CN114395563A - 调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种调控人参细胞中JA‑Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与应用，该调控人参细胞中JA‑Ile转运的PgABCG11基因序列如SEQ ID NO.1所示，PgABCG11基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从多个人参ABCG基因中筛选到编码的蛋白质能够转运茉莉酸‑异亮氨酸复合物(JA‑Ile)的PgABCG11基因。筛选得到的PgABCG11基因编码蛋白参与JA‑Ile转运至细胞核，可以显著增加人参细胞内源性JA‑Ile在细胞核中的含量，从而影响人参皂苷生物合成途径中一系列酶的表达，并且最终实现人参皂苷的大量合成与积累，达到提高人参皂苷产量和提升人参品质的目的。该基因及其编码的蛋白是一种高效、特异性和切实可行的提高人参细胞核中JA‑Ile含量的方法，在增加人参皂苷含量方面有着重要应用前景。

Description

调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与 应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

人参皂苷是我国名贵中药人参(Panax ginseng C.A.Meyer)中最重要的药效成分。目前，已经分离并鉴定结构的人参皂苷有超过50种，其中包括人参皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、CK和CM等。大量的研究发现许多人参皂苷单体在抗肿瘤、抗衰老和增强免疫力等方面具有十分独特的药理作用。高品质的人参资源是其在医药领域发挥优势的物质基础，然而，野生的人参资源匮乏，人工种植的人参中人参皂苷含量低，使得优质人参产业化发展受到限制。具有高含量的人参皂苷是高品质人参资源的重要保证。然而，人参中人参皂苷的组成与含量受多种因素的影响，其中最重要的因素是人参皂苷受其生物合成酶基因及相关的调控基因的高度调节，而这些基因又受到植物体内的重要生物信息素如茉莉酸类化合物(jasmonates，JAs)的调节。

JAs作为重要的生物信号分子参与植物生长发育的多种生理过程调控，在此过程中通常会激发一系列防御性次生代谢产物的合成。JAs是植物受外界刺激后反应最快的植物激素，常作为外源性的诱导剂或信号分子，用以提高植物中的次生代谢产物含量。研究发现，在人参中施加JAs可以提高人参皂苷生物合成途径中的关键酶基因如FPS、SS、SE、DDS、β-AS和P450等基因的表达水平，实现人参皂苷含量的提高。在JAs当中，茉莉酸(jasmonicacid，JA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和茉莉酸-异亮氨酸复合物(jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile)是具有高活性的几种小分子激素，JA-Ile是三者中最具活性的分子。

然而，外源性的加入JAs诱导次生代谢产物合成的同时，会带来一些新问题，比如难以精准控制施加的量和时机，通常也会对细胞的生长产生明显抑制，进而影响次生代谢产物的产量，通过激活内源性的茉莉酸类物质的合成是解决上述问题的重要方法之一。JA-Ile是JAs中最后起到调控JA响应基因的最重要的效应分子，通过分子水平精准控制JA-Ile对JA响应基因的调控很重要。在JA-Ile发挥作用的过程中，先是JA合成的前体物质OPDA在叶绿体中合成，随后进入过氧化物酶体中生成JA，而后生成的JA被运送到细胞质中合成茉莉酸-异亮氨酸(JA-Ile)，JA-Ile需要经过转运进入细胞核后，JA-Ile促进泛素连接酶复合物(SCFCOI1)与JAZ蛋白形成复合物，然后26S蛋白酶就会把JAZ蛋白水解，之前被抑制活性的转录因子MYC等就会被释放出来，从而激活下游基因的表达，进而影响不同的次级代谢途径。

在上述的JA-Ile调控通路中，JA-Ile与其受体的结合，离不开JA-Ile在细胞以及亚细胞器间的运输。而转运蛋白通过将其运出或运入细胞以及亚细胞器，调控JA-Ile在细胞内分布对JA-Ile发挥其功能至关重要。研究发现，拟南芥和水稻细胞质膜上存在ABC转运蛋白AtABCG25和OsABCG27参与ABA的外运；在酵母细胞和BY2细胞中，AtABCG40也具有内运ABA的功能，AtABCG40在ABA信号途径中很重要。ABC转运蛋白ABCC亚家族的MRP4也参与JA结构同系物前列腺素在动物细胞中的外运。可见JAs在细胞内的运输同样需要膜上的转运蛋白参与。JA-Ile作为JA信号途径中最重要的小分子，对于人参皂苷产量和提升人参品质具有重要意义，因此研究人参中是否同样存在转运蛋白参与JA-Ile的核质运输，对于JA-Ile介导的信号调控非常重要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与应用，其目的是通过筛选获得PgABCG11基因，利用PgABCG11基因编码的蛋白对JA-Ile进行高效转运，从而调控人参细胞核内源性JA-Ile含量，进一步利用转运的内源性的JA-Ile调节人参皂苷生物合成与积累，最终可以达到提高人参皂苷产量和提升人参品质的目的。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因，所述调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因序列如SEQ ID NO.1所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因编码蛋白，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种用于扩增调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因重组载体，所述重组载体由植物表达载体与所述调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因组成。

