JP5531373B2 - Ｃｄ２０陰転化ｂ細胞性悪性リンパ腫細胞株及びその利用 - Google Patents

Description

本発明はB細胞性悪性リンパ腫の治療又は治療法の開発に有用な技術に関する。本明細書が開示する技術は、B細胞性悪性リンパ腫の中でも、CD20の陰転化によって、CD20を標的とした分子標的薬に対して耐性を示すに至った病態（CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫）の治療又は治療法の開発において特に有用である。

リツキシマブ（Rituximab）は、Bリンパ球に特異的に発現するCD20抗原を特異的に認識するモノクローナルキメラ抗体である（非特許文献１、２）。CD20抗原は、比較的進行の遅い濾胞性悪性リンパ腫や進行の速いびまん性悪性リンパ腫などに代表されるB細胞性の悪性腫瘍に広く発現する。リツキシマブはCD20抗原に対する分子標的薬として、CD20抗原を発現するこれらのB細胞性悪性疾患に対する化学療法に加えて投与されるようになった（非特許文献３〜８）。25年以上にわたって、CHOP化学療法はB細胞性悪性リンパ腫患者に対して利用されてきたが、残念なことに、他の化学療法剤の組み合わせや、投与量の変更によっても、疾患の治癒率を向上させることはできなかった。しかし最近の報告では、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫に対して、CHOPをベースとした古典的な化学療法にリツキシマブを併用することで疾患の治癒率や無病生存率が有意に改善されることが確認された（非特許文献３〜８）。

リツキシマブが臨床の場で使用されるようになって5年が経過するが、CD20陽性悪性リンパ腫の治癒率は未だ満足とは言いがたい値であり、リツキシマブで治療を受けた患者のうち無視できない数の患者において、リツキシマブに反応しない腫瘍の進展、形質転換が経験されるようになった（非特許文献９〜１２）。最近Teruiらは、48人のCD20陽性リンパ腫患者のうち5人の患者がリツキシマブに耐性を示し、また48人のうち10人のCD20コーディングシークエンス部分に遺伝子変異を認めたと報告した（非特許文献１０）。遺伝子変異によるCD20蛋白の構造変化がリツキシマブ耐性のメカニズムの一つであろうと推測されている。しかしCD20のコーディングシークエンス部分の遺伝子変異とリツキシマブ耐性との間に明確な関連性が示されず、このことからも、遺伝子変異以外にもリツキシマブ耐性のメカニズムが存在することが示唆された。
最近になって我々は、リツキシマブの反復投与の後にリツキシマブ耐性の特徴を持つ腫瘍に形質転換した、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫（発症時診断）の患者を経験した。この患者の病勢は、リツキシマブ投与中に悪化を示し、その時点における病理所見やフローサイトメトリー(FCM)による検討では、リンパ腫細胞にCD20の発現が認められなかった。
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リツキシマブに耐性を示すに至った場合、有効な代替療法が存在しないのが現状であり、リツキシマブに対する耐性化の克服が急務となっている。耐性化を克服できればリツキシマブの継続的な使用が可能となり、多くの患者にとって福音となる。また、医療界への貢献も計り知れない。ところで、現在のところ顕在化してはいないが、リツキシマブに限らず、CD20を標的とした他の分子標的薬についても同様の機序に基づく耐性化の出現が予想される。さらには、将来開発される分子標的薬についても同様の機序に基づく耐性化の出現が懸念される。
そこで本発明は、リツキシマブに代表される、CD20を標的とした分子標的薬に対する耐性化の阻止又は克服に有効な治療戦略の開発に有用なツール、手段などを提供することを課題とする。また、当該治療戦略に利用される治療薬及び治療法を提供することも課題とする。

本発明者らは、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する有効な治療戦略の開発を目指して検討を重ねた。その結果、以下の知見・成果が得られた。
（１）CD20陰転化によって、CD20を標的とした分子標的薬であるリツキシマブに耐性となった患者の腫瘍細胞より細胞株（CD20陰転化悪性リンパ腫細胞株）を樹立することに成功した。
（２）この細胞株（RRBL1）を用いて、CD20の発現低下のメカニズムを解析した。その結果、CD20 mRNA発現量の減少がCD20の陰転化の重要な一因であることが強く示唆された。興味深いことに、RRBL1を長期培養することによって樹立された亜株RRBL2においては、CD20蛋白の十分な発現が確認された。これらの結果は、CD20陰転化細胞においてCD20を再発現させることが可能であることを示すとともに、CD20の再発現を誘導することがCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫の有効な治療戦略になることを示唆する。
ここで、分子標的薬の高い特異性を考慮すれば、本発明者らが見出した耐性獲得に至る上記の機序は普遍性が高いといえる。従って、CD20の再発現を誘導するという戦略は、RRBL1が由来する病態に限らず、CD20の陰転化によって分子標的薬に対して耐性を獲得するに至った様々な病態に対して有効であることが大いに期待される。
（３）RRBL1に種々の薬剤を添加し経時的にCD20の発現を解析したところ、特定の薬剤（DNAメチル化酵素阻害剤である5-Aza-2'-Deoxycytidine及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ）によってCD20 mRNA及びCD20蛋白の誘導が可能であった。即ち、DNAメチル化酵素阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する治療薬として有望であることが判明した。また、RBBL1を用いた試験系が、CD20の発現誘導に基づく治療戦略に有用な化合物を見出すための有効な手段になることが裏付けられた。
（４）RRBL1を免疫不全マウスに移植し、腫瘍が形成されるか否かを検討した結果、腫瘍の形成及び増大が観察され、RBBL1細胞が免疫不全マウスの生体内の環境で維持可能であることが判明した。また、RBBL1細胞を経静脈的に投与して腫瘍の形成を観察したところ、RBBL1細胞の元になった患者と非常に近似した病理所見を示した。このように、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫を再現するin vivoモデルを作製することに成功した。また、in vitroにとどまらず、in vivoにおいて治療戦略の開発を進める上でもRBBL1が非常に有用であることが示された。
本発明は主として以上の知見・成果に基づくものであり、以下の細胞株、スクリーニング方法などを提供する。
［１］CD20蛋白の発現が陰転化したB細胞性悪性リンパ腫に由来するCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞株。
［２］前記B細胞性悪性リンパ腫は、濾胞性リンパ腫から形質転換したびまん性B細胞性悪性リンパ腫である、［１］に記載の細胞株。
［３］CD20蛋白の発現の陰転化がCD20 mRNAの発現量低下に起因する、［１］に記載の細胞株。
［４］CD20蛋白の潜在的発現能を有する、［３］に記載の細胞株。
［５］CD10陽性、CD19陽性、CD20陰性、及び免疫グロブリン軽鎖（κ鎖、λ鎖）陰性である、［１］に記載の細胞株。
［６］受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９１０で特定される細胞株である、［１］に記載の細胞株。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞株を免疫不全非ヒト動物に移植又は投与することによって作製される、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫の病態を反映したモデル動物。
［８］前記免疫不全非ヒト動物がNOD/SCIDマウスである、［７］に記載のモデル動物。
［９］CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
（１）試験物質の存在下、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、及び
（２）培養後の細胞におけるCD20 mRNA発現量又はCD20蛋白発現量を測定し、前記試験物質のCD20発現誘導能を評価するステップ、
を含む方法。
［１０］以下のステップを更に含む、［９］に記載のスクリーニング方法、
（３）ステップ（２）の結果に基づいて選抜された試験物質の存在下、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、
（４）CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（３）後の細胞を培養するステップ、及び
（５）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
［１１］以下のステップを更に含む、［９］に記載のスクリーニング方法、
（３）ステップ（２）の結果に基づいて選抜された試験物質と、CD20を標的とした分子標的薬の存在下、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫細胞又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、及び
（４）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
［１２］前記CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞が、［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞株である、［９］〜［１１］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［１３］CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
（１）試験物質の存在下、［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞株を培養するステップ、及び
（２）CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（１）後の細胞を培養するステップ、及び
（３）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、
を含む方法。
［１４］CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
（１）試験物質、及びCD20を標的とした分子標的薬の存在下、［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞株を培養するステップ、及び
（２）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、
を含む方法。
［１５］CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
（１）［７］又は［８］に記載のモデル動物に試験物質を投与するステップ、及び
（２）前記モデル動物が反映する、CD陰性B細胞性悪性リンパ腫に特徴的な病態の変化を調べるステップ、
を含む方法。
［１６］CD20蛋白の発現量を増大させる化合物を含み、CD20を標的とした分子標的薬と併用されることを特徴とする、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬。
［１７］前記化合物が、CD20 mRNAの発現量を増大させる作用を有する、［１６］に記載の医薬。
［１８］前記化合物としてDNAメチル化酵素阻害剤及び／又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が用いられる、［１６］に記載の医薬。
［１９］DNAメチル化酵素阻害剤及び／又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、CD20を標的とした分子標的薬とを併用することを特徴とする、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫の治療法。
［２０］CD20を標的とした分子標的薬と併用されて薬効を発揮する、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬を製造するためのDNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用。

