CN108949762A

CN108949762A - 翅发育相关基因optomotor-blind的dsRNA及其在害虫防治中的应用

Info

Publication number: CN108949762A
Application number: CN201810870037.8A
Authority: CN
Inventors: 李志红; 郭韶堃; 沈杰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2018-12-07

Abstract

本发明公开了翅发育相关基因optomotor blind的dsRNA及其在害虫防治中的应用。本发明首次对橘小实蝇翅发育基因optomotor blind设计引物并合成了dsRNA，且运用饲喂法对橘小实蝇optomotor blind基因进行RNAi，在保证干扰效率的前提下得到翅发育畸形的表型。本发明不仅解决了注射导入dsRNA在田间难以操作的问题，为今后研究直接喷施的RNA制剂来防控橘小实蝇打下基础，也对有效防控橘小实蝇的入侵和扩散，保护我国农业生产、生态安全以及人类健康具有良好的经济、社会效益。

Description

翅发育相关基因optomotor-blind的dsRNA及其在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及翅发育相关基因optomotorblind(omb)的dsRNA及其在害虫防治中的应用，特别涉及在橘小实蝇防治中的应用。

背景技术

橘小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)隶属于双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、果实蝇属(Bactrocera)，是多种热带、亚热带水果和蔬菜的重要害虫，近年来在我国北扩形势严峻。橘小实蝇为杂食性害虫，寄主范围广，可危害柑桔、番石榴、杨桃、芒果、香蕉、茄子、辣椒、瓜类等40多科250多种水果和蔬菜(邓志声，2001；商鸿生，1997)，2014年我国农业部将其列为农业重点防控入侵对象，橘小实蝇的防控策略受到普遍关注。目前，国内外普遍采用套袋、性诱及施用化学农药等措施控制重要经济实蝇的田间危害，但这些方法有一定的局限性，难以实现高效治理。近年来，基于遗传控制的橘小实蝇雄虫不育技术(SIT)为防治重要经济实蝇开辟了一条新途径，得到一定发展，但这种方法也因其工作量大且需要连续释放不育雄虫而受到限制。因此，探索更为简便和可持续的控制方法，实现绿色、高效的橘小实蝇田间治理尤为重要。

昆虫翅的形成利于其迁移并扩大生活范围，橘小实蝇也因此扩散危害，对橘小实蝇翅发育相关基因的研究可以帮助从遗传学角度研究橘小实蝇的防治方法。随着对果蝇等模式昆虫的深入研究，与翅发育有关的信号通路逐渐被揭示，这些信号通路基因参与调控翅的发育，对于探索非模式昆虫翅发育机理提供参考意义。幼虫时期的翅称为翅芽，果蝇翅芽划分为前(anterior，A)、后(posterior，P)、背(dorsal，D)、腹(ventral，V)4个隔间(Bryant，1970；Garcia-Bellido&Merriam，1971b；Garcia-Bellido et al.，1973)，分别由A/P隔间边界和D/V隔间边界隔开，边界线处细胞形成A/P和D/V组织中心，指导翅在2个轴向上的发育(Klein，2001)。Optomotor blind(简称omb)是Dpp信号通路的下游靶标基因，对维持前后隔间边界起到关键作用，在omb突变背景下前隔间的细胞会越过A/P边界到达后隔间，但不与后隔间细胞混合(Shen&Dahmann，2005b)。在后隔间抑制omb，翅芽上会出现一条A/P沟，在成虫翅中表现为在翅中间形成巨大缺刻，而在前隔间抑制omb并不能产生这样的沟(Shen et al.，2008)。

