CN112592912B

CN112592912B - 糖苷酶及其编码基因和它们的应用

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Publication number: CN112592912B
Application number: CN202110017674.2A
Authority: CN
Inventors: 包崇卯; 许云辉; 毕春艳; 刘兴; 周国婷
Original assignee: Yunnan Yunuo Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Yunnan Yunuo Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2021-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-01-07
Also published as: CN112592912A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了一种糖苷酶及其编码基因和它们的应用。具体地，本发明提供了一种糖苷酶及其编码基因，含有该基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，以及以该糖苷酶在降解糖苷类化合物或制备药曲中的应用。将本发明提供的糖苷酶用于降解人参皂苷和/或绞股蓝皂苷时，均能够获得人参皂苷CK，转化率较高。

Description

糖苷酶及其编码基因和它们的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及糖苷酶及其编码基因和它们的应用。

背景技术

人参皂苷化合物K(人参皂苷Compound K，人参皂苷CK，结构式如下式所示)是二醇型人参皂苷在人体肠道内的主要代谢产物，属于稀有人参皂苷。研究发现，人参皂苷CK在体内外都有良好的抑制肿瘤细胞生长和转移的作用，是一种潜在抗肿瘤药物，并且在抗衰老、改善记忆、抗炎等各方面都有一定的疗效。因此，如何获得大量的人参皂苷CK是目前药学研究的重点。

目前，人参皂苷CK主要通过生物转化法或生物合成法获得。其中，生物转化法是利用有机体(细胞、细胞器)或酶作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系(包括细菌、真菌和植物组织等)对外源性底物进行结构修饰的化学反应。其本质是利用生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应。生物转化具有反应条件温和、不易破坏皂苷结构、副产物少、后处理简单及对环境友好等优点。近年来，以人参皂苷为原料进行生物转化以获得人参皂苷CK的研究越来越多，特别是利用微生物或酶对二醇型人参皂苷的C3和C20位的糖苷结构进行修饰，使含量较高的人参皂苷的糖苷经过水解作用，定向转化为人参皂苷CK。根据构成糖苷结构的糖基的不同，人参皂苷中常见的糖苷结构包括葡萄糖苷、木糖苷、乳糖苷、阿拉伯糖苷等。但是，现有的用于人参皂苷生物转化的酶活性较低，且大部分具有高度专一性，即仅可以特异性作用于某一种糖苷结构，而无法满足同时作用于一种以上糖苷结构的要求，从而导致转化率较低。因此，急需研发活性较高的酶用于配合使用提高生成人参皂苷CK的生物转化率。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供新型的活性较高的糖苷酶及其编码基因和它们的应用，特别是在制备药曲方面的应用。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种糖苷酶，该糖苷酶为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：1-5中任意一项所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)由在SEQ ID NO：1-5中任意一项所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。

本发明第二方面提供了编码第一方面所述的糖苷酶的基因。

本发明第三方面提供了含有第二方面所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。

本发明第四方面提供了一种组合物，该组合物含有第一方面所述的五种酶。

本发明第五方面提供了第一方面所述的糖苷酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、或者第四方面的组合物在制备人参皂苷化合物K和/或含有人参皂苷化合物K的药曲中的应用。

本发明第六方面提供了一种药曲的制备方法，该制备方法包括：将制曲原料与糖苷酶接触，以得到含有人参皂苷化合物K的药曲；其中，所述制曲原料为含有人参皂苷和/或绞股蓝皂苷的原料，所述糖苷酶为一种或多种第一方面所述的糖苷酶或者由第四方面所述的组合物提供。

本发明第七方面提供了由第六方面所述的制备方法制备得到的药曲。

本发明第八方面提供了第七方面所述的药曲在制备酒中的应用。

通过上述技术方案，将本发明提供的糖苷酶用于降解人参皂苷和/或绞股蓝皂苷时能够获得人参皂苷CK，并且人参皂苷CK的转化率在65％以上。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位(U)表示，本发明中β-葡萄糖苷酶酶活力单位的定义是：在pH5、40℃的条件下，以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物，每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的量为一个酶活单位；吡喃型阿拉伯糖苷酶酶活力单位的定义是：在pH5、40℃的条件下，以对硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷为底物，每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的量为一个酶活单位；呋喃型阿拉伯糖苷酶酶活力单位的定义是：在pH5、40℃的条件下，以对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷为底物，每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的量为一个酶活单位；鼠李糖苷酶酶活力单位的定义是：在pH5、40℃的条件下，以对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷为底物，每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的量为一个酶活单位；木糖苷酶酶活力单位的定义是：在pH 5、40℃的条件下，以对硝基苯基-β-D-木糖苷为底物，每分钟水解产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位。

