CN102925460B

CN102925460B - 调控人参皂苷转运与积累的PgPDR1基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN102925460B
Application number: CN201210464442.2A
Authority: CN
Inventors: 罗志勇; 张儒; 祝捷; 黄景嘉; 陈湘晖; 罗俊
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2032-11-16
Also published as: CN102925460A

Abstract

本发明公开一种促进人参皂苷转运与积累相关基因PgPDR1及其编码蛋白和应用。该人参ABC转运蛋白基因PgPDR1序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究发现PgPDR1基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累有关。初步表明所述PgPDR1基因具有促进人参皂苷合成、转运和积累方面的功能。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参及其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参转基因细胞或植物生产原人参二醇、Rb、Re、Rh2、Rg2和Rg3等人参皂苷单体。

Description

调控人参皂苷转运与积累的PgPDR1基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及改良植物性状，具体是促人参皂苷生物合成、转运与积累的相关基因及其蛋白和应用。本发明在提高人参等植物中人参皂苷含量方面有着重要的应用价值。

背景技术

人参（P.ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属多年生草本植物，是名贵中药材。人参中含有多种药用成分，其中人参皂苷是人参最主要的活性成分。目前已从人参根中分离出50余种人参皂苷，现代医学研究证明各皂苷单体具有重要的药用价值，且已广泛应用于临床。但是其中一些具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性强的皂苷含量极低。近年来，国内外对利用人参细胞培养等技术生产人参皂苷进行了广泛和深入的研究，但其含量仍较低，远不能满足市场的需求。

在植物次生代谢调控中，可以通过导入关键酶等基因调控合成途径中的多步限速反应，并促进次生代谢产物的合成；或通过诱导跨膜转运蛋白将合成的代谢产物转运到细胞外或细胞器中得以积累，利用转运系统使合成代谢向积累方向转变，从而提高次生代谢产物含量。通过人参皂苷的转运机制，进而促进人参皂苷合成与积累，有望成为人参皂苷高产调控的新策略。

植物ABC（ATP-binding cassette transporter）转运蛋白是目前已知最大，功能最广泛的蛋白家族，ABC转运蛋白属跨膜运输蛋白，利用水解ATP释放的能量转运有机酸、生物碱、细胞代谢产物和药物等。参与细菌耐药性、次生代谢产物积累、胁迫反应和肿瘤抗药性等。ABC转运蛋白家族包括多向耐药性蛋白（pleiotropic drug resistance，PDR），多药耐药性蛋白（multidrug resistance，MDR）等。PDR是其中最大的亚族，是植物和真菌中特有的一种ABC转运蛋白。但目前对植物PDR基因相关研究甚少，离体细胞培养中，香紫苏醇可诱导NpPDR1基因上调表达，在细胞内NpPDR1蛋白累积增强了细胞向胞外转运香紫苏醇以及其类似物的能力。拟南芥（A.thaliana）细胞内香紫苏醇的累积亦能诱导AtPDR12基因上调表达，同时在细胞外检测到AtPDR12蛋白向胞外转运的香紫苏醇，推测萜类物质可能是AtPDR12基因表达的上游调控物质。因此，PDR蛋白可能通过转运内源性抗真菌二萜类物质参与植物防御反应。此外，尚无植物PDR蛋白转运更复杂萜类分子的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种能够调控人参皂苷转运与积累相关的基因、由该基因编码的蛋白及其应用，为今后开发基因工程产品奠定基础。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种调控人参皂苷转运与积累的PgPDR1基因，其基因序列如SEQ ID N0.1所示。

本发明还提供了一种用于扩增PgPDR1基因的简并引物对，所述引物对如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。

本发明还提供了含有PgPDR1基因重组载体，具体包括：植物表达载体pCAMBIA1301，即，将PgPDR1基因克隆到空载体pCAMBIA1301中，获得重组载体pCAMBIA1301-PgPDR1；原核表达载体pET28a，即，将PgPDR1基因克隆到空载体pET28a中，获得重组载体pET28a-PgPDR1。PgPDR1基因亦可克隆到其他空载体中，或制备成转基因细胞及重组菌。

本发明还提供了PgPDR1基因在调控人参皂苷转运与积累中的应用；PgPDR1基因在人参育种中的应用。

本发明还提供了一种由SEQ ID N0.1所示PgPDR1基因编码的蛋白，该蛋白的序列如SEQ ID N0.2所示。

本发明还提供了SEQ ID N0.2所示蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用，以及该蛋白在人参育种中的应用。

本发明利用现有的植物基因工程技术，利用植物PDR基因同源性设计简并引物，采用简并引物PCR技术和RACE等方法分离与鉴定人参皂苷转运与积累相关的基因序列，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过异源表达鉴定证明PgPDR1基因对人参皂苷的转运功能。本发明人参ABC转运蛋白基因PgPDR1序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究发现PgPDR1基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累有关。初步表明所述PgPDR1基因具有促进人参皂苷合成、转运和积累方面的功能。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参甚至其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参组织培养或转基因植物生产Rb、Re和Rg等人参皂苷单体。