双链RNA(dsRNA)介导的RNA干扰(RNA interference，RNAi)通过特异性降解靶标mRNA实现抑制特定基因表达的目的。随着生物技术的发展，RNAi已经在探索基因功能、基因治疗等方面显示出了巨大潜力，通过对农业害虫进行基因控制使其在昆虫学领域被广泛应用(Jaubert-Possamai et al.，2007；Price&Gatehouse，2008)。RNA干扰最早应用于果蝇并得以发展，相关学者利用RNA干扰技术研究果蝇的交配行为，发现体内缺少Genderblind蛋白的雄虫无法正确选择配偶(Grosjean et al.,2007)。目前，应用RNAi技术证明了对淡色库蚊(Culex pipiens)的胰岛素基因进行沉默，可激活体内FOXO(forkhead transcriptionfactor)的下游靶标基因，从而导致滞育(Sim&Denlinger,2008)。在赤拟谷盗中用RNAi抑制ubx和abd-A两个基因的表达，在中胸至第8腹节的10个体节均出现了鞘翅盘(Tomoyasu etal.，2005)，对赤拟谷盗晚期幼虫显微注射wg基因的dsRNA后，成虫翅宽度减小，翅间距增大，且羽化过程受到严重影响。赤拟谷盗是具有高效RNAi机制的昆虫，对赤拟谷盗任何虫态进行RNA干扰，都可使目的基因的表达受到抑制，且抑制效应还可以持续到下一代(李承军等，2011)。人工合成的dsRNA作为一种RNA制剂在未来害虫防治中具有广阔的发展和应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种dsRNA。

本发明提供的dsRNA为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

本发明的第二个目的是提供编码上述dsRNA的DNA分子。

本发明提供的编码上述dsRNA的DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。

本发明的第三个目的是提供含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

本发明的第四个目的是提供上述dsRNA或上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系的新用途。

本发明提供了上述dsRNA或上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下a1)-a8)中任一种中的应用：

a1)防治橘小实蝇；

a2)制备防治橘小实蝇的产品；

a3)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；

a4)制备防控橘小实蝇的入侵和/或扩散的产品；

a5)抑制橘小实蝇翅发育；

a6)制备抑制橘小实蝇翅发育的产品；

a7)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达；

a8)制备抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的产品。

本发明的第五个目的是提供一种抑制橘小实蝇翅发育的方法。

本发明提供的抑制橘小实蝇翅发育的方法是将抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的物质导入橘小实蝇，从而实现抑制橘小实蝇翅发育。

上述方法中，所述抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的物质为上述dsRNA。

上述方法中，所述导入的方式为饲喂。所述饲喂的方法具体可为将dsRNA与纳米载体和饲料混匀，得到混合物，将所述混合物饲喂橘小实蝇。所述dsRNA、纳米载体和饲料的配比为1μg：(1-1.5)μL：(0.05-0.1)g，具体地，所述dsRNA、纳米载体和饲料的配比为1μg：1.4μL：0.075g。

上述方法中，所述橘小实蝇可为1龄橘小实蝇幼虫。

本发明的第六个目的是提供上述方法的新用途。

本发明提供了上述方法在如下b1)-b3)中任一种中的应用：

b1)防治橘小实蝇；

b2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；

b3)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达。

本发明的第七个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品的活性成分为如下c1)或c2)：

c1)上述dsRNA；

c2)上述DNA分子；

所述产品具有如下d1)-d4)中任一种功能：

d1)防治橘小实蝇；

d2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；

d3)抑制橘小实蝇翅发育；

d4)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达。

本发明的第八个目的是提供抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的物质。

本发明提供的抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的物质为如下e1)-e3)中任一种：

e1)上述dsRNA；

e2)上述DNA分子；

e3)含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

本发明首次对橘小实蝇翅发育相关基因optomotor blind设计引物并合成了dsRNA，且运用饲喂法对optomotor blind基因进行RNA干扰，在保证干扰效率的前提下得到翅发育畸形的表型。本发明从翅发育的角度对靶标基因进行敲除，使害虫不具飞行能力，无法扩散为害，不仅解决了注射导入dsRNA在田间难以操作的问题，使RNA制剂方便应用于害虫防治领域，为今后研究直接喷施的RNA制剂来防控橘小实蝇打下基础，也对有效防控橘小实蝇的入侵和扩散，保护我国农业生产、生态安全以及人类健康具有良好的经济、社会效益。