第一方面，本发明提供了一种糖苷酶，其中，该糖苷酶为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：1-5中任意一项所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)SEQ ID NO：1-5中任意一项所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1-5中任意一项所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。其中，酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(a)衍生的蛋白质的底物转化率与(a)的底物转化率之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述酶的任意一个氨基酸残基位置上。

如前所述，本发明提供的酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)进行添加修饰，举例来说，(b)可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明提供的酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

上述糖苷酶可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的糖苷酶的基因。相应地，所述基因可以为如下的(1)或(2)：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO：6-10中任意一项所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码的酶的酶活性不变的DNA分子。其中，所述严格条件可以为：在6×SCC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SCC，0.1％SDS和1×SCC，0.1％SDS各洗膜一次。酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(2)编码的蛋白质的底物转化率与(1)编码的蛋白质的底物转化率之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述酶的活性一致的氨基酸序列。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6-10中任意一项所示。

如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了含有第二方面所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在本发明中，所述重组载体可以含有本发明提供的基因。重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pPICZɑA质粒。重组载体的构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用SalⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ等；对于pPICZɑA，可用NdeⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ、BamH、HindⅢ等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用EcoRⅠ和Xba I双酶切pPICZɑA及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。

在本发明中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明所述基因相连获得。优选地，所述表达盒还包括启动子和/或增强子。

在本发明中，所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞中获得。

本发明提供的重组菌可以含有本发明提供的重组载体。本发明提供的糖苷酶还可以通过以下方法制得：培养本发明提供的重组菌，诱导编码所述糖苷酶的基因的表达；分离提纯所表达的糖苷酶。

在本发明中，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中以获得重组菌，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为酵母，更优选为毕赤酵母。

第四方面，本发明提供了一种组合物，其特征在于，该组合物含有(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)所示的酶作为活性成分：

(I)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶(β-葡萄糖苷酶，β-glucosidase)；

(II)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶(吡喃型阿拉伯糖苷酶，α-L-Arabinopyranosidase)；

(III)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶(呋喃型阿拉伯糖苷酶，α-L-Arabinofuranosidase)；

(IV)由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶(鼠李糖苷酶，Rhamnosidase)；

(V)由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶(木糖苷酶，β-Xylosidase)。

在本发明中，以所述组合物的总重量为基准，所述酶的含量为10-90重量％。优选地，所述组合物中还可以含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂等。

本发明中，对所述组合物中各种酶的含量没有特别的要求，(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)所示的酶的酶活力之间的比值可以为1:0.5-2:0.5-2:0.5-2:0.5-2，优选为1:1:1:1:1。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的糖苷酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、或者第四方面所述的组合物在制备人参皂苷化合物K和/或含有人参皂苷化合物K的药曲中的应用。

本发明的糖苷酶能够降解糖苷类化合物(使糖苷类化合物中的糖苷键发生水解而断裂)，特别是含有葡萄糖残基的化合物、含有阿拉伯糖残基的化合物、含有鼠李糖残基的化合物、和/或含有β-木糖残基的化合物，尤其是人参皂苷类化合物。

第六方面，本发明提供了一种药曲的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将制曲原料与糖苷酶接触，以得到含有人参皂苷化合物K的药曲；

其中，所述制曲原料为含有人参皂苷和/或绞股蓝皂苷的原料，所述糖苷酶为一种或多种第一方面所述的糖苷酶或者由第四方面所述的组合物提供。

本发明中述及的人参皂苷和/或绞股蓝皂苷是指人参根、人参茎叶花及三七茎叶花等原料含有的本领域常见的各种人参皂苷和/或绞股蓝皂苷，例如人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg₃、人参皂苷Rh₂、人参皂苷C-O、人参皂苷C-Mx₁、人参皂苷C-Mc₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rf、人参皂苷Re、人参皂苷R₁、人参皂苷F1、人参皂苷C-Y、人参皂苷Mc、人参皂苷Rg₂、人参皂苷C-Mx、绞股蓝皂苷GypXVII和绞股蓝皂苷Gyp LXXV中的至少一种。

本发明中，所述制曲原料可以由含有人参皂苷和/或绞股蓝皂苷的材料(优选食品级)以及营养源组成。提供人参皂苷和/或绞股蓝皂苷的材料可以选自人参的根、人参的茎、人参的叶、人参的花、三七的茎、三七的叶和三七的花中的至少一种。营养源可以为糯米、玉米、高粱、黄黍、大豆、麸皮和稻壳中的至少一种。以干基计，提供人参皂苷和/或绞股蓝皂苷的材料与营养源的重量比可以为(3-5):1，优选为8：2。一般地，所述制曲原料为熟料，也即所述制曲原料经蒸煮后再与所述糖苷酶接触。

