CN109234254B

CN109234254B - 一种alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN109234254B
Application number: CN201811456929.XA
Authority: CN
Inventors: 李宜奎; 汪仁; 李洁; 李晓丹; 徐晟�
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN109234254A

Abstract

本发明涉及alpha‑葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明首次揭示了石蒜属植物忽地笑的alpha‑葡萄糖苷酶，其具有良好的转葡萄糖基活性，可以产生alpha‑葡萄糖苷物质。本发明还揭示了编码所述alpha‑葡萄糖苷酶的多核苷酸，表达所述alpha‑葡萄糖苷酶的载体与宿主细胞，以及生产α‑熊果苷的方法。

Description

一种alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及一种来源于石蒜科植物的alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。

背景技术

alpha-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase,α-glucosidase,EC 3.2.1.20)在植物体中具有重要的生理作用。淀粉的水解是植物种子萌发过程中最重要的事件之一，产生为胚芽生长提供能量的碳源物质—D-葡萄糖。在植物种子萌发过程中，alpha-葡萄糖苷酶作用于α-淀粉酶、β-淀粉酶和脱支酶水解淀粉产生的麦芽糖及麦芽寡糖，生成游离的D-葡萄糖。目前，研究者已对多种植物的alpha-葡萄糖苷酶编码基因进行了克隆和表达分析，发现不同来源的alpha-葡萄糖苷酶的底物特异性差异很大。荞麦和甜菜来源的alpha-葡萄糖苷酶具有长链麦芽寡糖的底物特异性，例如，二者对麦芽七糖的Kcat/Km值分别是其对麦芽糖的8倍和50倍；而大麦alpha-葡萄糖苷酶更倾向于催化短链底物。

alpha-葡萄糖苷酶不仅能够催化水解末端非还原性的α-1,4连接的葡萄糖苷键释放D-葡萄糖，还能够将从低聚糖类底物非还原末端释放的D-葡萄糖残基转移到另一糖类或苯酚类或蛋白质类底物的羟基形成α-1,6葡萄糖苷键，产生非发酵性的低聚异麦芽糖或糖苷、糖酯、糖肽等，在低聚异麦芽糖及一些非天然的alpha-葡萄糖苷等生产领域具有重要的应用。

忽地笑(Lycoris aurea)是多年生草本球根药用植物，属于石蒜科石蒜属，富含加兰他敏、石蒜碱、文殊兰碱等石蒜科植物所特有的生物碱(石蒜科生物碱)与其它生物碱、以及其它类型的植物天然产物(如alpha-葡萄糖苷等)。这些天然产物具有重要的生物活性和应用价值。例如，加兰他敏作为一种特定的、竞争性的、可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，在临床上用于治疗阿尔茨海默病(老年痴呆症)。又例如，作为一种苯酚衍生物，α-熊果苷(对-羟基苯-alpha-D-吡喃葡萄糖苷)通过其糖苷键的水解缓慢释放活性组分氢醌(对-羟基苯酚，对苯二酚)，能够抑制参与黑色素合成的关键酶酪氨酸酶的活性。相较于氢醌，α-熊果苷是一种安全、温和的用于治疗色素沉着过度失调症的试剂。此外，α-熊果苷还能保护肌肤免受自由基的侵害，亲水性佳，在化妆品工业具有巨大的市场潜力。这些天然产物具有广泛的应用和需求。在这些天然产物的生物合成过程中，alpha-葡萄糖苷酶其中。但是，石蒜属植物alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因尚未被分离与克隆。因此，本领域有必要开发石蒜属植物忽地笑的alpha-葡萄糖苷酶。该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式进行天然产物的生物转化与生物合成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石蒜科植物的alpha-葡萄糖苷酶，所述的alpha-葡萄糖苷酶选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；或

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1─51个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有alpha-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或

(c)与SEQ ID NO:1氨基酸序列有至少82％序列相同性，且具有alpha-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明SEQ ID NO:1所示的蛋白质是从忽地笑(Lycoris aurea)中分离得到的一种新的alpha-葡萄糖苷酶。为便于表述，将SEQ ID NO:1所示的蛋白质命名为alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2。