附图说明

图1为空白对照组(CK)和dsGFP对照组橘小实蝇表型。

图2为dsomb处理组橘小实蝇表型。

图3为RNA干扰效率检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的纳米载体(G2)为一种荧光星形聚合物，记载于文献“Bicheng Heet al.Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control ofinsect pests,2013”中，公众可从中国农业大学获得。

实施例1、翅发育相关基因Optomotor blind(简称omb)的dsRNA的获得

一、供试橘小实蝇样品

本实验所用虫源橘小实蝇是中国农业大学植物检疫与入侵生物学实验室室内种群，室内饲养条件：温度为25℃；相对湿度保持在70％左右；光周期为14h:10h(L:D)。橘小实蝇的饲养方法如下：橘小实蝇在养虫笼中统一饲养，将幼虫饲料(幼虫饲料配方如表1所示)加入到500mL蒸馏水中煮沸装瓶备用，待冷却后呈冻状；成虫饲料(成虫饲料是将蔗糖和大豆蛋白胨按质量比为1:3的比例混匀得到的)加水湿润后喂食成虫，成虫产卵后将卵放在幼虫饲料上，待卵孵化为幼虫后取食饲料，幼虫老熟后入土化蛹，约十天后羽化出成虫，将其放入养虫笼中完成生活史。养虫笼中适量添加水瓶作为水分补充。

表1、橘小实蝇幼虫饲料配方

组分	用量(g)
		酵母粉	20
大豆蛋白胨	5
		蔗糖	60
琼脂	6
		尼白金	0.6
山梨酸	0.5
		抗坏血酸	3.3

二、样品RNA的提取及反转录

1、样品RNA的提取

利用天根生化科技(北京)有限公司的总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取样品RNA，得到供试样品的RNA。具体步骤如下：

(1)将供试橘小实蝇样品组织在液氮中磨碎。每50-100mg(取70-80mg)组织加1mL裂解液RZ，用研磨棒进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液RZ体积的10％。

(2)将匀浆样品室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

(3)4℃，12000rpm(～13400×g)离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。

(4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。

(5)4℃，12000rpm(～13400×g)离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要存在于水相中，水相的体积均为所用裂解液RZ的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。

(6)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀(此时可能出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃，12000rpm(～13400×g)离心30s，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，分两次转入吸附柱CR3中，4℃，12000rpm(～13400×g)离心30s，弃掉收集管中的废液。

(7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液PD(使用前加入无水乙醇)，4℃，12000rpm(～13400×g)离心30s，弃废液，将吸附柱CR3放入收集管中。

(8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入无水乙醇)，室温静置2min，4℃，12000rpm(～13400×g)离心30s，弃废液。

(9)重复操作步骤(8)。

(10)将吸附柱CR3放入2mL收集管中，4℃，12000rpm(～13400×g)离心2min，去除残余液体，置于超净工作台上通风片刻，充分晾干。

(11)将吸附柱CR3转入一个新的1.5mL离心管中，加30-100μL Rnase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃，12000rpm(～13400×g)离心2min。

(12)收集洗脱液加入吸附柱CR3再次洗脱，测定提取RNA的浓度。将RNA保存在-80℃。

2、反转录

以步骤1中提取的RNA为模板，利用TaKaRa公司(日本)的PrimeScript^TM RTreagent Kit with gDNAEraser进行反转录，得到cDNA。以下操作均在冰上进行。具体步骤如下：

(1)在200μL离心管中建立如表2所示的反应体系，该体系需加入1mg RNA，根据测得的RNA浓度，计算所需RNA体积，RNA体积不得超过7μL。反应条件如下：42℃金属浴2min，4℃保存。

表2、反转录第一步反应体系

组分	体积(μL)
		5×gDNA Eraser Buffer	2
gDNA Eraser	1
		Total RNA	*
RNase Free ddH₂O	Up to 10
		Total	10

