CN111996214A

CN111996214A - 一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用

Info

Publication number: CN111996214A
Application number: CN202010742701.8A
Authority: CN
Inventors: 王永煜; 权颖怡
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2020-11-27

Abstract

本发明公开了一种构建人多能干细胞中可诱导高效表达的基因体系，具体是基于PiggyBac转座子系统，在体外快速通过无缝克隆的方式构建含外源基因的PiggyBac转座子质粒，并通过与含转座酶基因的PB200PA质粒共转染人多能干细胞，建立起可以通过DOX诱导高效表达外源基因的人多能干细胞模型，该方法简单快捷，构建所得的基因体系稳定，且可在人多能干细胞中高效表达特定外源基因，并能实现在特定时间诱导外源基因过表达，可以广泛应用于多能干细胞的相关基因研究中。

Description

一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用

技术领域

本发明涉及表达基因体系的建立技术，具体是涉及一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用。

背景技术

人多能干细胞具有强大的自我更新、自我复制能力，并且可以分化成体内所有的细胞，形成人体内所有组织和器官。在体外进行人多能干细胞的培养为器官再生、修复和疾病治疗方面的研究提供了强大的推动力。在对增殖、分化、迁移调控相关影响因素的基础研究，细胞移植及基因载体治疗的临床研究及移植治疗疾病过程中的机制研究等方面具有巨大的应用前景。

近些年来，由于种属差异，动物模型与人类在生理、病理情况下存在很大差异，很多研究结果不能应用于人类。尤其是在基础研究领域，损伤修复及移植治疗疾病过程研究中，对于细胞外基质相关蛋白、细胞生长因子、信号传导通路等对细胞多能性、增殖、分化、迁移及移植治疗中影响多向分化潜能的细胞因子及相关基因的机制仍不清楚。因此，如何在体外建立高效表达外源性基因的人多能干细胞的方法对于研究以上问题具有重要作用。

目前对于过表达基因的人多能干细胞的建立主要采用慢病毒载体系统使外源性基因整合到宿主基因组中，但由于人多能干细胞自身的特性使得对于病毒载体启动子的要求极为苛刻及对病毒浓度、纯度的高要求和通过电转体系建立过表达的人多能干细胞系由于其对电转体系的高要求及电穿孔造成的细胞较高死亡率使得外源性基因表达受到限制，因此探索新的方法快速、高效地实现外源性基因的表达具有重要的意义。

PiggyBac转座子系统具有转座效率高、删除精确、半随机插入和携带片段较大等优点。但是作为一种转基因实验的工具，特别是在哺乳动物个体水平的转基因方面，还存在转基因效率待提高、外源基因随机插入对内源基因破坏的风险待降低等问题待解决。

发明内容

本发明的目的是克服现有多能干细胞中过表达外源基因效率低等技术的不足，提供一种构建人多能干细胞中可诱导高效表达的基因体系，该方法简单快捷，构建所得的基因体系具有以下优点：体系稳定；可在人多能干细胞中高效表达特定外源基因；可在特定时间诱导外源基因过表达等。基于该体系的构建方法可以阐明该基因在干细胞中相关功能及调节机制。

本发明的具体方案如下：

一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，包括以下步骤：

步骤一：使用无缝克隆的方式构建TRE6P-P2A-EGFP质粒；

步骤二：构建含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒；

步骤三：使用所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒和含转座基因酶的PB200PA质粒共转染人多能干细胞；

步骤四：建立表达所述外源基因的稳定细胞株。

进一步的，使用强力霉素(记作DOX)诱导所述外源基因的表达。

优选的，所述强力霉素的浓度为1～2ug/ml，诱导时间为20～30小时。

优选的，所述TRE6P-P2A-EGFP质粒的构建具体包括以下步骤：

步骤一：设计P2A-EGFP特异性无缝克隆引物：包括P2A-EGFP正向引物(如SEQ ID:1所示)和P2A-EGFP反向引物(如SEQ ID:2所示)，进行PCR扩增，得到P2A-EGFP片段；