作为优选，所述表达载体为pCAMBIA1302。

作为优选，所述调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因重组载体的构建方式如下：以所述调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因的开放读码框作为超表达序列，将该cDNA片段插入到植物表达载体pCAMBIA1302中制得。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种利用PgABCG11基因调控人参内源性JA-Ile含量以提高人参皂苷合成与积累中的应用。

作为优选，所述应用方式为利用农杆菌介导所述PgABCG11基因转化人参愈伤组织或叶片。

本发明所提供的人参PgABCG11基因可以是cDNA序列(SEQ ID NO.1)，也可以是其对应的基因组序列，或者是与PgABCG11基因序列高度同源，通常在95％以上，且编码蛋白具有相同功能的DNA序列。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用基因工程技术，采用MeJA诱导的人参转录组测序方法，初步筛选出37个人参ABCG家族半分子蛋白基因，再通过农杆菌介导的转化人参叶片和细胞实验，从多个人参ABCG基因中筛选到编码的蛋白质能够转运茉莉酸-异亮氨酸复合物(JA-Ile)的PgABCG11基因。筛选得到的PgABCG11基因编码蛋白参与JA-Ile转运至细胞核，可以显著增加人参细胞内源性JA-Ile在细胞核中的含量。该基因及其编码的蛋白是一种高效、特异性和切实可行的提高人参细胞核中JA-Ile含量的方法。

内源性的JA-Ile可以调节人参皂苷生物合成过程中的一系列基因，本发明提供的PgABCG11基因及其编码蛋白能够通过显著增加人参细胞核中JA-Ile含量，从而影响人参皂苷生物合成途径中一系列酶的表达，并且最终实现人参皂苷的大量合成与积累，达到提高人参皂苷产量和提升人参品质的目的。本发明利用人参PgABCG11基因及其编码蛋白在内源性JA-Ile转运中的重要作用，根据PgABCG11基因序列构建植物超表达载体，在人参细胞中超表达PgABCG11基因，实现人参细胞中内源性JA-Ile和人参总皂苷含量的提高，可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参，获得人参总皂苷含量高的优良人参品种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中PgABCG11基因电泳结果，图中，泳道1表示PCR扩增产物，M表示DNA标准分子量；

图2是本发明实施例2中荧光定量PCR(qRT-PCR)检测100μmol/L外源性MeJA处理不同时间后人参发根细胞中PgABCG11基因的表达水平，以β-actin作为内参；

图3是本发明实施例7中农杆菌GV3101介导PgABCG11基因转化后的人参植株及其叶片；

图4是本发明实施例7中荧光定量PCR(qRT-PCR)检测农杆菌GV3101介导转化人参叶片中PgABCG11基因表达水平，以β-actin作为内参；

图5是本发明实施例7中农杆菌介导转化PgABCG11基因的人参叶片中人参皂苷含量；

图6是本发明实施例8中荧光定量PCR(qRT-PCR)检测农杆菌介导转化人参愈伤组织中PgABCG11基因的表达水平，以β-actin作为内参；

图7是本发明实施例8中农杆菌介导转化PgABCG11基因的人参愈伤组织中人参皂苷含量；

图8是本发明实施例8中农杆菌介导转化PgABCG11基因的人参细胞核中JA-Ile含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。

实施例1

PgABCG11基因的获得

1、人参RNA提取及其反转录制备cDNA

取适量新鲜的4年生人参根诱导的发根于1/2MS液体培养基中，120rpm、25℃暗培养3周，再在培养基中加入100μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)，25℃继续暗培养24h后，取适量人参发根于液氮预冷的研钵内，加入液氮后快速研磨成细粉。取30–40mg于1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol试剂，40μLβ-巯基乙醇，混匀后置于室温5–10min；加入0.2mL氯仿，振摇l5s，室温放置10–15min；4℃，12000×g离心15min，收集上层置于于1.5mL离心管中，弃去沉淀；再加入0.4mL3mol/L醋酸铵(pH5.2)和0.6mL异丙醇后混匀，室温放置5–10min，4℃、12000×g离心10min，弃去上清；加入1mL 75％的乙醇，混匀；4℃，10000×g离心5min，弃去上清液，再加入20μL DEPC水溶解RNA，备用。