(2)建立如表3所示的反应体系，反应条件如下：金属浴37℃15min，85℃5s，4℃保存。

表3、反转录第二步反应体系

组分	体积(μL)
		步骤(1)中的反应溶液	10
5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)	4
		Prime Script RT Enzyme MixⅠ	1
RT Prime Mix	1
		RNase Free ddH₂O	4
Total	20

三、含有翅发育相关基因optomotor blind的重组质粒的构建

1、引物的设计与合成

(1)根据已获得的橘小实蝇翅发育相关基因optomotor blind的cDNA模板信息，利用SMART分析目的基因序列。

(2)利用Primer premier 5.0软件设计引物，并利用Oligo7评估引物。

(3)引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成的引物序列如下：

上游引物(5’-3’)：CGGCAAATGTTTCCTCAAAT；

下游引物(5’-3’)：CGGCTATAAATTCCGTCTCCT。

2、PCR扩增基因片段及产物测序

以步骤二获得的cDNA为模板，用Hot Start Green Master Mix(Promega公司(美国))进行PCR扩增反应，在200μL离心管中建立如表4所示的反应体系(50μL)。

表4、PCR反应体系

反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，相应温度退火30s，72℃延伸30s，共38个循环；最后72℃延伸10min。4℃保存。

取5μL扩增产物用加入10000×GeneRed核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，115V恒压电泳30min。用紫外凝胶成像系统进行观察。

将剩余扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果表明：PCR产物大小为403bp，其核苷酸序列为序列2。

3、PCR扩增产物回收纯化

采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(康宁生命科学(吴江)有限公司)对PCR扩增产物进行回收纯化。具体步骤如下：

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，每2-3min间断混合，直至凝胶完全融化(约6-8min)。

(3)加1.5个凝胶体积的Buffer DE-B，混合均匀。

(4)吸取(3)中的混合液，转移到DNA制备管(置于试剂盒内提供的2mL离心管)中，12000×g离心1min，弃滤液。

(5)将制备管放置回2mL离心管，加入500μL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液。

(6)将制备管放置回2mL离心管，加入700μL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方式再用12000×g离心1min。

(7)将制备管放置回2mL离心管，12000×g离心1min。

(8)将制备管放置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入30μL Eluent，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。

4、目的片段的克隆与测序

(1)将回收纯化的扩增产物与Promega公司(美国)的-T载体系统连接。在200μL离心管中配制如表5所示的反应体系(10μL)。

表5、连接反应体系

组分	体积(μL)
		PCR产物	3
pGEM-T Vector	1
		2×Rapid Ligation Buffer	5
T4 DNA Ligase	1
		Total	10

(2)4℃过夜连接。

(3)Amp/LB固体培养基的制备：在950mL ddH₂O中加入胰蛋白胨(tryptone)10g；酵母提取物(east extract)5g；NaCl 10g。用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L。然后加入15g琼脂粉，121℃高压灭菌20min，待冷却至50℃左右时，加入500μL氨苄抗生素Amp，倒制平板。

(4)转化平板的制备：向铺好的Amp/LB固体培养基表面分别加入35μL IPTG(24mg/mL)及40μL X-gal(20mg/mL)。用涂布器将其均匀涂开，避光置于37℃约1h，使溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发完全。

(5)取1.5mL离心管，将5μL连接产物加入50μL DH5α感受态细胞(TaKaRa公司)中，轻轻混匀，冰上放置30min。

(6)将离心管置于42℃金属浴60-90s，然后迅速将离心管转移到冰上，静止5min，期间不晃动离心管。

(7)向离心管中加入500μL SOC培养基，混匀后37℃，150rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp)。

(8)振荡培养后的菌液于2000rmp常温离心5min，抽取多余SOC培养基，剩余大约120-150μL，抽打混匀菌液。

(9)将菌液涂布于Amp/LB固体培养基上，37℃倒置培养12h。

(10)挑选10个单克隆，于LB液体培养基中37℃振荡培养12h。

(11)取2μL菌液，以其为模板，进行PCR扩增反应，在200μL已灭菌的离心管中建立如表6所示的反应体系(50μL)。

表6、菌液PCR反应体系

①反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，53.8℃退火30s，72℃延伸30s，共38个循环；72℃延伸10min。4℃保存。