本发明中，所述接触的条件可以包括：相对于每克的制曲原料，糖苷酶的用量为1-10U，优选为1-6U。所述接触的条件还可以包括温度为30-50℃，优选为35-45℃。所述接触的条件还可以包括控制接触体系的湿度为60-100％，优选控制为70-90％。所述接触的条件还可以包括时间为10-100h，优选为60-75h。

本发明中，通过使用所述糖苷酶，可以将制曲的过程与降解糖苷类化合物获得人参皂苷CK的过程相偶联，这样使得操作上更加便捷。

第七方面，本发明提供了由第六方面所述的制备方法制备得到的药曲。本发明制得的药曲中含有丰富的人参皂苷CK，进一步进行发酵可以获得含有人参皂苷CK的酒制品。使用本发明获得的药曲生产酒制品的方法可以包括：将药曲、酵母与淀粉原料混合。相对于每千克的淀粉原料，所述药曲的用量为500-1000g。所述淀粉原料可以为常见的用于发酵制备酒制品的原料，如糯米、高粱和玉米中的至少一种。所述混合的条件包括：温度为20-40℃，湿度为50-70％，时间为20-40天。本领域技术人员公知的是，为了缩短混合时间，可以使用淀粉酶预先处理淀粉原料。

第八方面，本发明提供了第七方面所述的药曲在制备酒中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，人参和/或三七茎叶及花原料均购自云南昆明中药材市场(人参总皂苷含量为3-5重量％)；人参皂苷CK的转化率＝转化产物中CK的实际质量÷原料转化为CK的理论质量×100％。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的糖苷酶的制备。

(1)基因的获得

根据糖苷酶的核苷酸序列(对应的编号和编码的氨基酸序列如下所示)分别通过人工化学合成法(委托昆明硕擎生物科技有限公司)获得相应的基因。

(I)β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列(5’-3’)：

β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列：

(II)吡喃型阿拉伯糖苷酶

吡喃型阿拉伯糖苷酶的核苷酸序列(5’-3’)：

吡喃型阿拉伯糖苷酶的氨基酸序列：

(III)呋喃型阿拉伯糖苷酶

呋喃型阿拉伯糖苷酶的核苷酸序列(5’-3’)：

呋喃型阿拉伯糖苷酶的氨基酸序列：

(IV)鼠李糖苷酶

鼠李糖苷酶的核苷酸序列(5’-3’)：

鼠李糖苷酶的氨基酸序列：

(V)木糖苷酶

木糖苷酶的核苷酸序列(5’-3’)：

木糖苷酶的氨基酸序列：

(2)表达载体和重组菌株的构建

对由步骤(1)获得的基因以及毕赤酵母表达载体pPICZɑA(购于美国Invitrogen公司)均进行EcoR I和Xba I双酶切，然后使用T4连接酶(购于宝生物工程(大连)有限公司)将上述两个经酶切后的产物连接，获得重组质粒。

将获得的重组质粒转化毕赤酵母GS115(购自美国Invitrogen，货号为C18100)获得重组酵母。

(3)酶的制备

将得到的重组酵母接种于培养基BMGY(将10g酵母提取物、20g蛋白胨溶解到700mLddH₂O中，121℃下灭菌20min。待冷却至室温后加入1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6)100mL，10×YNB 100mL、10×G 100mL、500×B 2mL，混匀，4℃保存)中，28℃培养2-3d至OD₆₀₀A值在2-6之间，离心收集菌体用BMMY培养基(将10g酵母提取物、20g蛋白胨溶解到700mL ddH₂O中，121℃下灭菌20min。待冷却至室温后加入1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6)100mL，10×YNB 100mL、10×M 100mL、500×B 2mL，混匀，4℃保存)稀释至OD₆₀₀A＝1.0，在30℃继续培养，每隔24h添加0.5％甲醇诱导培养7d，离心收集上清，获得粗酶液。

将粗酶液置于冰上，缓慢加入磨碎的硫酸铵粉末，边加边搅拌，添加到硫酸铵饱和为止。在4℃静置24h左右，12000r/min离心50min，弃上清，用少量PBS溶解沉淀。将PBS溶解的沉淀透析，除去硫酸铵，重悬于含10mM咪唑的PBS缓冲液中。根据表达出的重组酶含有His标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化：磷酸缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)，1mL/min平衡Ni柱后，以流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样；继续使用含10mM咪唑的磷酸缓冲液1mL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白；以磷酸缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，500mM咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液1-5。纯化的酶液用10％SDS蛋白凝胶电泳检测。