在一个优选例中，所述的alpha-葡萄糖苷酶活性是指利用麦芽糖为底物，产生D-葡萄糖。

在另一个优选例中，所述的alpha-葡萄糖苷酶活性是指以麦芽糖为糖基供体，催化转糖基反应合成alpha-葡萄糖苷产物。

在另一个优选例中，所述的序列(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

本发明的另一目的在于提供分离的多核苷酸，该多核苷酸是编码所述alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用合适特定物种表达的密码子。因而，本发明alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸还包括由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到的编码具有alpha-葡萄糖苷酶活性的核苷酸序列。

本发明的又一目的是提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。所述的载体是将本发明的编码所述alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明所述alpha-葡萄糖苷酶的重组表达载体或抑制本发明所述alpha-葡萄糖苷酶编码多核苷酸表达的基因沉默载体。

在一个优选例中，该载体是含有编码所述alpha-葡萄糖苷酶的SEQ ID NO:2所示序列的重组表达载体pET28a-LaAgl2。

在另一个优选例中，该载体是含有编码所述alpha-葡萄糖苷酶的SEQ ID NO:2所示序列中第154-2961位多核苷酸的重组表达载体pET28a-LaAgl2(ΔN51)。

本发明的又一目的是提供一种表达构建物。所述表达构建物包括以下酶的编码基因和/或基因表达盒：

所述的alpha-葡萄糖苷酶；和/或

糖基受体生物合成酶。

所述基因表达盒是酶在宿主细胞中表达与调控所需要的生物学元件，包括启动子、增强子、衰减子、核糖体结合位点、Kozak序列、内含子和/或转录终止子等；此外，还可包括标签编码序列和/或信号(肽)编码序列等。

在一个优选例中，所述的表达构建物还包括大肠杆菌启动子、大肠杆菌核糖体结合位点和/或大肠杆菌转录终止子。

本发明的又一目的是提供一种宿主细胞，它含有所述的载体或表达构建物或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。将所述的重组表达载体或者基因沉默载体或者表达构建物导入所述的适当宿主细胞中，获得表达本发明所述alpha-葡萄糖苷酶的基因工程菌株、转基因细胞系、转基因愈伤、转基因组织、转基因植株或者基因工程植株。更佳地，所述的宿主细胞是内源存在糖基受体物质或其前体的细胞。

本发明的又一目的是提供所述的alpha-葡萄糖苷酶的用途，用于转葡萄糖基给糖基受体，产生alpha-葡萄糖苷产物。

在一个优选例中，所述的糖基受体是对苯二酚；或所述的产物是α-熊果苷。

本发明的又一目的是提供所述的表达构建物的用途，用于生产α-熊果苷。

本发明的又一目的是提供一种生产α-熊果苷的方法。所述方法包括：利用所述的alpha-葡萄糖苷酶，以麦芽糖为糖基供体，以对苯二酚为糖基受体，合成α-熊果苷。

在一个优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，利用转化的宿主细胞催化对苯二酚和麦芽糖合成α-熊果苷；所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。

本发明首次揭示了石蒜科植物忽地笑来源的alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2，其具有良好的转葡萄糖基产生alpha-葡萄糖苷的活性。本发明还揭示了编码所述alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸、表达所述alpha-葡萄糖苷酶的表达载体及宿主细胞。本发明应用石蒜科植物来源的alpha-葡萄糖苷酶，可以实现天然产物(例如但不限于α-熊果苷)的生物转化以及生物合成。

附图说明

图1是alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2和LaAgl2(ΔN51)合成α-熊果苷的HPLC检测图。

具体实施方式

以下结合具体实施例并附图，进一步阐述本发明。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2编码基因的克隆

合成两条引物分别具有序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

以从忽地笑中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上两条引物SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4进行PCR。DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的

Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增程序为：95℃5min；94℃45s,56℃45s，72℃3min，共30个循环；72℃10min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