②电泳检测：取5μL扩增产物用加入10000×GeneRed核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，115V恒压电泳30min。用紫外凝胶成像系统进行观察。

(12)取0.5mL菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

(13)选取测序结果正确的菌液样品12000rmp离心1min，尽量吸除上清，收集菌体。

5、提取质粒

利用天根生化科技(北京)有限公司的快速质粒小提试剂盒(离心柱型)进行重组质粒的提取，具体步骤如下：

(1)取1-4mL过夜培养的菌液，加入离心管中，用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸取上清。

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1(提前加入RNase A和TIANRed)，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

(3)向离心管中加入150μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，此时溶液颜色应为澄清的紫色。若紫色中混杂有浑浊的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清紫色。

(4)向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。12000rpm离心2min。

(5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(6)向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(7)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心1min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(8)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液TB，12000rpm离心30s，将质粒溶液收集到离心管中。

四、合成dsRNA

1、引物的设计及模板的合成

设计带有T7启动子的引物，以步骤三提取的质粒为模板，采用带有T7启动子的引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行纯化，得到用于合成dsRNA的模板。具体步骤如下：

(1)在步骤三的2中设计的引物5’端直接加上T7引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，T7引物序列如下：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’。

(2)按照步骤三的2中的反应体系和反应条件，以步骤三提取的质粒为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有T7启动子的DNA。

(3)取250μL PCR扩增产物于1.5mL离心管中，加入100μL ddH₂O和350μL异丙醇，-20℃放置10h使DNA沉淀。

(4)4℃，13000rpm离心30min。

(5)用移液器吸去上清。

(6)加入1mL 75％乙醇溶液洗涤沉淀。4℃，13000rpm离心5min，吸去上清。

(7)重复步骤(6)。

(8)打开离心管管盖，将离心管置于超净工作台中，干燥沉淀。

(9)将干燥沉淀溶解于20μL ddH₂O中，检测DNA浓度，-20℃保存。

2、合成dsRNA

以步骤1获得的带有T7启动子的DNA为模板，利用Promega公司(美国)的T7RiboMAX^TM Express RNAi System，体外转录生成dsRNA。具体步骤如下：

(1)利用Promega公司(美国)的T7RiboMAX^TM Express RNAi System在1.5mL离心管中建立如表7所示的反应体系(20μL)，该体系需加入1.5μg纯化扩增产物，根据步骤1中测得的纯化DNA的浓度，计算所需DNA体积，不得超过8μL。

表7、RNAi反应体系

组分	体积(μL)
		Buffer	10
Enzyme Mix T-express	2
		纯化扩增产物	*
Nulease-Free Water	Up to 20
		Total	20

(2)用封口膜将离心管管口封住，37℃水浴孵育6h以上。

(3)70℃水浴10min，室温放置20min。

(4)向离心管中加入1μL稀释的RNase Solution和1μL RQ RNase-Free DNase。37℃水浴30min。

(5)向离心管中加入2.2μL 3M Solution Acetate和24.2μL异丙醇。在冰上静置5min，4℃，13000rpm低温离心3min。若无沉淀，吸打溶液后相同条件下再次离心30min。

(6)用移液器吸去上清液，加入0.5mL 70％乙醇溶液洗涤沉淀；4℃，1000rpm低温离心3min。

(7)打开离心管管盖，将离心管置于超净工作台中，干燥沉淀。

(8)加入20μL Nuclease-Free H₂O，使沉淀溶解得到dsRNA，测定浓度并保存在-20℃。

对获得的dsRNA进行测序。测序结果表明：翅发育基因optomotor blind的dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列1，其反义链的核苷酸序列为序列1的反向互补序列。上述翅发育基因optomotor blind的dsRNA也可通过人工合成的方法获得。dsRNA的编码基因序列为序列2。

