CN105925609B - 带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法 - Google Patents

带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种带有标记基因的Tet‑on诱导过表达的重组载体及构建方法，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了成本低而高效的载体系统及其相应的转基因方法来建立转基因细胞系，并通过可控诱导目的外源基因过表达来观察该基因在多能干细胞向造血分化过程中可能发挥的效应和功能。本发明中的载体也能够很好的应用于其他细胞或模式动物的转基因操作，以简化遗传研究的方法。

Description

带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及制备方法。
背景技术
现有的基因过表达载体主要有慢病毒载体，还原病毒载体，类腺病毒载体，转座子载体和非整合质粒等。从建立稳定转基因细胞系的角度来看，整合载体是最适合于转基因方法研究基因功能的。目前最有效的整合载体是慢病毒载体和转座子载体PiggyBac。
慢病毒载体最大的优点是侵染效率和整合效率高，足够高的滴度条件下几乎可以使全部目标细胞受到转染，包括一些很难转染的细胞型。但它的缺点也是很明显：
(1)首先它有物种特异性，受制于受体特异性，一般而言只能转染人类细胞；即使经过基因改造，其应用的范围一般也不超过哺乳动物，应用面有限；
(2)载体本身体积太大而载体容量小，不能满足很多分子遗传学操作的需要；
(3)包装困难且花费高昂，往往针对特定基因的包装十分艰难甚至不可能，导致研究方法的不可预见性，这是慢病毒载体的一个致命弱点；
(5)慢病毒载体整合到基因组以后很容易被基因沉默，其基因表达强度和持续性往往较弱并且只在少数细胞群中有表达。
基于转座子原理的载体系统，包括PiggyBac，Sleeping Beauty等等，其中效率最高的是PiggyBac载体。以SBI公司生产的PB系列载体为例，作为基于PiggyBac的表达载体，具有如下的显著优点：
(1)没有物种和细胞型的限制，可以转染几乎所有的模式生物和细胞类型；
(2)可以用脂质体、磷酸钙沉淀法或电转化方法转化各种细胞，也可以注射受精卵，一般转染效率都很高；
(3)无需包装步骤，省时省力，而且几乎可以成功表达各种类型序列的表达框，基本没有序列特异性的问题，最大程度降低了研究进度的不可预见性，比慢病毒系统大大节省了时间，精力和花费；
(4)由于PB系列载体都含有特定的隔离子(insulator)保护，表达框不易被失活而且表达持续而稳定，任何时期和任何类型细胞里都可以成功表达；
(5)载体容积很大，插入片段可以达到14kb以上，可以满足目前绝大多数分子遗传学研究的需要，也为后续衍生载体的开发提供了巨大空间；
(6)载体体积相对较小，易于分子克隆操作，载体的重组变异可能性要小于病毒载体。
(7)该系统配套的转座酶表达载体经过人源化改造，是目前重组效率最高的PiggyBac转座酶，配套使用整合效率很高。
但它的缺点在于该载体没有现成的适合我们需要的商品化Tet-on诱导表达系统，重新改造载体工作量又相当大；
本发明中的造血分化研究是从人类多能干细胞(hPSC)开始向造血分化的，由于该类细胞具有极其强烈的对于外源基因和载体表达的沉默特性，成为最难构建转基因细胞系的细胞种类。同时hPSC对慢病毒的转导非常抗拒和敏感，极易导致基因沉默和细胞死亡以及分化，难以有效应用已经极为成熟的慢病毒体系来实现基因的功能研究。而从hPSC向造血分化过程中，会出现很多种细胞型，需要在各个不同的细胞型和发育时期实现基因的高效持续过表达，这些都对载体系统提出了极为苛刻的要求。为了实现我们的实验目的，并创造出兼具各自优点的载体系统，必须对其进行彻底的改造，来实现与满足在研究中的需要。
发明内容
本发明所要解决的问题在于克服上述不足之处，提供一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法。
解决以上技术问题的一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的PiggyBac重组载体，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述重组载体包括源于pTRIPZ的Tet-on顺式表达元件和反式表达元件，以实现成功的诱导过表达；所述载体还包含源于PB513B-1的PiggyBac载体骨架、标记基因GFP及T2A序列，以实现高效的基因整合和方便分子克隆。
所述Tet-on顺式表达元件包括TRE调控区域和CMV mini Promoter序列。
所述Tet-on反式表达元件包括hUbC启动子、tTA3CDS、内部核糖体插入位点(IRES)元件、嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因以及猴空泡病毒(SV 40)PolyA。
所述PiggyBac载体骨架包括边界与整合元件、隔离子、细菌克隆抗性筛选基因和复制原点，等。