RRBL1細胞株の由来である患者の臨床経過。患者は1993年初診で来院。FSCの診断にて古典的化学療法（▼）を施行された。さらに1998年からはリツキシマブ併用化学療法（▽）が繰り返し施行された。患者の病状は完解に入ることなく、病勢進行を見る際に化学療法が繰り返し施行された。2004年、リツキシマブ併用化学療法施行中に悪性リンパ腫の急速な進行が認められた。この時点で、CD20陰転化DLBCLへの形質転換と診断された。この頃より、末梢血中にCD20陰性の腫瘍細胞が多数認められるようになった。2004年7月に、腫瘍細胞を含む末梢血が採取され、長期の培養を経てRRBL1細胞株が樹立された。患者に対しリツキシマブを含まない救済化学療法を施行したが効果は低く、リンパ腫の白血病化が顕著に認められ、2005年2月、患者は死亡した。 RRBL1細胞と、その元になった患者のリンパ腫細胞に認められた染色体異常。（Ａ）は患者検体、（Ｂ）はRRBL1細胞。詳細な染色体異常は以下の通りである。（Ａ） 47, XY, t(1;7)(p36;p15), t (2;8)(p12;q24), -6, add(6)(q21), t(14;18)(q32;q21), +18, der(18)t(14;18), +der(?)t(?;13)(?;q12), +mar2。（Ｂ） 47, XY, der(1)t(1;?7) (p36;p15),dup(1)(q21q42), add(2)(p11), -6, del(6)(q15q21), add(7)(p11), -8, add(10)(p13), -13, t(14;18)(q32;q21),+der(18)t(14;18), +3mar。 RRBL1細胞と、その元になった患者のリンパ腫細胞に認められた染色体異常。（Ｃ） t(14;18)(q32;q21)に認められる、BCL2遺伝子とJH遺伝子の相互転座を示す。転座部位は黒の矢印で示される。JHにおける詳細な転座部位は、J1からJ6まで報告がある（非特許文献１３、１９）。転座部位を増幅するために用いられたPCRプライマーが黒の矢印で示される。（Ｄ） RRBL1細胞とそのもととなった患者の臨床病期ごとに採取された細胞よりゲノムDNAが抽出され、BCL2-JH転座部位を増幅するためのPCRが施行された。すべての検体において、同一サイズの単一バンドが確認された。Ad-LN; 患者が来院した際に採取されたリンパ節、TF-PB; 2004年7月に採取された末梢血リンパ腫細胞、RRBL1a（90日培養後）と RRBL1b（120日培養後）; in vitro で培養されたRRBL1細胞。（Ｅ） BCL2-JH6転座部位の遺伝子配列(Genbank登録番号；DQ979790)。 RRBL1細胞における、CD20蛋白とmRNAの発現。（Ａ） RRBL1細胞、Raji細胞における抗CD20抗体(B1モノクローナル抗体)を用いた免疫染色。RRBL1細胞においてはCD20の発現は認められないが、Raji細胞においては細胞表面に発現が確認される。MG; メイギムザ染色。（Ｂ） Raji細胞、RRBL1細胞、NALM6細胞から全細胞溶解液が採取され、CD20抗体を用いたウエスタンブロット法を施行した。Raji細胞（レーン１）においては、CD20蛋白の発現が確認されたが、RRBL1細胞、NALM6細胞においては発現が確認されなかった（レーン２、３）。陽性コントロールとして、GAPDHに対するウエスタンブロットが施行された。（C） CD20 mRNAを検出する定量的RT-PCR。陰性コントロールとして293T細胞が用いられた（レーン２）。RRBL1細胞におけるCD20 mRNAの発現量（レーン３）は陽性コントロールRaji細胞（レーン１）に比べ有意に低かった。さらにCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫患者から得られた細胞からRNAを抽出し、同様の検討を行った（レーン４〜１１）。RRBL1細胞におけるCD20 mRNA発現量はこれらに比べても有意に低かった。（Ｄ） RRBL1細胞を経代培養し、亜株RRBL2が樹立された。この細胞から全細胞溶解液を抽出し、抗CD20抗体を用いたウエスタンブロットが施行された。RRBL2細胞において、CD20の発現が確認された（レーン３）。 in vitroトランスレーションによって発現させた蛋白を、抗Flag抗体で検出（ウエスタンブロット）した結果。レーン１はCD20遺伝子のCDSを挿入したベクターからの翻訳産物、レーン２はT7Ts-Flagベクターのみからの翻訳産物。 RRBL1細胞のリツキシマブに対する耐性を示す図。Raji細胞（Ａ）、RRBL1細胞（Ｂ）の細胞数がそれぞれ折れ線グラフで示される。 RRBL1細胞におけるCD20 mRNA及びCD20蛋白の再発現。（Ａ） 5-Aza'-2-Deoxycytidineで処理したRRBL1細胞をRT-PCRで解析した結果。（Ｂ） 実験手順の説明。（Ｃ） 培養後の細胞より抽出したRNA及び蛋白を用いたウエスタンブロットの結果。Raji（レーン1）及びNALM6（レーン2）をそれぞれ、CD20発現の陽性対照及び陰性対照として使用した。 （Ａ） Aza、TSAで処理したRRBL1細胞のウエスタンブロット解析の結果。（Ｂ） Azaの存在下、又はAza及びTSAの存在下で培養したRRBL1細胞をFCMで解析した結果。（Ｃ）リツキシマブに対する耐性の比較。RRBL1細胞（非処理群）と、Aza及びTSAで処理されたRRBL1細胞（処理群）をリツキシマブ非存在下（●、■）又は存在下（◆、▲）で培養した後、生細胞数を比較した。 CD20遺伝子プロモーターにおけるCD20転写調節の解析。（Ａ） CD20遺伝子プロモーターの構成。図中の矢印（CD20pro-U、CD20pro-L）は、クロマチン免疫沈降法（ChIP）で使用されたPCRプライマーの位置を示す。（Ｂ） 抗Pu.1抗体、抗IRF4抗体、抗アセチル化H4(Ac-H4)抗体、抗Sin3抗体、及び抗HDAC1抗体を用いたChIPアッセイの結果。（Ｃ） 抗CD20抗体及び抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロットの結果。 RRBL1細胞を移植したNOD/SCIDマウスに形成された腫瘍の重量。RRBL1細胞(5 X 10⁶) がNOD/SCID免疫不全マウスの背部に皮下注射された。投与から30日で肉眼的に確認できる腫瘍が認められ、腫瘍サイズか腫瘍の重量が計算された。二匹のマウスに同様の検討を施行し（SC1, SC2）、ほとんど同様の経過が認められた。 RRBL1細胞を投与したNOD/SCIDマウスの病理組織（図左）とRRBL1細胞の元になった患者の剖検組織所見（図右）の比較。RRBL1細胞 (5 X 10⁶)がNOD/SCIDマウスの静脈内に投与された。移植後8週間でマウスは適切な麻酔のもとで臓器が摘出され、病理学的に検討が加えられた。RRBL1細胞はびまん性に肝臓、脾臓、腎臓、骨髄等の臓器に浸潤していた（HE染色、図左）。抗CD20抗体を用いた免疫染色では腫瘍細胞は陰性を示し、B細胞を認識する抗CD79a抗体を用いた免疫染色では腫瘍細胞は陽性に認められた。また、細胞株のもととなった患者の剖検組織所見を右に示した。腫瘍細胞は、肝臓、脾臓、腎臓、骨髄にびまん性に浸潤し、抗CD20抗体を用いた免疫染色では陰性を示した。抗CD79a抗体を用いた検討では、陽性を示し、B細胞のリンパ腫細胞であることが確認された。これらの結果から、RRBL1細胞を移植したNOD/SCIDマウスの病理所見は、患者の病態を良く反映した所見であることが確認された。 原発性リンパ腫細胞とRRBL1細胞の表面抗原。 名古屋大学医学部附属病院におけるCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫に対するリツキシマブ使用経験とCD20陰性転化の頻度。名古屋大学医学部附属病院において、リツキシマブを含む化学療法を施行されたCD20陽性悪性リンパ腫症例を示す。2001年末から2006年の約5年間において124症例に対してリツキシマブを含む化学療法が施行され、うち36症例（29％）において再発、再燃が認められた。このうちの約半数19症例において再度組織生検が施行され、5症例（再生検された症例のうち26.3％）においてCD20発現の陰性転化が確認された。CD20が陰性転化した症例の予後は極めて不良で、陰性転化確認後1年以内に全ての症例が死亡している。

