WO2015182941A1 - 신규 카탈라아제 신호서열 및 이를 이용한 카탈라아제 발현방법 - Google Patents

신규 카탈라아제 신호서열 및 이를 이용한 카탈라아제 발현방법 Download PDF

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    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a novel signal sequence and its use for mass expression of catalase, and more particularly to a novel lipase signal sequence; An expression vector comprising the signal sequence and a catalase gene; A recombinant microorganism into which the expression vector is introduced; And it relates to a method for producing a large amount of catalase by culturing the recombinant microorganism.
  • Catalase is an enzyme that promotes the conversion of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) to oxygen (O 2 ) and water (H 2 O). Most catalase enzymes contain four polypeptide subunits, each with a molecular weight of 50,000 to 60,000 and one heme per subunit (Wasserman and Hultin (1981) Arch. Biochem. Biophys . 212: 385-392; Hartig and Ruis (1986) Eur. J. Biochem. 160: 487-490).
  • an expression secretion plasmid vector comprising a promoter, a transcriptional promoter sequence, a DNA encoding a secretory signal sequence, a structural gene of the target protein, and a transcription terminator has been using.
  • the secretory signal sequences currently used to secrete the target protein in Aspergillus niger include its own signal sequence and the Aspergillus niger glucoamylase signal sequence, and the strong promoter is glucoamylase (glaA). There is a promoter.
  • the present inventors have tried to develop a method for mass-producing catalase using genetic engineering methods to overcome the limitation of the expression, when finding a new signal sequence for expressing catalase, and using the signal sequence By confirming that the catalase is expressed in large quantities, the present invention has been completed.
  • An object of the present invention is a novel lipase signal sequence for expressing a large amount of catalase;
  • An expression vector comprising the signal sequence and a catalase gene; It is to provide a recombinant microorganism into which the expression vector is introduced.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a large amount of catalase by culturing the recombinant microorganism.
  • the present invention provides An07g00440 lipase signal sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and modified lipase signal sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a nucleic acid encoding the signal sequence and a gene of the protein of interest, and a recombinant microorganism into which the expression vector is introduced.
  • the present invention also comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to produce the protein of interest; And (b) provides a method for producing a protein of interest comprising the step of recovering the produced protein of interest.
  • A is a schematic diagram detailing each part of the promoter, signal sequence, foreign gene and electron termination code when cDNA of the foreign gene is cloned and inserted
  • B is a schematic diagram of further including An07g00440 lipase signal sequence
  • C is An07g00440 Schematic diagram of further comprising a lipase modified signal sequence.
  • Figure 2 shows the expression vector of Example 1-2.
  • A represents a vector (pASP503) using the glaA promoter and pdcA terminator and can clone a cDNA containing its own signal sequence (BASP503)
  • B represents a vector using the glaA promoter and pdcA terminator and an An07g00440 lipase signal sequence ( pASPW504)
  • C represents a vector (pASPV505) using the glaA promoter and pdcA terminator and containing the An07g00440 lipase modified signal sequence.
  • Figure 3 shows the results of the analysis of recombinant microbial culture medium of Example 5,
  • A is a culture solution analysis of recombinant microorganism pASPF503PMC
  • B is a culture solution analysis of recombinant microorganism pASPW504PMC
  • C is a culture solution analysis of recombinant microorganism pASPV505PMC.
  • a recombinant microorganism into which the expression vector is introduced As a result, it was confirmed that a large amount of catalase could be produced by culturing the prepared recombinant microorganism.
  • the present invention relates to an An07g00440 lipase signal sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid encoding the signal sequence.
  • the An07g00440 lipase signal sequence is characterized in that it is derived from Aspergillus niger , but is not limited thereto.
  • the nucleic acid encoding the signal sequence may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the second amino acid tyrosine (T) of the An07g00440 lipase signal sequence is substituted with a positively charged arginine (R), and the third amino acid isoleucine (I)
  • the present invention relates to a modified lipase signal sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a nucleic acid encoding the modified lipase signal sequence, which is substituted with tryptophane (T).
