TW202237833A - 經工程處理之醣基轉移酶及甜菊糖之葡萄糖苷化方法 - Google Patents
經工程處理之醣基轉移酶及甜菊糖之葡萄糖苷化方法Info
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Abstract
本發明提供經工程處理之醣基轉移酶(GT)酵素、具有GT活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶(SuS)酵素、具有SuS活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明亦提供包含該GT酵素的組成物及使用該經工程處理之GT酵素來製造具有β-葡萄糖鍵結之產物的方法。本發明進一步提供用於生產甜菊糖苷(rebaudiosides) (譬如,甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I及甜菊糖苷D)的組成物及方法。本發明亦提供包含該SuS酵素的組成物及使用其等的方法。亦提供用於生產GT及SuS酵素的方法。
Description
此申請案主張2017年2月3日提申之美國臨時專利申請案第62/454,417號以及2017年3月30日提申之美國臨時專利申請案第62/479,262號的優先權,二者為所有目的係以其等之整體在此併入以作為參考資料。
本發明提供經工程處理之醣基轉移酶(GT)酵素、具有GT活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶(SuS)酵素、具有SuS活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明亦提供包含該GT酵素的組成物及使用該經工程處理之GT酵素來製造具有β-葡萄糖鍵結之產物的方法。本發明進一步提供組成物及用於生產甜菊糖苷(rebaudiosides) (譬如,甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I及甜菊糖苷D)的方法。本發明亦提供包含該SuS酵素的組成物及使用其等的方法。亦提供用於生產GT及SuS酵素的方法。
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序列表之正式影本,檔名為「CX8-162WO3_ST25.txt」,於2018年1月24日創建且大小為31,099千位元組,係經由EFS-網以ASCII格式化文字檔、與本說明書同時提交。經由EFS-網提申之序列表為本說明書的一部分且以其之整體在此併入以作為參考資料。
醣基轉移酶(GT)為由一種經活化的核苷糖轉譯後轉移醣基殘基至單體及聚合型受體分子(諸如,其他糖類、蛋白質、脂質及其他有機受質)的酵素。因而,此等酵素使用一種經活化的予體糖受質其含有一種經取代的磷酸脫離基。予體糖受質(即,「醣基予體」)通常活化為核苷二磷酸糖。然而,也使用其他糖類,諸如核苷單磷酸糖、脂質磷酸鹽及未取代的磷酸鹽(參見諸如,Lairson等人,Ann. Rev. Biochem., 77:25.1-25.35 [2008])。GTs根據受質及反應產物的立體化學,而分類為保留酶或轉化酶(inverting enzymes)。予體變旋異構鍵之立體化學保留(諸如,α至α)的反應中,GT為保留酶。立體化學轉化(諸如,α至β)的反應中,GT為轉化酶。此等醣基化產物涉及各種的代謝途徑及過程。更確切地,許多雙醣類、寡醣類及多醣類之生物合成涉及各種的醣基轉移酶作用。葡萄糖苷基部分的轉移能改變細胞內受體的生物活性、溶解度及轉移性質。GTs可用於特定化合物之靶定合成(諸如,醣基綴合物(glycoconjugates)及醣苷),以及生產差別醣基化藥物、生物探針或天然產物庫。於一些方法中,大規模使用GTs於醣基綴合物合成需要大量醣基予體,增加此方法的成本。已經開發出核苷酸回收系統以允許由釋放的核苷酸再合成醣基予體。此等回收系統也減少反應期間形成核苷酸副產物的量,藉此減少GT引致的抑制作用。然而,適合由GTs大規模生產醣基綴合物之改良的方法仍然有需要。
本發明提供經工程處理之醣基轉移酶(GT)酵素、具有GT活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶(SuS)酵素、具有SuS活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明亦提供包含該GT酵素的組成物及使用該經工程處理之GT酵素來製造具有β-葡萄糖鍵結之產物的方法。本發明進一步提供組成物及用於生產甜菊糖苷(rebaudiosides) (譬如,甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I及甜菊糖苷D)的方法。本發明亦提供包含該SuS酵素的組成物及使用其等的方法。亦提供用於生產GT及SuS酵素的方法。
本發明提供經工程處理之醣基轉移酶,其包含與序列辨識編號:2有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之多肽序列。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與下列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性的一多肽:序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少90%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少91%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少92%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少93%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:44、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少94%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少95%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少96%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少97%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:44、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少98%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含與序列辨識編號:44、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088有至少99%的序列同一性的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含選自於序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088的一多肽。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶係選自於β-1,2-醣基轉移酶及β-1,3-醣基轉移酶。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶優先使用除了尿嘧啶二磷酸以外的一糖予體。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列表中提供的一種變異體經工程處理之醣基轉移酶:2.1、3.1、5.1、6.1、6.3、8.1、9.1、9.2、9.4、11.1、12.1、14.1、15.1、15.2、15.3、16.1、17.1、43.1、43.2、44.2、45.1、45.3、46.1、46.2、46.3、47.1、47.2、47.3、48.1、48.2、49.1、49.3、50.1、50.2、50.3、50.4、51.1、51.2、52.1、53.1、53.3、54.1、54.2、54.3、55.1、55.2、55.3、56.1、56.2、56.3、57.1、58.1、58.2、58.3、59.1、59.3、59.3、60.1、60.2、61.1、61.2、62.1、62.2、63.1、63.2、64.1、64.2、65.1、65.2、66.1、66.2、67.1、67.2、67.3、68.1、68.2、69.1、69.2、70.1、70.2、71.1、71.2、71.3、72.1、72.2、72.3、73.1、73.2、74.1、74.2、74.3、75.1、75.2、75.3、77.1,及/或77.2。本發明提供經工程處理之醣基轉移酶,其包含與下列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之一多肽序列:序列辨識編號:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、22、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、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6668、6670、6672、6674、6676、6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198,7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212、7214、7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358、7360、7362、7364、7366、7368、7370、7372、7374、7376、7378、7380、7382、7384、7386、7388、7390、7392、7394、7396、7398、7400、7402、7404、7406、7408、7410、7412、7414、7416、7418、7420、7422、7424、7426、7428、7430、7432、7434、7436、7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336、8338、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366、8368、8482、8484、8486、8488、8490、8492、8494、8496、8498、8500、8502、8504、8506、8508、8510、8512、8514、8516、8518、8520、8522、8524、8526、8528 ,8530 ,8532、8534、8536、8538 ,8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220、9222、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238,及/或9240。
在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:10、10/309、262、278/284/311/339/360、283、307、309、339/361、344/361及361,其中該位置係根據序列辨識編號:4予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:10-/309R、262K、262L、278L/284I/311G/339A/360G、283T、307V、309L/N/R/S、339A/361G、344I/361G及361G,其中該位置係根據序列辨識編號:4予以編號。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:R10-/V309R、R262K、R262L、Y278L/T284I/R311G/V339A/N360G、S283T、L307V、V309L/N/R/S、V339A/S361G、V344I/S361G及S361G,其中該位置係根據序列辨識編號:4予以編號。於還有一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28,及/或30。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少同一性的一序列:序列辨識編號:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28,及/或30。於再一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含序列辨識編號:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28,及/或30。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:112/172/283/318、112/261/318、112/282/283/431、137/283、137/283/431、163/318、261/283/306/337、261/283/337、261/337、269/318、282/283、282/283/431、283、283/306/308/360、283/306/337/426、283/318/337/360、283/360、318、360及431,其中該位置係根據序列辨識編號:8予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:112S/172S/283Q/318E、112S/261S/318E、112S/282T/283Q/431E、137K/283Q、137K/283Q/431E、163K/318E、261S/283Q/306V/337F、261S/283Q/337F、261S/337S、269T/318E、282T/283Q、282T/283Q/431E、283Q、283Q/306V/308S/360G、283Q/306V/337S/426V、283Q/318E/337S/360G、283Q/360G、318E、360G及431E,其中該位置係根據序列辨識編號:8予以編號。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:E112S/T172S/T283Q/T318E、E112S/R261S/T318E、E112S/S282T/T283Q/Q431E、N137K/T283Q、N137K/T283Q/Q431E、L163K/T318E、R261S/T283Q/L306V/W337F、 R261S/T283Q/W337F、 R261S/W337S、Q269T/T318E、S282T/T283Q、S282T/T283Q/Q431E、 T283Q、T283Q/L306V/R308S/S360G、T283Q/L306V/W337S/A426V、T283Q/T318E/W337S/S360G、T283Q/S360G、T318E、S360G及Q431E,其中該位置係根據序列辨識編號:8予以編號。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68,及/或70。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68,及/或70。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含序列辨識編號:32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68,及/或70。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:4、6、22、64、74、84、87、97、106、110、112、137、139、154、159、169、179、191、195、198、199、207、233、259、261、262、306、347、356、396、417、421、427及435,其中該位置係根據序列辨識編號:32予以編號。於再一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:4P、6P、22A/L/H/P、64P、74W、84A/G、87A/H、97S、106D/G/S/T、110S、112A/P、137G、139P、154A/L/Q/V、159M/R、169T、179V、191R、195G、198M/S/V、199A/D/G/K/Q/S、207L、233R、259Q、261A/H/P/W、262G、306V、347D、356G、396R、417A/R/P、421V、427A及435Q/R,其中該位置係根據序列辨識編號:32予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:K4P、E6P、Q22A/L/H/P、F64P、R74W、L84A/G、M87A/H、A97S、L106D/G/S/T、A110S、E112A/P、N137G、R139P、H154A/L/Q/V、Q159M/R、D169T、S179V、S191R、N195G、I198M/S/V、L199A/D/G/K/Q/S、I207L、I233R、H259Q、R261A/H/P/W、T262G、L306V、G347D、S356G、Y396R、E417A/R/P、Y421V、R427A及V435Q/R,其中該位置係根據序列辨識編號:32予以編號。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:22/84/87/154/198/199/356、22/84/87/154/198/199/306/356、22/84/87/154/199/306/356、22/84/87/154/356、22/84/87/154/198/199/306/356、22/84/87/154/199/306/356、22/84/87/198/199/306/356、22/84/87/198/199/356、22/84/87/198/199/306/356、22/84/87/198/199/356、22/84/87/199/306/356、22/84/87/199/356、22/84/154/198/199/207/306、22/84/154/198/199/306、22/84/154/198/199/356、22/84/154/198/199/356、22/84/154/198/199/356、22/84/154/199/356、22/84/154/199/207、22/84/154/199/356、22/84/154/207/306/356、22/84/154/306/356、22/84/154/198/199/306/356、22/84/154/198/199、22/84/154/198/199/306/356、22/84/154/199/306/356、22/84/154/199/356、22/84/154/199/356、22/84/198/199/306/356、22/84/199/356、22/84/207/356、22/84/356、22/84/154/198/199/306/356、22/87/154/198/199/356、22/87/154/199/306/356、22/87/154/322/356、22/87/154/198/199/356、22/87/154/199/356、22/87/154/198/199/207/306/356、22/87/154/199/207/356、22/87/154/199/356、22/87/154/199/306/356、22/87/198/199/306/356、22/87/198/199/306/356、22/87/198/199/207/356、22/87/198/199/356、22/87/199/356、22/87/199/356、22/154/198/199/207/306/356、22/154/198/199/356、22/154/199/356、22/154/198/199/306/356、22/154/199/356、22/154/199/207/306/356、22/198/199/356、22/198/199/207/329/356、22/199/356、22/207/356、22/356及84/154/198/199,其中該位置係根據序列辨識編號:32予以編號。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:22P/84G/87H/154L/198S/199A/356G、22P/84G/87H/154L/198S/199S/306V/356G、22P/84G/87H/154L/199K/306V/356G、22P/84G/87H/154L/356G、22P/84G/87H/154V/198S/199S/306V/356G、22P/84G/87H/154V/199K/306V/356G、22P/84G/87H/198S/199A/306V/356G、22P/84G/87H/198S/199K/356G、22P/84G/87H/198S/199S/306V/356G、22P/84G/87H/198S/199S/356G、22P/84G/87H/199A/306V/356G、22P/84G/87H/199S/356G、22P/84G/154L/198S/199A/207L/306V、22P/84G/154L/198S/199A/306V、22P/84G/154L/198S/199A/356G、22P/84G/154L/198S/199K/356G、22P/84G/154L/198S/199S/356G、22P/84G/154L/199A/356G、22P/84G/154L/199K/207L、22P/84G/154L/199S/356G、22P/84G/154L/207L/306V/356G、22P/84G/154L/306V/356G,22P/84G/154V/198S/199A/306V/356G、22P/84G/154V/198S/199K、22P/84G/154V/198S/199K/306V/356G、22P/84G/154V/199A/306V/356G、22P/84G/154V/199A/356G、22P/84G/154V/199S/356G、22P/84G/198S/199K/306V/356G、22P/84G/199S/356G、22P/84G/207L/356G、22P/84G/356G、22P/84V/154V/198S/199S/306V/356G、22P/87H/154L/198S/199K/356G、22P/87H/154L/199A/306V/356G、22P/87H/154L/322S/356G、22P/87H/154V/198S/199K/356G、22P/87H/154V/199S/356G、22P/87H/154V/198S/199S/207L/306V/356G、22P/87H/154V/199A/207L/356G、22P/87H/154V/199K/356G、22P/87H/154V/199S/306V/356G、22P/87H/198S/199A/306V/356G、22P/87H/198S/199K/306V/356G、22P/87H/198S/199S/207L/356G、22P/87H/198S/199K/356G、22P/87H/199A/356G、22P/87H/199K/356G、22P/154L/198S/199A/207L/306V/356G、22P/154L/198S/199A/356G、22P/154L/199A/356G、22P/154V/198S/199S/306V/356G、22P/154V/199A/356G、22P/154V/199K/207L/306V/356G、22P/198S/199A/356G、22P/198S/199K/207L/329C/356G、22P/199A/356G、22P/207L/356G、22P/356G及84G/154L/198S/199K,其中該位置係根據序列辨識編號:32予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含選自於下列的至少一突變或突變組:Q22P/L84G/M87H/H154L/I198S/L199A/S356G、Q22P/L84G/M87H/H154L/I198S/L199S/L306V/S356G、Q22P/L84G/M87H/H154L/L199K/L306V/S356G、 Q22P/L84G/M87H/H154L/S356G、Q22P/L84G/M87H/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G、Q22P/L84G/M87H/H154V/L199K/L306V/S356G、Q22P/L84G/M87H/I198S/L199A/L306V/S356G、 Q22P/L84G/M87H/I198S/L199K/S356G、Q22P/L84G/M87H/I198S/L199S/L306V/S356G、Q22P/L84G/M87H/I198S/L199S/S356G、Q22P/L84G/M87H/L199A/L306V/S356G、Q22P/L84G/M87H/L199S/S356G、Q22P/L84G/H154L/I198S/L199A/I207L/L306V、Q22P/L84G/H154L/I198S/L199A/L306V、Q22P/L84G/H154L/I198S/L199A/S356G、Q22P/L84G/H154L/I198S/L199K/S356G、Q22P/L84G/H154L/I198S/L199S/S356G、Q22P/L84G/H154L/L199A/S356G、Q22P/L84G/H154L/L199K/I207L、Q22P/L84G/H154L/L199S/S356G、Q22P/L84G/H154L/I207L/L306V/S356G、Q22P/L84G/H154L/L306V/S356G、Q22P/L84G/H154V/I198S/L199A/L306V/S356G、Q22P/L84G/H154V/I198S/L199K、Q22P/L84G/H154V/I198S/L199K/L306V/S356G、Q22P/L84G/H154V/L199A/L306V/S356G、Q22P/L84G/H154V/L199A/S356G、Q22P/L84G/H154V/L199S/S356G、Q22P/L84G/I198S/L199K/L306V/S356G、Q22P/L84G/L199S/S356G、Q22P/L84G/I207L/S356G、Q22P/L84G/S356G、Q22P/L84V/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G、Q22P/M87H/H154L/I198S/L199K/S356G、Q22P/M87H/H154L/L199A/L306V/S356G、Q22P/M87H/H154L/P322S/S356G、Q22P/M87H/H154V/I198S/L199K/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199S/S356G、Q22P/M87H/H154V/I198S/L199S/I207L/L306V/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199A/I207L/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199K/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199S/L306V/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199A/L306V/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199K/L306V/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199S/I207L/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199K/S356G、Q22P/M87H/L199A/S356G、Q22P/M87H/L199K/S356G、Q22P/H154L/I198S/L199A/I207L/L306V/S356G、Q22P/H154L/I198S/L199A/S356G、Q22P/H154L/L199A/S356G、Q22P/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G、Q22P/H154V/L199A/S356G、Q22P/H154V/L199K/I207L/L306V/S356G、Q22P/I198S/L199A/S356G、Q22P/I198S/L199K/I207L/G329C/S356G、Q22P/L199A/S356G、Q22P/I207L/S356G、Q22P/S356G及L84G/H154L/I198S/L199K,其中該位置係根據序列辨識編號:32予以編號。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346,及1290。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346,及1290。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346,及1290。
本發明進一步提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:64/106/109/112/131/159/233/421/427/431、64/106/109/112/417/421/427/431、64/106/109/139/179/417/421/427/431、64/106/109/233/347/427/431、64/106/112/347/417/421、64/106/139/179/233/417/427/431、64/106/417/421、64/106/431、64/106/109/112/131/179/417/427/431、64/106/109/417/421/427/431/439、64/106/112/139/159/179/204/396/417、64/106/112/159/179/417/421、64/106/204/417/421/427、64/109/112/139/159/179/417/431、64/109/112/139/417、64/109/139/233/417/421、64/109/159/179/204/233/417/421、64/109/417/421、64/109/417/421、64/139/233/417/427/431/439、64/139/347/417/421/427/431、64/417/421/431、106/109/112/131/159/179/417/421、106/109/112/131/159/204/347/417/421/427、106/109/112/204/347/421/439、106/109/112/261/417/431、106/109/112/347/427、106/109/139/427/431、106/109/417/421/427、106/112/159/204/233/417/421/427/431、106/112/233/417、106/112/396/417/421、106/139/159/233/347/417/421/427/431、106/233/421/427、106/417、106/109/139/347/417/421/427、106/109、106/109/139/233/417/421、106/109/139/417、106/109/233/427/431、106/112/159/179/204/417/421、106/112/159/179/233/417/421/427/439、106/131/179/233/421/427/431、106/139/421、106/347/417/427/431、109/112/131/159/179/439、109/112/131/159/417/421、109/112/139/179/417/427、109/112/159/179/417/421、109/112/159/417/427、109/112/179/204/233/417/421/427、109/112/179/347/417、109/112/204/233/417、109/112/204/427、109/112/233/417/431、109/112/417/421/427、109/112/417/427/431、109/131/139/179/261/396/421、109/131/204、109/139/179/417/421/427、109/139/179/417/427、109/179/233/421、109/204/417/431、109/417/421、109/417/427/431、112/131/179/204/417/421/427、112/131/179/347/417/421、112/139/179/204/233/347/427、112/159/417/421、112/417/421、131/179/233/417/427、139/233/417、159/347/417/421/431、179/417/421、233/417/421/427/431及347/417,其中該位置係根據序列辨識編號:232予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:64P/106S/109R/112P/131P/159R/233R/421V/427L/431D、64P/106S/109R/112P/417A/421V/427A/431D、64P/106S/109R/139P/179L/417R/421V/427L/431D、64P/106S/109R/233R/347D/427A/431D、64P/106S/112P/347D/417A/421V、64P/106S/139P/179L/233R/417A/427A/431D、64P/106S/417R/421V、64P/106S/431D、64P/106T/109R/112P/131P/179L/417R/427A/431D、64P/106T/109R/417A/421V/427L/431D/439P、64P/106T/112P/139P/159R/179V/204D/396R/417A、64P/106T/112P/159R/179L/417R/421V、64P/106T/204D/417A/421V/427A、64P/109R/112P/139P/159R/179L/417R/431D、64P/109R/112P/139P/417A、64P/109R/139P/233R/417R/421V、64P/109R/159R/179V/204D/233R/417R/421V、64P/109R/417A/421V、64P/109R/417R/421V、64P/139P/233R/417R/427L/431D/439P、64P/139P/347D/417R/421V/427L/431D、64P/417R/421V/431D、 106S/109R/112P/131P/159R/179L/417A/421V、106S/109R/112P/131P/159R/204D/347D/417A/421V/427L、106S/109R/112P/204D/347D/421V/439P、106S/109R/112P/261P/417R/431D、106S/109R/112P/347D/427A、106S/109R/139P/427A/431D、106S/109R/417R/421V/427L、106S/112P/159R/204D/233R/417R/421V/427A/431D、106S/112P/233R/417R、106S/112P/396R/417R/421V、106S/139P/159R/233R/347D/417R/421V/427A/431D、106S/233R/421V/427A、106S/417A、106T/109R/139P/347D/417A/421V/427A、106T/109R、106T/109R/139P/233R/417R/421V、106T/109R/139P/417R、106T/109R/233R/427A/431D、106T/112P/159R/179L/204D/417A/421V、106T/112P/159R/179V/233R/417A/421V/427L/439P、106T/131P/179L/233R/421V/427L/431D、106T/139P/421V、106T/347D/417R/427A/431D、109R/112P/131P/159R/179V/439P、109R/112P/131P/159R/417R/421V、109R/112P/139P/179V/417R/427A、109R/112P/159R/179V/417R/421V、109R/112P/159R/417R/427L、109R/112P/179V/204D/233R/417A/421V/427L、109R/112P/179V/347D/417R、109R/112P/204D/233R/417R、109R/112P/204D/427A、109R/112P/233R/417A/431D、109R/112P/417A/421V/427L、109R/112P/417A/427A/431D、109R/131P/139P/179V/261P/396R/421V、109R/131P/204D、 109R/139P/179L/417R/421V/427A、109R/139P/179L/417R/427L、109R/179V/233R/421V、109R/204D/417R/431D、109R/417R/421V、109R/417R/427A/431D、112P/131P/179V/204D/417R/421V/427L、112P/131P/179L/347D/417R/421V、112P/139P/179V/204D/233R/347D/427L、112P/159R/417R/421V、112P/417R/421V、131P/179L/233R/417R/427A、139P/233R/417A、159R/347D/417A/421V/431D、179V/417R/421V、233R/417R/421V/427L/431D及347D/417R,其中該位置係根據序列辨識編號:232予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:F64P/L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/I233R/Y421V/R427L/Q431D、F64P/L106S/L109R/E112P/E417A/Y421V/R427A/Q431D、F64P/L106S/L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427L/Q431D、F64P/L106S/L109R/I233R/G347D/R427A/Q431D、 F64P/L106S/E112P/G347D/E417A/Y421V、F64P/L106S/R139P/S179L/I233R/E417A/R427A/Q431D、F64P/L106S/E417R/Y421V、F64P/L106S/Q431D、F64P/L106T/L109R/E112P/S131P/S179L/E417R/R427A/Q431D、F64P/L106T/L109R/E417A/Y421V/R427L/Q431D/K439P、F64P/L106T/E112P/R139P/Q159R/S179V/G204D/Y396R/E417A、F64P/L106T/E112P/Q159R/S179L/E417R/Y421V、F64P/L106T/G204D/E417A/Y421V/R427A、F64P/L109R/E112P/R139P/Q159R/S179L/E417R/Q431D、F64P/L109R/E112P/R139P/E417A、F64P/L109R/R139P/I233R/E417R/Y421V、F64P/L109R/Q159R/S179V/G204D/I233R/E417R/Y421V、F64P/L109R/E417A/Y421V、F64P/L109R/E417R/Y421V、F64P/R139P/I233R/E417R/R427L/Q431D/K439P、F64P/R139P/G347D/E417R/Y421V/R427L/Q431D、F64P/E417R/Y421V/Q431D、L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/S179L/E417A/Y421V、L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/G204D/G347D/E417A/Y421V/R427L、L106S/L109R/E112P/G204D/G347D/Y421V/K439P、L106S/L109R/E112P/R261P/E417R/Q431D、 L106S/L109R/E112P/G347D/R427A、L106S/L109R/R139P/R427A/Q431D、L106S/L109R/E417R/Y421V/R427L、L106S/E112P/Q159R/G204D/I233R/E417R/Y421V/R427A/Q431D、L106S/E112P/I233R/E417R、L106S/E112P/Y396R/E417R/Y421V、L106S/R139P/Q159R/I233R/G347D/E417R/Y421V/R427A/Q431D、L106S/I233R/Y421V/R427A、L106S/E417A、L106T/L109R/R139P/G347D/E417A/Y421V/R427A、L106T/L109R、L106T/L109R/R139P/I233R/E417R/Y421V、L106T/L109R/R139P/E417R、L106T/L109R/I233R/R427A/Q431D、L106T/E112P/Q159R/S179L/G204D/E417A/Y421V、L106T/E112P/Q159R/S179V/I233R/E417A/Y421V/R427L/K439P、L106T/S131P/S179L/I233R/Y421V/R427L/Q431D、L106T/R139P/Y421V、L106T/G347D/E417R/R427A/Q431D、L109R/E112P/S131P/Q159R/S179V/K439P、L109R/E112P/S131P/Q159R/E417R/Y421V、L109R/E112P/R139P/S179V/E417R/R427A、L109R/E112P/Q159R/S179V/E417R/Y421V、L109R/E112P/Q159R/E417R/R427L、L109R/E112P/S179V/G204D/I233R/E417A/Y421V/R427L、L109R/E112P/S179V/G347D/E417R、L109R/E112P/G204D/I233R/E417R、L109R/E112P/G204D/R427A、L109R/E112P/I233R/E417A/Q431D、L109R/E112P/E417A/Y421V/R427L、L109R/E112P/E417A/R427A/Q431D、L109R/S131P/R139P/S179V/R261P/Y396R/Y421V、L109R/S131P/G204D、L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427A、L109R/R139P/S179L/E417R/R427L、L109R/S179V/I233R/Y421V、L109R/G204D/E417R/Q431D、L109R/E417R/Y421V、L109R/E417R/R427A/Q431D、E112P/S131P/S179V/G204D/E417R/Y421V/R427L、E112P/S131P/S179L/G347D/E417R/Y421V、E112P/R139P/S179V/G204D/I233R/G347D/R427L、E112P/Q159R/E417R/Y421V、E112P/E417R/Y421V、S131P/S179L/I233R/E417R/R427A、R139P/I233R/E417A、Q159R/G347D/E417A/Y421V/Q431D、S179V/E417R/Y421V、I233R/E417R/Y421V/R427L/Q431D及G347D/E417R,其中該位置係根據序列辨識編號:232予以編號。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374 376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496,及/或498。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374 376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496,及/或498。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374 376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496,及/或498。
本發明進一步提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:106/112/204/347/396/417、106/112/204/347/396/417/427、106/112/204/347/396/417/427/431、112/204/347/396/417/427、112/204/347/396/417/427/431及204/347/396/417/431,其中該位置係根據序列辨識編號:348予以編號。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:106S/112P/204D/347D/396Y/417R、106S/112P/204D/347D/396Y/417R/427A、106S/112P/204D/347D/396Y/417R/427A/431D、112P/204D/347D/396Y/417R/427A、112P/204D/347D/396Y/417R/427A/431D及204D/347D/396Y/417R/431D,其中該位置係根據序列辨識編號:348予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R、L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A、L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A/Q431D、E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A、E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A/Q431D及G204D/G347D/R396Y/E417R/Q431D,其中該位置係根據序列辨識編號:348予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:500、502、504、506、508,及/或510。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:500、502、504、506、508,及/或510。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含序列辨識編號:500、502、504、506、508,及/或510。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14/100、28/44/365/407、38/118/290/351/375/401/422、38/178/401、38/290/351/401/422、54/413、74/102/137/161/259/289、92/118、98/233、102/161/250/435、110/222/250/259/435、118/156/178/290/375/401/422、137/161/435、137/169、159/169/173/300/424/438、185/290/401/422、290/351/401及435/438,其中該位置係根據序列辨識編號:348予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14V/100F、28M/44V/365I/407E、38R/118A/290E/351G/375P/401L/422M、38R/178V/401L、38R/290E/351G/401L/422M、54P/413L、74W/102K/137G/161L/259S/289S、92L/118A、98P/233W、102K/161L/250A/435E、110G/222R/250R/259P/435G、118A/156A/178V/290E/375P/401L/422M、137G/161L/435R、137G/169G、159M/169S/173G/300Q/424E/438A、185R/290E/401L/422M、290E/351G/401L及435Q/438A,其中該位置係根據序列辨識編號:348予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:I14V/L100F、I28M/I44V/V365I/A407E、K38R/S118A/D290E/A351G/D375P/W401L/I422M、K38R/A178V/W401L、K38R/D290E/A351G/W401L/I422M、T54P/V413L、R74W/R102K/N137G/D161L/H259S/K289S、I92L/S118A、D98P/I233W、R102K/D161L/T250A/V435E、A110G/K222R/T250R/H259P/V435G、S118A/S156A/A178V/D290E/D375P/W401L/I422M、N137G/D161L/V435R、N137G/D169G、Q159M/D169S/R173G/D300Q/Q424E/M438A、K185R/D290E/W401L/I422M、D290E/A351G/W401L及V435Q/M438A,其中該位置係根據序列辨識編號:348予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、222、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546,及/或548。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、222、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546,及/或548。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、222、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546,及/或548。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14/28/38/74/100/102/118/161/169/178/233/250/407/422/438、14/28/38/74/102/156/159/233/250/289/413/422/424/435/438、 14/28/38/100/102/110/159/161/233/259/290/300/351/435、14/28/38/110/137/161/222/289/401、14/28/44/74/98/102/137/159/161/185/222/250、14/28/44/92、14/28/44/161/169、14/28/44/375、14/28/54/161/185/413、14/28/54/365、14/28/74/98/100/102/161/173/178/233/250/259/290/407、14/28/92/100/102/159/161/169/233、14/28/92/100/102/159/161/233/351/422、14/28/92/100/102/422/424/435、14/28/92/100/161/222/233/289/300、14/28/100/137/156/161/222/259/289/365/401/435/438、14/28/100/156/161/250、14/28/102/118/137/161/185/222/250/259/401、14/28/159/289/290/300、14/28/159/365/435、14/28/35、14/38/74/110/156/161/173/178/222/300、14/38/100/102/161/173/178/222/250/375/401/413、44/74/100/102/161/233/365/435/438、14/74/110/159/161/169/173/250/259/290/375/407/422、14/74/161/375/401、14/92/98/100/159/161/259/365/422/424/435、14/110/156/161/375/401/435/438、14/159/161/365/435/438、14/161/222/250/259/289/375/401/413、14/161/222/250/435/438、14/161/300、28、28/38/92/98/100/102/156/161、28/44/74/401、28/44/92/161/222/300/413、28/44/98/100/102/118、28/44/118/156/161/222/289/435/M438、28/44/289/290/351/422、28/44/435/438、28/54/92/159/161/290、28/54/159/290/438、28/54/250/439、28/74/156/159/161/178/300/365/435/438、28/74/156/161/365/407、 28/74/161/290/365、28/92/100/102/110/161/185/250/300/375/435、28/92/98/100/110/156/161/401、28/92/118/159/222/250/259/300/407、28/156/161/185/435/438、28/156/161/233/259/300/435、 28/98/100/102/161/185/351/401/435/438、38/161/300/438、74/98/100/102/110/118/161/178/250/289/290/300/435/438、74/98/100/102/118/156/159/161/435/438、74/156/161/173/178/424/435、74/375/435、98/100/118/159/161/300、98/100/156/159/161/178/259/289/290/351/422、102/137/159/161/422/424、118、137/159/161/185/300/351/365/435、156/159/161/169、159/161/222/290/375/407、159/161/401及161/259/289/435/438,其中該位置係根據序列辨識編號:548予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14V/28M/38R/74/100F/102K/118A/161L/169G/178V/233W/250R/407E/422M/438A、14V/28M/38R/74W/102K/156A/159M/233W/250A/289S/413L/422M/424E/435R/438A、14V/28M/38R/100F/102K/110G/159M/161L/233W/259S/290E/300Q/351G/435Q、14V/28M/38R/110G/137G/161L/222R/289S/401L、14V/28M/44V/74W/98P/102K/137G/159M/161L/185R/222R/250A、14V/28M/44V/92L、14V/28M/44V/161L/169S、14V/28M/44V/375P、14V/28M/54P/161L/185R/413L、14V/28M/54P/365I、14V/28M/74W/98P/100F/102K/161L/173G/178V/233W/250A/259S/290E/407E、14V/28M/92L/100F/102K/159M/161L/169S/233W、14V/28M/92L/100F/102K/159M/161L/233W/351G/422M、14V/28M/92L/100F/102K/422M/424E/435Q、14V/28M/92L/100F/161L/222R/233W/289S/300Q、14V/28M/100F/137G/156A/161L/222R/259S/289S/365I/401L/435R/438A、14V/28M/100F/156A/161L/250R、14V/28M/102K/118A/137G/161L/185R/222R/250R/259P/401L、14V/28M/159M/289S/290E/300Q、14V/28M/159M/365I/435Q、14V/28M/351G、14V/38R/74W/110G/156A/161L/173G/178V/222R/300Q、14V/38R/100F/102K/161L/173G/178V/222R/250R/375P/401L/413L、44V/74W/100F/102K/161L/I33W/365I/435G/438A、14V/74W/110G/159M/161L/169G/173G/250A/259P/290E/375P/407E/422M、14V/74W/161L/375P/401L、14V/92L/98P/100F/159M/161L/259P/365I/422M/424E/435R、14V/110G/156A/161L/375P/401L/435EM438A、14V/159M/161L/365I/435E/438A、14V/161L/222R/250R/259S/289S/375P/401L/413L、14V/161L/222R/250R/435Q/438A、14V/161L/300Q、28M、28M/38R/92L/98P/100F/102K/156A/161L、28M/44V/74W/401L、28M/44V/92L/161L/222R/300Q/413L、28M/44V/98P/100F/102K/118A、28M/44V/118A/156A/161L/222R/289S/435Q/438A、28M/44V/289S/290E/351G/422M、28M/44V/435R/438A、28M/54P/92L/159M/161L/290E、28M/54P/159M/290E/438A、28M/54P/250R/439N 28M/74W/156A/159M/161L/178V/300Q/365I/435Q/438A、28M/74W/156A/161L/365I/407E、28M/74W/161L/290E/365I、28M/92L/98P/100F/110G/156A/161L/401L、28M/92L/100F/102K/110G/161L/185R/250A/300Q/375P/435Q、28M/92L/118A/159M/222R/250R/259P/300Q/407E、28M/98P/100F/102K/161L/185R/351G/401L/435E/438A、28M/156A/161L/185R/435R/438A、28M/156A/161L/233W/259S/300Q/435R、38R/161L/300Q/438A、74W/98P/100F/102K/110G/118A/161L/178V/250R/289S/290E/300Q/435E/438A、74W/98P/100F/102K/118A/156A/159M/161L/435E/438A、74W/156A/161L/173G/178V/424E/435E、74W/375P/435G、98P/100F/118A/159M/161L/300Q、98P/100F/156A/159M/161L/178V/259S/289S/290E/351G/422M、102K/137G/159M/161L/422M/424E、118A、137G/159M/161L/185R/300Q/351G/365I/435Q、156A/159M/161L/169S、159M/161L/222R/290E/375P/407E、159M/161L/401L及161L/259S/289S/435R/438A,其中該位置係根據序列辨識編號:548予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:I14V/I28M/K38R/R74W/L100F/R102K/S118A/D161L/D169G/A178V/I233W/T250R/A407E/I422M/M438A、I14V/I28M/K38R/R74W/R102K/S156A/Q159M/I233W/T250A/K289S/V413L/I422M/Q424E/V435R/M438A、I14V/I28M/K38R/L100F/R102K/A110G/Q159M/D161L/I233W/H259S/D290E/D300Q/A351G/V435Q、I14V/I28M/K38R/A110G/N137G/D161L/K222R/K289S/W401L、I14V/I28M/I44V/R74W/D98P/R102K/N137G/Q159M/D161L/K185R/K222R/T250A、I14V/I28M/I44V/I92L、I14V/I28M/I44V/D161L/D169S、I14V/I28M/I44V/D375P、I14V/I28M/T54P/D161L/K185R/V413L、I14V/I28M/T54P/V365I、I14V/I28M/R74W/D98P/L100F/R102K/D161L/R173G/A178V/I233W/T250A/H259S/D290E/A407E、I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/Q159M/D161L/D169S/I233W、I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/Q159M/D161L/I233W/A351G/I422M、I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/I422M/Q424E/V435Q、I14V/I28M/I92L/L100F/D161L/K222R/I233W/K289S/D300Q、I14V/I28M/L100F/N137G/S156A/D161L/K222R/H259S/K289S/V365I/W401L/V435R/M438A、I14V/I28M/L100F/S156A/D161L/T250R、I14V/I28M/R102K/S118A/N137G/D161L/K185R/K222R/T250R/H259P/W401L、I14V/I28M/Q159M/K289S/D290E/D300Q、 I14V/I28M/Q159M/V365I/V435Q、I14V/I28M/A351G、I14V/K38R/R74W/A110G/S156A/D161L/R173G/A178V/K222R/D300Q、I14V/K38R/L100F/R102K/D161L/R173G/A178V/K222R/T250R/D375P/W401L/V413L、I44V/R74W/L100F/R102K/D161L/I233W/V365I/V435G/M438A、I14V/R74W/A110G/Q159M/D161L/D169G/R173G/T250A/H259P/D290E/D375P/A407E/I422M、I14V/R74W/D161L/D375P/W401L、I14V/I92L/D98P/L100F/Q159M/D161L/H259P/V365I/I422M/Q424E/V435R、I14V/A110G/S156A/D161L/D375P/W401L/V435E/M438A、I14V/Q159M/D161L/V365I/V435E/M438A、I14V/D161L/K222R/T250R/H259S/K289S/D375P/W401L/V413L、I14V/D161L/K222R/T250R/V435Q/M438A、I14V/D161L/D300Q、I28M、I28M/K38R/I92L/D98P/L100F/R102K/S156A/D161L、I28M/I44V/R74W/W401L、I28M/I44V/I92L/D161L/K222R/D300Q/V413L、I28M/I44V/D98P/L100F/R102K/S118A、I28M/I44V/S118A/S156A/D161L/K222R/K289S/V435Q/M438A、I28M/I44V/K289S/D290E/A351G/I422M、I28M/I44V/V435R/M438A、I28M/T54P/I92L/Q159M/D161L/D290E、I28M/T54P/Q159M/D290E/M438A、I28M/T54P/T250R/K439N、I28M/R74W/S156A/Q159M/D161L/A178V/D300Q/V365I/V435Q/M438A、I28M/R74W/S156A/D161L/V365I/A407E、I28M/R74W/D161L/D290E/V365I、I28M/D98P/L100F/R102K/D161L/K185R/A351G/W401L/V435E/M438A、I28M/I92L/L100F/R102K/A110G/D161L/K185R/T250A/D300Q/D375P/V435Q、I28M/I92L/S118A/Q159M/K222R/T250R/H259P/D300Q/A407E、I28M/S156A/D161L/K185R/V435R/M438A、I28M/S156A/D161L/I233W/H259S/D300Q/V435R、I28M/I92L/D98P/L100F/A110G/S156A/D161L/W401L、K38R/D161L/D300Q/M438A、R74W/D98P/L100F/R102K/A110G/S118A/D161L/A178V/T250R/K289S/D290E/D300Q/V435E/M438A、R74W/D98P/L100F/R102K/S118A/S156A/Q159M/D161L/V435E/M438A、R74W/S156A/D161L/R173G/A178V/Q424E/V435E、R74W/D375P/V435G、D98P/L100F/S118A/Q159M/D161L/D300Q、D98P/L100F/S156A/Q159M/D161L/A178V/H259S/K289S/D290E/A351G/I422M、R102K/N137G/Q159M/D161L/I422M/Q424E、S118A、 N137G/Q159M/D161L/K185R/D300Q/A351G/V365I/V435Q、S156A/Q159M/D161L/D169S、 Q159M/D161L/K222R/D290E/D375P/A407E、Q159M/D161L/W401L及D161L/H259S/K289S/V435R/M438A,其中該位置係根據序列辨識編號:548予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678,及680,其中該位置係根據序列辨識編號:548予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678及680,其中該位置係根據序列辨識編號:548予以編號。