本发明中构建具有带有标记基因的成熟的Tet-on诱导过表达的重组载体，并利用PiggyBac载体骨架将其插入人类多能干细胞的基因组，构建能够持续高效而无渗漏性的外源基因诱导表达转基因细胞系。
本发明中一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤一：设计5’引物GFP-5’-XhoI和3’引物T2A-3’-SwaI，以PB513B-1载体为模板，PCR扩增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI双酶切后切胶回收；pTRIPZ的一个衍生载体pHBTetOE-puro-Gata1，也经过XhoI和MluI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成pHBTetOE-GFP-T2A-C载体；
步骤二：设计5’引物Tet-on-5’-PB-LVX和3’引物Tet-on-3’-PB以pHBTetOE-GFP-T2A-C载体为模板，PCR扩增出2.7kb长的Tet-on相关元件，3’用T4PNK磷酸化，5’引入XbaI位点，XbaI酶切后切胶纯化；PB513B-1经过SpeI和HpaI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成PB-Tet-on-OE载体。
所述步骤一中，引物为：
5’引物GFP-5’-XhoI：
5’TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3’；
3’引物T2A-3’-SwaI：
5’TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTAAATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3’。
所述步骤二中，引物为：
5’引物Tet-on-5’-PB-LVX：5’CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3’；
3’引物Tet-on-3’-PB：5’ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3’。
所述步骤一中，扩增程序为：98℃预变性1min，98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃10min，4℃保存。
所述步骤二中，扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性15s,60℃退火30s,68℃延伸5min,32个循环后72℃ 10min，4℃保存。
本发明中还有根据重组载体而得的基于人类RUNX1b基因诱导过表达载体PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b。
本发明所述载体在构建能诱导过表达RUNX1b的人类多能干细胞系以及该基因功能研究中的应用。
本发明的有益效果为：
该载体的优点在于：
(1)保持了pTRIPZ绝大多数Tet-on顺反式元件，因此也就继承了其主要的优点，能够在几乎所有生物和细胞型中正常表达并避免渗漏表达。同时避免了慢病毒载体的很多缺点，如容易沉默，物种和细胞型限制，以及转导病毒可能带来的细胞毒性和免疫反应。
(2)保持了PiggyBac载体，特别是PB513B-1的基因组整合特性，包括经过改进的整合序列和人源化转座酶，整合效率高，且可以用多种转染方法进行转基因操作。
(3)增大了Tet-on系统插入片段的范围，即使是很大基因片段的插入，也不影响载体的转染、整合和正常过表达；而同样的操作在pTRIPZ衍生载体中会使载体长度超过病毒包装的极限，导致包装效率极低甚至不能包装。利用PiggyBac载体骨架使得这个载体具有很大的改造潜力，日后可以在这个载体上插入更多的元件，具有更多的功能。
(4)从PB513B-1引入隔离子元件(Insulator)保护Tet-on元件在插入任何物种或细胞型的基因组的任何部位或者在细胞不同发育阶段都能正常过表达，大大提高了过表达的效率和载体的有效作用时空点。
(5)该载体不仅可以在人类多能干细胞中有效使用，也能很好的应用于其他任何生物体或不同的细胞系，其可移植性非常出色。构建一个成功的载体，就能迅速应用于其他的模式生物或细胞系的转基因操作，可以大大加速基因功能的研究进程。
(6)由于引进了一个与目的基因共表达但又独自定位的GFP基因(greenfluorescence protein)，使得在不影响目的基因功能定位的前提下，提供了一个监测其时空表达的精确方式，使研究者能够用流式分析技术和其他免疫荧光技术准确分析和追踪目的基因正常表达的细胞，使其生物学效应不被其他未整合或基因沉默的细胞所淹没。这是目前绝大多数PiggyBac类型载体系统中所没有的，特别适合于沉默效应明显的研究系统中。
本发明构建了成本低而高效的载体系统及其相应的转基因方法来建立转基因细胞系，并通过可控诱导目的外源基因过表达来观察该基因在多能干细胞向造血分化过程中可能发挥的效应和功能。本发明中的重组载体也能够很好的应用于其他细胞型或模式动物的转基因操作，以简化遗传研究的方法。