以oligod(T)18为引物，利用逆转录酶合成cDNA第一链，将合成的cDNA作为模板PCR扩增，或者置于-20℃保存，备用。

2、PgABCG11基因的PCR扩增

基于MeJA诱导的人参转录组测序结果，通过筛选获得PgABCG11基因序列，根据候选PgABCG11基因序列信息，以Primer Premier 5软件设计PCR扩增引物，候选PgABCG11基因的PCR扩增引物如下。

PgABCG11-F：5′-ATGCAGGCTGATGATAATGTTC-3′；(SEQ ID NO.3)

PgABCG11-R：5′-TTAATTAAGGTGTAGAGGTGTA-3′；(SEQ ID NO.4)

PgABCG11基因PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸120s，35个循环；72℃延伸7min。PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳进行分析。图1为PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳的结果，图1中泳道1表示PgABCG11基因PCR扩增产物，M表示DNA标准分子量，结果显示PCR产物大小约为2055bp，与理论大小完全一致，结果表明成功获得了PgABCG11基因。

3、PgABCG11基因测序及分析

将PCR产物中目标条带进行回收并测序，测序结果与转录组测序结果进行比较，结果显示序列与转录组测序结果完全一致。对序列进行Blast分析比较，结果显示PgABCG11基因编码的蛋白具有ATP-binding cassette(ABC)转运蛋白家族的保守序列，在蛋白序列的97–106位置处含有Walker A(GPSGSGKS)、203–215处含有ABC signature(ISGGQKRRVSICI)和224–235位置处的Walker B(LFLDE)，因此该基因编码蛋白属于植物ABCG亚家族中的半分子蛋白，即证明成功获得了PgABCG11基因。

实施例2

荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PgABCG11基因的表达水平

1、RNA提取及反转录

提取4年生新鲜人参根诱导的发根的RNA，发根在1/2MS液体培液基中25℃，110r/min暗培养21d，再加入MeJA(100μmol/L)进行处理，处理不同时间后分别取出发根，RNA提取和反转录方法同实施例1。上述RNA以oligod(T)18为引物，以拟转录酶合成cDNA。β-actin和PgABCG11基因的qRT-PCR分析引物如下：

β-actin正向引物F：5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；(SEQ ID NO.5)

β-actin反向引物R：5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCT-3′；(SEQ ID NO.6)

PgABCG11正向引物F：5′-TCGGTGCTGTTCGCTTGTAT-3′；(SEQ ID NO.7)

PgABCG11反向引物R：5′-CCTTGAATTCCAGCTCCCGT-3′；(SEQ ID NO.8)

2、qRT-PCR分析基因表达水平

以CFX Connect荧光定量PCR仪进行分析检测，按照SYBR Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒进行扩增。反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II12.5μL，cDNA模板0.5μL，正向和反向引物(10μmol/L)各0.5μL，补ddH₂O至25μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性40s，60℃退火30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。每个样品3个重复，反应结束后，分析PgABCG11基因的表达模式。

图2是qRT-PCR检测100μmol/L外源性MeJA处理不同时间后人参发根中PgABCG11基因的表达水平，以β-actin作为内参。图2结果显示人参发根中PgABCG11基因的表达受MeJA诱导后显著提升，在诱导12h后达到最高水平，随着MeJA处理时间的加长，PgABCG11基因的表达水平有所下降，但是仍处于较高水平。MeJA是JA信号通路中的重要分子，结果提示PgABCG11基因与JA信号通路有关。

实施例3

人参皂苷提取及含量测定

1、人参皂苷的提取

取新鲜的人参细胞或组织，用ddH₂O清洗2-3遍，60℃干燥至恒重。将其研磨成细粉，用80％甲醇60℃浸提(1g：40mL)，超声波处理3次，每次15min；60℃水浴蒸干甲醇，水洗超声溶解，乙醚萃取两次，取水相，用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃水浴蒸干正丁醇，即得到人参总皂苷，用适量的甲醇超声波溶解，定容至刻度，过0.45μm的微孔滤膜，得到样品溶液。

