JP6124389B2 - 悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデル及びその利用 - Google Patents
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Description
を、さらに備えることもできる。前記細網線維芽細胞に対する前記1又は2以上の被験化合物の作用と前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する作用とに基づいて前記1又は2以上の被験化合物を評価する工程を、さらに備えることもできる。
本明細書に開示される悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルは、細網線維芽細胞と悪性リンパ腫の腫瘍細胞(以下、単に腫瘍細胞という。)とを含むことができる。
本明細書によれば、悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルのための培養剤が提供される。この培養剤は、動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を前記腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養し、前記非ヒト動物から分離して得られる悪性リンパ腫の腫瘍細胞を含むことができる。
本明細書に開示される悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの製造方法は、細網線維芽細胞と腫瘍細胞とを混合する工程を備えることができる。本製造方法によれば、インビトロでも、簡易な方法で動物内における腫瘍細胞を含む微小環境を模倣した培養系を構築できる。
本明細書の開示される、インビトロ培養系に適した悪性リンパ腫の腫瘍細胞の製造方法は、動物から採取された悪性リンパ腫の腫瘍細胞を準備する工程と、腫瘍細胞を当該腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物に移植して前記非ヒト動物内で培養する工程と、を備えることができる。本製造方法によれば、インビトロでも増殖活性に優れる腫瘍細胞を効率的に準備できる。また、こうして得られる非ヒト動物内で培養された腫瘍細胞は、インビトロ培養系や腫瘍細胞モデルの構築に適しておりそれ自体有用である。本製造方法における、腫瘍細胞の準備、非ヒト動物への移植、培養については、既に説明したインビトロ腫瘍細胞モデルの製造における各種実施態様を適用できる。
本明細書に開示される、腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤は、細網線維芽細胞を含むことができる。腫瘍細胞の培養に細網線維芽細胞を用いることで、腫瘍細胞を含む動物内の微小環境をより近似した状態をインビトロでも再現し、より増殖活性に優れる状態を形成できる。こうした細網線維芽細胞としては、既に悪性リンパ腫のインビトロ腫瘍細胞モデルの製造に関して説明した各種実施態様を適用できる。
本明細書に開示される、腫瘍細胞をインビトロで培養するための培養剤のスクリーニング方法は、1又は2以上の細網線維芽細胞を被験細胞とし、当該被験細胞と腫瘍細胞とを混合し培養する工程と、培養工程で得られた培養物と腫瘍細胞の増殖抑制剤とを接触させる工程と、増殖抑制剤と接触後の腫瘍細胞の細胞活性を評価する工程と、を備えることができる。この方法によれば、腫瘍細胞にインビトロで培養するのに適した培養剤となる細網線維芽細胞を取得できる。また、この方法によれば、用いる腫瘍細胞に対応してより適した細網線維芽細胞を取得することができる。
本明細書に開示される、腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニング方法は、インビトロ腫瘍細胞モデルと1又は2以上の被験化合物とを接触させる工程と、インビトロ腫瘍細胞モデルに対する1又は2以上の被験化合物の作用を評価する工程と、を備えることができる。この方法によれば、従来とは異なり、より動物内での状態に近い増殖活性を有する腫瘍細胞に対して被験化合物を提供できるため、腫瘍細胞に対してより現実的な、あるいはより有効な作用剤のスクリーニングを実施できる。また、後述するように、インビトロ腫瘍細胞モデルには、腫瘍細胞でない細網線維芽細胞を含んでいるために、この細胞を比較対象とすることで、腫瘍細胞により高い特異性で有効な作用剤をスクリーニングできる。
本明細書に開示される増殖抑制剤は、パモ酸ピルビニウムを有効成分とする。パモ酸ピルビニウムは、悪性リンパ腫、特にびまん性大細胞型B細胞リンパ腫に有効な薬剤である。この化合物は、リンパ細胞の支持細胞であり正常細胞である細網線維芽細胞には作用が弱く、かつ腫瘍細胞に作用が強い薬剤である。
インフォームドコンセントを取得したリンパ腫患者から、末梢血、骨髄またはリンパ節検体を採取し、常法に従いフィコール法(GE Healthcare#17-1440-03)で単核球分離を行った。細胞をRPMI培地(シグマ#R5886)で2回洗浄し細胞数を計数した。1x106〜107 cells/bodyでNOGマウス(重度免疫不全マウス)(公益財団法人実験動物研究所)の腹腔内移植を行った。腫瘍細胞を移植する際にGVHDに備え、OKT-3(100μg/body)を腹腔内投与した。なお、2代目以降の継代に関しては行わなかった。
(1)キメリズム解析