在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者的一序列:序列辨識編號:550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678及680,其中該位置係根據序列辨識編號:548予以編號。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:19/44/110/191/198/199/208/300/365、19/75/76/87/92/199/207/208、19/87/92/191/199/209/413/435、44/76/197/199/208/351、44/87/92/137/159/199/209、44/87/137/159/169/191/199/208、44/87/137/191/197/209/289/401、44/87/199/208、75/76/87/92、75/76/87/92/290/300、75/76/87/191、75/76/87/191/197/199/209/300、75/87/92/169/207/208/300/413/435、75/87/110/137/169/191/199/208/209/289/435、75/87/110/191/197/198/207/208/289/290/300/401/413、75/87/300、75/110/197/199/208/290/300/401/413、76/92/199/209、87/92/197/198/199/208/300、 87/137/435、87/169/191/199/207/209/401/413、87/191/198/199/222/244/289/300/435、87/92/110/169/199/207/209/290/300、87/92/159/169/191/198/290/413/435、87/92/159/191/199/208/209/289/290、87/92/208/401、87/435、92/137/191/199/209、92/197/199/207/208/401、137/198/199/207/208/426/435、137/199/208/209/290/435、137/365、159/197/199/207/209、169/191/197/199/207/208、169/197/199/207/209/222/300/413/435、191/207/208/289/290/413/435及197/198/199/208/209,其中該位置係根據序列辨識編號:562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:19L/44V/110G/191R/198M/199K/208A/300Q/365I、19L/75L/76R/87W/92L/199K/207L/208A、19L/87W/92L/191R/199K/209G/413L/435Q、44V/76R/197R/199K/208D/351G、44V/87W/92L/137G/159M/199K/209G、44V/87W/137G/159M/169S/191R/199K/208D、44V/87W/137G/191R/197R/209G/289S/401L、44V/87W/199K/208A、75L/76R/87W/92L、75L/76R/87W/92L/290E/300Q、75L/76R/87W/191R、75L/76R/87W/191R/197R/199K/209G/300Q、75L/87W/92L/169S/207L/208A/300Q/413L/435Q、75L/87W/110G/137G/169S/191R/199K/208A/209G/289S/435Q、75L/87W/110G/191R/197R/198M/207L/208D/289S/290E/300Q/401L/413L、 75L/87W/300Q、75L/110G/197R/199K/208A/290E/300Q/401L/413L、76R/92L/199K/209G、87L/92L/197R/198M/199K/208D/300Q、 87W/137G/435R、87W/169S/191R/199K/207L/209G/401L/413L、87W/191R/198M/199K/222R/244L/289S/300Q/435R、87W/92L/110G/169S/199K/207L/209G/290E/300Q、87W/92L/159M/169S/191R/198M/290E/413L/435Q、87W/92L/159M/191R/199K/208A/209G/289S/290E、87W/92L/208A/401L、87W/435R、92L/137G/191R/199K/209G、92L/197R/199K/207L/208D/401L、137G/198M/199K/207L/208D/426V/435R、137G/199K/208A/209G/290E/435R、137G/365I、159M/197R/199K/207L/209G、169S/191R/197R/199K/207L/208D、169S/197R/199K/207L/209G/222R/300Q/413L/435R、191R/207L/208A/289S/290E/413L/435Q及197R/198M/199K/208D/209G,其中該位置係根據序列辨識編號:562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:V19L/I44V/A110G/S191R/I198M/A199K/K208A/D300Q/V365I、V19L/I75L/S76R/M87W/I92L/A199K/I207L/K208A、V19L/M87W/I92L/S191R/A199K/Q209G/V413L/V435Q、I44V/S76R/Q197R/A199K/K208D/A351G、I44V/M87W/I92L/N137G/Q159M/A199K/Q209G、I44V/M87W/N137G/Q159M/G169S/S191R/A199K/K208D、I44V/M87W/N137G/S191R/Q197R/Q209G/K289S/W401L、 I44V/M87W/A199K/K208A、I75L/S76R/M87W/I92L、I75L/S76R/M87W/I92L/D290E/D300Q、I75L/S76R/M87W/S191R、I75L/S76R/M87W/S191R/Q197R/A199K/Q209G/D300Q、I75L/M87W/I92L/G169S/I207L/K208A/D300Q/V413L/V435Q、I75L/M87W/A110G/N137G/G169S/S191R/A199K/K208A/Q209G/K289S/V435Q、I75L/M87W/A110G/S191R/Q197R/I198M/I207L/K208D/K289S/D290E/D300Q/W401L/V41 L、I75L/M87W/D300Q、I75L/A110G/Q197R/A199K/K208A/D290E/D300Q/W401L/V413L、S76R/I92L/A199K/Q209G、M87L/I92L/Q197R/I198M/A199K/K208D/D300Q、M87W/N137G/V435R、M87W/G169S/S191R/A199K/I207L/Q209G/W401L/V413L、M87W/S191R/I198M/A199K/K222R/P244L/K289S/D300Q/V435R、M87W/I92L/A110G/G169S/A199K/I207L/Q209G/D290E/D300Q、M87W/I92L/Q159M/G169S/S191R/I198M/D290E/V413L/V435Q、M87W/I92L/Q159M/S191R/A199K/K208A/Q209G/K289S/D290E、M87W/I92L/K208A/W401L、M87W/V435R、I92L/N137G/S191R/A199K/Q209G、I92L/Q197R/A199K/I207L/K208D/W401L、N137G/I198M/A199K/I207L/K208D/A426V/V435R、N137G/A199K/K208A/Q209G/D290E/V435R、N137G/V365I、Q159M/Q197R/A199K/I207L/Q209G、G169S/S191R/Q197R/A199K/I207L/K208D、G169S/Q197R/A199K/I207L/Q209G/K222R/D300Q/V413L/V435R、S191R/I207L/K208A/K289S/D290E/V413L/V435Q及Q197R/I198M/A199K/K208D/Q209G,其中該位置係根據序列辨識編號:562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752,及/或754。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752,及/或754。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含序列辨識編號:682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752,及/或754。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:22、25、51、56、71、78、80、81、88、157、185/208/230/252/255/290/365、189/206/208/365、200、208/365/435、243、245、249、259、262/401、279、282、284、304/322/365/401、308、338、339、352、362、364、365/401/413/435、366及374,其中該位置係根據序列辨識編號:696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:22L、25L、25V、51A、56L、71R、78E、78F、78G、78I、78K、78M、78P、78Q、78R、80L、81C、88I、88K、88V、157G、157Q、185R/208A/230S/252N/255N/290E/365I、189L/206K/208A/365I、200N、200S、208A/365I/435Q、243C、243L、243M、243V、243Y、245G、249E、249H、249I、249M、249N、249P、249S、249T、249Y、259G、259S、259Y、262S/401L、279G、282T、284T、304P/322S/365I/401L、308F、308Y、338C、339D、352Q、362T、364G、365I/401L/413L/435Q、366A及374T,其中該位置係根據序列辨識編號:696予以編號。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:P22L、I25L、I25V、K51A、N56L、Q71R、L78E、L78F、L78G、L78I、L78K、L78M、L78P、L78Q、L78R、T80L、H81C、R88I、R88K、R88V、L157G、L157Q、K185R/K208A/E230S/S252N/S255N/D290E/V365I、I189L/M206K/K208A/V365I、K200N、K200S、K208A/V365I/V435Q、I243C、I243L、I243M、I243V、I243Y、L245G、L249E、L249H、L249I、L249M、L249N、L249P、L249S、L249T、L249Y、H259G、H259S、H259Y、T262S/W401L、S279G、S282T、S284T、S304P/P322S/V365I/W401L、R308F、R308Y、V338C、P339D、F352Q、L362T、S364G、V365I/W401L/V413L/V435Q、C366A及S374T,其中該位置係根據序列辨識編號:696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:4684、4686、4688、4690、4692、4694、4696、4698、4700、4702、4704、4706、4708、4710、4712、4714、4716、4718、4720、4722、4724、4726、4728、4730、4732、4734、4736、4738、4740、4742、4744、4746、4748、4750、4752、4754、4756、4758、4760、4762、4764、4766、4768、4770、4772、4774、4776、4778、4780、4782、4784、4786、4788、4790、4792、4794、4796、4798、4800、4902、4804、4806、4808、4810及4812。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:4684、4686、4688、4690、4692、4694、4696、4698、4700、4702、4704、4706、4708、4710、4712、4714、4716、4718、4720、4722、4724、4726、4728、4730、4732、4734、4736、4738、4740、4742、4744、4746、4748、4750、4752、4754、4756、4758、4760、4762、4764、4766、4768、4770、4772、4774、4776、4778、4780、4782、4784、4786、4788、4790、4792、4794、4796、4798、4800、4902、4804、4806、4808、4810及4812。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:4684、4686、4688、4690、4692、4694、4696、4698、4700、4702、4704、4706、4708、4710、4712、4714、4716、4718、4720、4722、4724、4726、4728、4730、4732、4734、4736、4738、4740、4742、4744、4746、4748、4750、4752、4754、4756、4758、4760、4762、4764、4766、4768、4770、4772、4774、4776、4778、4780、4782、4784、4786、4788、4790、4792、4794、4796、4798、4800、4902、4804、4806、4808、4810及4812。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:51/56、51/56/243/249/282/353/362/366、51/56/243/249/308/362/364、51/56/249/353、51/56/249/362/364、51/56/249/362/366、51/243/249/308/353、51/243/249/348/362/366、51/249、51/249/282/284/364、51/249/282/353/366、51/249/284/308/362/366、51/249/353/362/364、51/353/362、56、56/243/249/282/364/366、56/243/364/366、56/249、56/249/284/353、56/249/353、56/284/366、243/249/282/284/362/364/366、243/249/308/353/366、243/249/353/362/366、243/282/353/362/364、243/282/362/364/366、243/308/353、249/353/362/366、282、308/366及362/366,其中該位置係根據序列辨識編號:4684予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:51A/56H、51A/56H/243L/249E/282T/353Y/362M/366S、51A/56H/243L/249E/308F/362M/364G、51A/56H/249M/362M/364G、51A/56H/249M/362M/366S、51A/56H/249Y/353Y、51A/243L/249E/308F/353Y、51A/243L/249E/348S/362M/366V、51A/249E/353Y/362M/364G、51A/249M、51A/249M/282T/284T/364G、51A/249M/282T/353Y/366S、51A/249Y/284T/308F/362M/366V、51A/353Y/362M、56H、56H/243L/249E/282T/364G/366V、56H/243L/364G/366V、56H/249M/284T/353Y、56H/249M/353Y、56H/249Y、56H/284T/366V、243L/249E/282T/284T/362M/364G/366S、243L/249M/308F/353Y/366A、243L/249Y/353Y/362M/366S、243L/282T/353Y/362M/364G、243L/282T/362M/364G/366V、243L/308F/353Y、249Y/353Y/362M/366S、282T、308F/366A及362M/366A,其中該位置係根據序列辨識編號:4684予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:K51A/N56H、K51A/N56H/I243L/L249E/S282T/W353Y/L362M/C366S、K51A/N56H/I243L/L249E/R308F/L362M/S364G、K51A/N56H/L249M/L362M/S364G、K51A/N56H/L249M/L362M/C366S、K51A/N56H/L249Y/W353Y、K51A/I243L/L249E/R308F/W353Y、K51A/I243L/L249E/A348S/L362M/C366V、K51A/L249E/W353Y/L362M/S364G、K51A/L249M、K51A/L249M/S282T/S284T/S364G、K51A/L249M/S282T/W353Y/C366S、K51A/L249Y/S284T/R308F/L362M/C366V、K51A/W353Y/L362M、N56H、N56H/I243L/L249E/S282T/S364G/C366V、N56H/I243L/S364G/C366V、N56H/L249M/S284T/W353Y、N56H/L249M/W353Y、N56H/L249Y、N56H/S284T/C366V、I243L/L249E/S282T/S284T/L362M/S364G/C366S、I243L/L249M/R308F/W353Y/C366A、I243L/L249Y/W353Y/L362M/C366S、I243L/S282T/W353Y/L362M/S364G、I243L/S282T/L362M/S364G/C366V、I243L/R308F/W353Y、L249Y/W353Y/L362M/C366S、S282T、R308F/C366A及L362M/C366A,其中該位置係根據序列辨識編號:4684予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:4814、4816、4818、4820、4822、4824、4826、4828、4830、4832、4834、4836、4838、4840、4842、4844、4846、4848、4850、4852、4854、4856、4858、4860、4862、4864、4866、4868、4870、4872及4874。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:4814、4816、4818、4820、4822、4824、4826、4828、4830、4832、4834、4836、4838、4840、4842、4844、4846、4848、4850、4852、4854、4856、4858、4860、4862、4864、4866、4868、4870、4872及4874。在一些另外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:4814、4816、4818、4820、4822、4824、4826、4828、4830、4832、4834、4836、4838、4840、4842、4844、4846、4848、4850、4852、4854、4856、4858、4860、4862、4864、4866、4868、4870、4872及4874。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:25、25/56/353、25/243/249/259/366、25/243/249/362、25/362/366、51、51/56/200/243/249/259/338、51/56/362、51/71/249/279/284/362/366、56/243/249、56/362/366、70/198/259/313、85、88、88/173、110、159、163、171、174、175、177、198、198/313、198/313/428、200/243/249/259、208、208/320、209、209/234、222、226、234、234/408、243/338/362/366、253、256、259、265、272、289、322、336、353/362、405、411、428及439,其中該位置係根據序列辨識編號:4838予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:25L、25L/56L/353Y、25V/243M/249I/362M、25V/243M/249Y/259G/366A、25V/362M/366S、51A、51A/56L/200S/243M/249I/259G/338C、51A/56L/362M、51A/71R/249M/279G/284T/362M/366S、56L/243M/249M、56L/243M/249Y、56L/362M/366A、70S/198D/259E/313S、85E、88C/173S、88I、110S、159N、163K、171D、171E、171P、171V、174E、174S、175N、177K、177P、177S、198D、198D/313S、198D/313S/428S、198E、198S、198T、200S/243M/249Y/259G、208E、208G、208I、208L、208N、208T、208V、208W/320I、209A、209E/234Q、222P、226R、226T、234A、234E、234H/408D、234T、243M/338C/362M/366S、253A、256A、259N、259S、259T、265A、272D、289H、289T、322V、336E、353Y/362M、405Q、411T、428K、439D及439Q,其中該位置係根據序列辨識編號:4838予以編號。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:I25L、I25L/H56L/W353Y、I25V/L243M/E249I/L362M、I25V/L243M/E249Y/H259G/V366A、I25V/L362M/V366S、K51A、K51A/H56L/K200S/L243M/E249I/H259G/V338C、K51A/H56L/L362M、K51A/Q71R/E249M/S279G/S284T/L362M/V366S、H56L/L243M/E249M、H56L/L243M/E249Y、H56L/L362M/V366A、P70S/I198D/H259E/F313S、A85E、R88C/R173S、R88I、A110S、Q159N、L163K、K171D、K171E、K171P、K171V、L174E、L174S、E175N、Q177K、Q177P、Q177S、I198D、I198D/F313S、I198D/F313S/V428S、I198E、I198S、I198T、K200S/L243M/E249Y/H259G、K208E、K208G、K208I、K208L、K208N、K208T、K208V、K208W/V320I、Q209A、Q209E/R234Q、K222P、E226R、E226T、R234A、R234E、R234H/N408D、R234T、L243M/V338C/L362M/V366S、S253A、L256A、H259N、H259S、H259T、Q265A、P272D、K289H、K289T、P322V、K336E、W353Y/L362M、E405Q、R411T、V428K、K439D及K439Q,其中該位置係根據序列辨識編號:4838予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:4876、4878、4880、4882、4884、4886、4888、4890、4892、4894、4896、4898、4900、4902、4904、4906、4908、4910、4912、4914、4916、4918、4920、4922、4924、4926、4928、4930、4932、4934、4936、4938、4940、4942、4944、4946、4948、4950、4952、4954、4956、4958、4960、4962、4964、4966、4968、4970、4972、4974、4976、4978、4980、4982、4984、4986、4988、4990、4992、4994、4996、4998、5000、5002、5004、5006、5008、5010、5012、5014及5016。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:4876、4878、4880、4882、4884、4886、4888、4890、4892、4894、4896、4898、4900、4902、4904、4906、4908、4910、4912、4914、4916、4918、4920、4922、4924、4926、4928、4930、4932、4934、4936、4938、4940、4942、4944、4946、4948、4950、4952、4954、4956、4958、4960、4962、4964、4966、4968、4970、4972、4974、4976、4978、4980、4982、4984、4986、4988、4990、4992、4994、4996、4998、5000、5002、5004、5006、5008、5010、5012、5014及5016。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:4876、4878、4880、4882、4884、4886、4888、4890、4892、4894、4896、4898、4900、4902、4904、4906、4908、4910、4912、4914、4916、4918、4920、4922、4924、4926、4928、4930、4932、4934、4936、4938、4940、4942、4944、4946、4948、4950、4952、4954、4956、4958、4960、4962、4964、4966、4968、4970、4972、4974、4976、4978、4980、4982、4984、4986、4988、4990、4992、4994、4996、4998、5000、5002、5004、5006、5008、5010、5012、5014及5016。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8、9、25、25/198/209、25/200/209/338、25/200/243/249、25/209/243、25/209/243/249、25/209/243/259、25/209/249/259/366、25/209/259、25/209/279/366、25/209/289/366、25/249、25/259/279、25/259/279/289、25/279/284、25/279/284/289、25/289、34、53、54、55、61、69、70、73、79、87、91、107、108、111、141、153、158、174、190、194、198、198/200/209/243/249/289、198/249/338、200/209/366、201、205、209、209/249/259/279/338/366、209/249/259/289、209/249/279/284/289、209/249/338、209/279/289、209/366、234/297、238、247、249/259、252、253、254、256、259/366、279、279/338、289、297、308、321、322、327、336、338、341、342、364、366、388、392、411、412、414、426、430、432、446及449,其中該位置係根據序列辨識編號:4876予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8D、8L、9G、25H/209E/243M/249Y、25L、25L/198D/209E、25L/200S/209E/338C、25L/200S/243M/249M、25L/209E/243M、25L/209E/243M/249Y、25L/209E/243M/259G、25L/209E/249I/259G/366A、25L/209E/259G、25L/209E/279G/366A、25L/209E/289T/366A、25L/249I、25L/259G/279G、25L/259G/279G/289T、25L/279G/284T、25L/279G/284T/289T、25L/289T、34I、53C、53L、53R、53V、54P、54V、55T、55W、61S、69N、69Q、69S、69T、70K、73S、79G、79S、79V、87L、87M、87R、91Q、91R、91T、107A、107C、107T、108C、111C、111G、141M、153S、158Q、174M、190R、194Q、198D、198D/200S/209E/243M/249Y/289T、198D/249M/338C、200S/209E/366A、201P、201T、205P、209E、209E/249I/259G/289T、209E/249M/338C、209E/249Y/259G/279G/338C/366A、209E/249Y/279G/284T/289T、209E/279G/289T、209E/366A、234H/297A、238K、247A、247L、249M/259G、252A、252E、252Q、253G、253P、254G、254M、254P、256D、256T、256W、259G/366A、279G、279G/338C、289T、297A、308C、308L、308T、321D、322M、322R、322T、327L、336M、336Y、338C、341V、342R、364S、366A、388T、388V、392H、392Q、411E、411S、412H、412T、414L、426T、430R、432T、446F及449L,其中該位置係根據序列辨識編號:4876予以編號。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:T8D、T8L、V9G、I25H/Q209E/L243M/E249Y、I25L、I25L/I198D/Q209E、I25L/K200S/Q209E/V338C、I25L/K200S/L243M/E249M、I25L/Q209E/L243M、I25L/Q209E/L243M/E249Y、I25L/Q209E/L243M/H259G、I25L/Q209E/E249I/H259G/V366A、I25L/Q209E/H259G、I25L/Q209E/S279G/V366A、I25L/Q209E/K289T/V366A、I25L/E249I、I25L/H259G/S279G、I25L/H259G/S279G/K289T、I25L/S279G/S284T、I25L/S279G/S284T/K289T、I25L/K289T、V34I、K53C、K53L、K53R、K53V、T54P、T54V、S55T、S55W、T61S、D69N、D69Q、D69S、D69T、P70K、E73S、P79G、P79S、P79V、W87L、W87M、W87R、I91Q、I91R、I91T、L107A、L107C、L107T、M108C、S111C、S111G、L141M、A153S、P158Q、L174M、K190R、S194Q、I198D、I198D/K200S/Q209E/L243M/E249Y/K289T、I198D/E249M/V338C、K200S/Q209E/V366A、E201P、E201T、K205P、Q209E、Q209E/E249I/H259G/K289T、Q209E/E249M/V338C、Q209E/E249Y/H259G/S279G/V338C/V366A、Q209E/E249Y/S279G/S284T/K289T、Q209E/S279G/K289T、Q209E/V366A、R234H/G297A、A238K、K247A、K247L、E249M/H259G、S252A、S252E、S252Q、S253G、S253P、S254G、S254M、S254P、L256D、L256T、L256W、H259G/V366A、S279G、S279G/V338C、K289T、G297A、R308C、R308L、R308T、E321D、P322M、P322R、P322T、F327L、K336M、K336Y、V338C、Q341V、E342R、G364S、V366A、S388T、S388V、K392H、K392Q、R411E、R411S、R412H、R412T、M414L、A426T、K430R、K432T、S446F及S449L,其中該位置係根據序列辨識編號:4876予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:5018、5020、5022、5024、5026、5028、5030、5032、5034、5036、5038、5040、5042、5044、5046、5048、5050、5052、5054、5056、5058、5060、5062、5064、5066、5068、5070、5072、5074、5076、5078、5080、5082、5084、5086、5088、5090、5092、5094、5096、5098、5100、5102、5104、5106、5108、5110、5112、5114、5116、5118、5120、5122、5124、5126、5128、5130、5132、5134、5136、5138、5140、5142、5144、5146、5148、5150、5152、5154、5156、5158、5160、5162、5164、5166、5168、5170、5172、5174、5176、5178、5180、5182、5184、5186、5188、5190、5192、5194、5196、5198、5200、5202、5204、5206、5208、5210、5212、5214、5216、5218、5220、5222、5224、5226、5228、5230、5232、5234、5236、5238、5240、5242、5244、5246、5248、5250、5252、5254、5256、5258及5260。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:5018、5020、5022、5024、5026、5028、5030、5032、5034、5036、5038、5040、5042、5044、5046、5048、5050、5052、5054、5056、5058、5060、5062、5064、5066、5068、5070、5072、5074、5076、5078、5080、5082、5084、5086、5088、5090、5092、5094、5096、5098、5100、5102、5104、5106、5108、5110、5112、5114、5116、5118、5120、5122、5124、5126、5128、5130、5132、5134、5136、5138、5140、5142、5144、5146、5148、5150、5152、5154、5156、5158、5160、5162、5164、5166、5168、5170、5172、5174、5176、5178、5180、5182、5184、5186、5188、5190、5192、5194、5196、5198、5200、5202、5204、5206、5208、5210、5212、5214、5216、5218、5220、5222、5224、5226、5228、5230、5232、5234、5236、5238、5240、5242、5244、5246、5248、5250、5252、5254、5256、5258及5260。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:5018、5020、5022、5024、5026、5028、5030、5032、5034、5036、5038、5040、5042、5044、5046、5048、5050、5052、5054、5056、5058、5060、5062、5064、5066、5068、5070、5072、5074、5076、5078、5080、5082、5084、5086、5088、5090、5092、5094、5096、5098、5100、5102、5104、5106、5108、5110、5112、5114、5116、5118、5120、5122、5124、5126、5128、5130、5132、5134、5136、5138、5140、5142、5144、5146、5148、5150、5152、5154、5156、5158、5160、5162、5164、5166、5168、5170、5172、5174、5176、5178、5180、5182、5184、5186、5188、5190、5192、5194、5196、5198、5200、5202、5204、5206、5208、5210、5212、5214、5216、5218、5220、5222、5224、5226、5228、5230、5232、5234、5236、5238、5240、5242、5244、5246、5248、5250、5252、5254、5256、5258及5260。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:88、88/110、88/110/159/198/200、88/110/159/198/234/259/265、88/110/159/198/259、88/110/198、88/110/234、88/159/198、88/198、88/198/200/259、88/198/259、88/259、88/259/265、110/259/265/411、159/198/411、159/259/411、171/174/175/177/208/320/428/439、171/175/177/208/320/428、171/177、171/177/226/428/439、171/208/320、171/208/320/428、171/208/428、174/175/177/208/320/428、174/175/428、174/320、198、198/200、198/200/234、198/234、198/259、208、208/320/331/428、208/320/428、208/428、234、259、320/428及428,其中該位置係根據序列辨識編號:5066予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:88I、88I/110D、88I/110D/159N/198D/234T/259N/265A、88I/110D/159N/198D/259E、88I/110D/159N/198E/200S、88I/110D/198D、88I/110D/198S、88I/110D/234T、88I/159N/198D、88I/198D/200S/259E、88I/198D/259E、88I/198S、88I/259E/265A、88I/259N、110D/259N/265A/411T、159N/198E/411T、159N/259E/411T、171E/177P/226T/428K/439D、171E/208E/320I、171E/208E/320I/428K、171E/208E/428K、171P/174E/175N/177P/208W/320I/428K/439D、171P/175N/177P/208L/320I/428K、171P/177P、174E/175N/177P/208E/320I/428K、174E/175N/428K、174E/320I、198D、198D/200S/234E、198D/234Q、198E/200S、198E/259E、208E、208E/320I/428K、208E/428K、208L/320I/331C/428K、234E、259E、320I/428K及428K,其中該位置係根據序列辨識編號:5066予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:R88I、R88I/A110D、R88I/A110D/Q159N/I198D/R234T/G259N/Q265A、R88I/A110D/Q159N/I198D/G259E、R88I/A110D/Q159N/I198E/K200S、R88I/A110D/I198D、R88I/A110D/I198S、R88I/A110D/R234T、R88I/Q159N/I198D、R88I/I198D/K200S/G259E、R88I/I198D/G259E、R88I/I198S、R88I/G259E/Q265A、R88I/G259N、A110D/G259N/Q265A/R411T、Q159N/I198E/R411T、Q159N/G259E/R411T、K171E/Q177P/E226T/V428K/K439D、K171E/K208E/V320I、K171E/K208E/V320I/V428K、K171E/K208E/V428K、K171P/L174E/E175N/Q177P/K208W/V320I/V428K/K439D、K171P/E175N/Q177P/K208L/V320I/V428K、K171P/Q177P、L174E/E175N/Q177P/K208E/V320I/V428K、L174E/E175N/V428K、L174E/V320I、I198D、I198D/K200S/R234E、I198D/R234Q、I198E/K200S、I198E/G259E、K208E、K208E/V320I/V428K、K208E/V428K、K208L/V320I/R331C/V428K、R234E、G259E、V320I/V428K及V428K,其中該位置係根據序列辨識編號:5066予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:5262、5264、5266、5268、5270、5272、5274、5276、5278、5280、5282、5284、5286、5288、5290、5292、5294、5296、5298、5300、5302、5304、5306、5308、5310、5312、5314、5316、5318、5320、5322、5324、5326、5328、5330、5332、5334、5336、5338、5340及5342。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:5262、5264、5266、5268、5270、5272、5274、5276、5278、5280、5282、5284、5286、5288、5290、5292、5294、5296、5298、5300、5302、5304、5306、5308、5310、5312、5314、5316、5318、5320、5322、5324、5326、5328、5330、5332、5334、5336、5338、5340及5342。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:5262、5264、5266、5268、5270、5272、5274、5276、5278、5280、5282、5284、5286、5288、5290、5292、5294、5296、5298、5300、5302、5304、5306、5308、5310、5312、5314、5316、5318、5320、5322、5324、5326、5328、5330、5332、5334、5336、5338、5340及5342。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2、7、25/61/208/252/253、25/61/428、25/107/208/320/428、25/208/247/252/253/364/428、25/247/249/252/364/428、38、53/54/55/153/201、53/54/308/392、53/171/308/392、54、61/107/208/252/253/254/364/428、61/208/252/254/428、64、68、73/87/201、91/201/439/444、99、106、107、107/208/320/364/428、107/247/249/252/254/364、107/247/252、107/247/428、109、159、169、171、172、177、179、190、190/208/247/252/428、222、233、233/269、247/249/252/254/320/428、249/252/253/254、249/252/254/428、251、252/253/254、253/320、259、264、289、296、300、308、308/327/439、317、318、320、320/364/428、320/428、347、404、408、417、424、427、428、428/434、431、435及438,其中該位置係根據序列辨識編號:5290予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2L、2N、7P、25L/61S/208N/252E/253G、25L/61S/428K、25L/107T/208E/320I/428K、25L/208E/247L/252E/253G/364S/428K、25L/247L/249I/252E/364S/428K、38Q、53R/54V/55T/153S/201P、53V/54V/308L/392H、53V/171P/308L/392H、54A、61S/107T/208N/252E/253G/254M/364S/428K、61S/208W/252E/254M/428K、64S、68K、73S/87M/201P、91T/201P/439D/444H、99P、106T、107A、107A/208N/320I/364S/428K、107A/247A/249I/252E/254M/364S、107A/247A/252E、107A/247A/428K、109S、159L、169C、169E、169L、169Q、169V、171S、171T、171V、172H、172N、177P、179A、179S、190R、190R/208N/247L/252E/428K、222A、233C、233G、233K、233L、233M、233Q、233Q/269R、233V、247A/249I/252E/254M/320I/428K、249I/252E/253G/254M、249I/252E/254M/428K、251L、252E/253G/254M、253G/320I、259T、264A、289S、296A、296H、296Q、300G、308L、308L/327L/439D、317R、318T、320I、320I/364S/428K、320I/428K、347H、347K、347P、347R、404T、408R、417P、424A、424W、427L、427R、428E/434N、428F、428I、428K、428Q、428R、428S、431E、431R、435C、435K、435M、435Q、435R、435T及438Q,其中該位置係根據序列辨識編號:5290予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E2L、E2N、T7P、I25L/T61S/K208N/S252E/S253G、I25L/T61S/V428K、I25L/L107T/K208E/V320I/V428K、I25L/K208E/K247L/S252E/S253G/G364S/V428K、I25L/K247L/Y249I/S252E/G364S/V428K、R38Q、K53R/T54V/S55T/A153S/E201P、K53V/T54V/R308L/K392H、K53V/K171P/R308L/K392H、T54A、T61S/L107T/K208N/S252E/S253G/S254M/G364S/V428K、T61S/K208W/S252E/S254M/V428K、F64S、N68K、E73S/W87M/E201P、I91T/E201P/K439D/Y444H、E99P、S106T、L107A、L107A/K208N/V320I/G364S/V428K、L107A/K247A/Y249I/S252E/S254M/G364S、L107A/K247A/S252E、L107A/K247A/V428K、R109S、N159L、G169C、G169E、G169L、G169Q、G169V、K171S、K171T、K171V、T172H、T172N、Q177P、V179A、V179S、K190R、K190R/K208N/K247L/S252E/V428K、K222A、W233C、W233G、W233K、W233L、W233M、W233Q、W233Q/Q269R、W233V、K247A/Y249I/S252E/S254M/V320I/V428K、Y249I/S252E/S253G/S254M、Y249I/S252E/S254M/V428K、A251L、S252E/S253G/S254M、S253G/V320I、E259T、F264A、K289S、R296A、R296H、R296Q、D300G、R308L、R308L/F327L/K439D、S317R、E318T、V320I、V320I/G364S/V428K、V320I/V428K、D347H、D347K、D347P、D347R、G404T、N408R、R417P、Q424A、Q424W、A427L、A427R、V428E/D434N、V428F、V428I、V428K、V428Q、V428R、V428S、D431E、D431R、V435C、V435K、V435M、V435Q、V435R、V435T及A438Q,其中該位置係根據序列辨識編號:5290予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:5344、5346、5348、5350、5352、5354、5356、5358、5360、5362、5364、5366、5368、5370、5372、5374、5376、5378、5380、5382、5384、5386、5388、5390、5392、5394、5396、5398、5400、5402、5404、5406、5408、5410、5412、5414、5416、5418、5420、5422、5424、5426、5428、5430、5432、5434、5436、5438、5440、5442、5444、5446、5448、5450、5452、5454、5456、5458、5460、5462、5464、5466、5468、5470、5472、5474、5476、5478、5480、5482、5484、5486、5488、5490、5492、5494、5496、5498、5500、5502、5504、5506、5508、5510、5512、5514、5516、5518、5520、5522、5524、5526、5528、5530、5532、5534、5536、5538、5540及5542。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:5344、5346、5348、5350、5352、5354、5356、5358、5360、5362、5364、5366、5368、5370、5372、5374、5376、5378、5380、5382、5384、5386、5388、5390、5392、5394、5396、5398、5400、5402、5404、5406、5408、5410、5412、5414、5416、5418、5420、5422、5424、5426、5428、5430、5432、5434、5436、5438、5440、5442、5444、5446、5448、5450、5452、5454、5456、5458、5460、5462、5464、5466、5468、5470、5472、5474、5476、5478、5480、5482、5484、5486、5488、5490、5492、5494、5496、5498、5500、5502、5504、5506、5508、5510、5512、5514、5516、5518、5520、5522、5524、5526、5528、5530、5532、5534、5536、5538、5540及5542。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:5344、5346、5348、5350、5352、5354、5356、5358、5360、5362、5364、5366、5368、5370、5372、5374、5376、5378、5380、5382、5384、5386、5388、5390、5392、5394、5396、5398、5400、5402、5404、5406、5408、5410、5412、5414、5416、5418、5420、5422、5424、5426、5428、5430、5432、5434、5436、5438、5440、5442、5444、5446、5448、5450、5452、5454、5456、5458、5460、5462、5464、5466、5468、5470、5472、5474、5476、5478、5480、5482、5484、5486、5488、5490、5492、5494、5496、5498、5500、5502、5504、5506、5508、5510、5512、5514、5516、5518、5520、5522、5524、5526、5528、5530、5532、5534、5536、5538、5540及5542。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2、49、73、87、87/88、87/88/94/159/177/208、87/88/159/198、87/88/177/198/249、87/88/208、87/159/177、87/159/320、87/177/249、87/198、87/198/199、87/198/208/320、87/208、87/208/320、87/320、88、88/177、88/177/208、88/177/320、88/198、88/199、88/199/208、88/208、88/208/249/320、88/320、113、134、135、158、159/177/198、159/177/208、159/198/208/320、171、173、177/198、177/208、195、214、222、253、256、257、268、272、289、300、302、330、348、374、392、399、408、411、412、437、439、445及453,其中該位置係根據序列辨識編號:5372予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2G、2H、2P、49A、73P、73T、87M、87M/88R、87M/88R/94K/159Q/177P/208E、87M/88R/159Q/198E、87M/88R/177P/198E/249I、87M/88R/208E、87M/159Q/177P、87M/159Q/320I、87M/177P/249I、87M/198E、87M/198E/199K、87M/198E/208E/320I、87M/208E、87M/208E/320I、87M/320I、88R、88R/177P、88R/177P/208E、88R/177P/320I、88R/198I、88R/199K、88R/199K/208E、88R/208E、88R/208E/249I/320I、88R/320I、113S、134G、134S、135A、158D、158E、159Q/177P/198E、159Q/177P/208E、159Q/198I/208E/320I、171T、173N、173P、177P/198E、177P/208E、195H、214L、222R、253G、256P、257A、257Q、268A、268G、268H、272K、289T、300G、302R、330D、348C、374K、374R、392D、399D、408D、411Q、412H、437I、437T、437V、439A、445T及453R,其中該位置係根據序列辨識編號:5372予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E2G、E2H、E2P、F49A、E73P、E73T、W87M、W87M/I88R、W87M/I88R/E94K/N159Q/Q177P/K208E、W87M/I88R/N159Q/D198E、W87M/I88R/Q177P/D198E/Y249I、W87M/I88R/K208E、W87M/N159Q/Q177P、W87M/N159Q/V320I、W87M/Q177P/Y249I、W87M/D198E、W87M/D198E/A199K、W87M/D198E/K208E/V320I、W87M/K208E、W87M/K208E/V320I、W87M/V320I、I88R、I88R/Q177P、I88R/Q177P/K208E、I88R/Q177P/V320I、I88R/D198I、I88R/A199K、I88R/A199K/K208E、I88R/K208E、I88R/K208E/Y249I/V320I、I88R/V320I、E113S、D134G、D134S、S135A、P158D、P158E、N159Q/Q177P/D198E、N159Q/Q177P/K208E、N159Q/D198I/K208E/V320I、K171T、R173N、R173P、Q177P/D198E、Q177P/K208E、N195H、S214L、K222R、S253G、L256P、L257A、L257Q、D268A、D268G、D268H、P272K、K289T、D300G、K302R、E330D、A348C、S374K、S374R、K392D、N399D、N408D、R411Q、R412H、L437I、L437T、L437V、K439A、E445T及Y453R,其中該位置係根據序列辨識編號:5372予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:5544、5546、5548、5550、5552、5554、5556、5558、5560、5562、5564、5566、5568、5570、5572、5574、5576、5578、5580、5582、5584、5586、5588、5590、5592、5594、5596、5598、5600、5602、5604、5606、5608、5610、5612、5614、5616、5618、5620、5622、5624、5626、5628、5630、5632、5634、5636、5638、5640、5642、5644、5646、5648、5650、5652、5654、5656、5658、5660、5662、5664、5666、5668、5670、5672、5674、5676、5678、5680、5682、5684、5686、5688及5690。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:5544、5546、5548、5550、5552、5554、5556、5558、5560、5562、5564、5566、5568、5570、5572、5574、5576、5578、5580、5582、5584、5586、5588、5590、5592、5594、5596、5598、5600、5602、5604、5606、5608、5610、5612、5614、5616、5618、5620、5622、5624、5626、5628、5630、5632、5634、5636、5638、5640、5642、5644、5646、5648、5650、5652、5654、5656、5658、5660、5662、5664、5666、5668、5670、5672、5674、5676、5678、5680、5682、5684、5686、5688及5690。