在紫外灯照射下，切下目标DNA条带。然后采用多功能DNA纯化试剂盒(离心柱型)(北京百泰克生物技术有限公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的alpha-葡萄糖苷酶编码基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的pMD19-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到pMD19-T载体，所构建的载体命名为pMDT-LaAgl2。经测序获得alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2的编码基因序列。

alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2编码基因具有序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列。自SEQ ID NO:2的5’-端第1-2961位核苷酸为alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2编码基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID NO:2的5’-端的第1-3位核苷酸为alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2编码基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:2的5’-端的第2959-2961位核苷酸为alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2编码基因的终止密码子TAG。alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2编码基因编码一个含有986个氨基酸的蛋白质LaAgl2，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为109 916Da，等电点pI为5.19。

实施例2、alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2重组表达载体的构建

(1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的5’-端分别设置NheI和NotI两个酶切位点及其保护碱基序列，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同实施例1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经NheI和NotI双酶切，利用宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的T4DNA连接酶连接同样经NheI和NotI双酶切的pET28a载体(Novagen)中。连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证获得阳性转化子。通过测序进一步验证重组质粒pET28a-NheI-LaAgl2-NotI构建成功，并在NheI和NotI酶切位点之间含有SEQ ID NO:2的全长多核苷酸序列。所获得的重组质粒命名为pET28a-LaAgl2。

(2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的5’-端分别设置NheI和NotI两个酶切位点及其保护碱基序列，以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同实施例1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经NheI和NotI双酶切，利用T4DNA连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))连接同样经NheI和NotI双酶切的pET28a载体(Novagen)中。连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加卡那霉素(终浓度为25μg/mL)的LB平板上。通过菌落PCR验证获得阳性转化子。测序进一步验证重组质粒pET28a-NheI-LaAgl2(ΔN51)-NotI构建成功，并在NheI和NotI酶切位点之间含有SEQ ID NO:2多核苷酸序列中154-2961位核苷酸。所获得的重组质粒命名为pET28a-LaAgl2(ΔN51)。

实施例3、alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2和LaAgl2(ΔN51)的表达

(1)将重组质粒pET28a-LaAgl2利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌Rosseta(DE3)/pET28a-LaAgl2。挑取单克隆过夜培养，再将菌液按100倍稀释于含卡那霉素(终浓度为25μg/mL)的LB培养基中培养。待菌液生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行诱导培养，培养温度为25℃。

(2)将重组质粒pET28a-LaAgl2(ΔN51)利用热击法(42℃，90s)转化进入大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌Rosseta(DE3)/pET28a-LaAgl2(ΔN51)。挑取单克隆过夜培养，再将菌液按100倍稀释于含卡那霉素(终浓度为25μg/mL)的LB培养基中培养。待菌液生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行诱导培养，培养温度为25℃。

实施例4、alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2和LaAgl2(ΔN51)合成α-熊果苷

(1)配制200mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)。

(2)收集诱导12h的细菌培养液于8000rpm、4℃离心5min，弃上清后用0.85％NaCl溶液洗涤菌体1次。菌体用麦芽糖(1.5M)-磷酸钠缓冲液(pH 7.2,125mM)重悬后全部转移到250ml无菌三角瓶中，加入对苯二酚(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)母液至终浓度为100mM-250mM，混匀，于25℃-40℃、160rpm-250rpm震荡培养16h–24h。

(3)取生物转化液于沸水煮10min。室温下，12000rpm，离心5min。取上清用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液上样高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。分析条件为：采用LC-20A高效液相色谱仪(岛津，日本)，InertSustain C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温30℃，二极管阵列检测器，波长282nm，进样量10μl，流动相为20％甲醇(v/v)，流速0.8mL/min，等度洗脱。分析结果如图1，结果表明：alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2和LaAgl2(ΔN51)均能够合成产物α-熊果苷；α-熊果苷含量达到15g/L-38g/L。可以理解为，alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2和LaAgl2(ΔN51)均具有转葡萄糖基活性，可用于糖基受体的葡萄糖基化产生alpha-葡萄糖苷。