(4)酶活力测定

分别吸取0.1mmol/L pNP溶液(对硝基苯酚，配制方法：准确称取对硝基苯酚13.9mg，用蒸馏水定容至1000mL)0.1mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL至10mL容量瓶中，用2mol/L碳酸钠溶液(配制方法：称取碳酸钠211.98g，定容至1000mL)定容后混匀。以蒸馏水作为空白，于405nm处比色，测定其吸光值，以对硝基酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

将10μL上述纯化的酶液和90μL的0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液于40℃水浴锅平衡5min，加入平衡后的5mmol/L的底物(分别为对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷和对硝基苯基-β-D-木糖苷)100μL(溶剂为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)，反应10min后，加入100μL 2mol/L碳酸钠溶液终止反应，测定405nm处的吸收值。经测定，纯化的酶液1-5的活力分别为150U/mL、86U/mL、107U/mL、43U/mL和112U/mL。

(5)复合酶制剂的配制

将得到的酶液1-5按照酶活力等比例混合，得到复合酶制剂。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的酶在制备含有人参皂苷CK的药曲中的应用。

配制制曲原料：根据投料量：麸皮12.5重量％，稻壳7.5重量％，三七茎叶干燥粉碎物(粒度400目)80重量％在拌麸机中加水将原料拌和均匀，备用；

蒸麸：物料均匀地送入蒸麸机，边投料边进汽，装完料后开大气蒸麸，圆汽后蒸60min，关汽后再焖麸20min。

冷却接种：蒸毕出机立即撒冷至50℃，加入复合酶制剂(相对于每克以干基计的制曲原料，复合酶制剂的用量为4U)，翻拌均匀。

装盘：装完盘后的品温控制在37.5±2.5℃，装盘疏松均匀，料层厚度不超过50cm。装盘后，表面上撒少许稻壳，用于吸收由曲料蒸发的水分，以利保潮，也可防止外界杂菌侵入。

保温处理：室温保持在38.5±1.5℃，品温控制在36.5±1.5℃。

保湿处理：送风用湿度大的循环风，相对湿度为92.5±2.5％，补充曲内的水分不足，减少水分的连接挥发，药曲湿度不低于70％。

出曲：药曲经过3天培养后，加大通风量(停止加湿)，排除曲料水分，控制出箱水分在25％以下，出箱的曲立即打散成粉状，打散的曲粉存放在阴凉通风处备用。所得药曲没有酸臭味及其它怪味，有独特的三七花叶药香味。

人参皂苷CK含量分析：将1g曲粉溶于100mL蒸馏水中，取20μL上清进高效液相色谱检测人参皂苷CK的生成量，检测方法为：采用汉邦C18 HPLC分析柱进行定量检测分析，分析流动相为甲醇：水＝92：8；流动相流速为1.0mL/min；检测时柱温为30℃；检测波长203nm。结果表明，所得药曲中人参皂苷CK的含量为0.05重量％，人参皂苷CK的转化率为75％。

实施例3

按照实施例2的方法制备含有人参皂苷CK的药曲，不同的是，将制曲原料中的“三七茎叶干燥粉碎物(粒度400目)”分别替换为“三七花干燥粉碎物(粒度400目)”、“栽培人参(根)干燥粉碎物(粒度400目)”和“人参茎叶干燥粉碎物(粒度400目)”。结果显示，所得药曲中人参皂苷CK的含量分别为0.048重量％、0.12重量％和0.037重量％，人参皂苷CK的转化率分别为69％、82％和71.5％。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的酶在制备酒中的应用。

将500公斤糯米用1.5倍清水浸泡24h后煮熟，放凉备用；按照0.65％的量往米饭中添加糖化酶(购自安琪酵母股份有限公司)和米饭重量1.5倍的凉白开，40℃保温12小时。然后用纱布过滤得到糖化醪液。

将酿酒酵母(活性干酵母，购自安琪酵母股份有限公司)用复水活化：取干酵母量8倍的39℃温水，将干酵母搅拌并溶解其中，34℃保温活化3.5小时。将实施例2获得的曲粉和活化后的酵母加入到糖化醪液中，每千克糯米加入700g药曲粉和350mg干酵母。将上述添加了酵母、药曲的糖化醪液密封，自然条件(温度为20℃±5℃，湿度为60％±5％)下发酵30天后酒精度达15％，经HPLC检测(条件同上)，人参皂苷CK的含量为1.2mg/L。空白对照组不加曲粉，发酵30天后酒精度为16％，说明本发明药曲的引入不会对制酒过程产生不良影响。