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:5544、5546、5548、5550、5552、5554、5556、5558、5560、5562、5564、5566、5568、5570、5572、5574、5576、5578、5580、5582、5584、5586、5588、5590、5592、5594、5596、5598、5600、5602、5604、5606、5608、5610、5612、5614、5616、5618、5620、5622、5624、5626、5628、5630、5632、5634、5636、5638、5640、5642、5644、5646、5648、5650、5652、5654、5656、5658、5660、5662、5664、5666、5668、5670、5672、5674、5676、5678、5680、5682、5684、5686、5688及5690。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/7/107/233/252/253/320、2/7/107/233/252/253/320/408/428、2/7/233/252/253/320/427/428、2/233/252/317/320、7/107/190/233/252/253/317/408/427、7/107/233/252/253、7/107/233/252/317/320、7/107/233/252/317/408、7/190/233/252/253/320/427、7/190/233/252/317/320/427/428、7/190/233/252/408/427、7/233/252/253/317/408/427、7/233/252/253/408、7/233/252/317/320/427、7/233/252/317/428、64/169/201/347/392、64/172/264/268/347/392/417、91/94/171/172/201/264/347、91/201/264/347/392、94/201/264/347/435、107/190/233/252、107/190/233/252/317/320、107/233/252/253、107/252/317、169/171/172/264/392/435、169/171/201/264/392/435、169/172/201/264/347、169/172/201/264/347/392/435、169/172/201/347/392、169/172/201/417/435、171/172/201/264/392/417/435、171/201/392/417、190/233/252、190/233/252/253/317/320/408/428、190/233/252/317/408、190/233/252/320/408、201/264/347/392/417/435、201/264/347/392/435、201/264/347/417/435、233/252/253/317/320/427/428、233/252/253/408/427、233/252/317/408、233/252/317/427、233/252/320、233/252/320/408/428、348/374/435及374,其中該位置係根據序列辨識編號:5562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2L/7P/233K/252E/253G/320I/427R/428R、2N/7P/107A/233K/252E/253G/320I、2N/7P/107A/233K/252E/253G/320I/408R/428R、2N/233K/252E/317R/320I、7P/107A/190R/233K/252E/253G/317R/408R/427R、7P/107A/233K/252E/253G、7P/107A/233K/252E/317R/320I、7P/107A/233K/252E/317R/408R、7P/190R/233K/252E/253G/320I/427L、7P/190R/233K/252E/317R/320I/427R/428R、7P/190R/233K/252E/408R/427R、7P/233K/252E/253G/317R/408R/427L、7P/233K/252E/253G/408R、7P/233K/252E/317R/320I/427L、7P/233K/252E/317R/428R、64S/169E/201P/347P/392H、64S/172H/264A/268V/347P/392H/417P、91T/94E/171T/172H/201P/264A/347G、91T/201P/264A/347G/392H、94E/201P/264A/347G/435Q、107A/190R/233K/252E、107A/190R/233K/252E/317R/320I、107A/233K/252E/253G、107A/252E/317R、169E/171T/172H/264A/392H/435Q、169E/171T/201P/264A/392H/435Q、169E/172H/201P/264A/347G、169E/172H/201P/264A/347K/392H/435R、169E/172H/201P/347G/392H、169E/172H/201P/417P/435R、171T/172H/201P/264A/392H/417P/435R、171T/201P/392H/417P、190R/233K/252E、190R/233K/252E/253G/317R/320I/408R/428R、190R/233K/252E/317R/408R、190R/233K/252E/320I/408R、201P/264A/347K/392H/417P/435R、201P/264A/347K/417P/435R、201P/264A/347P/392H/435Q、233K/252E/253G/317R/320I/427R/428R、233K/252E/253G/408R/427L、233K/252E/317R/408R、233K/252E/317R/427R、233K/252E/320I、233K/252E/320I/408R/428R、348S/374R/435R及374R,其中該位置係根據序列辨識編號:5562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E2L/T7P/W233K/S252E/S253G/V320I/A427R/K428R、E2N/T7P/L107A/W233K/S252E/S253G/V320I、E2N/T7P/L107A/W233K/S252E/S253G/V320I/N408R/K428R、E2N/W233K/S252E/S317R/V320I、T7P/L107A/K190R/W233K/S252E/S253G/S317R/N408R/A427R、T7P/L107A/W233K/S252E/S253G、T7P/L107A/W233K/S252E/S317R/V320I、T7P/L107A/W233K/S252E/S317R/N408R、T7P/K190R/W233K/S252E/S253G/V320I/A427L、T7P/K190R/W233K/S252E/S317R/V320I/A427R/K428R、T7P/K190R/W233K/S252E/N408R/A427R、T7P/W233K/S252E/S253G/S317R/N408R/A427L、T7P/W233K/S252E/S253G/N408R、T7P/W233K/S252E/S317R/V320I/A427L、T7P/W233K/S252E/S317R/K428R、F64S/G169E/E201P/D347P/K392H、F64S/T172H/F264A/D268V/D347P/K392H/R417P、I91T/K94E/K171T/T172H/E201P/F264A/D347G、I91T/E201P/F264A/D347G/K392H、K94E/E201P/F264A/D347G/V435Q、L107A/K190R/W233K/S252E、L107A/K190R/W233K/S252E/S317R/V320I、L107A/W233K/S252E/S253G、L107A/S252E/S317R、G169E/K171T/T172H/F264A/K392H/V435Q、G169E/K171T/E201P/F264A/K392H/V435Q、G169E/T172H/E201P/F264A/D347G、G169E/T172H/E201P/F264A/D347K/K392H/V435R、G169E/T172H/E201P/D347G/K392H、G169E/T172H/E201P/R417P/V435R、K171T/T172H/E201P/F264A/K392H/R417P/V435R、K171T/E201P/K392H/R417P、K190R/W233K/S252E、K190R/W233K/S252E/S253G/S317R/V320I/N408R/K428R、K190R/W233K/S252E/S317R/N408R、K190R/W233K/S252E/V320I/N408R、E201P/F264A/D347K/K392H/R417P/V435R、E201P/F264A/D347K/R417P/V435R、E201P/F264A/D347P/K392H/V435Q、W233K/S252E/S253G/S317R/V320I/A427R/K428R、W233K/S252E/S253G/N408R/A427L、W233K/S252E/S317R/N408R、W233K/S252E/S317R/A427R、W233K/S252E/V320I、W233K/S252E/V320I/N408R/K428R、A348S/S374R/V435R及S374R,其中該位置係根據序列辨識編號:5562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14、55、56、255、282、308、336、342、364、391、407及422,其中該位置係根據序列辨識編號:5562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14I、55V、56A、255L、282S、308L、308Q、336Q、342W、364A、364S、391C、407C、407V及422Q,其中該位置係根據序列辨識編號:5562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:V14I、S55V、L56A、S255L、T282S、R308L、R308Q、K336Q、E342W、G364A、G364S、L391C、E407C、E407V及M422Q,其中該位置係根據序列辨識編號:5562予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:5692、5694、5696、5698、5700、5702、5704、5706、5708、5710、5712、5714、5716、5718、5720、5722、5724、5726、5728、5730、5732、5734、5736、5738、5740、5742、5744、5746、5748、5750、5752、5754、5756、5758、5760、5762、5764、5766、5768、5770、5772、5774、5776、5778、5780、5782、5784、5786、5788、5790、5792、5794、5796、5798、5800、5802、5804、5806、5808、5810、5812及5814。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:5692、5694、5696、5698、5700、5702、5704、5706、5708、5710、5712、5714、5716、5718、5720、5722、5724、5726、5728、5730、5732、5734、5736、5738、5740、5742、5744、5746、5748、5750、5752、5754、5756、5758、5760、5762、5764、5766、5768、5770、5772、5774、5776、5778、5780、5782、5784、5786、5788、5790、5792、5794、5796、5798、5800、5802、5804、5806、5808、5810、5812及5814。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:5692、5694、5696、5698、5700、5702、5704、5706、5708、5710、5712、5714、5716、5718、5720、5722、5724、5726、5728、5730、5732、5734、5736、5738、5740、5742、5744、5746、5748、5750、5752、5754、5756、5758、5760、5762、5764、5766、5768、5770、5772、5774、5776、5778、5780、5782、5784、5786、5788、5790、5792、5794、5796、5798、5800、5802、5804、5806、5808、5810、5812及5814。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/4/113/158/163/302/364/399/449、2/4/113/158/163/330/449、2/4/113/163/449、2/4/158/163/364/449、2/4/158/222/257/302/330、2/4/158/330、2/4/163/222/302/330/364/449、2/4/163/257、2/4/163/257/330/399/449、2/4/163/330/449、2/4/163/364、2/4/163/364/453、2/4/302、2/113、2/113/163、2/113/163/449、2/113/330/399、2/113/449、2/158/163、2/158/163/364/399、2/163/364/453、2/364/449、4/113/158/163/330/364/399、4/113/158/302/330/364、4/113/163/364/399、4/158/163/364/399、4/364/449、87、87/95/198、87/198、87/266、87/322、107/134/135/195/412/417、107/195/268/322/439、107/195/272、107/195/417/439、107/374/417/439、113/158/163/364/399、134、134/135/195/268/317、158/163/257/330/364/449、158/163/302/330/364/399、158/163/364、163/257/302/364、163/302/330/364/449、163/364、173、173/190/233/252/427/437、173/190/252/257/347/427/437、173/190/257/374/437、173/190/257/427/437、173/233/252/257/427、173/233/437、173/252、173/252/268/437、173/252/347/411、173/257/374/437、173/374/437、173/427/437、190/233/252/257/347/411/437、190/252、190/252/257/285/427、190/252/257/411/437、190/252/257/427、190/374/427/437、195/272/320/439、195/317/320、198、198/244、198/292、233/252、233/252/257、233/252/257/347、233/252/257/347/411/437、233/252/257/427/437、233/252/285、233/252/285/437、233/252/411/437、233/252/437、233/374、233/374/437、252/257、252/257/347/437、257/347/411/437、268/417、285/347/437、302/364、330/364、347/411/437、347/427/437、364/399、374、374/411/437、408/417、411/437及437,其中該位置係根據序列辨識編號:5708予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2P/4T/113S/158D/163A/330D/449R、2P/4T/113S/158D/163R/302R/364S/399D/449R、2P/4T/113S/163R/449R、2P/4T/158D/163A/364S/449R、2P/4T/158D/222R/257Q/302R/330D、2P/4T/158D/330D、2P/4T/163A/257Q、2P/4T/163A/330D/449R、2P/4T/163A/364S、2P/4T/163A/364S/453R、2P/4T/163R/222R/302R/330D/364S/449R、2P/4T/163R/257Q/330D/399D/449R、2P/4T/302R、2P/113S、2P/113S/163A、2P/113S/163R/449R、2P/113S/330D/399D、2P/113S/449R、2P/158D/163A/364S/399D、2P/158D/163R、2P/163R/364S/453R、2P/364S/449R、4T/113S/158D/163A/330D/364S/399D、4T/113S/158D/302R/330D/364S、4T/113S/163A/364S/399D、4T/158D/163A/364S/399D、4T/364S/449R、87W、87W/95L/198E、87W/198E、87W/198I、87W/266L、87W/322S、107A/134S/135A/195H/412H/417P、107A/195H/268A/322L/439P、107A/195H/272K、107A/195H/417P/439P、107A/374T/417P/439P、113S/158D/163A/364S/399D、113S/158D/163R/364S/399D、134S、134S/135A/195H/268A/317R、158D/163A/257Q/330D/364S/449R、158D/163A/364S、158D/163R/302R/330D/364S/399D、163A/257Q/302R/364S、163A/364S、163R/302R/330D/364S/449R、173N、173N/190R/233K/252E/427R/437V、173N/190R/252E/257A/347G/427R/437I、173N/190R/257A/374K/437V、173N/190R/257A/427R/437I、173N/233K/252E/257A/427R、173N/233K/437I、173N/252E、173N/252E/268H/437V、173N/252E/347G/411Q、173N/257A/374K/437V、173N/374K/437I、173N/427R/437I、190R/233K/252E/257A/347G/411Q/437I、190R/252E、190R/252E/257A/285Q/427R、190R/252E/257A/411Q/437I、190R/252E/257A/427R、190R/374K/427R/437V、195H/272K/320I/439P、195H/317R/320I、198E、198E/292P、198I、198I/244L、233K/252E、233K/252E/257A、233K/252E/257A/347G、233K/252E/257A/347G/411Q/437I、233K/252E/257A/427R/437V、233K/252E/285Q、233K/252E/285Q/437V、233K/252E/411Q/437V、233K/252E/437V、233K/374K、233K/374K/437I、252E/257A、252E/257A/347G/437V、257A/347G/411Q/437V、268A/417P、285Q/347G/437V、302R/364S、330D/364S、347G/411Q/437I、347G/427R/437V、364S/399D、374K、374K/411Q/437I、374K/411Q/437V、408D/417P、411Q/437V及437I,其中該位置係根據序列辨識編號:5708予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E2P/K4T/E113S/P158D/L163A/E330D/S449R、E2P/K4T/E113S/P158D/L163R/K302R/G364S/N399D/S449R、E2P/K4T/E113S/L163R/S449R、E2P/K4T/P158D/L163A/G364S/S449R、E2P/K4T/P158D/K222R/L257Q/K302R/E330D、E2P/K4T/P158D/E330D、E2P/K4T/L163A/L257Q、E2P/K4T/L163A/E330D/S449R、E2P/K4T/L163A/G364S、E2P/K4T/L163A/G364S/Y453R、E2P/K4T/L163R/K222R/K302R/E330D/G364S/S449R、E2P/K4T/L163R/L257Q/E330D/N399D/S449R、E2P/K4T/K302R、E2P/E113S、E2P/E113S/L163A、E2P/E113S/L163R/S449R、E2P/E113S/E330D/N399D、E2P/E113S/S449R、E2P/P158D/L163A/G364S/N399D、E2P/P158D/L163R、E2P/L163R/G364S/Y453R、E2P/G364S/S449R、K4T/E113S/P158D/L163A/E330D/G364S/N399D、K4T/E113S/P158D/K302R/E330D/G364S、K4T/E113S/L163A/G364S/N399D、K4T/P158D/L163A/G364S/N399D、K4T/G364S/S449R、M87W、M87W/H95L/D198E、M87W/D198E、M87W/D198I、M87W/W266L、M87W/P322S、L107A/D134S/S135A/N195H/R412H/R417P、L107A/N195H/D268A/P322L/K439P、L107A/N195H/P272K、L107A/N195H/R417P/K439P、L107A/S374T/R417P/K439P、E113S/P158D/L163A/G364S/N399D、E113S/P158D/L163R/G364S/N399D、D134S、D134S/S135A/N195H/D268A/S317R、P158D/L163A/L257Q/E330D/G364S/S449R、P158D/L163A/G364S、P158D/L163R/K302R/E330D/G364S/N399D、L163A/L257Q/K302R/G364S、L163A/G364S、L163R/K302R/E330D/G364S/S449R、R173N、R173N/K190R/W233K/S252E/A427R/L437V、R173N/K190R/S252E/L257A/K347G/A427R/L437I、R173N/K190R/L257A/S374K/L437V、R173N/K190R/L257A/A427R/L437I、R173N/W233K/S252E/L257A/A427R、R173N/W233K/L437I、R173N/S252E、R173N/S252E/D268H/L437V、R173N/S252E/K347G/R411Q、R173N/L257A/S374K/L437V、R173N/S374K/L437I、R173N/A427R/L437I、K190R/W233K/S252E/L257A/K347G/R411Q/L437I、K190R/S252E、K190R/S252E/L257A/E285Q/A427R、K190R/S252E/L257A/R411Q/L437I、K190R/S252E/L257A/A427R、K190R/S374K/A427R/L437V、N195H/P272K/V320I/K439P、N195H/S317R/V320I、D198E、D198E/L292P、D198I、D198I/P244L、W233K/S252E、W233K/S252E/L257A、W233K/S252E/L257A/K347G、W233K/S252E/L257A/K347G/R411Q/L437I、W233K/S252E/L257A/A427R/L437V、W233K/S252E/E285Q、W233K/S252E/E285Q/L437V、W233K/S252E/R411Q/L437V、W233K/S252E/L437V、W233K/S374K、W233K/S374K/L437I、S252E/L257A、S252E/L257A/K347G/L437V、L257A/K347G/R411Q/L437V、D268A/R417P、E285Q/K347G/L437V、K302R/G364S、E330D/G364S、K347G/R411Q/L437I、K347G/A427R/L437V、G364S/N399D、S374K、S374K/R411Q/L437I、S374K/R411Q/L437V、N408D/R417P、R411Q/L437V及L437I,其中該位置係根據序列辨識編號:5708予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:5816、5818、5820、5822、5824、5826、5828、5830、5832、5834、5836、5838、5840、5842、5844、5846、5848、5850、5852、5854、5856、5858、5860、5862、5864、5866、5868、5870、5872、5874、5876、5878、5880、5882、5884、5886、5888、5890、5892、5894、5896、5898、5900、5902、5904、5906、5908、5910、5912、5914、5916、5918、5920、5922、5924、5926、5928、5930、5932、5934、5936、5938、5940、5942、5944、5946、5948、5950、5952、5954、5956、5958、5960、5962、5964、5966、5968、5970、5972、5974、5976、5978、5980、5982、5984、5986、5988、5990、5992、5994、5996、5998、6000、6002、6004、6006、6008、6010、6012及6014。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:5816、5818、5820、5822、5824、5826、5828、5830、5832、5834、5836、5838、5840、5842、5844、5846、5848、5850、5852、5854、5856、5858、5860、5862、5864、5866、5868、5870、5872、5874、5876、5878、5880、5882、5884、5886、5888、5890、5892、5894、5896、5898、5900、5902、5904、5906、5908、5910、5912、5914、5916、5918、5920、5922、5924、5926、5928、5930、5932、5934、5936、5938、5940、5942、5944、5946、5948、5950、5952、5954、5956、5958、5960、5962、5964、5966、5968、5970、5972、5974、5976、5978、5980、5982、5984、5986、5988、5990、5992、5994、5996、5998、6000、6002、6004、6006、6008、6010、6012及6014。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:5816、5818、5820、5822、5824、5826、5828、5830、5832、5834、5836、5838、5840、5842、5844、5846、5848、5850、5852、5854、5856、5858、5860、5862、5864、5866、5868、5870、5872、5874、5876、5878、5880、5882、5884、5886、5888、5890、5892、5894、5896、5898、5900、5902、5904、5906、5908、5910、5912、5914、5916、5918、5920、5922、5924、5926、5928、5930、5932、5934、5936、5938、5940、5942、5944、5946、5948、5950、5952、5954、5956、5958、5960、5962、5964、5966、5968、5970、5972、5974、5976、5978、5980、5982、5984、5986、5988、5990、5992、5994、5996、5998、6000、6002、6004、6006、6008、6010、6012及6014。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/4/14/158/282/364/449、2/4/14/158/282/407、2/4/14/163/198、2/4/14/163/282/399、2/4/14/198/308/407、2/4/14/282/308/364、2/4/14/282/308/407、2/4/14/282/364、2/4/158/163/364/399/407、2/4/158/198/282/364/407、2/4/163/198/282/308/342、2/4/163/282/342/364、2/4/163/364/399/449、2/4/198/282/449、2/4/198/364/391/449、2/4/282/342/364/407、2/14/158/198/407/449、2/14/163/308/364、2/14/163/364/407、2/14/282、2/14/282/308、2/14/282/308/364、2/14/282/399、2/14/308、2/14/308/364、2/158/163/407/449、2/163/282、2/163/282/308/364、2/198/282/308/342、2/198/282/399、2/282、2/282/308/342/407、2/282/308/391/407、2/282/399、2/282/399/407、2/308、2/308/364/399、4/14/158/163/198/282/407、4/14/158/282/364/391/407、4/14/163/282、4/14/163/282/308/342/407/449、4/14/198/308/364、4/14/282、4/14/282/308/364/407/449、4/14/282/342/399/407、4/14/364/391、4/158/282/364/399、4/163/282/308/407、4/198/399/407、4/282/342/364/407、4/282/364/407、4/364、12、14/158/163/198/364、14/158/163/282/364、14/158/198/282/342/364/449、14/158/364、14/163/198/282/342/364/449、14/163/282/308、14/282、14/282/308、14/282/342/364/391、14/282/364、14/282/364/391/407/449、14/282/399/407/449、14/407、37、44、70、71/331、74、75、90、106、108、112、114、115、131、138、139、156、158/282/407、158/282/407/449、158/364/399/407/449、158/364/449、162、163/198/282/342、163/282/308/364/399、163/282/399/407、163/282/407/449、174、198/282/308/342、198/282/407、198/308、247、248、254、258、282/308/342/364/449、282/308/449、365、389、401/402、416、427、429、432、433及456,其中該位置係根據序列辨識編號:5976予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2P/4T/14I/158D/282S/364A/449R、2P/4T/14I/158D/282S/407V、2P/4T/14I/163A/198E、2P/4T/14I/163A/282S/399D、2P/4T/14I/198E/308L/407V、2P/4T/14I/282S/308L/364A、2P/4T/14I/282S/308L/407V、2P/4T/14I/282S/364A、2P/4T/158D/163A/364A/399D/407V、2P/4T/158D/198E/282S/364A/407V、2P/4T/163A/198E/282S/308L/342W、2P/4T/163A/282S/342W/364A、2P/4T/163A/364A/399D/449R、2P/4T/198E/282S/449R、2P/4T/198E/364A/391C/449R、2P/4T/282S/342W/364A/407V、2P/14I/158D/198E/407V/449R、2P/14I/163A/308L/364A、2P/14I/163A/364A/407V、2P/14I/282S、2P/14I/282S/308L、2P/14I/282S/308L/364A、2P/14I/282S/399D、2P/14I/308L、2P/14I/308L/364A、2P/158D/163A/407V/449R、2P/163A/282S、2P/163A/282S/308L/364A、2P/198E/282S/308L/342W、2P/198E/282S/399D、2P/282S、2P/282S/308L/342W/407V、2P/282S/308L/391C/407V、2P/282S/399D、2P/282S/399D/407V、2P/308L、2P/308L/364A/399D、4T/14I/158D/163A/198E/282S/407V、4T/14I/158D/282S/364A/391C/407V、4T/14I/163A/282S、4T/14I/163A/282S/308L/342W/407V/449R、4T/14I/198E/308L/364A、4T/14I/282S、4T/14I/282S/308L/364A/407V/449R、4T/14I/282S/342W/399D/407V、4T/14I/364A/391C、4T/158D/282S/364A/399D、4T/163A/282S/308L/407V、4T/198E/399D/407V、4T/282S/342W/364A/407V、4T/282S/364A/407V、4T/364A、12S、14I/158D/163A/198E/364A、14I/158D/163A/282S/364A、14I/158D/198E/282S/342W/364A/449R、14I/158D/364A、14I/163A/198E/282S/342W/364A/449R、14I/163A/282S/308L、14I/282S、14I/282S/308L、14I/282S/342W/364A/391C、14I/282S/364A、14I/282S/364A/391C/407V/449R、14I/282S/399D/407V/449R、14I/407V、37R、44V、70K、71L/331K、74H、75G、75M、90Q、90S、90T、106Y、108H、112N、114P、115R、131V、138V、139A、139R、139S、156C、158D/282S/407V、158D/282S/407V/449R、158D/364A/399D/407V/449R、158D/364A/449R、162A、163A/198E/282S/342W、163A/282S/308L/364A/399D、163A/282S/399D/407V、163A/282S/407V/449R、174P、198E/282S/308L/342W、198E/282S/407V、198E/308L、247C、247L、248C、248L、248W、254Q、258N、282S/308L/342W/364A/449R、282S/308L/449R、365I、389A、389E、389S、401F/402L、416L、416S、427K、427R、429W、432L、433L及456R,其中該位置係根據序列辨識編號:5976予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E2P/K4T/V14I/P158D/T282S/G364A/S449R、E2P/K4T/V14I/P158D/T282S/E407V、E2P/K4T/V14I/L163A/D198E、E2P/K4T/V14I/L163A/T282S/N399D、E2P/K4T/V14I/D198E/R308L/E407V、E2P/K4T/V14I/T282S/R308L/G364A、E2P/K4T/V14I/T282S/R308L/E407V、E2P/K4T/V14I/T282S/G364A、E2P/K4T/P158D/L163A/G364A/N399D/E407V、E2P/K4T/P158D/D198E/T282S/G364A/E407V、E2P/K4T/L163A/D198E/T282S/R308L/E342W、E2P/K4T/L163A/T282S/E342W/G364A、E2P/K4T/L163A/G364A/N399D/S449R、E2P/K4T/D198E/T282S/S449R、E2P/K4T/D198E/G364A/L391C/S449R、E2P/K4T/T282S/E342W/G364A/E407V、E2P/V14I/P158D/D198E/E407V/S449R、E2P/V14I/L163A/R308L/G364A、E2P/V14I/L163A/G364A/E407V、E2P/V14I/T282S、E2P/V14I/T282S/R308L、E2P/V14I/T282S/R308L/G364A、E2P/V14I/T282S/N399D、E2P/V14I/R308L、E2P/V14I/R308L/G364A、E2P/P158D/L163A/E407V/S449R、E2P/L163A/T282S、E2P/L163A/T282S/R308L/G364A、E2P/D198E/T282S/R308L/E342W、E2P/D198E/T282S/N399D、E2P/T282S、E2P/T282S/R308L/E342W/E407V、E2P/T282S/R308L/L391C/E407V、E2P/T282S/N399D、E2P/T282S/N399D/E407V、E2P/R308L、E2P/R308L/G364A/N399D、K4T/V14I/P158D/L163A/D198E/T282S/E407V、K4T/V14I/P158D/T282S/G364A/L391C/E407V、K4T/V14I/L163A/T282S、K4T/V14I/L163A/T282S/R308L/E342W/E407V/S449R、K4T/V14I/D198E/R308L/G364A、K4T/V14I/T282S、K4T/V14I/T282S/R308L/G364A/E407V/S449R、K4T/V14I/T282S/E342W/N399D/E407V、K4T/V14I/G364A/L391C、K4T/P158D/T282S/G364A/N399D、K4T/L163A/T282S/R308L/E407V、K4T/D198E/N399D/E407V、K4T/T282S/E342W/G364A/E407V、K4T/T282S/G364A/E407V、K4T/G364A、R12S、V14I/P158D/L163A/D198E/G364A、V14I/P158D/L163A/T282S/G364A、V14I/P158D/D198E/T282S/E342W/G364A/S449R、V14I/P158D/G364A、V14I/L163A/D198E/T282S/E342W/G364A/S449R、V14I/L163A/T282S/R308L、V14I/T282S、V14I/T282S/R308L、V14I/T282S/E342W/G364A/L391C、V14I/T282S/G364A、V14I/T282S/G364A/L391C/E407V/S449R、V14I/T282S/N399D/E407V/S449R、V14I/E407V、S37R、I44V、P70K、Q71L/R331K、W74H、L75G、L75M、P90Q、P90S、P90T、S106Y、M108H、P112N、D114P、E115R、P131V、L138V、P139A、P139R、P139S、S156C、P158D/T282S/E407V、P158D/T282S/E407V/S449R、P158D/G364A/N399D/E407V/S449R、P158D/G364A/S449R、E162A、L163A/D198E/T282S/E342W、L163A/T282S/R308L/G364A/N399D、L163A/T282S/N399D/E407V、L163A/T282S/E407V/S449R、L174P、D198E/T282S/R308L/E342W、D198E/T282S/E407V、D198E/R308L、K247C、K247L、H248C、H248L、H248W、S254Q、D258N、T282S/R308L/E342W/G364A/S449R、T282S/R308L/S449R、V365I、D389A、D389E、D389S、L401F/E402L、D416L、D416S、A427K、A427R、L429W、K432L、A433L及S456R,其中該位置係根據序列辨識編號:5976予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:6016、6018、6020、6022、6024、6026、6028、6030、6032、6034、6036、6038、6040、6042、6044、6046、6048、6050、6052、6054、6056、6058、6060、6062、6064、6066、6068、6070、6072、6074、6076、6078、6080、6082、6084、6086、6088、6090、6092、6094、6096、6098、6100、6102、6104、6106、6108、6110、6112、6114、6116、6118、6120、6122、6124、6126、6128、6130、6132、6134、6136、6138、6140、6142、6144、6146、6148、6150、6152、6154、6156、6158、6160、6162、6164、6166、6168、6170、6172、6174、6176、6178、6180、6182、6184、6186、6188、6190、6192、6194、6196、6198、6200、6202、6204、6206、6208、6210、6212、6214、6216、6218、6220、6222、6224、6226、6228、6230、6232、6234、6236、6238、6240、6242、6244、6246、6248、6250、6252、6254、6256、6258及6260。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:6016、6018、6020、6022、6024、6026、6028、6030、6032、6034、6036、6038、6040、6042、6044、6046、6048、6050、6052、6054、6056、6058、6060、6062、6064、6066、6068、6070、6072、6074、6076、6078、6080、6082、6084、6086、6088、6090、6092、6094、6096、6098、6100、6102、6104、6106、6108、6110、6112、6114、6116、6118、6120、6122、6124、6126、6128、6130、6132、6134、6136、6138、6140、6142、6144、6146、6148、6150、6152、6154、6156、6158、6160、6162、6164、6166、6168、6170、6172、6174、6176、6178、6180、6182、6184、6186、6188、6190、6192、6194、6196、6198、6200、6202、6204、6206、6208、6210、6212、6214、6216、6218、6220、6222、6224、6226、6228、6230、6232、6234、6236、6238、6240、6242、6244、6246、6248、6250、6252、6254、6256、6258及6260。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14/113/158、14/113/158/163、14/113/158/163/190/257/308/342、14/113/158/163/437、14/113/158/308/317/330/449、14/113/163/190/308/317、14/113/163/257/308/342/437/449、14/113/163/257/437、14/113/163/308/317/320/322/330/449、14/113/320/437/449、14/158、14/158/163/190/257/308/317/330/437、14/158/163/190/342/437、14/158/163/257、14/158/163/257/308/449、14/158/257/308/437/449、14/158/317/320/330/437、14/163/317/320、14/190、14/190/257/317/320/322、14/257/308/320/322/330、14/257/308/322/330/437、14/317、14/330、14/449、19、29/375、41、45、46、71、72、80、81、83、84、85、88、95、105、113/158/163/190/257/437、113/158/163/190/308/317/322、113/158/163/190/308/320、113/158/163/257/308/317/322/437/449、113/158/190/257/320、113/158/190/320/322/449、113/158/320/322/437、113/257/308、113/257/317/322/437、155、158/163、158/163/190/257/308/342/449、158/163/308、158/163/322/437、158/308/320/437、158/320/437/449、163/308/330/437/449、168、190/449、197、199、202、209、243、249、263、273、317/320/322/330、322/330、366、375及383,其中該位置係根據序列辨識編號:6138予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14I/113S/158P、14I/113S/158P/163A、14I/113S/158P/163A/190R/257Q/308L/342W、14I/113S/158P/163A/437I、14I/113S/158P/308L/317R/330D/449R、14I/113S/163A/190R/308L/317R、14I/113S/163A/257Q/308L/342W/437I/449R、14I/113S/163A/257Q/437I、14I/113S/163A/308L/317R/320I/322L/330D/449R、14I/113S/320I/437I/449R、14I/158P、14I/158P/163A/190R/257Q/308L/317R/330D/437I、14I/158P/163A/190R/342W/437I、14I/158P/163A/257Q、14I/158P/163A/257Q/308L/449R、14I/158P/257Q/308L/437I/449R、14I/158P/317R/320I/330D/437I、14I/163A/317R/320I、14I/190R、14I/190R/257Q/317R/320I/322L、14I/257Q/308L/320I/322L/330D、14I/257Q/308L/322L/330D/437I、14I/317R、14I/330D、14I/449R、19Q、29M/375P、41A、45L、46S、71V、72S、72T、80P、81T、83A、83K、83N、83S、83T、84D、84H、84N、85L、88A、88C、88H、88K、88T、95N、105A、113S/158P/163A/190R/257Q/437I、113S/158P/163A/190R/308L/317R/322L、113S/158P/163A/190R/308L/320I、113S/158P/163A/257Q/308L/317R/322L/437I/449R、113S/158P/190R/257Q/320I、113S/158P/190R/320I/322L/449R、113S/158P/320I/322L/437I、113S/257Q/308L、113S/257Q/317R/322L/437I、155L、158P/163A、158P/163A/190R/257Q/308L/342W/449R、158P/163A/308L、158P/163A/322L/437I、158P/308L/320I/437I、158P/320I/437I/449R、163A/308L/330D/437I/449R、168C、168T、190R/449R、197K、199E、199H、199M、199Q、199Y、202H、202Q、202T、202V、209T、243I、249S、263T、273A、273H、273R、317R/320I/322L/330D、322L/330D、366C、366L、366S、366T、366V、375A、375P、375T、375V及383V,其中該位置係根據序列辨識編號:6138予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:V14I/E113S/D158P、V14I/E113S/D158P/L163A、V14I/E113S/D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/E342W、V14I/E113S/D158P/L163A/L437I、V14I/E113S/D158P/R308L/S317R/E330D/S449R、V14I/E113S/L163A/K190R/R308L/S317R、V14I/E113S/L163A/L257Q/R308L/E342W/L437I/S449R、V14I/E113S/L163A/L257Q/L437I、V14I/E113S/L163A/R308L/S317R/V320I/P322L/E330D/S449R、V14I/E113S/V320I/L437I/S449R、V14I/D158P、V14I/D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/S317R/E330D/L437I、V14I/D158P/L163A/K190R/E342W/L437I、V14I/D158P/L163A/L257Q、V14I/D158P/L163A/L257Q/R308L/S449R、V14I/D158P/L257Q/R308L/L437I/S449R、V14I/D158P/S317R/V320I/E330D/L437I、V14I/L163A/S317R/V320I、V14I/K190R、V14I/K190R/L257Q/S317R/V320I/P322L、V14I/L257Q/R308L/V320I/P322L/E330D、V14I/L257Q/R308L/P322L/E330D/L437I、V14I/S317R、V14I/E330D、V14I/S449R、V19Q、L29M/D375P、S41A、F45L、H46S、Q71V、D72S、D72T、T80P、H81T、P83A、P83K、P83N、P83S、P83T、G84D、G84H、G84N、A85L、R88A、R88C、R88H、R88K、R88T、H95N、E105A、E113S/D158P/L163A/K190R/L257Q/L437I、E113S/D158P/L163A/K190R/R308L/S317R/P322L、E113S/D158P/L163A/K190R/R308L/V320I、E113S/D158P/L163A/L257Q/R308L/S317R/P322L/L437I/S449R、E113S/D158P/K190R/L257Q/V320I、E113S/D158P/K190R/V320I/P322L/S449R、E113S/D158P/V320I/P322L/L437I、E113S/L257Q/R308L、E113S/L257Q/S317R/P322L/L437I、V155L、D158P/L163A、D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/E342W/S449R、D158P/L163A/R308L、D158P/L163A/P322L/L437I、D158P/R308L/V320I/L437I、D158P/V320I/L437I/S449R、L163A/R308L/E330D/L437I/S449R、P168C、P168T、K190R/S449R、Q197K、A199E、A199H、A199M、A199Q、A199Y、I202H、I202Q、I202T、I202V、E209T、L243I、Y249S、V263T、S273A、S273H、S273R、S317R/V320I/P322L/E330D、P322L/E330D、A366C、A366L、A366S、A366T、A366V、D375A、D375P、D375T、D375V及N383V,其中該位置係根據序列辨識編號:6138予以編號。
在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:6262、6264、6266、6268、6270、6272、6274、6276、6278、6280、6282、6284、6286、6288、6290、6292、6294、6296、6298、6300、6302、6304、6306、6308、6310、6312、6314、6316、6318、6320、6322、6324、6326、6328、6330、6332、6334、6336、6338、6340、6342、6344、6346、6348、6350、6352、6354、6356、6358、6360、6362、6364、6366、6368、6370、6372、6374、6376、6378、6380、6382、6384、6386、6388、6390、6392、6394、6396、6398、6400、6402、6404、6406、6408、6410、6412、6414、6416、6418、6420、6422、6424、6426、6428、6430、6432、6434、6436、6438、6440、6442、6444、6446、6448、6450、6452、6454、6456、6458及6460。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:6262、6264、6266、6268、6270、6272、6274、6276、6278、6280、6282、6284、6286、6288、6290、6292、6294、6296、6298、6300、6302、6304、6306、6308、6310、6312、6314、6316、6318、6320、6322、6324、6326、6328、6330、6332、6334、6336、6338、6340、6342、6344、6346、6348、6350、6352、6354、6356、6358、6360、6362、6364、6366、6368、6370、6372、6374、6376、6378、6380、6382、6384、6386、6388、6390、6392、6394、6396、6398、6400、6402、6404、6406、6408、6410、6412、6414、6416、6418、6420、6422、6424、6426、6428、6430、6432、6434、6436、6438、6440、6442、6444、6446、6448、6450、6452、6454、6456、6458及6460。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:6262、6264、6266、6268、6270、6272、6274、6276、6278、6280、6282、6284、6286、6288、6290、6292、6294、6296、6298、6300、6302、6304、6306、6308、6310、6312、6314、6316、6318、6320、6322、6324、6326、6328、6330、6332、6334、6336、6338、6340、6342、6344、6346、6348、6350、6352、6354、6356、6358、6360、6362、6364、6366、6368、6370、6372、6374、6376、6378、6380、6382、6384、6386、6388、6390、6392、6394、6396、6398、6400、6402、6404、6406、6408、6410、6412、6414、6416、6418、6420、6422、6424、6426、6428、6430、6432、6434、6436、6438、6440、6442、6444、6446、6448、6450、6452、6454、6456、6458及6460。