Tet-on过表达载体的优点：
只需1μg/ml多西环素(Doxycycline)即可进行强度很高的过表达，表达时间也很持久，而如此低浓度的诱导剂对于宿主细胞的毒性很低，减低了研究的背景，也利于迅速打开和关闭目的基因的过表达，有利于研究精度的提高；
没有添加Doxycycline时无渗漏型表达，属于严谨控制的诱导表达体系，有助于减少对宿主细胞的毒性和降低表达背景，提高研究的精度和可信度；
目标基因的启动子是CMV，反式激活因子的启动子是pUbC，都没有物种和细胞型的表达特异性，适应面很广。
由于顺式表达元件和反式调控元件都在一个载体上，单个载体发生整合即能使Tet-on系统有效运作，大大提高了获得良好转基因细胞系和成功诱导表达的机率。
本发明不仅适合于在转基因多能干细胞向造血分化过程研究中，也试用其他细胞及动物模型的相关转基因和诱导过表达研究。
附图说明
图1为本发明中的带有GFP标记基因的成熟Tet-on诱导过表达系统PB-Tet-on-OE的质粒示意图。
图2-1，2-2为转染了PB-Tet-on-OE和PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b的人类多能干细胞(H1)进行诱导表达的荧光图
图3为本发明中qPCR法鉴定过表达水平结果图
图4-1为本发明中Western Blot法在蛋白水平鉴定过表达结果图，图4-1中(A为Runx1特异性抗体检测的Western Blot结果，B为GAPDH特异性抗体检测的Western Blot结果，A1,B1为DOX未诱导的PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b hESC总蛋白抽提样品，A2,B2为DOX诱导过表达的PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b hESC总蛋白抽提样品，C,PageRuler预染蛋白Ladder，DOX诱导过表达样品检测到一个52.8kd的主带，与人类RUNX1b蛋白的分子量吻合；还有一个79.8kd的次带，是未被蛋白酶切开的人类Runx1b蛋白与GFP蛋白连接在一起的全长肽段)
图4-2中A图为GFP特异性引物扩增PCR产物检测结果，B图为hRunx1b特异性引物扩增PCR产物检测结果；A1,B1:以PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b hESC genomic DNA为模板，以GFP或hRunx1b特异性引物扩增的PCR产物；A2,B2:以PB-Tet-on-OE hESC genomic DNA为模板，以GFP或hRunx1b特异性引物扩增的PCR产物；A3,以PB-Tet-on-OE质粒DNA为模板，以GFP特异性引物扩增的PCR产物；B3,以PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b质粒DNA为模板，以hRunx1b特异性引物扩增的PCR产物；M1:NEB 1kb ladder，M2:NEB 100bp ladder)
图5-1,5-2为本发明中流式细胞检测结果图
图6-1，6-2为转基因hESC系向三胚层分化的荧光检测图
图7-1，7-2为转基因hESC系PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b(编号96)和PB-Tet-on-OE(编号53)多能性的荧光检测图
图8-1到图8-7为转基因hESC系向造血分化过程D4的重要造血分化相关基因qPCR检测图，比较有无hRUNX1b过表达对于这些基因转录水平表达的影响
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述，其中的分子克隆步骤参照《分子克隆实验指南》相关章节进行，试剂盒试剂等相关材料均为市售商品，具体如下：
本发明中以下实施例中所用pTRIPZ及其衍生载体购自汉恒公司，PB513B-1载体购自SBI公司；限制性内切酶及DNA修饰酶购自NEB公司；
hESCs细胞系H1由中国医学科学院实验血液学国家重点实验室于2011年9月提供；mAGM-S3取自小鼠的AGM区，自1998年在本实验室维持并保持稳定高效的造血能力；
其中，试剂：BSA美国Sigma A9418，IMDM培养基美国GIBCO 12440053，DMEM培养基美国Sigma D5796，F12培养液美国GIBCO 21700-075，KSR美国Gibco N10828-028，mTeSR1STEMCELL 05850，Y-27632(ROCK抑制剂)MERCK 688000，改良型α-MEM美国HycloneSH30265.01B，非必需氨基酸(NEAA)美国Gibco07796，β-巯基乙醇Sigma，0.25％Trypsin/EDTA Gibco 25200056，胎牛血清(FBS)Hyclone 0078，bFGF WAKO 060-04543，血管内皮细胞生长因子(VEGF)WAKO 229-01313，L-谷氨酰胺Gibco25030081，青霉素/链霉素Gibco15070063，May-Giemsa染液德国MERCK，台盼蓝(Trypan Blue stain)Gibco公司，抗坏血酸(Ascorbic acid)Sigma公司，转铁蛋白(Transferrin)Sigma公司，Matrigel BD公司；实时荧光定量PCR试剂盒Roche FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)04913914001，逆转录试剂盒Bio-rad iScript TM Cdna Synthesis Kit 170-8891。
