CN117511970A - 一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因及其应用，属于基因工程技术领域，PgJOX2基因属于JOX家族基因，该基因来源于人参，利用PgJOX2氧化JA的能力进而实现人参皂苷合成的调节，通过基因编辑、沉默或敲除PgJOX2基因，使得JA无法转变为12‑OH‑JA，适度提升人参细胞内源性JA的含量，进而激活JA诱导的人参皂苷生物合成关键酶基因，实现人参皂苷积累，与施加外源性的JAs相比，对细胞的生长影响更小，与对照人参愈伤组织相比，PgJOX2基因沉默人参愈伤组织中人参皂苷含量显著提高，为提高人参皂苷产量提供了一种高效的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因及其应用。
背景技术
人参（Panax ginseng C. A. Meyer）作为五加科人参属珍贵中药材，拥有着悠久的使用历史和深厚的文化底蕴，其独特的药效成分——人参皂苷，更是赋予了它独特的药用价值。目前，已经从人参中分离并鉴定的人参皂苷超过50种，其中包括人参皂苷Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh、Rs和Ro等。研究发现，许多人参皂苷单体在抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力、抗炎保肝和抗糖尿病等方面具有独特的药理作用，临床应用十分广泛。高品质的人参药材是其发挥治疗效果的重要物质基础，但是由于野生的人参资源匮乏，人工种植的人参中人参皂苷含量低，使得优质人参药材变得尤为稀缺。人参中人参皂苷的组成与含量受其生物合成途径中一系列关键酶基因的高度调节，这些基因的功能也受到一些重要因子如茉莉酸类化合物（jasmonates，JAs）、生物胁迫等的影响。
茉莉酸类化合物是一类脂肪酸衍生物，涉及到不饱和脂肪酸的氧化级联反应，其反应过程中的多种中间产物在植物生长发育中发挥重要调节作用，其中茉莉酸（jasmonicacid，JA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和茉莉酸-异亮氨酸复合物（jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile）发挥最为重要的作用。加入外源性的JAs亦可以刺激众多植物细胞中次生代谢产物的合成与积累。大量研究发现，在施加外源性的JA、MeJA等衍生物可以提高人参皂苷生物合成途径中的关键酶基因表达水平，进而促进人参皂苷合成。无论是外源性还是内源性的JAs，过量的JAs也会严重影响植物的生长和发育过程，如萌发、果实成熟、根的生长和衰老等。因此，茉莉酸等也会在一些酶的作用下转变为茉莉酸的衍生物，从而维持植物体内JAs特别是终末端的重要物质JA的平衡。
研究发现，茉莉酸可以脱去羧基形成顺式茉莉酮，顺式茉莉酮是一些植物花香中的化合物，它可以通过吸引植食性昆虫的天敌，提高植物抗虫性。茉莉酸也可以羟基化成12-羟基JA（12-OH-JA），茉莉酸的羟基化形式在多种植物中存在，一直都被认为是一种没有活性的贮存形式。当植物用12-OH-JA处理时，既没有引起JA相关基因的表达，也没有对植物的生长产生抑制作用。近年来，基因组学和蛋白质组学的研究表明，植物细胞中存在大量的氧化酶，部分氧化酶可以催化JA的羟基化以缓解过量JA对细胞生长等方面的抑制。在拟南芥中发现一类茉莉酸诱导的氧化酶（jasmonate-induced oxygenase，JOX）或称之为茉莉酸氧化酶（jasmonic acid oxidase，JAO）属于羟基化酶，可以将JA直接羟基化生成12-OH-JA，从而参与调节JA介导的信号转导过程。
然而，目前尚不清楚PgJOX2基因在人参细胞中的作用，以及PgJOX2基因的克隆和应用于人参皂苷生物合成调控的研究未见报道。如何通过PgJOX2调节人参内源性JA水平，进而实现对人参细胞持久高效的人参皂苷合成与积累调控，对于提高人参皂苷的积累和利用人参皂苷具有重要的价值。
发明内容
为解决上述问题，本方案提供了一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因及其应用，利用PgJOX2氧化JA的能力进而实现利用其调节人参皂苷合成，通过基因编辑、沉默或敲除PgJOX2基因，使得JA无法转变为12-OH-JA，适度提升人参细胞内源性JA的含量，进而激活JA诱导的人参皂苷生物合成关键酶基因，实现人参皂苷积累，与施加外源性的JAs相比，由于细胞中的JA含量较低对细胞的生长影响很小，因此该方法能实现人参皂苷的合成与细胞生长达到很好的平衡。
为达到上述目的，本方面首先提供了一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因，所述PgJOX2基因序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述PgJOX2基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
作为优选，所述PgJOX2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因的重组载体，所述受冠菌素诱导的PgJOX2基因与植物表达载体组成所述重组载体。