上述参照具体实施方式是对该一种alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用所进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例；因此，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修饰，在不脱离本发明总体构思下的变化和修改同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 986

<212> PRT

<213> 忽地笑(Lycoris aurea L'Hér. Herb)

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (1)..(986)

<400> 1

Met Val Glu Asn Ser Arg Ser Ser Ser Gly Lys Met Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ile Val Glu Glu Gly Val Phe Arg Phe Asp Cys Ser Ser Asp Val Arg

20 25 30

Ser Lys Ala Phe Pro Ser Leu Ser Phe Ala Asp Pro Lys Val Arg Glu

35 40 45

Thr Leu Ile Met Thr Tyr Lys Val Pro Glu Phe Val Pro Glu Phe Thr

50 55 60

Cys Phe Asp Gly Gly Asp Gln Ile Val Val Leu Gln Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Thr Ser Phe Tyr Gly Thr Gly Glu Val Ser Gly Gln Leu Glu Arg Thr

85 90 95

Gly Lys Arg Ile Phe Thr Trp Asn Thr Asp Ala Trp Gly Tyr Gly Pro

100 105 110

Glu Thr Thr Ser Leu Tyr Gln Ser His Pro Trp Val Leu Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Asp Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ala Asp Thr Thr Arg Arg Cys

130 135 140

Glu Ile Asp Leu Trp Glu Ser Ser Thr Ile Lys Phe Lys Ala Val Ala

145 150 155 160

Val Tyr Pro Val Ile Thr Phe Gly Pro Phe Glu Ser Pro Thr Glu Val

165 170 175

Leu Val Ser Leu Ser His Ala Ile Gly Thr Val Phe Met Pro Pro Lys

180 185 190

Trp Ser Leu Gly Tyr His Gln Cys Arg Trp Ser Tyr Asp Ser Asp Val

195 200 205

Lys Val Leu Lys Ile Ala Arg Thr Phe Arg Glu Lys Gly Ile Pro Cys

210 215 220

Asp Val Ile Trp Met Asp Ile Asp Tyr Met Asp Gly Phe Arg Cys Phe

225 230 235 240

Ser Phe Asp Gln Glu Arg Phe Pro Asp Pro Lys Ser Met Val Asn Asp

245 250 255

Leu His Ala Ile Gly Phe Lys Ala Ile Trp Met Leu Asp Pro Gly Ile

260 265 270

Lys Ser Glu Glu Gly Tyr Phe Val Tyr Asp Ser Gly Ser Glu Asn Asp

275 280 285

Val Trp Ile Leu Thr Ala Asp Gly Lys Pro Tyr Val Gly Glu Val Trp

290 295 300

Pro Gly Pro Cys Val Phe Pro Asp Phe Thr Gln Glu Lys Thr Gln Ser

305 310 315 320

Trp Trp Ala Lys Leu Val Lys Gly Phe Ile Ala Asn Gly Val Asp Gly

325 330 335

Ile Trp Asn Asp Met Asn Glu Pro Ala Ile Phe Lys Ser Val Thr Lys

340 345 350

Thr Met Pro Glu Ser Asn Ile His Arg Gly Asp Ala Glu Leu Gly Gly

355 360 365

Cys Gln Asn His Ser Tyr Tyr His Asn Val Tyr Gly Leu Leu Met Ala

370 375 380

Arg Ser Thr Tyr Glu Gly Met Lys Met Ala Ser Glu Ser Arg Arg Pro

385 390 395 400

Phe Val Leu Thr Arg Ala Gly Phe Ile Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Ala