（用語の説明）
説明の便宜上、本明細書中で使用する用語の一部についてその定義・意味を以下にまとめて記す。
「CD20（clusters of differentiation 20）（又はCD20抗原）」は分子量33〜37kDaのリン酸化蛋白であり、B細胞の活性化や増殖に関与すると考えられている。CD20はB細胞系表面マーカーの一つであり、成熟B細胞の他、B細胞性悪性リンパ腫の大部分、及び慢性リンパ性白血病細胞においてその発現が認められている。
「CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫」とはCD20の発現が認められるB細胞性悪性リンパ腫のことをいい、濾胞性B細胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性悪性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫等が該当する。
「CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫」とは、もともとCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫であったものが、CD20蛋白の発現レベルの大幅な低下が生ずることによってCD20陰性であると評価されるに至った病態のことをいう。このようなCD20陽性からCD20陰性への変化のことを本明細書では「CD20陰転化」と表現する。CD20を標的とした分子治療薬（例えばリツキシマブ）の継続的な使用によってCD20陰転化が生ずることが経験されている。
「CD20を標的とした分子標的薬」とは、CD20を標的として設計された化合物であって、CD20への作用を介して薬効を発揮するものをいう。現在、CD20を標的とした分子標的薬としてリツキシマブ、イブリルモマブ（⁹⁰Y Ibritumomab）、トシツモマブ（¹³¹I Tositumomab）が実際に癌治療に使用されている。リツキシマブはRituxan（登録商標、バイオジェン・アイデック社）の名称で、イブリルモマブはZevalin（登録商標、バイオジェン・アイデック社）の名称で、トシツモマブはBEXXAR（登録商標、グラクソ・スミスクライン社）の名称で提供されている。

（CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞株）
本発明の第１の局面はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞株（以下、「本発明の細胞株」という）に関する。本発明の細胞株は、CD20蛋白の発現が陰転化したB細胞性悪性リンパ腫に由来する。即ち、本発明の細胞株は、当初はCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫であったものがCD20陰性と評価されるに至ったB細胞性悪性リンパ腫の細胞を基に株化されたものである。例えば、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫を罹患する患者の末梢血より、単核球の分離、それに続く培養によって本発明の細胞株を樹立することが可能である。後述の実施例に示すように本発明者らは、当初、濾胞性リンパ腫と診断され、リツキシマブによる治療後にCD20陰性のびまん性B細胞性悪性リンパ腫として形質転換して再燃した患者よりCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞株の樹立に成功している。当該細胞株（RRBL1）は以下の通り所定の寄託機関に寄託されており、容易に入手可能である。
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号 中央第６）
寄託日：平成１８年９月２０日
受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１０２６

尚、上記細胞株（RRBL1）は、平成１９年（２００７年）９月１２日付けの移管請求に基づき、以下の通り国際寄託へ移管されている。
国際寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号 中央第６）
受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９１０
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９１０

本発明者らの検討の結果、RRBL1ではCD20 mRNAの発現レベルの大幅な低下が生じていることが判明した。即ち、CD20 mRNAの発現量低下に起因してCD20蛋白の発現が陰転化していることが明らかとなった。このようにRRBL1の樹立によって、分子標的薬に対する耐性獲得の機序の一端が明らかとなった。
また、RBBL1はCD20蛋白の発現能を保持していること、即ちCD20蛋白の潜在的発現能を有することが明らかとなった。
ここで、分子標的薬の特異性の高さや作用機序の普遍性を考えると、CD20を標的とした分子標的薬に対して耐性を獲得した病態から樹立される細胞株では、RRBL1と同様にCD20 mRNAの発現量低下に起因してCD20蛋白の発現が陰転化しており、且つCD20の潜在的発現能を有する蓋然性が高い。つまり、CD20を標的とした分子標的薬に対して耐性を獲得した様々な病態より、可逆的にmRNAの発現量が低下することでCD20の陰転化が生じた細胞株をRRBL1と同様に樹立可能であるといえる。

本発明者らの更なる検討によってRRBL1はCD10陽性、CD19陽性、CD20陰性、及び免疫グロブリン軽鎖（κ鎖、λ鎖）陰性（以上、B細胞マーカー）、CD2陰性、CD3陰性、CD4陰性、CD５陰性、CD7陰性、CD8陰性、CD56陰性（以上、T細胞又はNK細胞マーカー）、CD11c陰性、CD16陰性、CD25陽性、CD30陰性、及びCD34陰性であることが判明した（図１２を参照）。

（モデル動物）
本発明の第２の局面は本発明の細胞株を利用して作製されるモデル動物に関する。本発明のモデル動物は、本発明の細胞株を免疫不全非ヒト動物に移植又は投与することによって作製され、使用する細胞株に対応した特徴的な病態を反映する。この特徴によって、使用する細胞株に対応した病態に対する治療戦略を検討するためのin vivoモデルとして有用となる。例えば、本発明のモデル動物を用いて候補治療薬の薬効や副作用を検討することや、CD20の発現量の変化を組織レベルで検討すること等を行うことが可能である。
使用する細胞株によって本発明のモデル動物が反映する病態は異なるが、典型的には、本発明のモデル動物では病理所見として肝臓、脾臓、腎臓、骨髄等への腫瘍細胞の浸潤が認められる。
尚、後述の実施例に示すように、本発明者らはRRBL1をNOD/SCIDマウスに投与することによって、RRBL1の元になった患者の病態を良好に反映したモデルマウスを作製することに成功している。

ここで、免疫不全非ヒト動物への細胞の移植又は投与方法は常法に従えばよく、皮下注射、腹腔内注射、経静脈投与等を採用することができる（細胞工学 別冊、マウス解剖イラストレイテッド（野村慎太郎 著、秀潤社）等の成書が参考になる）。使用する免疫不全非ヒト動物の種類は特に限定されず、BALB/cヌードマウス、BALB/cAヌードマウス、NU/NUマウス、NIH-IIIヌードマウス、Fox Chase Scidマウス、Fox Chase Scid Beige マウス、Fox Chase Scid Ourbredマウス、NOD/SCIDマウス、NOGマウス、ヌードラット等を用いればよい。この中でもNOD/SCIDマウス及びNOGマウスが生着性の点から特に好ましい。尚、上掲の各種免疫不全非ヒト動物は日本クレア株式会社（東京、日本）、日本チャールズ・リバー株式会社（横浜、日本）、Charles River Laboratories（ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）、Taconic（ニューヨーク、米国）などから入手することが可能である。