实施例1
一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
构建方法，包括如下步骤：
步骤一：设计5’引物GFP-5’-XhoI和3’引物T2A-3’-SwaI，以PB513B-1载体(SBI公司)为模板，PCR扩增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI双酶切后切胶回收；pTRIPZ的一个衍生载体pHBTetOE-puro-Gata1(汉恒公司)，也经过XhoI和MluI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成pHBTetOE-GFP-T2A-C载体；
步骤二：设计5’引物Tet-on-5’-PB-LVX和3’引物Tet-on-3’-PBPCR扩增出2.7kb长的Tet-on相关元件，3’用T4PNK磷酸化，5’引入XbaI位点，XbaI酶切后切胶纯化；PB513B-1经过SpeI和HpaI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成PB-Tet-on-OE载体。
所述步骤一中，引物为：
5’引物GFP-5’-XhoI：5’TTTCCCCTCGAGCCAC CATGGAGAGCGACG 3’；3’引物T2A-3’-SwaI：5’TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTAAATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3’。
所述步骤一中，扩增程序为：98℃预变性1min，98℃变性10s，58℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃10min，4℃保存。
步骤一中反应体系如下表1：
表1
5×Phusion HF Buffer 10
10mM dNTPs 1
DMSO 1.5
Phusion DNA Polymerase 0.5
Nuclease-free water 28
10uM FM269 2.5
10uM FM270 2.5
46
Template DNA，1ng/ulPB513B-1 4
Total 50
所述步骤二中，引物为：
5’引物Tet-on-5’-PB-LVX：5’CGAGGTTCTAGA CGAGTTTACTCCC 3’；3’引物Tet-on-3’-PB：5’ATTGTT CCAGACGCGAACTCAGG 3’。
所述步骤二中，扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性15s，60℃复性30s，68℃延伸5min，32个循环后72℃10min，4℃保存。
步骤二中反应体系如下表2：
表2
10X AccuPrime<sup>TM</sup> PCR Buffer I 5
AccuPrime<sup>TM</sup> Taq High Fidelity 0.2
H20 40.8
Tet-on-5’-PB-LVX，10μM 1
Tet-on-3’-PB，10μM 1
pHBTetOE-GFP-T2A-C，1ng/ul 2
Total 50μl
实施例2
其它内容如实施例1中的内容，本发明中重组载体包括源于pTRIPZ的Tet-on顺式表达元件和反式表达元件，以实现成功的诱导过表达；所述载体还包含源于PiggyBac载体骨架，以实现高效的基因整合和方便分子克隆。
Tet-on顺式表达元件包括TRE调控区域和CMV mini Promotor序列。
Tet-on反式表达元件包括hUbC启动子、tTA3CDS、IRES元件、Puromycin抗性基因以及SV 40PolyA。
PiggyBac载体骨架包括边界与整合元件、隔离子、细菌克隆抗性筛选基因和复制原点，等。
本发明中构建具有带有标记基因的成熟的Tet-on诱导过表达载体，并利用PiggyBac载体骨架将其插入人类多能干细胞的基因组，构建能够持续高效而无渗漏性的外源基因诱导表达转基因细胞系。
试验例：
本发明中的试验例以人类RUNX1b诱导过表达的多能干细胞系为例：
基于人类RUNXb基因诱导过表达载体PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b的构建：