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:37/71/125/174/247/248/427、37/71/247/331/365/389/401/429、37/139/329/365/427/433/449、37/139/427/432/433/449、37/139/429/432/433、37/174/401/402/433/449、37/248/331/389/427/433、37/248/389/401/429、37/331/432/433、71/139/389/427/429/432/433/449、71/174/329/427/429/432/433、71/174/365/427/432、71/248/365/389/401、71/248/449、71/254/433/449、71/427/432/433/449、71/432/433、139/156/174/389/401/427/433/449、139/156/247/365/401/433/449、139/156/247/389/401/427/433/449、139/156/248/389、139/156/248/389/401/416/427/429/433、139/156/365、139/174/248/331/389/401/449、139/174/254、139/174/365/401/402/427/433/449、139/247/248/331/401/417/432/449、139/248/254/449、139/248/402/416/427/433/449、139/248/432/433、139/254/401/416/427/433/449、139/401/449、156/248/256、156/254/331/365/427/432/449、156/389/401/402/416/432/433、174/247/248/389/401/432/433、174/329/432/449、174/365、174/389/429/432/433/449、247/248/401、247/248/449、247/331/401/427/432/449、247/401、247/427/432、248/331/427/429/433、248/365/389/427/429/432/449、248/401/429/432/433、248/416、248/416/449、248/449、254/365、254/427/433、331/365/429/432/433/449、365/401/402/429/432/433、389/401/416/432/449、389/401/427/432、401/427、416/427/433/449、416/432/433、416/432/433/449、427/432、427/432/449、432及433/449,其中該位置係根據序列辨識編號:6288予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:37R/71L/125M/174P/247C/248W/427R、37R/71L/247C/331K/365I/389E/401F/429W、37R/139K/329P/365I/427R/433L/449R、37R/139K/427R/432L/433L/449R、37R/139K/429W/432L/433L、37R/174P/401F/402L/433L/449R、37R/248W/331K/389E/427R/433L、37R/248W/389A/401F/429W、37R/331K/432L/433L、71L/139K/389A/427R/429W/432L/433L/449R、71L/174P/329P/427R/429W/432L/433L、71L/174P/365I/427R/432L、71L/248W/365I/389A/401F、71L/248W/449R、71L/254Q/433L/449R、71L/427R/432L/433L/449R、71L/432L/433L、139K/156C/174P/389E/401F/427R/433L/449R、139K/156C/247C/365I/401F/433L/449R、139K/156C/247L/389E/401F/427R/433L/449R、139K/156C/248W/389A/401F/416S/427R/429W/433L、139K/156C/248W/389E、139K/156C/365I、139K/174P/248W/331K/389A/401F/449R、139K/174P/254Q、139K/174P/365I/401F/402L/427R/433L/449R、139K/247C/248W/331K/401F/417Q/432L/449R、139K/248W/254A/449R、139K/248W/402L/416L/427R/433L/449R、139K/248W/432L/433L、139K/254Q/401F/416S/427R/433L/449R、139K/401F/449R、156C/248W/256M、156C/254Q/331K/365I/427R/432L/449R、156C/389E/401F/402L/416L/432L/433L、174P/247C/248W/389A/401F/432L/433L、174P/329P/432L/449R、174P/365I、174P/389E/429W/432L/433L/449R、247C/248W/401F、247C/331K/401F/427R/432L/449R、247C/427R/432L、247L/248W/449R、247L/401F、248W/331K/427R/429W/433L、248W/365I/389E/427R/429W/432L/449R、248W/401F/429W/432L/433L、248W/416L、248W/416L/449R、248W/449R、254Q/365I、254Q/427R/433L、331K/365I/429W/432L/433L/449R、365I/401F/402L/429W/432L/433L、389A/401F/416S/432L/449R、389E/401F/427R/432L、401F/427R、416L/427R/433L/449R、416L/432L/433L/449R、416S/432L/433L、427R/432L、427R/432L/449R、432L及433L/449R,其中該位置係根據序列辨識編號:6288予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:S37R/Q71L/L125M/L174P/K247C/H248W/A427R、S37R/Q71L/K247C/R331K/V365I/D389E/L401F/L429W、S37R/P139K/G329P/V365I/A427R/A433L/S449R、S37R/P139K/A427R/K432L/A433L/S449R、S37R/P139K/L429W/K432L/A433L、S37R/L174P/L401F/E402L/A433L/S449R、S37R/H248W/R331K/D389E/A427R/A433L、S37R/H248W/D389A/L401F/L429W、S37R/R331K/K432L/A433L、Q71L/P139K/D389A/A427R/L429W/K432L/A433L/S449R、Q71L/L174P/G329P/A427R/L429W/K432L/A433L、Q71L/L174P/V365I/A427R/K432L、Q71L/H248W/V365I/D389A/L401F、Q71L/H248W/S449R、Q71L/S254Q/A433L/S449R、Q71L/A427R/K432L/A433L/S449R、Q71L/K432L/A433L、P139K/S156C/L174P/D389E/L401F/A427R/A433L/S449R、P139K/S156C/K247C/V365I/L401F/A433L/S449R、P139K/S156C/K247L/D389E/L401F/A427R/A433L/S449R、P139K/S156C/H248W/D389A/L401F/D416S/A427R/L429W/A433L、P139K/S156C/H248W/D389E、P139K/S156C/V365I、P139K/L174P/H248W/R331K/D389A/L401F/S449R、P139K/L174P/S254Q、P139K/L174P/V365I/L401F/E402L/A427R/A433L/S449R、P139K/K247C/H248W/R331K/L401F/P417Q/K432L/S449R、P139K/H248W/S254A/S449R、P139K/H248W/E402L/D416L/A427R/A433L/S449R、P139K/H248W/K432L/A433L、P139K/S254Q/L401F/D416S/A427R/A433L/S449R、P139K/L401F/S449R、S156C/H248W/L256M、S156C/S254Q/R331K/V365I/A427R/K432L/S449R、S156C/D389E/L401F/E402L/D416L/K432L/A433L、L174P/K247C/H248W/D389A/L401F/K432L/A433L、L174P/G329P/K432L/S449R、L174P/V365I、L174P/D389E/L429W/K432L/A433L/S449R、K247C/H248W/L401F、K247C/R331K/L401F/A427R/K432L/S449R、K247C/A427R/K432L、K247L/H248W/S449R、K247L/L401F、H248W/R331K/A427R/L429W/A433L、H248W/V365I/D389E/A427R/L429W/K432L/S449R、H248W/L401F/L429W/K432L/A433L、H248W/D416L、H248W/D416L/S449R、H248W/S449R、S254Q/V365I、S254Q/A427R/A433L、R331K/V365I/L429W/K432L/A433L/S449R、V365I/L401F/E402L/L429W/K432L/A433L、D389A/L401F/D416S/K432L/S449R、D389E/L401F/A427R/K432L、L401F/A427R、D416L/A427R/A433L/S449R、D416L/K432L/A433L/S449R、D416S/K432L/A433L、A427R/K432L、A427R/K432L/S449R、K432L及A433L/S449R,其中該位置係根據序列辨識編號:6288予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:5/449、6、10、25、25/449、69、69/449、87、87/449、91、91/449、144/449、153、153/449、159、159/449、172、172/449、212/449、233、233/449、288/449、303、317、347/449、361、369及421,其中該位置係根據序列辨識編號:6288予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:5S/449R、6P、10K、25I/449R、25M/449R、25Q/449R、25S、69A、69M/449R、87A/449R、87E、87K、87Q、87R、91L、91N/449R、91Q、91T/449R、91V、144Q/449R、153T/449R、153V、159K、159R/449R、172S、172T/449R、212L/449R、233A、233C、233G、233L/449R、233M/449R、233Q/449R、233R、233S、233V、288P/449R、303C、303V、317Y、347P/449R、361C、369K及421I,其中該位置係根據序列辨識編號:6288予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:T5S/S449R、E6P、R10K、L25I/S449R、L25M/S449R、L25Q/S449R、L25S、D69A、D69M/S449R、M87A/S449R、M87E、M87K、M87Q、M87R、I91L、I91N/S449R、I91Q、I91T/S449R、I91V、M144Q/S449R、A153T/S449R、A153V、Q159K、Q159R/S449R、H172S、H172T/S449R、A212L/S449R、W233A、W233C、W233G、W233L/S449R、W233M/S449R、W233Q/S449R、W233R、W233S、W233V、E288P/S449R、Q303C、Q303V、S317Y、K347P/S449R、T361C、V369K及V421I,其中該位置係根據序列辨識編號:6288予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:6462、6464、6466、6468、6470、6472、6474、6476、6478、6480、6482、6484、6486、6488、6490、6492、6494、6496、6498、6500、6502、6504、6506、6508、6510、6512、6514、6516、6518、6520、6522、6524、6526、6528、6530、6532、6534、6536、6538、6540、6542、6544、6546、6548、6550、6552、6554、6556、6558、6560、6562、6564、6566、6568、6570、6572、6574、6576、6578、6580、6582、6584、6586、6588、6590、6592、6594、6596、6598、6600、6602、6604、6606、6608、6610、6612、6614、6616、6618、6620、6622、6624、6626、6628、6630、6632、6634、6636、6638、6640、6642、6644、6646、6648、6650、6652、6654、6656、6658、6660、6662、6664、6666、6668、6670、6672、6674及6676。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:6462、6464、6466、6468、6470、6472、6474、6476、6478、6480、6482、6484、6486、6488、6490、6492、6494、6496、6498、6500、6502、6504、6506、6508、6510、6512、6514、6516、6518、6520、6522、6524、6526、6528、6530、6532、6534、6536、6538、6540、6542、6544、6546、6548、6550、6552、6554、6556、6558、6560、6562、6564、6566、6568、6570、6572、6574、6576、6578、6580、6582、6584、6586、6588、6590、6592、6594、6596、6598、6600、6602、6604、6606、6608、6610、6612、6614、6616、6618、6620、6622、6624、6626、6628、6630、6632、6634、6636、6638、6640、6642、6644、6646、6648、6650、6652、6654、6656、6658、6660、6662、6664、6666、6668、6670、6672、6674及6676。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:6462、6464、6466、6468、6470、6472、6474、6476、6478、6480、6482、6484、6486、6488、6490、6492、6494、6496、6498、6500、6502、6504、6506、6508、6510、6512、6514、6516、6518、6520、6522、6524、6526、6528、6530、6532、6534、6536、6538、6540、6542、6544、6546、6548、6550、6552、6554、6556、6558、6560、6562、6564、6566、6568、6570、6572、6574、6576、6578、6580、6582、6584、6586、6588、6590、6592、6594、6596、6598、6600、6602、6604、6606、6608、6610、6612、6614、6616、6618、6620、6622、6624、6626、6628、6630、6632、6634、6636、6638、6640、6642、6644、6646、6648、6650、6652、6654、6656、6658、6660、6662、6664、6666、6668、6670、6672、6674及6676。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:37/41/45/72/81/83/84/88/155/163/168/190/331/375、37/41/45/72/81/83/84/88/155/263/273/331/375/432、37/41/45/72/81/83/84/88/155/331/366/375、37/41/45/72/81/83/84/88/155/331/375、37/41/45/72/81/83/84/88/248/375、37/41/45/72/81/83/84/88/331/366/432/433、37/41/45/72/88/155/168/190/331/366/375/432、37/41/45/72/88/155/168/190/331/375、37/41/45/72/88/190/263/273/331/366、37/41/45/72/155/163/168/190/243/263/273/331/366/432、37/41/45/72/155/163/168/243/248/273/331/366/432/433、37/41/45/72/155/163/168/263/366/432/433、37/41/45/72/155/163/331/366/375、37/41/45/72/155/190/243/248/273/331/432/433、37/41/45/72/155/190/248/263/331、37/41/45/72/155/190/263/331/366、37/41/45/72/155/190/273/331/366/375、37/41/45/72/155/190/273/366、37/41/45/72/155/190/273/366/375/432、37/41/45/72/155/248/263/273/366、37/41/45/72/155/263/331/375、37/41/45/72/155/263/375、37/41/45/72/155/273/366、37/41/45/72/155/331/366/375/432/433、37/41/45/72/190/263/273/331、37/41/45/72/190/331/366、37/41/45/72/190/366、37/41/45/72/263/331/366、37/41/45/72/263/366/432/433、37/41/45/72/331/366、37/41/45/81/83/84/88/155/168/190/243/331/366、37/41/45/81/83/84/88/155/168/331/375、37/41/45/81/83/84/88/155/263/273/331/366、37/41/45/81/83/84/88/163/168/263/273/331/366/375、37/41/45/155/163/168/263/331/375、37/41/45/155/168/248/273/331/375、37/41/45/155/190/331/366/375、37/41/45/155/366、37/41/45/155/366/432/433、37/41/45/155/375、37/41/45/243/248/273/331、37/41/45/263/331/375/432、37/41/45/331/366/432/433、37/72/81/83/88/155/190、37/72/197/273/331/375/432、37/83/263/365/366/375、37/190/202、41/45/72/155/263/331/366/375/432/433、41/45/163/168/243/248/273/366/432、45/72/84/88/197/375、45/72/88/366、45/72/163/202/365/366/375、45/72/168/243/331/365/366/429/432、45/84/168/190/199/254/273/365/366、45/163/168/190/199/366/429/432、45/163/168/197/263/331/365/366、72/81/83/84/88/155/163/168/190/366、72/81/83/84/88/155/190、72/81/83/84/88/155/190/273/331/366/432、72/81/83/84/88/155/273/331/375、72/81/83/84/88/155/366、72/81/83/84/88/163/168/190/243/263/331/366、72/81/83/84/88/163/168/263/331/375、72/81/84/190/248、72/83/84/88/202/254/273/366/375、72/83/84/197/202/243/263/365/366、72/83/88/243/263/331/365/366、72/155/163/168/190/366/432/433、72/155/190、72/155/190/263/331/366、72/155/190/366、72/155/273/331/375/432、72/243/248/263/366/432/433、72/243/248/273/366/432/433、72/243/248/366/432/433、72/248、81/83/84/88/155/163/168/273/331/375、81/83/84/88/155/190/263/331/366、81/83/84/88/155/263/366/375、81/83/84/88/155/366、81/83/84/88/190/263/375、81/83/84/88/263/273/331/366/432、81/83/169/190/263、81/83/190/263/365/366、81/83/202/365/366/402、81/88/375/402、83/88/155/273/366/375、84/155/168/197/199/331/366/375/383/402、84/168/197/202/263/366、84/197/366/402、155/168/190/197/199/366、155/168/375、155/263/366/432/433、190/199/202/331/366、197/199/202、197/202/248、197/248、199/263/331/365/366、248/375、365/366及365/375/402,其中該位置係根據序列辨識編號:6468予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:37R/41A/45L/72T/81T/83S/84N/88T/155L/163A/168T/190R/331K/375P、37R/41A/45L/72T/81T/83S/84N/88T/155L/263T/273R/331K/375P/432L、37R/41A/45L/72T/81T/83S/84N/88T/155L/331K/366C/375P、37R/41A/45L/72T/81T/83S/84N/88T/155L/331K/375P、37R/41A/45L/72T/81T/83S/84N/88T/248W/375P、37R/41A/45L/72T/81T/83S/84N/88T/331K/366V/432L/433A、37R/41A/45L/72T/88T/155L/168T/190R/331K/366C/375P/432L、37R/41A/45L/72T/88T/155L/168T/190R/331K/375P、37R/41A/45L/72T/88T/190R/263T/273R/331K/366C、37R/41A/45L/72T/155L/163A/168T/190R/243I/263T/273R/331K/366C/432L、37R/41A/45L/72T/155L/163A/168T/243I/248W/273R/331K/366V/432L/433A、37R/41A/45L/72T/155L/163A/168T/263T/366C/432L/433A、37R/41A/45L/72T/155L/163A/331K/366C/375P、37R/41A/45L/72T/155L/190R/243I/248W/273R/331K/432L/433A、37R/41A/45L/72T/155L/190R/248W/263T/331K、37R/41A/45L/72T/155L/190R/263T/331K/366C、37R/41A/45L/72T/155L/190R/273R/331K/366V/375P、37R/41A/45L/72T/155L/190R/273R/366C、37R/41A/45L/72T/155L/190R/273R/366C/375P/432L、37R/41A/45L/72T/155L/248W/263T/273R/366C、37R/41A/45L/72T/155L/263T/331K/375P、37R/41A/45L/72T/155L/263T/375P、37R/41A/45L/72T/155L/273R/366C、37R/41A/45L/72T/155L/331K/366V/375P/432L/433A、37R/41A/45L/72T/190R/263T/273R/331K、37R/41A/45L/72T/190R/331K/366C、37R/41A/45L/72T/190R/366C、37R/41A/45L/72T/263T/331K/366C、37R/41A/45L/72T/263T/366C/432L/433A、37R/41A/45L/72T/331K/366C、37R/41A/45L/81T/83S/84N/88T/155L/168T/190R/243I/331K/366C、37R/41A/45L/81T/83S/84N/88T/155L/168T/331K/375P、37R/41A/45L/81T/83S/84N/88T/155L/263T/273R/331K/366C、37R/41A/45L/81T/83S/84N/88T/163A/168T/263T/273R/331K/366C/375P、37R/41A/45L/155L/163A/168T/263T/331K/375P、37R/41A/45L/155L/168T/248W/273R/331K/375P、37R/41A/45L/155L/190R/331K/366V/375P、37R/41A/45L/155L/366C、37R/41A/45L/155L/366C/432L/433A、37R/41A/45L/155L/375P、37R/41A/45L/243I/248W/273R/331K、37R/41A/45L/263T/331K/375P/432L、37R/41A/45L/331K/366V/432L/433A、37R/72T/81T/83S/88T/155L/190R、37R/72T/197K/273R/331K/375P/432L、37R/83S/263T/365I/366V/375P、37R/190R/202H、41A/45L/72T/155L/263T/331K/366V/375P/432L/433A、41A/45L/163A/168T/243I/248W/273R/366C/432L、45L/72T/84N/88T/197K/375P、45L/72T/88T/366C、45L/72T/163A/202H/365I/366V/375P、45L/72T/168T/243I/331K/365I/366C/429W/432L、45L/84N/168T/190R/199Q/254A/273R/365I/366C、45L/163A/168T/190R/199Q/366C/429W/432L、45L/163A/168T/197K/263T/331K/365I/366C、72T/81T/83S/84N/88T/155L/163A/168T/190R/366C、72T/81T/83S/84N/88T/155L/190R、72T/81T/83S/84N/88T/155L/190R/273R/331K/366V/432L、72T/81T/83S/84N/88T/155L/273R/331K/375P、72T/81T/83S/84N/88T/155L/366C、72T/81T/83S/84N/88T/163A/168T/190R/243I/263T/331K/366C、72T/81T/83S/84N/88T/163A/168T/263T/331K/375P、72T/81T/84N/190R/248W、72T/83S/84N/88T/202H/254A/273R/366C/375P、72T/83S/84N/197K/202H/243I/263T/365I/366C、72T/83S/88T/243I/263T/331K/365I/366C、72T/155L/163A/168T/190R/366V/432L/433A、72T/155L/190R、72T/155L/190R/263T/331K/366C、72T/155L/190R/366C、72T/155L/273R/331K/375P/432L、72T/243I/248W/263T/366V/432L/433A、72T/243I/248W/273R/366V/432L/433A、72T/243I/248W/366V/432L/433A、72T/248W、81T/83S/84N/88T/155L/163A/168T/273R/331K/375P、81T/83S/84N/88T/155L/190R/263T/331K/366C、81T/83S/84N/88T/155L/263T/366V/375P、81T/83S/84N/88T/155L/366C、81T/83S/84N/88T/190R/263T/375P、81T/83S/84N/88T/263T/273R/331K/366C/432L、81T/83S/169D/190R/263T、81T/83S/190R/263T/365I/366C、81T/83S/202H/365I/366C/402L、81T/88T/375P/402L、83S/88T/155L/273R/366V/375P、84N/155L/168T/197K/199Q/331K/366V/375P/383V/402L、84N/168T/197K/202H/263T/366C、84N/197K/366C/402L、155L/168T/190R/197K/199Q/366C、155L/168T/375P、155L/263T/366C/432L/433A、190R/199Q/202H/331K/366C、197K/199Q/202H、197K/202H/248W、197K/248W、199Q/263T/331K/365I/366C、248W/375P、365I/366C及365I/375P/402L,其中該位置係根據序列辨識編號:6468予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/K190R/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/S273R/R331K/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/R331K/A366C/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/
H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/H248W/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/
R88T/R331K/A366V/K432L/L433A、S37R/S41A/
F45L/D72T/R88T/V155L/P168T/K190R/R331K/A366C/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/R88T/
V155L/P168T/K190R/R331K/D375P、S37R/S41A/
F45L/D72T/R88T/K190R/V263T/S273R/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/
K190R/L243I/V263T/S273R/R331K/A366C/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/L243I/H248W/S273R/R331K/A366V/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/V263T/A366C/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/
V155L/L163A/R331K/A366C/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/L243I/H248W/S273R/R331K/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/
D72T/V155L/K190R/H248W/V263T/R331K、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/
S273R/R331K/A366V/D375P、S37R/S41A/F45L/
D72T/V155L/K190R/S273R/A366C、S37R/S41A/
F45L/D72T/V155L/K190R/S273R/A366C/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/H248W/V263T/
S273R/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/V263T/
R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/
V263T/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/S273R/
A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/R331K/
A366V/D375P/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/
D72T/K190R/V263T/S273R/R331K、S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V263T/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V263T/A366C/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/P168T/K190R/L243I/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/P168T/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/H81T/
P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/S273R/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/V263T/S273R/R331K/A366C/D375P、S37R/S41A/F45L/V155L/L163A/P168T/V263T/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/V155L/P168T/H248W/
S273R/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/V155L/
K190R/R331K/A366V/D375P、S37R/S41A/F45L/
V155L/A366C、S37R/S41A/F45L/V155L/A366C/
K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/V155L/D375P、S37R/S41A/F45L/L243I/H248W/S273R/R331K、S37R/S41A/F45L/V263T/R331K/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/R331K/A366V/K432L/L433A、S37R/D72T/H81T/P83S/R88T/V155L/K190R、S37R/D72T/Q197K/S273R/R331K/D375P/K432L、S37R/P83S/V263T/V365I/A366V/D375P、S37R/K190R/I202H、S41A/F45L/D72T/V155L/
V263T/R331K/A366V/D375P/K432L/L433A、S41A/F45L/L163A/P168T/L243I/H248W/S273R/A366C/K432L、F45L/D72T/G84N/R88T/Q197K/D375P、F45L/D72T/R88T/A366C、F45L/D72T/L163A/I202H/
V365I/A366V/D375P、F45L/D72T/P168T/L243I/
R331K/V365I/A366C/L429W/K432L、F45L/G84N/
P168T/K190R/A199Q/S254A/S273R/V365I/A366C、F45L/L163A/P168T/K190R/A199Q/A366C/L429W/K432L、F45L/L163A/P168T/Q197K/V263T/R331K/V365I/A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/K190R/A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/
V155L/K190R、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/
V155L/K190R/S273R/R331K/A366V/K432L、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/S273R/R331K/D375P、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/
A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/
P168T/K190R/L243I/V263T/R331K/A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/V263T/R331K/D375P、D72T/H81T/G84N/K190R/H248W、D72T/P83S/G84N/R88T/I202H/S254A/S273R/A366C/D375P、D72T/P83S/G84N/Q197K/I202H/L243I/
V263T/V365I/A366C、D72T/P83S/R88T/L243I/V263T/
R331K/V365I/A366C、D72T/V155L/L163A/P168T/
K190R/A366V/K432L/L433A、D72T/V155L/K190R、D72T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C、D72T/V155L/K190R/A366C、D72T/V155L/S273R/
R331K/D375P/K432L、D72T/L243I/H248W/V263T/
A366V/K432L/L433A、D72T/L243I/H248W/S273R/
A366V/K432L/L433A、D72T/L243I/H248W/A366V/
K432L/L433A、D72T/H248W、H81T/P83S/G84N/
R88T/V155L/L163A/P168T/S273R/R331K/D375P、H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C、H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/
A366V/D375P、H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/A366C、H81T/P83S/G84N/R88T/K190R/V263T/D375P、H81T/P83S/G84N/R88T/V263T/S273R/R331K/A366C/K432L、H81T/P83S/E169D/K190R/V263T、H81T/P83S/K190R/V263T/V365I/A366C、H81T/P83S/I202H/V365I/A366C/E402L、H81T/R88T/D375P/E402L、P83S/R88T/V155L/
S273R/A366V/D375P、G84N/V155L/P168T/Q197K/
A199Q/R331K/A366V/D375P/N383V/E402L、G84N/P168T/Q197K/I202H/V263T/A366C、G84N/Q197K/A366C/E402L、V155L/P168T/K190R/Q197K/A199Q/A366C、V155L/P168T/D375P、V155L/V263T/A366C/K432L/
L433A、K190R/A199Q/I202H/R331K/A366C、Q197K/
A199Q/I202H、Q197K/I202H/H248W、Q197K/H248W、A199Q/V263T/R331K/V365I/A366C、H248W/D375P、V365I/A366C及V365I/D375P/E402L,其中該位置係根據序列辨識編號:6468予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2、3、4、9、53/437、61、64、72/170、72/405、94、96、98、113、118、118/120、120、129、134/158、158、165、170、171、173、183、193、214、214/222、222、226、229、234、253、265、269、272、289、296、300、302、304、322、322/407、330、390、395/439、396、398、399、403、405、408、411、412、423、428、434、435、438、439、442、444、448、449、452及454,其中該位置係根據序列辨識編號:6468予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2F、2H、2K、2M、2Q、2R、2V、3F、3L、3M、4N、4S、9A、9G、9K、9M、9S、53E/437T、61Q、64L、64M、72E/170A、72E/405S、94R、96C、96K、98E、98S、98T、113D、113G、113P、118C、118T/120V、118V、120V、129P、134E/158N、158T、165L、170A、170G、170H、170P、170V、171A、171L、171P、171Q、173I、173K、173L、173S、183I、183L、183P、193F、214K、214R、214R/222H、222A、222N、222Q、222R、226S、229M、229Q、234N、234S、234T、253D、253E、253N、253P、253T、253V、265H、269L、269M、269N、269R、272S、289D、289G、289N、289R、296Q、300A、300E、302G、304K、304P、322A、322G、322K、322P、322P/407I、322S、322T、322V/407I、330S、390I、390R、395I/439V、396T、396V、398S、399P、399Q、399S、403V、405A、405D、405P、405S、405T、408D、408K、408S、411H、411K、411T、412K、423T、428E、428G、428I、428L、428N、428Q、428R、428S、428T、428V、428Y、434E、434G、435A、435D、435E、435G、435I、435K、435L、435N、435S、435V、435Y、438E、438R、438S、439A、439E、439G、439H、439M、439R、439W、442F、442T、444A、448K、448Q、449G、449L、449S、452T及454V,其中該位置係根據序列辨識編號:6468予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:P2F、P2H、P2K、P2M、P2Q、P2R、P2V、N3F、N3L、N3M、T4N、T4S、V9A、V9G、V9K、V9M、V9S、K53E/I437T、S61Q、F64L、F64M、D72E/D170A、D72E/E405S、K94R、G96C、G96K、D98E、D98S、D98T、S113D、S113G、S113P、A118C、A118T/L120V、A118V、L120V、A129P、D134E/P158N、P158T、Y165L、D170A、D170G、D170H、D170P、D170V、K171A、K171L、K171P、K171Q、R173I、R173K、R173L、R173S、M183I、M183L、M183P、Y193F、S214K、S214R、S214R/K222H、K222A、K222N、K222Q、K222R、E226S、L229M、L229Q、R234N、R234S、R234T、S253D、S253E、S253N、S253P、S253T、S253V、Q265H、Q269L、Q269M、Q269N、Q269R、P272S、K289D、K289G、K289N、K289R、R296Q、D300A、D300E、K302G、S304K、S304P、L322A、L322G、L322K、L322P、L322P/V407I、L322S、L322T、L322V/V407I、E330S、V390I、V390R、V395I/P439V、Y396T、Y396V、E398S、N399P、N399Q、N399S、R403V、E405A、E405D、E405P、E405S、E405T、N408D、N408K、N408S、R411H、R411K、R411T、R412K、R423T、K428E、K428G、K428I、K428L、K428N、K428Q、K428R、K428S、K428T、K428V、K428Y、D434E、D434G、R435A、R435D、R435E、R435G、R435I、R435K、R435L、R435N、R435S、R435V、R435Y、A438E、A438R、A438S、P439A、P439E、P439G、P439H、P439M、P439R、P439W、S442F、S442T、Y444A、E448K、E448Q、R449G、R449L、R449S、S452T及I454V,其中該位置係根據序列辨識編號:6468予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198、7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212及7214。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198、7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212及7214。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198、7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212及7214。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:5/6/25/317、5/6/69/288/303、5/6/91/288/317、5/25/91/212/303/317、5/25/91/263、5/25/288、5/69/91/212/288、5/69/91/212/303、5/91/288/303、5/91/303、5/91/317/421、5/288、6/91/212/288/303/369/421、6/212/288/303、6/288、25/91/212/288、25/91/263/288/303、25/91/303/317/369、25/91/317/369、25/263/317、87/144、87/144/159/361、87/144/159/361/433、87/433、88/144、88/144/159、91/263/317/369、91/288/303/317/369、91/288/317/369/421、91/303、91/317、91/317/369、109/144/153/155/159/433、144、212/288、263/288/303/317及288,其中該位置係根據序列辨識編號:6864予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:5S/6P/25I/317Y、5S/6P/69A/288P/303V、5S/6P/91Q/288P/317Y、5S/25Q/91Q/212L/303V/317Y、5S/25Q/91Q/263T、5S/25Q/288P、5S/69A/91Q/212L/288P、5S/69A/91Q/212L/303V、5S/91Q/288P/303V、5S/91Q/303V、5S/91Q/317Y/421I、5S/288P、6P/91Q/212L/288P/303V/369K/421I、6P/212L/288P/303V、6P/288P、25Q/91Q/212L/288P、25Q/91Q/263T/288P/303V、25Q/91Q/317Y/369K、25Q/91T/303V/317Y/369K、25Q/263T/317Y、87K/144Q、87K/144Q/159K/361C、87K/144Q/159K/361C/433A、87K/433A、88T/144Q、88T/144Q/159K、91Q/263T/317Y/369K、91Q/288P/303V/317Y/369K、91Q/288P/317Y/369K/421I、91Q/303V、91Q/317Y、91Q/317Y/369K、109W/144Q/153V/155L/159K/433A、144Q、212L/288P、263T/288P/303V/317Y及288P,其中該位置係根據序列辨識編號:6864予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:T5S/E6P/L25I/S317Y、T5S/E6P/D69A/E288P/Q303V、T5S/E6P/I91Q/E288P/S317Y、T5S/L25Q/I91Q/A212L/Q303V/S317Y、T5S/L25Q/I91Q/V263T、T5S/L25Q/E288P、T5S/D69A/I91Q/A212L/E288P、T5S/D69A/I91Q/A212L/Q303V、T5S/I91Q/E288P/Q303V、T5S/I91Q/Q303V、T5S/I91Q/S317Y/V421I、T5S/E288P、E6P/I91Q/A212L/E288P/Q303V/V369K/V421I、E6P/A212L/E288P/Q303V、E6P/E288P、L25Q/I91Q/A212L/E288P、L25Q/I91Q/V263T/E288P/Q303V、L25Q/I91Q/S317Y/V369K、L25Q/I91T/Q303V/S317Y/V369K、L25Q/V263T/S317Y、M87K/M144Q、M87K/M144Q/Q159K/T361C、M87K/M144Q/Q159K/T361C/L433A、M87K/L433A、R88T/M144Q、R88T/M144Q/Q159K、I91Q/V263T/S317Y/V369K、I91Q/E288P/Q303V/S317Y/V369K、I91Q/E288P/S317Y/V369K/V421I、I91Q/Q303V、I91Q/S317Y、I91Q/S317Y/V369K、R109W/M144Q/A153V/V155L/Q159K/L433A、M144Q、A212L/E288P、V263T/E288P/Q303V/S317Y及E288P,其中該位置係根據序列辨識編號:6864予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:7362、7364、7366、7368、7370、7372、7374、7376、7378、7380、7382、7384、7386、7388、7390、7392、7394、7396、7398、7400、7402、7404、7406、7408、7410、7412、7414、7416、7418、7420、7422、7424、7426、7428、7430、7432、7434及7436,其中該位置係根據序列辨識編號:6864予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:7362、7364、7366、7368、7370、7372、7374、7376、7378、7380、7382、7384、7386、7388、7390、7392、7394、7396、7398、7400、7402、7404、7406、7408、7410、7412、7414、7416、7418、7420、7422、7424、7426、7428、7430、7432、7434及7436。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:7362、7364、7366、7368、7370、7372、7374、7376、7378、7380、7382、7384、7386、7388、7390、7392、7394、7396、7398、7400、7402、7404、7406、7408、7410、7412、7414、7416、7418、7420、7422、7424、7426、7428、7430、7432、7434及7436。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/3/433/435/442、2/81、9/37/113/396、9/87、9/144/331、37/113/144/396、37/233、53/144/233/269/331/428、53/233/269/390/395/396、53/234、61/120/156/163/165/197/303/308、61/120/159/300/308/407、61/120/300/303/407、61/156/159/163/165/243/248/253/300/303/308、61/156/163/243/248/300/303/308/407、61/156/163/300/365/411、61/156/197/253、61/163/300/303/308/405/407/411、61/165/248/253/407/411、61/214、61/214/300/308、61/243/300/308/407/411、61/300/303/308、61/300/303/405、61/365/405、69、69/81、69/134、69/263、69/263/434/438/439、69/439、81、81/134、81/222、81/222/263/322/435/442、81/433/435/438/442、85/156/159/243/248/253/308/405/407/411、87/144、87/144/396、113/233/234、120/156/159/169/197/214/303/308/365/405/407、120/156/159/248/300/308、120/156/248/303/308/411、120/159、120/159/165/197、120/159/197/308/407/411、120/159/197/365/411、120/197/253/300/308、120/253/300/303/308/407、120/308/407/411、134/222/263、144/234/269、156/165/248/300/303/308、156/197/248/300/411、156/214/308/411、156/248/253/308、159/163/165/197/214/243/300/303/308/407、163/197/253/300/303/308/365、171/263、183/233/234/331/428、197/253/308/407、197/300/303/308/365、197/300/308/411、222、222/263/435/442、233/396/399、263、269、269/428/437、300/303/308、300/308/405/411、308及322,其中該位置係根據序列辨識編號:7388予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2K/3M/433A/435E/442F、2K/81T、9G/37S/113D/396T、9G/87K、9G/144Q/331R、37S/113D/144Q/396T、37S/233S、53E/144Q/233Q/269R/331R/428I、53E/233Q/269R/390I/395I/396T、53E/234N、61Q/120V/156S/163A/165L/197K/303V/308L、61Q/120V/159K/300A/308L/407I、61Q/120V/300A/303V/407I、61Q/156S/159K/163A/165L/243I/248W/253T/300A/303V/308L、61Q/156S/163A/243I/248W/300A/303V/308L/407I、61Q/156S/163A/300A/365I/411T、61Q/156S/197K/253E、61Q/163A/300A/303V/308L/405P/407I/411T、61Q/165L/248W/253T/407I/411T、61Q/214R、61Q/214R/300A/308L、61Q/243I/300A/308L/407I/411T、61Q/300A/303V/308L、61Q/300A/303V/405P、61Q/365I/405P、69A、69A/81T、69A/134E、69A/263T、69A/263T/434E/438S/439H、69A/439H、81T、81T/134E、81T/222A、81T/222A/263T/322S/435E/442F、81T/433A/435I/438R/442F、85V/156S/159K/243I/248W/253T/308L/405P/407I/411T、87K/144Q、87K/144Q/396T、113D/233Q/234N、120V/156S/159K/169D/197K/214R/303V/308L/365I/405P/407I、120V/156S/159K/248W/300A/308L、120V/156S/248W/303V/308L/411T、120V/159K、120V/159K/165L/197K、120V/159K/197K/308L/407I/411T、120V/159K/197K/365I/411T、120V/197K/253T/300A/308L、120V/253T/300A/303V/308L/407I、120V/308L/407I/411T、134E/222A/263T、144Q/234N/269R、156S/165L/248W/300A/303V/308L、156S/197K/248W/300A/411T、156S/214R/308L/411T、156S/248W/253T/308L、159K/163A/165L/197K/214R/243I/300A/303V/308L/407I、163A/197K/253E/300A/303V/308L/365I、171P/263T、183L/233Q/234N/331R/428I、197K/253T/308L/407I、197K/300A/303V/308L/365I、197K/300A/308L/411T、222A、222A/263T/435I/442F、233Q/396T/399Q、263T、269R、269R/428I/437L、300A/303V/308L、300A/308L/405P/411T、308L及322S,其中該位置係根據序列辨識編號:7388予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:P2K/N3M/L433A/R435E/S442F、P2K/H81T、V9G/R37S/S113D/Y396T、V9G/M87K、V9G/M144Q/K331R、R37S/S113D/M144Q/Y396T、R37S/W233S、K53E/M144Q/W233Q/Q269R/K331R/K428I、K53E/W233Q/Q269R/V390I/V395I/Y396T、K53E/R234N、S61Q/L120V/C156S/L163A/Y165L/Q197K/Q303V/R308L、S61Q/L120V/Q159K/D300A/R308L/V407I、S61Q/L120V/D300A/Q303V/V407I、S61Q/C156S/Q159K/L163A/Y165L/L243I/H248W/S253T/D300A/Q303V/R308L、S61Q/C156S/L163A/L243I/H248W/D300A/Q303V/R308L/V407I、S61Q/C156S/L163A/D300A/V365I/R411T、S61Q/C156S/Q197K/S253E、S61Q/L163A/D300A/Q303V/R308L/E405P/V407I/R411T、S61Q/Y165L/H248W/S253T/V407I/R411T、S61Q/S214R、S61Q/S214R/D300A/R308L、S61Q/L243I/D300A/R308L/V407I/R411T、S61Q/D300A/Q303V/R308L、S61Q/D300A/Q303V/E405P、S61Q/V365I/E405P、D69A、D69A/H81T、D69A/D134E、D69A/V263T、D69A/V263T/D434E/A438S/P439H、D69A/P439H、H81T、H81T/D134E、H81T/K222A、H81T/K222A/V263T/L322S/R435E/S442F、H81T/L433A/R435I/A438R/S442F、A85V/C156S/Q159K/L243I/H248W/S253T/R308L/E405P/V407I/R411T、M87K/M144Q、M87K/M144Q/Y396T、S113D/W233Q/R234N、L120V/C156S/Q159K/E169D/Q197K/S214R/Q303V/R308L/V365I/E405P/V407I、L120V/C156S/Q159K/H248W/D300A/R308L、L120V/C156S/H248W/Q303V/R308L/R411T、L120V/Q159K、L120V/Q159K/Y165L/Q197K、L120V/Q159K/Q197K/R308L/V407I/R411T、L120V/Q159K/Q197K/V365I/R411T、L120V/Q197K/S253T/D300A/R308L、L120V/S253T/D300A/Q303V/R308L/V407I、L120V/R308L/V407I/R411T、D134E/K222A/V263T、M144Q/R234N/Q269R、C156S/Y165L/H248W/D300A/Q303V/R308L、C156S/Q197K/H248W/D300A/R411T、C156S/S214R/R308L/R411T、C156S/H248W/S253T/R308L、Q159K/L163A/Y165L/Q197K/S214R/L243I/D300A/Q303V/R308L/V407I、L163A/Q197K/S253E/D300A/Q303V/R308L/V365I、K171P/V263T、M183L/W233Q/R234N/K331R/K428I、Q197K/S253T/R308L/V407I、Q197K/D300A/Q303V/R308L/V365I、Q197K/D300A/R308L/R411T、K222A、K222A/V263T/R435I/S442F、W233Q/Y396T/N399Q、V263T、Q269R、Q269R/K428I/I437L、D300A/Q303V/R308L、D300A/R308L/E405P/R411T、R308L及L322S,其中該位置係根據序列辨識編號:7388予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:41、56、61、72、76、87、88、107、139、156、338及407,其中該位置係根據序列辨識編號:7388予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:41E、56D、61D、61E、72P、76S、87E、88L、88M、107L、107V、139N、156S、338V及407T,其中該位置係根據序列辨識編號:7388予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:A41E、L56D、S61D、S61E、T72P、R76S、M87E、R88L、R88M、A107L、A107V、K139N、C156S、C338V及V407T,其中該位置係根據序列辨識編號:7388予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366及8368。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366及8368。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366及8368。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:37/72/76/81、37/72/76/107/156/331、37/72/195/331、53/81/195/197、69/72/76/107、72/76/107/156、72/76/107/195/197、72/269、81/107/195、87、87/91、87/91/94、87/91/94/120、87/91/94/233、87/91/94/233/259、87/91/94/263/389、87/91/120/233、87/91/120/233/411/431/435/437、87/91/144/259、87/91/163、87/91/163/233、87/91/163/233/263、87/91/163/389、87/91/233、87/91/233/389、87/91/259/263/389/428/431/435/437、87/91/263/389、87/91/322、87/91/389、87/94、87/94/144/263/428/435、87/94/263、87/163/233、87/233、87/233/259、87/233/322/389/411、87/233/389、87/259、87/263、87/428/431/435、87/435、91、91/94、91/94/120/233、91/94/120/233/389/431/438、91/94/233/259、91/120、91/120/233、91/233、91/233/259/389、91/233/389、94/233/411、144/389、163/233、195/197、197、233、233/259/263、233/259/389、233/438、259、263、263/389、322、389及428/431/435,其中該位置係根據序列辨識編號:8088予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:37S/72P/76S/81T、37S/72P/76S/107L/156S/331R、37S/72P/195Q/331R、53E/81T/195Q/197K、69A/72P/76S/107L、72P/76S/107L/156S、72P/76S/107L/195Q/197K、72P/269R、81T/107L/195Q、87A、87A/91L、87A/91L/94C/233Q、87A/91L/94C/233Q/259T、87A/91L/120L/233Q、87A/91L/120L/233Q/411T/431M/435E/437L、87A/91L/163A、87A/91L/233Q、87A/91L/233Q/389L、87A/91L/259T/263T/389L/428I/431M/435I/437L、87A/91L/322S、87A/94C、87A/94C/263T、87A/233Q、87A/233Q/259T、87A/233Q/322S/389L/411T、87A/233Q/389L、87A/259T、87A/263T、87A/428I/431M/435E、87A/435E、87K、87K/91L、87K/91L/94C、87K/91L/94C/120L、87K/91L/94C/233Q、87K/91L/94C/263T/389L、87K/91L/120L/233Q、87K/91L/144Q/259T、87K/91L/163A/233Q、87K/91L/163A/233Q/263T、87K/91L/163A/389L、87K/91L/233Q、87K/91L/263T/389L、87K/91L/389L、87K/94C/144Q/263T/428I/435E、87K/163A/233Q、91L、91L/94C、91L/94C/120L/233Q、91L/94C/120L/233Q/389L/431M/438S、91L/94C/233Q/259T、91L/120L、91L/120L/233Q、91L/233Q、91L/233Q/259T/389L、91L/233Q/389L、94C/233Q/411T、144Q/389L、163A/233Q、195Q/197K、197K、233Q、233Q/259T/263T、233Q/259T/389L、233Q/438S、259T、263T、263T/389L、322S、389L及428I/431M/435E,其中該位置係根據序列辨識編號:8088予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:R37S/T72P/R76S/H81T、R37S/T72P/R76S/A107L/C156S/K331R、R37S/T72P/H195Q/K331R、K53E/H81T/H195Q/Q197K、D69A/T72P/R76S/A107L、T72P/R76S/A107L/C156S、T72P/R76S/A107L/H195Q/Q197K、T72P/Q269R、H81T/A107L/H195Q、M87A、M87A/Q91L、M87A/Q91L/K94C/W233Q、M87A/Q91L/K94C/W233Q/E259T、M87A/Q91L/V120L/W233Q、M87A/Q91L/V120L/W233Q/R411T/D431M/R435E/I437L、M87A/Q91L/L163A、M87A/Q91L/W233Q、M87A/Q91L/W233Q/E389L、M87A/Q91L/E259T/V263T/E389L/K428I/D431M/R435I/I437L、M87A/Q91L/L322S、M87A/K94C、M87A/K94C/V263T、M87A/W233Q、M87A/W233Q/E259T、M87A/W233Q/L322S/E389L/R411T、M87A/W233Q/E389L、M87A/E259T、M87A/V263T、M87A/K428I/D431M/R435E、M87A/R435E、M87K、M87K/Q91L、M87K/Q91L/K94C、M87K/Q91L/K94C/V120L、M87K/Q91L/K94C/W233Q、M87K/Q91L/K94C/V263T/E389L、M87K/Q91L/V120L/W233Q、M87K/Q91L/M144Q/E259T、M87K/Q91L/L163A/W233Q、M87K/Q91L/L163A/W233Q/V263T、M87K/Q91L/L163A/E389L、M87K/Q91L/W233Q、M87K/Q91L/V263T/E389L、M87K/Q91L/E389L、M87K/K94C/M144Q/V263T/K428I/R435E、M87K/L163A/W233Q、Q91L、Q91L/K94C、Q91L/K94C/V120L/W233Q、Q91L/K94C/V120L/W233Q/E389L/D431M/A438S、Q91L/K94C/W233Q/E259T、Q91L/V120L、Q91L/V120L/W233Q、Q91L/W233Q、Q91L/W233Q/E259T/E389L、Q91L/W233Q/E389L、K94C/W233Q/R411T、M144Q/E389L、L163A/W233Q、H195Q/Q197K、Q197K、W233Q、W233Q/E259T/V263T、W233Q/E259T/E389L、W233Q/A438S、E259T、V263T、V263T/E389L、L322S、E389L及K428I/D431M/R435E,其中該位置係根據序列辨識編號:8088予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:55、111、252、255、324、328、413及451,其中該位置係根據序列辨識編號:8088予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:55G、111T、252P、255T、324D、324G、328T、413L及451Q,其中該位置係根據序列辨識編號:8088予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:S55G、S111T、S252P、S255T、P324D、P324G、L328T、V413L及V451Q,其中該位置係根據序列辨識編號:8088予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:8482、8484、8486、8488、8490、8492、8494、8496、8498、8500、8502、8504、8506、8508、8510、8512、8514、8516、8518、8520、8522、8524、8526、8528、8530、8532、8534、8536、8538、8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238及9240。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:8482、8484、8486、8488、8490、8492、8494、8496、8498、8500、8502、8504、8506、8508、8510、8512、8514、8516、8518、8520、8522、8524、8526、8528、8530、8532、8534、8536、8538、8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238及9240。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:8482、8484、8486、8488、8490、8492、8494、8496、8498、8500、8502、8504、8506、8508、8510、8512、8514、8516、8518、8520、8522、8524、8526、8528、8530、8532、8534、8536、8538、8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238及9240。