作为优选，所述植物表达载体为pART27。
作为优选，所述重组载体的构建方式为：以SEQ ID NO.5所示的PgJOX2基因干扰序列以正反两个方向连接至pKANNIBAL载体中，再将pKANNIBAL载体中的基因干扰表达框连接至pART27载体中。
基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因或受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因的重组载体在调节人参皂苷合成与积累中的应用。
作为优选，所述人参PgJOX2基因在调节人参皂苷合成与积累中的应用方法为：通过基因编辑、干扰、沉默或敲除所述人参PgJOX2基因，提高人参发根、细胞、组织和植株中人参皂苷的含量。
下面对本发明作进一步说明：
本发明提供的PgJOX2基因属于JOX家族基因，该基因来源于人参（Panax ginsengC.A. Meyer）并命名为PgJOX2，基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ IDNO.4所示，且该基因编码的蛋白属于茉莉酸诱导的氧化酶。通过qRT-PCR分析显示PgJOX2基因和人参皂苷合成关键酶基因PgSE和PgDDS均受COR（冠菌素）和MeJA的诱导表达，并且其表达模式与人参皂苷的积累相似。
通过基因编辑、沉默或敲除PgJOX2基因，使得JA无法转变为12-OH-JA，适度提升人参细胞内源性JA的含量，进而激活JA诱导的人参皂苷生物合成关键酶基因，实现人参皂苷积累，本发明所用的人参PgJOX2基因可以是cDNA序列（SEQ ID NO.1），也可以是其对应的基因组序列，或者是与PgJOX2基因序列高度同源，通常在95%以上，且编码蛋白具有相同功能的DNA序列。
人参PgJOX2基因沉默的RNAi载体通过如下方式构建：以SEQ ID NO.5所示的PgJOX2基因DNA干扰序列以正反两个方向连接至pKANNIBAL载体中，再将pKANNIBAL载体中的基因干扰表达框连接至pART27载体中；所述人参PgJOX2基因的RNAi载体中，DNA干扰片段上下游分别含有CaMV35S启动子和OCS终止子，中间含有磷酸双激酶（Pdk）内含子。
总之，本发明利用人参PgJOX2基因调节在人参细胞内JA的含量，通过基因编辑、干扰、沉默或敲除所述人参PgJOX2基因，提高人参发根、细胞、组织和植株中人参皂苷的含量，同时不影响生长，是一种比较高效的生产人参皂苷的方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用冠菌素诱导的人参细胞中基因差异表达的转录组测序分析的方法，发现人参中多个JOX家族基因，其中PgJOX2基因受COR和MeJA的诱导，且PgJOX2基因的表达模式与人参皂苷的含量变化密切相关。通过农杆菌A4介导的RNAi技术瞬时干扰PgJOX2基因在人参愈伤组织中的表达，发现PgJOX2基因沉默的人参细胞中人参皂苷的含量明显提高，人参细胞的生长不受影响。基于这些研究结果可知，利用基因干扰、沉默或敲除PgJOX2基因可以提高人参细胞中人参皂苷的含量，该基因及其编码的蛋白是一种切实可行的提高人参中皂苷含量及产量的方法。
（2）本发明利用人参PgJOX2基因调节在人参细胞内JA的含量，具体体现在PgJOX2氧化JA进而实现人参皂苷合成的调节，通过基因编辑、沉默或敲除PgJOX2基因，使得JA无法转变为12-OH-JA，适度提升人参细胞内源性JA的含量，进而激活JA诱导的人参皂苷生物合成关键酶基因，实现人参皂苷积累。
（3）本发明通过RNAi技术构建了PgJOX2基因沉默的RNAi植物表达载体，获得了PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织，与对照人参愈伤组织相比，PgJOX2基因沉默人参愈伤组织中人参皂苷含量显著提高。由此说明，利用基因编辑、基因沉默、基因干扰或基因敲除PgJOX2基因能够显著提高人参皂苷含量，同时不影响人参细胞的生长，为提高人参皂苷产量提供了一种高效的技术手段。
（4）本发明提供的方法与施加外源性的JAs相比，由于细胞中的JA含量较低对细胞的生长影响很小，因此该方法能实现人参皂苷的合成与细胞生长达到很好的平衡。
附图说明
图1是本发明实施例2中荧光定量PCR（qRT-PCR）检测100μmol/L的MeJA处理不同时间后人参发根中PgJOX2基因的表达水平，以β-actin作为内参；
图2是本发明实施例2中荧光定量PCR（qRT-PCR）检测100μmol/L的MeJA、1μmol/L和10μmol/L的COR处理48h后人参发根中PgJOX2基因的表达水平，以β-actin作为内参；
图3是本发明实施例2中荧光定量PCR（qRT-PCR）检测100μmol/L的MeJA、1μmol/L和10μmol/L的COR处理48h后人参发根中人参皂苷生物合成关键酶基因表达情况；其中PgSE为鲨烯环氧酶基因；PgDDS为达玛烯二醇合成酶基因；以β-actin作为内参；
图4是本发明实施例2中100μmol/L的MeJA、1μmol/L和10μmol/L的COR处理48h后人参发根中人参皂苷的含量；
图5是本发明实施例3中PgJOX2基因沉默RNAi载体表达框示意图；