2、人参总皂苷含量测定

人参总皂苷含量测定采用HPLC法，HPLC测定条件为：LC-MS 8050高效液相色谱仪；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)；流动相为乙腈(A)：1％甲酸(B)，洗脱条件如下：A：B(10：90)-(25：75)2min；A：B(25：75)2-8min；A：B(25：75)–(45：55)8–16.5min；A：B(45：55)16.5–21.5min；A：B(45：55)–(98：2)21.5–21.6min；A：B(98：2)21.6–25min；A：B(98：2)–(10：90)25–25.1min；A：B(10：90)25.1–29min。流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为3μL，检测波长为202nm。

以人参总皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1和Rg3作为标准品分别测定样品中的各皂苷单体的含量，再以各皂苷单体含量之和代表人参细胞中总皂苷的含量。

实施例4

人参细胞核的提取

称取约0.5g生长旺盛的人参细胞置于冰上预冷的研钵中，按人参细胞和细胞核提取液1g：6mL的比例加入细胞核提取液，再加入0.2％(V/V)TritonX-100，研磨3min。然后将研磨后的液体移入离心管中漩涡振荡30s，4℃温度下500×g离心5min。取上清液即为细胞核粗提液。再将细胞核粗提液转移至3mL Percoll的顶部，4℃温度下3500×g离心25-30min，收集沉淀，即为纯化的细胞核。再将纯化的细胞核以0.1mol/L的磷酸钾缓冲液在4℃温度下3500×g离心25-30min，重复操作两遍，最后加入1mL 0.1mol/L的磷酸钾缓冲液重悬细胞核沉淀，备用。

实施例5

JA-Ile的提取及其含量测定

1、人参细胞JA-Ile的提取

取人参细胞核或愈伤组织于PBS缓冲液中清洗3次，取细胞于液氮中研磨至干粉，称取适量并加入异丙醇-水-盐酸混合提取液，添加8μL 1μg/mL的内标溶液，4℃振荡30min；加入二氯甲烷，低温振荡30min；4℃13000r/min离心5min，取下层有机相；避光，以氮气吹干有机相，以甲醇(0.1％甲酸)复溶，4℃13000×g离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，HPLC-MS/MS检测JA-Ile。

2、JA-Ile含量测定

液相测定条件为：Agilent 1290色谱仪，色谱柱为Poroshell 120 SB-C18反相色谱柱(2.1×150，2.7μm)；柱温：30℃；流动相：A：B＝甲醇/0.1％甲酸)：(水/0.1％甲酸)；洗脱梯度：0–1min，A＝20％；1–9min，A递增至80％；9–10min，A＝80％；10-10.1min，A递减至20％；10.1-15min，A＝20％；进样体积：2μL。

质谱条件：AB SCIEX-6500QTRAP质谱仪，电喷雾电离源(ESI)雾化温度：400℃，气帘气(CUR)：15psi，喷雾电压(IS)：4500V，雾化气压力(Gas1)：65psi，辅助气压力(Gas2)：70psi，监测模式为多反应监测模式(MRM)，每个离子对根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测。

实施例6

PgABCG11基因植物超表达载体构建

1、PCR扩增PgABCG11基因

根据筛选的PgABCG11基因序列信息设计同源重组引物，用以扩展其cDNA全长，扩增引物如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10。以Bgl II限制性核酸内切酶酶切pCAMBIA1302质粒制备线性化载体，将PCR扩增产物和线性化的载体胶回收。同源重组PCR扩增引物如下：

PgABCG11-F1：

5′-GGACTCTTGACCATGCAGGCTGATGATAATGTTC-3′；(SEQ ID NO.9)

PgABCG11-R1：

5′-TCGCCTTTGGAAGTTGAATGCCTTAATTAAGGTGTAGAGGTGTA-3′；(SEQ ID NO.10)

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。

2、pCAMBIA1302-PgABCG11载体构建及农杆菌GV3101的转化

参考In-Fusion HD Cloning Kit说明书将PgABCG11基因连接至pCAMBIA1302载体，连接后经PCR和测序鉴定正确后，将构建的重组载体命名为pCAMBIA1302-PgABCG11。pCAMBIA1302-PgABCG11载体以冻融法转化农杆菌GV3101，转化后阳性克隆以PCR进行鉴定。经鉴定成功后获得含pCAMBIA1302-PgABCG11超表达载体的农杆菌。