在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106,及/或108。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106,及/或108。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含序列辨識編號:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106,及/或108。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:69/173/175/243/246/354/365/383/399、69/173/243/383/399、56/191/354/383/399、70/225/246/409/413、70/115/225/409、70/225/413、70/225/247、74/310/396/424、74/396及173/175/191/365/383/399,其中該位置係根據序列辨識編號:758予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:69H/173N/175S/243A/246K/354I/365I/383V/399A、69H/173N/243A/383V/399A、56T/191D/354I/383V/399A、70L/225G/246P/409K/413V、70L/115S/225G/409K、70L/225G/413V、70L/225G/247G、74T/310D/396E/424S、74T/396E及173H/175S/191D/365I/383V/399A,其中該位置係根據序列辨識編號:758予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:R69H/Y173N/P175S/V243A/M246K/L354I/M365I/M383V/T399A、R69H/Y173N/V243A/M383V/T399A、I56T/N191D/L354I/M383V/T399A、F70L/N225G/M246P/E409K/I413V、F70L/Q115S/N225G/E409K、F70L/N225G/I413V、F70L/N225G/E247G、H74T/K310D/G396E/N424S、H74T/G396E及Y173H/P175S/N191D/M365I/M383V/T399A,其中該位置係根據序列辨識編號:758予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:770、772、774、776、778、780、782、784、786,及/或788。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:770、772、774、776、778、780、782、784、786,及/或788。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:770、772、774、776、778、780、782、784、786,及/或788。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24/28、24/28/262、24/28/262/264、24/28/262/264/423、24/264/294、28、28/262/264、28/423、69/173/175/243/246/354/365/383/399、69/173/243/383/399、56/191/354/383/399、70/115/225/409、70/225/246/409/413、70/225/247、70/225/413、74/310/396/424、74/396、159、173/175/191/365/383/399、199、262/264及264/29,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24E/28N、24E/28N/262Y、24E/28N/262Y/264S、24E/28N/262Y/264S/423E、24E/264S/294V、28N、28N/262Y/264S、28N/423E、69H/173N/175S/243A/246K/354I/365I/383V/399A、 69H/173N/243A/383V/399A、56T/191D/354I/383V/399A、70L/115S/225G/409K、70L/225G/246P/409K/413V、70L/225G/247G、70L/225G/413V、74T/310D/396E/424S、74T/396E、159R、173H/175S/191D/365I/383V/399A、199H、262Y/264S及264S/291V,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Y24E/S28N、Y24E/S28N/F262Y、Y24E/S28N/F262Y/C264S、Y24E/S28N/F262Y/C264S/K423E,Y24E/C264S/A294V、S28N、S28N/F262Y/C264S、S28N/K423E、R69H/Y173N/P175S/V243A/M246K/L354I/M365I/M383V/T399A、R69H/Y173N/V243A/M383V/T399A、I56T/N191D/L354I/M383V/T399A、F70L/Q115S/N225G/E409K、F70L/N225G/M246P/E409K/I413V、F70L/N225G/E247G、F70L/N225G/I413V、H74T/K310D/G396E/N424S、H74T/G396E、F156R、Y173H/P175S/N191D/M365I/M383V/T399A、G199H、F262Y/C264S及C264S/I291V,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、1292,及/或1294。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、1292,及/或1294。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、1292,及/或1294。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24、28、32、264、269、325、341、351及366,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24L/V、28G/K/L、32C/R/S、264A/G、269S/W、325G/H、341V、351L及366L/Q/T,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Y24L/V、S28G/K/L、N32C/R/S、C264A/G、Y269S/W、K325G/H、F341V、M351L及H366L/Q/T,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844,及/或846。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844,及/或846。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844,及/或846。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:56/69/70/175/191/246、56/69/70/175/191/246/354、56/69/70/175/354、56/69/70/191/246/354/365、56/69/70/246/354、56/69/175/191/246/354、56/69/175/246/354、56/69/175/246/354/365、56/69/246/354、56/69/246/365、56/70/175/191/246、56/70/175/191/246/354、56/70/175/191/354/365、56/70/175/246/354、56/70/175/246/365、56/70/191/246/354/365、56/70/191/354、56/175/246、56/175/354、56/175/354/365、56/191/246/354、56/246、56/246/354/365、56/354、69、69/70/175/191/246/354/365、 69/70/191/246/354/365、69/70/246、69/70/354/365、69/175/191/246/354、69/175/354、69/246/354/365、69/354、70、70/175/191/246/354/365、70/175/191/354/365、70/191/246/354/365、70/191/246/365、126、126/220、126/403、175、175/191、175/191/246/354/365、175/191/354、175/191/354/365、175/246/354、175/246/354/365、175/354、191/246/354、246/354、354及354/365,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:56T/69Q/70L/175S/191D/246K、56T/69Q/70L/175S/191D/246K/354I、56T/69Q/70L/175S/354I、56T/69Q/70L/191D/246K/354I/365I、56T/69Q/70L/246K/354I、56T/69Q/175S/191D/246K/354I、56T/69Q/175S/246K/354I、56T/69Q/175S/246K/354I/365I、56T/69Q/246K/354I、56T/69Q/246K/M65I、56T/70L/175S/191D/246K、56T/70L/175S/191D/246K/354I、56T/70L/175S/191D/354I/365I、56T/70L/175S/246K/354I、56T/70L/175S/246K/365I、56T/70L/191D/246K/354I/365I、56T/70L/191D/354I、56T/175S/246K、56T/175S/354I、56T/175S/354I/365I、56T/191D/246K/354I、56T/246K、56T/246K/354I/365I、56T/354I、69Q、69Q/70L/175S/191D/246K/354I/365I、69Q/70L/191D/246K/354I/365I、69Q/70L/246K、69Q/70L/354I/365I、69Q/175S/191D/246K/354I、69Q/175S/354I、69Q/246K/354I/365I、69Q/354I、70L、70L/175S/191D/246K/354I/365I、70L/175S/191D/354I/365I、70L/191D/246K/354I/365I、70L/191D/246K/365I、126F、126F/220L、126F/403R、175S、175S/191D、175S/191D/246K/354I/365I、175S/191D/354I、175S/191D/354I/365I、175S/246K/354I、175S/246K/354I/365I、175S/354I、191D/246K/354I、246K/354I、354I及354I/365I,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:I56T/H69Q/F70L/P175S/N191D/M246K、I56T/H69Q/F70L/P175S/N191D/M246K/L354I、I56T/H69Q/F70L/P175S/L354I、I56T/H69Q/F70L/N191D/M246K/L354I/M365I、I56T/H69Q/F70L/M246K/L354I、I56T/H69Q/P175S/N191D/M246K/L354I、I56T/H69Q/P175S/M246K/L354I、I56T/H69Q/P175S/M246K/L354I/M365I、I56T/H69Q/M246K/L354I、I56T/H69Q/M246K/M365I、I56T/F70L/P175S/N191D/M246K、I56T/F70L/P175S/N191D/M246K/L354I、I56T/F70L/P175S/N191D/L354I/M365I、I56T/F70L/P175S/M246K/L354I、I56T/F70L/P175S/M246K/M365I、I56T/F70L/N191D/M246K/L354I/M365I、I56T/F70L/N191D/L354I、I56T/P175S/M246K、I56T/P175S/L354I、I56T/P175S/L354I/M365I、I56T/N191D/M246K/L354I、I56T/M246K、I56T/M246K/L354I/M365I、I56T/L354I、H69Q、H69Q/F70L/P175S/N191D/M246K/L354I/M365I、H69Q/F70L/N191D/M246K/L354I/M365I、H69Q/F70L/M246K、H69Q/F70L/L354I/M365I、H69Q/P175S/N191D/M246K/L354I、H69Q/P175S/L354I、H69Q/M246K/L354I/M365I、H69Q/L354I、F70L、F70L/P175S/N191D/M246K/L354I/M365I、F70L/P175S/N191D/L354I/M365I、F70L/N191D/M246K/L354I/M365I、F70L/N191D/M246K/M365I、I126F、I126F/C220L、I126F/K403R、P175S、P175S/N191D、P175S/N191D/M246K/L354I/M365I、P175S/N191D/L354I、P175S/N191D/L354I/M365I、P175S/M246K/L354I、P175S/M246K/L354I/M365I、P175S/L354I、N191D/M246K/L354I、M246K/L354I、L354I及L354I/M365I,其中該位置係根據序列辨識編號:770予以編號。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950,及/或952。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950,及/或952。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950,及/或952。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24/32/264/269/330/402/403、24/32/264/269/382/403/406、24/32/264/330、24/32/269、24/32/269/382/385/389/402/406、24/32/269/403、24/32/330、24/264/269/389/402/406、70/126/175/191/246/325/354/366、70/126/175/325/330/351/354/366、70/126/191/246/325/351/354/366/423、70/126/191/246/325/351/354/423、70/126/191/246/325/351/366/423、70/126/191/246/354/366、70/126/246/330/366、70/126/246/354/366、126/211/220/253/316/342、126/211/220/275/279/323、126/211/260/423、126/220/260、126/220/316、56/220/260/423、220/260及220/260/423,其中該位置係根據序列辨識編號:792予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24L/32S/264A/269S/330Q/402V/403R、24L/32S/264A/269S/382G/403R/406M、24L/32S/264A/330Q、24L/32S/269S、24L/32S/269S/382G/385V/389E/402I/406M、24L/32S/269S/403R、24L/32S/330Q、24L/264A/269S/389E/402V/406M、70L/126F/175S/191D/246K/325H/354I/366Q、70L/126F/175S/325H/330Q/351L/354I/366Q、70L/126F/191D/246K/325H/351L/354I/366Q/423K、70L/126F/191D/246K/325H/351L/354I/423K、70L/126F/191D/246K/325H/351L/366Q/423K、70L/126F/191D/246K/354I/366Q、70L/126F/246K/330Q/366Q、70L/126F/246K/354I/366Q、126F/211E/220L/253D/316V/342L、126F/211E/220L/275Q/279L/323V、126F/211E/260V/423K、126F/220L/260V、126F/220L/316V、56V/220L/260V/423K、220L/260V及220L/260V/423K,其中該位置係根據序列辨識編號:792予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E24L/N32S/S264A/Y269S/P330Q/L402V/K403R、E24L/N32S/S264A/Y269S/A382G/K403R/I406M、E24L/N32S/S264A/P330Q、E24L/N32S/Y269S、E24L/N32S/Y269S/A382G/I385V/D389E/L402I/I406M、E24L/N32S/Y269S/K403R、E24L/N32S/P330Q、E24L/S264A/Y269S/D389E/L402V/I406M、F70L/I126F/P175S/N191D/M246K/K325H/L354I/H366Q、F70L/I126F/P175S/K325H/P330Q/M351L/L354I/H366Q、F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/L354I/H366Q/E423K、F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/L354I/E423K、F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/H366Q/E423K、F70L/I126F/N191D/M246K/L354I/H366Q、F70L/I126F/M246K/P330Q/H366Q、F70L/I126F/M246K/L354I/H366Q、I126F/T211E/C220L/G253D/I316V/I342L、I126F/T211E/C220L/D275Q/V279L/L323V、I126F/T211E/T260V/E423K、I126F/C220L/T260V、I126F/C220L/I316V、I56V/C220L/T260V/E423K、C220L/T260V及C220L/T260V/E423K,其中該位置係根據序列辨識編號:792予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996、998,及/或1000。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996、998,及/或1000。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996、998,及/或1000。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24/32/97/162/202、24/32/126/198/201/367、24/32/126/198/202/220/226/260/269S、24/32/146/226、24/32/198/201/220/226、24/32/198/201/226、24/97/260/367、32/97/198/202/226/260、32/202/367、32/226/367、56/175/197/211/330/382/385、56/175/197/253/385/389、56/175/264/382/385/389/402/406、56/197/264/279/330/382/389/402/403/406、56/211/253/316/323、56/211/264/316/389、56/211/279/323/330/402、56/264/385/389、97/202/367、162/220/226/367、175/197/211/264/330、175/211/264/279/316/323、175/211/279/323/330/402/403/406、175/211/323/382/402/403/406、175/211/403/406、175/264/316/323/330/403/406、175/264/316/389/402、175/264/323/330、197/211/316/342/406、197/211/316/382/389/402/403、197/211/402、197/279/323、198/201/367、198/202/220/269/367、201/202/367、211/382/406、211/385/389、211/402/403及389,其中該位置係根據序列辨識編號:954予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24L/32S/97G/162R/202G、24L/32S/126A/198P/201G/367W、24L/32S/126A/198P/202G/220L/226V/260V/269S、24L/32S/146A/226V、24L/32S/198P/201G/220L/226V、24L/32S/198P/201G/226V、24L/97G/260V/367W、32S/97G/198P/202G/226V/260V、32S/202G/367W、32S/226V/367W、56V/175S/197P/211E/330Q/382G/385V、56V/175S/197P/253D/385V/389E、56V/175S/264A/382G/385V/389E/402V/406M、56V/197P/264A/279L/330Q/382G/389E/402V/403R/406M、56V/211E/253D/316V/323V、56V/211E/264A/316V/389E、56V/211E/279L/323V/330Q/402I、56V/264A/385V/389E、97G/202G/367W、162R/220L/226V/367W、175S/197P/211E/264A/330Q、175S/211E/264A/279L/316V/323V、175S/211E/279L/323V/330Q/402I/403R/406M、175S/211E/323V/382G/402I/403R/406M、175S/211E/403R/406M、175S/264A/316V/323V/330Q/403R/406M、175S/264A/316V/389E/402V、175S/264A/323V/330Q、197P/211E/316V/342L/406M、197P/211E/316V/382G/389E/402I/403R、197P/211E/402I、197P/279L/323V、198P/201G/367W、198P/202G/220L/269S/367W、201G/202G/367W、211E/382G/406M、211E/385V/389E、211E/402I/403R及D389E,其中該位置係根據序列辨識編號:954予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E24L/N32S/H97G/N162R/Q202G、E24L/N32S/F126A/E198P/M201G/N367W、E24L/N32S/F126A/E198P/Q202G/C220L/W226V/T260V/Y269S、E24L/N32S/L146A/W226V、E24L/N32S/E198P/M201G/C220L/W226V、E24L/N32S/E198P/M201G/W226V、E24L/H97G/T260V/N367W、N32S/H97G/E198P/Q202G/W226V/T260V、N32S/Q202G/N367W、N32S/W226V/N367W、I56V/P175S/A197P/T211E/P330Q/A382G/I385V、I56V/P175S/A197P/G253D/I385V/D389E、I56V/P175S/S264A/A382G/I385V/D389E/L402V/I406M、I56V/A197P/S264A/V279L/P330Q/A382G/D389E/L402V/K403R/I406M、I56V/T211E/G253D/I316V/L323V、I56V/T211E/S264A/I316V/D389E、I56V/T211E/V279L/L323V/P330Q/L402I、I56V/S264A/I385V/D389E、H97G/Q202G/N367W、N162R/C220L/W226V/N367W、P175S/A197P/T211E/S264A/P330Q、P175S/T211E/S264A/V279L/I316V/L323V、P175S/T211E/V279L/L323V/P330Q/L402I/K403R/I406M、P175S/T211E/L323V/A382G/L402I/K403R/I406M、P175S/T211E/K403R/I406M、P175S/S264A/I316V/L323V/P330Q/K403R/I406M、P175S/S264A/I316V/D389E/L402V、P175S/S264A/L323V/P330Q、A197P/T211E/I316V/I342L/I406M、A197P/T211E/I316V/A382G/D389E/L402I/K403R、A197P/T211E/L402I、A197P/V279L/L323V、E198P/M201G/N367W、E198P/Q202G/C220L/Y269S/N367W、M201G/Q202G/N367W、T211E/A382G/I406M、T211E/I385V/D389E、T211E/L402I/K403R及D389E,其中該位置係根據序列辨識編號:954予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022、1024、1026、1028、1030、1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044、1046、1048、1050、1052、1054、1056、1058、1060、1062、1064、1066、1068、1070、1072、1074、1076,及/或1078。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022、1024、1026、1028、1030、1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044、1046、1048、1050、1052、1054、1056、1058、1060、1062、1064、1066、1068、1070、1072、1074、1076,及/或1078。在一些額外的具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022、1024、1026、1028、1030、1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044、1046、1048、1050、1052、1054、1056、1058、1060、1062、1064、1066、1068、1070、1072、1074、1076,及/或1078。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24/32/175/211/260/330/403/406、24/32/175/226/253/275/316、24/32/201/226/260/264/330/402/406、24/162/175/198/211/226/275/316/323/389、24/162/175/201/275/316、24/162/198/201/211/226/323/351、24/162/198/201/226/351、24/162/201/253/264/351/402/406、24/175/198/211/226/253/316、24/175/201/275/316/351、24/175/201/316、24/175/211/220/260/275/330/389、24/175/211/253/316、24/175/211/316/330、24/175/226/323/351、24/198/201、24/198/201/211、24/198/201/211/220/260、24/198/201/220/275/389/402/406、24/198/201/226/330/389、24/198/201/351、24/201/211/253/323/351/366/389/402/403、24/201/226/253/402/403/406、24/226/330/351/403、175/198/201/211/226/260/264/323/402/406及175/198/226/260/351/402/403/406,其中該位置係根據序列辨識編號:1054予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:24L/32S/175S/211E/260V/330Q/403R/406M、24L/32S/175S/226V/253D/275Q/316V、24L/32S/201G/226V/260V/264A/330Q/402I/406M、24L/162R/175S/198P/211E/226V/275Q/316V/323V/389E、24L/162R/175S/201G/275Q/316V、24L/162R/198P/201G/211E/226V/323V/351M、24L/162R/198P/201G/226V/351M、24L/162R/201G/253D/264A/351M/402I/406M、24L/175S/198P/211E/226V/253D/316V、24L/175S/201G/275Q/316V/351M、24L/175S/201G/316V、24L/175S/211E/220L/260V/275Q/330Q/389E、24L/175S/211E/253D/316V、24L/175S/211E/316V/330Q、24L/175S/226V/323V/351M、24L/198P/201G、24L/198P/201G/211E、24L/198P/201G/211E/220L/260V、24L/198P/201G/220L/275Q/389E/402I/406M、24L/198P/201G/226V/330Q/389E、24L/198P/201G/351M、24L/201G/211E/253D/323V/351M/366H/389E/402I/403R、24L/201G/226V/253D/402I/403R/406M、24L/226V/330Q/351M/403R、175S/198P/201G/211E/226V/260V/264A/323V/402I/406M及175S/198P/226V/260V/351M/402I/403R/406M,其中該位置係根據序列辨識編號:1054予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:E24L/N32S/P175S/T211E/T260V/P330Q/K403R/I406M、E24L/N32S/P175S/W226V/G253D/D275Q/I316V、E24L/N32S/M201G/W226V/T260V/S264A/P330Q/L402I/I406M、E24L/N162R/P175S/E198P/T211E/W226V/D275Q/I316V/L323V/D389E、E24L/N162R/P175S/M201G/D275Q/I316V、E24L/N162R/E198P/M201G/T211E/W226V/L323V/L351M、E24L/N162R/E198P/M201G/W226V/L351M、E24L/N162R/M201G/G253D/S264A/L351M/L402I/I406M、E24L/P175S/E198P/T211E/W226V/G253D/I316V、E24L/P175S/M201G/D275Q/I316V/L351M、E24L/P175S/M201G/I316V、E24L/P175S/T211E/C220L/T260V/D275Q/P330Q/D389E、E24L/P175S/T211E/G253D/I316V、E24L/P175S/T211E/I316V/P330Q、E24L/P175S/W226V/L323V/L351M、E24L/E198P/M201G、E24L/E198P/M201G/T211E、E24L/E198P/M201G/T211E/C220L/T260V、E24L/E198P/M201G/C220L/D275Q/D389E/L402I/I406M、E24L/E198P/M201G/W226V/P330Q/D389E、E24L/E198P/M201G/L351M、E24L/M201G/T211E/G253D/L323V/L351M/Q366H/D389E/L402I/K403R、E24L/M201G/W226V/G253D/
L402I/K403R/I406M、E24L/W226V/P330Q/L351M/K403R、P175S/E198P/M201G/T211E/W226V/T260V/S264A/L323V/L402I/I406M及P175S/E198P/W226V/T260V/L351M/L402I/
K403R/I406M,其中該位置係根據序列辨識編號:1054予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2596、2598、2600、2602、2604、2606、2608、2610、2612、2614、2616、2618、2620、2622、2624、2626、2628、2630、2632、2634、2636、2638、2640、2642、2644及2646。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2596、2598、2600、2602、2604、2606、2608、2610、2612、2614、2616、2618、2620、2622、2624、2626、2628、2630、2632、2634、2636、2638、2640、2642、2644及2646。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2596、2598、2600、2602、2604、2606、2608、2610、2612、2614、2616、2618、2620、2622、2624、2626、2628、2630、2632、2634、2636、2638、2640、2642、2644及2646。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:21/127/129/161、21/127/129/161/162、21/127/129/162/199/200、127/129/161/162/199、127/129/161/199/200、127/129/162、156、156/161、156/161/162、156/162/199及156/199/200,其中該位置係根據序列辨識編號:1002予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:21Y/127H/129A/161S、21Y/127H/129A/161S/162G、21Y/127H/129A/162T/199H/200A、127H/129A/162T、127Q/129A/161S/162G/199H、127Q/129A/161S/199H/200A、156R、156R/161S、156R/161S/162G、156R/161S/162T、156R/162G/199H及156R/199H/200A,其中該位置係根據序列辨識編號:1002予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:W21Y/L127H/P129A/K161S、W21Y/L127H/P129A/K161S/N162G、W21Y/L127H/P129A/N162T/G199H/N200A、L127H/P129A/N162T、L127Q/P129A/K161S/N162G/G199H、L127Q/P129A/K161S/G199H/N200A、F156R、F156R/K161S、F156R/K161S/N162G、F156R/K161S/N162T、F156R/N162G/G199H及F156R/G199H/N200A,其中該位置係根據序列辨識編號:1002予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2648、2650、2652、2654、2656、2658、2660、2662、2664、2666、2668、2670、2672、2674、2676、2678、2680、2682及2684。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2648、2650、2652、2654、2656、2658、2660、2662、2664、2666、2668、2670、2672、2674、2676、2678、2680、2682及2684。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2648、2650、2652、2654、2656、2658、2660、2662、2664、2666、2668、2670、2672、2674、2676、2678、2680、2682及2684。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/7/12/15/175/260/318、7/12/400/435、7/318/451、12/15/57/71/175/260/400/402、12/15/57/220/254/260/318/402、12/15/57/318/402/435、12/15/318/400/402/406、12/57/175/451、12/175/260/264/318/400、12/175/400/402/406、12/318/402/404/406/451、12/318/402/404/451、15/175/318/400/402、57/175/220/260/264/402、57/175/404、57/220/260/400/402/406、57/260/400/402/404、57/400/402、57/402、152/192/195、160/186/195、195、260及400/402,其中該位置係根據序列辨識編號:2600予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2-/7E/12S/15K/175S/260V/318D、7E/12S/400Q/435V、7E/318D/451N、12S/15K/57K/71I/175S/260V/400Q/402I、12S/15K/57K/220L/254K/260V/318D/402I、12S/15K/57K/318D/402I/435V、12S/15K/318D/400Q/402I/406M、12S/57K/175S/451N、12S/175S/260V/264A/318D/400Q、12S/175S/400Q/402I/406M、12S/318D/402I/404S/406M/451N、12S/318D/402I/404S/451N、15K/175S/318D/400Q/402I、57K/175S/220L/260V/264A/402I、57K/175S/404G、57K/220L/260V/400Q/402I/406M、57K/260V/400Q/402I/404S、57K/400Q/402I、57K/402I、152V/192D/195P、160V/186M/195P、195P、260V及400Q/402I,其中該位置係根據序列辨識編號:2600予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H2-/H7E/A12S/R15K/P175S/T260V/E318D、H7E/A12S/E400Q/A435V、H7E/E318D/K451N、A12S/R15K/I57K/V71I/P175S/T260V/E400Q/L402I、A12S/R15K/I57K/C220L/T254K/T260V/E318D/L402I、A12S/R15K/I57K/E318D/L402I/A435V、A12S/R15K/E318D/E400Q/L402I/I406M、A12S/I57K/P175S/K451N、A12S/P175S/T260V/S264A/E318D/E400Q、A12S/P175S/E400Q/L402I/I406M、A12S/E318D/L402I/D404S/I406M/K451N、A12S/E318D/L402I/D404S/K451N、R15K/P175S/E318D/E400Q/L402I、I57K/P175S/C220L/T260V/S264A/L402I、I57K/P175S/D404G、I57K/C220L/T260V/E400Q/L402I/I406M、I57K/T260V/E400Q/L402I/D404S、I57K/E400Q/L402I、I57K/L402I、L152V/E192D/R195P、L160V/F186M/R195P、R195P、T260V及E400Q/L402I,其中該位置係根據序列辨識編號:2600予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:32、135、148、152、186、237、239、240、323、325、326、327、330、331及356,其中該位置係根據序列辨識編號:2600予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:32R、135A、148A、152V、186V、237T、239E、239F、239Y、240A、240P、323L、325G、325R、326M、327V、330A、331C、331H、331S及356G,其中該位置係根據序列辨識編號:2600予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:N32R、V135A、S148A、L152V、F186V、D237T、I239E、I239F、I239Y、T240A、T240P、V323L、H325G、H325R、F326M、A327V、P330A、R331C、R331H、R331S及F356G,其中該位置係根據序列辨識編號:2600予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2686、2688、2690、2692、2694、2696、2698、2700、2702、2704、2706、2708、2710、2712、2714、2716、2718、2720、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2764、2766、2768、2770、2772及2774。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2686、2688、2690、2692、2694、2696、2698、2700、2702、2704、2706、2708、2710、2712、2714、2716、2718、2720、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2764、2766、2768、2770、2772及2774。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2686、2688、2690、2692、2694、2696、2698、2700、2702、2704、2706、2708、2710、2712、2714、2716、2718、2720、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2764、2766、2768、2770、2772及2774。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14/23/274/326/329、14/31/184/274/322/326/329/330、14/56/184/185/194/238/239/274/329/399、14/56/184/194/234/315/326/329/399/401、14/56/194/238/315/325/326/329/330/399、14/56/252/274/315/326/329/330/401、14/184/185/194/234/325/326/329、14/184/185/194/388/399/401、14/184/194/355/399、14/185/194/238/399、14/185/236/238/239/274/322/326/329/355/399/401、14/194、14/322/326/330、14/326/330、14/355、14/355/399、23/31/147/184/185/238/252/325/329/330/388/401、31/56/315/329/330、65、65/114/132/238、65/238/240、147/236/238/243/315/329/330/399/401、185/194/236/239/325/326、223/412及238,其中該位置係根據序列辨識編號:2718予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14R/23Q/274Q/326V/329A、14R/31R/184A/274Q/322L/326V/329A/330H、14R/56K/184A/185M/194P/238M/239A/274Q/329A/399Q、14R/56K/184A/194P/234Y/315V/326V/329Q/399Q/401I、14R/56K/194P/238M/315V/325M/326V/329A/330H/399Q、14R/56K/252D/274Q/315V/326V/329A/330H/401I、14R/184A/185M/194P/234Y/325M/326V/329A、14R/184A/185M/194P/388E/399Q/401I、14R/184A/194P/355G/399Q、14R/185M/194P/238M/399Q、14R/185M/236T/238M/239A/274Q/322L/326V/329Q/355G/399Q/401I、14R/194P、14R/322L/326V/330H、14R/326V/330H、14R/355G、14R/355G/399Q、23Q/31R/147A/184A/185M/238M/252D/325M/329A/330H/388E/401I、31R/56K/315V/329A/330H、65D、65D/114E/132R/238M、65D/238T/240S、147A/236T/238M/243G/315V/329A/330H/399Q/401I、185M/194P/236T/239A/325M/326V、223T/412S及238M,其中該位置係根據序列辨識編號:2718予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:K14R/L23Q/D274Q/A326V/P329A、K14R/N31R/M184A/D274Q/V322L/A326V/P329A/R330H、K14R/I56K/M184A/F185M/R194P/I238M/T239A/D274Q/P329A/E399Q、K14R/I56K/M184A/R194P/F234Y/
I315V/A326V/P329Q/E399Q/L401I、K14R/I56K/
R194P/I238M/I315V/F325M/A326V/P329A/R330H/E399Q、K14R/I56K/G252D/D274Q/I315V/A326V/P329A/
R330H/L401I、K14R/M184A/F185M/R194P/F234Y/F325M/
A326V/P329A、K14R/M184A/F185M/R194P/D388E/
E399Q/L401I、K14R/M184A/R194P/F355G/E399Q、K14R/F185M/R194P/I238M/E399Q、K14R/F185M/D236T/I238M/T239A/D274Q/V322L/A326V/P329Q/F355G/E399Q/L401I、K14R/R194P、K14R/V322L/A326V/R330H、K14R/A326V/R330H、K14R/F355G、K14R/F355G/E399Q、L23Q/N31R/S147A/M184A/F185M/I238M/G252D/F325M/P329A/R330H/D388E/L401I、N31R/I56K/I315V/P329A/R330H、E65D、E65D/Q114E/H132R/I238M、E65D/I238T/N240S、S147A/D236T/I238M/D243G/I315V/P329A/R330H/E399Q/L401I、F185M/R194P/D236T/T239A/F325M/A326V、S223T/I412S及I238M,其中該位置係根據序列辨識編號:2718予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11、45、55、56、58、65、104、113、114、132、135、138、165、238、256、273、286、309、391、422、430及449,其中該位置係根據序列辨識編號:2718予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11G、11Q、45F、45V、55L、56T、58R、65N、65S、104L、113V、114R、132Q、132S、135L、138G、138K、165P、238G、256P、273R、286R、309E、309H、391R、422R、430L、430V及449F,其中該位置係根據序列辨識編號:2718予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:S11G、S11Q、L45F、L45V、I55L、I56T、K58R、E65N、E65S、M104L、L113V、Q114R、H132Q、H132S、N135L、N138G、N138K、E165P、I238G、E256P、E273R、N286R、K309E、K309H、N391R、K422R、E430L、E430V及Y449F,其中該位置係根據序列辨識編號:2718予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2776、2778、2780、2782、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854、2856、2858、2860、2862、2864、2866、2868、2870、2872、2874、2876、2878、2880及2882。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2776、2778、2780、2782、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854、2856、2858、2860、2862、2864、2866、2868、2870、2872、2874、2876、2878、2880及2882。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2776、2778、2780、2782、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854、2856、2858、2860、2862、2864、2866、2868、2870、2872、2874、2876、2878、2880及2882。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:23/31/185/324/401、23/31/185/355、31/134/185/252/274/324/388、31/134/238/252/322/324/388、31/134/252/324、31/184/185/238/239/322、31/236、31/322、31/388、134/184/185/234/236/239/274/324/388、184/185/322、234/236/238/322/324/355、236、238/324/329/355、322/324及324/329/355/401,根據序列辨識編號:2814予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:23Q/31R/185M/324G/401I、23Q/31R/185M/355G、31R/134A/185M/252D/274Q/324G/388E、31R/134A/238E/252D/322L/324G/388E、31R/134A/252D/324G、31R/184A/185M/238Y/239A/322L、31R/236T、31R/322L、31R/388E、134A/184A/185M/234Y/236T/239A/274Q/324G/388E、184A/185M/322L、234Y/236T/238E/322L/324G/355G、236T、238Y/324G/329Q/355G、322L/324G及324G/329Q/355G/401I,根據序列辨識編號:2814予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:L23Q/N31R/F185M/H324G/L401I、L23Q/N31R/F185M/F355G、N31R/V134A/F185M/G252D/D274Q/H324G/D388E、N31R/V134A/M238E/G252D/V322L/H324G/D388E、N31R/V134A/G252D/H324G、N31R/M184A/F185M/M238Y/T239A/V322L、N31R/D236T、N31R/V322L、N31R/D388E、V134A/M184A/F185M/F234Y/D236T/T239A/D274Q/H324G/D388E、M184A/F185M/V322L、F234Y/D236T/M238E/V322L/H324G/F355G、D236T、M238Y/H324G/A329Q/F355G、V322L/H324G及H324G/A329Q/F355G/L401I,根據序列辨識編號:2814予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:122、164、176、177、316、325、400、425、426、427、440及446,根據序列辨識編號:2814予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:122L、164H、164M、164R、176K、176L、176N、176R、177A、316R、325L、400V、425R、426A、426R、427R、440R及446R,根據序列辨識編號:2814予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:I122L、V164H、V164M、V164R、V176K、V176L、V176N、V176R、E177A、G316R、M325L、T400V、K425R、S426A、S426R、I427R、I440R及S446R,根據序列辨識編號:2814予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2884、2886、2888、2890、2892、2894、2896、2898、2900、2902、2904、2906、2908、2910、2912、2914、2916、2918、2920、2922、2924、2926、2928、2830、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948及2950,根據序列辨識編號:2814予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2884、2886、2888、2890、2892、2894、2896、2898、2900、2902、2904、2906、2908、2910、2912、2914、2916、2918、2920、2922、2924、2926、2928、2830、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948及2950。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2884、2886、2888、2890、2892、2894、2896、2898、2900、2902、2904、2906、2908、2910、2912、2914、2916、2918、2920、2922、2924、2926、2928、2830、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948及2950。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11、11/45/58/132/138/286、11/58、11/58/65/104/107/138/286、11/58/65/107/135/223/286/391/430、11/58/65/135/138、11/58/104/107/114/138/223/391、11/58/114/286/309/391、11/58/132/165/286/391/422/430、11/58/138/309、11/65/104/107/138/165/286/391/430、11/65/107/135/165/391/430、11/65/132/135/138/223/391、11/65/132/135/252、11/65/132/391/430、11/65/135/138、11/104/132/138/309/391、11/104/132/138/391、11/107/114/223/309/430、11/107/138、11/114/135/138/223、11/114/223/252/286/391、11/132/135/138/223/286、11/132/138/223/286/391、11/138/165/223/309、58/65/138、58/65/138/165、58/65/165/309/430、58/104/114/165/391、107/114/132/138、107/430、135/138/165/309/430及223/309,其中該位置係根據序列辨識編號:2884予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11G/45V/58R/132Q/138G/286R、11G/58R/104L/107G/114R/138K/223T/391R、11G/58R/114R/286R/309H/391R、11G/58R/132Q/165P/286R/391R/422S/430L、11G/65N/132Q/391R/430L、11G/104L/132Q/138G/309H/391R、11G/107G/114R/223T/309H/430L、11Q、11Q/58R、11Q/58R/65N/104L/107G/138G/286R、11Q/58R/65N/107G/135L/223T/286R/391R/430L、11Q/58R/65N/135L/138G、11Q/58R/138G/309E、11Q/65N/104L/107G/138G/165P/286R/391R/430L、11Q/65N/107G/135L/165P/391R/430L、11Q/65N/132Q/135L/138G/223T/391R、11Q/65N/132Q/135L/252D、11Q/65N/135L/138G、11Q/104L/132Q/138K/391R、11Q/107G/138G、11Q/114R/135L/138G/223T、11Q/114R/223T/252D/286R/391R、11Q/132Q/135L/138K/223T/286R、11Q/132Q/138G/223T/286R/391R、11Q/138K/165P/223T/309H、58R/65N/138G/165P、58R/65N/138K、58R/65N/165P/309H/430L、58R/104L/114R/165P/391R、107G/114R/132Q/138G、107G/430L、135L/138G/165P/309H/430L及223T/309E,其中該位置係根據序列辨識編號:2884予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:S11G/L45V/K58R/H132Q/N138G/N286R、S11G/K58R/M104L/P107G/Q114R/N138K/S223T/N391R、S11G/K58R/Q114R/N286R/K309H/N391R、S11G/K58R/H132Q/E165P/N286R/N391R/K422S/E430L、S11G/E65N/H132Q/N391R/E430L、S11G/M104L/H132Q/N138G/K309H/N391R、S11G/P107G/Q114R/S223T/K309H/E430L、S11Q、S11Q/K58R、S11Q/K58R/E65N/M104L/P107G/N138G/N286R、S11Q/K58R/E65N/P107G/N135L/S223T/N286R/N391R/E430L、S11Q/K58R/E65N/N135L/N138G、S11Q/K58R/N138G/K309E、S11Q/E65N/M104L/P107G/N138G/E165P/N286R/N391R/E430L、S11Q/E65N/P107G/N135L/E165P/N391R/E430L、S11Q/E65N/H132Q/N135L/N138G/S223T/N391R、S11Q/E65N/H132Q/N135L/G252D、S11Q/E65N/N135L/N138G、S11Q/M104L/H132Q/N138K/N391R、S11Q/P107G/N138G、S11Q/Q114R/N135L/N138G/S223T、S11Q/Q114R/S223T/G252D/N286R/N391R、S11Q/H132Q/N135L/N138K/S223T/N286R、S11Q/H132Q/N138G/S223T/N286R/N391R、S11Q/N138K/E165P/S223T/K309H、K58R/E65N/N138G/E165P、K58R/E65N/N138K、K58R/E65N/E165P/K309H/E430L、K58R/M104L/Q114R/E165P/N391R、P107G/Q114R/H132Q/N138G、P107G/E430L、N135L/N138G/E165P/K309H/E430L及S223T/K309E,其中該位置係根據序列辨識編號:2884予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964、2966、2968、2970、2972、2974、2976、2978、2980、2982、2984、2986、2988、2990、2992、2994、2996、2998、3000、3002、3004、3006、3008、3010、3012、3014及3016。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964、2966、2968、2970、2972、2974、2976、2978、2980、2982、2984、2986、2988、2990、2992、2994、2996、2998、3000、3002、3004、3006、3008、3010、3012、3014及3016。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964、2966、2968、2970、2972、2974、2976、2978、2980、2982、2984、2986、2988、2990、2992、2994、2996、2998、3000、3002、3004、3006、3008、3010、3012、3014及3016。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8/448、58/107/122/176/236/324/325/400/426/427、58/107/122/236/324/400/425/446、58/107/122/322/400/425/427/440/446、58/107/164/400、58/107/236/400、58/107/400、58/122/164/236/446、58/122/176/236/400/446、58/122/176/322/324/426/427、58/122/322/325、58/122/325、58/122/440、58/164/176、58/164/324/425/427、58/176/236、58/236、107/122/236/425/426/446、107/164/236/400/446、107/176/322/325/440/446、107/176/400/425/427/440、107/236、107/440、122/164/176/324/400、122/164/400/440、122/164/400/440/446、122/176/236/400、122/176/324/400/440、122/400、122/425/426/446、122/440/446、139、139/252、164、164/271/425/426、164/322/324/325/400/425/440/446、164/400、176/400、189及324/400/425/426/440/446,其中該位置係根據序列辨識編號:3016予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8S/448A、58R/107G/122L/176R/236T/324G/325L/400V/426R/427R、58R/107G/122L/236T/324G/400V/425R/446R、58R/107G/122L/322L/400V/425R/427R/440R/446R、58R/107G/164H/400V、58R/107G/236T/400V、58R/107G/400V、58R/122L/164H/236T/446R、58R/122L/176R/236T/400V/446R、58R/122L/176R/322L/324G/426A/427R、58R/122L/322L/325L、58R/122L/325L、58R/122L/440R、58R/164H/176R、58R/164H/324G/425R/427R、58R/176R/236T、58R/236T、107G/122L/236T/425R/426A/446R、107G/164H/236T/400V/446R、107G/176R/322L/325L/440R/446R、107G/176R/400V/425R/427R/440R、107G/236T、107G/440R、122L/164H/176R/324G/400V、122L/164H/400V/440R、122L/164H/400V/440R/446R、122L/176R/236T/400V、122L/176R/324G/400V/440R、122L/400V、122L/425R/426R/446R、122L/440R/446R、139V、139V/252D、164H、164H/271G/425R/426R、164H/322L/324G/325L/400V/425R/440R/446R、164H/400V、176R/400V、189R及324G/400V/425R/