实施例5

按照实施例4的方法制酒，不同的是，将实施例2获得的曲粉分别替换为实施例3获得的曲粉，发酵30天后酒精度分别为14％、14％和15％，经HPLC检测(条件同上)，人参皂苷CK的含量分别为1.05mg/L、1.2mg/L和0.98mg/L。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南与诺生物工程有限责任公司

<120> 糖苷酶及其编码基因和它们的应用

<130> I45804YNU

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

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ttgaaggaac caaagatctt gtctttgttc ggttacgacg ctatcgctgc tcaaagaaac 1260

actgacatga acttgaagtc ttctaactgg ggtgacttga tgacttctaa gactttgtac 1320

ccaaacggta ctgttgactg tagaactcac aacaagttct tgttcatgca atctactaac 1380

ccatctatcg ttgctccatg taagaacttg aacggtacta tgatctctgg tggtggttct 1440

ggttctgaca ctccatctaa gatcgacgct ccaactgacg ctggtcaaag attggcttac 1500

gaagacaaca ctttcttggc ttgggacttc gcttctcaat ctccagttgt taacccagct 1560

tctgacgctt gtttggtttt catcaacgaa gctgctttcg gtaagtggga cagaccatac 1620

gttgctgacg ctacttctga cactttggtt gaaaacgttg cttctcaatg taacaacact 1680

atggttatca tgaacaacgc tggtatcaga ttggttgaca gatgggttga aaacccaaac 1740

atcactgctg ttatctacgg tcacttgcca ggtcaagact ctggtagagc tttggttgaa 1800

atcaactacg gtaagcaaac tccacacggt agattgccat acactgttgc taagaacgct 1860

tctgacaagg acggtttgtt gaacccagtt gttccatctg gtactatgga cttgactaga 1920

ccacaagaca acttcactga cttcgtttac atcgactacc acttgaacga acaaaagaac 1980

atcactggtc acactagatt cggttacggt ttgacttact ctagagaaga ctactctggt 2040

ttgaagatcc aatggcactc tggtgttaac actgactact tgccaccaaa ctctactatc 2100

gaaaagttgg gtatctctgc tttgtgggac gttgttgcta ctgttacttg ttctgtttct 2160

actggttgtt ctgttactaa ggctgaagtt gctcaattgc acaagttgtg gccaggtggt 2220

accgcggaga tctccgctgg ctctgagaag gagctttacc gagccgagta accagcaaga 2280

ctgacgtatg attgtagcag acgccacgtc agttcatccg atcgtgtgaa cgtcgcttcg 2340

gtatcgcaga agcgtgtata ttgcgtttat cgtggggata ctctgtctga tcacgcattg 2400

cagcgggcat cgacgctata a 2421

<210> 7

<211> 1569

<212> DNA

<213> 吡喃型阿拉伯糖苷酶

<400> 7

atgccaaagc actctttgga cttgaagcca ttcttcatgg aaaagtctag aaactacgtt 60

gacatgttgt tgaacttcag agttgctttg gacttcttgt ctcaaggtag aaacttgcac 120

ttgggtgaaa gacacgttga cggtttgtac tctttgaaca gagcttctgc tgacttcgac 180

aaggaataca gatctaacac tcacggttct aagggtaaca gagctactca ctggttgtac 240

ccaggtttca actacgttaa gtacactaga tggtctgaat ctactgttcc acaattggaa 300

agaccatctt ctactcactt gaactggcac tctagattgg aaaacttctt cagattgaac 360

aagttgaact ggtggttcaa caagttgaga ggtaacgaac caaacgacgc tgttaacttg 420

tctttgatgg gtttggaaac tgctttggac ttgttgttct acgctcaaat cccaaagggt 480

actaagtact tgacttctaa cagagctgaa ccatctgacc aaccattcgg taagaagatg 540

tggtgtttgg gtccaaacca agacggtcca gctcaaactt tccacaagtc tgctgaagac 600

tacggtactt tctacgcttc tgttttgaac tacaacagag ctatcgaccc aatgtgggaa 660

ttggttgttt ctacttcttc ttctggtgtt atggacaacg ctggttcttg ggaagaaact 720

tctatcgaat tcccattcga cttgaactct ttcgtttctt gtcacgctta caactctcca 780

aacttgcaat ctgaccactc tagaaacatg aaggctttct tgtactcttt gactagaatg 840

tactctactg aatctgacgt tgctagatct gaagacttcc acttggctag attgaagact 900

aagttggacg tttctatcac tttcgctgaa tggaacgttt ggcacttgaa cgaattccca 960

tctttgccac aatctggtga aggtaacaag ttgccatctc caagagaaga agaagacaag 1020