1，如图1所示，该载体以PB-Tet-on-OE质粒为出发质粒。设计引物Runx1a,b-5’-ATG(5’ATGCGTATCCCCGTAGATGCCAG 3’)和Runx1b,c-3’coding(5’TTTAAAGCGGCCGCGAATTCATTAATAGGGCCTCCACACGGCCTCCTC 3’)(该序列不引入多余的氨基酸序列到hRUNX1b)，并以pcDNA3-Runx1b质粒上的人类Runx1b CDS为模板进行PCR扩增反应，获得5’端含有ATG起始密码子和3’端携带有EcoRI酶切位点的人类Runx1b编码区序列(1359bp)。利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物后用T4PNK进行末端磷酸化并用EcoRI酶切，PB-Tet-on-OE质粒进行SwaI和EcoRI双酶切并切胶回收，以T4DNA连接酶连接。将连接后的产物转化感受态细胞DH5α，并进行酶切鉴定与基因序列的测定。
2，基于H1的转基因细胞系PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b及其载体对照PB-Tet-on-OE的建系过程：
(1)转染质粒的制备：将含有质粒PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b和PB-Tet-on-OE的DH5α菌株的冻存菌液在含有Amp的固体LB培养基平皿中划线接种，37℃过夜培养获得单个菌落。挑单个菌落到3ml的Amp-LB液体培养基中37℃280rpm培养8小时后,1/500接种到含有Amp的100ml LB液体培养基中，37℃280rpm过夜培养。利用PureLinkTMHiPure PlasmidMidiprep Kit(Invitrogen,cat:K2100-05)制备质粒，并利用分光光度法测定OD260/280及核酸浓度，-80℃保存备用。
(2)人类多能干细胞系的细胞培养与传代
本研究中使用的基础细胞系为人类胚胎干细胞系H1，培养条件为商品化的mTeSR1培养基(Stem cell公司)37℃、5％CO2的培养箱中培养。在细胞成长汇合至80％后，以D-PBS洗涤细胞一次，再以专门的商品化酶ReleSR(Stem cell，cat:05872)37℃消化5分钟。再以mTeSR培养基将细胞团吹成适当小片，以1:3的比例分装到Matrigel(Invitrogen,cat:A1413301)打底的培养皿中继续培养。
(3)多能干细胞系的转染和抗性筛选
按1:3的培养面积比接种H1细胞到Matrigel打底的24孔板中并培养1-2天，当hESC克隆达到适当大小时，加入脂质体与质粒的混合物进行转染。具体方法如下：在第一个无菌的0.6ml eppendorf管添加50μl Medium,然后加入0.5μg转座子载体transposon(PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b或PB-Tet-on-OE)与转座子辅助载体transposase(PB200A-1，SBI公司)的混合物,其mol比为1∶3，再加入2μl LP3000TMReagent，混合均匀；在第二个无菌的0.6ml eppendorf管添加50μl Medium,然后加入0.75μl3000Reagent，混合均匀；最后将两个管中的成分迅速混匀后室温孵育5min，然后加入到相应的含有500μl mTeSR1培养基的24孔板的孔中，混合均匀后37℃、5％CO2的培养箱中继续培养2天，其中第二天添加250μl mTeSR1培养基；保留一个孔为不加任何DNA的转染阴性对照。之后吸去上清，添加新鲜的500μl mTeSR1培养基，继续培养2-3天，每天换液；最后换成含有1μg/ml Puromycin的mTeSR1培养基，每天换液，直至所有没有被转染的hESC被杀死而具有Puromycin抗性的克隆长到足够大又不互相融合的时候，挑取5-10个状态最好而较大的克隆到Matrigel打底的96孔板中用含有1μg/ml Puromycin的mTeSR1继续培养。待其生长汇合之后连续传代，从96孔板到48孔板，再到24孔板，最后传到35-mm培养皿中。这之后再用不含Puromycin的mTeSR1培养基继续扩大培养。最后当hESC生长汇合后每35-mm培养皿用ReleSR解离后重悬于含有20％DMSO的mTeSR1培养基中并分装到2个冻存管中，先放到室温的冻存盒(Nelgene,Cryo 1℃freezing Container,cat:5100-0001)中，在-80℃低温冰箱中降温过夜，然后转移到液氮罐中永久保存。
3，转染PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b和PB-Tet-on-OE的H1细胞系的转基因和诱导过表达鉴定：
(1)转基因整合鉴定：培养于35-mm培养皿的转基因H1细胞系用QIAamp BloodMini Kit(Qiagen,cat:51104)提取基因组DNA,然后用Runx1a,b-5’-ATG/Runx1b,c-3’coding以相应基因组DNA为模板进行PCR扩增人类RUNX1b CDS及GFP CDS序列，以1％琼脂糖胶1xTAE电泳系统检测PCR产物大小，证实其符合预期大小。