图6是本发明实施例3中PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织qRT-PCR分析结果；CK为转空载体pART27后的人参愈伤组织（对照组），TS6、TS7和TS11为PgJOX2基因瞬时沉默（transient silence）的人参愈伤组织（实验组）；
图7是本发明实施例3中PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织中人参皂苷含量测定结果；CK为转空载体pART27后的人参愈伤组织（对照组），TS6、TS7和TS11为PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织（实验组）；
图8是本发明实施例3中PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织中JA和12-OH-JA含量测定结果；CK为转空载体pART27后的人参愈伤组织（对照组），TS6、TS7和TS11为PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织（实验组）。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1 PgJOX2基因的克隆
1、人参中总RNA的提取及cDNA的合成
（1）人参中总RNA提取
将人参发根在无菌条件下接种于无激素的1/2MS固体培养基中，25℃暗培养人参发根3周，取生长旺盛的人参发根，接种于1/2MS液体培养基中，在120rpm、25℃暗培养3周，然后在培养基中分别加入终浓度为1μmol/L和10μmol/L的冠菌素（COR），继续培养48h后收集人参发根，并以Trizol法提取人参总RNA，备用。
（2）人参cDNA的合成
以提取的人参总RNA为模板，oligod(T)18为引物，反转录合成人参cDNA，将合成的人参cDNA置于-20℃保存，备用。
2、PCR扩增克隆人参PgJOX2基因
对COR诱导的人参细胞转录组测序结果进行分析，根据筛选得到的人参PgJOX2基因序列设计PCR扩增引物，PgJOX2基因扩增所用的正反方向引物序列如下。
PgJOX2-F：5′-ATGAACTGCTTACAGAGTTGGCCGGAGCCGATT-3′；（SEQ ID NO.2）
PgJOX2-R：5′-TTATCGCGGGGATTTAAGTGATTCAACT-3′；（SEQ ID NO.3）
PgJOX2基因PCR扩增的条件如下：预变性94℃ 3min，变性94℃ 20s，退火56℃30s，72℃ 30s， 35个循环；终延伸72℃ 5min。经过PCR扩增后的产物以琼脂糖凝胶电泳进行分析，然后对和预期大小一致的电泳条带进行胶回收，再对胶回收产物进行测序分析，测序结果见SEQ ID NO.1，其开放读码框（ORF）的长度为1080bp，其编码蛋白序列见SEQ IDNO.4，编码蛋白包含359个氨基酸，最后在NCBI中进行序列比对分析，结果表明该基因编码蛋白为茉莉酸诱导的氧化酶（JOX）。
实施例2 荧光定量PCR（qRT-PCR）分析PgJOX2基因的表达模式
1、RNA提取及其反转录
将人参发根在无菌条件下接种于无激素的1/2MS固体培养基中，25℃暗培养人参发根3周，取生长旺盛的人参发根，接种于1/2MS液体培养基中，在120rpm、25℃暗培养3周，然后在培养基中分别加入终浓度为1μmol/L、10μmol/L的COR和100μmol/L的MeJA，继续培养不同时间后分别收集人参发根，并以Trizol法提取人参总RNA，备用。以oligod（T）18为引物，逆转录合成cDNA，以β-actin作为内参，β-actin、PgJOX2、PgSE和PgDDS基因的qRT-PCR引物如下：
β-actin基因qRT-PCR引物F：5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；（SEQ ID NO.6）
β-actin基因qRT-PCR引物R：5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCTTGA-3′；（SEQ ID NO.7）
PgJOX2基因qRT-PCR引物F：5′-TCTTATATCCGGTGCGTGCC-3′；（SEQ ID NO.8）
PgJOX2基因qRT-PCR引物R：5′-CGAGTTCGCATAACCCACCT-3′；（SEQ ID NO.9）
PgSE基因qRT-PCR引物F:5′-TGGCCTAAACCCGCGTCCAA-3′；（SEQ ID NO.10）
PgSE基因qRT-PCR引物R:5′-AGCGCCGAGCCACATTCGT-3′；（SEQ ID NO.11）
PgDDS基因qRT-PCR引物F:5′- TGAGATTAGATGAAAACGAAC-3′；（SEQ ID NO.12）
PgDDS基因qRT-PCR引物R:5′-GGCAATGATAAGGGGAGGTGT-3′；（SEQ ID NO.13）
2、qRT-PCR分析人参PgJOX2和人参皂苷合成酶基因表达模式