附图说明

图1是本发明通过简并引物扩增的人参PDR基因片段图示；图中，1表示简并引物PCR扩增产物，M表示Marker；

图2是本发明通过简并引物扩增的人参PDR基因片段推测氨基酸序列比对及结构域图；

图3是本发明的PCR扩增PgPDR1基因图示；图中，1表示PCR扩增PgPDR1全长序列产物，M表示Marker；

图4是本发明的PgPDR1蛋白跨膜结构域预测图；

图5是本发明的PgPDR1基因编码氨基酸序列及其与其它植物PDR基因同源性比较图；

图6是本发明的PgPDR1基因编码氨基酸序列进化树分析图；

图7是本发明的PgPDR1基因在人参不同组织中的表达水平图；

图8是本发明的PgPDR1基因在100μM MeJA诱导下的人参细胞中表达水平图。

具体实施方式

实施实例1PgPDR1基因的获得

1、人参悬浮细胞培养

（1）取吉林长白山人参产区四年生人参根，自来水浸泡45min后冲洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒（sec），无菌水冲洗2次，无菌室超净工作台上用0.1%HgCl2消毒，不断搅动，无菌蒸馏水冲洗4-5次。

（2）在无菌条件下，将消毒过的外植体接种到含有2，4-D（2.0mg/L）和KT（0.5mg/L）的MS培养基中。经3次继代培养后外植体完全脱分化，待完全形成愈伤组织后，每100ml三角瓶接种6个外植体，培养条件如前述，培养45天（d）后将愈伤组织行继代培养，以补充培养物所需的营养物质和其它要求。接种30d后进行第一次继代培养，以后每3-4周继代一次。

（3）当得到愈伤组织后，将其转入到MS液体培养基中。愈伤组织块直径应小于3mm。若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在50ml的锥形瓶内，每10ml液体培养基接种1.5-2.0g愈伤组织，接种后震荡培养，120rpm，24℃，暗培养。每隔4-7d继代一次。

2、细胞处理及其RNA提取

（1）细胞处理

1）取460μL茉莉酸甲酯（MeJA）溶于4540μL乙醇，加5ml双蒸水至10ml，配成10ml 200mM的MeJA母液，用0.22μm的滤器过滤除菌。

2）在悬浮细胞继代的48h后，10ml液体培养基加入10μL母液至终浓度为200μM，120rpm，24℃，振荡暗培养，培养24h后提取人参细胞的总RNA。

（2）人参悬浮细胞总RNA提取

①3000×g离心5min收集的悬浮细胞，在研钵内用液氮充分研磨成粉末。每40mg研磨的粉末置于1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol试剂，40μL β-巯基乙醇，用移液器吸头重悬细胞沉淀，室温孵育5-10min。

②加入0.2ml氯仿，振摇l5sec，室温孵育10-15min。

③4℃、12000×g离心15min，收集上层无色水相于1.5ml离心管中，勿吸动中间层，弃沉淀。

④加入0.4ml 3mol/L醋酸铵（pH 5.2），0.6ml异丙醇，轻柔振荡混匀，室温孵育5-10min（RNA沉淀）。4℃、12000×g离心10min，弃上清。

⑤加入1ml 75％乙醇并振荡；4℃，7500×g离心5min，弃上清，重复该步骤。

⑥空气中干燥10min，加入20μL DEPC水溶解RNA。

⑦RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在0.5×TBE中进行，琼脂糖浓度为1％（每100ml凝胶中加入2.5μL的10mg/ml EB），4μL上样量，8v/cm恒压40min，然后在紫外凝胶成像系统中观察所提取RNA的完整性。

3、cDNA合成

纯化mRNA后，以o1igo(dT)为引物，M-MuLV反转录酶反转录总mRNA。

（1）反应体系如下:

（2）轻柔搅拌混匀；室温放置10min后，移至恒温水浴箱；42℃，1h；结束后，冰上冷却2min。

4、简并引物PCR扩增

（1）简并引物设计与合成

利用Bioedit软件对已报道的6种植物PDR基因序列烟草（NpPDR1，AJ404328和NtPDR1，AB109388.1）、拟南芥（AtPDR1，BK001001和AtPDR12，BK0010011）、(SpTUR2，Z70524）和小麦（TaPDR1，FJ185035）进行同源性比对，找出高度保守的区域，采用Primer 5.0软件设计简并引物如下：

P1：5′-CCAGGNGTDCTNACNGCNYTNATG-3′；（SEQ ID N0.3）

P2：5′-CATCCANGTYGCYGGRTTGTANCC-3′。（SEQ ID N0.4）

引物由上海英骏生物有限公司合成。

（2）PCR扩增

以cDNA为模板，用简并引物P1、P2进行“touchdown”PCR扩增。

反应体系为：10×PCR缓冲液5μL、MgCl₂（25mmol/L）3μL、dNTP（2.5mmol/L）8μL、P1（20μmol/L）2μL、P2（20μmol/L）2μL、cDNA 2μL、dd H₂O27.5μL和LATaq DNApolymerase（5U/μL）0.5μL。

反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、45℃退火2min、72℃延伸2min，2个循环；94℃变性30s、42℃退火2min、72℃延伸2min，2个循环；94℃变性30s、40℃退火2min、72℃延伸2min，2个循环；94℃变性30s、50℃退火2min、72℃延伸2min，26个循环；72℃延伸10min。1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

（3）扩增片段胶回收、连接、测序及分析

将PCR产物胶回收后连接至pGEM-T Easy载体上，并转化大肠杆菌DH5α。PCR初步鉴定正确后，将重组质粒pGEM-PDR送上海英骏公司测序。测序后获得2条序列长度均为693bp的基因片段，测序结果利用NCBI中的Blast工具与GenBank的dbEST数据库和蛋白数据库进行同源性比对，与其他植物PDR基因高度同源。