（スクリーニング方法）
本発明の第３の局面は、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法の第１の態様では、（１）試験物質の存在下、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップと、（２）培養後の細胞におけるCD20 mRNA発現量又はCD20蛋白発現量を測定し、試験物質のCD20発現誘導能を評価するステップが実施される。
本発明のスクリーニング方法で選抜された物質（スクリーニング結果物）は、CD20を標的とする分子治療薬（以下、特に説明のない限り、「分子標的薬」とは「CD20を標的とした分子標的薬」のことを指す）と併用されるという条件の下、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬の有効成分として有力な候補（リード化合物）となる。選抜された物質が十分な薬効を有する場合にはそのまま医薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合であっても化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で医薬の有効成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。

スクリーニング結果物はCD20発現誘導能を有する。このCD20発現誘導能によってスクリーニング結果物は、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫に対して適用された場合にはCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫細胞が分子標的薬に対して耐性を獲得することを阻止し、CD20が陽性であっても、その発現量が比較的高くはないB細胞に対してもCD20の更なる発現を促すことによって、分子標的薬がより良好に作用する環境を作り出す。一方、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して適用された場合には、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を分子標的薬に対して感受性へと変換し、分子標的薬が再び薬効を奏する環境を作り出す。以上のようにスクリーニング結果物は、分子標的薬と併用されることによって、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫及びCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫のいずれに対しても効果的な治療成績をもたらすと期待される。
以下、本発明のスクリーニング方法の詳細についてステップ毎に説明する。

（１）培養ステップ
このステップではCD20陰転化B細胞悪性リンパ腫細胞を用意し、試験物質の存在下での培養に供する。CD20陰転化B細胞悪性リンパ腫細胞として上記本発明の細胞株（例えばRRBL1）を用いることができるのは当然であるが、株化していない細胞を用いることもできる。即ち、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫を罹患した患者から採取した細胞をそのまま本発明のスクリーニング方法に供しても良い。尚、ここでの「そのまま」とは、株化の操作が行われないことを意味し、分離操作や洗浄操作など、スクリーニング方法に適用するにあたって通常必要とされる操作を制限するものではない。

使用する細胞の数は特に限定されず、検出感度、実験設備等を考慮して定めることができる。例えば、１回のスクリーニング操作に1×10²個〜1×10⁶個の細胞を用いることができる。

培養液中の試験物質の存在量（添加量）は任意に設定可能であるが、正常細胞を同様の条件で培養した際に致命的な影響を与えない範囲で添加量を設定するとよい。当業者であれば予備実験によって適切な添加量を設定可能である。
培養時間は、試験物質の作用・効果が十分に評価できるように設定されるものであるが、特に限定されない。例えば、培養時間を１分〜１０日の範囲内で設定することができる。尚、目的の作用・効果を示す物質が見出された場合には、その物質が作用・効果を示すまでに要する時間を基に、以降のスクリーニングにおける培養時間を設定することができる。例えば、後述の実施例に記載されるようにRRBL1を用いた試験では１〜７日程度の培養によって5-Aza-2'-DeoxycytidineがCD20の発現を誘導することが明らかになったことから、この知見に基づいてRRBL1を用いたスクリーニング方法であれば培養時間を１〜７日の範囲内で設定することができる。

本発明のスクリーニング方法に供する試験物質としては、様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ビタミン、ホルモン等））又は無機化合物を用いることができる。試験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験物質として用いてもよい
ここで、上述の通り、RRBL1を用いた検討によってCD20陰転化がCD20 mRNAの発現レベルの低下に起因して生ずることが明らかとなった。この知見より、CD20遺伝子の転写調節に影響を与えることによって転写率を向上させる化合物（DNAメチル化酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ヒストンメチル化酵素阻害剤、RNA干渉（siRNA）、核酸・蛋白アプタマー、スモールペプチド、ドミナントネガティブ蛋白等）を試験物質として使用することが好ましい。

（２）測定・評価ステップ
このステップでは、培養後の細胞におけるCD20 mRNA発現量又はCD20蛋白発現量（以下、これら二つをまとめて「CD20発現量」という）を測定し、試験物質のCD20発現誘導能を評価する。CD20 mRNA発現量の測定にはRT-PCR法（リアルタイム法を含む）、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダイゼーション法（例えばノザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション）などの常法を採用できる。CD20蛋白発現量は、CD20蛋白に対して特異的に結合する化合物を用いて測定できる。CD20蛋白発現量の測定は、これに限定されるものではないが、免疫学的手法によることが好ましい。免疫学的手法では特定の蛋白に対する抗体が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標として当該蛋白が検出される。ここでの用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、又はこれらの断片等を含む。本発明における抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。
免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。尚、検出方法としては例えば、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー（FCM）、免疫沈降法、免疫染色法、イムノブロッティング等の方法が挙げられる。

標識化した抗体を用いることにより、上記の測定を容易に実施することが可能である。抗体の標識化には例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、³²P、¹³¹I、¹²⁵I等の放射性同位体、及びビオチン等を用いることができる。

測定結果を用いて試験物質のCD20発現誘導能を評価する。例えば、試験物質の存在下で培養する細胞（試験群）と、試験物質の非存在下で培養する細胞（対照群）とを用意し、各群についてCD20発現量を測定し、比較する。比較結果から、試験物質が存在した結果としてCD20発現量が変化した程度（発現量変化）が求められる。対照群に比較して試験群のCD20発現量が多い場合、即ち試験物質にCD20発現誘導能が認められた場合、当該試験物質がCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効であると判定できる。試験群においてCD20発現量の顕著な増加が認められた場合、当該試験物質の有効性は特に高いと判定できる。
尚、試験物質の非存在下でのCD20発現量が予め判明している場合には、この発現量を対照群の発現量として用いることもできる。また、試験物質の存在下での培養前後のCD20発現量を比較することによっても、試験物質のCD20発現誘導能を評価することができる。

本発明の一態様では、CD20発現量の測定を経時的に行い、測定時点の異なる複数の測定結果を得ることにし、得られた複数の測定結果を用いて試験物質のCD20発現誘導能を評価する。このような経時的な測定に基づけば、試験物質の作用の仕方や持続時間など、試験物質の有効性を評価する上で有益な多くの情報を得ることができる。

以上のステップ（１）及び（２）の後、以下のステップ（３）〜（５）を実施することにしてもよい。
（３）ステップ（２）の結果に基づいて選抜された試験物質の存在下、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ。
（４）CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（３）後の細胞を培養するステップ。
（５）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
これらのステップを実施することによって、ステップ（１）及び（２）で選抜された試験物質が分子標的薬と併用された際に実際に治療効果を示すか否かを確認できる。以下、各ステップの詳細を説明するが、ここで特に言及しない事項についてはステップ（１）及び（２）における対応する説明が援用される。

（３）培養ステップ（選抜された試験物質の存在下）
この培養ステップでは、CD20発現誘導能が認められた試験物質の存在下、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞が培養される。ここで使用するCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞は、ステップ（１）で使用した細胞と同一種類のものでも異なる種類のものでもよい。後者の例として、ステップ（１）で使用した細胞が由来する患者と異なる患者から採取したCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫を用いる場合を挙げることができる。CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞としてRRBL1を用いることもできる。

