方华膜的厚度为15nm，所述导电碳膜的厚度为9nm。
在一实施例中，方华膜的厚度为20nm，所述导电碳膜的厚度为20nm。
在一实施例中，氮化硅膜厚度为50nm。
在一实施例中，氮化硅膜厚度为55nm。
二、上述复合载网的可行性测试
将上述制备的一系列尺寸不同的复合载网按照以下方法依次进行可行性测试：
选取57Fe富集的四氧化三铁纳米颗粒作为药物静脉注射至小鼠体内，取小鼠肝组织样品固定、包埋、切片并进行免疫标记。利用IEM技术观察四氧化三铁纳米颗粒的蓄积位点和其降解相关铁蛋白的分布信息，并选择感兴趣区域进行精确定位；使用STXM-XANES分析感兴趣区域内Fe的价态信息；最后使用Nano-SIMS分析感兴趣区域内Fe的同位素比值，计算该区域内外源Fe的比例分布。具体结果如下：
经IEM观察发现载网完好，且可以实现亚细胞水平下细胞结构及免疫标记的观察及定位，图3中A图为选定的感兴趣区，其区域内有成团的四氧化三铁纳米颗粒和带有金颗粒标记的铁蛋白团簇，图3中B图为A图中方框处的高倍观察图像。进一步利用坐标铜网上的坐标对此感兴趣区域进行精确定位，为实现后续STXM-XANES和Nano-SIMS技术对此感兴趣区域样品的原位分析奠定基础。
对带有切片的载网进行STXM-XANES分析，可以根据不同Fe元素的价态比例将区域进行划分，如图4中所划分的四个区域，且分析完成后样品仍然完好，可以进行下一步Nano-SIMS分析。
使用Nano-SIMS对载网切片上的感兴趣区进行分析，光镜下观察到该区域结构完整，经过一次离子的轰击膜未发生破损，且检测到足够强的56Fe16O和57Fe16O信号，成功获得了56Fe16O/57Fe16O在该区域内的信号强度比值(如图5B)，根据57Fe富集丰度及天然丰度可以计算该区域内经注射进入体内的外源Fe比例。
上述实施例仅是本发明较佳实施方式，凡依本发明所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包含于本发明专利申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种复合载网，包括一钼环作为支持基底，基底之上依次为导电胶、坐标铜网、方华膜、导电碳膜、氮化硅膜、导电碳膜；
所述钼环为内径1.4-1.6mm的圆形孔；
所述复合载网是通过如下方法制备的：
1)选用一钼环作为支持基底；
2)将导电胶涂于上述钼环任一侧，之后将涂有导电胶的一侧扣于坐标铜网，并用玻片按压平整，自然干燥；
3)将方华膜置于盛有蒸馏水的烧杯中，方华膜会漂浮在水面上，将未涂有导电胶的坐标铜网面朝下均匀地摆放在方华膜上，按压坐标铜网使其与方华膜贴紧，用滤纸覆盖整个膜，当滤纸刚湿透时提起，坐标铜网与方华膜一起粘附在滤纸上离开水面，并进行烘干；
4)在上述未与坐标铜网连接的方华膜一侧镀上一层导电碳膜；
5)由NH3和SiH4通过化学气相沉积在未与方华膜连接的导电碳膜表面生成一层氮化硅膜；
6)在上述未与导电碳膜连接的氮化硅膜表面再次镀上一层导电碳膜。
2.如权利要求1所述的复合载网，其特征在于，所述复合载网的直径为3-3.2mm，厚度为80-100μm。
3.如权利要求1所述的复合载网，其特征在于，所述坐标铜网为200目，孔径为95-105μm的坐标铜网，孔中心距为115-135μm，肋宽为25-35μm，厚度为28-32μm。
4.如权利要求1所述的复合载网，其特征在于，所述方华膜为软性材质，其厚度为15-20nm。
5.如权利要求1所述的复合载网，其特征在于，所述氮化硅膜由NH3和SiH4通过化学气相沉积反应在所述复合载网基板上生成，厚度为50-55nm。
6.如权利要求1所述的复合载网，其特征在于，所述导电碳膜为软性材质，其厚度为9-20nm。
7.制备权利要求1所述复合载网的方法，包括以下步骤：
1)选用一钼环作为支持基底，所述钼环为内径1.4-1.6mm的圆形孔；
2)将导电胶涂于上述钼环任一侧，之后将涂有导电胶的一侧扣于坐标铜网，并用玻片按压平整，自然干燥；
3)将方华膜置于盛有蒸馏水的烧杯中，方华膜会漂浮在水面上，将未涂有导电胶的坐标铜网面朝下均匀地摆放在方华膜上，按压坐标铜网使其与方华膜贴紧，用滤纸覆盖整个膜，当滤纸刚湿透时提起，坐标铜网与方华膜一起粘附在滤纸上离开水面，并进行烘干；
4)在上述未与坐标铜网连接的方华膜一侧镀上一层导电碳膜；
5)由NH3和SiH4通过化学气相沉积在未与方华膜连接的导电碳膜表面生成一层氮化硅膜；
6)在上述未与导电碳膜连接的氮化硅膜表面再次镀上一层导电碳膜。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述烘干温度为58-62℃。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤4)与步骤6)中导电碳膜的制备采用真空镀膜系统。
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