4、cDNA全长扩增

根据简并引物扩增获得的693bp PDR基因序列设计5′端和3′端扩增引物，5′-RACE引物（GSP5-3）和3′-RACE引物（GSP3-3）分别为：

GSP5-3：5′-CAACCTCAGCCAAGCCGAGTAGA-3′；（SEQ ID N0.5）

GSP3-3：5′-GTTCTCACTGCTCTAATGGGTGTC-3′。（SEQ ID N0.6）

①RNA提取及其反转录

RNA提取采用上述方法进行，反转录采用SMART RACE cDNA AmplificationKit中反转录酶和引物。

②5′端扩增反应体系

③5′端扩增反应条件

94℃ 2min，1cycles:

94℃ 30sec，72℃ 4min 30sec，5cycles;

94℃ 30sec，70℃ 30sec，72℃ 4min 30sec，5cycles;

94℃ 30sec，68℃ 30sec，72℃ 4min 30sec，20cycles

④3′端扩增体系

⑤3′端扩增反应条件

94℃ 2min，1cycles:

94℃ 30sec，72℃ 2min，5cycles;

94℃ 30sec，70℃ 30sec，72℃ 2min，5cycles;

94℃ 30sec，68℃ 30sec，72℃ 2min，20cycles

⑥电泳及其测序

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收并与pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α，提取单菌落质粒。对质粒进行双酶切鉴定和PCR检测，检测无误后送上海英骏公司测序。测序后获得5′端cDNA长度为3005bp，3′端cDNA长度为1875bp，经拼接后得到包含完整编码框的全长为4652bp的序列（PgPDR1），提交到Genbank，登录号为KC013236。

5、序列分析

经过测序成功获得了长度为4652bp的cDNA序列，利用NCBI中在线分析工具BLAST和ORF Finder（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）进行比较和ORF查找发现该序列中CDS序列长度为4344bp，对其编码的氨基酸序列采用CLUSTAL X软件分析比较，与其他植物PDR基因如大豆（GmPDR1，XM003546171）、烟草（NpPDR1，AJ404328；NtPDR1，AB109388.1和NpPDR2，BAD07484.1）、水稻（OsPDR1，AJ535054；OsPDR2，AJ535053和OsPDR3，AJ535052）有较高同源性。利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在线分析软件分析跨膜结构域，结果显示该蛋白为跨膜蛋白。并使用MEGA4软件以邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发生树。系统树中分支的置信水平用自引导值（Bootstrap test）估计，重复1000次，结果显示该基因与大豆的PDR基因亲缘性最近，其次是烟草和水稻。

6、表达分析

取新鲜的人参的根、不定根、芽、种子和发根，分别提取RNA；再以100μMMeJA分别诱导人参根0、1、3、6、12和24h，提取各时间点人参根总RNA。以oligod（T）18为引物，AMV反转录酶合成cDNA，并以β-actin为内参，利用real-time PCR扩增PgPDR1基因，PgPDR1和β-actin扩增引物分别为：

PgPDR1：F：5′-TGCCTGTGTGGTGGAGATGGT-3′；（SEQ ID N0.7）

R：5′-TGAAGCCGACTACCGCAGATCCA-3′；（SEQ ID N0.8）

β-actin：F：5′-CGTGATCTTACAGATAGCTTCATGA-3′；（SEQ ID N0.9）

R：5′-AGAGAAGCTAAGATTGATCCTCC-3′。（SEQ ID N0.10）

反应体系为：

采用两步法PCR扩增标准程序:95℃30sec；95℃40sec，60℃30sec共40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃15sec。每个样品三次重复。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，采用2^-ΔΔCt方法计算PgPDR1基因在不同组织和MeJA诱导下不同时间表达水平的差异。结果显示其在发根中表达最高，其次是种子、不定根和根，芽中表达最低。MeJA可以显著诱导人参皂苷的合成，PgPDR1基因表达随诱导时间增加不断增加，与人参皂苷的合成与积累变化规律一致。

实施实例2表达载体的构建及转化

1、植物过表达载体的构建及转基因植株筛选

（1）分别用BglII和Nhe I双酶切pCAMBIA1301和PgPDR1，回收pCAMBIA1301载体和PgPDR1基因片段。将两片段连接并转化DH5α，筛选出重组子，重组质粒命名为pCAMBIA1301-PgPDR1。其中扩增PgPDR1基因的上下游引物分别为：

PgPDR1：F1:5′-GGAAGATCTTCC ATGGACGGAAGTAATCTGTA-3′；（SEQ IDN0.11）

R1:5′-CTAGCTAGCTAGCTATCGCCTTTGGAAGTTGA-3′。（SEQ ID N0.12）

其中划线部分为BglII和Nhe I酶切位点。

（2）根癌农杆菌感受态细胞的制备

①在含有100μg/ml利福霉素的YEB平板上划线培养农杆菌LBA4404，28℃暗培养2d。

②挑取单菌落接种到含有100μg/ml利福霉素的YEB培养基中，28℃振荡培养过夜。

③将过夜活化的农杆菌按l:50的比例稀释到50ml含有100μg/ml的卡那霉索的YEB培养基中，28℃振荡培养至OD600约为0.4-0.6，冰浴30min。

④于4℃，5000rpm离心10min，弃上清液，用10ml 0.15mM NaCl悬浮菌体。

⑤于4℃，5000rpm离心10min，弃上清液，用2ml 20mM CaCl₂悬浮菌体。

⑥每管200μL分装，液氮速冻，-70℃保存。

（3）根癌农杆菌感受态细胞的转化

①将根癌农杆菌感受态细胞置于冰上，缓慢解冻。

②加入0.5μgpCAMBIA1301-PgPDR1质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min。