リンパ腫マウスモデルの腹腔内から採取し、シングルセル化し、赤血球を除去した脾臓細胞及び腫瘍細胞をそれぞれPBSに5x105/100μLに調整した。マウスCD45(biolegend、 mouseCD45-PerCP #103130、ヒトCD45 (BD、 humanCD45-PE、 #555483)、もしくはヒトCD19(BD、humanCD19-PE、#555413)を1μL添加し30分間4℃で静置した。さらに、PBS2mLを加え300xgで10分間遠心し、上清を取除いた。細胞を、0.1μg/mLに調整したDAPI(invitrogen #D1306)溶液300μLに再懸濁し、FACSにてキメリズム解析を行った。結果を図1に示す。図1に示すように、脾臓及び腹腔内から採取した腫瘍に関しては、マウス由来細胞とヒト由来の腫瘍細胞とのキメリズムが形成されていることがわかった。
リンパ腫マウスモデルから脾臓を採取し、自動染色装置(VENTANA BENCHMARK XTシステム)で処理し免疫染色を行った。抗体はヒトCD45 (Roche#760-4279)を使いDAB法により免疫染色を行った。結果を図2に示す。図2に示すように、腹腔内から採取した腫瘍細胞においてマウス由来細胞とヒト由来の腫瘍細胞とのキメリズムが形成されていることがわかった。
薬効試験には、7週から8週齢のNOGマウスに他のNOGマウス内で継代可能となったDLBCL患者由来の細胞(TAK)を1x106細胞を腹腔内に移植したリンパ腫マウスモデルを使用した。抗腫瘍剤であるシクロホスファミド1水和物(CPA、図中薬剤Aで示す。)(Sigma #C7397)をRPMI(FBSフリー)で75mg/10mLに調整し、移植後22日目から75mg/kgの用量で連日腹腔内投与を行う。29日目に脾臓を摘出し、重量測定を行った。測定後10%中性ホルマリンで固定し、免疫染色は自動染色装置(VENTANA BENCHMARK XTシステム)で処理し、抗体はヒトCD45(Roche#760-4279)を使いDAB法により免疫染色を行った。結果を図3に示す。
7週から8週齢のNOGマウスに他のNOGマウス内で継代可能となったDLBCL患者由来の細胞(ONO)を1x106細胞を腹腔内に移植した。移植後14日目、21日目及び28日目に解剖し脾臓を摘出した。ヒトCD20抗体(DAKO L26)で免疫染色を行い、移植後28日目の脾臓は連続切片を作製しEVG染色、アザン染色、渡辺鍍銀染色を行った。結果を図4に示す。図4上段に示すように、移植からの時間経過に伴い、マウス内でヒト由来の腫瘍細胞が増殖していることがわかった。また、図4下段に示すように、移植後28日目の染色結果からは、ヒト由来の腫瘍細胞が細網線維芽細胞とともにマトリックスを形成していることがわかった。
全ての培養は37℃、5%CO2の条件で行った。経時的にTrypan Blueで生細胞のカウントを行った。3〜4日毎にBLS4の継代を行い、リンパ腫細胞は全量継代した。結果を図8に示す。
Claims (8)
- 悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニング方法であって、
悪性リンパ腫に罹患した動物由来の悪性リンパ腫の株化されていない腫瘍細胞を、その腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養する工程と、
前記非ヒト動物内から分離した前記株化されていない腫瘍細胞と細網線維芽細胞とを混合し共培養して悪性リンパ腫の株化されていないインビトロ腫瘍細胞モデルを作製する工程と、
前記株化されていないインビトロ腫瘍細胞モデルに1又は2以上の被検化合物を接触させる工程と、
前記株化されていないインビトロ腫瘍細胞モデルに対する前記1又は2以上の被検化合物の作用を評価する工程と、
を備える、方法。 - 前記細網線維芽細胞は、株化された細網線維芽細胞である、請求項1に記載の方法。
- さらに、前記株化されていないインビトロ腫瘍細胞モデルの作製工程に先立って、前記細網線維芽細胞を培養する工程を備え、前記作製工程は、予め培養された前記細網線維芽細胞を用いる工程である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記作用は、前記1又は2以上の被検化合物の前記株化されていない腫瘍細胞に対する増殖抑制、増殖促進及び耐性から選択されるいずれかである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記細網線維芽細胞と前記1又は2以上の被検化合物を接触させる工程と、
前記細網線維芽細胞に対する前記1又は2以上の被検化合物の作用を評価する工程と、
をさらに備える、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 前記細網線維芽細胞に対する前記1又は2以上の被検化合物の作用と、前記インビトロ腫瘍細胞モデルに対する前記1又は2以上の被検化合物の作用と、に基づいて前記1又は2以上の被検化合物を評価する工程を、さらに備える、請求項5に記載の方法。
- 悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニングのための悪性リンパ腫の株化されていないインビトロ腫瘍細胞モデルの製造方法であって、
悪性リンパ腫に罹患した動物由来の悪性リンパ腫の株化されていない腫瘍細胞を、その腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養する工程と、
前記非ヒト動物内から分離した前記株化されていない腫瘍細胞と細網線維芽細胞とを混合し共培養して悪性リンパ腫の株化されていないインビトロ腫瘍細胞モデルを作製する工程と、
を備える、方法。 - 次の(1)及び(2)を共培養して得られる、悪性リンパ腫の腫瘍細胞に対する作用剤のスクリーニングのためのインビトロ腫瘍細胞モデル。
(1)細網線維芽細胞
(2)悪性リンパ腫に罹患した動物由来の悪性リンパ腫の株化されていない腫瘍細胞を、当該腫瘍細胞が免疫的に許容される非ヒト動物内で培養され分離して得られる腫瘍細胞
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