(2)qPCR进行转录水平的检测
培养于24孔板的转基因细胞中加入1μg/ml Doxycycline以诱导GFP及RUNX1b过表达，10小时及24小时后用倒置荧光显微镜进行观察和拍照(如图2-1，2-2)。用Trizol试剂抽提Doxycycline诱导24小时或未诱导的转基因细胞系总RNA并用iScriptTMcDNASynthesisKit(Bio-Rad,cat:170-8891)逆转录成cDNA,以Runx1b/c-EX7B-F(5’TCTGCAGAACTTTCCAGTCG 3’)和Runx1b/c-EX8-R(5’GTCGGGGAGTAGGTGAAGG 3’)作为检测引物，以GADPH-EX7-F(5’GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3’)和GADPH-EX8-R(5’ACCACCCTGTTGCTGTA GCCAA 3’)作为内参引物，用FastStartUniversal SYBR Green Master kit(Roche,cat:04913850001)在荧光定量PCR仪(Bio-rad Q5)上进行实时荧光定量检测，以确定诱导表达的hRUNX1b含量上升的倍数。
qPCR法鉴定过表达水平结果如图3，PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b(编号为MF96)的hESC在Doxycycline诱导(DOX+)或不诱导(DOX-)条件下RUNX1b表达的转录水平比较，前者是后者的大约37倍。
(3)Western Blot进行蛋白水平的检测
在培养于35-mm培养皿的转基因多能干细胞中加入1μg/ml Doxycycline以诱导hRUNX1b过表达，然后用0.5mM EDTA将其消化成单细胞并重悬于D-PBS,离心沉淀以后用500μl RIPA(含有1mM PMSF和Roche的1x蛋白酶抑制剂)重悬，冰浴30min并震荡促使其裂解，最后12000x g 4℃5min沉淀不溶组分，上清按50μl分装并冻存于-80C。用BCA法与标准蛋白进行比较蛋白样品浓度，并以此为根据调整上样样品的蛋白总量一致。用标准SDS-PAGE(10％分离胶/5％浓缩胶)在Tis-甘氨酸缓冲电泳体系中分离蛋白样品，然后转至PVGF膜上，用鼠抗人Runx1一抗(DW71,sc-101146,Santa cruz公司)或鼠抗人GAPDH一抗(内参对照，KC-5G4,KangChen公司)结合目标，然后用Goat Anti-Mouse IgGH&L(HRP)preadsorbed二抗(ab97040，Abcom公司)结合一抗，最后用AmershamTMECLTMPrime蛋白印迹试剂(RPN2232，GEHealthcare)显色，用ImageQuant LAS 4000mini拍照记录结果(如图4-1，图4-2)。
DOX诱导过表达样品检测到一个52.8kd的主带，与人类Runx1b蛋白的分子量吻合；还有一个79.8kd的次带，应该是未被蛋白酶切开的人类Runx1b蛋白与GFP蛋白连接在一起的全长肽段，而对照未诱导样品没有明显条带。
4，转染PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b和PB-Tet-on-OE的H1细胞系的多能性和向三胚层分化能力鉴定
(1)转基因多能干细胞系的多能性检测
转基因人类多能干细胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b的克隆细胞团在0.1％Triton X-100通透后,分别与相应的人类多能干细胞特征性抗体(SSEA4、TRA-1、Oct4和Nanog一抗)结合，再与相应的带Cy3或FITC荧光标记的二抗结合，最后用核DNA染料DAPI染色，在荧光显微镜下进行荧光检测，如图7-1，7-2。
检测结果说明以上两个细胞系都具有正常的人类多能干细胞特征性基因表达，可以进一步用于向造血分化的研究。
(2)转基因多能干细胞系向三胚层分化能力的检测
转基因人类多能干细胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b的克隆细胞团在Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit(C027,R&DSystems公司)的诱导下分别向内胚层，中胚层和外胚层分化。在Triton X-100通透后,分别与相应的特征抗体(SOX17,Brachyury和OTX2一抗)结合，再与相应的带Cy3荧光标记的二抗结合，最后用核DNA染料DAPI染色，在荧光显微镜下进行荧光检测，如图6-1，6-2。
检测结果说明以上两个细胞系都具有正常的向三胚层分化的能力，可以进一步用于向造血分化的研究。
5，共培养系统检测hRUNX1b过表达对于人类多能干细胞向造血分化过程的效应。
(1)转基因hESCs(PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b和PB-Tet-on-OE)维持未分化培养采用无基质细胞培养方法，根据以上描述的方法进行培养和传代；