③置液氮中冷冻2min，迅速移入37℃水浴中热激5min，再迅速冰浴2min，之后加入800μL YEB液体培养基，于28℃振荡培养3-4h。

④5000rpm离心5min沉淀菌体，弃掉800μL上清后重新悬浮菌体，均匀涂布于含有100μg/ml利福霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB培养基上，28℃培养2-3d。

（4）根癌农杆菌质粒提取和鉴定

①PCR鉴定

挑取转化的农杆菌单菌落接种于1.5ml含卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养，用PgPDR1基因特异性引物：

PgPDR1：F：5′-TGCCTGTGTGGTGGAGATGGT-3′；（SEQ ID N0.7）

R：5′-TGAAGCCGACTACCGCAGATCCA-3′；（SEQ ID N0.8）

PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。PCR反应程序如下：94℃30sec，55℃45sec，72℃30sec，35个循环；72℃2min。

②酶切鉴定

挑取农杆菌单菌落接种于含有100μg/ml的利福霉素和50μg/ml的卡那霉素的YEB培养基中，28℃培养过夜培养，提取重组质粒pCAMBIA1301-PgPDR1，采用上述方法以BglII和Nhe I双酶切提取的质粒。

（5）含pCAMBIA1301-PgPDR1质粒的根癌农杆菌培养

28℃划线培养含有pCAMBIA1301-PgPDR1质粒的农杆菌约2d。挑取单菌落接种于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，至OD600约为0.6时收集菌液，4000rpm离心10min，沉淀重悬于1/2MS液体培养基中。

（6）叶盘法侵染烟草

将烟草幼叶置于自来水中冲洗3-4次，然后在70％乙醇中浸泡30-60sec，10％次氯酸钠中消毒10-20min，再用无菌水充分冲洗，然后置于无菌培养皿中，将叶片切成0.5-l cm2的小片，将剪好的叶片分别放入含有pCAMBIA1301-PgPDR1质粒的农杆菌菌液中侵染5min，将叶片上的菌液用无菌滤纸吸干。

（7）共培养

侵染过并吸干表面菌液的叶盘，气孔面朝上，紧靠着放在共培养基上（MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L），黑暗处培养2d。

（8）筛选及分化培养

暗培养2d后，转换到筛选分化培养基上（MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L+Kan 100mg/L+Cef300mg/L），每15d换一次筛选分化培养基，至分化出的烟草长至3-5cm时转至生根培养基中。

（9）生根培养

将分化至3-5cm的烟草分别切下，转移至生根培养基（1/2MS+IBA 2.0mg/L）。

（10）移栽

当再生植株的根长至5-8cm时，打开封口膜炼苗2-3d，将幼苗移栽至花盆内，移栽后最初的5-l0d罩上透明塑料，保持90%-100%的湿度，并在罩上打些小孔以利于气体交换。移栽的基质以及花盆均预先消毒。

（7）转基因植株PCR鉴定

以转基因植株的基因组DNA为模板，采用上述重组质粒鉴定所用的PgPDR1基因特异性引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同上。经鉴定得到分化成苗的T₀代阳性转基因植株。

2、转运功能鉴定

取转PgPDR1基因的烟草幼叶，采用上述相同方法诱导产生悬浮细胞，利用人参皂苷饲喂及比较植物功能基因组学技术，通过通过气相色谱-质谱联用(gaschromatography-mass spectrometry，GC/MS)法直接定量测定并比较分析转基因烟草培养系中人参皂苷化学成分谱表型的改变，确定PgPDR1转运蛋白对人参皂苷的转运功能。

3、原核表达分析

（1）PCR扩增

以已扩增的PgPDR1基因为模板，以上下游分别添加BamH I和Hind III酶切位点序列的引物进行扩增，其扩增所用的引物如下（划线部分分别为BamH I和HindIII酶切位点）：

5′-CGGGAATTCATGGACGGAAGTAATCTGTA-3′（SEQ ID N0.13）

5′-CCCAAGCTTGGGCTATCGCCTTTGGAAGTTGA-3′（SEQ ID N0.14）

反应体系同上，PCR反应程序如下：94℃30sec，55℃45sec，72℃4min 30sec，35个循环；72℃10min。

（2）酶切、连接转化及其筛选

分别用BamH I和Hind III双酶切pET28a和PCR产物，回收pET28a和PCR产物片段。将两片段连接并转化BL21，通过卡那霉素筛选、PCR扩增和酶切鉴定出重组子，重组质粒命名为pET28a-PgPDR1。

（3）PgPDR1蛋白诱导表达及其功能分析

挑取含有重组pET28a-PgPDR1质粒的菌落BL21(DE3)，至l0ml LB（含Kan 50μg/ml）中37℃过夜培养。取l ml菌液加入到含100m1LB培养基(含Kan 50μg/ml)，37℃震荡培养至OD600约为0.4-0.6。加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导，每隔1h收集一次菌液，5000×g离心10min，收获沉淀，以1g菌体加入4ml PBS缓冲液的比例重悬，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴5min取上清进行SDS-PAGE分析。