  • the nucleic acid encoding the modified lipase signal sequence may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to an expression vector comprising a nucleic acid encoding the lipase signal sequence and a gene of the protein of interest.
  • vector means a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention.
  • plasmid vectors For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with the plasmid vector. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene and a restriction enzyme cleavage site (c) allows foreign DNA fragments to be inserted. Although no suitable restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods can facilitate ligation of the vector and foreign DNA.
  • genes are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences.
  • This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to enable gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) are bound to regulatory sequence (s).
  • DNA for a pre-sequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • operably linked means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are in contact and present within the reading frame. However, enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • the target protein may be characterized as catalase, and the catalase may be characterized as being penicillium marneffei catalase protein of SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
  • the expression vector may be characterized in that it further comprises a glucoamylase promoter, but is not limited thereto.
  • the expression vector may be pASPW504PMC or pASPV505PMC, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a recombinant microorganism into which a nucleic acid encoding the lipase signal sequence and a gene of a protein of interest are introduced; Or it relates to a recombinant microorganism into which the expression vector is introduced.
  • the recombinant microorganism may be characterized in that the Aspergillus Niger, but is not limited thereto.
  • microorganism As the recombinant microorganism, host cells having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of introduced DNA are commonly used. As all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells, bacteria, yeasts, molds, and the like are available, and the present invention. Aspergillus Niger was used in the embodiment of the present invention, but not limited thereto, and any kind of microorganism may be used as long as the catalase can be sufficiently expressed.
  • vectors function equally to express the DNA sequences of the present invention
  • hosts function equally for the same expression system.
  • one of ordinary skill in the art may, without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden, select appropriately among other vectors, expression control sequences and hosts.
  • a host should be considered, since the vector must be replicated therein, and the number of copies of the vector, the ability to control the number of copies and other proteins encoded by the vector, e.g. Expression of antibiotic markers should also be considered.
  • the transformed recombinant microorganism may be prepared according to any conventionally known transformation method.
  • transformation refers to a phenomenon in which DNA is introduced into a host so that DNA can be reproduced as a factor of a chromosome or by completion of chromosome integration. Means.
  • a commonly known gene manipulation method may be used as a method of inserting the gene on the chromosome of the host cell.
  • a commonly known gene manipulation method may be used.
  • a retroviral vector an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and herpes simplex.
  • a method of directly inserting on the chromosome of the host cell may also be used.
  • nucleic acid conjugates nucleic acid conjugates, naked DNA, artificial virons, chemically promoted DNA influx, calcium phosphate (CaPO 4 ) Precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, lithium acetate-DMSO method and the like can be used.
  • Sonoporation for example methods using the Sonitron 2000 system (Rich-Mar), can also be used for the delivery of nucleic acids.
  • Other representative nucleic acid delivery systems are Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland). And BTX Molesular Syetem (Holliston, Mass.).
  • Lipofection methods are specified in US Pat. No. 5,049,386, US Pat. No. 4,946,787 and US Pat. No. 4,897,355 and lipofection reagents are commercially available, for example TRANSFECTAM TM and LIPOFECTINTM.
  • Suitable cations or neutral lipids for effective receptor-recognition lipofection of polynucleotides include lipids from Felgner (WO91 / 17424 and WO91 / 16024) and can be delivered to cells via in vitro introduction and to target tissues via in vivo introduction. have.
  • nucleic acid complexes including target liposomes such as immunolipid complexes
  • Methods of preparing lipid: nucleic acid complexes, including target liposomes such as immunolipid complexes are well known in the art (Crystal, Science., 270: 404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2: 291 297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5: 382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5: 647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to produce the protein of interest; And (b) relates to a method for producing a target protein comprising the step of recovering the produced target protein.