实施例7

1、人参叶片瞬时超表达PgABCG11基因

(1)含pCAMBIA1302-PgABCG11的农杆菌培养

挑取含有pCAMBIA1302-PgABCG11载体的农杆菌和对照农杆菌(含有空载体pCAMBIA1302)单菌落分别接种于10mL加相应抗生素的LB液体培养基中培养16-24h。取1mL菌液转接到50mL LB加相应抗生素的液体培养基中，并加入10μL 100mmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS；母液用DMSO配制，使其终浓度为20μmol/L)。28℃培养过夜。培养物与5000rpm、4℃离心10min，收集菌体，用MS培养基清洗3次后，用MS+乙酰丁香酮(终浓度为20μmol/L)培养基将菌液稀释至OD600为0.8左右，作为侵染液。

(2)农杆菌介导PgABCG11基因转化人参叶片

用1mL注射器(无针头)吸取农杆菌侵染液，从人参叶片下表皮注射到人参叶片内；注射3天后，剪下人参叶片观察荧光，根据荧光亮度进行后期的PgABCG11基因表达水平测定和人参皂苷含量测定实验。

图3是农杆菌GV3101介导转化后的人参植株及其叶片。图3中对照为注射农杆菌GV3101(含空载体pCAMBIA1302)3天后的人参叶片；图3中PgABCG11为注射农杆菌GV3101(含pCAMBIA1302-PgABCG11)3天后的人参叶片。从图3可知，使用含空载体pCAMBIA1302农杆菌GV3101介导转化后的人参叶片与含pCAMBIA1302-PgABCG11的农杆菌GV3101介导转化后的人参叶片表面生长情况基本一致，使用载体对人参叶片进行介导转化不会对人参叶片正常生长产生影响。

2、转化后的人参叶片中PgABCG11基因表达水平及总皂苷含量

取农杆菌GV3101侵染3天后的人参叶片，采用实施例2方法中qRT-PCR分析人参叶片中PgABCG11基因的表达水平，分析所用引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，内参β-actin所用引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，结果如图4所示；采用实施例3的方法测量人参叶片中总皂苷的含量，结果如图5所示。

图4对照为注射农杆菌GV3101(含空载体pCAMBIA1302)3天后的叶片中PgABCG11基因表达水平；PgABCG11为注射农杆菌GV3101(含pCAMBIA1302-PgABCG11)3天后的叶片中PgABCG11基因表达水平；结果显示转PgABCG11基因的人参叶片中PgABCG11基因表达水平显著提高，是对照组的3.61倍。

图5是农杆菌菌GV3101介导转化PgABCG11基因的人参叶片中人参皂苷含量，PgABCG11+Vp为转化重组载体(pCAMBIA1302-PgABCG11)的人参叶片并施加80μmol/L的ABC转运蛋白特异性抑制剂维拉帕米(verapamil，Vp)。从图5结果可知，转PgABCG11基因的人参叶片人参皂苷含量是对照的2.16倍，加入ABC蛋白抑制剂Vp后，人参皂苷的合成明显受到抑制，其含量是转PgABCG11基因人参叶片中的0.52倍，从而提示了PgABCG11基因促进了人参皂苷的生物合成和积累。

实施例8

1、农杆菌介导转化人参愈伤组织

(1)农杆菌培养见实施例7。取新鲜的人参愈伤组织，分别放入含有pCAMBIA1302-PgABCG11和pCAMBIA1302的农杆菌GV3101侵染液中2-5min，用无菌滤纸吸干菌液，置于1/2MS+2,4D的培养基上避光共培养3–5d。加入250mg/L头孢霉素抑制农杆菌；再接于含有1/2MS+2,4D，挑取转化平板上突起的新生细胞团，转入新鲜1/2MS+2,4D培养基中(加入250mg/L头孢霉素和卡那霉素)。每隔5–7d转移1次，直至无细菌生长，每4周继代1次。

(2)qRT-PCR分析转化后的人参细胞中PgABCG11基因表达水平

取筛选的转基因人参愈伤组织，提取总RNA，以oligod(T)18为引物，利用反转录酶反转录合成cDNA第一链，并通过qRT-PCR的方法对转基因人参细胞进行筛选鉴定，获得的阳性人参细胞，PgABCG11基因分析所用引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，内参β-actin所用引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

图6是qRT-PCR检测农杆菌介导转化人参愈伤组织中PgABCG11基因的表达水平，以β-actin作为内参；图中对照为转化空载体(pCAMBIA1302)筛选得到的人参愈伤组织；PgABCG11为转化含重组载体(pCAMBIA1302-PgABCG11)的人参愈伤组织；结果显示转PgABCG11基因的人参愈伤组织中PgABCG11基因表达水平显著提高，是对照组的4.55倍。表明获得了PgABCG11基因超表达的人参愈伤组织。