选取PgPDR1蛋白表达量高的时间点，加入人参皂苷等底物，分析PgPDR1蛋白的转运功能，并结合His-tag进行蛋白纯化，体外解析其结构。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> 调控人参皂苷转运与积累的PgPDR1基因及其编码蛋白和应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4344

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atggacggaa gtaatctgta cagggcaagc aatagtatac ggcaaagcag caggagtagt 60

tcaagggaaa ggattggatt tggaagtttg agagcaggta gtacttcgat atggagagac 120

cagggtatgg acgttttctc taaatcatcg cgggatgaag atgatgaaga agcacttaaa 180

tgggcttccc ttgagaaact tcccactttt gatcgtttga ggaaaggcct gcttcttgga 240

tcgcagggtg ctggcttcaa tgaagtcgat gttgataatc ttggggttca gcagaggaag 300

aatttactcg agaggcttgt cagagttgcc gaagaagata atgagaagtt cttgttgaaa 360

ctcagggatc gaattgatag agttggagtt gatttgccca caatcgaagt cagattcgag 420

catttgagtg ttgaagcaga agctcatgtg gggagcagag ctttgccttc tttcttgaac 480

ttcagtatta gtatagtgga ggggttctta aacattttcc acttacttcg aaatacaaag 540

aagcatctaa ctatccttca agatgttagc ggaatcctca agccttgcag gatgactttg 600

cttttaggtc ctccaagttc tgggaagacc accctgatgc ttgctttggc tggaaagctt 660

gatcccaccc ttaggttttc tggaagggtg acttacaatg gccatggcat gcaagagttt 720

gtgccccaga gaacggctgc ctatatcagc caacatgatc tgcatatagg agaaatgact 780

gtgcgagaaa ccttggcttt ctctgcaaga tgccaggggg ttggatcacg ctacgaaatg 840

ttggcagagc tggcaagaag agagaaagat gcaaatatta agcctgatcc cgatgttgat 900

atctacatga aggctgccgc aacagcaggt caagaggcta gcgtggtcac agattatgtt 960

ctaaagattt tgggacttga tatctgtgca gatacaatgg taggtgatca aatgatcagg 1020

ggtatatctg gaggacagaa aaagcgtgtt acaacaggtg agatgttggt tggaccgtcg 1080

agggcacttt ttatggacga gatatctact ggtttggaca gttcgacaac ttttcaaatt 1140

gtgaattcac tgaagcacag tgtccacatt ctccaaggaa ctgctctcat ctctctcttg 1200

caaccagccc ctgaaactta tgatctgttt gatgacatta ttcttctatc tgatggccac 1260

atagtgtatc agggtccccg tgaacatgtg cttgagtttt tcgaatctat gggtttcaaa 1320

tgtccagaga gaaaaggtgt tgctgatttc ttgcaagaag taacatcaaa gaaagatcag 1380

aaacagtact ggctacacaa agatgagcct tacagattta ttacagctag agaatttgct 1440

gaggcttacc agtcatttca tgttggactc aaaatggtag atgatcttgc aatcccattt 1500

gacaagagca aaagccaccc agctgctttg acaacggaga agtatggtgt taacaagaag 1560

gagctcttga aagctctgac tgcaagagaa gttttgctta tgaagagaaa ctcatttgtt 1620

tacatattca aattgttcca acttaccact atggcagtga ttacaatgac actgttcctg 1680

agaactgagt tggaccaaag ttcgactacc gaaggagggt tatacatggg tgctctattt 1740

ttcgctgtgg ttatgctcat gtttaatggg ttggcagagc ttgccatgac aattgcaaag 1800

cttcctgtct tttacaagca gagggacctt ctcttttatc cttcatggtc atatgctctt 1860

ccatcatgga tcatcaagat acccgtaaca attttagaag ttgcagtctg ggtagtcctc 1920

acatattacg ttattggatt tgatccgaat gttggaagat tctttaaaca atacctagta 1980

cttttactca tcaaccaaat ggcttctgca ttgttccgga tgacgggggc attgggtagg 2040

accatgattc ttgcaaacac atttggggga tttgcattgc ttatactttt tgcattaggt 2100

ggatttgtcc tagcacgaga ggatgtagcg aaatggtgga tatggggtta ctattcgtca 2160

ccaatgatgt atgggatgaa tgcaattgca gtaaatgaat ttcttgggca tcaatggaac 2220

aaattaacta ccaatggaac tgagacaatt ggagttgcac ttttgaagtc tcgggggttc 2280

ttcccatatt catactggta ttggataggg acaggggcat tggttggatt cattttatta 2340

ctcaacttag gctacgcggt ggcacttgat tatcttaacc ctctggggaa gccacaagct 2400

attattccag agacaagtga ctctgaacaa gccggagaaa ccactgagtt atcgtctgaa 2460

ttatcatcca tgacagaatc caatgtcgaa accaaccaga acaagaaaaa aggaatgatt 2520

cttccatttg aaccacattc cattactttt gatgatatta aatattctgt tgacatgcca 2580

caggaaatga aagaacaagg tgttgttgaa gataaactgt tgcttctgaa gggtgtgagt 2640

ggagcattca ggccaggtgt tctcactgct ctaatgggtg tcagtggtgc tggtaaaaca 2700

actttgatgg atgtgctggc ggggaggaaa actggtggat atatagaggg aaacataaca 2760