  • An07g00440 lipase signal sequence and An07g00440 lipase modified signal sequence described in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 were then chemically synthesized for secretion of catalase to outside of Aspergillus niger.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by An07g00440 lipase signal sequence and An07g00440 lipase modified signal sequence described in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is the same as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • An07g00440 lipase signal sequence of SEQ ID NO: 1 consists of 2 amino acids of N-domain, 12 amino acids of H-domain, and 5 amino acids of C-domain (total of 19 amino acids).
  • An07g00440 lipase modified signal sequence of SEQ ID NO: 2 is a signal sequence obtained by converting a tyrosine, a second amino acid, into a positively charged arginine amino acid, and converting a third amino acid, isoleucine, to tryptophan.
  • SEQ ID NO: 4 An07g00440 Lipase Modified Signal Sequence (SEQ ID NO: 4):
  • Single chain oligonucleotides of 69 bp size were chemically synthesized so as to have restriction sites of restriction enzymes ClaI and NaeI at both ends of the signal sequence sequence, and the double-chain oligonucleotides were synthesized from the single-chain oligonucleotides. Annealing reaction was carried out to prepare oligonucleotides. Each 69 bp fragment was recovered. The recovered fragment was cut and cloned into pASPF503 vector with restriction enzymes ClaI and NaeI and named pASPW504 and pASPV505, respectively (FIGS. 1 and 2).
  • the pASPF503 vector contains a glaA promoter and a pdcA terminating factor and includes a hygromycin resistance gene, hygromycin B phosphotransferase (FIGS. 1 and 2). Hydromycin B is inserted into peptidyl-tRNA in ribosomes to interfere with the translation of peptidyl-tRNA. Hygromycin B phosphotransferase enzyme inactivates hygromycin B and thus can select for recombinant microorganisms.
  • the catalase protein derived from penicillium manefei of SEQ ID NO: 5 encodes a total of 734 amino acids and includes 19 signal sequences (mrglyslgtlaglvvaasa) and 23 presequences (acpmltgelpagsvanphhhgkr).
  • the penicillium manepai-derived catalase gene of SEQ ID NO: 6 having a size of 2205 bp was chemically synthesized by having the recognition sites of restriction enzymes ClaI and NotI at both ends of the PMC (penicillium manefei catalase) base sequence, respectively. Cloned to vector.
  • PMC DNA including the signal sequence was cleaved into ClaI and NotI, cloned into the pASPF503 vector of Example 1-1 and named pASP503PMC.
  • PMC DNA that does not contain a signal sequence in SEQ ID NO: 6 has a PMCVF1 primer (gcctgcccaatgctgacaggcg) that does not have a restriction enzyme recognition site at the 5 'end of the sequence and a single restriction enzyme NotI recognition site at the 3' end of the sequence. It was chemically synthesized using the PMCNotR1 primer (gcggccgcctatttatccacagcaaagc) of SEQ ID NO. 8, and 2145 bp fragments were obtained by performing polymerase chain reaction (PCR). The obtained fragment was cloned between pASPW504, pASPV505 vector NaeI and NotI restriction enzyme of Example 1-1, and named pASPW504PMC and pASPV505PMC, respectively.
  • PMCVF1 primer gcctgcccaatgctgacaggcg
  • the expression vectors pASP503PMC, pASPW504PMC and pASPV505PMC of Example 2 were introduced into Aspergillus Niger and transformed (Tilburn et al., Gene., 26: 205-221, 1983).
  • the liquid cultured mycelium was treated with cell wall lyase to make a protoplast, and pASP600s DNA was inserted into the genome.
  • pASP600s DNA was inserted into the genome.
  • recombinant microorganisms resistant to hygromycin B are inoculated on the same agar medium and subjected to primary passage. After 4 days, evenly disperse the recombinant microorganism spores in agar complete medium, and incubate for 5-6 days until the spores are evenly formed at 30 ° C.
  • Aspirate spores were harvested at 1 ⁇ 10 6 cells / ml with 0.1% Tween 80 from the culture dish incubated for 5 days, and the dilutions were inoculated into 1 ml liquid medium. Incubate at 28 °C, 200rpm, 4 days in a shaker. The culture medium was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes to remove the cells and confirmed the activity in the recovered culture supernatant.