405 410 415

Thr Trp Ser Gly Asp Asn Leu Ser Thr Trp Glu His Leu His Met Ser

420 425 430

Leu Pro Met Val Leu Gln Leu Gly Leu Ser Gly Gln Pro Leu Ser Gly

435 440 445

Pro Asp Ile Gly Gly Phe Ala Gly Asn Ala Thr Pro Lys Leu Phe Gly

450 455 460

Arg Trp Met Gly Val Gly Ala Met Phe Pro Phe Cys Arg Gly His Ser

465 470 475 480

Glu Ala Gly Thr Ile Asp Gln Glu Pro Trp Ser Phe Gly Glu Glu Cys

485 490 495

Glu Glu Val Cys Arg Arg Ala Leu Met Arg Arg Tyr Arg Leu Ile Pro

500 505 510

His Ile Tyr Thr Leu Phe Tyr Met Ala His Thr Lys Gly Ser Pro Val

515 520 525

Ala Ala Pro Ser Phe Phe Ala Asp Pro Glu Asn Leu Ile Leu Arg Thr

530 535 540

Val Glu Asn Ser Phe Leu Leu Gly Pro Leu Leu Ile Cys Ser Ser Thr

545 550 555 560

Thr Pro Asp His Gly Ser His Glu Val Ser His Val Leu Pro Ser Gly

565 570 575

Thr Trp Leu Arg Phe Asp Phe Cys Asp Ser His Pro Asp Leu Pro Thr

580 585 590

Leu Tyr Leu Gln Gly Gly Ser Ile Ile Pro Val Gly Ser Pro Val Gln

595 600 605

His Ile Gly Glu Ala Asn Leu Thr Asn Glu Leu Ser Leu Phe Val Ala

610 615 620

Leu Asp Asn Asn Gly Lys Ala Glu Gly Val Leu Phe Glu Asp Asp Gly

625 630 635 640

Asp Gly Tyr Gly Tyr Thr Gln Gly Ala Tyr Leu Leu Thr Tyr Tyr Val

645 650 655

Ala Glu Leu Gln Ser Ser Ile Ile Thr Val Lys Val Ser Lys Thr Glu

660 665 670

Gly Ser Trp Lys Arg Pro Lys Arg Val Leu His Val Leu Ile Leu Leu

675 680 685

Gly Gly Gly Ala Met Ile Asp Arg Lys Gly Ala Asp Gly Glu Glu Ile

690 695 700

Glu Ile Thr Ile Pro Ser Glu Ser Glu Val Ser Asn Leu Val Val Ala

705 710 715 720

Ser Glu Asn Gln Tyr Gln Met Gln Ile Glu Arg Ala Lys Arg Ile Pro

725 730 735

Asp Val Tyr Arg Leu Pro Gly Gln Lys Gly Ile Glu Leu Ser Lys Thr

740 745 750

Pro Val Asp Leu Lys Ser Gly Asp Trp Ala Leu Lys Val Val Pro Trp

755 760 765

Ile Gly Gly Arg Ile Ile Ser Met Ile His Leu Pro Ser Gly Thr Gln

770 775 780

Trp Leu His Cys Arg Val Glu Ile Asp Gly Tyr Glu Glu Tyr Ser Gly

785 790 795 800

Val Glu Tyr Arg Ser Ala Gly Cys Thr Glu Gln Tyr Thr Val Val Glu

805 810 815

Arg Asp Leu Glu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Ser Leu Cys Leu Glu Gly

820 825 830

Asp Ile Gly Gly Gly Leu Ile Leu Gln Arg Gln Ile Ser Thr Pro Lys

835 840 845

Asp Ala Ser Lys Ile Leu His Ile Asp Ser Ser Ile Ile Ala Arg Ser

850 855 860

Val Gly Ala Gly Ser Gly Gly Tyr Ser Arg Leu Val Cys Leu Arg Val

865 870 875 880

Arg Pro Met Phe Thr Leu Leu His Pro Thr Glu Val Ser Ile Ala Phe

885 890 895

Thr Ser Val Asp Gly Ser Glu His Glu Leu His Pro Glu Ser Gly Glu

900 905 910

Gln Thr Phe Glu Gly Pro Leu Gln Pro Asn Gly Glu Trp Arg Leu Val

915 920 925

Asp Lys Cys Ala Gly Leu Ser Leu Val Asn Arg Phe Tyr Leu Asn Gln

930 935 940

Val Asn Lys Cys Leu Ile His Trp Gly Ser Gly Thr Val Asn Leu Glu

945 950 955 960

Leu Trp Ser Glu Glu Arg Pro Val Ser Lys Glu Thr Pro Leu Arg Ile

965 970 975

Ser His Glu Tyr Glu Val Glu His Leu Ser

980 985

<210> 2

<211> 2961

<212> DNA

<213> 忽地笑(Lycoris aurea L'Hér. Herb)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2961)