atttctgggt atccaaagaa gcaggaaacc tttgctcgga tatctggata ctgtgagcag 2820

aacgacatcc actcacctca tgtaactgtc tacgagtcct tgctctactc ggcttggctg 2880

aggttgcctt cagaagttga ctctacaact agaaagatgt tcgtcgatga ggtcctggat 2940

ttagttgagc tgaactcgtt gaagaacgga ctaattgggt tgccaggtgt aaatggtctc 3000

tcaaccgagc agcgcaagag gctaaccatt gcagttgagc tggttgcaaa cccctccata 3060

atattcatgg atgagccaac ttcagggctg gatgcaagag ctgctgcaat cgtgatgaga 3120

acagttagga atactgtgga cacgggaagg actgttgttt gcactatcca tcaaccaagc 3180

attgacatat ttgaagcgtt tgatgagctt ttcctcatga agcgtggagg actggagtta 3240

tatgcaggac cagttggacg gcaatcttgt gagctaatca agtactttga ggatattgaa 3300

ggaataagta aaatcaaaga cggatataat ccagccacct ggatgttaga agttactaca 3360

tctgctcaag aaatggttct ggggattgat ttcactgaag tgtacagaaa ttcaaatttg 3420

tacaggagaa acaaagaact tattaaagaa ttaagtacac atcgttctgg ttccaaagat 3480

ctctattttc ctactcagta ctcgcaatct ttcatcactc aatgcgtggc ttgcctatgg 3540

aaacaacgat gctcatattg gagaaacaca tcttatactg cagtgagatt tctcttcaca 3600

accgccatag ctttgatgtt tgggtcgatg ttctgggacc ttggttccaa aatggatagt 3660

caacaagatc tctccagtgc aatgggttct atgtatgcgg cttgcctctt cctcggggtc 3720

caaaatgcat catccgtgca gccagtggta gccgtagaaa gaacagtgtt ttacagagaa 3780

agagctgccg gaatgtattc agctttgcca tatgcctttg cacaggtttt ggtagaagta 3840

ccatatgttc tagcacaagc ttcggtatat ggtcttatcg tttatgcaat gattggattt 3900

gaatggacag cagtgaaatt cttttggtat ttattcttca tgttcttcac attcctatac 3960

ttcaccctct atggcatgat gaccgtggca gtgactccca acgcggacat tgctgctatt 4020

attgctgcag cattttatgc catatggaat ctcttttcag gatatataat cccgcgacct 4080

agtatgcccg tgtggtggag atggtatgct tgggtatgcc cagttgctta cacattgtac 4140

ggtctgcttg cgtcgcaatt tggagacatt gaagacaaga cccttgtgga cgtgaagaaa 4200

agtgtaaagg tgttcattga agattattat gggtttgaac atggtaatgt ttggattgct 4260

ggatctgcgg tagtcggctt cactgttgtt tttgccttca cctttgcctt ctccatcaag 4320

gcattcaact tccaaaggcg atag 4344

<210> 2

<211> 1447

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Asp Gly Ser Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Asn Ser Ile Arg Gln Ser

1 5 10 15

Ser Arg Ser Ser Ser Arg Glu Arg Ile Gly Phe Gly Ser Leu Arg Ala

20 25 30

Gly Ser Thr Ser Ile Trp Arg Asp Gln Gly Met Asp Val Phe Ser Lys

35 40 45

Ser Ser Arg Asp Glu Asp Asp Glu Glu Ala Leu Lys Trp Ala Ser Leu

50 55 60

Glu Lys Leu Pro Thr Phe Asp Arg Leu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Gly

65 70 75 80

Ser Gln Gly Ala Gly Phe Asn Glu Val Asp Val Asp Asn Leu Gly Val

85 90 95

Gln Gln Arg Lys Asn Leu Leu Glu Arg Leu Val Arg Val Ala Glu Glu

100 105 110

Asp Asn Glu Lys Phe Leu Leu Lys Leu Arg Asp Arg Ile Asp Arg Val

115 120 125

Gly Val Asp Leu Pro Thr Ile Glu Val Arg Phe Glu His Leu Ser Val

130 135 140

Glu Ala Glu Ala His Val Gly Ser Arg Ala Leu Pro Ser Phe Leu Asn

145 150 155 160

Phe Ser Ile Ser Ile Val Glu Gly Phe Leu Asn Ile Phe His Leu Leu

165 170 175

Arg Asn Thr Lys Lys His Leu Thr Ile Leu Gln Asp Val Ser Gly Ile

180 185 190

Leu Lys Pro Cys Arg Met Thr Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ser Ser Gly

195 200 205

Lys Thr Thr Leu Met Leu Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Pro Thr Leu

210 215 220

Arg Phe Ser Gly Arg Val Thr Tyr Asn Gly His Gly Met Gln Glu Phe

225 230 235 240

Val Pro Gln Arg Thr Ala Ala Tyr Ile Ser Gln His Asp Leu His Ile

245 250 255

Gly Glu Met Thr Val Arg Glu Thr Leu Ala Phe Ser Ala Arg Cys Gln

260 265 270

Gly Val Gly Ser Arg Tyr Glu Met Leu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Glu