426R/440R/446R,其中該位置係根據序列辨識編號:3016予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:G8S/K448A、K58R/P107G/I122L/
V176R/D236T/H324G/M325L/T400V/S426R/I427R、K58R/P107G/I122L/D236T/H324G/T400V/K425R/S446R、K58R/P107G/I122L/V322L/T400V/K425R/I427R/I440R/S446R、K58R/P107G/V164H/T400V、K58R/P107G/D236T/T400V、K58R/P107G/T400V、K58R/I122L/V164H/D236T/S446R、K58R/I122L/V176R/D236T/T400V/S446R、K58R/I122L/V176R/V322L/H324G/S426A/I427R、K58R/I122L/V322L/M325L、K58R/I122L/M325L、K58R/I122L/I440R、K58R/V164H/V176R、K58R/V164H/H324G/K425R/I427R、K58R/V176R/D236T、K58R/D236T、P107G/I122L/D236T/K425R/S426A/S446R、P107G/V164H/D236T/T400V/S446R、P107G/V176R/V322L/M325L/I440R/S446R、P107G/V176R/T400V/K425R/I427R/I440R、P107G/D236T、P107G/I440R、I122L/V164H/V176R/H324G/T400V、I122L/V164H/T400V/I440R、I122L/V164H/T400V/I440R/S446R、I122L/V176R/D236T/T400V、I122L/V176R/H324G/T400V/I440R、I122L/T400V、I122L/K425R/S426R/S446R、I122L/I440R/S446R、I139V、I139V/G252D、V164H、V164H/S271G/K425R/S426R、V164H/V322L/H324G/M325L/T400V/K425R/I440R/S446R、V164H/T400V、V176R/T400V、P189R及H324G/T400V/K425R/S426R/I440R/S446R,其中該位置係根據序列辨識編號:3016予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:9、65、106、115、116、172、178、200、210、213、240、242、245、255、324/423、385、408、409、411、412、415、416、423及447,其中該位置係根據序列辨識編號:3016予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:9C、9M、65S、106A、115D、115R、116V、172R、172S、178K、200A、200T、200V、210L、210V、213G、240C、240E、240L、240P、240V、242I、242Y、245M、255P、324R/423R、385R、408P、409L、411Q、412R、415A、415H、415K、415R、416R、423A、423R、447L及447R,其中該位置係根據序列辨識編號:3016予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:S9C、S9M、N65S、K106A、N115D、N115R、L116V、N172R、N172S、Q178K、G200A、G200T、G200V、E210L、E210V、A213G、N240C、N240E、N240L、N240P、N240V、A242I、A242Y、K245M、D255P、H324R/N423R、V385R、E408P、T409L、E411Q、I412R、G415A、G415H、G415K、G415R、K416R、N423A、N423R、N447L及N447R,其中該位置係根據序列辨識編號:3016予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:3018、3020、3022、3024、3026、3028、3030、3032、3034、3036、3038、3040、3042、3044、3046、3048、3050、3052、3054、3056、3058、3060、3062、3064、3066、3068、3070、3072、3074、3076、3078、3080、3082、3084、3086、3088、3090、3092、3094、3096、3098、3100、3102、3104、3106、3108、3110、3112、3114、3116、3118、3120、3122、3124、3126、3128、3130、3132、3134、3136、3138、3140、3142、3144、3146、3148、3150、3152、3154、3156、3158、3160、3162、3164、3166、3168、3170、3172、3174、3176、3178及3180。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:3018、3020、3022、3024、3026、3028、3030、3032、3034、3036、3038、3040、3042、3044、3046、3048、3050、3052、3054、3056、3058、3060、3062、3064、3066、3068、3070、3072、3074、3076、3078、3080、3082、3084、3086、3088、3090、3092、3094、3096、3098、3100、3102、3104、3106、3108、3110、3112、3114、3116、3118、3120、3122、3124、3126、3128、3130、3132、3134、3136、3138、3140、3142、3144、3146、3148、3150、3152、3154、3156、3158、3160、3162、3164、3166、3168、3170、3172、3174、3176、3178及3180。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:3018、3020、3022、3024、3026、3028、3030、3032、3034、3036、3038、3040、3042、3044、3046、3048、3050、3052、3054、3056、3058、3060、3062、3064、3066、3068、3070、3072、3074、3076、3078、3080、3082、3084、3086、3088、3090、3092、3094、3096、3098、3100、3102、3104、3106、3108、3110、3112、3114、3116、3118、3120、3122、3124、3126、3128、3130、3132、3134、3136、3138、3140、3142、3144、3146、3148、3150、3152、3154、3156、3158、3160、3162、3164、3166、3168、3170、3172、3174、3176、3178及3180。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:、8、8/107/139/164/415/416/440/448、8/107/139/255/322/325/415/416/440/448、8/107/164/255、8/107/164/423/440、8/139、8/139/164/200/236/240/322/440/448、8/139/164/236/416/423/440、8/139/189/240/325/416、8/139/200/236/240/255/423、8/139/255/415/416、8/164、8/164/189/200/322/324/325/416/448、8/164/240/423、8/164/252/255/448、8/164/448、8/236/240/252/448、8/240/423、8/252/255/322/325/448、12/164/440、107/139、107/139/200/240/322/324/325/448、107/236/240/325/440、107/240/252/423/448、107/423、139、139/164/236/240、139/255/325/415/440、164/189、164/189/236/240、164/189/240/252/415/423、164/200/236、164/200/236/240/324/416/440、164/200/236/255/322/324/423/440、164/236、164/236/240/440、164/236/423、164/322/325、164/322/325/416/423、164/416/448、200/236/322/325/416、200/322/325/415/448、236/415/416、240、240/252/255/322/415/416、240/252/255/415/448、255/423、325及415/416/448,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2-、8S、8S/107G/139V/164H/415A/416R/440R/448A、8S/107G/139V/255P/322L/325L/415A/416R/440R/448A、8S/107G/164H/255P、8S/107G/164H/423R/440R、8S/139V、8S/139V/164H/200A/236T/240E/322L/440R/448A、8S/139V/164H/236T/416R/423R/440R、8S/139V/189R/240E/325L/416R、8S/139V/200A/236T/240E/255P/423R、8S/139V/255P/415A/416R、8S/164H、8S/164H/189R/200A/322L/324G/325L/416R/448A、8S/164H/240E/423R、8S/164H/252D/255P/448A、8S/164H/448A、8S/236T/240E/252D/448A、8S/240E/423R、8S/252D/255P/322L/325L/448A、12S/164H/440R、107G/139V、107G/139V/200A/240E/322L/324G/325L/448A、107G/236T/240E/325L/440R、107G/240E/252D/423R/448A、107G/423R、139V、139V/164H/236T/240E、139V/255P/325L/415A/440R、164H/189R、164H/189R/236T/240E、164H/189R/240E/252D/415A/423R、164H/200A/236T、164H/200A/236T/240E/324G/416R/440R、164H/200A/236T/255P/322L/324G/423R/440R、164H/236T、164H/236T/240E/440R、164H/236T/423R、164H/322L/325L、164H/322L/325L/416R/423R、164H/416R/448A、200A/236T/322L/325L/416R、200A/322L/325L/415A/448A、236T/415A/416R、240E、240E/252D/255P/322L/415A/416R、240E/252D/255P/415A/448A、255P/423R、325L及415A/416R/448A,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H2-、G8S、G8S/P107G/I139V/V164H/
G415A/K416R/I440R/K448A、G8S/P107G/I139V/D255P/
V322L/M325L/G415A/K416R/I440R/K448A、G8S/P107G/V164H/D255P、G8S/P107G/V164H/
N423R/I440R、G8S/I139V、G8S/I139V/V164H/
G200A/D236T/N240E/V322L/I440R/K448A、G8S/I139V/V164H/D236T/K416R/N423R/I440R、G8S/I139V/P189R/N240E/M325L/K416R、G8S/I139V/G200A/D236T/N240E/D255P/N423R、G8S/I139V/D255P/G415A/K416R、G8S/V164H、G8S/V164H/P189R/G200A/V322L/H324G/M325L/K416R/K448A、G8S/V164H/N240E/N423R、G8S/V164H/G252D/D255P/K448A、G8S/V164H/K448A、G8S/D236T/N240E/G252D/K448A、G8S/N240E/N423R、G8S/G252D/D255P/V322L/M325L/K448A、T12S/V164H/I440R、P107G/I139V、P107G/I139V/G200A/N240E/V322L/H324G/M325L/K448A、P107G/D236T/N240E/M325L/I440R、P107G/N240E/G252D/N423R/K448A、P107G/N423R、I139V、I139V/V164H/D236T/N240E、I139V/D255P/M325L/G415A/I440R、V164H/P189R、V164H/P189R/D236T/N240E、V164H/P189R/N240E/G252D/G415A/N423R、V164H/G200A/D236T、V164H/G200A/D236T/N240E/
H324G/K416R/I440R、V164H/G200A/D236T/D255P/
V322L/H324G/N423R/I440R、V164H/D236T、V164H/D236T/N240E/I440R、V164H/D236T/N423R、V164H/V322L/M325L、V164H/V322L/M325L/K416R/N423R、V164H/K416R/K448A、G200A/D236T/V322L/M325L/K416R、G200A/V322L/M325L/G415A/K448A、D236T/G415A/K416R、N240E、N240E/G252D/D255P/V322L/G415A/K416R、N240E/G252D/D255P/G415A/K448A、D255P/N423R、M325L及G415A/K416R/K448A,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2、3、8、34、72、73、75、113、114、186、189、221、235、237、239、256、286、299、305、309、312、313、323、355、389、406、422、438及446,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2N、2S、2T、3I、8S、34R、72Y、73A、73P、73T、73V、75H、113I、114V、186G、186I、189S、221K、235M、237L、237M、237V、239A、256I、256L、256S、256T、286L、286S、299A、299L、299R、299V、305G、309R、312S、312T、312V、313D、323P、355A、389F、389G、406F、406G、406N、406Q、422C、422R、422S、438T、446H及446P,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H2N、H2S、H2T、H3I、G8S、K34R、L72Y、H73A、H73P、H73T、H73V、P75H、L113I、Q114V、E186G、E186I、P189S、E221K、Q235M、P237L、P237M、P237V、T239A、E256I、E256L、E256S、E256T、N286L、N286S、E299A、E299L、E299R、E299V、D305G、K309R、L312S、L312T、L312V、E313D、D323P、F355A、D389F、D389G、T406F、T406G、T406N、T406Q、K422C、K422R、K422S、E438T、R446H及R446P,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:20/126/128/155/161、20/126/128/160/161、20/126/128/160/161/198、20/126/128/161、20/126/128/161/198/199、20/126/155/160/198、20/126/155/161、20/126/160、20/126/160/161、20/126/161、20/128/155/160/161/198、20/128/155/161/199、20/128/155/199、20/128/160/161/198、20/155/160、20/155/160/161、20/155/161、20/155/161/199、20/160/161/198、121/126/128/161/369、126/128/155/160/161、126/128/155/160/161/199、126/128/155/161/199、126/128/160/161/369、126/128/160/198/369、126/128/160/199/369、126/128/160/369、126/128/161/199/369、126/128/161/369、126/128/369、126/160/161/199/369、126/160/198/369、126/196/198/369、126/198/369、126/199/369、126/369、128/155/160/161、128/155/160/161/199、128/155/160/198、128/155/199、128/160/161/369、128/161/199/369、128/198/199/369、128/199/369、128/369、155/161/198/199、155/199、160/161/369、161/198/369、161/369及199/369,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:20Y/126H/128A/155R/161T、20Y/126H/128A/161T、20Y/126H/155R/160S/198P、20Y/126H/160S、20Y/126H/160S/161T、20Y/126Q/128A/160S/161T、20Y/126Q/128A/160S/161T/198H、20Y/126Q/128A/161T/198H/199A、20Y/126Q/155R/161G、20Y/126Q/161G、20Y/128A/155R/160S/161T/198H、20Y/128A/155R/161T/199A、20Y/128A/155R/199A、20Y/128A/160S/161T/198P、20Y/155R/160S、20Y/155R/160S/161G、20Y/155R/161T、20Y/155R/161T/199A、20Y/160S/161T/198H、121F/126H/128A/161T/369N、126H/128A/155R/160S/161T、126H/128A/160S/198H/369N、126H/128A/161G/199A/369N、126H/128A/161G/369N、126H/128A/369N、126H/160S/161G/199A/369N、126H/160S/198P/369N、126H/196V/198P/369N、126Q/128A/155R/160S/161T/199A、126Q/128A/155R/161G/199A、126Q/128A/160S/161T/369N、126Q/128A/160S/199A/369N、126Q/128A/160S/369N、126Q/198P/369N、126Q/199A/369N、126Q/369N、128A/155R/160S/161T、128A/155R/160S/161T/199A、128A/155R/160S/198P、128A/155R/199A、128A/160S/161G/369N、128A/161G/199A/369N、128A/198H/199A/369N、128A/199A/369N、128A/369N、155R/161G/198H/199A、155R/199A、160S/161G/369N、160S/161T/369N、161T/198P/369N、161T/369N及199A/369N,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:W20Y/L126H/P128A/F155R/R161T、W20Y/L126H/P128A/R161T、W20Y/L126H/F155R/K160S/G198P、W20Y/L126H/K160S、W20Y/L126H/K160S/R161T、W20Y/L126Q/P128A/K160S/R161T、W20Y/L126Q/P128A/K160S/R161T/G198H、W20Y/L126Q/P128A/R161T/G198H/N199A、W20Y/L126Q/F155R/R161G、W20Y/L126Q/R161G、W20Y/P128A/F155R/K160S/R161T/G198H、W20Y/P128A/F155R/R161T/N199A、W20Y/P128A/F155R/N199A、W20Y/P128A/K160S/R161T/G198P、W20Y/F155R/K160S、W20Y/F155R/K160S/R161G、W20Y/F155R/R161T、W20Y/F155R/R161T/N199A、W20Y/K160S/R161T/G198H、V121F/L126H/P128A/R161T/P369N、L126H/P128A/F155R/K160S/R161T、L126H/P128A/K160S/G198H/P369N、L126H/P128A/R161G/N199A/P369N、L126H/P128A/R161G/P369N、L126H/P128A/P369N、L126H/K160S/R161G/N199A/P369N、L126H/K160S/G198P/P369N、L126H/A196V/G198P/P369N、L126Q/P128A/F155R/K160S/R161T/N199A、L126Q/P128A/F155R/R161G/N199A、L126Q/P128A/K160S/R161T/P369N、L126Q/P128A/K160S/N199A/P369N、L126Q/P128A/K160S/P369N、L126Q/G198P/P369N、L126Q/N199A/P369N、L126Q/P369N、P128A/F155R/K160S/R161T、P128A/F155R/K160S/R161T/N199A、P128A/F155R/K160S/G198P、P128A/F155R/N199A、P128A/K160S/R161G/P369N、P128A/R161G/N199A/P369N、P128A/G198H/N199A/P369N、P128A/N199A/P369N、P128A/P369N、F155R/R161G/G198H/N199A、F155R/N199A、K160S/R161G/P369N、K160S/R161T/P369N、R161T/G198P/P369N、R161T/P369N及N199A/P369N,其中該位置係根據序列辨識編號:3082予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:3182、3184、3186、3188、3190、3192、3194、3196、3198、3200、3202、3204、3206、3208、3210、3212、3214、3216、3218、3220、3222、3224、3226、3228、3230、3232、3234、3236、3238、3240、3242、3244、3246、3248、3250、3252、3254、3256、3258、3260、3262、3264、3266、3268、3270、3272、3274、3276、3278、3280、3282、3284、3286、3288、3290、3292、3294、3296、3298、3300、3302、3304、3306、3308、3310、3312、3314、3316、3318、3320、3322、3324、3326、3328、3330、3332、3334、3336、3338、3340、3342、3344、3346、3348、3350、3352、3354、3356、3358、3360、3362、3364、3366、3368、3370、3372、3374、3376、3378、3380、3382、3384、3386、3388、3390、3392、3394、3396、3398、3400、3402、3404、3406、3408、3410、3412、3414、3416、3418、3420、3422、3424、3426、3428、3430、3432、3434、3436、3438、3440、3442、3444、3446、3448、3450、3452、3454、3456、3458、3460、3462、3464、3466、3468、3470、3472、3474、3476、3478、3480、3482、3484、3486、3488及3490。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:3182、3184、3186、3188、3190、3192、3194、3196、3198、3200、3202、3204、3206、3208、3210、3212、3214、3216、3218、3220、3222、3224、3226、3228、3230、3232、3234、3236、3238、3240、3242、3244、3246、3248、3250、3252、3254、3256、3258、3260、3262、3264、3266、3268、3270、3272、3274、3276、3278、3280、3282、3284、3286、3288、3290、3292、3294、3296、3298、3300、3302、3304、3306、3308、3310、3312、3314、3316、3318、3320、3322、3324、3326、3328、3330、3332、3334、3336、3338、3340、3342、3344、3346、3348、3350、3352、3354、3356、3358、3360、3362、3364、3366、3368、3370、3372、3374、3376、3378、3380、3382、3384、3386、3388、3390、3392、3394、3396、3398、3400、3402、3404、3406、3408、3410、3412、3414、3416、3418、3420、3422、3424、3426、3428、3430、3432、3434、3436、3438、3440、3442、3444、3446、3448、3450、3452、3454、3456、3458、3460、3462、3464、3466、3468、3470、3472、3474、3476、3478、3480、3482、3484、3486、3488及3490。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:3182、3184、3186、3188、3190、3192、3194、3196、3198、3200、3202、3204、3206、3208、3210、3212、3214、3216、3218、3220、3222、3224、3226、3228、3230、3232、3234、3236、3238、3240、3242、3244、3246、3248、3250、3252、3254、3256、3258、3260、3262、3264、3266、3268、3270、3272、3274、3276、3278、3280、3282、3284、3286、3288、3290、3292、3294、3296、3298、3300、3302、3304、3306、3308、3310、3312、3314、3316、3318、3320、3322、3324、3326、3328、3330、3332、3334、3336、3338、3340、3342、3344、3346、3348、3350、3352、3354、3356、3358、3360、3362、3364、3366、3368、3370、3372、3374、3376、3378、3380、3382、3384、3386、3388、3390、3392、3394、3396、3398、3400、3402、3404、3406、3408、3410、3412、3414、3416、3418、3420、3422、3424、3426、3428、3430、3432、3434、3436、3438、3440、3442、3444、3446、3448、3450、3452、3454、3456、3458、3460、3462、3464、3466、3468、3470、3472、3474、3476、3478、3480、3482、3484、3486、3488及3490。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:106/164/172/200/409、106/164/172/210/240/415、106/164/172/242/409/416、106/164/200/210/242、106/164/200/210/415、106/164/200/240/408/409/416、106/164/210/240/408/409/416、106/164/210/408/409、106/164/240/415、106/164/409/415/423、106/172/200/210/240/242/408/415/416/423、106/172/200/210/242、106/172/240、106/172/240/242/409/415、106/172/242、106/172/242/416/423、106/172/408/409、106/172/409/423、106/200/210/409、106/210/240、106/210/240/408/415、106/240/242、106/240/242/409、106/242/408/409、164/172/200/210/242/409、164/172/240/242/415、164/172/242/408、164/200/408/415/416、164/240/242/408、164/240/242/415/423、164/423、172/200/210/240/408、172/200/240、172/200/408/416、172/210/415、172/240、172/240/242/415、172/240/409、200/210/240/242/409、200/240/242/407、200/242/415/416/423、200/408/409、210/240、240、240/242、240/242/408/416、240/242/415/423、240/408、240/415及409/415,其中該位置係根據序列辨識編號:3244予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:106A/164H/172R/200A/409L、106A/164H/172R/210V/240E/415R、106A/164H/172R/242I/409L/416R、106A/164H/200A/210V/242I、106A/164H/200A/210V/415A、106A/164H/200A/240E/408P/409L/416R、106A/164H/210V/240E/408P/409L/416R、106A/164H/210V/408P/409L、106A/164H/240E/415A、106A/164H/409L/415A/423R、106A/172R/200A/210V/240E/242I/408P/415A/416R/423R、106A/172R/200A/210V/242I、106A/172R/240E、106A/172R/240E/242I/409L/415R、106A/172R/242I、106A/172R/242I/416R/423R、106A/172R/408P/409L、106A/172R/409L/423R、106A/200A/210V/409L、106A/210V/240E、106A/210V/240E/408P/415R、106A/240E/242I、106A/240E/242I/409L、106A/242I/408P/409L、164H/172R/200A/210V/242I/409L、164H/172R/240E/242I/415R、164H/172R/242I/408P、164H/200A/408P/415A/416R、164H/240E/242I/408P、164H/240E/242I/415R/423R、164H/423R、172R/200A/210V/240E/408P、172R/200A/240E、172R/200A/408P/416R、172R/210V/415A、172R/240E、172R/240E/242I/415R、172R/240E/409L、200A/210V/240E/242I/409L、200A/240E/242I/407S、200A/242I/415A/416R/423R、200A/408P/409L、210V/240E、240E、240E/242I、240E/242I/408P/416R、240E/242I/415A/423R、240E/408P、240E/415R及409L/415R,其中該位置係根據序列辨識編號:3244予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:K106A/V164H/N172R/G200A/T409L、K106A/V164H/N172R/E210V/N240E/G415R、K106A/V164H/N172R/A242I/T409L/K416R、K106A/V164H/G200A/E210V/A242I、K106A/V164H/G200A/E210V/G415A、K106A/V164H/G200A/N240E/E408P/T409L/K416R、K106A/V164H/E210V/N240E/E408P/T409L/K416R、K106A/V164H/E210V/E408P/T409L、K106A/V164H/N240E/G415A、K106A/V164H/T409L/G415A/N423R、K106A/N172R/G200A/E210V/N240E/A242I/E408P/G415A/K416R/N423R、K106A/N172R/G200A/E210V/A242I、K106A/N172R/N240E、K106A/N172R/N240E/A242I/T409L/G415R、K106A/N172R/A242I、K106A/N172R/A242I/K416R/N423R、K106A/N172R/E408P/T409L、K106A/N172R/T409L/N423R、K106A/G200A/E210V/T409L、K106A/E210V/N240E、K106A/E210V/N240E/E408P/G415R、K106A/N240E/A242I、K106A/N240E/A242I/T409L、K106A/A242I/E408P/T409L、V164H/N172R/G200A/E210V/A242I/T409L、V164H/N172R/N240E/A242I/G415R、V164H/N172R/A242I/E408P、V164H/G200A/E408P/G415A/K416R、V164H/N240E/A242I/E408P、V164H/N240E/A242I/G415R/N423R、V164H/N423R、N172R/G200A/E210V/N240E/E408P、N172R/G200A/N240E、N172R/G200A/E408P/K416R、N172R/E210V/G415A、N172R/N240E、N172R/N240E/A242I/G415R、N172R/N240E/T409L、G200A/E210V/N240E/A242I/T409L、G200A/N240E/A242I/G407S、G200A/A242I/G415A/K416R/N423R、G200A/E408P/T409L、E210V/N240E、N240E、N240E/A242I、N240E/A242I/E408P/K416R、N240E/A242I/G415A/N423R、N240E/E408P、N240E/G415R及T409L/G415R,其中該位置係根據序列辨識編號:3244予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14、35、42、46、49、105、134、143、179、181、232、278、290、336、373、381、401及441,其中該位置係根據序列辨識編號:3244予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14K、35D、42F、42I、42V、46T、46V、49A、49M、49P、49Q、49S、105A、134A、134C、134S、143P、179A、179D、179T、181L、232T、278I、278L、290L、336A、373R、381G、401V、441I及441R,其中該位置係根據序列辨識編號:3244予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:R14K、Q35D、L42F、L42I、L42V、C46T、C46V、L49A、L49M、L49P、L49Q、L49S、S105A、V134A、V134C、V134S、K143P、V179A、V179D、V179T、M181L、P232T、V278I、V278L、I290L、S336A、K373R、A381G、L401V、Q441I及Q441R,其中該位置係根據序列辨識編號:3244予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:3492、3494、3496、3498、3500、3502、3504、3506、3508、3510、3512、3514、3516、3518、3520、3522、3524、3526、3528、3530、3532、3534、3536、3538、3540、3542、3544、3546、3548、3550、3552、3554、3556、3558、3560、3562、3564、3566、3568、3570、3572、3574、3576、3578、3580、3582、3584、3586、3588、3590、3592、3594、3596、3598、3600、3602、3604、3606、3608、3610、3612、3614、3616、3618、3620、3622、3624、3626、3628、3630、3632、3634、3636、3638、3640、3642、3644、3646、3648、3650及3652。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:3492、3494、3496、3498、3500、3502、3504、3506、3508、3510、3512、3514、3516、3518、3520、3522、3524、3526、3528、3530、3532、3534、3536、3538、3540、3542、3544、3546、3548、3550、3552、3554、3556、3558、3560、3562、3564、3566、3568、3570、3572、3574、3576、3578、3580、3582、3584、3586、3588、3590、3592、3594、3596、3598、3600、3602、3604、3606、3608、3610、3612、3614、3616、3618、3620、3622、3624、3626、3628、3630、3632、3634、3636、3638、3640、3642、3644、3646、3648、3650及3652。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:3492、3494、3496、3498、3500、3502、3504、3506、3508、3510、3512、3514、3516、3518、3520、3522、3524、3526、3528、3530、3532、3534、3536、3538、3540、3542、3544、3546、3548、3550、3552、3554、3556、3558、3560、3562、3564、3566、3568、3570、3572、3574、3576、3578、3580、3582、3584、3586、3588、3590、3592、3594、3596、3598、3600、3602、3604、3606、3608、3610、3612、3614、3616、3618、3620、3622、3624、3626、3628、3630、3632、3634、3636、3638、3640、3642、3644、3646、3648、3650及3652。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:21、91、125、127、130/187、143、143/150、145、152、156、186、187、195、197、200、201、202、264、268、364、365及415,其中該位置係根據序列辨識編號:3346予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:21M、21P、91M、125C、125M、125V、127G、130T/187Q、143H、143P/150S、145W、152L、156P、156Q、186N、186V、187S、195F、195G、195R、195S、195T、195Y、197D、197L、197Q、197W、200E、200P、200R、200T、201A、201R、201S、201W、202A、202W、264S、264T、268F、268Q、268W、364S、364W、365L及415D,其中該位置係根據序列辨識編號:3346予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:L21M、L21P、P91M、F125C、F125M、F125V、Q127G、A130T/K187Q、K143H、K143P/A150S、L145W、F152L、F156P、F156Q、E186N、E186V、K187S、L195F、L195G、L195R、L195S、L195T、L195Y、P197D、P197L、P197Q、P197W、G200E、G200P、G200R、G200T、G201A、G201R、G201S、G201W、I202A、I202W、F264S、F264T、Y268F、Y268Q、Y268W、M364S、M364W、Q365L及G415D,其中該位置係根據序列辨識編號:3346予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:3760、3762、3764、3766、3768、3770、3772、3774、3776、3778、3780、3782、3784、3786、3788、3790、3792、3794、3796、3798、3800、3802、3804、3806、3808、3810、3812、3814、3816、3818、3820、3822、3824、3826、3828、3830、3832、3834、3836、3838、3840、3842、3844、3846、3848及3850。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:3760、3762、3764、3766、3768、3770、3772、3774、3776、3778、3780、3782、3784、3786、3788、3790、3792、3794、3796、3798、3800、3802、3804、3806、3808、3810、3812、3814、3816、3818、3820、3822、3824、3826、3828、3830、3832、3834、3836、3838、3840、3842、3844、3846、3848及3850。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:3760、3762、3764、3766、3768、3770、3772、3774、3776、3778、3780、3782、3784、3786、3788、3790、3792、3794、3796、3798、3800、3802、3804、3806、3808、3810、3812、3814、3816、3818、3820、3822、3824、3826、3828、3830、3832、3834、3836、3838、3840、3842、3844、3846、3848及3850。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/5/113/186/237/406、2/73/186/237、2/189/286、2/286/355/416/422、5/34/73/113/406、5/73/186/406、5/113/237/406、5/186/237/245/256/406、5/186/237/406、5/256/406、34/113/186/237/406、72/73/172/235/240/242/438、72/172/239/240/242/408、72/172/240/242、73/172、73/172/235/239/240、73/172/235/239/242、73/172/239/240、73/172/239/240/242、73/172/240/242/408、73/172/240/408、73/186/237/406、73/235/240/323、73/235/240/408、73/237、73/239/242、113/186/406、172、172/188/323、172/235、172/235/239/240/242、172/235/239/408、172/235/240、172/235/240/242/438、172/239/240/242/323/408、172/240、172/240/299/323、186、186/237、186/237/286、186/406、189/333/355/421、235/239/240、235/240/242、237、239/240、239/240/242/256/323、239/240/242/323/408、239/240/408、239/242/408、240/242/256/438及242/408,其中該位置係根據序列辨識編號:3502予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2-/5N/113I/186G/237V/406Q、2-/73A/186G/237V、2S/189S/286Q、2S/286Q/355A/416R/422R、5N/34R/73A/113I/406N、5N/73A/186G/406N、5N/113I/237V/406N、5N/186G/237V/245T/256I/406Q、5N/186G/237V/406Q、5N/256L/406Q、34R/113I/186G/237L/406N、72Y/73P/172R/235M/240E/242I/438T、72Y/172R/239A/240E/242I/408P、72Y/172R/240E/242I、73A/186G/237L/406Q、73A/237V、73P/172R、73P/172R/235M/239A/240E、73P/172R/235M/239A/242I、73P/172R/239A/240E、73P/172R/239A/240E/242I、73P/172R/240E/242I/408P、73P/172R/240E/408P、73P/235M/240E/323P、73P/235M/240E/408P、73P/239A/242I、113I/186G/406Q、172R、172R/188G/323P、172R/235M、172R/235M/239A/240E/242I、172R/235M/239A/408P、172R/235M/240E、172R/235M/240E/242I/438T、172R/239A/240E/242I/323P/408P、172R/240E、172R/240E/299A/323P、186G、186G/237L、186G/237V/286S、186G/406N、186G/406Q、189S/333H/355A/421Q、235M/239A/240E、235M/240E/242I、237L、239A/240E、239A/240E/242I/256S/323P、239A/240E/242I/323P/408P、239A/240E/408P、239A/242I/408P、240E/242I/256S/438T及242I/408P,其中該位置係根據序列辨識編號:3502予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H2-/H5N/L113I/E186G/P237V/T406Q、H2-/H73A/E186G/P237V、H2S/P189S/N286Q、H2S/N286Q/F355A/K416R/K422R、H5N/K34R/H73A/L113I/T406N、H5N/H73A/E186G/T406N、H5N/L113I/P237V/T406N、H5N/E186G/P237V/K245T/E256I/T406Q、H5N/E186G/P237V/T406Q、H5N/E256L/T406Q、K34R/L113I/E186G/P237L/T406N、L72Y/H73P/N172R/Q235M/N240E/A242I/E438T、L72Y/N172R/T239A/N240E/A242I/E408P、L72Y/N172R/N240E/A242I、H73A/E186G/P237L/T406Q、H73A/P237V、H73P/N172R、H73P/N172R/Q235M/T239A/N240E、H73P/N172R/Q235M/T239A/A242I、H73P/N172R/T239A/N240E、H73P/N172R/T239A/N240E/A242I、H73P/N172R/N240E/A242I/E408P、H73P/N172R/N240E/E408P、H73P/Q235M/N240E/D323P、H73P/Q235M/N240E/E408P、H73P/T239A/A242I、L113I/E186G/T406Q、N172R、N172R/E188G/D323P、N172R/Q235M、N172R/Q235M/T239A/N240E/A242I、N172R/Q235M/T239A/E408P、N172R/Q235M/N240E、N172R/Q235M/N240E/A242I/E438T、N172R/T239A/N240E/A242I/D323P/E408P、N172R/N240E、N172R/N240E/E299A/D323P、E186G、E186G/P237L、E186G/P237V/N286S、E186G/T406N、E186G/T406Q、P189S/N333H/F355A/S421Q、Q235M/T239A/N240E、Q235M/N240E/A242I、P237L、T239A/N240E、T239A/N240E/A242I/E256S/D323P、T239A/N240E/A242I/D323P/E408P、T239A/N240E/E408P、T239A/A242I/E408P、N240E/A242I/E256S/E438T及A242I/E408P,其中該位置係根據序列辨識編號:3502予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:96、127、132、144、153、155、156、186、187、196、199及200,其中該位置係根據序列辨識編號:3502予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:96A、96P、127I、127L、127V、132H、132K、132T、144V、153A、153G、155M、156W、186A、186G、186R、187A、187R、187T、196S、199A、199S、199Y及200S,其中該位置係根據序列辨識編號:3502予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:G96A、G96P、Q127I、Q127L、Q127V、Q132H、Q132K、Q132T、I144V、S153A、S153G、F155M、F156W、E186A、E186G、E186R、K187A、K187R、K187T、A196S、N199A、N199S、N199Y及A200S,其中該位置係根據序列辨識編號:3502予以編號。