该实施例采用CFX Connect荧光定量PCR仪进行基因表达水平分析，qRT-PCR扩增采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒，在25µL的反应体系中分别加入：2×SYBR® Premix ExTaqTM II 12.5µL，正向和反向引物（10μM）各0.5µL，cDNA模板0.5µL，ddH2O 11µL。qRT-PCR扩增反应的条件为：预变性95℃ 1min，变性95℃ 40s，退火60℃ 30s，40个循环；变性95℃15s，退火60℃ 60s，变性95℃ 15s，1个循环。每个样品3个重复，待反应结束后根据扩增曲线和溶解曲线判断反应的特异性，最后采用2-ΔΔCt法分析各个基因的表达模式。
图1和图2是100μmol/L的MeJA、1μmol/L和10μmol/LCOR处理后人参发根中PgJOX2基因的表达水平，图2表明，与对照CK相比，PgJOX2基因的表达受COR和MeJA诱导。
图3是100μmol/L的MeJA、1μmol/L和10μmol/L的COR处理48h后人参发根中人参皂苷生物合成关键酶基因表达情况；与对照CK相比，人参皂苷合成关键酶基因PgSE和PgDDS的表达均受MeJA和COR的诱导。
图4是100μmol/L的MeJA、1μmol/L和10μmol/L的COR处理48h后人参发根中人参皂苷含量；与对照CK相比，MeJA诱导后人参皂苷为对照的4.10倍，1μmol/L和10μmol/L的COR处理48h后人参皂苷为对照的5.10和4.86倍，其变化趋势与PgJOX2、PgSE和PgDDS基因表达模式变化一致，表明PgJOX2参与人参皂苷积累调节。
实施例3 PgJOX2基因干扰载体的构建及其在人参愈伤组织中瞬时沉默
1、PgJOX2基因干扰载体的构建
（1）PCR扩增PgJOX2基因的RNAi片段
采用OligoEngine 2.0 RNAi软件设计PgJOX2基因干扰的片段，其序列见SEQ IDNO.5，PCR扩增PgJOX2基因干扰序列，其所用的引物如下：
正义引物RNAi-F:5′-CCGCTCGAGACCTTACACTTGGCCTGTCG-3′；（SEQ ID NO.14）
正义引物RNAi-R:5′-CGGGGTACCTGGTGCAATGGTTTTGTCGC-3′；（SEQ ID NO.15）
反义引物RNAi-F:5′-GCTCTAGAACCTTACACTTGGCCTGTCG-3′；（SEQ ID NO.16）
反义引物RNAi-R:5′-CCATCGATTGGTGCAATGGTTTTGTCGC-3′；（SEQ ID NO.17）
分别以上述正义引物对（SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，下划线分别为Xho I和Kpn I酶切位点）和反义引物对（SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，下划线分别Cla I和Xba I酶切位点）进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的片段。
（2）pART27-PgJOX2-RNAi载体的构建
PgJOX2基因正义片段PCR产物和pKANNIBAL质粒经Xho I和Kpn I双酶切后连接、转化和筛选，获得含PgJOX2基因正义片段的重组质粒pKANNIBAL-PgJOX2-S。PgJOX2基因反义片段PCR产物和pKANNIBAL-PgJOX2-S质粒经Cla I和Xba I双酶切后连接、转化和筛选，获得含PgJOX2基因正义和反义片段的过渡重组质粒pKANNIBAL-PgJOX2-RNAi。
将重组质粒pKANNIBAL-PgJOX2-RNAi与pART27使用Not I酶切后连接、转化和筛选，经酶切、测序鉴定后，获得含PgJOX2基因干扰片段的重组质粒pART27-PgJOX2-RNAi，图5为PgJOX2基因沉默RNAi载体表达框示意图，PgJOX2基因特异性干扰序列分别以正反两个方向连接在表达载体pART27的Pdk intron两侧；上游连接CaMV 35S启动子序列，下游连接OSC终止子序列；其中所用抗性基因为卡那霉素（NPT）。
2、pART27-PgJOX2-RNAi重组质粒转化农杆菌A4
分别取1-2μg的pART27-PgJOX2-RNAi和pART27（对照）质粒加入含农杆菌（A.rhizogenes）A4感受态细胞悬液的离心管中，置于冰上轻柔混匀，放置于冰上静置30min；液氮迅速冷冻处理2min，置于37℃水浴中热激5min，再冰浴处理2min，最后在离心管中加入800μL无菌的YEB液体培养基，28℃培养4h；5000rpm离心5min沉淀获得菌体，并弃掉上清液，加入新鲜的无菌YEB液体培养基重悬菌体，取50-200μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的YEB固体筛选培养基上，28℃培养3d。
3、农杆菌介导pART27-PgJOX2-RNAi转化人参愈伤组织
（1）农杆菌A4菌株的培养
将含有pART27-PgJOX2-RNAi和pART27的农杆菌A4于YEB液体培养基中28℃、110rpm培养过夜，使其OD600至4.4-0.6左右，4℃离心5-10min，收集菌体，用1/2MS液体培养基清洗3次后，用含有20mg/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将菌液稀释10倍后作为侵染液。