275 280 285

Lys Asp Ala Asn Ile Lys Pro Asp Pro Asp Val Asp Ile Tyr Met Lys

290 295 300

Ala Ala Ala Thr Ala Gly Gln Glu Ala Ser Val Val Thr Asp Tyr Val

305 310 315 320

Leu Lys Ile Leu Gly Leu Asp Ile Cys Ala Asp Thr Met Val Gly Asp

325 330 335

Gln Met Ile Arg Gly Ile Ser Gly Gly Gln Lys Lys Arg Val Thr Thr

340 345 350

Gly Glu Met Leu Val Gly Pro Ser Arg Ala Leu Phe Met Asp Glu Ile

355 360 365

Ser Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Thr Phe Gln Ile Val Asn Ser Leu

370 375 380

Lys His Ser Val His Ile Leu Gln Gly Thr Ala Leu Ile Ser Leu Leu

385 390 395 400

Gln Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Asp Leu Phe Asp Asp Ile Ile Leu Leu

405 410 415

Ser Asp Gly His Ile Val Tyr Gln Gly Pro Arg Glu His Val Leu Glu

420 425 430

Phe Phe Glu Ser Met Gly Phe Lys Cys Pro Glu Arg Lys Gly Val Ala

435 440 445

Asp Phe Leu Gln Glu Val Thr Ser Lys Lys Asp Gln Lys Gln Tyr Trp

450 455 460

Leu His Lys Asp Glu Pro Tyr Arg Phe Ile Thr Ala Arg Glu Phe Ala

465 470 475 480

Glu Ala Tyr Gln Ser Phe His Val Gly Leu Lys Met Val Asp Asp Leu

485 490 495

Ala Ile Pro Phe Asp Lys Ser Lys Ser His Pro Ala Ala Leu Thr Thr

500 505 510

Glu Lys Tyr Gly Val Asn Lys Lys Glu Leu Leu Lys Ala Leu Thr Ala

515 520 525

Arg Glu Val Leu Leu Met Lys Arg Asn Ser Phe Val Tyr Ile Phe Lys

530 535 540

Leu Phe Gln Leu Thr Thr Met Ala Val Ile Thr Met Thr Leu Phe Leu

545 550 555 560

Arg Thr Glu Leu Asp Gln Ser Ser Thr Thr Glu Gly Gly Leu Tyr Met

565 570 575

Gly Ala Leu Phe Phe Ala Val Val Met Leu Met Phe Asn Gly Leu Ala

580 585 590

Glu Leu Ala Met Thr Ile Ala Lys Leu Pro Val Phe Tyr Lys Gln Arg

595 600 605

Asp Leu Leu Phe Tyr Pro Ser Trp Ser Tyr Ala Leu Pro Ser Trp Ile

610 615 620

Ile Lys Ile Pro Val Thr Ile Leu Glu Val Ala Val Trp Val Val Leu

625 630 635 640

Thr Tyr Tyr Val Ile Gly Phe Asp Pro Asn Val Gly Arg Phe Phe Lys

645 650 655

Gln Tyr Leu Val Leu Leu Leu Ile Asn Gln Met Ala Ser Ala Leu Phe

660 665 670

Arg Met Thr Gly Ala Leu Gly Arg Thr Met Ile Leu Ala Asn Thr Phe

675 680 685

Gly Gly Phe Ala Leu Leu Ile Leu Phe Ala Leu Gly Gly Phe Val Leu

690 695 700

Ala Arg Glu Asp Val Ala Lys Trp Trp Ile Trp Gly Tyr Tyr Ser Ser

705 710 715 720

Pro Met Met Tyr Gly Met Asn Ala Ile Ala Val Asn Glu Phe Leu Gly

725 730 735

His Gln Trp Asn Lys Leu Thr Thr Asn Gly Thr Glu Thr Ile Gly Val

740 745 750

Ala Leu Leu Lys Ser Arg Gly Phe Phe Pro Tyr Ser Tyr Trp Tyr Trp

755 760 765

Ile Gly Thr Gly Ala Leu Val Gly Phe Ile Leu Leu Leu Asn Leu Gly

770 775 780

Tyr Ala Val Ala Leu Asp Tyr Leu Asn Pro Leu Gly Lys Pro Gln Ala

785 790 795 800

Ile Ile Pro Glu Thr Ser Asp Ser Glu Gln Ala Gly Glu Thr Thr Glu

805 810 815

Leu Ser Ser Glu Leu Ser Ser Met Thr Glu Ser Asn Val Glu Thr Asn

820 825 830

Gln Asn Lys Lys Lys Gly Met Ile Leu Pro Phe Glu Pro His Ser Ile

835 840 845

Thr Phe Asp Asp Ile Lys Tyr Ser Val Asp Met Pro Gln Glu Met Lys

850 855 860

Glu Gln Gly Val Val Glu Asp Lys Leu Leu Leu Leu Lys Gly Val Ser

865 870 875 880

Gly Ala Phe Arg Pro Gly Val Leu Thr Ala Leu Met Gly Val Ser Gly

885 890 895

Ala Gly Lys Thr Thr Leu Met Asp Val Leu Ala Gly Arg Lys Thr Gly

900 905 910

Gly Tyr Ile Glu Gly Asn Ile Thr Ile Ser Gly Tyr Pro Lys Lys Gln

915 920 925

Glu Thr Phe Ala Arg Ile Ser Gly Tyr Cys Glu Gln Asn Asp Ile His

930 935 940

Ser Pro His Val Thr Val Tyr Glu Ser Leu Leu Tyr Ser Ala Trp Leu

945 950 955 960

Arg Leu Pro Ser Glu Val Asp Ser Thr Thr Arg Lys Met Phe Val Asp

965 970 975

Glu Val Leu Asp Leu Val Glu Leu Asn Ser Leu Lys Asn Gly Leu Ile

980 985 990

Gly Leu Pro Gly Val Asn Gly Leu Ser Thr Glu Gln Arg Lys Arg Leu

995 1000 1005

Thr Ile Ala Val Glu Leu Val Ala Asn Pro Ser Ile Ile Phe Met