tactggaact ctaacgcttt gttgttcggt aagtctcact tgaactctaa cggtcactct 1080

gacagattga aggctgcttc taacagacaa ttggtttaca actacaacac tatcatgact 1140

gaaccaaaga tgggtgcttg gagacaaact actttccact tgaactcttt gactgctaag 1200

ttggctagag gtactactgt tttggaacca aagttggctt ctggtactta cgaaactgac 1260

aagtactcta gaactccaac tatcaactct gttaaccaaa ctcacgaaga cggtactatc 1320

tctgttgaag ttgctaacag acaaatggaa tctagaaacg acttcccaaa cactttgcca 1380

gaaggtttcg cttctgcttt ggttgaacac ttgactttgc acgaaaacga cttgttggct 1440

aagaacacta ctcacttgca aaacagagtt gttttgttcc caaacagaac tatcacttct 1500

gacttgaaca cttctttcgg taagttgaac ttgccaccag tttctgcttg gactttcggt 1560

gttaagtaa 1569

<210> 8

<211> 1509

<212> DNA

<213> 呋喃型阿拉伯糖苷酶

<400> 8

atgtccaagt acaactacaa cgccgtcaac gactccaagt acctcaacgg tgagatcgac 60

aagcgcccct acggtaactt catcgagcac ctcggtcgcg ccgtctacga gggtaagtac 120

gagcccgacg ccccctcctg ggacgagaac ggtttcgaga aggacgtcaa gctcaacgag 180

tccgagctca agtcccccaa cctccgctac cccggtgaga acttcgtctc cggttacctc 240

tggtccgacg gtaacggtcc caccgagcag cgcccccgcc gcctcgacaa ggcccgcgcc 300

accaccgagt ccaacttcca cggtaccaac gagttcatgg actggaagca cctcggtggt 360

gccgagatca ccaacgccgt caagctcggt tcccgcggtg aggacgaggc ccgcaacaac 420

gtccgctact gcctccaccc cggtggtacc tacctctccg acctccgcaa gctctccggt 480

tccaaggagc ccaacctctt caagatctgg gagctcggtt ccgagatgga ccacccctgg 540

cagaacggtc acaagcgcgc cgccgagtac ttccgctcct ggggttccca ctggaaggtc 600

atgaagcaca ccgaccccta catcgagatg gccgtctgcg gttcctccca ctccggtaac 660

cccacctccc tcgtctggga gctcgtcgtc ctccacctca actacgagct cgtctcctac 720

aactcctggc actcctacat cggtaaccgc cacgaggact ggcccaacta ctccgcccac 780

tccctcacca tccacctcaa ctggtccgag ctcatcaagc tctggcgcat cgagcgctcc 840

gccaagaaga tctggaagaa gtccctcaac acctccccct tcgagtggaa cgaggagtcc 900

gaccacctca acgagtggta caactacaac tcctggggtt ccgcccccct cctcgagcgc 960

cagctctcca tggaggccga cgccctcgtc ttcgagtgct ccctcttcaa gctcaacgag 1020

tgggccgacc gcgtcaagaa cgcctgcctc gcccagctcg tcttcgtcat cgccacctcc 1080

atgaaggact cccgcgaggc cctcatcacc cgccccacct actacctctt cggtctcgag 1140

tccctctccg accagggtac cgtcctctcc aacgccgtct cctccccctg gtacgacacc 1200

aaggacttct ccctccgcac ctggctcgag tccgtctccc acctcaacga ggagcactcc 1260

gagctcaccg tcttcgccgt caaccgcctc accgacgagc acaacgagga gctcgacatg 1320

cgcgacttcg agggttccgc cgtctccgag tacaacgtcc tcatgatgaa cgacgacaag 1380

gccaccaacg gtgagtccac catgaacgtc gtccccatcg agctctccaa cgccaaggtc 1440

ggtgacggtc gcctcaccgc caccctcccc cccaagtcct ggtacaacta ccgcatgtcc 1500

acccagtga 1509

<210> 9

<211> 2667

<212> DNA

<213> 鼠李糖苷酶

<400> 9

atgtccctgc ccgacgaggc caagctgaac cgcgaggccc tgaactccct gtccatggtc 60

cgctacgagg ccaagggtct gtacgtccag cagcacggtt ccgagtggac ccacgagtgc 120

cccctgtccc gcacccacaa ctcccgctcc ggttccttca tcgcccacct gaacttctcc 180

tacaactaca acctgcccac ctcctggggt accgagcgcc tgttcgccac ctccacccag 240

tcctggggtt cctacaacta caactcctgc cagctgcgct ccaagatcac cgaggactac 300

ggtaacgagt ggtccggttt ccgcaccttc cacccccagc agtggtccaa caactcccag 360

cgcaccgccc tgtacacctc caagtacacc tggatccacg gtcccttcgg tcccggtgac 420