2、人参细胞中皂苷含量和JA-Ile转运活性测定

人参细胞中总皂苷提取和含量测定见实施例3。人参细胞核提取方法见实施例4，取对照人参细胞(转空载体pCAMBIA1302)和PgABCG11基因超表达人参细胞的细胞核，并分别分装为96μL，每组3个重复，置于冰上备用以测定PgABCG11编码蛋白对JA-Ile的转运活性。然后置于室温(25℃)2min以活化细胞核，其中PgABCG11基因超表达人参细胞的细胞核溶液分两组，一组不加抑制剂，一组中加入80μmol/L的ABC转运蛋白特异性抑制剂Vp。然后分别向各细胞核溶液中加入32nmol/L的JA-Ile和10mmol/L ATP，共孵育0s、60s、120s、180s后，再在各样品中加入0.1mol/L预冷的LiCl，迅速置于冰上以终止反应。最后用5mL预冷的0.1mol/L磷酸钾缓冲液冲洗三遍后收集细胞核。细胞核中JA-Ile提取和含量测定方法见实施例5。

图7是农杆菌介导转化PgABCG11基因的人参愈伤组织中人参皂苷含量，图8是人参细胞核中JA-Ile的含量；图7和图8中对照为转化空载体(pCAMBIA1302)获得的人参愈伤组织；PgABCG11为转化重组载体(pCAMBIA1302-PgABCG11)获得的人参愈伤组织；PgABCG11+Vp为转化重组载体(pCAMBIA1302-PgABCG11)获得的人参愈伤组织并施加80μmol/L的ABC转运蛋白特异性抑制剂Vp。图7和图8的结果显示，转PgABCG11基因的人参愈伤组织中人参皂苷含量显著上升，是对照的1.89倍，加入ABC蛋白抑制剂Vp后，人参皂苷的合成明显受到抑制，其含量是转PgABCG11基因的人参愈伤组织中的0.44倍。与皂苷含量变化正相关的是人参细胞核中最重要的JA信号通路分子JA-Ile的含量。在转PgABCG11基因的人参愈伤组织中，细胞核中JA-Ile含量显著增加，其含量是对照的2.47倍；加入ABC转运蛋白特异性抑制剂维拉帕米后，JA-Ile在细胞核中的含量减少，其含量是对照的0.47倍，表明PgABCG11蛋白参与JA-Ile转运至细胞核。

细胞核中JA-Ile可以促进泛素连接酶复合物(SCFCOI1)与JAZ蛋白形成复合物，当形成复合物后，26S蛋白酶就会把JAZ蛋白水解掉。JAZ蛋白被水解后，之前被抑制活性的转录因子MYC等就会被释放出来，可以和下游靶基因的G-box相结合，从而影响下游基因的表达。在人参细胞中，通过JA-Ile进入细胞核进而影响人参皂苷生物合成途径中一系列酶的表达，最终合成出一系列人参皂苷，提高了人参皂苷的含量。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 湖南工程学院

<120> 调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与应用

<141> 2022-02-11

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2055

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaggctg atgataatgt tcaacatgag ctgaaactta gctcaggctc agtctctggc 60