1010 1015 1020

Asp Glu Pro Thr Ser Gly Leu Asp Ala Arg Ala Ala Ala Ile Val

1025 1030 1035

Met Arg Thr Val Arg Asn Thr Val Asp Thr Gly Arg Thr Val Val

1040 1045 1050

Cys Thr Ile His Gln Pro Ser Ile Asp Ile Phe Glu Ala Phe Asp

1055 1060 1065

Glu Leu Phe Leu Met Lys Arg Gly Gly Leu Glu Leu Tyr Ala Gly

1070 1075 1080

Pro Val Gly Arg Gln Ser Cys Glu Leu Ile Lys Tyr Phe Glu Asp

1085 1090 1095

Ile Glu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Asp Gly Tyr Asn Pro Ala Thr

1100 1105 1110

Trp Met Leu Glu Val Thr Thr Ser Ala Gln Glu Met Val Leu Gly

1115 1120 1125

Ile Asp Phe Thr Glu Val Tyr Arg Asn Ser Asn Leu Tyr Arg Arg

1130 1135 1140

Asn Lys Glu Leu Ile Lys Glu Leu Ser Thr His Arg Ser Gly Ser

1145 1150 1155

Lys Asp Leu Tyr Phe Pro Thr Gln Tyr Ser Gln Ser Phe Ile Thr

1160 1165 1170

Gln Cys Val Ala Cys Leu Trp Lys Gln Arg Cys Ser Tyr Trp Arg

1175 1180 1185

Asn Thr Ser Tyr Thr Ala Val Arg Phe Leu Phe Thr Thr Ala Ile

1190 1195 1200

Ala Leu Met Phe Gly Ser Met Phe Trp Asp Leu Gly Ser Lys Met

1205 1210 1215

Asp Ser Gln Gln Asp Leu Ser Ser Ala Met Gly Ser Met Tyr Ala

1220 1225 1230

Ala Cys Leu Phe Leu Gly Val Gln Asn Ala Ser Ser Val Gln Pro

1235 1240 1245

Val Val Ala Val Glu Arg Thr Val Phe Tyr Arg Glu Arg Ala Ala

1250 1255 1260

Gly Met Tyr Ser Ala Leu Pro Tyr Ala Phe Ala Gln Val Leu Val

1265 1270 1275

Glu Val Pro Tyr Val Leu Ala Gln Ala Ser Val Tyr Gly Leu Ile

1280 1285 1290

Val Tyr Ala Met Ile Gly Phe Glu Trp Thr Ala Val Lys Phe Phe

1295 1300 1305

Trp Tyr Leu Phe Phe Met Phe Phe Thr Phe Leu Tyr Phe Thr Leu

1310 1315 1320

Tyr Gly Met Met Thr Val Ala Val Thr Pro Asn Ala Asp Ile Ala

1325 1330 1335

Ala Ile Ile Ala Ala Ala Phe Tyr Ala Ile Trp Asn Leu Phe Ser

1340 1345 1350

Gly Tyr Ile Ile Pro Arg Pro Ser Met Pro Val Trp Trp Arg Trp

1355 1360 1365

Tyr Ala Trp Val Cys Pro Val Ala Tyr Thr Leu Tyr Gly Leu Leu

1370 1375 1380

Ala Ser Gln Phe Gly Asp Ile Glu Asp Lys Thr Leu Val Asp Val

1385 1390 1395

Lys Lys Ser Val Lys Val Phe Ile Glu Asp Tyr Tyr Gly Phe Glu

1400 1405 1410

His Gly Asn Val Trp Ile Ala Gly Ser Ala Val Val Gly Phe Thr

1415 1420 1425

Val Val Phe Ala Phe Thr Phe Ala Phe Ser Ile Lys Ala Phe Asn

1430 1435 1440

Phe Gln Arg Arg

1445

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

ccaggngtdc tnacngcnyt natg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

catccangty gcyggrttgt ancc 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

caacctcagc caagccgagt aga 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

gttctcactg ctctaatggg tgtc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

tgcctgtgtg gtggagatgg t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

tgaagccgac taccgcagat cca 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

cgtgatctta cagatagctt catga 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

agagaagcta agattgatcc tcc 23

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

ggaagatctt ccatggacgg aagtaatctg ta 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 智人

<400> 12

ctagctagct agctatcgcc tttggaagtt ga 32

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

cgggaattca tggacggaag taatctgta 29

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 智人

<400> 14

cccaagcttg ggctatcgcc tttggaagtt ga 32

Claims

1.一种调控人参皂苷转运与积累的PgPDR1基因，其特征在于，所述PgPDR1基因序列如SEQ ID N0.1所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述PgPDR1基因的引物对，其特征在于，所述引物对如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。

3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的PgPDR1基因。

4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET28a或pCAMBIA1301。

5.根据权利要求1所述PgPDR1基因在调控人参皂苷转运与积累中的应用。

6.根据权利要求1所述PgPDR1基因在人参育种中的应用。