（４）培養ステップ（分子標的薬の存在下）
この培養ステップは分子標的薬の存在下で行われる。分子標的薬としてリツキシマブ、イブリルモマブ、又はトシツモマブを好適に用いることができるが、これらに限られるものではない。
培養液中の分子標的薬の存在量（添加量）は任意に設定可能であるが、正常細胞を同様の条件で培養した際に致命的な影響を与えない範囲で添加量を設定するとよい。当業者であれば予備実験によって適切な添加量を設定可能である。
培養時間は、分子標的薬の作用が発揮されるのに十分な時間とする。例えば、ここでの培養時間を１分〜１０日の範囲内で設定することができる。

（５）測定・評価ステップ
このステップでは培養後の細胞の生存数を測定し、試験物質及び分子標的薬の作用による細胞殺傷効果を評価する。評価結果に基づいて試験物質の有効性が判定される。例えば、ステップ（３）と（４）を実施する群（試験群）と、ステップ（４）のみを実施する群（即ち、分子標的薬の存在下での培養のみを実施する群：対照群）とを用意し、各群について培養後の生細胞数を測定し、比較する。比較結果から、試験物質の存在下での培養を実施した結果として細胞生存率が変化した程度が求められる。対照群に比較して試験群の生細胞数が少ない（細胞生存率が低い）場合、即ち試験物質に分子標的薬の作用・効果を高める能力が認められた場合、当該試験物質は有効であると判定できる。試験群において細胞生存率の顕著な低下が認められた場合、当該試験物質の有効性は特に高いと判定できる。
対照群を設定するのではなく、試験群における培養前後の細胞数を比較することによっても、試験物質の有効性を判定することが可能である。但し、上記の如き対照群を設定した方が信頼性の高い結果を得ることができる。
尚、このステップにおける測定を経時的に行い、複数の測定結果に基づいて判定することにしてもよい。

本発明の一態様では上記ステップ（３）〜（５）に代えて以下のステップ（３）及び（４）を実施する。
（３）ステップ（２）の結果に基づいて選抜された試験物質と、CD20を標的とした分子標的薬の存在下、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫細胞又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ。
（４）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。

これらのステップを実施することによって、ステップ（１）及び（２）で選抜された試験物質が、CD20を標的とした分子標的薬と同時に投与された際に実際に治療効果を示すか否かを調べることができる。培養ステップに供する細胞としてCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫細胞を採用した場合、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫に対する治療効果を検討することができる。他方、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を採用した場合はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する治療効果を検討することができる。

この態様では試験物質と分子標的薬が共存する条件下で培養を実施する。培養ステップに続いて実施される測定・評価ステップでは、上記のステップ（５）と同様に、培養後の細胞の生存数を測定し、試験物質及び分子標的薬の作用による細胞殺傷効果を評価する。そして評価結果に基づき試験物質の有効性を判定する。対照群として、試験物質の非存在下且つ分子標的薬の存在下で培養する細胞、試験物質及び分子標的薬の非存在下で培養する細胞を用いることができる。
尚、ここで特に言及しなかった事項については、既述の対応する記載が援用される。

本発明は更に、CD20を標的とした分子標的薬と併用された際に良好な治療効果をもたらす物質をより簡便にスクリーニングする方法を提供する。ここでのスクリーニング方法では本発明の細胞株（RRBL1等）が利用される。具体的には以下の二種類のスクリーニング方法が提供される。
（第１の態様）
CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
（１）試験物質の存在下、本発明の細胞株を培養するステップ、及び
（２）CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（１）後の細胞を培養するステップ、及び
（３）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、
を含む方法。

（第２の態様）
CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
（１）試験物質、及びCD20を標的とした分子標的薬の存在下、本発明の細胞株を培養するステップ、及び
（２）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、
を含む方法。

本発明はさらに本発明のモデル動物を利用したスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法によればCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質をin vivoレベルの実験によって選抜することができる。具体的には以下のスクリーニング方法が提供される。
CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
（１）本発明のモデル動物に試験物質を投与するステップ、及び
（２）前記モデル動物が反映する、CD陰性B細胞性悪性リンパ腫に特徴的な病態の変化を調べるステップ、
を含む方法。
以下、各ステップの詳細を説明するが、特に言及しない事項については既述の対応する記載が援用される。

ステップ（１）では本発明のモデル動物に試験物質を投与する。投与経路は特に限定されず、経口投与、静脈内投与（注射）、皮内投与（注射）、皮下投与（注射）、経皮投与、口腔内投与、標的器官（臓器）への直接投与（注射）等から適当なものを選択できる。尚、ここでの「標的器官（臓器）」は、モデル動物においてCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫の特徴を示す器官（臓器）であり、例えば腫瘍細胞の浸潤が認められる肝臓、脾臓、腎臓、骨髄等が該当する。
投与量は任意に設定可能である。例えば、モデル動物に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の投与量とすることができる。
投与回数も任意に設定可能である。例えば、投与回数を１回〜２０回の範囲内とする。

ステップ（２）では、試験物質投与後のモデル動物を用いて、CD陰性B細胞性悪性リンパ腫に特徴的な病態の変化を調べる。病態の改善が認められた場合、試験物質が有効であると判定できる。例えば、標的器官（臓器）の肉眼的観察、免疫染色、病理組織学的観察、腫瘍重量測定、胸水腹水測定、蛋白抽出、RNA抽出、FCM等によって、病態の変化を調べることができる。好ましくは、試験物質を投与しないモデル動物（対照群）を用意し、試験群と対照群との間で病態を比較し、試験物質の有効性を判定する。

（医薬）
本発明の更なる局面は、RRBL1を用いた検討によって得られた知見、即ちCD20陰転化の一因がCD20 mRNAのエピジェニックな変化によること、及びCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞においてCD20蛋白を再発現させることが可能であることに基づいて、CD20蛋白の発現量を増大させる化合物を含有することを特徴とする、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬を提供する。本発明の医薬は分子標的薬と併用される。但し、本発明の医薬を分子標的薬との混合製剤として構成することもでき（後述）、この場合には単独で使用され得る。

CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫に対して使用された場合、本発明の医薬はCD20蛋白の発現量の低下を抑制ないし阻止することによって、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫の細胞が分子標的薬に対して耐性を獲得することを防止する。これによって分子標的薬が継続的に作用し得る環境が作り出され、良好な治療効果がもたらされる。また、CD20陽性と判定されたB細胞においても、CD20の発現量が比較的低い場合には、その発現量をさらに増大させることにより、分子標的薬がより効果的に作用する環境を提供する。一方、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して使用された場合、本発明の医薬はCD20蛋白の再発現を促すことでCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を分子標的薬に感受性を示す形質へと変化させる。その結果、分子標的薬が再び作用できるようになり、良好な治療効果がもたらされる。

ここでの「CD20蛋白の発現量を増大させる化合物」は、CD20遺伝子の転写、翻訳又は翻訳後修飾のいずれかの段階に作用することで、CD20蛋白の発現量を増大させることができればよい。
RRBL1を用いた検討の結果、CD20の陰転化とCD20 mRNAの発現量の変化が密接な関係にあることが判明した。このことを考慮すれば、CD20蛋白の発現量を増大させる手段としてCD20 mRNAの発現量を増大させることが有効といえる。そこで好ましくは、本発明では「CD20蛋白の発現量を増大させる化合物」として、CD20遺伝子の転写調節に影響を与えることによって転写率を向上させる化合物（例えばDNAメチル化酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ヒストンメチル化酵素阻害剤、RNA干渉（siRNA）、核酸・蛋白アプタマー、スモールペプチド、ドミナントネガティブ蛋白等）が用いられる。後述の実施例に示す通り、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞に対してDNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用した場合にCD20 mRNAの発現量が増大することが確認された。そこで本発明の好ましい一態様ではDNAメチル化酵素阻害剤及び／又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が有効成分として用いられる。
DNAメチル化酵素阻害剤として5-Aza-2'-Deoxycytidine、5-Azacytidine、5-Fuluoro-2'-deoxycytidine、5,6-Dihydro-5-azacytidine、Zebularine、Hydralazineなど様々な化合物が知られており、これらは全て本発明の医薬の有効成分の有力な候補となる。同様に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤として、トリコスタチンＡ(TSA)、バルプロ酸、フェニルブチレート、SAHA(suberoylanilidie hydroxamic acid)、FR901228(depsipeptide,FK228)、MS-27-275、CHAPs、LAQ824、YM753、PDX101、LBH589など様々な化合物が知られており、これらは全て本発明の医薬の有効成分の有力な候補となる。尚、公知のDNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対してその作用を損なわない程度に改変を施した各種誘導体を本発明におけるDNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤として用いることもできる。
DNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に分類される化合物を二種類以上組み合わせて（併用して）本発明の医薬を構成してもよい。例えば、異なる種類のDNAメチル化酵素阻害剤の組合せや、一種又は二種以上のDNAメチル化酵素阻害剤と一種又は二種以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の組合せなど、この場合の組み合わせは任意である。