(2)mAGM-S3基质细胞的准备
复苏液氮冻存的mAGM-S3细胞株于明胶包被的100mm培养皿中，培养基为含有5％胎牛血清的MEM ALPHA MOD(SH30265.01，Hyclone公司)，37℃，5％CO2培养至细胞完全汇合之后，用0.05％胰酶消化重悬，用冰的D-PBS和培养基终止消化，传代至明胶包被的12孔板中，轻柔摇匀，37℃5％CO2培养1-2天。当细胞融合度不低于90％时(约2×105细胞/孔)，13Gray X射线辐照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用。
(3)hESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞并诱导hRUNX1b过表达
用200μL枪头枪尖在显微镜下将转基因hESCs未分化集落划分成0.5-1×103细胞的小集落片，以35个集落/12孔板每孔(约2×105hESCs/孔)的密度接种集落于辐照过的mAGM-S3细胞上，加1.5ml hESCs未分化细胞维持液，轻柔摇匀，37℃5％CO2培养3天，然后换成造血诱导分化液(IMDM 515ml,去补体化FBS 60ml(终浓度10％)，NEAA 5mL，L-谷氨酰胺10ml，50mg/ml AA 600μl,转铁蛋白40μl,VEGF 10μg,2-ME 5μl)再培养14天(从这一天开始计算开关以后的天数，记为DX)，并从D0开始加或不加Doxycycline来比较有无hRUNX1b过表达对于造血分化的影响，每天换液(D6以后根据细胞培养情况可一天换液2次)，至D14将产生大量造血干/祖细胞，收集细胞备用。
(4)流式分析
共培养开关后14天(D14)的共培养细胞用D-PBS洗涤2遍，用枪头刺破造血克隆后用0.25％Trypsin/EDTA 37℃处理5-7min，冰D-PBS及含血清培养液终止胰酶作用，用1ml枪头反复吹打直至无大细胞团块凝集，收集到离心管中，1300rpm室温离心5min，弃上清，重悬于SM buffer(含有2％FBS的D-PBS)，70μm滤膜过滤。大约每0.5ml加入普通兔血清5-10ul混匀，置于冰上封闭20分钟，阻断抗体抗原非特异性结合位点，再加入特异性抗体(CD34-APC、CD45-PE各3μl)，震荡混匀，冰上避光反应20-30min，1ml SM buffer洗涤1次，400xg室温离心5min，弃上清，SM buffer液200μl重悬于流式上样管中，用BD CantoII流式细胞仪进行检测，实验数据使用Flowjo10软件进行分析。
分别针对GFP+和GFP-两个亚群进行CD34+/CD45+细胞群统计分析，发现对于DOX诱导过表达的PB-Tet-on-OE而言，GFP+和GFP-两个亚群中CD34+/CD45+是接近的；但在DOX诱导过表达的PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b hES cell line中，CD34+/CD45+细胞群的含量在GFP-中比GFP+要高出10倍以上。由于人类Runx1b基因和GFP是共表达的，以上检测结果很清楚的表明Runx1b的过表达对于CD34+/CD45+细胞群的产生具有强烈的抑制作用。(如图5-1，图5-2)
(5)qPCR分析造血分化早期hRUNX1B过表达对于造血分化相关基因表达的影响(如图8-1到图8-7)
A,总RNA抽提
用以上的方法来培养和获得PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b和PB-Tet-on-OE开关后D4的共培养细胞，400x g室温离心5min，弃上清，采用Trizol提取总RNA，冻存于-80℃储存，实时荧光定量PCR方法检测目标基因的表达；
B,逆转录cDNA
逆转录20μL反应体系：
反应程序：25℃5min；42℃30min；85℃5min；4℃保存。获得的cDNA样本分装后-80℃储存；
C,qPCR分析
以FastStart Universal SYBR Green Master kit(cat:04913850001,Roche)进行如下分析反应体系(15μl)
GAPDH(管家基因)引物序列：
GADPH-EX7-F 5’GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3’
GADPH-EX8-R 5’ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3’
Gata1引物序列：
Gata1-Ex5-F 5’CACGACACTGTGGCGGAGAAAT 3’
Gata1-Ex6-R 5’TTCCAGATGCCTTGCGGTTTCG 3’
GATA3引物序列：
GATA3-EXN1-F 5’GCGAGACAGAGCGAGCAA 3’
GATA-3-EXN2-R 5’ACTGGGTACGGCAGAATAAAA 3’
LMO2引物序列：
LMO2-EX2-F 5’GCGCCTCTACTACAAACTGGGC 3’