  • 1 U is the amount of enzyme that breaks down 1 mole of hydrogen peroxide per minute.
  • Substrate is prepared by adding 0.1 ml of 30% Hydrogen Peroxide to 49.9 ml of 50 mM Potassium phosphate buffer pH7.0. 30 ul of fermentation broth is added to measure absorbance at 255 nm.
  • the expression vector comprising the novel signal sequence according to the present invention can induce mass expression and secretion of not only specific catalase but also other target proteins, which is very useful for stable mass production of specific catalase and other target proteins.

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Abstract

본 발명은 카탈라아제를 대량 발현시키기 위한 신규 신호서열 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 카탈라아제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물; 및 상기 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 신호서열을 포함하는 발현벡터를 이용하면 특정 카탈라아제뿐만 아니라 다른 목적단백질의 대량 발현 및 분비를 유도할 수 있어, 특정 카탈라아제 및 다른 목적단백질의 안정적인 대량 생산에 있어 매우 유용하다.

Description

신규 카탈라아제 신호서열 및 이를 이용한 카탈라아제 발현방법
본 발명은 카탈라아제를 대량 발현시키기 위한 신규 신호서열 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 카탈라아제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물; 및 상기 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
카탈라아제는 과산화수소(H2O2)를 산소(O2)와 물(H2O)로 전환 시키는 것을 촉진하는 효소이다. 대부분의 카탈라아제 효소는 네 가지 폴리펩티드 서브유닛을 함유하며, 각각은 50,000 내지 60,000 의 분자량을 가지고, 서브유닛 당 한 개의 햄(Heme)을 갖는다(Wasserman and Hultin (1981) Arch. Biochem. Biophys. 212:385-392; Hartig and Ruis (1986) Eur. J. Biochem. 160:487-490).
산업용으로 사용되는 여러 종류의 단백질은 안정성이 널리 알려져 있는 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus orryzae), 트리코더마 리제이(Trichoderma reesei)를 사용하여 생산하여 왔고, 목적 단백질을 발현 및 분비시키기 위하여 전사 촉진서열인 프로모터(promoter), 분비 신호 서열을 코딩하는 DNA, 목적 단백질의 구조 유전자 및 전사 종결자(transcription terminator)로 구성된 발현 분비 플라스미드 벡터를 사용하여왔다.
아스퍼질러스 나이거에서 목적 단백질을 분비시키기 위해 현재 사용되고 있는 분비 신호서열로는 발현하고자하는 유전자의 자체 신호서열과 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라제 신호서열이 있고, 강력한 프로모터로는 글루코아밀라제 (glaA)프로모터가 있다.
그러나 지금까지 알려진 신호서열만으로는 원하는 단백질을 대량 발현할 수는 없는 실정이다. 따라서, 상업적으로 중요한 효소인 카탈라아제를 보다 효율적으로 대량 생산할 수 있는 신호서열이 절실히 요구되고 있는 실정이며, 이에 대한 수요는 지속적으로 증가하고 있는 상황이다.
이에, 본 발명자들은 상기 발현의 한계를 극복하기 위하여 유전공학적 방법을 이용하여 카탈라아제를 대량생산하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 카탈라아제를 발현하기 위한 신규한 신호서열을 발굴하고, 상기 신호서열을 이용할 경우 카탈라아제가 대량으로 발현되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 카탈라아제를 대량으로 발현시키기 위한 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 카탈라아제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 An07g00440 리파제 신호서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 변형 리파제 신호서열을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 신호서열을 코딩하는 핵산과 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 생산방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 발현벡터의 모식도이다. A는 외래유전자의 cDNA를 클로닝하여 삽입하였을 때, 프로모터, 신호서열, 외래유전자 및 전자 종결암호 각각의 부분을 자세히 나타낸 모식도이고, B는 An07g00440 리파제 신호서열을 더 포함하는 경우의 모식도이며, C는 An07g00440 리파제 변형 신호서열을 더 포함하는 경우의 모식도이다.