本発明の一態様では分子標的薬を本発明の医薬中に含有させる。このような医薬ではその単独での使用によって、上記同様の治療効果を期待できる。

本発明の医薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。

本発明の医薬における有効成分の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量％〜約100重量％とする。
本発明の医薬の剤型も特に限定されず、例えば点滴剤、注射剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、外用剤、及び座剤などとして本発明の医薬を調製できる。

（治療法）
本発明は更に、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫の治療法を提供する。本発明の治療法では、DNAメチル化酵素阻害剤及び／又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と分子標的薬とが併用される。好ましくは、前者を投与後に後者を投与するか、両者を同時に投与する。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、リンパ節内、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好適には、本発明の治療法における対象はヒトである。

投与量は症状、投与対象の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば予備実験（細胞又はモデル動物を用いた実験など）の結果や臨床試験の結果を踏まえて適宜適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、三日に一回、四日に一回、一週間に一回、二週間に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、投与対象の病状や薬効の持続時間などを考慮することができる。

尚、本明細書で特に言及しない事項（条件、操作方法など）については常法に従えばよく、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）、Current protocols in Immunology, John Wiley& Sons Inc等を参考にすることができる。

１．CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞株の樹立
（１）患者背景
初診時43歳日本人男性である患者より細胞を採取した。この患者は1993年に両側頚部リンパ節腫脹と盗汗を主訴に名古屋大学付属病院に外来受診した。来院時、全身のリンパ節腫脹と触診上脾腫（左肋骨下縁より3横指）を認めた。血液検査にてヘモグロビン9.9 g/dl、血小板7.6万と、貧血、血小板減少を示した。白血球、LDHは正常範囲であった。左頚部リンパ節の生検が施行され、濾胞性リンパ腫（follicular small cleaved B-cell lymphoma：FSC）と診断され、表面抗原解析（FCM）にてCD10 (+), CD19 (+), CD20 (+), Igκ (+) の特徴が示された（図１２）。このように、このリンパ腫の細胞はCD20陽性であることが確認された。また、骨髄穿刺にて骨髄浸潤が確認された。古典的化学療法が繰り返し施行され、部分緩解（PR）が得られた(図１)。1997年からはリツキシマブ併用(375 mg/kg)化学療法が施行された。その後は病状が進行する度にリツキシマブ併用化学療法が施行された。リツキシマブは合計14回にわたって投与されたが、2004年6月、リツキシマブ併用化学療法施行中に、下腹部からそけい部にかけての腫瘍の急速な増大と脾腫の増大が認められた。骨髄にはCD10 (+), CD19 (+), Igκ (+) and CD20 (-)を示すリンパ腫細胞の浸潤が確認された(図１２)。骨髄所見にて、CD20陰性のリンパ腫細胞の浸潤が確認された。この時点において患者はCD20陰性のびまん性大細胞型悪性リンパ腫（DLBCL）への形質転換と診断された。その後、リツキシマブを併用しない救済化学療法が施行されたが、病状は悪化し、2004年7月にはCD20陰性のリンパ腫細胞が末梢血中にも認められるようになり、その数は次第に増加した。化学療法の甲斐なく、CD20陰性悪性リンパ腫細胞は急性白血病様の病態を呈し、患者は2005年2月20日に重症肺炎にて死亡した。患者の家族よりのインフォームドコンセントが取得された後、剖検が施行された。尚、患者の臨床経過を図１に示した。

（２）RRBL1細胞の樹立
2004年7月、インフォームドコンセントの後、患者の末梢血を採取した。Ficoll-Paque (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)により単核球を分離し、20 % ウシ胎仔血清（FCS)を含むRPMI1640培養液 (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)中での長期培養に供した。細胞は1年以上経代培養され、これにより株化されたと判断した。我々はこの細胞株をRRBL1(Rituximab resistant B-cell lymphoma 1)と名付けた。RRBL1細胞とその元になった患者のリンパ腫細胞に認められた染色体異常を図２に示した。第1染色体と第7染色体の相互転座t(1;7)(p36;p15)と、第14染色体と第18染色体の相互転座 t(14;18)(q32;q21)は両細胞で保存されていた。t(14;18)(q32;q21)の詳細な切断部位を確認するために、BCL2/JHの接合部位に特異的なプライマー(図３のＣ)を用いてPCRを施行した。異なる培養時期にサンプリングしたRRBL1細胞と、異なる臨床病期に採取した患者の悪性リンパ腫細胞よりゲノムDNAを調製し、このPCRによる検討に使用した(図３のＤ)。約800bpの単一のバンドがすべてのサンプルで増幅された(図３のＤ、レーン1〜4)。この結果より、RRBL1細胞は患者のCD20陰性リンパ腫細胞と基本的に同一のクローン由来であることが確認された。

２．RRBL1の解析、耐性化機序の解明
（１）RRBL1におけるCD20抗原の発現
次に我々は、RRBL1細胞におけるCD20蛋白の発現を検討した。RRBL1細胞のサイトスピン標本を用い、抗CD20モノクローナル抗体にて免疫染色を施行したが、CD20蛋白の発現は確認できなかった（図４のＡ）。陽性対照（コントロール）として用いたBurkittリンパ腫細胞株RajiにおいてはCD20蛋白の発現が確認された。次に、Raji細胞、RRBL1細胞、NALM6細胞よりそれぞれ全細胞溶解液を調製し、抗CD20抗体を用いたウエスタンブロットを施行した。NALM6細胞はCD20陰性細胞株として報告されており、陰性対照（コントロール）となる。図４のＢに示す通り、CD20蛋白の発現はRaji細胞のみで確認され、NALM6細胞とRRBL1細胞は陰性を示した。しかし興味深いことに、長時間の露光によって、RRBL1細胞にもごく僅かではあるがCD20蛋白の発現が認められた（図示せず）。この結果より、RRBL1細胞ではCD20蛋白の発現量は非常に少量であり、FCMや免疫染色によっては確認できないものと示唆された。

次に、定量的RT-PCRによってRRBL1細胞におけるCD20 mRNAの発現量を確認した（図４のＣ）。Raji細胞より調製したmRNAを陽性対照とし、293T細胞より調製したmRNAを陰性対照とした。さらにCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫の患者より採取したリンパ腫細胞のRNAについても同様に検討を加えた。実験の結果、RRBL1細胞におけるCD20 mRNAの発現量はRaji細胞や陽性対照である患者検体に比べて約100倍低いことが確認された（図４のＣ）。陰性対照の293T細胞では増幅を確認できなかった。以上より、RRBL1細胞におけるCD20蛋白発現量の低下は、mRNA発現量の低下に起因するものであると示唆された。