（2）人参愈伤组织培养及转化
取4年生人参新鲜根诱导的人参愈伤组织，置于6,7-V固体培养基（加入2,4-D至终浓度为1.5mg/L）上预培养1–2周。取预培养的人参愈伤组织，放入含有pART27-PgJOX2-RNAi和pART27的农杆菌A4侵染液中5-10min，用无菌滤纸吸干菌液，置于含有1.5mg/L 2,4-D的6,7-V固体培养基上避光共培养3-5d。
（3）qRT-PCR分析PgJOX2基因瞬时沉默后的PgJOX2基因表达水平
农杆菌与愈伤组织共培养3-5d后的人参愈伤组织，提取总RNA，以oligod(T)18为引物，反转录合成cDNA，qRT-PCR分析基因表达水平，PgJOX2基因所用引物为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，内参基因β-actin所用引物为SEQ ID NO.6和 SEQ ID NO.7。
图6为PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织qRT-PCR分析结果；其中CK为转pART27空载体的愈伤组织作为对照；TS6、TS7和TS11为转PgJOX2基因RNAi载体后筛选得到的几个基因沉默的人参愈伤组织。结果表明，与对照CK相比，获得的人参愈伤组织中TS6、TS7和TS11基因表达水平均出现明显的下降，表明TS6、TS7和T11人参愈伤组织中的PgJOX2基因得以沉默。
（4）人参愈伤组织中人参皂苷含量测定
取上述共培养后的新鲜的人参愈伤组织，ddH2O清洗干净后以60℃干燥，研磨成细粉，用80%甲醇60℃浸提(1g:40mL)，超声波提取3次，每次10min；60℃蒸干甲醇，用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃水浴蒸干正丁醇，再用适量的甲醇溶解后待测。
人参皂苷含量测定采用HPLC法，LC-MS 8050高效液相色谱仪；色谱柱为ACQUITYUPLC BEH Shield RP18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)；流动相为乙腈:1%甲酸。流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为3μL，检测波长为202nm。
以人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2和Rg3作为标准品分别测定样品中的各皂苷单体的含量，再以各皂苷单体含量之和代表人参细胞中总皂苷的含量。
图7为PgJOX2基因瞬时沉默后的人参愈伤组织中皂苷含量测定结果，与对照CK相比，PgJOX2基因沉默的人参愈伤组织TS6、TS7和TS11人参皂苷显著增加，其中TS7人参愈伤组织中人参皂苷的含量增加1.95倍。
（5）人参细胞中JA和12-OH-JA提取及含量测定
取新鲜的人参愈伤组织置于液氮中研磨至干粉，称取适量并加入异丙醇-水-盐酸混合提取液，添加内标溶液，4℃振荡30min；加入二氯甲烷，低温振荡30min；4℃ 13000r/min离心5min，取下层有机相；避光，以氮气吹干有机相，以甲醇（0.1%甲酸）复溶，4℃ 13000×g离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，HPLC-MS/MS检测JA和12-OH-JA。
图8是PgJOX2基因瞬时沉默的人参愈伤组织中JA和12-OH-JA含量测定结果，其中CK为转空载体pART27后的人参愈伤组织；TS6、TS7和TS11为3个PgJOX2基因瞬时沉默（transient silence，TS）的人参愈伤组织；与对照CK相比，基因沉默的人参愈伤组织TS6、TS7和TS11的JA含量显著提高，其中TS7人参愈伤组织中JA的含量增加1.42倍，12-OH-JA含量降低至对照的0.54倍。表明沉默PgJOX2基因后，人参细胞中JA不能有效转变为12-OH-JA，进而诱导人参皂苷生物合成关键酶基因表达促进人参皂苷的积累。
Claims (8)
1.一种受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因，其特征在于，所述PgJOX2基因序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因，其特征在于，所述PgJOX2基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因，其特征在于，所述PgJOX2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因的重组载体，其特征在于，所述受冠菌素诱导的PgJOX2基因与植物表达载体组成所述重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述植物表达载体为pART27。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方式为：以SEQID NO.5所示的PgJOX2基因干扰片段以正反两个方向连接至pKANNIBAL载体中，再将pKANNIBAL载体中的基因干扰表达框连接至pART27载体中。