aacaagctgg gtcgcggtct ggccaactcc ttccgcaacg agtggtccaa cgtccgctcc 480

ctgaagaact ccggttcctt cggtgagcag ggttacatgt cctggcagaa cctgaagctg 540

aaccgctccg gttccgtccg cgcctgcgag gccggtgcca tcaacggtaa ctccaacacc 600

cccgtccaca acctgcccgg tttctccgag tcctccaacc gccacaccaa cgagatctgg 660

gccggtatcg tcgagaccgt ctccttcgcc tgcggtaccc actgggacac cgcctccacc 720

tgggaggtct ccgacgagtt ccactacctg cgccgctacc agcccgccca gaactccgcc 780

ttcgcctccc tgaacgacta caccatgacc ttctcccgca cctacatccg caagggtacc 840

ctgtggaagg tctccaacga ggtcggtggt ttcggtccct actcctacat caactccgag 900

tcccccgagg actccaccga gtccaacacc aaccacctga acgtccccgc caacaccctg 960

aagctgtcct acggttccaa cgaggtcaac cagaccgagt ggaacaccgg taaggtcttc 1020

tacgagtggc tgatcgagga catcaaggag ggtgcctact acgagatcaa catctccatc 1080

cacttctccg agtacgccaa catccgcacc ggtaactccc tgttcgtcgc cctggaccac 1140

ctgcagatct cctccaagac caccggttcc tccggtacca tcgacggtgg tacctccggt 1200

ttccacctgt accaggacca gtccatgctg gtcaaggacg tcgaggtcat ctccttcaac 1260

ggtacccagt actaccgcaa ccccatgacc ctgtacaacg tcctggagga gaactccgtc 1320

aacctggccg cctccgaggt ctgcctggac ggtgccaagc gctcccactg ggtctggaac 1380

ggtcacttcc gcaagaactc cgaggtcatc cagtcctcca cctaccgctc ctccgagatc 1440

acctactccc tggagtactg gatctcccgc ttcaagctga tgtcctccca gtccgccggt 1500

tacttcgaga tgtcccccgc catgggtcag tcccgcaccc tgaacgacac ctacgcctcc 1560

ttcggtctgc tggactacca ggagttcctg tccaacgtct tcgccggtca cgcccgcaac 1620

tccggtgacc cccagttcgt cgccaagcac tggaacatga tccgcaagtc cgtcgaggcc 1680

atcctggagc gcatcgacga ctactccggt ctggcccagt ccgagcgcat cggtgccttc 1740

ttctccaagc tgaacaacgg taccgccgtc tccggtctgc gcgcccacac caaggaccag 1800

atggccaccg tcgcctggga gatgaacgag accggtcacg acaacatgtg gacccgctcc 1860

gccacctcca tcaaggccga gatcttccag ctggtcgtcc tgtcccgcct gtcctacctg 1920

gccaccgacc tgtccgacaa gctggagcag tccatcaccg gtaccgaggc cgcctccctg 1980

gccggtgtcg ccaacggtaa gaacgccgag ctgctgtccg cctccctgtc ccgcctgcgc 2040

ctgggtatcc actacaagac ctcctccctg gtcgcctcca actccaccga gaacctggcc 2100

cccttcctga ccggtttcat gctggagtcc atcctgcagg agtcccgcaa ctcccccaac 2160

tcctcccagg ccttctccac cgccatcgag gtcctgtccg accagctgtg ggccgccatg 2220

gtcacccaga ccaactactc caccggtacc acctggaagc tgtccatgcc cgacggtcgc 2280

cccaagaccc acggttacac ctcccacgcc cacggtcacc tgaactcccc cacctacgtc 2340

ctgtccgaga acgccgccgg tctgcaggcc accgaggccg gtttctccaa ctgggagttc 2400

ctgctggcct ccctggacgt ccacgtctcc tgggcccgcc tgctggtccc caccccccac 2460

ggtgccatcg ccgcctcctg gcgctccaac ggtacctccg tccagctgtc cgtctgcggt 2520

ccctccggta ccgagggtgt cgtctccgtc cccttcgacc gcgactccta ctccgtcaac 2580

ggtaagcagc agaacctgtc caaggacggt ctggaggccg ccgtctccgg tggttcctgc 2640

accgagcacc tgaaccgctc cggttga 2667

<210> 10

<211> 1569

<212> DNA

<213> 木糖苷酶

<400> 10

atgctgaaaa gcaacccgcg cctgaacggc ttttggccgg acccgagcga atgccgcgtc 60

ggcctggact attataaaac gacgagcacg tttgaaagct ttatcggcgt cagcatcgac 120

catctgaaag acctggtcaa cgaacgcctg tggggccata gcctgacgcg catgagccag 180

ctgtttatcc gcggcctgcc ggactttggc ggcatctggg ccccgcatct gaactatcat 240

ctgggcacgt tttggctgat cacgagcgac gtcgacctgt gggaaaacca tatctttgac 300