非常に興味深いことに、RRBL1細胞を長期に亘り経代培養することにより、亜株のRRBL2細胞が樹立された。RRBL2細胞においては、CD20蛋白の発現がRaji細胞と同様にウエスタンブロットで確認された（図４のＤ）。これは、CD20蛋白の発現能をRRBL1細胞が保持していることを明示しているといえる。また、CD20 mRNAの発現量低下には、何らかのエピジェネティックな調節機構が働いていることが強く示唆される。

一方、RRBL1細胞から調製したRNAを鋳型にして、CD20遺伝子のCDS全長をRT-PCRにて増幅し、T7Ts-Flagベクターにサブクローニングした。in vitroトランスレーションによって、Flagタグを付加したCD20蛋白を翻訳した後、SDS-PAGEを施行し、抗Flag抗体を用いたウエスタンブロットを施行した（図５）。正常サイズのCD20蛋白が翻訳されている（レーン１）。尚、10個のクローンについて遺伝子配列をシークエンスしたが、遺伝子変異は認められなかった

（２）リツキシマブに対する耐性
10% FCSを含有するRPMI1640培養液にリツキシマブ（500 mg/ml)を加え、37℃で2日間培養し、生細胞数を測定した。尚、Raji細胞を同様の条件下で培養した（対照群）。図６に示すように、Raji細胞の増殖はリツキシマブによって有意に抑制されるが、RRBL1細胞では増殖抑制が認められなかった。このようにRRBL1細胞はin vitroにおいてリツキシマブ耐性を示すことが確認された。

（３）CD20 mRNA及びCD20蛋白の再発現
RRBL1細胞の培養液中に5-Aza-2'-Deoxycytidine (SIGMA、以下「Aza」と略す)を投与し、24時間後に細胞を洗浄した。さらに2日間培養した後、細胞からRNA及び全細胞溶解液を抽出し、RT-PCRとウエスタンブロット法による解析に供した。その結果、CD20 mRNAの発現はAza処理後で上昇した（図７のＡ、RT、レーン2）。ウエスタンブロット解析では、Aza処理後にCD20蛋白の発現が認められた（図７のＡ、IB、レーン2）。

続いて、CD20 mRNA及びCD20蛋白の発現に関して継時的変化を調べた（図７のＢ）。0日目にAzaを培養液に投与し、37℃で24時間培養した(1日目)。その後、細胞を洗浄し、さらに1〜6日間培養した(2日目〜7日目)。培養後の細胞よりRNAと蛋白を抽出し、ウエスタンブロット(抗CD20抗体、抗IRF4抗体、抗PU.1抗体、抗DNMT1抗体、抗GAPDH抗体を使用)とRT-PCRによる解析に供した。結果を図７のＣに示す。Aza投与後1日目（レーン4）よりCD20蛋白の発現が上昇していることを確認できるが、発現量は3日目（レーン6）をピークとし、その後減少した。CD20 mRNAの発現は、CD20蛋白の発現と同様の傾向を示した（RT, レーン3〜8）。
IRF4、PU.1は、CD20遺伝子プロモーターに結合することが報告されている転写因子である。これらの発現はAza投与前から認められ、一時的に発現の上昇傾向が認められる（レーン5）。DNMT1(DNAメチルトランスフェラーゼ1)は、Azaにより分解されることが報告されている。既報の通り、Aza投与後1日目にDNMT1発現の著明な減少が認められる（レーン4）。

（４）分子標的薬併用投与時のCD20 mRNA及びCD20蛋白の発現
RRBL1細胞の培養上清にAza及びTSA(トリコスタチンA：ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤)を単独又は併用投与した。Aza投与１日後に細胞を洗浄した。さらに2日間培養後、細胞より蛋白を抽出した。TSA投与群についてはTSA投与後24時間の時点で細胞から蛋白を抽出した。併用投与群についてはまずAzaを投与して1日間培養した。洗浄後の細胞を１日間培養した後、TSAを投与し、さらに１日経過後に細胞を溶解し、蛋白を抽出した。このようにして得られた各サンプルをSDS-PAGEに供した後、抗CD20抗体と抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロットを施行した。ウエスタンブロットの結果を図８のＡに示す。CD20蛋白の発現はAzaとTSAの併用によって、より強く誘導された（図８のＡ、レーン6）。

RRBL1をAzaの存在下、又はAza及びTSAの存在下で培養後、細胞表面抗原をFCMで検討した。CD20抗原を発現する細胞（緑部分）は、Azaを単独使用した場合に比較して、AzaとTSAの併用使用した場合により多く認められた（図８のＢ）。

RRBL1細胞（非処理群）と、Aza及びTSAで処理されたRRBL1細胞（処理群）をそれぞれリツキシマブ非存在下（●、■）又は存在下（◆、▲）で２日間培養し、生細胞数を比較した（図８のＣ）。AzaとTSAで処理されたRRBL1細胞の増殖は、リツキシマブによって有意に阻害された（▲）。この結果より、Aza及びTSAで処理されることによってCD20蛋白の発現が誘導されたRRBL1細胞はリツキシマブに感受性であることが示された。

（５）CD20遺伝子プロモーターにおけるCD20転写調節の解析
CD20遺伝子プロモーターの構成を図９のＡに示す。CD20遺伝子プロモーターには転写因子Pu.1とIRF4の結合ドメインが存在する。さらに下流には、Oct2等の転写調節因子が結合することが報告されているE-boxが存在する。
RRBL1細胞におけるCD20遺伝子プロモーター部位のクロマチン免疫沈降法（ChIPアッセイ）を行った。Aza及びTSAで処理したRRBL1細胞（処理群）と非処理のRRBL1細胞（非処理群）をホルマリン固定した後、クロマチンを抽出し、抗Pu.1抗体、抗IRF4抗体、抗アセチル化H4(Ac-H4)抗体、抗Sin3抗体、及び抗HDAC1抗体を用いてChIPアッセイを施行した。結合したDNAは図９のＡに示したプライマーを用いたPCRで検出した。図９のＢに示すように、Pu.1、IRF4は、薬剤処理の有無に関わらず、CD20プロモーターに結合していた（レーン5〜8）。薬剤処理によってCD20プロモーター部位のヒストンH4のアセチル化の割合が増加した（レーン10）。転写抑制因子複合体の構成蛋白であるSin3、HDAC1は薬剤処理前にはプロモーターにリクルートされているが（レーン11、13）、処理後は解離していた（レーン12、14）。
一方、薬剤処理したRRBL1細胞より蛋白を抽出し、抗CD20抗体及び抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロットを施行した。Sin3、HDAC1の蛋白発現自体は薬剤投与の有無によって大きくは変化しないことが確認された（図９のＣ）。これによって、図９のＢで示された、Sin3、HDAC1のCD20遺伝子プロモーターからの消失は、リクルートされていた蛋白が解離されたことに起因することが示唆された。

３．RBBL1の免疫の免疫不全NOD/SCIDマウスへの移植
以上の解析の結果、RRBL1細胞がリツキシマブ耐性CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫のモデルとして有用であることが確認された。RRBL1のin vivoへの移植モデルが確立されればさらに有用な系となると考えられる。そこで、RRBL1細胞をNOD/SCIDマウス（財団法 人実験動物中央研究所（神奈川県川崎市））の背部に皮下注射し、腫瘍が形成されるか否かを検討した。注射から30日目に腫瘍の形成が肉眼的に確認できるようになり、腫瘍の増大は53日目まで観察することが可能であった（図１０）。このことは、RRBL1細胞がNOD/SCIDマウスの生体内の環境で維持可能であることを示す。次に、RRBL1細胞を経静脈的に投与して腫瘍の形成を観察した。移植から50日後、マウスに麻酔を施行した後に臓器を取り出し、病理組織を検討した（図１１左）。腫瘍細胞は肝臓、脾臓、腎臓、骨髄等の腫瘍臓器に著明に浸潤して増殖し、免疫染色を施行するとその腫瘍細胞はCD20陰性、CD79a陽性のBリンパ球の性格を保持していることが確認された。RRBL1細胞の由来となる患者の剖検組織所見（図１１右）と比較した結果、患者組織においてもCD20陰性、CD79a陽性のB細胞性悪性リンパ腫細胞が肝臓、脾臓、腎臓、骨髄に著明な浸潤を認め、RRBL1移植マウスと大変似通った病理所見を示していることが確認された。これらの結果は、RRBL1細胞NOD/SCID移植モデルは、RRBL1細胞株の元となった患者の病状を非常によく反映し、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対する新規治療戦略（従来の化学療法剤のみならず、分子標的薬、ホルモン、ビタミン等の併用など）を検討するin vivoモデルとして極めて有用であることを強く示唆する。