7.一种如权利要求1-3任一项所述的受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因或如权利4-6任一项所述的受冠菌素诱导的人参PgJOX2基因的重组载体在调节人参皂苷合成与积累中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人参PgJOX2基因在调节人参皂苷合成与积累中的应用方法为：通过基因编辑、干扰、沉默或敲除所述人参PgJOX2基因，提高人参发根、细胞、组织和植株中人参皂苷的含量。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113549630A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-10-26 | 湖南工程学院 | 一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的方法及应用 |
| CN114395563A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-04-26 | 湖南工程学院 | 调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与应用 |
| CN114507676A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-17 | 湖南工程学院 | 一种人参皂苷合成调节的PgJAR1基因及其编码蛋白与应用 |
| CN114634939A (zh) * | 2022-05-07 | 2022-06-17 | 湖南工程学院 | 一种调节人参中茉莉酸甲酯合成的PgJMT1基因及其应用 |
| CN114891803A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-08-12 | 湖南工程学院 | 一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用 |
| CN116891855A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-10-17 | 吉林农业大学 | 一种人参PgMYC24基因及其应用 |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113549630A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-10-26 | 湖南工程学院 | 一种人参PgJAZ1基因及基于该基因提高原人参三醇型皂苷的方法及应用 |
| CN114395563A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-04-26 | 湖南工程学院 | 调控人参细胞中JA-Ile转运的PgABCG11基因及其编码蛋白与应用 |
| CN114507676A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-17 | 湖南工程学院 | 一种人参皂苷合成调节的PgJAR1基因及其编码蛋白与应用 |
| CN114634939A (zh) * | 2022-05-07 | 2022-06-17 | 湖南工程学院 | 一种调节人参中茉莉酸甲酯合成的PgJMT1基因及其应用 |
| CN114891803A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-08-12 | 湖南工程学院 | 一种受茉莉酸甲酯诱导的人参PgWRKY40基因及其应用 |
| CN116891855A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-10-17 | 吉林农业大学 | 一种人参PgMYC24基因及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LI LI等: "Selection and validation of reference genes desirable for gene expression analysis by qRT-PCR in MeJA-treated ginseng hairy roots", PLOS ONE, vol. 14, no. 12, 5 December 2019 (2019-12-05), pages 1 - 16 * |
| 曲子越;李影;李林夕;王朝焕;王敏;尹静;: "RNAi载体构建新方法及其在植物次生代谢调控中的应用", 中草药, no. 07, 12 April 2017 (2017-04-12), pages 1458 - 1465 * |
| 林彦萍;张美萍;王康宇;孙春玉;王义;: "人参皂苷生物合成研究进展", 中国中药杂志, vol. 41, no. 23, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 4292 - 4302 * |
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