tcagcctcgt ctcatattaa tcgagaaatt aagaatgcag tactagaggt agaaactagc 120

tcaataccga taagtagacg acaagaaaaa caagaaaatg atggtgtttt cttgacatgg 180

gaggatttgt gggtgacagt ttcaaatgga ggaagcagca atgggagtag gtctatcctt 240

caaggtctca ccggttatgc ccgacccggt gaggtgttgg ccattatggg tccttctggc 300

tccggcaagt ccacccttct tgatgccttg gcagggagac tagactcaaa cacatggcaa 360

aacgggaaca ttctaatcaa tggtcacaaa caaaaactgg cttatggaac gtcggcttat 420

gtaactcaag atgatacttt gatgacaaca ttaaccgtta gcgaagccat atactattct 480

gcacaactcc aactgccaaa caccatgaca ttgttagaaa agagagagcg agccgacttg 540

acaataaggg aaatggggct gcaagattct gtgaacacaa ggataggagg atggggtgca 600

aaaggaatta gcggtggcca aaagaggcga gttagcattt gcatcgaggt cttaacgcgc 660

ccaaagttgc tcttccttga tgagcctaca agcggccttg acagtgcagc atcctactat 720

gtcatgagca gaattgcgcg ccttgatcaa ggagaaggaa ggacgattat aacttctatt 780

catcagccta gtagtgaagt gtttgctctt tttcacaatt tgtgcctttt gtcttctggg 840

aaaacaattt actttggccc tgctagatca gcaaatgaat ttttcgcgtt gaatggtttc 900

ccttgcccga ctctccaaaa tccatccgat catttcctca gaacaataaa caaggatttt 960

gatgaggaca ttgaacaagg atcaggtgga aggaagccca cagaagaagt gattgaaata 1020

cttgtaaagt cgtataaatc gtcgagtaat taccaagaaa gtttaaggca ggttgctgaa 1080

atttgtaaga agggaggtga agaattggag aagagaagcc atgctagctt cattacccaa 1140

tctatagtac tgatgaggcg atcttctgtg aacatgttcc gtgacattgg ctactactgg 1200

ttacgcctag ctatctatct gacgttagct ttaggcctag gcaccatctt ctttaatgtt 1260

agctcaagct ctagtcatag ttctattcag ggaaaagggt atatgatcat gtttgtggct 1320

tcgtttttga ctttcatgac cattggtgga ttcccttcat ttgtagagga catgaaggtg 1380

tttgaacgcg aaagattaaa cgggcactat gggtcgagtg catttgtcat aggcaacaca 1440

ctatcttcca tgccatactt gttactagtg tctatatttc ccggagcaat tgcttattac 1500

ctaactggcc ttcgccaagg atatgaacac ttcgcgtact ttgcttcggt gctgttcgct 1560

tgtatgatgt tagtagaaag cctaatgatg atcgtggcaa gtatagtccc taactttttg 1620

atgggcataa taacgggagc tggaattcaa ggcctcatga tcttaggcgg tggtttcttt 1680

agattaccac acgatttacc cggaccattt tggaaatacc caatgtacta cattgcattc 1740

cataagtatg cattccaagg attgtacaag aatgagtttg aaggagtttc ttatcacatg 1800

agcaatcaag ctggtggttt aataactggc gagtctattt tgagagaaat gtggcaagtg 1860

gaattaggct actcaaaatg ggttaacttg ggcattttgt tagggatgct gcttttctat 1920

cggttgctgt ttttcgtcat aatcaagagt gccgaaaagt ttaagcctgc tgttagagaa 1980

ttcatgtccc tttcgcccaa gaaagccaag caggtcatgc tgaatcctac tgctacacct 2040

ctacacctta attaa 2055

<210> 2

<211> 684

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Ala Asp Asp Asn Val Gln His Glu Leu Lys Leu Ser Ser Gly

1 5 10 15

Ser Val Ser Gly Ser Ala Ser Ser His Ile Asn Arg Glu Ile Lys Asn

20 25 30

Ala Val Leu Glu Val Glu Thr Ser Ser Ile Pro Ile Ser Arg Arg Gln

35 40 45

Glu Lys Gln Glu Asn Asp Gly Val Phe Leu Thr Trp Glu Asp Leu Trp

50 55 60

Val Thr Val Ser Asn Gly Gly Ser Ser Asn Gly Ser Arg Ser Ile Leu

65 70 75 80

Gln Gly Leu Thr Gly Tyr Ala Arg Pro Gly Glu Val Leu Ala Ile Met

85 90 95

Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Leu Asp Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Arg Leu Asp Ser Asn Thr Trp Gln Asn Gly Asn Ile Leu Ile Asn Gly