在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:3654、3656、3658、3660、3662、3664、3666、3668、3670、3672、3674、3676、3678、3680、3682、3684、3686、3688、3690、3692、3694、3696、3698、3700、3702、3704、3706、3708、3710、3712、3714、3716、3718、3720、3722、3724、3726、3728、3730、3732、3734、3736、3738、3740、3742、3744、3746、3748、3750、3752、3754、3756、3758、3852、3854、3856、3858、3860、3862、3864、3866、3868、3870、3872、3874、3876、3878、3880、3882、3884、3886、3888、3890、3892、3894、3896及3898。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:3654、3656、3658、3660、3662、3664、3666、3668、3670、3672、3674、3676、3678、3680、3682、3684、3686、3688、3690、3692、3694、3696、3698、3700、3702、3704、3706、3708、3710、3712、3714、3716、3718、3720、3722、3724、3726、3728、3730、3732、3734、3736、3738、3740、3742、3744、3746、3748、3750、3752、3754、3756、3758、3852、3854、3856、3858、3860、3862、3864、3866、3868、3870、3872、3874、3876、3878、3880、3882、3884、3886、3888、3890、3892、3894、3896及3898。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:3654、3656、3658、3660、3662、3664、3666、3668、3670、3672、3674、3676、3678、3680、3682、3684、3686、3688、3690、3692、3694、3696、3698、3700、3702、3704、3706、3708、3710、3712、3714、3716、3718、3720、3722、3724、3726、3728、3730、3732、3734、3736、3738、3740、3742、3744、3746、3748、3750、3752、3754、3756、3758、3852、3854、3856、3858、3860、3862、3864、3866、3868、3870、3872、3874、3876、3878、3880、3882、3884、3886、3888、3890、3892、3894、3896及3898。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/5/35/105/143/237/373/416/422、2/5/35/143/232/237/416/422/441、2/5/35/232/278/373/416、2/5/105/143/232/373/416/422、2/5/278、2/105/143/232/237/278/373/441、2/143/232/373/441、2/143/373/441、5/35/232/373/416/422、5/105/232/237/373/416/441、5/105/237/278/422/441、5/105/237/416/422/441、5/143/189/232/237/441、5/143/232/237/278、5/143/232/237/416/422、5/143/232/373/422/441、5/143/237/278/373/416/422、5/143/373、5/189/237/278/373/416/422/441、5/232/416/422、5/237/373/422、5/373/416、26/42、26/42/46/49、26/42/46/49/134、26/42/46/49/134/186、26/42/46/134、26/42/49/134、26/42/49/134/186/355、26/42/49/134/401、26/42/134/401、26/49/134、26/134、26/134/186/355/401、26/134/355、26/134/401、26/355/401、35、35/105/189/232/373/416、42/46/49/97/134/401、42/46/49/134、42/46/49/134/186、42/46/49/134/186/355、42/46/49/134/235/355/401、42/46/49/134/401、42/46/49/186、42/49/134/186/355、42/49/134/186/401、42/49/134/355/401、42/134/186、42/186/355、46/49/134、49/134/355、105/143/232/237/373/416/422/441、105/143/278/373、105/189/237、105/237/278/373/416/422、105/237/373/422/441、105/373、105/373/441、134/401、143、143/189、143/189/232/422/441、143/189/237/373/416/422、143/232、143/237、143/237/422/441、186/355、189/232/373/416/422/441、189/237/278/416/441、232/237、237/373、237/373/441及237/422,其中該位置係根據序列辨識編號:3696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2-/5N/35D/105A/143P/237V/373R/416R/422R、2-/5N/35D/143P/232T/237L/416R/422R/441R、2-/5N/35D/232T/278L/373R/416R、2-/5N/105A/143P/232T/373R/416R/422R、2-/5N/278L、2-/105A/143P/232T/237L/278L/373R/441R、2-/143P/232T/373R/441R、2-/143P/373R/441R、5N/35D/232T/373R/416R/422R、5N/105A/232T/237L/373R/416R/441R、5N/105A/237L/278I/422R/441R、5N/105A/237V/416R/422R/441R、5N/143P/189S/232T/237V/441R、5N/143P/232T/237L/278L、5N/143P/232T/237L/416R/422R、5N/143P/232T/373R/422R/441R、5N/143P/237L/278L/373R/416R/422R、5N/143P/373R、5N/189S/237V/278I/373R/416R/422R/441R、5N/232T/416R/422R、5N/237L/373R/422R、5N/373R/416R、26V/42I/49Q/134C/186G/355A、26V/42I/49Q/134C/401V、26V/42V、26V/42V/46V/49A、26V/42V/46V/49A/134A、26V/42V/46V/49A/134C/186G、26V/42V/46V/134A、26V/42V/49S/134C、26V/42V/134C/401V、26V/49Q/134A、26V/134A、26V/134A/186G/355A/401V、26V/134C/355A、26V/134T/401V、26V/355A/401V、35D、35D/105A/189S/232T/373R/416R、42I/46V/49A/134A、42I/46V/49S/134C/186G、42I/46V/49S/186G、42V/46V/49A/134A/401V、42V/46V/49A/134T/186G/355A、42V/46V/49P/134C/235R/355A/401V、42V/46V/49S/97P/134C/401V、42V/49A/134C/186G/355A、42V/49S/134A/186G/401V、42V/49S/134C/355A/401V、42V/134C/186G、42V/186G/355A、46V/49Q/134T、49S/134C/355A、105A/143P/232T/237V/373R/416R/422R/441R、105A/143P/278L/373R、105A/189S/237V、105A/237L/278L/373R/416R/422R、105A/237L/373R/422R/441R、105A/373R、105A/373R/441R、134C/401V、143P、143P/189S、143P/189S/232T/422R/441R、143P/189S/237L/373R/416R/422R、143P/232T、143P/237L/422R/441R、143P/237V、186G/355A、189S/232T/373R/416R/422R/441R、189S/237L/278I/416R/441R、232T/237L、237L/422R、237V/373R及237V/373R/441R,其中該位置係根據序列辨識編號:3696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H2-/H5N/Q35D/S105A/K143P/P237V/K373R/K416R/K422R、H2-/H5N/Q35D/K143P/P232T/P237L/K416R/K422R/Q441R、H2-/H5N/Q35D/P232T/V278L/K373R/K416R、H2-/H5N/S105A/K143P/P232T/K373R/K416R/K422R、H2-/H5N/V278L、H2-/S105A/K143P/P232T/P237L/
V278L/K373R/Q441R、H2-/K143P/P232T/K373R/Q441R、H2-/K143P/K373R/Q441R、H5N/Q35D/P232T/K373R/K416R/K422R、H5N/S105A/P232T/P237L/K373R/K416R/Q441R、H5N/S105A/P237L/V278I/K422R/Q441R、H5N/S105A/P237V/K416R/K422R/Q441R、H5N/K143P/P189S/P232T/P237V/Q441R、H5N/K143P/P232T/P237L/V278L、H5N/K143P/P232T/P237L/K416R/K422R、H5N/K143P/P232T/K373R/K422R/Q441R、H5N/K143P/P237L/V278L/K373R/K416R/K422R、H5N/K143P/K373R、H5N/P189S/P237V/V278I/
K373R/K416R/K422R/Q441R、H5N/P232T/K416R/K422R、H5N/P237L/K373R/K422R、H5N/K373R/K416R、I26V/L42I/L49Q/V134C/E186G/F355A、I26V/L42I/L49Q/V134C/L401V、I26V/L42V、I26V/L42V/C46V/L49A、I26V/L42V/C46V/L49A/V134A、I26V/L42V/C46V/L49A/V134C/E186G、I26V/L42V/C46V/V134A、I26V/L42V/L49S/V134C、I26V/L42V/V134C/L401V、I26V/L49Q/V134A、I26V/V134A、I26V/V134A/E186G/F355A/L401V、I26V/V134C/F355A、I26V/V134T/L401V、I26V/F355A/L401V、Q35D、Q35D/S105A/P189S/P232T/K373R/K416R、L42I/C46V/L49A/V134A、L42I/C46V/L49S/V134C/E186G、L42I/C46V/L49S/E186G、L42V/C46V/L49A/V134A/L401V、L42V/C46V/L49A/V134T/E186G/F355A、L42V/C46V/L49P/V134C/Q235R/F355A/L401V、L42V/C46V/L49S/T97P/V134C/L401V、L42V/L49A/V134C/E186G/F355A、L42V/L49S/V134A/E186G/L401V、L42V/L49S/V134C/F355A/L401V、L42V/V134C/E186G、L42V/E186G/F355A、C46V/L49Q/V134T、L49S/V134C/F355A、S105A/K143P/P232T/P237V/K373R/K416R/K422R/Q441R、S105A/K143P/V278L/K373R、S105A/P189S/P237V、S105A/P237L/V278L/K373R/K416R/K422R、S105A/P237L/K373R/K422R/Q441R、S105A/K373R、S105A/K373R/Q441R、V134C/L401V、K143P、K143P/P189S、K143P/P189S/P232T/K422R/Q441R、K143P/P189S/P237L/K373R/K416R/K422R、K143P/P232T、K143P/P237L/K422R/Q441R、K143P/P237V、E186G/F355A、P189S/P232T/K373R/K416R/K422R/Q441R、P189S/P237L/V278I/K416R/Q441R、P232T/P237L、P237L/K422R、P237V/K373R及P237V/K373R/Q441R,其中該位置係根據序列辨識編號:3696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:3、8、50、61、62、101、137、158、161、164、176、193、223、223/243、235、237、239、240、243、244、248、249、301、323、330、352、364、426及427,其中該位置係根據序列辨識編號:3696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:3N、8R、8V、50P、50V、61N、61Y、62A、101L、137R、158W、161L、164A、164E、164F、164L、176P、176Q、176T、193F、223A、223L/243G、235R、237A、237L、239F、239G、239M、239P、239Q、239Y、240V、243G、243H、243R、243S、243Y、244N、248T、249G、249H、301A、323T、330C、352A、364Q、426L、427S及427T,其中該位置係根據序列辨識編號:3696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H3N、S8R、S8V、I50P、I50V、E61N、E61Y、K62A、A101L、Q137R、F158W、R161L、H164A、H164E、H164F、H164L、R176P、R176Q、R176T、D193F、T223A、T223L/D243G、Q235R、P237A、P237L、T239F、T239G、T239M、T239P、T239Q、T239Y、E240V、D243G、D243H、D243R、D243S、D243Y、D244N、I248T、D249G、D249H、Q301A、D323T、H330C、S352A、M364Q、A426L、R427S及R427T,其中該位置係根據序列辨識編號:3696予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:3900、3902、3904、3906、3908、3910、3912、3914、3916、3918、3920、3922、3924、3926、3928、3930、3932、3934、3936、3938、3940、3942、3944、3946、3948、3950、3952、3954、3956、3958、3960、3962、3964、3966、3968、3970、3972、3974、3976、3978、3980、3982、3984、3986、3988、3990、3992、3994、3996、3998、4000、4002、4004、4006、4008、4010、4012、4014、4016、4018、4020、4022、4024、4026、4028、4030、4032、4034、4036、4038、4040、4042、4044、4046、4048、4050、4052、4054、4056、4058、4060、4062、4064、4066、4068、4070、4072、4074、4076、4078、4080、4082、4084、4086、4088、4090、4092、4094、4096、4098、4100、4102、4104、4106、4108、4110、4112、4114、4116、4118、4120、4122、4124、4126、4128、4130、4132、4134、4136、4138、4140、4142、4144及4146。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:3900、3902、3904、3906、3908、3910、3912、3914、3916、3918、3920、3922、3924、3926、3928、3930、3932、3934、3936、3938、3940、3942、3944、3946、3948、3950、3952、3954、3956、3958、3960、3962、3964、3966、3968、3970、3972、3974、3976、3978、3980、3982、3984、3986、3988、3990、3992、3994、3996、3998、4000、4002、4004、4006、4008、4010、4012、4014、4016、4018、4020、4022、4024、4026、4028、4030、4032、4034、4036、4038、4040、4042、4044、4046、4048、4050、4052、4054、4056、4058、4060、4062、4064、4066、4068、4070、4072、4074、4076、4078、4080、4082、4084、4086、4088、4090、4092、4094、4096、4098、4100、4102、4104、4106、4108、4110、4112、4114、4116、4118、4120、4122、4124、4126、4128、4130、4132、4134、4136、4138、4140、4142、4144及4146。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:3900、3902、3904、3906、3908、3910、3912、3914、3916、3918、3920、3922、3924、3926、3928、3930、3932、3934、3936、3938、3940、3942、3944、3946、3948、3950、3952、3954、3956、3958、3960、3962、3964、3966、3968、3970、3972、3974、3976、3978、3980、3982、3984、3986、3988、3990、3992、3994、3996、3998、4000、4002、4004、4006、4008、4010、4012、4014、4016、4018、4020、4022、4024、4026、4028、4030、4032、4034、4036、4038、4040、4042、4044、4046、4048、4050、4052、4054、4056、4058、4060、4062、4064、4066、4068、4070、4072、4074、4076、4078、4080、4082、4084、4086、4088、4090、4092、4094、4096、4098、4100、4102、4104、4106、4108、4110、4112、4114、4116、4118、4120、4122、4124、4126、4128、4130、4132、4134、4136、4138、4140、4142、4144及4146。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:5/73/113/186/187/373/423、5/73/143/144/179/186/187/422、5/73/144/179/186/373/423、5/73/144/187/373/422、5/143/144/179/181/186/187/373、5/144/179/181/373/422、5/144/373/422、49/96/127/132/156/196、49/96/127/153/278、49/96/132/153/155/156/237/278/406、49/96/132/153/199/200、49/96/132/155、49/96/132/155/237/278、49/96/155/199/200/406、49/153/155、73/113/143/179/181/422、73/113/179/181/186/187、73/143/144/179/186/187/373/423、73/179/181/186/187/373、73/179/181/186/373/422、73/181/186/187、96/127/132/153/278、96/127/153/155、96/132/153/155、96/132/153/155/156、96/132/153/155/156/200、96/132/153/156、96/132/196/199、96/132/278、96/153/155/156、96/153/155/199/200/237、96/153/406、113/143/179/186/187、113/144/186/423、113/144/373、113/181/186/373/422、113/373/422、127/132、127/132/153/156、127/132/155/156/406、127/153/155/199/200/237、127/406、132/153/155、132/153/237/406、132/155、132/237、143/144/179/181/186/187/422、143/179/181/186/187/422/423、144/179/181/186/187/373、144/179/186/187/373、153/155/156/237、153/155/196/199/237、153/199/406、153/237、155/199、179/181/186、179/181/186/187/423、179/186/187、179/187/373/422、181/186/187/422/423及373/423,其中該位置係根據序列辨識編號:3956予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:5N/73A/113I/186G/187R/373R/423R、5N/73A/143P/144V/179D/186G/187R/422R、5N/73A/144V/179D/186A/373R/423R、5N/73A/144V/187R/373R/422R、5N/143P/144V/179T/181L/186G/187R/373R、5N/144V/179T/181L/373R/422R、5N/144V/373R/422R、49S/96A/127I/132K/156W/196S、49S/96A/132H/153A/199S/200S、49S/96P/127I/153A/278L、49S/96P/132H/153A/155M/156W/237L/278L/406Q、49S/96P/132H/155M、49S/96P/132K/155M/237L/278L、49S/96P/155M/199S/200S/406Q、49S/153A/155M、73A/113I/143P/179T/181L/422R、73A/113I/179T/181L/186A/187R、73A/143P/144V/179D/186G/187T/373R/423R、73A/179D/181L/186A/373R/422R、73A/179D/181L/186G/187R/373R、73A/181L/186A/187T、96A/132H/153A/156W、96A/132K/153A/155M/156W、96A/132K/153A/155M/156W/200S、96A/153A/155M/156W、96P/127I/132H/153A/278L、96P/127I/153A/155M、96P/132H/153A/155M/156W、96P/132H/196S/199S、96P/132K/153A/155M、96P/132K/278L、96P/153A/155M/199S/200S/237L、96P/153A/406Q、113I/143P/179D/186G/187R、113I/144V/186G/423R、113I/144V/373R、113I/181L/186A/373R/422R、113I/373R/422R、127I/132H、127I/132H/153A/156W、127I/132H/155M/156W/406Q、127I/153A/155M/199S/200S/237L、127I/406Q、132H/153A/237L/406Q、132H/155M、132K/153A/155M、132K/237L、143P/144V/179T/181L/186G/187R/422R、143P/179T/181L/186G/187R/422R/423R、144V/179T/181L/186A/187R/373R、144V/179T/186A/187T/373R、153A/155M/156W/237L、153A/155M/196S/199S/237L、153A/199S/406Q、153A/237L、155M/199S、179D/181L/186G/187R/423R、179D/187T/373R/422R、179T/181L/186A、179T/186A/187T、181L/186G/187R/422R/423R及373R/423R,其中該位置係根據序列辨識編號:3956予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H5N/P73A/L113I/E186G/K187R/K373R/N423R、H5N/P73A/K143P/I144V/V179D/E186G/K187R/K422R、H5N/P73A/I144V/V179D/E186A/K373R/N423R、H5N/P73A/I144V/K187R/K373R/K422R、H5N/K143P/I144V/V179T/M181L/E186G/K187R/K373R、H5N/I144V/V179T/M181L/K373R/K422R、H5N/I144V/K373R/K422R、A49S/G96A/Q127I/Q132K/F156W/A196S、A49S/G96A/Q132H/S153A/N199S/A200S、A49S/G96P/Q127I/S153A/V278L、A49S/G96P/Q132H/S153A/F155M/F156W/P237L/V278L/T406Q、A49S/G96P/Q132H/F155M、A49S/G96P/Q132K/F155M/P237L/V278L、A49S/G96P/F155M/N199S/A200S/T406Q、A49S/S153A/F155M、P73A/L113I/K143P/V179T/M181L/K422R、P73A/L113I/V179T/M181L/E186A/K187R、P73A/K143P/I144V/V179D/E186G/K187T/K373R/N423R、P73A/V179D/M181L/E186A/K373R/K422R、P73A/V179D/M181L/E186G/K187R/K373R、P73A/M181L/E186A/K187T、G96A/Q132H/S153A/F156W、G96A/Q132K/S153A/F155M/F156W、G96A/Q132K/S153A/F155M/F156W/A200S、G96A/S153A/F155M/F156W、G96P/Q127I/Q132H/S153A/V278L、G96P/Q127I/S153A/F155M、G96P/Q132H/S153A/F155M/F156W、G96P/Q132H/A196S/N199S、G96P/Q132K/S153A/F155M、G96P/Q132K/V278L、G96P/S153A/F155M/N199S/A200S/P237L、G96P/S153A/T406Q、L113I/K143P/V179D/E186G/K187R、L113I/I144V/E186G/N423R、L113I/I144V/K373R、L113I/M181L/E186A/K373R/K422R、L113I/K373R/K422R、Q127I/Q132H、Q127I/Q132H/S153A/F156W、Q127I/Q132H/F155M/F156W/T406Q、Q127I/S153A/F155M/N199S/A200S/P237L、Q127I/T406Q、Q132H/S153A/P237L/T406Q、Q132H/F155M、Q132K/S153A/F155M、Q132K/P237L、K143P/I144V/V179T/M181L/E186G/K187R/K422R、K143P/V179T/M181L/E186G/K187R/K422R/N423R、I144V/V179T/M181L/E186A/K187R/K373R、I144V/V179T/E186A/K187T/K373R、S153A/F155M/F156W/P237L、S153A/F155M/A196S/N199S/P237L、S153A/N199S/T406Q、S153A/P237L、F155M/N199S、V179D/M181L/E186G/K187R/N423R、V179D/K187T/K373R/K422R、V179T/M181L/E186A、V179T/E186A/K187T、M181L/E186G/K187R/K422R/N423R及K373R/N423R,其中該位置係根據序列辨識編號:3956予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11、12、41、44、44/187、45、55、56、57、65、66、70、72、73、74/238、82、83、85、103、111、113、114、117、132、135、138、140、159、160、162、167、182、214、220、222、223、226、236、238、256、286、299、309、387、388、389、391、393、406、408、412、418、422、429、430、449及450,其中該位置係根據序列辨識編號:3956予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11D、11L、12I、12L、41H、44H、44S/187T、45Y、55A、55G、55L、56R、57G、57H、57P、65C、65G、65P、65Q、65R、66L、70W、72V、73H、73S、74M/238V、82S、83R、85W、103H、103Q、111F、113S、114G、114I、117N、117S、132G、135E、138K、138S、138T、140C、140G、159N、160D、160Q、160T、162L、167L、182I、182L、182Q、182T、182V、182Y、214H、214T、220G、220S、222F、223D、226Q、236L、236T、236V、238A、238G、238I、238R、238S、238T、256R、286G、299V、309P、309R、309S、309T、387P、387Q、387R、388A、388S、389A、389G、389L、389V、391A、391L、391S、391V、393P、393T、406G、406S、408L、408T、412G、412R、418A、418H、418M、422L、429D、430P、449G、449H、449L、449R、449S、450N及450V,其中該位置係根據序列辨識編號:3956予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q11D、Q11L、T12I、T12L、F41H、Y44H、Y44S/K187T、L45Y、I55A、I55G、I55L、K56R、K57G、K57H、K57P、N65C、N65G、N65P、N65Q、N65R、S66L、V70W、L72V、P73H、P73S、L74M/M238V、P82S、H83R、H85W、K103H、K103Q、K111F、L113S、Q114G、Q114I、K117N、K117S、Q132G、L135E、G138K、G138S、G138T、P140C、P140G、L159N、K160D、K160Q、K160T、P162L、P167L、R182I、R182L、R182Q、R182T、R182V、R182Y、K214H、K214T、T220G、T220S、L222F、T223D、K226Q、D236L、D236T、D236V、M238A、M238G、M238I、M238R、M238S、M238T、E256R、N286G、E299V、K309P、K309R、K309S、K309T、D387P、D387Q、D387R、E388A、E388S、D389A、D389G、D389L、D389V、R391A、R391L、R391S、R391V、H393P、H393T、T406G、T406S、P408L、P408T、I412G、I412R、R418A、R418H、R418M、K422L、E429D、E430P、Y449G、Y449H、Y449L、Y449R、Y449S、K450N及K450V,其中該位置係根據序列辨識編號:3956予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:4148、4150、4152、4154、4156、4158、4160、4162、4164、4166、4168、4170、4172、4174、4176、4178、4180、4182、4184、4186、4188、4190、4192、4194、4196、4198、4200、4202、4204、4206、4208、4210、4212、4214、4216、4218、4220、4222、4224、4226、4228、4230、4232、4234、4236、4238、4240、4242、4244、4246、4248、4250、4252、4254、4256、4258、4260、4262、4264、4266、4268、4270、4272、4274、4276、4278、4280、4282、4284、4286、4288、4290、4292、4294、4296、4298、4300、4302、4304、4306、4308、4310、4312、4314、4316、4318、4320、4322、4324、4326、4328、4330、4332、4334、4336、4338、4340、4342、4344、4346、4348、4350、4352、4354、4356、4358、4360、4362、4364、4366、4368、4370、4372、4374、4376、4378、4380、4382、4384、4386、4388、4390、4392、4394、4396、4398、4400、4402、4404、4406、4408、4410、4412、4414、4416、4418、4420、4422、4424、4426、4428、4430、4432、4434、4436、4438、4440、4442、4444、4446、4448、4450、4452、4454、4456、4458、4460、4462、4464、4466、4468、4470、4472、4474、4476、4478、4480、4482、4484、4486、4488、4490、4492、4494及4496。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:4148、4150、4152、4154、4156、4158、4160、4162、4164、4166、4168、4170、4172、4174、4176、4178、4180、4182、4184、4186、4188、4190、4192、4194、4196、4198、4200、4202、4204、4206、4208、4210、4212、4214、4216、4218、4220、4222、4224、4226、4228、4230、4232、4234、4236、4238、4240、4242、4244、4246、4248、4250、4252、4254、4256、4258、4260、4262、4264、4266、4268、4270、4272、4274、4276、4278、4280、4282、4284、4286、4288、4290、4292、4294、4296、4298、4300、4302、4304、4306、4308、4310、4312、4314、4316、4318、4320、4322、4324、4326、4328、4330、4332、4334、4336、4338、4340、4342、4344、4346、4348、4350、4352、4354、4356、4358、4360、4362、4364、4366、4368、4370、4372、4374、4376、4378、4380、4382、4384、4386、4388、4390、4392、4394、4396、4398、4400、4402、4404、4406、4408、4410、4412、4414、4416、4418、4420、4422、4424、4426、4428、4430、4432、4434、4436、4438、4440、4442、4444、4446、4448、4450、4452、4454、4456、4458、4460、4462、4464、4466、4468、4470、4472、4474、4476、4478、4480、4482、4484、4486、4488、4490、4492、4494及4496。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:4148、4150、4152、4154、4156、4158、4160、4162、4164、4166、4168、4170、4172、4174、4176、4178、4180、4182、4184、4186、4188、4190、4192、4194、4196、4198、4200、4202、4204、4206、4208、4210、4212、4214、4216、4218、4220、4222、4224、4226、4228、4230、4232、4234、4236、4238、4240、4242、4244、4246、4248、4250、4252、4254、4256、4258、4260、4262、4264、4266、4268、4270、4272、4274、4276、4278、4280、4282、4284、4286、4288、4290、4292、4294、4296、4298、4300、4302、4304、4306、4308、4310、4312、4314、4316、4318、4320、4322、4324、4326、4328、4330、4332、4334、4336、4338、4340、4342、4344、4346、4348、4350、4352、4354、4356、4358、4360、4362、4364、4366、4368、4370、4372、4374、4376、4378、4380、4382、4384、4386、4388、4390、4392、4394、4396、4398、4400、4402、4404、4406、4408、4410、4412、4414、4416、4418、4420、4422、4424、4426、4428、4430、4432、4434、4436、4438、4440、4442、4444、4446、4448、4450、4452、4454、4456、4458、4460、4462、4464、4466、4468、4470、4472、4474、4476、4478、4480、4482、4484、4486、4488、4490、4492、4494及4496。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8/375、50/137/189/375、62/153/155/156/159、62/153/155/156/159/427、62/153/155/199/406、137/164/375、153、153/155/156、153/155/156/159/199/238/406、153/155/237/238/239/406、153/155/238/239、153/155/427、153/156/159、153/156/199/237/427、153/156/427、153/159/237/238/352、153/176/181/427、155/156、155/156/176/181/199、155/156/176/238/427、155/181/199/238/406、156/199、156/199/427、164/375/433、223/375、375及427,其中該位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8V/375L、50V/137R/189G/375L、62A/153A/155M/156W/159V、62A/153A/155M/156W/159V/427T、62A/153A/155M/199S/406Q、137R/164E/375L、153A、153A/155M/156W、153A/155M/156W/159V/199S/238G/406Q、153A/155M/237L/238T/239F/406Q、153A/155M/238T/239F、153A/155M/427T、153A/156W/159V、153A/156W/199S/237L/427T、153A/156W/427T、153A/159V/237L/238G/352A、153A/176Q/181L/427S、155M/156W、155M/156W/176Q/181L/199S、155M/156W/176Q/238T/427S、155M/181L/199S/238G/406Q、156W/199S、156W/199S/427T、164E/375L/433D、223A/375L、375L及427S,其中該位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:S8V/I375L、I50V/Q137R/P189G/I375L、K62A/S153A/F155M/F156W/L159V、K62A/S153A/F155M/F156W/L159V/R427T、K62A/S153A/F155M/N199S/T406Q、Q137R/H164E/I375L、S153A、S153A/F155M/F156W、S153A/F155M/F156W/L159V/N199S/M238G/T406Q、S153A/F155M/P237L/M238T/T239F/T406Q、S153A/F155M/M238T/T239F、S153A/F155M/R427T、S153A/F156W/L159V、S153A/F156W/N199S/P237L/R427T、S153A/F156W/R427T、S153A/L159V/P237L/M238G/S352A、S153A/R176Q/M181L/R427S、F155M/F156W、F155M/F156W/R176Q/M181L/N199S、F155M/F156W/R176Q/M238T/R427S、F155M/M181L/N199S/M238G/T406Q、F156W/N199S、F156W/N199S/R427T、H164E/I375L/N433D、T223A/I375L、I375L及R427S,其中該位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:7、9、10、12、53、65、68、99、106、110、115、116、131、132、136、170、178、190、192、194、200、220、238、242、245、257、272、280、302、304、335、385、395、399、402、408、412、416、423、445、447及449,其中該位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:7H、9G、10D、12S、53N、65F、68I、99R、106K、106R、106S、110G、115A、115T、116I、131C、131S、132G、132R、132T、136D、136G、136R、136S、170E、178L、190T、192A、192L、192P、194F、200S、220M、220Q、220S、238I、238L、242L、245P、257H、272H、280W、302P、302S、304I、335K、335R、385A、385C、385P、385S、395Q、399K、402R、408E、412R、416R、423L、445H、445K、445R、447L、449K、449L、449Q及449R,其中該位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:G7H、S9G、G10D、T12S、E53N、N65F、H68I、H99R、A106K、A106R、A106S、S110G、N115A、N115T、L116I、E131C、E131S、Q132G、Q132R、Q132T、E136D、E136G、E136R、E136S、A170E、Q178L、D190T、E192A、E192L、E192P、P194F、A200S、T220M、T220Q、T220S、M238I、M238L、I242L、K245P、N257H、R272H、F280W、N302P、N302S、E304I、P335K、P335R、V385A、V385C、V385P、V385S、G395Q、Q399K、K402R、P408E、I412R、K416R、R423L、N445H、N445K、N445R、N447L、Y449K、Y449L、Y449Q及Y449R,其中該位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:4498、4500、4502、4504、4506、4508、4510、4512、4514、4516、4518、4520、4522、4524、4526、4528、4530、4532、4534、4536、4538、4540、4542、4544、4546、4548、4550、4552、4554、4556、4558、4560、4562、4564、4566、4568、4570、4572、4574、4576、4578、4580、4582、4584、4586、4588、4590、4592、4594、4596、4598、4600、4602、4604、4606、4608、4610、4612、4614、4616、4618、4620、4622、4624、4626、4628、4630、4632、4634、4636、4638、4640、4642、4644、4646、4648、4650、4652、4654、4656、4658、4660、4662、4664、4666 4668、4670、4672、4674、4676、4678、4680及4682。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:4498、4500、4502、4504、4506、4508、4510、4512、4514、4516、4518、4520、4522、4524、4526、4528、4530、4532、4534、4536、4538、4540、4542、4544、4546、4548、4550、4552、4554、4556、4558、4560、4562、4564、4566、4568、4570、4572、4574、4576、4578、4580、4582、4584、4586、4588、4590、4592、4594、4596、4598、4600、4602、4604、4606、4608、4610、4612、4614、4616、4618、4620、4622、4624、4626、4628、4630、4632、4634、4636、4638、4640、4642、4644、4646、4648、4650、4652、4654、4656、4658、4660、4662、4664、4666 4668、4670、4672、4674、4676、4678、4680及4682。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:4498、4500、4502、4504、4506、4508、4510、4512、4514、4516、4518、4520、4522、4524、4526、4528、4530、4532、4534、4536、4538、4540、4542、4544、4546、4548、4550、4552、4554、4556、4558、4560、4562、4564、4566、4568、4570、4572、4574、4576、4578、4580、4582、4584、4586、4588、4590、4592、4594、4596、4598、4600、4602、4604、4606、4608、4610、4612、4614、4616、4618、4620、4622、4624、4626、4628、4630、4632、4634、4636、4638、4640、4642、4644、4646、4648、4650、4652、4654、4656、4658、4660、4662、4664、4666 4668、4670、4672、4674、4676、4678、4680及4682。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11/41/44/127/132/406、11/41/44/127/278/406、11/41/45/73/127/278/406/408、11/41/45/127/278/406、11/41/132/278、11/44/45/127、11/44/73/127/132/135、11/44/73/127/132/135/406/408、11/44/127、11/44/132/278/406、11/45/73/127/135、11/45/127/132/135/138/182、11/45/406、11/73/127/132/135/182/278、11/73/127/132/278/406/408、11/73/127/132/406/408、11/73/132、11/73/132/135/408、11/127/132/135、11/127/132/135/182、11/127/132/135/406、11/127/132/138/182、11/127/132/182、11/132/135/406、11/182/406、41/44/45/73/127/132/278、41/45/127/132/135/278/406、41/73/132/135/406、44/45/73/132/135/406、44/45/127/132/135/138/182/406/408、44/45/127/132/278、44/73/127/135、44/73/127/135/182/278/406/408、44/73/132/135/406/408、45/73/127/132/135/406/408、45/73/132、45/73/132/135/182、45/73/278/406/408、45/127/132、45/127/132/135/182、45/127/132/135/182/406/408、45/127/135、45/132/408、45/406、56/309/449、57、65/114/422/427、65/114/427、65/143、65/143/235/427、73/127、73/127/132、127、127/132/135/182、127/132/135/182/406、132/135、132/135/182、132/135/406、132/406、164、164/220/309/449、164/220/449、164/449、182、220/449、309、309/449、406、418/427、427、427/429及449,其中該位置係根據序列辨識編號:4550予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11L/41H/44H/127I/132K/406G、11L/41H/44H/127I/278L/406S、11L/41H/45Y/73H/127I/278L/406G/408A、11L/41H/45Y/127I/278L/406G、11L/41H/132K/278L、11L/44H/45Y/127I、11L/44H/73H/127I/132K/135E、11L/44H/73S/127I/132K/135E/406G/408A、11L/44H/127I、11L/44H/132K/278L/406G、11L/45Y/73H/127I/135E、11L/45Y/127I/132K/135E/138T/182T、11L/45Y/406G、11L/73H/127I/132K/278L/406G/408A、11L/73H/127I/132K/406G/408A、11L/73H/132K、11L/73S/127I/132K/135E/182L/278L、11L/73S/132K/135E/408A、11L/127I/132K/135E、11L/127I/132K/135E/182L、11L/127I/132K/135E/406S、11L/127I/132K/138T/182L、11L/127I/132K/182T、11L/132K/135E/406G、11L/182L/406S、41H/44H/45Y/73H/127I/132K/278L、41H/45Y/127I/132K/135E/278L/406S、41H/73H/132K/135E/406G、44H/45Y/73H/132K/135E/406G、44H/45Y/127I/132K/135E/138T/182L/406S/408A、44H/45Y/127I/132K/278L、44H/73H/127I/135E、44H/73S/127I/135E/182L/278L/406G/408A、44H/73S/132K/135E/406G/408A、45Y/73H/127I/132K/135E/406G/408A、45Y/73H/132K、45Y/73H/132K/135E/182L、45Y/73S/278L/406G/408A、45Y/127I/132K、45Y/127I/132K/135E/182L、45Y/127I/132K/135E/182T/406G/408A、45Y/127I/135E、45Y/132K/408A、45Y/406G、56R/309P/449L、57G、65G/114I/422L/427S、65G/114I/427S、65G/143K、65G/143K/235R/427S、73H/127I、73H/127I/132K、127I、127I/132K/135E/182I/406G、127I/132K/135E/182L、132K/135E、132K/135E/182I、132K/135E/406G、132K/406S、164E、164E/220G/309S/449H、164E/220G/449L、164E/449H、182L、220G/449H、309P/449L、309R、309T/449H、406G、418A/427S、427S、427S/429D及449L,其中該位置係根據序列辨識編號:4550予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q11L/F41H/Y44H/Q127I/Q132K/T406G、Q11L/F41H/Y44H/Q127I/V278L/T406S、Q11L/F41H/L45Y/A73H/Q127I/V278L/T406G/P408A、Q11L/F41H/L45Y/Q127I/V278L/T406G、Q11L/F41H/Q132K/V278L、Q11L/Y44H/L45Y/Q127I、Q11L/Y44H/A73H/Q127I/Q132K/L135E、Q11L/Y44H/A73S/Q127I/Q132K/L135E/T406G/P408A、Q11L/Y44H/Q127I、Q11L/Y44H/Q132K/V278L/T406G、Q11L/L45Y/A73H/Q127I/L135E、Q11L/L45Y/Q127I/Q132K/L135E/G138T/R182T、Q11L/L45Y/T406G、Q11L/A73H/Q127I/Q132K/V278L/T406G/P408A、Q11L/A73H/Q127I/Q132K/T406G/P408A、Q11L/A73H/Q132K、Q11L/A73S/Q127I/Q132K/L135E/R182L/V278L、Q11L/A73S/Q132K/L135E/P408A、Q11L/Q127I/Q132K/L135E、Q11L/Q127I/Q132K/L135E/R182L、Q11L/Q127I/Q132K/L135E/T406S、Q11L/Q127I/Q132K/G138T/R182L、Q11L/Q127I/Q132K/R182T、Q11L/Q132K/L135E/T406G、Q11L/R182L/T406S、F41H/Y44H/L45Y/A73H/Q127I/Q132K/V278L、F41H/L45Y/Q127I/Q132K/L135E/V278L/T406S、F41H/A73H/Q132K/L135E/T406G、Y44H/L45Y/A73H/Q132K/L135E/T406G、Y44H/L45Y/Q127I/Q132K/L135E/G138T/R182L/T406S/P408A、Y44H/L45Y/Q127I/Q132K/V278L、Y44H/A73H/Q127I/L135E、Y44H/A73S/Q127I/L135E/R182L/V278L/T406G/P408A、Y44H/A73S/Q132K/L135E/T406G/P408A、L45Y/A73H/Q127I/Q132K/L135E/T406G/P408A、L45Y/A73H/Q132K、L45Y/A73H/Q132K/L135E/R182L、L45Y/A73S/V278L/T406G/P408A、L45Y/Q127I/Q132K、L45Y/Q127I/Q132K/L135E/R182L、L45Y/Q127I/Q132K/L135E/R182T/T406G/P408A、L45Y/Q127I/L135E、L45Y/Q132K/P408A、L45Y/T406G、K56R/K309P/Y449L、K57G、N65G/Q114I/K422L/R427S、N65G/Q114I/R427S、N65G/P143K、N65G/P143K/Q235R/R427S、A73H/Q127I、A73H/Q127I/Q132K、Q127I、Q127I/Q132K/L135E/R182I/T406G、Q127I/Q132K/L135E/R182L、Q132K/L135E、Q132K/L135E/R182I、Q132K/L135E/T406G、Q132K/T406S、H164E、H164E/T220G/K309S/Y449H、H164E/T220G/Y449L、H164E/Y449H、R182L、T220G/Y449H、K309P/Y449L、K309R、K309T/Y449H、T406G、R418A/R427S、R427S、R427S/E429D及Y449L,其中該位置係根據序列辨識編號:4550予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358及7360。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358及7360。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358及7360。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:7/10/73/127/132/385/423、10、10/53/73/99、10/53/272/423/427、10/53/423、10/73、10/73/127、10/127/132/385、10/132/302/385、53/73/200/423、53/127/132/385、53/127/136/385、53/132/136/302/423/427、53/132/302/385/423/427、65/106/445/447/449、65/143/220、65/220/309/445/447、65/220/445/449、65/399/406/447/449、65/402/406/445/449、65/445/447/449、65/447/449、73、73/127/427、73/132/136/385/427、73/385、73/385/427、106/220/399/402/406、115/116/278、115/170/190/238/412、115/190/194、115/245/278、116/170/190、116/190/406/408、116/238、116/238/245、116/416、127、132、143/220/445/447、143/309/402、143/309/445/447/449、170、170/190/192/194、170/192、170/192/194/278、170/192/194/335、170/194、170/194/335/416、170/238、170/335、170/335/416、190、190/192/194、190/194、190/194/238/245、190/194/335/416、190/194/412、190/245/412、192/194、192/194/242/406/408、194、200、200/385、220/399、220/445、220/445/447、257/385、272/302、272/385、278、302/385、309/399/449、309/445/447/449、385、385/427、399/406、399/406/449、402/445/449、406/445/447/449、406/445/449、423/427、445/447/449、445/449、447及449,其中該位置係根據序列辨識編號:7324予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:7V/10D/73H/127I/132G/385P/423L、10D、10D/53N/73H/99R、10D/53N/272H/423L/427S、10D/53N/423L、10D/73H、10D/73H/127I、10D/127I/132R/385P、10D/132R/302P/385P、53N/73H/200S/423L、53N/127I/132R/385S、53N/127I/136R/385L、53N/132G/136R/302P/423L/427S、53N/132G/302P/385S/423L/427S、65G/106R/445K/447L/449L、65G/143K/220Q、65G/220Q/309P/445R/447L、65G/220Q/445R/449K、65G/220Q/445R/449R、65G/399K/406G/447L/449R、65G/402R/406G/445R/449R、65G/445K/447L/449R、65G/447L/449L、73H、73H/127I/427S、73H/132R/136R/385S/427S、73H/385S、73H/385S/427S、106R/220Q/399K/402R/406G、115A/170E/190T/238L/412R、115A/190T/194F、115A/245P/278L、115T/116I/278L、116I/170E/190T、116I/190T/406G/408A、116I/238L、116I/238L/245P、116I/416R、127I、132G、143K/220Q/445K/447L、143K/309P/402R、143K/309P/445K/447L/449L、170E、170E/190T/192L/194F、170E/192L、170E/192L/194F/278L、170E/192L/194F/335K、170E/194F、170E/194F/335R/416R、170E/238L、170E/335K、170E/335K/416R、190T、190T/192L/194F、190T/194F、190T/194F/238L/245P、190T/194F/335R/416R、190T/194F/412R、190T/245P/412R、192L/194F、192L/194F/242L/406G/408A、194F、200S、200S/385S、220M/445K、220Q/399K、220Q/445K/447L、257H/385S、272H/302P、272H/385P、278L、302P/385P、302P/385S、309P/399K/449L、309P/445K/447L/449L、385S、385S/427S、399K/406G、399K/406G/449L、402R/445R/449L、406G/445K/449R、406G/445R/447L/449L、406G/445R/449K、423L/427S、445K/449L、445R/447L/449L、445R/449L、447L及449L,其中該位置係根據序列辨識編號:7324予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:G7V/G10D/A73H/Q127I/K132G/V385P/R423L、G10D、G10D/E53N/A73H/H99R、G10D/E53N/R272H/R423L/R427S、G10D/E53N/R423L、G10D/A73H、G10D/A73H/Q127I、G10D/Q127I/K132R/V385P、G10D/K132R/N302P/V385P、E53N/A73H/A200S/R423L、E53N/Q127I/K132R/V385S、E53N/Q127I/E136R/V385L、E53N/K132G/E136R/N302P/R423L/R427S、E53N/K132G/N302P/V385S/R423L/R427S、N65G/A106R/N445K/N447L/Y449L、N65G/P143K/T220Q、N65G/T220Q/K309P/N445R/N447L、N65G/T220Q/N445R/Y449K、N65G/T220Q/N445R/Y449R、N65G/Q399K/S406G/N447L/Y449R、N65G/K402R/S406G/N445R/Y449R、N65G/N445K/N447L/Y449R、N65G/N447L/Y449L、A73H、A73H/Q127I/R427S、A73H/K132R/E136R/V385S/R427S、A73H/V385S、A73H/V385S/R427S、A106R/T220Q/Q399K/K402R/S406G、N115A/A170E/D190T/M238L/I412R、N115A/D190T/P194F、N115A/K245P/V278L、N115T/L116I/V278L、L116I/A170E/D190T、L116I/D190T/S406G/P408A、L116I/M238L、L116I/M238L/K245P、L116I/K416R、Q127I、K132G、P143K/T220Q/N445K/N447L、P143K/K309P/K402R、P143K/K309P/N445K/N447L/Y449L、A170E、A170E/D190T/E192L/P194F、A170E/E192L、A170E/E192L/P194F/V278L、A170E/E192L/P194F/P335K、A170E/P194F、A170E/P194F/P335R/K416R、A170E/M238L、A170E/P335K、A170E/P335K/K416R、D190T、D190T/E192L/P194F、D190T/P194F、D190T/P194F/M238L/K245P、D190T/P194F/P335R/K416R、D190T/P194F/I412R、D190T/K245P/I412R、E192L/P194F、E192L/P194F/I242L/S406G/P408A、P194F、A200S、A200S/V385S、T220M/N445K、T220Q/Q399K、T220Q/N445K/N447L、N257H/V385S、R272H/N302P、R272H/V385P、V278L、N302P/V385P、N302P/V385S、K309P/Q399K/Y449L、K309P/N445K/N447L/Y449L、V385S、V385S/R427S、Q399K/S406G、Q399K/S406G/Y449L、K402R/N445R/Y449L、S406G/N445K/Y449R、S406G/N445R/N447L/Y449L、S406G/N445R/Y449K、R423L/R427S、N445K/Y449L、N445R/N447L/Y449L、N445R/Y449L、N447L及Y449L,其中該位置係根據序列辨識編號:7324予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2、4、11/44、11/71、11/287、11/441、37、40、42、42/138、42/141、43、46、47、48/398、49、49/406/408、51、64、71、76、97、100、108、108/172、109、112、117/157/301、118、118/406/408、119、119/172、130、133、134、141、157、169、172/420、172/437、179、181、259、274、275、287、288、333/398、333/406/408、338、356、357、376、381、385、394/420、396、397/406/408、398、401、406/408、410、417、420、434、437及441,其中該位置係根據序列辨識編號:7324予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2T、4F、11L/44H、11L/71P、11L/71T、11L/287S、11L/441S、37G、40Q、42A、42A/141P、42D/138C、42G、43A、43L、43M、43T、46C、46L、46Q、46T、47N、48S/398V、49G、49K、49N/406G/408A、51M、51Q、51V、64A、64F、64G、64L、64Q、64R、64V、71T、76H、76L、97L、97V、100R、108G/172H、108T、109L、109V、109Y、112N、112Q、112R、112T、112V、117R/157T/301R、118A、118A/406G/408A、118I、118L、118S、118V、119A、119G、119S、119T/172H、130S、133H、133L、133R、133S、134S、141G、141Q、141S、157C、157E、157T、169E、172H/420L、172H/437D、179I、179R、181H、181T、259T、274Q、274T、275L、287A、287K、287L、287S、288P、333S/398T、333S/406G/408A、338S、356S、356T、357T、376G、376M、376N、376R、376S、381C、385A、394H/420W、396A、396S、397L/406G/408A、398H、398K、398L、398M、398R、401T、406G/408A、410R、417C、417S、420F、420L、434C、437G、437V及441L,其中該位置係根據序列辨識編號:7324予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H2T、H4F、Q11L/Y44H、Q11L/E71P、Q11L/E71T、Q11L/V287S、Q11L/Q441S、A37G、G40Q、V42A、V42A/A141P、V42D/G138C、V42G、I43A、I43L、I43M、I43T、V46C、V46L、V46Q、V46T、S47N、T48S/A398V、A49G、A49K、A49N/S406G/P408A、N51M、N51Q、N51V、S64A、S64F、S64G、S64L、S64Q、S64R、S64V、E71T、E76H、E76L、T97L、T97V、K100R、N108G/R172H、N108T、F109L、F109V、F109Y、I112N、I112Q、I112R、I112T、I112V、K117R/N157T/Q301R、P118A、P118A/S406G/P408A、P118I、P118L、P118S、P118V、D119A、D119G、D119S、D119T/R172H、A130S、V133H、V133L、V133R、V133S、A134S、A141G、A141Q、A141S、N157C、N157E、N157T、P169E、R172H/I420L、R172H/E437D、D179I、D179R、M181H、M181T、V259T、D274Q、D274T、M275L、V287A、V287K、V287L、V287S、N288P、N333S/A398T、N333S/S406G/P408A、G338S、G356S、G356T、V357T、V376G、V376M、V376N、V376R、V376S、A381C、V385A、R394H/I420W、E396A、E396S、I397L/S406G/P408A、A398H、A398K、A398L、A398M、A398R、L401T、S406G/P408A、G410R、V417C、V417S、I420F、I420L、A434C、E437G、E437V及Q441L,其中該位置係根據序列辨識編號:7324予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336及8338。