ggctttaaca tcctggtcac ggccaacaac agcaacggca aatggacgcg cccgcatctg 360

ctggacagca tcggcggcga catgagcctg tttatcgaca gcgacggcaa agtctatctg 420

tataactata actgggacca tcgcatcggc agctggggca aaggcggcat ctggctgcag 480

gaatggcgcg gccatgaaag cacgctggaa ggcgaaccga aagtcatcaa cacgggcacg 540

ggcggccgcc atctggaatg gccgcatctg catctgatgg aacgcagcta tcatctgctg 600

gacgccgaac atggcacggg ctatagccat ctgaacacga aagcccgcag catcgaaatc 660

aaaggcccgc atgaatataa cagctggctg ccgtttctga cgggccataa agaacgcaac 720

aaaccgatcc agctgaacgg ccatagcgaa ctggtccaga cgtattggag cgaatggaac 780

tttcatgccc tgtgggaacg cccgaaacat ggccgcgaag ccctgacgta tgaatggaac 840

acgcatgaac gcctgaacca tatcgaagaa agccagcgcc tgctgaacgg ccatagcacg 900

gccccgccgc tggaatggat gagcgacatc cgcacgctgc attataacta tagctggggc 960

gaccagagcg ccgacatcgg ccataacatg aactttagca gcgaacgcat cccgaactat 1020

aaagaactga cgacggaaca tagccgcccg aaccataaca gcatctatgg ccgcacgcat 1080

ctgatccatt ttgccacgca gaactgggtc gcccgcatcc cgcagagcct gcgctttacg 1140

gccgaaagca cggaactgaa ctttccggaa acgtttcaga aacgctatat cgccgtcaac 1200

tattataaca cgagcgaaac gaacgacctg caggtcagca gcctgcattt taactggggc 1260

cgcatcggcc atgtcacgat ctgccgcttt acgtttagca aaggcagcaa agccgaaatc 1320

gtcatcatcc aggaatggaa cctggacgac agccgcggcg tctgggaaac gtattattat 1380

agctattgca gccgcggcaa agactggtat ccgggcaacc tgagcgccgc cgaaagcaaa 1440

aaactgagcg accgcagcga acatgtccgc ggcggcggct ttatcacgca taacgtcggc 1500

atgcagtgcc agctgtggca ggcccatcag tttgccagct ttacgtatgc catgtataaa 1560

ccgcagtaa 1569

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Poly-Arg

<400> 11

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Poly-His

<400> 12

His His His His His His

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> FLAG

<400> 13

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Strep-tag II

<400> 14

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> c-myc

<400> 15

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

Claims

1.一种糖苷酶，其特征在于，该糖苷酶为（a）或（b）：

（a）由SEQ ID NO：1-5中任意一项所示的氨基酸序列组成的酶；

（b）由在SEQ ID NO：1-5中任意一项所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。

2.编码权利要求1所述的糖苷酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6-10中任意一项所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。

5.一种组合物，其特征在于，该组合物含有（I）、（II）、（III）、（IV）和（V）所示的酶作为活性成分：

（I）由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶；

（II）由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶；

（III）由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶；

（IV）由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶；

（V）由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的酶和/或由在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。

6.权利要求5所述的组合物在制备人参皂苷化合物K和/或含有人参皂苷化合物K的药曲中的应用。

7.一种药曲的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将制曲原料与糖苷酶接触，以得到含有人参皂苷化合物K的药曲，所述接触的条件包括：相对于每克的制曲原料，糖苷酶的用量为1-10U；温度为30-50℃；湿度为60-100%；时间为10-100h；

其中，所述制曲原料为含有人参皂苷和/或绞股蓝皂苷的原料，提供人参皂苷和/或绞股蓝皂苷的材料选自人参的根、人参的茎、人参的叶、三七的茎、三七的叶和三七的花中的至少一种；所述糖苷酶由权利要求5所述的组合物提供。

8.由权利要求7所述的制备方法制备得到的药曲，其特征在于，该药曲含有权利要求7中所述的糖苷酶。

9.权利要求8所述的药曲在制备酒中的应用。