实施例2、翅发育相关基因optomotor blind的dsRNA在防治橘小实蝇中的应用

一、饲喂dsRNA

选取1龄健康的、发育正常的橘小实蝇幼虫为实验材料，实验设置空白对照组、dsGFP(无关基因)对照组和处理组，各组三个重复，每个重复40头幼虫。

1、空白对照组(CK)

取20个1.5mL离心管，每个离心管中加入约0.15g碾碎的橘小实蝇幼虫饲料和4μLddH₂O，混匀。每个离心管中放入两头幼虫进行取食。每天观察幼虫取食和生长情况。48h后饲料被完全取食，后续仅补喂饲料即可，直至幼虫生长至三龄末期。将离心管中的一头存活幼虫挑入土中化蛹羽化，观察成虫翅发育情况，另一头幼虫保存于RNA保存液中，用于目的基因表达量的检测。

2、dsGFP对照组

取20个1.5mL离心管，每个离心管中加入约0.15g碾碎的橘小实蝇幼虫饲料。将GFP基因的dsRNA(dsGFP)稀释至浓度为500ng/μL，得到dsGFP溶液，取4μL dsGFP溶液与2.8μL纳米载体(G2)混匀，静置15min后加入离心管中，与0.15g幼虫饲料混匀(dsGFP、纳米载体和饲料的配比为1μg：1.4μL：0.075g)。每个离心管中放入2头幼虫进行取食。每天观察幼虫取食和生长情况。48h后饲料被完全取食，后续仅补喂饲料即可，直至幼虫生长至三龄末期。将离心管中的一头存活幼虫挑入土中化蛹羽化，观察成虫翅发育情况。另一头幼虫保存于RNA保存液中，用于目的基因表达量的检测。

上述GFP基因的dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列3，其反义链的核苷酸序列为序列3的反向互补序列。

3、dsomb处理组

取20个1.5mL离心管，每个离心管中加入约0.15g碾碎的橘小实蝇幼虫饲料。将实施例1中制备的翅发育基因optomotor blind的dsRNA稀释至浓度为500ng/μL，得到dsRNA溶液，取4μL dsRNA溶液与2.8μL纳米载体(G2)混匀，静置15min后加入离心管中，与0.15g幼虫饲料混匀(dsRNA、纳米载体和饲料的配比为1μg：1.4μL：0.075g)。每个离心管中放入2头幼虫进行取食。每天观察幼虫取食和生长情况。48h后饲料被完全取食，后续仅补喂饲料即可，直至幼虫生长至三龄末期。将离心管中的一头存活幼虫挑入土中化蛹羽化，观察成虫翅发育情况。另一头幼虫保存于RNA保存液中，用于目的基因表达量的检测。

二、RNA干扰效率的检测

1、干扰表型检测

对空白对照组(CK)、dsGFP对照组和dsomb处理组幼虫化蛹羽化后的成虫的翅发育情况进行观察。

结果如图1和图2所示。图1为空白对照组(CK)和dsGFP对照组的翅发育情况。图2为dsomb处理组的翅发育情况。从图1中可以看出：与空白对照组(CK)相比，dsGFP对照组翅发育无明显异常。从图2可以看出：dsomb处理组的不同个体的翅出现翅发育畸形的表型，具体表现为翅卷曲、皱缩，无法正常飞行。说明本发明的用于干扰翅发育基因optomotor blind表达的dsRNA有效干扰了橘小实蝇的翅发育，可用于防治橘小实蝇。

2、基因表达量的测定

对空白对照组(CK)、dsGFP对照组和dsomb处理组保存的幼虫进行RNA提取并进行反转录，以获得的cDNA为模板，利用TaKaRa公司(日本)的Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)进行Real Time PCR反应，分别检测橘小实蝇空白对照组(CK)、dsGFP对照组和dsomb处理组的样品的目的基因表达量。以橘小实蝇18s rRNA为内参基因。引物序列如表8所示。实时荧光PCR反应体系如表9所示。反应条件如下：95℃预变性30s；PCR反应95℃5s，60℃34s，共40个循环；溶解曲线分析：95℃15s；60℃1min，95℃15s。