步骤二：对PB-TRE6P质粒进行酶切、跑胶、纯化；

步骤三：将所述P2A-EGFP片段插入所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒中，再经筛选获得所述TRE6P-P2A-EGFP质粒。

优选的，所述P2A-EGFP片段的插入位置为所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒的TRE3G启动子和3Xflag序列中间。

优选的，所述转染过程包括以下步骤：

步骤一：将所述人多能干细胞培养到密度为3.5～4.5x10⁵个细胞/35mm培养皿，更换干细胞培养液；

步骤二：将所述人多能干细胞滴入含有所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的脂质体转染培养液中；

步骤三：每天更换所述脂质体转染培养液，得到转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞。

优选的，所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的质量比为(4～7):1。

优选的，所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的脂质体转染培养液的具体制备方法为：将所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒加入到培养液中，随后将所述培养液稀释80～120倍，再转移到含有脂质体转染试剂的培养液中混匀、静置。

进一步的，将所述转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞培养到密度为8.5～9.5x10⁵个细胞/35mm培养皿，使用嘌呤霉素处理细胞，经传代筛选获得所述稳定细胞株。

优选的，所述嘌呤霉素的浓度为0.5～1ug/ml，并传代筛选2～4代。

其中：

所述PB-TRE6P质粒的描述详见附图1；

所述P2A-EGFP特异性无缝克隆引物是根据P2A-EGFP基因的CDS序列和所述质粒PB-TRE6P的MCS位点设计而来，其中，P2A-EGFP正向引物含酶切位点：Hind III、BamH I、EcoR I；P2A-EGFP反向引物含有酶切位点Sal I。

PB200PA质粒的图谱详见附图4。

本发明的有益效果为：

本发明基于PiggyBac转座子系统，在体外快速通过无缝克隆的方式构建含外源基因的PiggyBac转座子质粒，并通过与含转座酶基因的PB200PA质粒共转染人多能干细胞，建立起可以通过DOX诱导高效表达外源基因的人多能干细胞模型，可以广泛应用于多能干细胞的相关基因研究中。

目前对于过表达基因的人多能干细胞的建立主要采用慢病毒载体系统使外源性基因整合到宿主基因组中，但由于人多能干细胞自身的一些特性，使得对于病毒载体启动子的要求极为苛刻，对病毒浓度和纯度的要求也很高。比如，人多能干细胞本身具有强大的复制能力和多潜能性，前者赋予了细胞强大的增殖能力，这使得研究者不得不面临这样的挑战：如何保证细胞在培养过程中的稳定性；后者的多潜能性，可以允许细胞向不同方向分化，从而得到多种终末细胞产品，但同时也会在应用过程中导致畸胎瘤或其他的危险。此外，通过电转体系建立过表达的人多能干细胞系对电转体系的高要求及电穿孔造成细胞的较高死亡率也使得外源性基因表达受到限制。而采用本发明的方法的进步之处主要有：

通过本发明的方法建立的过表达的人多能干细胞系弥补了上述两种方法的不足，只需通过普通的转染试剂进行转染质粒就可以得到稳定的基因表达体系。本发明使用两种表达载体：PiggyBac转座子和含转座基因酶的PB200PA表达载体，共转染人多能干细胞。在转座酶的作用下，PiggyBac转座子质粒诱导生成多能干细胞，在细胞外形、基因表达模式和表观遗传等方面均与胚胎干细胞一致。随后在人多能干细胞中再瞬间转染适量转座酶表达载体PB200PA，其表达的转座酶可使转座子表达载体在外源基因插入位点处发生无缝切除，从而获得更安全的无转录因子、无载体的可诱导高效表达基因的人多能干细胞。与病毒载体相比，本发明提供的技术方案具有安全性高、操作方便、成本更低等优点；与电转体系相比，细胞的存活率和增殖效率更高。同时，PiggyBac转座子具有转座率高和可携带基因片段较大的优点，通过本发明的方法建立的细胞系，能够实现外源性基因的高效表达。