도 2는 실시예 1-2의 발현벡터를 나타낸 것이다. A는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 사용하고 자체 신호서열을 포함하는 cDNA를 클로닝 할 수 있는 벡터(pASP503)를 나타내고, B는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 사용하고 An07g00440 리파제 신호서열을 포함하는 벡터(pASPW504)를 나타내며, C는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 사용하고 An07g00440 리파제 변형 신호서열을 포함하는 벡터(pASPV505)를 나타낸다.
도 3은 실시예 5의 재조합미생물 배양액 분석결과를 나타낸 것으로, A는 재조합미생물 pASPF503PMC의 배양액 분석결과, B는 재조합미생물 pASPW504PMC의 배양액 분석결과, C는 재조합미생물 pASPV505PMC의 배양액 분석결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 특정 카탈라아제 및 다른 목적단백질을 다량 발현시킬 수 있는 An07g00440 리파제 신호서열 및 변형 리파제 신호서열; 상기 신호서열과 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제조하였다. 그 결과, 제조된 재조합미생물을 배양시켜 카탈라아제를 다량으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 목적단백질을 코딩하는 핵산으로 서열번호 6의 페니실륨 마네페이 카탈라아제 유전자를 이용하여, 본 발명의 신규 신호서열을 이용하는 경우 카탈라아제가 다량으로 생산됨을 확인하였다. 그러나, 이는 하나의 예시에 불과한바, 특정 카탈라아제 뿐만 아니라 다른 목적단백질에도 본 발명을 적용할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 것이다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 An07g00440 리파제 신호서열 및 상기 신호서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 An07g00440 리파제 신호서열은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신호서열을 코딩하는 핵산은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 An07g00440 리파제 신호서열의 2번째 아미노산인 타이로신(tyrosine; T)이 양전하를 띠는 알지닌(arginine; R)으로 치환되고, 3번째 아미노산인 아이소루신(isoleucine; I)이 트립토판(tryptophane; T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 변형 리파제 신호서열 및 상기 변형 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변형 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산 및 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현 시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.
아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들) 일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 목적단백질은 카탈라아제인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 카탈라아제는 서열번호 5의 페니실륨 마네페이(Penicillium marneffei) 카탈라아제 단백질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 글루코아밀라아제 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 pASPW504PMC 또는 pASPV505PMC인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산과 목적단백질의 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물; 또는 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합미생물이 아스퍼질러스 나이거인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 본 발명의 실시예에서는 아스퍼질러스 나이거를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 카탈라아제가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
상기 형질전환된 재조합미생물은 통상적으로 알려진 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
또한, 형질전환방법에는 발현벡터를 이용한 방법 외에도, 숙주세포의 염색체상에 직접 삽입하는 방법도 이용될 수 있다.
일반적으로 전기천공법(electroporation), 리포펙션, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론, 화학물질 촉진 DNA 유입, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 이용될 수 있다.
소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, TRANSFECTAMTM 및 LIPOFECTINTM 이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 생산방법에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 발현벡터 pASPW504 및 pASPW505의 제조
1-1 : An07g00440 리파제 신호서열 및 An07g00440 리파제 변형 신호서열의 화학합성
카탈라아제의 아스퍼질러스 나이거 외부로의 분비를 위하여 하기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 An07g00440 리파제 신호서열과 An07g00440 리파제 변형 신호서열을 화학합성하였다. 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 An07g00440 리파제 신호서열과 An07g00440 리파제 변형 신호서열이 암호화하는 단백질의 아미노산 서열은 각각 하기의 서열번호 1 또는 서열번호 2와 같다.
서열번호 1의 An07g00440 리파제 신호서열은 N-domain 2개 아미노산, H-domain 12개 아미노산, C-domain 5개 아미노산(총 19개의 아미노산)으로 구성된다. 서열번호 2의 An07g00440 리파제 변형 신호서열은 2번째 아미노산인 타이로신을 양전하를 띠는 알지닌 아미노산으로 변형하고, 3번째 아미노산인 아이소루신을 트립토판으로 전환한 신호서열이다.