LMO2-EX3-R 5’CTCATAGGCACGAATCCGCTTG 3’
PCDH12引物序列：
PCDH12-EX3-F 5’GACCTCTCTGTGAAGCAACTGC 3’
PCDH12-EX4-R 5’CACATTGTCACGGTAGTTGGTGG 3’
Runx1a引物序列：
Runx1a-Ex6-F 5’ACAGCCATGAGGGTCAGC 3’
Runx1a-Ex7A-R 5’ATCTCCAGGGTGCTGTGTCT 3’
SPI1引物序列：
SPI1-EX2-F 5’GACACGGATCTATACCAACGCC 3’
SPI1-EX3-R 5’CCGTGAAGTTGTTCTCGGCGAA 3’
vWF引物序列：
vWF-EX27-F 5’CCTTGAATCCCAGTGACCCTGA 3’
vWF-EX28-R 5’GGTTCCGAGATGTCCTCCACAT 3’
如图8-1到图8-7结果显示，包括GATA1,GATA3,LMO2,PCDH12(VE-CAD),RUNX1a(Runx1的另一种重要剪切体)，SPI1，vWF等造血相关重要基因，相比PB-Tet-on-OE(编号MF53)，在PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx1b(编号MF96)过表达的D4共培养细胞中被大幅下调，这可能是其向造血分化被抑制的直接原因。
以下试验例中主要溶液的配制如下：
(1)人源化ESC培养基配制
mTeSRTM1Basal Medium 400mL
mTeSRTM1 5X Supplement 100mL
共500ml，混匀，置于4℃冰箱备用。
(2)AGM培养液配制
α-MEM 500mL
FBS(去补体化) 25mL
共525ml，混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
(3)hESC未分化细胞维持液配制
共630ml，混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
(4)造血诱导分化液配制
共590ml，混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：
设计5’引物GFP-5’-XhoI和3’引物T2A-3’-SwaI，以PB513B-1载体为模板，PCR扩增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI双酶切后切胶回收；pTRIPZ的一个衍生载体pHBTetOE-puro-Gata1，也经过XhoI和MluI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以 T4 DNA 连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞 DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成pHBTetOE-GFP-T2A-C载体；其中，引物序列为：
5’引物 GFP-5’-XhoI：
5’ TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3’；
3’引物 T2A-3’-SwaI ：
5’ TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTAAATGGGCCGGGATTCTCCTC CA 3’；
步骤二：
设计5’引物Tet-on-5’-PB-LVX和3’引物Tet-on-3’-PB以pHBTetOE-GFP-T2A-C载体为模板， PCR扩增出2.7kb长的Tet-on相关元件，3’用T4 PNK磷酸化，5’引入XbaI位点，XbaI酶切后切胶纯化；PB513B-1经过SpeI和HpaI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成PB-Tet-on-OE载体；其中引物序列为：
5’引物Tet-on-5’-PB-LVX：5’ CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3’；3’引物Tet-on-3’-PB：5’ ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3’。
2. 根据权利要求1所述的一种带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，扩增程序为：98℃ 预变性1min，98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃ 10min，4℃保存；
所述步骤二中，扩增程序为：94ºC预变性1min; 94ºC 变性15s, 60ºC 退火30s,68ºC延伸5 min, 32个循环后72ºC 10 min，4℃保存。
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