进一步地优化，本发明针对细胞在分化后可能会发生转基因沉默这个问题，通过调节PiggyBac转座子和含转座基因酶的比例来控制基因的表达过程。具体到本发明的体系中，经优化后，最终得到的优化比例为：含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与PB200PA质粒的重量比为(4～7):1，高于这个比例的转座酶可能会导致过多的基因插入基因组并导致转基因泄漏，而低于这个比例的转座酶则无法解决上述的转基因沉默问题，或者基因表达过弱，无法有效解决上述的转基因沉默问题。而在本发明的优化比例下，可有助于避免人多能干细胞分化后代中的转基因沉默现象，克服由于人多能干细胞系无限传代而引起的外源性基因表达减弱的缺陷，使细胞外源性基因实现高效表达。

此外，细胞密度和抗生素浓度对于有效转染、筛选获得稳定的细胞株至关重要。转染前的细胞浓度控制在较低水平，具体到本发明的实施例中，转染前培养人多能干细胞的细胞密度培养到3.5-4.5x10⁵个细胞/35mm培养皿。研究中发现，细胞密度过高容易形成细胞团聚现象，这对于转染效率的负面影响较大，也会导致较高的细胞死亡率。在本发明的细胞密度下进行转染，有助于提高转染效率。完成转染后，再以较高的细胞密度(本发明中的细胞密度为8.5-9.5x10⁵个细胞/35mm培养皿)，配合嘌呤霉素处理细胞，以提高细胞的存活率，经2～4代筛选获得稳定细胞株。其中，不同种类的细胞具有不同的生长特性，对嘌呤霉素的敏感性也不同，本发明中，经滴定测试确定的合适的嘌呤霉素的浓度为0.5～1ug/ml。

进一步地优化，同时也是作为本发明的另一个创新点，利用本发明的方法建立的过表达的人多能干细胞系与其他方法最大的进步还体现在：可实现对外源基因表达的可控调节。在应用中，可以根据不同的研究目的在特定的时间通过添加(或撤除)DOX来诱导(或沉默)外源基因的过表达，从而使外源性基因的表达受人为控制。其中，基于具体的体系，需要对DOX的浓度做相应的优化，具体到本发明，优化的DOX的使用浓度为1～2ug/ml，若低于该浓度范围，则会导致诱导基因表达无效的问题，而高于该浓度范围则对细胞产生毒害作用。因此，在整体上，基于PiggyBac转座子系统将外源基因导入，再配合对DOX使用时机、浓度和诱导时间的控制，可以进一步实现诱导外源基因的持续性、高效、可控的表达，

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明。

图1为PB-TRE6P质粒图谱；

图2为PiggyBac转座子载体PB-TRE6P-P2A-EGFP质粒图谱；

图3为PiggyBac转座子载体PB-TRE6P-VGLL4-P2A-EGFP质粒图谱；

图4为PiggyBac转座酶PB200PA质粒图谱；

图5为稳定过表达VGLL4基因的人胚胎干细胞H1ESC细胞，其中，DOX-:未加DOX的形态及荧光图；DOX+:加DOX诱导过表达；DOX+/-：DOX诱导过表达后，撤去DOX第4天；

图6为稳定过表达VGLL4基因的人胚胎干细胞H1ESC细胞及诱导表达和去诱导表达后VGLL4蛋白、多能性基因SOX2、OCT4蛋白的变化。其中，DOX-:未加DOX；DOX+:加DOX诱导过表达；DOX+/-：DOX诱导过表达后，撤去DOX第4天；图6-a：VGLL4蛋白变化；图6-b：多能性基因SOX2蛋白变化；图6-c：OCT4蛋白变化；