表8、实时荧光PCR所需引物

基因	上游引物(5’-3’)	下游引物(5’-3’)
			18s	CGCTGCTTTCACAACATCAC	CGCTGCTTTCACAACATCAC
omb	TGGTCAACGGACTGGAAGTG	TGTGTTGGTGTCTTGCGTTG

表9、实时荧光PCR反应体系

结果如图3所示。从图中可以看出：与空白对照组(CK)和dsGFP对照组相比，dsomb处理组的橘小实蝇中的optomotor blind基因的表达量显著降低。

序列表

<110>中国农业大学

<120>翅发育相关基因optomotor-blind的dsRNA及其在害虫防治中的应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>403

<212>RNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

cggcaaaugu uuccucaaau gaaauuucgc guuucggguc uggacgccaa ggcgaaauau 60

auuuugcucu uggacaucgu agcggcggac gauuaccguu acaaguuuca caacagccgc 120

uggaugaucg ccggcaaggc ggauccggaa augccaaaac gcauguacau ccaccccgau 180

ucgccgacca ccggcgaaca guggaugcag aaggucgucu cauuucacaa auuaaaauug 240

accaacaaua uuagugauaa acauggauuu guaaguacua cgauacucaa uucaaugcau 300

aaauaccagc cacguuucca uuuggugcga gccaaugaca uacucaagcu gccguacuca 360

acauuucgga cguauguuuu caaggagacg gaauuuauag ccg 403

<210>2

<211>403

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

cggcaaatgt ttcctcaaat gaaatttcgc gtttcgggtc tggacgccaa ggcgaaatat 60

attttgctct tggacatcgt agcggcggac gattaccgtt acaagtttca caacagccgc 120

tggatgatcg ccggcaaggc ggatccggaa atgccaaaac gcatgtacat ccaccccgat 180

tcgccgacca ccggcgaaca gtggatgcag aaggtcgtct catttcacaa attaaaattg 240

accaacaata ttagtgataa acatggattt gtaagtacta cgatactcaa ttcaatgcat 300

aaataccagc cacgtttcca tttggtgcga gccaatgaca tactcaagct gccgtactca 360

acatttcgga cgtatgtttt caaggagacg gaatttatag ccg 403

<210>3

<211>420

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 60

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 120

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 180

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 240

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 300

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 360

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 420

Claims

1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

2.编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列2。

3.含有权利要求2所述的DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

4.权利要求1所述的dsRNA或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下a1)-a8)中任一种中的应用：

a1)防治橘小实蝇；

a2)制备防治橘小实蝇的产品；

a3)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；

a4)制备防控橘小实蝇的入侵和/或扩散的产品；

a5)抑制橘小实蝇翅发育；

a6)制备抑制橘小实蝇翅发育的产品；

a7)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达；

a8)制备抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的产品。

5.一种抑制橘小实蝇翅发育的方法，是将抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的物质导入橘小实蝇，从而实现抑制橘小实蝇翅发育。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的物质为权利要求1所述的dsRNA。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述导入的方式为饲喂；

或，所述橘小实蝇为1龄橘小实蝇幼虫。

8.权利要求5-7任一所述的方法在如下b1)-b3)中任一种中的应用：

b1)防治橘小实蝇；

b2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；

b3)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达。

9.产品，其活性成分为如下c1)或c2)：

c1)权利要求1所述的dsRNA；

c2)权利要求2所述的DNA分子；

所述产品具有如下d1)-d4)中任一种功能：

d1)防治橘小实蝇；

d2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；

d3)抑制橘小实蝇翅发育；

d4)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达。

10.抑制橘小实蝇翅发育基因optomotor blind表达的物质，为如下e1)-e3)中任一种：

e1)权利要求1所述的dsRNA；

e2)权利要求2所述的DNA分子；

e3)权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。