<400> 2

atggtggaga attcgaggag tagcagtgga aagatggtgt tcgagcctat tgtcgaagaa 60

ggagttttcc gattcgattg ctcgtcagat gttcgatcga aggcgtttcc gagcttatct 120

ttcgccgatc cgaaggttag ggagacgttg atcatgactt acaaggtgcc tgagttcgtg 180

cctgagttca cctgcttcga cggcggcgat cagattgttg ttcttcagct tcctaatgga 240

acctcatttt acggaactgg agaagtgagt ggacagctcg agcggacagg gaagcggatt 300

ttcacgtgga acacggatgc atggggttat ggtccagaaa ccacatcgtt ataccagtca 360

catccttggg ttcttgcgct acttcctgat gggagggcat taggggtact tgctgacaca 420

actcgacgtt gtgagattga tctatgggaa agttctacca taaagtttaa ggctgtggct 480

gtttaccccg tcatcacatt tggcccattt gagtcgccta ctgaagtcct tgtatctctc 540

tctcatgcca taggaactgt ttttatgcct ccaaaatggt ctcttggtta ccatcaatgt 600

cgctggagct atgattctga tgttaaagtc cttaagattg ctagaacatt tcgagagaaa 660

ggcataccct gtgacgtcat atggatggat attgattaca tggatgggtt tcgatgtttt 720

tcctttgacc aagagcgctt ccctgatccc aaatctatgg taaatgatct tcatgccatt 780

ggtttcaaag caatctggat gcttgaccct gggattaaaa gtgaagaagg ctacttcgtt 840

tatgatagcg gatctgaaaa tgatgtctgg atcctgacgg cggatggcaa accttatgtt 900

ggggaggtat ggcctggacc ttgtgttttc ccagatttca cacaagaaaa aacacaatca 960

tggtgggcaa agttagtaaa aggcttcatt gctaatggtg ttgatggaat atggaatgat 1020

atgaatgaac ctgctatttt caaatctgtg acaaaaacaa tgcctgagag caacatccat 1080

agaggtgacg ctgaacttgg tggctgccaa aatcactctt actaccacaa tgtctatggt 1140

ttattgatgg caagatcaac ttatgaaggc atgaaaatgg ctagtgagag tagacggcct 1200

tttgttctca caagagctgg ttttattgga agccaacggt atgcagcaac ctggagtggg 1260

gataacctat caacctggga gcacctacat atgagtttac ccatggtgct tcaattgggc 1320

ctcagtggtc agcctctatc agggccagat ataggtggct ttgccggaaa tgcaacacca 1380

aagctttttg gaagatggat gggtgtaggt gccatgtttc ctttttgccg tgggcactct 1440

gaagcgggaa ccattgacca ggagccatgg tcatttggag aagagtgtga agaagtgtgc 1500

cgccgtgcat tgatgaggcg ctatcggctt atacctcaca tatatactct tttttatatg 1560

gcacatacaa agggctctcc tgttgcagct ccttcctttt ttgctgatcc agaaaatttg 1620

attttgagga cagttgaaaa ttcatttctg ctcgggccac ttttaatttg ttcaagcaca 1680

acacctgatc atggatcaca tgaagtgtca catgtcttac caagtggaac ctggctgcga 1740

tttgattttt gtgattcaca tccagacttg cctacccttt atctgcaagg ggggtcaata 1800

attcctgttg gttctccagt tcagcatatt ggtgaagcaa atctgaccaa tgagctatca 1860

ctgtttgttg ctttagacaa taatggtaaa gcagaaggtg ttttatttga ggatgatggt 1920

gatggatatg ggtatactca aggggcctat ctcttgacat attacgttgc tgaactgcaa 1980

tcttcaatta ttaccgttaa agtctccaaa acagaaggat catggaagag gccaaagcgt 2040

gttctgcacg tgcttattct cttgggtgga ggtgctatga ttgacagaaa gggtgctgat 2100

ggagaggaaa tagaaattac aatcccatca gaatccgaag tctctaactt ggtagtagca 2160

agtgaaaatc agtaccaaat gcagatagaa agagcaaaac ggatcccaga tgtatatcga 2220

cttccaggac agaaaggaat tgaactctcc aaaactcctg ttgatctaaa gagtggtgac 2280

tgggctctta aagtggtgcc ttggattggc ggtcgaatta tctctatgat tcatcttcct 2340

tctgggaccc aatggcttca ttgcagagtt gaaatcgatg gttatgaaga atatagtggt 2400