图7为稳定过表达VGLL4基因的人胚胎干细胞H1ESC细胞及诱导表达和去诱导表达后VGLL4mRNA变化、多能性基因SOX2、OCT4、NANOG mRNA变化。其中，DOX-:未加DOX；DOX+:加DOX诱导过表达；图7-a：VGLL4mRNA变化；图7-b：多能性基因SOX2mRNA变化；图7-c：OCT4mRNA变；图7-d：NANOG mRNA变化。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1：

在人胚胎干细胞中诱导高效表达人VGLL4基因。

(1)PB-TRE6P-P2A-EGFP载体质粒的构建：

步骤一：根据P2A-EGFP基因CDS序列和质粒PB-TRE6P的MCS位点设计P2A-EGFP特异性无缝克隆引物。P2A-EGFP正向引物的序列如SEQ ID:1所示，其含酶切位点：Hind III、BamH I、EcoR I；P2A-EGFP反向引物的序列如SEQ ID:2所示，其含有酶切位点Sal I。

步骤二：PCR扩增。

使用聚合酶Phusion^TMHigh-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher，Cat#F530S)对P2A-EGFP基因进行PCR扩增，扩增反应体系为50ul，反应结束后取10ul PCR产物进行纯化，得到P2A-EGFP基因片段。

步骤三：通过常规分子克隆方法进行DNA片段的酶切与连接。

用BamH I、Sal I酶对PB-TRE6P质粒在37℃进行酶切，时间为6小时；之后将酶切后的PB-TRE6P载体片段进行纯化，与上述经过PCR扩增、纯化的P2A-EGFP基因片段在50℃进行同源重组，时间为30分钟，其反应体系如下：4×Buffer+PCR后的P2A-EGFP+酶切后的PB-TRE6P。

接下来，将20ul同源重组反应体系液全部加入到200ul DH5α感受态细胞中，置冰上1小时；随后在42℃下热激90秒钟，随后再迅速置冰中5分钟；再加入600ul经37℃预热的LB培养液，于220rpm条件下离心1小时，离心后全部涂布于含100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，挑取单克隆菌落进行测序，确认PiggyBac转座子载体TRE6P-P2A-EGFP质粒是否构建成功，结果参见附图2，对改造后的TRE6P-P2A-EGFP质粒反向测序结果如SEQ ID:5所示，正向测序结果如SEQ ID:6所示，可见已成功构建得所述的TRE6P-P2A-EGFP质粒。

(2)PB-TRE6P-VGLL4-P2A-EGFP质粒的构建：

根据VGLL4质粒的CDS序列和TRE6P-P2A-EGFP载体的MCS位点设计VGLL4特异性无缝克隆引物。其中，VGLL4正向引物的序列如SEQ ID:3所示，其含酶切位点：Hind III；VGLL4反向引物的序列如SEQ ID:4所示，其含酶切位点：EcoR I。

使用聚合酶Phusion^TMHigh-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher，Cat#F530S)对VGLL4基因进行PCR扩增，扩增反应体系为50ul，反应结束后取10ul PCR产物进行纯化，得到VGLL4基因片段。

之后，通过常规分子克隆方法进行DNA的酶切与连接。用Hind III、EcoR I酶对TRE6P-P2A-EGFP载体37℃、6h酶切，胶回收载体片段后进行纯化，与PCR后的VGLL4基因段50℃、30min进行同源重组，其反应体系如下：4×Buffer+PCR后的VGLL4基因+酶切后的TRE6P-P2A-EGFP。

接下来，将20ul同源重组反应体系反应液全部加入到200ul DH5α感受态细胞中，置冰上1小时，42℃热激90秒钟，迅速置冰中5分钟；加入600ul 37℃预热的LB培养液；37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆菌落进行测序，结果参见图3，测序结果如SEQ ID:7所示，。