An07g00440 리파제 신호서열 아미노산 서열(서열번호 1):
myipsvlllaaslfhgata
An07g00440 리파제 변형 신호서열 아미노산 서열(서열번호 2):
mrwpsvlllaaslfhgata
An07g00440 리파제 신호서열 염기서열(서열번호 3):
atgtatatcccctcggtgctgcttctggccgcgagcctgttccatggcgcaacg
An07g00440 리파제 변형 신호서열 염기서열(서열번호 4):
atgcgctggccctcggtgctgcttctggccgcgagcctgttccatggcgcaacggcc
1-2 : 발현벡터 pASPW504 및 pASPV505의 제조
신호서열 염기서열의 양 말단에 제한효소 ClaI과 NaeI의 인식부위를 갖도록 각각 69 bp 크기의 단일 사슬의 올리고뉴클리오티드(oligonucleotide)들을 화학합성하였고, 상기 단일사슬의 올리고뉴클리오티드로부터 이중사슬의 올리고뉴클리오티드를 제조하기 위하여 어닐링(annealing) 반응을 실시하였다. 각각 69 bp 크기의 절편을 회수하였다. 회수된 절편을 pASPF503 벡터에 제한효소 ClaI과 NaeI으로 커팅하고 클로닝하여 각각 pASPW504, pASPV505라 명하였다(도 1 및 2).
pASPF503 벡터는 glaA 프로모터와 pdcA 종결 인자를 포함하고 있으며, 하이그로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제를 포함한다(도 1 및 2). 하이드로마이신 B는 리보좀내의 펩티딜-tRNA에 삽입되어 펩티딜-tRNA의 번역(translation)을 방해한다. 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 효소는 하이그로마이신 B를 불활성화시키므로 재조합미생물을 선별할 수 있다.
실시예 2 카탈라아제 발현벡터 pASP503PMC, pASPW504PMC 및 pASPV505PMC의 제조
서열번호5의 페니실륨 마네페이 유래 카탈라아제 단백질은 총 734개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 19개의 신호서열(mrglyslgtlaglvvaasa)과 23개의 프리서열 (acpmltgelpagsvanphhhgkr) 아미노산을 포함한다. PMC(페니실륨 마네페이 카탈라아제) 염기서열의 양 말단에 각각 제한효소 ClaI과 NotI의 인식부위를 갖도록 하여, 2205 bp 크기의 서열번호6의 페니실륨 마네페이 유래 카탈라아제 유전자를 화학합성하여, pGEM-B1 벡터에 클로닝하였다.
신호서열을 포함한 PMC DNA는 ClaI과 NotI으로 절단하여 실시예 1-1의 pASPF503 벡터에 클로닝하고 pASP503PMC라 명명하였다.
서열번호 6에서 신호서열을 포함하지 않은 PMC DNA는 서열의 5' 말단에 제한효소 인식부위를 갖지 않는 서열번호 7의 PMCVF1 프라이머(gcctgcccaatgctgacaggcg)와 서열의 3' 말단에 단일한 제한효소 NotI 인식부위를 갖는 서열번호 8의 PMCNotR1 프라이머(gcggccgcctatttatccacagcaaagc)를 이용하여 화학합성하였으며, 두 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 2145 bp 절편을 확보 하였다. 확보된 절편은 실시예 1-1의 pASPW504, pASPV505 벡터 NaeI과 NotI제한 효소 사이에 클로닝하였으며, 각각 pASPW504PMC, pASPV505PMC라 명명하였다.
실시예 3 발현벡터를 도입한 재조합미생물의 제조 및 재조합미생물의 선별방법
실시예 2의 발현벡터 pASP503PMC, pASPW504PMC 및 pASPV505PMC를 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 형질전환하였다(Tilburn et al., Gene., 26:205-221, 1983). 형질전환을 위하여, 액상 배양한 균사체에 세포벽 분해 효소를 처리하여 프로토플라스트를 만든 후 pASP600s DNA를 유전체에 삽입하였다. 또한, 재조합미생물을 선별하기 위하여, 하이그로마시신이 첨가된 아가 배지에서 선별하여 계대 배양 하였다.