115 120 125

His Lys Gln Lys Leu Ala Tyr Gly Thr Ser Ala Tyr Val Thr Gln Asp

130 135 140

Asp Thr Leu Met Thr Thr Leu Thr Val Ser Glu Ala Ile Tyr Tyr Ser

145 150 155 160

Ala Gln Leu Gln Leu Pro Asn Thr Met Thr Leu Leu Glu Lys Arg Glu

165 170 175

Arg Ala Asp Leu Thr Ile Arg Glu Met Gly Leu Gln Asp Ser Val Asn

180 185 190

Thr Arg Ile Gly Gly Trp Gly Ala Lys Gly Ile Ser Gly Gly Gln Lys

195 200 205

Arg Arg Val Ser Ile Cys Ile Glu Val Leu Thr Arg Pro Lys Leu Leu

210 215 220

Phe Leu Asp Glu Pro Thr Ser Gly Leu Asp Ser Ala Ala Ser Tyr Tyr

225 230 235 240

Val Met Ser Arg Ile Ala Arg Leu Asp Gln Gly Glu Gly Arg Thr Ile

245 250 255

Ile Thr Ser Ile His Gln Pro Ser Ser Glu Val Phe Ala Leu Phe His

260 265 270

Asn Leu Cys Leu Leu Ser Ser Gly Lys Thr Ile Tyr Phe Gly Pro Ala

275 280 285

Arg Ser Ala Asn Glu Phe Phe Ala Leu Asn Gly Phe Pro Cys Pro Thr

290 295 300

Leu Gln Asn Pro Ser Asp His Phe Leu Arg Thr Ile Asn Lys Asp Phe

305 310 315 320

Asp Glu Asp Ile Glu Gln Gly Ser Gly Gly Arg Lys Pro Thr Glu Glu

325 330 335

Val Ile Glu Ile Leu Val Lys Ser Tyr Lys Ser Ser Ser Asn Tyr Gln

340 345 350

Glu Ser Leu Arg Gln Val Ala Glu Ile Cys Lys Lys Gly Gly Glu Glu

355 360 365

Leu Glu Lys Arg Ser His Ala Ser Phe Ile Thr Gln Ser Ile Val Leu

370 375 380

Met Arg Arg Ser Ser Val Asn Met Phe Arg Asp Ile Gly Tyr Tyr Trp

385 390 395 400

Leu Arg Leu Ala Ile Tyr Leu Thr Leu Ala Leu Gly Leu Gly Thr Ile

405 410 415

Phe Phe Asn Val Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Ser Ile Gln Gly Lys

420 425 430

Gly Tyr Met Ile Met Phe Val Ala Ser Phe Leu Thr Phe Met Thr Ile

435 440 445

Gly Gly Phe Pro Ser Phe Val Glu Asp Met Lys Val Phe Glu Arg Glu

450 455 460

Arg Leu Asn Gly His Tyr Gly Ser Ser Ala Phe Val Ile Gly Asn Thr

465 470 475 480

Leu Ser Ser Met Pro Tyr Leu Leu Leu Val Ser Ile Phe Pro Gly Ala

485 490 495

Ile Ala Tyr Tyr Leu Thr Gly Leu Arg Gln Gly Tyr Glu His Phe Ala

500 505 510

Tyr Phe Ala Ser Val Leu Phe Ala Cys Met Met Leu Val Glu Ser Leu

515 520 525

Met Met Ile Val Ala Ser Ile Val Pro Asn Phe Leu Met Gly Ile Ile

530 535 540

Thr Gly Ala Gly Ile Gln Gly Leu Met Ile Leu Gly Gly Gly Phe Phe

545 550 555 560

Arg Leu Pro His Asp Leu Pro Gly Pro Phe Trp Lys Tyr Pro Met Tyr

565 570 575

Tyr Ile Ala Phe His Lys Tyr Ala Phe Gln Gly Leu Tyr Lys Asn Glu

580 585 590

Phe Glu Gly Val Ser Tyr His Met Ser Asn Gln Ala Gly Gly Leu Ile

595 600 605

Thr Gly Glu Ser Ile Leu Arg Glu Met Trp Gln Val Glu Leu Gly Tyr

610 615 620

Ser Lys Trp Val Asn Leu Gly Ile Leu Leu Gly Met Leu Leu Phe Tyr

625 630 635 640

Arg Leu Leu Phe Phe Val Ile Ile Lys Ser Ala Glu Lys Phe Lys Pro

645 650 655

Ala Val Arg Glu Phe Met Ser Leu Ser Pro Lys Lys Ala Lys Gln Val

660 665 670

Met Leu Asn Pro Thr Ala Thr Pro Leu His Leu Asn

675 680

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcaggctg atgataatgt tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaattaagg tgtagaggtg ta 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgccccagaa gagcaccctg t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcatacagg gaaagatcgg ct 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcggtgctgt tcgcttgtat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccttgaattc cagctcccgt 20

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggactcttga ccatgcaggc tgatgataat gttc 34

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcgcctttgg aagttgaatg ccttaattaa ggtgtagagg tgta 44

Claims (8)

1.一种调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因，其特征在于，所述的PgABCG11基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因编码蛋白，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种用于扩增如权利要求1所述的调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.一种如权利要求1所述的调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因植物重组载体，其特征在于，所述重组载体由植物表达载体与所述PgABCG11基因组成。

5.根据权利要求4所述的调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因植物重组载体，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA1302。

6.根据权利要求5所述的调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因重组载体，其特征在于，所述PgABCG11基因的植物重组载体的构建方式如下：以所述调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因的开放读码框作为植物超表达序列，将该cDNA片段插入到植物表达载体pCAMBIA1302中制得。

7.一种如权利要求1所述的调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因在调节人参皂苷合成与积累中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用方式为利用农杆菌介导所述PgABCG11基因转化人参愈伤组织或人参叶片。

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