(3)TRE6P-VGLL4-P2A-EGFP转染人胚胎干细胞：

6孔板传代后第三天的人胚胎干细胞培养到密度为40％左右，更换新鲜的人胚胎干细胞培养液Nova(中盛溯源，Cat#RP01001)，

将2.5ug TRE6P-P2A-VGLL4-EGFP质粒及0.5ug PB200PA质粒(详见附图4)在250ulOpti-MEM^TM培养液中稀释后转移到含5ul Lipofectamine Stem Transfection Reagent的250ul Opti-MEM^TM培养液中混匀、静止5分钟，随后滴入细胞，之后每天更换Nova培养液。

(4)人胚胎干细胞中诱导外源基因VGLL4的表达：

将转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞培养到密度为90％左右，使用1ug/ml的嘌呤霉素处理细胞，并传代筛选到第4代，获得稳定的细胞株，最后加入2ug/ml DOX诱导外源基因VGLL4表达。

实施例2：

如实施例1所述，在诱导外源基因VGLL4的表达过程中，不添加DOX，使外源基因VGLL4不表达。

在另一实施例中，在DOX诱导过表达后，可以根据需要随时撤除DOX。

在另一实施例中，撤除DOX之后，如需过表达再随时添加DOX诱导外源基因VGLL4表达。

对比例1：

使用未转染人胚胎干细胞作为对照，待细胞长满后使用1ug/ml嘌呤霉素处理细胞，并传代筛选第4代，获得稳定的细胞株，最后加入2ug/ml DOX诱导外源基因VGLL4表达。

诱导过表达24小时后通过荧光倒置显微镜观察EGFP的绿色荧光强度，同时，通过蛋白免疫印迹(WB)及PCR与未加DOX的对照组确认外源基因VGLL4过表达是否成功。结果参见附图5、附图6和附图7，比较未加入DOX诱导、去诱导表达和加入DOX诱导的VGLL4蛋白变化，可以看出，本发明建立的基因表达体系，仅通过简单的转染就能够实现外源性基因的高效表达，且经DOX诱导的过表达基因是未经诱导的10倍以上，且撤除DOX之后，即可控制外源基因不表达。

这一发现具有显著的进步意义。现有的技术方案，一则难以实现在多能干细胞中高效表达外源性基因，二则无法在特定时间过表达某一外源基因，前者限制了生产与应用，后者增加了研究者对“某些基因在干细胞多能性及分化过程中调控机制”研究的难度。因此，通过本发明的方案，既可以提高在人多能干细胞中高效表达特定外源基因的效率，又可以实现人为控制外源性基因的表达进程：即在特定时间诱导外源基因过表达，根据该控制表达机制，在生产应用上，可以实现按需对相应的外源基因进行表达以满足当下的需求；在研究上，研究者可以通设计实验，控制表达进程，有利于阐明该基因在干细胞中相关功能及调节机制，对研究特定基因在干细胞多能性、分化等过程中的作用提供强有力的帮助。

除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系建立及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgtaaagga agcttggtgg atccggtaga tcgggtgaat tcgccaccaa cttcagcctg 60

ct 62

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcatggtct ttgtagtcgt cgaccttgta cagctcgtcc atg 43

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcctaccct cgtaaaggaa gcttgccacc atggagacgc cattggatgt t 51

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggctgaag ttggtggcga attcggagac cacagagggg gagtg 45

<210> 5

<211> 827

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcaatcatc gtctccttgt agtcgatgtc atgatcttta taatcaccgt catggtcttt 60

gtagtcgtcg accttgtaca gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa 120

ctccagcagg accatgtgat cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactgggt 180

gctcaggtag tggttgtcgg gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg 240

gtagtggtcg gcgagctgca cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac 300

cttgatgccg ttcttctgct tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta 360

ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat 420

gcggttcacc agggtgtcgc cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc 480

gtccttgaag aagatggtgc gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa 540

gtcgtgctgc ttcatgtggt cggggtagcg gctgaagcac tgcacgccgt aggtcagggt 600

ggtcacgagg gtgggccagg gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt 660

cagcttgccg taggtggcat cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt 720

tacgtcgccg tccagctcga ccaggatggg caccaccccg gtgaacagct cttcgccctt 780

agacaccatg gggccggggt tctcctccac gtccccggcc tgcttca 827

<210> 6

<211> 817

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtacacca cggcgcattt aacacacttt ccgtcttcta ccaacttttt ccgtaccact 60

ttcccttacc ctccgtaaag gaagcttggt ggatccggta gatcgggtga attcgccacc 120

aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac gtggaggaga accccggccc catggtgtct 180

aagggcgaag agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 240

aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 300

accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 360

accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 420

ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 480

gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 540

atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 600

tacaactact acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 660

gtgaacttca agattccgcc actacatcga ggacggcggc gtgcatttcg ccgaccacta 720

tcagcagaat cactcccctt cggcgacggc cctttttgtt gcccgacaac cactacctga 780

gcatcaattc cgcctcagaa tatgcctcat cagaatt 817

<210> 7

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cactgaccaa gaacagcctg gacgccagca ggccagccgg cctctcgccc acactgaccc 60

cgggggagcg gcagcagaac cggccctccg tgatcacctg tgcctcggct ggcgcccgca 120

actgcaacct ctcgcactgc cccatcgcgc acagcggctg tgccgcgccc gggcctgcca 180

gctaccggag gccaccgagc gctgccacca cctgtgaccc cgtggtggag gagcatttcc 240

gcaggagcct gggcaagaat tacaaggagc ccgagccggc acccaactcc gtgtccatca 300

cgggctccgt ggacgaccac tttgccaaag ctctgggtga cacgtggctc cagatcaaag 360

cggccaagga cggagcatcc agcagccctg agtccgcctc tcgcaggggc cagcccgcca 420

gcccctctgc ccacatggtc agccacagtc actccccctc tgtggtctcc gaattcgcca 480

ccaacttcag cctgctgaag caggccggcg acgtggagga gaaccccggc cccatggtgt 540

ctaaggcgag agctgtcacc ggggtggtgc ccatcctgtc gagctggacg cgacgtaaac 600

ggcacaaggt cagcgtgtcg gcggagggcg gagggcgatg cactaccgca ggctgaccct 660

gagtcaatct gcaccacgca ggcctgcccg tacttgccac ttcgtgacca ccctggacct 720

taacgggcgg tgcaa 735

Claims

1.一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：使用无缝克隆的方式构建TRE6P-P2A-EGFP质粒；

步骤二：构建含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒；

步骤四：建立表达所述外源基因的稳定细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：使用强力霉素诱导所述外源基因的表达。

3.根据权利要求2所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述强力霉素的浓度为1～2ug/ml，诱导时间为20～30小时。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述TRE6P-P2A-EGFP质粒的构建具体包括以下步骤：

步骤二：对PB-TRE6P质粒进行酶切、跑胶、纯化；

5.根据权利要求4所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：

所述P2A-EGFP片段的插入位置为所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒的TRE3G启动子和3Xflag序列中间。

6.根据权利要求5所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述转染过程包括以下步骤：

7.根据权利要求1或6所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：

所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的质量比为(4～7):1。

8.根据权利要求6所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：

所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的脂质体转染培养液的具体制备方法为：将所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒加入到培养液中，随后将所述培养液稀释80～120倍，再转移到含有脂质体转染试剂的培养液中混匀、静置。

9.根据权利要求8所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：

将所述转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞培养到密度为8.5～9.5x10⁵个细胞/35mm培养皿，使用嘌呤霉素处理细胞，经传代筛选获得所述稳定细胞株。

10.根据权利要求9所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述嘌呤霉素的浓度为0.5～1ug/ml，并传代筛选2～4代。