실시예 4 재조합미생물의 플라스크 배양
실시예 3의 재조합미생물 중에서 하이그로마이신 B에 내성을 가지는 재조합미생물들을 동일한 아가배지에 점 접종하여 1차 계대를 한다. 4일 후 아가완전 배지에 재조합미생물 포자를 골고루 분산시킨 후 30℃에서 포자가 골고루 형성될때까지 5-6일간 배양한다.
5일간 배양한 배양접시로부터 0.1% Tween 80으로 무성포자를 1X106 cell/ml로 수확하여 이 희석액을 1ml 액상 완전배지에 접종한다. 진탕배양기에서 28℃, 200rpm, 4일 동안 배양한다. 배양액을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양상등액에서 활성을 확인하였다.
실시예 5 카탈라아제 효소의 활성 측정
1U는 분당 1mole의 과산화수소를 분해하는 효소의 양이다. 50mM 포테슘 포스페이트 버퍼(Potassium phosphate buffer) pH7.0, 49.9 ml에 30% 하이드로겐 퍼록시드 (Hydrogen Peroxide) 0.1ml을 첨가하여 기질을 만든다. 발효액 30ul를 첨가하여 255nm에서 흡광도를 측정한다.
그 결과, pASP503PMC, pASPW504PMC, pASPV505PMC 각각을 함유하는 재조합미생물 모두 과산화효소 활성을 나타내었으며, 역가는 pASP503PMC 재조합미생물의 경우 2,300 unit/ml, pASPW504PMC 재조합미생물의 경우 26,000 unit/ml, pASPV505PMC 재조합미생물의 경우 53,000 unit/ml을 나타내었다. 자체 신호서열보다 An07g00440 리파제 신호서열에서 11.3배 높게 발현되었으며, An07g00440 리파제 변형 신호서열에서 2.03배 높게 발현되었다.
SDS PAGE 분석 결과 PMC 카탈라아제 분자량은 75.9 kD 크기이나 글라이코실레이션(Glycosylation)되어 실제 크기는 100 kD임을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 An07g00440 리파제 신호서열 및 An07g00440 리파제 변형 신호서열에 의해, 재조합 유전자가 아스퍼질러스 나이거 외부로 분비됨을 확인할 수 있었다 (도 3).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 신규 신호 서열을 포함하는 발현벡터를 이용하면 특정 카탈라아제 뿐만 아니라 다른 목적단백질의 대량 발현 및 분비를 유도할 수 있어, 특정 카탈라아제 및 다른 목적단백질의 안정적인 대량 생산에 있어 매우 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 리파제 신호서열.
  2. 제1항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래인 것을 특징으로 하는 리파제 신호서열.
  3. 제1항의 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제1항의 리파제 신호서열의 2번째 아미노산인 타이로신(tyrosine; T)이 양전하를 띠는 알지닌(arginine; R)으로 치환되고, 3번째 아미노산인 아이소루신(isoleucine; I)이 트립토판(tryptophane; T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 변형 리파제 신호서열.
  6. 제5항의 변형 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제1항 또는 제5항의 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산 및 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 목적단백질은 카탈라아제인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 카탈라아제는 서열번호 5의 페니실륨 마네페이(Penicillium marneffei) 카탈라아제 단백질인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  11. 제8항에 있어서, 글루코아밀라아제 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  12. 제8항에 있어서, pASPW504PMC 또는 pASPV505PMC인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  13. 제1항 또는 제5항의 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산과 목적단백질의 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  14. 제8항의 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물.
  15. 제14항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)인 것을 특징으로 하는 재조합미생물.
  16. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법:
    (a) 제13항의 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 목적단백질을 회수하는 단계.
  17. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법:
    (a) 제14항의 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 목적단백질을 회수하는 단계.
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