gttgagtacc gatctgcggg atgcaccgag caatatacag ttgttgagag ggatcttgag 2460

cagtcaggag aggaagaatc tctttgctta gaaggggata taggcggtgg attaattctc 2520

caacgccaaa tatctactcc aaaagatgct tcaaagattc tccatattga ttctagcatt 2580

atagctcgca gtgtgggagc cggttctggt ggatattcaa ggttggtttg tttgcgggta 2640

cgtccaatgt ttactcttct tcaccccact gaagtttcca ttgccttcac ttcagtcgac 2700

ggttcagagc atgaactcca cccagaatct ggggaacaaa cttttgaggg acctctccaa 2760

cctaacggtg aatggaggtt ggtcgacaaa tgtgcaggtc ttagtttggt taaccgtttc 2820

tacttgaatc aggtaaataa atgtttgata cactggggat cgggaaccgt gaacttggag 2880

ttgtggtctg aagagaggcc agtttctaag gaaactcctc tcagaatttc tcatgaatat 2940

gaagtggaac atctttcata g 2961

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<400> 3

cgggtacgaa aatggtggag aa 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(26)

<400> 4

gataggcaca agatcacata atggac 26

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (21)..(48)

<400> 5

gggaattcca tatggctagc atggtggaga attcgaggag tagcagtg 48

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (21)..(49)

<400> 6

gggaattcca tatggctagc atgacttaca aggtgcctga gttcgtgcc 49

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (19)..(45)

<400> 7

ccgctcgagt gcggccgctt atgaaagatg ttccacttca tattc 45

Claims

1.一种alpha-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的alpha-葡萄糖苷酶选自：

(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；或

(b) 氨基酸序列如SEQ ID NO:1的52-986位所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸，所述的多核苷酸包括分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.权利要求3所述的载体的用途，其特征在于：表达权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

6.权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶的用途，其特征在于，转葡萄糖基给糖基受体产生alpha-葡萄糖苷。

7.一种表达构建物，其特征在于，所述表达构建物包括以下酶的编码基因和基因表达盒：权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中包括权利要求7所述的表达构建物；所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

9.根据权利要求8所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌或乳酸菌，所述的真核细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

10.根据权利要求9所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的真菌细胞包括酵母细胞。

11.根据权利要求8所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是内源存在糖基受体或其前体的细胞。

12.权利要求7所述的表达构建物或权利要求8-11任一项所述的宿主细胞的用途，其特征在于，生产alpha-葡萄糖苷。

13.一种生产α-熊果苷的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶生产α-熊果苷；所述的方法包括：以权利要求3所述的载体或权利要求7所述的表达构建物转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，合成α-熊果苷；所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

14.根据权利要求13所述的一种生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述的原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌或乳酸菌；所述的真核细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

15.根据权利要求14所述的一种生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述的真菌细胞包括酵母细胞。

16.根据权利要求13所述的一种生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述宿主细胞是内源存在对苯二酚或其前体的细胞。