４．考察
臨床の場において、でリツキシマブがCD20陽性悪性リンパ腫に対する分子標的薬として古典的な化学療法剤（CHOP療法など）と併用されるようになってから5年以上が経過する（非特許文献１５、１６）。リツキシマブの併用によって緩解率、無病生存率もしくは無症候生存率が有意に延長されたとの報告が相次いでいる（非特許文献３〜８）。しかし、リツキシマブ併用によりCHOP療法等によるB細胞性悪性リンパ腫の治療成績が改善されたとはいえ、治癒率に関しては完璧というには未だほど遠い。最近になって、リツキシマブにより治療されたCD20陽性B細胞性悪性リンパ腫患者において、リツキシマブ耐性化リンパ腫として再発、再燃する例が報告されるようになった（非特許文献９〜１２）。このようなリツキシマブ耐性の問題は、初発のみならず再発のB細胞性リンパ腫患者の治療において、これからますます大きな問題となってくるであろうことは想像に難くない。これらの観点から、我々は少なくとも以下の2点に関して早急に検討しなくてはならないであろうと考えている。まず一点目は、CD20陰転化機序の詳細な解析、二点目はリツキシマブ耐性の克服である。

2001年9月より約5年間において、当施設においてリツキシマブを含む化学療法を施行されたCD20陽性悪性リンパ腫症例は124例であったが（図１３）、その中の36症例（29.0 %）において再発・再燃を来した。再発・再燃症例のうち19症例で腫瘍の再生検が施行されたが、うち5症例（再生検施行症例中26.3 %）で表面マーカー検査（FCM）、免疫染色においてCD20発現の消失、もしくは低下が認められた。
我々は、CD20陽性濾胞性リンパ腫がリツキシマブ投与後にCD20陰転化再燃し、びまん性大細胞型悪性リンパ腫(DLBCL)に形質転換した患者より、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞であるRRBL1細胞を株化することに成功した。この細胞株において、CD20抗原はFCMや免疫染色では検出不能であった。しかし、ウエスタンブロット法によっては、ごく僅かではあるがCD20蛋白の発現が確認され、興味深いことには定量的RT-PCR法によってはCD20陽性リンパ腫細胞に比較して約1/100の量のCD20 mRNAの発現を確認した。このことから、mRNAの発現量の減少が、CD20表面抗原の発現が陰転化した重要な一因であり、患者のリツキシマブ耐性化の原因であることが強く示唆された。大変興味深いことに、RRBL1を長期培養することによって得られた亜株RRBL2においては、CD20蛋白の十分な発現が確認された。この知見から、CD20 mRNAの発現が何らかの理由によって異常に抑制を受けた結果、リツキシマブに対する耐性化が生じたと考えられた。このmRNA発現抑制の原因として、（１）CD20プロモーター部分の遺伝子変異、（２）CD20遺伝子の欠失、（３）CpGの異常なメチル化等を含む、CD20 mRNA発現のエピジェネティックな変化（非特許文献１７）、（４）CD20 mRNAの発現を調節する転写因子や転写調節因子の異常、が考えられる。RRBL2ではCD20蛋白の発現が認められたという事実を考慮すれば（１）と（２）の可能性は低いと考えられる。

最近、CD20のコーディングシークエンスにおける遺伝子変異がリツキシマブに対する耐性の獲得の原因の一つとして報告された（非特許文献１０）。遺伝子変異が特定の部位に起こればそれが耐性機序に関わるであろうことは理解できる。最近の報告によるとリツキシマブはCD20蛋白の高次構造を認識することでその機能を発揮することが報告された（非特許文献１８）。しかし、我々が経験した症例においては、リツキシマブに対する耐性の獲得は、CD20蛋白の細胞表面への発現量が低下したことによってリツキシマブがCD20抗原を認識できないことによると予想された。CD20 mRNAの発現量が低下したことが問題であれば、何らかの方法によってCD20 mRNAの発現量を増加できればリツキシマブに対する耐性を克服できるといえる。即ち、CD20 mRNAの発現を誘導することが、リツキシマブに対する耐性の克服に向けた有望な戦略となる。
我々の更なる検討の結果、CD20 mRNA発現のエピジェネティックな変化が、リツキシマブ耐性化の主要な原因であることが示唆された。また、CD20 mRNAの発現を誘導し、CD20蛋白を再発現させることが可能であり、このような処理を施すことによってリツキシマブに対する感受性を高めることが可能であることが示された。この成果は、CD20 mRNAの発現を誘導するという戦略が実際に有効であることを裏付ける。

我々はまた、RRBL1細胞がNOD/SCIDマウスに移植可能であることを示した。重要なことは、この移植マウスにおける腫瘍細胞の浸潤形態が、RBBL1細胞の由来である患者の病態を非常に良く再現していた点である。このことから、RRBL1細胞はin vitroにおけるCD20陰転化機序の解析に有用であることにとどまらず、in vivoにおいてリツキシマブ耐性CD20陰性B細胞性悪性リンパ腫に対する治療戦略を開発する上でも非常に有用であるといえる。

本発明が提供するCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞、モデル動物、スクリーニング方法は、CD20を標的とした分子標的薬に対する耐性化の阻止又は克服のための治療戦略を開発する上で有用である。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (9)

1. CD20蛋白の発現が陰転化した、濾胞性リンパ腫から形質転換したびまん性B細胞性悪性リンパ腫、に由来するCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞株であって、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９１０で特定される細胞株。
2. 請求項１に記載の細胞株を免疫不全非ヒト動物に移植又は投与することによって作製される、CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫の病態を反映したモデル動物。
3. 前記免疫不全非ヒト動物がNOD/SCIDマウスである、請求項２に記載のモデル動物。
4. CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
   （１）試験物質の存在下、請求項１に記載の細胞株を培養するステップ、及び
   （２）培養後の細胞におけるCD20 mRNA発現量又はCD20蛋白発現量を測定し、前記試験物質のCD20発現誘導能を評価するステップ、
   を含む方法。
5. 以下のステップを更に含む、請求項４に記載のスクリーニング方法、
   （３）ステップ（２）の結果に基づいて選抜された試験物質の存在下、請求項１に記載の細胞株を培養するステップ、
   （４）CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（３）後の細胞を培養するステップ、及び
   （５）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
6. 以下のステップを更に含む、請求項４に記載のスクリーニング方法、
   （３）ステップ（２）の結果に基づいて選抜された試験物質と、CD20を標的とした分子標的薬の存在下、CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫細胞又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、及び
   （４）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
7. CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
   （１）試験物質の存在下、請求項１に記載の細胞株を培養するステップ、及び
   （２）CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（１）後の細胞を培養するステップ、及び
   （３）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、
   を含む方法。
8. CD20陽性B細胞性悪性リンパ腫又はCD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
   （１）試験物質、及びCD20を標的とした分子標的薬の存在下、請求項１に記載の細胞株を培養するステップ、及び
   （２）細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、
   を含む方法。
9. CD20陰転化B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であって、
   （１）請求項２又は３に記載のモデル動物に試験物質を投与するステップ、及び
   （２）前記モデル動物が反映する、CD陰性B細胞性悪性リンパ腫に特徴的な病態の変化を調べるステップ、
   を含む方法。