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336及8338。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336及8338。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11、11/64/109、11/445、42/43、42/44/71/73/116、43/73/141、46/47/51、46/51、47/49、47/51、64、64/65/109、64/65/112、64/112、64/134、64/445、65/112、65/112/445、71、71/73、71/73/141、71/141、71/302、73、73/116/141、73/141、73/302、109、109/112、109/115/118、109/134、109/406、112、112/445、116/287、127、127/169/172、127/169/287、127/169/376/398/399、127/169/398/399、127/287、127/376、141、141/302、169/172/287、169/172/288、169/172/288/398/399/420/423/427、169/172/398/399、169/287、169/398、169/398/399、287、287/288、287/376、287/398、287/399、287/420/423/427、288、288/376/398、288/398、288/399、302、376、376/398、376/399、398、398/399、398/399/420、398/427、399及420,其中該位置係根據序列辨識編號:7784予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11L、11L/64R/109V、11L/445K、42A/44H/71T/73H/116I、42G/43M、43T/73H/141P、46L/47N/51Q、46T/51Q、47N/49G、47N/51V、64R、64R/65G/109V、64R/65G/112N、64R/65G/112T、64R/112N、64R/134S、64R/445K、65G/112N、65G/112N/445K、71T、71T/73H、71T/73H/141G、71T/73H/141S、71T/141P、71T/302P、73H、73H/116I/141P、73H/141G、73H/141P、73H/141S、73H/302P、109L/112T、109V、109V/112T、109V/115A/118V、109V/134S、109V/406G、112N/445K、112T、116I/287S、127I、127I/169E/172H、127I/169E/287S、127I/169E/376M/398M/399K、127I/169E/398L/399K、127I/287S、127I/376M、141G、141G/302P、141P、141S、141S/302P、169E/172H/287S、169E/172H/288P、169E/172H/288P/398L/399K/420F/423L/427S、169E/172H/398M/399K、169E/287S、169E/398M/399K、169E/398T、287L/288P、287L/399K、287M、287S、287S/376M、287S/398T、287S/399K、287S/420F/423L/427S、288P、288P/376S/398L、288P/398K、288P/399K、302P、376M、376M/398L、376M/398M、376M/399K、398L、398L/399K、398L/427S、398M、398M/399K、398M/399K/420F、398R、398R/399K、398T/399K、399K及420F,其中該位置係根據序列辨識編號:7784予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q11L、Q11L/S64R/F109V、Q11L/N445K、V42A/Y44H/E71T/A73H/L116I、V42G/I43M、I43T/A73H/A141P、V46L/S47N/N51Q、V46T/N51Q、S47N/A49G、S47N/N51V、S64R、S64R/N65G/F109V、S64R/N65G/I112N、S64R/N65G/I112T、S64R/I112N、S64R/A134S、S64R/N445K、N65G/I112N、N65G/I112N/N445K、E71T、E71T/A73H、E71T/A73H/A141G、E71T/A73H/A141S、E71T/A141P、E71T/N302P、A73H、A73H/L116I/A141P、A73H/A141G、A73H/A141P、A73H/A141S、A73H/N302P、F109L/I112T、F109V、F109V/I112T、F109V/N115A/P118V、F109V/A134S、F109V/S406G、I112N/N445K、I112T、L116I/V287S、Q127I、Q127I/P169E/R172H、Q127I/P169E/V287S、Q127I/P169E/V376M/A398M/Q399K、Q127I/P169E/A398L/Q399K、Q127I/V287S、Q127I/V376M、A141G、A141G/N302P、A141P、A141S、A141S/N302P、P169E/R172H/V287S、P169E/R172H/N288P、P169E/R172H/N288P/A398L/Q399K/I420F/R423L/R427S、P169E/R172H/A398M/Q399K、P169E/V287S、P169E/A398M/Q399K、P169E/A398T、V287L/N288P、V287L/Q399K、V287M、V287S、V287S/V376M、V287S/A398T、V287S/Q399K、V287S/I420F/R423L/R427S、N288P、N288P/V376S/A398L、N288P/A398K、N288P/Q399K、N302P、V376M、V376M/A398L、V376M/A398M、V376M/Q399K、A398L、A398L/Q399K、A398L/R427S、A398M、A398M/Q399K、A398M/Q399K/I420F、A398R、A398R/Q399K、A398T/Q399K、Q399K及I420F,其中該位置係根據序列辨識編號:7784予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:10、10/144、10/199、13、14、15、15/394、16、22、36、89、93、96、116、116/123、116/143、116/350、123、125、127、143、144、149、156、186、187、197、198、199、201、202、203、268、287、324、331及350,其中該位置係根據序列辨識編號:7784予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:10D、10D/144L、10D/199G、13Q、14Q、15A、15L/394H、16A、16G、16T、22G、36M、89A、93A、96M、116I、116I/123N、116I/123S、116I/143R、116I/350L、123A、123G、123L、123S、123V、125L、127A、127G、127V、143G、144G、144Q、144S、149S、156V、186N、187G、187Y、197H、198Q、199G、199P、199R、199S、199Y、201A、201K、201L、201N、202A、202Y、203T、268W、287A、324R、331C、331V及350L,其中該位置係根據序列辨識編號:7784予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:G10D、G10D/V144L、G10D/N199G、L13Q、R14Q、V15A、V15L/R394H、L16A、L16G、L16T、A22G、L36M、G89A、H93A、G96M、L116I、L116I/Y123N、L116I/Y123S、L116I/P143R、L116I/M350L、Y123A、Y123G、Y123L、Y123S、Y123V、F125L、Q127A、Q127G、Q127V、P143G、V144G、V144Q、V144S、A149S、F156V、G186N、T187G、T187Y、P197H、G198Q、N199G、N199P、N199R、N199S、N199Y、G201A、G201K、G201L、G201N、I202A、I202Y、M203T、Y268W、V287A、H324R、I331C、I331V及M350L,其中該位置係根據序列辨識編號:7784予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220及9222。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220及9222。在一些具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220及9222。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與序列辨識編號:72有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之一多肽序列。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少90%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少91%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少92%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少93%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少94%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少95%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少96%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少97%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少98%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列至少99%或是更大的序列同一性的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於一些具體例中本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含下列的一多肽序列:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。於額外的具體例中,本發明提供下列表中提供的蔗糖合成酶:18.1、19.1、19.2、20.1、20.2、20.3、31.2、31.3、32.1、32.2、33.1、33.2、34.1、34.2、35.1、35.2、36.1、36.2、37.1、37.2、37.3、38.1、38.2、38.3、39.1、39.2、39.3、40.1、40.2、40.3、41.1、41.2、42.1,及/或42.2。本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之一多肽序列:序列辨識編號:1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762、7764、8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478、8480、8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104,及/或9106。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:4/9/349/532、4/13/113/343/532、4/13/113/532、4/33/47/52/343/532、4/47/52/532、4/113/532、4/13/113、4/13/532、4/33/113、4/343、7、8、44、95、117/440、136、221、343/532、440、444、478、532、583、611、615、615/789、695、722及788,其中該位置係根據序列辨識編號:74予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:4E/9T/349H/532S、4E/13R/113Q/343H/532S、4E/13R/113Q/532S、4E/33Q/47H/52D/343H/532S、4E/47H/52D/532S、4E/113Q/532S、4E/13R/113Q、4E/13R/532S、4E/33Q/113Q、4E/343H、7T、8M、44K、95S、117D/440T、136S、221A/H、343S/532S、440P/T、444K/T、478T/V、532R/T、583Q、611V、615C/E/T/V、615L/789D、695L、722Y及788E,其中該位置係根據序列辨識編號:74予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:A4E/L9T/Q349H/F532S、A4E/P13R/I113Q/V343H/F532S、A4E/P13R/I113Q/F532S、 A4E/Y33Q/L47H/A52D/V343H/F532S、A4E/L47H/A52D/F532S、A4E/I113Q/F532S、A4E/P13R/I113Q、A4E/P13R/F532S、A4E/Y33Q/I113Q、A4E/V343H、Q7T、Q8M、R44K、Q95S、G117D/R440T、R136S、R221A/H、V343S/F532S、R440P/T、Q444K/T、R478T/V、F532R/T、R583Q、R611V、R615C/E/T/V、R615L/A789D、V695L、R722Y及H788E,其中該位置係根據序列辨識編號:74予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150,及/或1152。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150,及/或1152。在一些另外的具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150,及/或1152。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8/221、47/221、68/129/248、68/129/248/595/600/756、68/146/248/387/506/550、68/189/272/316/477/719/756、75/105/154/215/264/345、75/105/345/410/769、75/105/530、75/345/530、85/170/225/266/534、87/125/230/267/375/464/708、93/129/506/550/595/719/756、93/477/635、95/136/788、95/201/478/583/724/788、95/385/478/583/788、95/440/478/724/788/792、95/444/478/603/792、95/444/478/724/788、95/478/724、98/250、113/225/266/415、126/314/499/549/589/755、136/440/444/478/603、136/440/444/478/583/788、136/444/478/583/788/792、225/372/534、266、306/358/703/776、358/636/737、440/444/583/724/788、440/478及466,其中該位置係根據序列辨識編號:1080予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8M/221H、47L/221H、68A/129E/248A、68A/129E/248A/595V/600I/756V、68A/146N/248A/387I/506P/550H、68A/189R/272L/316I/477K/719C/756V、75V/105E/154H/215F/264V/345T、75V/105E/345T/410S/769R、75V/105E/530L、75V/345T/530L、85V/170L/225E/266N/534H、87E/125E/230D/267V/375Y/464F/708A、93V/129E/506P/550H/595V/719C/756V、93V/477K/635S、95S/136S/788E、95S/201E/478V/583Q/724H/788E、95S/385L/478V/583Q/788E、95S/440T/478V/724H/788E/792S、95S/444T/478V/603S/792S、95S/444T/478V/724H/788E、95S/478T/724H、98V/250D、113L/225E/266N/415K、126L/314L/499H/549E/589E/755G、136S/440P/444T/478T/603S、136S/440T/444T/478V/583Q/788E、136S/444T/478V/583Q/788E/792S、225E/372V/534H、266N、306L/358E/703Y/776E、358E/636Q/737I、440P/444T/583Q/724H/788E、440T/478V及466I,其中該位置係根據序列辨識編號:1080予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q8M/R221H、H47L/R221H、V68A/R129E/S248A、V68A/R129E/S248A/I595V/V600I/I756V、V68A/D146N/S248A/V387I/S506P/R550H、V68A/G189R/I272L/V316I/D477K/A719C/I756V、 M75V/A105E/R154H/I215F/I264V/A345T、M75V/A105E/A345T/T410S/Q769R、M75V/A105E/P530L、M75V/A345T/P530L、R85V/I170L/A225E/R266N/E534H、I87E/T125E/N230D/I267V/W375Y/I464F/T708A、R93V/R129E/S506P/R550H/I595V/A719C/I756V、R93V/D477K/A635S、Q95S/R136S/H788E、Q95S/Q201E/R478V/R583Q/K724H/H788E、Q95S/R385L/R478V/R583Q/H788E、Q95S/R440T/R478V/K724H/H788E/M792S、Q95S/Q444T/R478V/G603S/M792S、Q95S/Q444T/R478V/K724H/H788E、Q95S/R478T/K724H、L98V/S250D、 I113L/A225E/R266N/R415K、V126L/V314L/N499H/D549E/G589E/R755G、 R136S/R440P/Q444T/R478T/G603S、 R136S/R440T/Q444T/R478V/R583Q/H788E、 R136S/Q444T/R478V/R583Q/H788E/M792S、A225E/I372V/E534H、R266N、R306L/P358E/N703Y/Q776E、P358E/L636Q/V737I、R440P/Q444T/R583Q/K724H/H788E、R440T/R478V及V466I,其中該位置係根據序列辨識編號:1080予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218,及/或1220。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218,及/或1220。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218,及/或1220。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8/68/95/98/358/478/595/724/792、8/68/98/221/248/250/440/477/534/595/724、8/68/788、8/93/95/98/136/221/595/600/788、8/93/95/113/250/440/595/600/724/788、8/95/98/440/478/534/600/788、8/136/248/478/788、47/75/85/105/125/129/170/635、47/75/85/105/375/756/776、47/75/85/264/267/372/415/635、47/75/85/87/129/375/776、47/75/85/87/170/372/756、47/85/105/129/201/230/267/583、47/85/125/372/583/635/756、47/85/170/756、47/85/87/105/125/635、47/85/87/154/756、47/125/129/375/756/776、47/129/170/635、47/154/372/375/583/635/708/756、68/93/95/358/440/444/478/534/595/603、68/93/95/444/788、68/93/98/136/248/250/358/440/534/724、75/85/87/105/264/267/583/708、75/85/129/154/264/375、85/125/215/375/415/635/776、85/87/105/215/267/756、85/87/129/375/756/776、87/125/129/170/230/756、87/154/306/375/756、93/95/98/534/792、95/440/444/724/788、129/215/372/756及170/264/267,其中該位置係根據序列辨識編號:1158予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8M/68A/95S/98V/358E/478T/595V/724H/792S、8M/68A/98V/221H/248A/250D/440P/477K/534H/595V/724H、8M/68A/788E、8M/93V/95S/98V/136S/221H/595V/600I/788E、8M/93V/95S/113I/250D/440T/595V/600I/724H/788E、8M/95S/98V/440P/478V/534H/600I/788E、8M/136S/248A/478V/788E、47L/75V/85V/105E/125E/129E/170L/635S、47L/75V/85V/105E/375Y/756V/776E、47L/75V/85V/264V/267V/372V/415R/635S、H47L/M75V/R85V/I87E/R129E/W375Y/Q776E、47L/75V/85V/87E/170L/372V/756V、47L/85V/105E/129E/201E/230D/267V/583Q、47L/85V/125E/372V/583Q/635S/756V、47L/85V/170L/756V、47L/85V/87E/105E/125E/635S、47L/85V/87E/154H/756V、47L/125E/129E/375Y/756V/776E、47L/129E/170L/635S、47L/154H/372V/375Y/583Q/635S/708A/756V、68A/93V/95S/358E/440T/444T/478V/534H/595V/603S、68A/93V/95S/444T/788E、68A/93V/98V/136S/248A/250D/358E/440P/534H/724H、75V/85V/87E/105E/264V/267V/583Q/708A、75V/85V/129E/154H/264V/375Y、85V/125E/215F/375Y/415R/635S/776E、85V/87E/105E/215F/267V/756V、85V/87E/129E/375Y/756V/776E、87E/125E/129E/170L/230D/756V、87E/154H/306L/375Y/756V、93V/95S/98V/534H/792S、95S/440P/444T/724H/788E、129E/215F/372V/756V、170L/264V/267V、8M/68A/95S/98V/358E/478T/
595V/724H/792S、8M/68A/98V/221H/248A/250D/
440P/477K/534H/595V/724H、8M/68A/788E、8M/93V/95S/98V/136S/221H/595V/600I/788E、8M/93V/95S/113I/250D/440T/595V/600I/724H/788E、8M/95S/98V/440P/478V/534H/600I/788E、8M/136S/248A/478V/788E、47L/75V/85V/105E/125E/129E/170L/635S、47L/75V/85V/105E/375Y/756V/776E、47L/75V/85V/264V/267V/372V/415R/635S、47L/75V/85V/87E/129E/375Y/776E、47L/75V/85V/87E/170L/372V/756V、47L/85V/105E/129E/201E/230D/267V/583Q、47L/85V/125E/372V/583Q/635S/756V、47L/85V/170L/756V、 47L/85V/87E/105E/125E/635S、47L/85V/87E/154H/756V、47L/125E/129E/375Y/756V/776E、47L/129E/170L/635S、47L/154H/372V/375Y/583Q/635S/708A/756V、68A/93V/95S/358E/440T/444T/478V/534H/595V/603S、68A/93V/95S/444T/788E、68A/93V/98V/136S/248A/250D/358E/440P/534H/724H、75V/85V/87E/105E/264V/267V/583Q/708A、75V/85V/129E/154H/264V/375Y、85V/125E/215F/375Y/415R/635S/776E、85V/87E/105E/215F/267V/756V、85V/87E/129E/375Y/756V/776E、87E/125E/129E/170L/230D/756V、87E/154H/306L/375Y/756V、93V/95S/98V/534H/792S、95S/440P/444T/724H/788E、129E/215F/372V/756V及170L/264V/267V,其中該位置係根據序列辨識編號:1158予以編號。在一些另外的具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q8M/V68A/Q95S/L98V/P358E/R478T/
I595V/K724H/M792S、Q8M/V68A/L98V/R221H/S248A/
S250D/R440P/D477K/E534H/I595V/K724H、Q8M/
V68A/H788E、Q8M/R93V/Q95S/L98V/R136S/R221H/I595V/
V600I/H788E、Q8M/R93V/Q95S/L113I/S250D/R440T/I595V/
V600I/K724H/H788E、Q8M/Q95S/L98V/R440P/R478V/
E534H/V600I/H788E、Q8M/R136S/S248A/R478V/H788E、H47L/M75V/R85V/A105E/T125E/R129E/I170L/A635S、H47L/M75V/R85V/A105E/W375Y/I756V/Q776E、H47L/M75V/R85V/I264V/I267V/I372V/K415R/A635S、H47L/M75V/R85V/I87E/R129E/W375Y/Q776E、H47L/M75V/R85V/I87E/I170L/I372V/I756V、H47L/R85V/A105E/R129E/Q201E/N230D/I267V/R583Q、H47L/R85V/T125E/I372V/R583Q/A635S/I756V、H47L/R85V/I170L/I756V、H47L/R85V/I87E/A105E/
T125E/A635S、H47L/R85V/I87E/R154H/I756V、H47L/T125E/R129E/W375Y/I756V/Q776E、H47L/
R129E/I170L/A635S、 H47L/R154H/I372V/W375Y/
R583Q/A635S/T708A/I756V、V68A/R93V/Q95S/P358E/
R440T/Q444T/R478V/E534H/I595V/G603S、V68A/
R93V/Q95S/Q444T/H788E、V68A/R93V/L98V/R136S/
S248A/S250D/P358E/R440P/E534H/K724H、M75V/R85V/I87E/A105E/I264V/I267V/R583Q/T708A、M75V/R85V/R129E/R154H/I264V/W375Y、R85V/T125E/I215F/W375Y/K415R/A635S/Q776E、R85V/I87E/A105E/I215F/I267V/I756V、R85V/I87E/R129E/W375Y/I756V/Q776E、I87E/T125E/R129E/I170L/N230D/I756V、I87E/R154H/R306L/W375Y/I756V、R93V/Q95S/L98V/E534H/M792S、Q95S/R440P/Q444T/K724H/H788E、R129E/I215F/I372V/I756V及I170L/I264V/I267V,其中該位置係根據序列辨識編號:1158予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286,及/或1288。在一些另外的具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286,及/或1288。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286,及/或1288。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:47/68/93/98/358/440、47/68/154/372/375、47/93/98/136/154/772/776、47/93/98/154/372/375/776、47/93/98/358/583/635、47/93/129/136/154/250/372/534/635/724、47/93/129/136/375/534/583、47/93/358/372/375/440/724、47/93/358/372/375/776、47/98/129/358/372/375/438/534、47/98/129/375/534/635/724/776、47/98/372/375、47/125/154、47/129/136/372/375/534、47/129/248/250/372/375/534/724、47/136/583/776、47/358/440/724、47/358/635/776、47/372/635/776、68/93/98/129/358/375/724、68/93/154/358/372/440/776、68/129/440、68/129/583/724、68/136/724、68/154/358/375、68/154/534/635、68/375/440/534/724/776、93/98/125/154/248、93/98/125/154/250/440、93/98/129/154/248、93/98/154/250/358/375/534、93/98/154/635/776、93/98/534、93/125/154/440/534、93/129/250/358/372/375/583、93/154/248/724、93/358/534/635、98/129/375/583、98/534/583/635、129/136/154/248/250/372/375/534、129/136/375、129/154/248/250/358/375/534/635、129/358/372/635、154/250/358/375/583、154/358/375/534/776、154/534/635/724、372/375/776、375/635及534/583,其中該位置係根據序列辨識編號:1222予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:47L/68A/93V/98V/358E/440P、47L/68A/154H/372V/375Y、47L/93V/98V/136S/154H/772G/776E、47L/93V/98V/154H/372V/375Y/776E、47L/93V/98V/358E/583Q/635S、47L/93V/129E/136S/154H/250D/372V/534H/635S/724H、47L/93V/129E/136S/375Y/534H/583Q、47L/93V/358E/372V/375Y/440P/724H、47L/93V/358E/372V/375Y/776E、47L/98V/129E/358E/372V/375Y/438Q/534H、47L/98V/129E/375Y/534H/635S/724H/776E、47L/98V/372V/375Y、47L/125E/154H、47L/129E/136S/372V/375Y/534H、47L/129E/248A/250D/372V/375Y/534H/724H、47L/136S/583Q/776E、47L/358E/440P/724H、47L/358E/635S/776E、47L/372V/635S/776E、68A/93V/98V/129E/358E/375Y/724H、68A/93V/154H/358E/372V/440P/776E、68A/129E/440P、68A/129E/583Q/724H、68A/136S/724H、68A/154H/358E/375Y、68A/154H/534H/635S、68A/375Y/440P/534H/724H/776E、93V/98V/125E/154H/248A、93V/98V/125E/154H/250D/440P、93V/98V/129E/154H/248A、93V/98V/154H/250D/358E/375Y/534H、93V/98V/154H/635S/776E、93V/98V/534H、93V/125E/154H/440P/534H、93V/129E/250D/358E/372V/375Y/583Q、93V/154H/248A/724H、93V/358E/534H/635S、98V/129E/375Y/583Q、98V/534H/583Q/635S、129E/136S/154H/248A/250D/372V/375Y/534H、129E/136S/375Y、129E/154H/248A/250D/358E/375Y/
534H/635S、129E/358E/372V/635S、154H/250D/
358E/375Y/583Q、154H/358E/375Y/534H/776E、154H/534H/635S/724H、372V/375Y/776E, 375Y/635S及534H/583Q,其中該位置係根據序列辨識編號:1222予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:H47L/V68A/R93V/L98V/P358E/R440P、H47L/V68A/R154H/I372V/W375Y、H47L/R93V/L98V/R136S/R154H/E772G/Q776E、H47L/R93V/L98V/R154H/I372V/W375Y/Q776E、H47L/R93V/L98V/P358E/R583Q/A635S、H47L/R93V/R129E/R136S/R154H/S250D/I372V/E534H/A635S/K724H、H47L/R93V/R129E/R136S/W375Y/
E534H/R583Q、H47L/R93V/P358E/I372V/W375Y/
R440P/K724H、H47L/R93V/P358E/I372V/W375Y/Q776E、H47L/L98V/R129E/P358E/I372V/W375Y/H438Q/E534H、H47L/L98V/R129E/W375Y/E534H/A635S/K724H/Q776E、H47L/L98V/I372V/W375Y、H47L/T125E/R154H、H47L/R129E/R136S/I372V/W375Y/E534H、H47L/R129E/S248A/S250D/I372V/W375Y/E534H/K724H、H47L/R136S/R583Q/Q776E、H47L/P358E/R440P/K724H、H47L/P358E/A635S/Q776E、H47L/I372V/A635S/Q776E、V68A/R93V/L98V/R129E/P358E/W375Y/K724H、V68A/R93V/R154H/P358E/I372V/R440P/Q776E、V68A/R129E/R440P、V68A/R129E/R583Q/K724H、V68A/R136S/K724H、V68A/R154H/P358E/W375Y、V68A/R154H/E534H/A635S、V68A/W375Y/R440P/E534H/K724H/Q776E、R93V/L98V/T125E/R154H/S248A、R93V/L98V/T125E/R154H/S250D/R440P、R93V/L98V/R129E/R154H/S248A、R93V/L98V/R154H/S250D/P358E/W375Y/E534H、R93V/L98V/R154H/A635S/Q776E、R93V/L98V/E534H、R93V/T125E/R154H/R440P/E534H、R93V/R129E/S250D/P358E/I372V/W375Y/R583Q、R93V/R154H/S248A/K724H、R93V/P358E/E534H/A635S、L98V/R129E/W375Y/R583Q、L98V/E534H/R583Q/A635S、R129E/R136S/R154H/S248A/S250D/I372V/W375Y/E534H、R129E/R136S/W375Y、R129E/R154H/S248A/S250D/P358E/W375Y/E534H/A635S、R129E/P358E/I372V/A635S、R154H/S250D/P358E/W375Y/R583Q、R154H/P358E/W375Y/E534H/Q776E、R154H/E534H/A635S/K724H、I372V/W375Y/Q776E、W375Y/A635S及E534H/R583Q,其中該位置係根據序列辨識編號:1222予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390及1392。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390及1392。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390及1392。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:17/357/364/434/519/684、17/357/434/519/684、17/434/684、17/684、54/97/118/307/694/727/738、68/98/129/136、68/98/129/136/154、68/98/129/136/154/534、68/98/129/154/534、68/98/129/154/635、68/98/136/154/534/635、68/98/136/154/635、68/98/154、68/98/154/534、68/98/154/534/635、68/129/136、68/129/136/154、68/129/136/154/464/635、68/129/136/534/635、68/129/154、68/129/154/765、68/136/154/534/635、68/136/534/635、68/136/635、68/154、68/154/534/635、68/154/635、97/118/442/694/727/738、98/129/136/154、98/129/136/154/635、98/129/136/534、98/129/136/635、98/129/154、98/129/154/534/635、98/129/534/635、98/136/154/635、98/136/534/635、98/136/635、98/154、98/154/534、122、129/136、129/136/154/635、129/136/534、129/136/635、129/154/534、129/154/635、129/635、132/136/154/534/635、136/154/635、136/534/635、136/603、136/635、154、154/635、157、160、161、167、253、285、381、519、550、563、564、635及785,其中該位置係根據序列辨識編號:1392予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:17D/357K/364R/434H/519T/684H、17D/357K/434H/519T/684H、17D/434H/684H、17D/684H、54D/97V/118N/307E/694N/727E/738E、68A/98V/129E/136S、68A/98V/129E/136S/154H、68A/98V/129E/136S/154H/534H、68A/98V/129E/154H/534H、68A/98V/129E/154H/635S、68A/98V/136S/154H/534H/635S、68A/98V/136S/154H/635S、68A/98V/154H、68A/98V/154H/534H、68A/98V/154H/534H/635S、68A/129E/136S、68A/129E/136S/154H、68A/129E/136S/154H/464F/635S、68A/129E/136S/534H/635S、68A/129E/154H、68A/129E/154H/765H、68A/136S/154H/534H/635S、68A/136S/534H/635S、68A/136S/635S、68A/154H、68A/154H/534H/635S、68A/154H/635S、97V/118N/442N/694N/727E/738E、98V/129E/136S/154H、98V/129E/136S/154H/635S、98V/129E/136S/534H、98V/129E/136S/635S、98V/129E/154H、98V/129E/154H/534H/635S、98V/129E/534H/635S、98V/136S/154H/635S、98V/136S/534H/635S、98V/136S/635S、98V/154H、98V/154H/534H、122D、122E、129E/136S、129E/136S/154H/635S、129E/136S/534H、129E/136S/635S、129E/154H/534H、129E/154H/635S、129E/635S、132C/136S/154H/534H/635S、136S/154H/635S、136S/534H/635S、136S/603D、136S/635S、154H、154H/635S、157A、157F、160A、160E、160M、160N、160S、160W、161Q、167E、253G、253T、253V、285A、381S、519A、519G、519L、519S、519T、550I、550M、550Q、550S、563V、564A、635D、635E、635R及785D,其中該位置係根據序列辨識編號:1392予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Y17D/Y357K/P364R/Y434H/F519T/F684H、Y17D/Y357K/Y434H/F519T/F684H、Y17D/Y434H/F684H、Y17D/F684H、G54D/A97V/A118N/N307E/G694N/L727E/A738E、V68A/L98V/R129E/R136S、V68A/L98V/R129E/R136S/R154H、V68A/L98V/R129E/R136S/R154H/E534H、V68A/L98V/R129E/R154H/E534H、V68A/L98V/R129E/R154H/A635S、V68A/L98V/R136S/R154H/E534H/A635S、V68A/L98V/R136S/R154H/A635S、V68A/L98V/R154H、V68A/L98V/R154H/E534H、V68A/L98V/R154H/E534H/A635S、V68A/R129E/R136S、V68A/R129E/R136S/R154H、V68A/R129E/R136S/R154H/I464F/A635S、V68A/R129E/R136S/E534H/A635S、V68A/R129E/R154H、V68A/R129E/R154H/D765H、V68A/R136S/R154H/E534H/A635S、V68A/R136S/E534H/A635S、V68A/R136S/A635S、V68A/R154H、V68A/R154H/E534H/A635S、V68A/R154H/A635S、A97V/A118N/H442N/G694N/L727E/A738E、L98V/R129E/R136S/R154H、L98V/R129E/R136S/R154H/A635S、L98V/R129E/R136S/E534H、L98V/R129E/R136S/A635S、L98V/R129E/R154H、L98V/R129E/R154H/E534H/A635S、L98V/R129E/E534H/A635S、L98V/R136S/R154H/A635S、L98V/R136S/E534H/A635S、L98V/R136S/A635S、L98V/R154H、L98V/R154H/E534H、A122D、A122E、R129E/R136S、R129E/R136S/R154H/A635S、R129E/R136S/E534H、R129E/R136S/A635S、R129E/R154H/E534H、R129E/R154H/A635S、R129E/A635S、R132C/R136S/R154H/E534H/A635S、R136S/R154H/A635S、R136S/E534H/A635S、R136S/G603D、R136S/A635S、R154H、R154H/A635S、G157A、G157F、F160A、F160E、F160M、F160N、F160S、F160W、S161Q、R167E、A253G、A253T、A253V、P285A、Q381S、F519A、F519G、F519L、F519S、F519T、R550I、R550M、R550Q、R550S、L563V、S564A、A635D、A635E、A635R及P785D,其中該位置係根據序列辨識編號:1392予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564及1566。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564及1566。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564及1566。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:17/54/97/136/329/550/684/738、17/54/97/329/524/684、17/54/161/519/727/738、17/54/524/550/727、17/161/434/524/766、17/434/524/684、17/434/738、17/442/524/550/684/721、17/727、17/738、54/97/161/434/442、54/97/434/524/550/684/727、54/136/442/550、54/434/524/738、97/136/519/550/727/738及329/550/684/727/738,其中該位置係根據序列辨識編號:1456予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:17D/54D/97V/136P/329Q/550I/684H/738E、17D/54D/97V/329Q/524T/684H、17D/54D/161T/519T/727E/738E、17D/54D/524T/550I/727E、17D/161T/434H/524T/766H、17D/434H/524T/684H、17D/434H/738E、17D/442N/524T/550I/684H/721K、17D/727E、17D/738E、54D/97V/161T/434H/442N、54D/97V/434H/524T/550I/684H/727E、54D/136P/442N/550I、54D/434H/524T/738E、97V/136P/519T/550I/727E/738E及329Q/550I/684H/727E/738E,其中該位置係根據序列辨識編號:1456予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Y17D/G54D/A97V/R136P/E329Q/R550I/F684H/A738E、Y17D/G54D/A97V/E329Q/A524T/F684H、Y17D/G54D/S161T/F519T/L727E/A738E、Y17D/G54D/A524T/R550I/L727E、Y17D/S161T/Y434H/A524T/R766H、Y17D/Y434H/A524T/F684H、Y17D/Y434H/A738E、Y17D/H442N/A524T/R550I/F684H/E721K、Y17D/L727E、Y17D/A738E、G54D/A97V/S161T/Y434H/H442N、G54D/A97V/Y434H/A524T/R550I/F684H/L727E、G54D/R136P/H442N/R550I、G54D/Y434H/A524T/A738E、A97V/R136P/F519T/R550I/L727E/A738E及E329Q/R550I/F684H/L727E/A738E,其中該位置係根據序列辨識編號:1456予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596及1598。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596及1598。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596及1598。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14/137/356/745、14/570、14/570/745、26/117/365、26/164/165/213/586、71/158/222/356、71/222/236、71/319/356/606、117/158/213/332/608、117/164/707、117/213/365/517、117/311/332、117/608、122、122/160/161/167/550、122/160/161/282/381/550、122/160/161/282/381/550/636、122/160/161/282/550、122/160/161/550/636、122/160/167/282/381/550/636、122/160/282/381、122/160/282/381/550、122/160/282/550、122/160/381/550、122/160/381/550/636、122/160/550、122/160/550/636、122/161/550、122/167、122/167/550、122/282/381/550、122/282/550、122/282/550/636、122/381/706、122/550、137/319/570、157/253/519、160/161、160/161/282/381/550、160/161/282/550、160/161/550/636/735、160/167/282/381/636、160/282、160/282/381/550、160/282/550/636、160/381/550/636/681、161/282/550/636、161/381/550、165/311、167/282/636、167/550、213/365/517/707、236、253/519、253/519/563、253/519/635、253/563/635、270/322/517、270/367/452/517/613/700/750、270/452/517/700/750、270/570、282/381/550、282/550、356/570、381/550、517、517/562/750、517/640、519/563、550、550/636及562,其中該位置係根據序列辨識編號:1582予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14D/137K/356H/745L、14D/570H、14D/570H/745L、26E/117E/365E、26E/164E/165E/213E/586E、71Q/158T/222L/356H、71Q/222L/236S、71Q/319K/356H/606S、117E/158E/213E/332E/608E、117E/164E/707E、117E/213E/365E/517E、117E/311E/332E、117E/608E、122D、122D/160M/282M/550S、122D/160W/161Q/167E/550M、122D/160W/161Q/282M/550Q、122D/160W/282M/381S/550M、122D/160W/550M、122D/160W/550Q/636Q、122D/167E、122D/282M/381S/550M、122D/282M/550Q、122D/550M、122E/160I/167E/282M/381H/550Q/636Q、122E/160M/161Q/282M/381S/550M/636Q、122E/160M/550Q/636Q、122E/160W/161Q/167E/550S、122E/160W/161Q/282M/381S/550S、122E/160W/161Q/550M/636Q、122E/160W/282M/381S、122E/160W/381S/550M/636Q、122E/160W/381S/550Q、122E/161Q/550Q、122E/167E/550M、122E/282M/550M/636Q、122E/282M/550Q、122E/282M/550S、122E/381S/706K、122E/550Q、137K/319K/570H、157A/253T/519L、160M/161Q、160M/161Q/282M/381S/550M、160M/161Q/282M/550Q、160M/282M、160M/282M/381S/550M、160M/282M/550M/636Q、160W/161Q/282M/550M、160W/161Q/282M/550Q、160W/161Q/550Q/636Q/735V、160W/167E/282M/381S/636Q、160W/282M/381S/550M、160W/381S/550Q/636Q/681V、161Q/282M/550Q/636Q、161Q/381S/550Q、165E/311E、167E/282M/636Q、167E/550Q、213E/365E/517E/707E、236S、253G/519L、253T/519L、253T/519L/563V、253T/519L/635D、253T/519L/635E、253T/563V/635R、253V/519G、253V/519L、270L/322V/517A、270L/367V/452Y/517A/613Q/700F/750M、270L/452Y/517A/700F/750M、270L/570H、282M/381S/550S、282M/550Q、356H/570H、381S/550Q、381S/550S、517A、517A/562I/750M、517A/640N、519L/563V、550M/636Q、550Q及562I,其中該位置係根據序列辨識編號:1582予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:R14D/R137K/R356H/R745L、R14D/R570H、R14D/R570H/R745L、S26E/G117E/H365E、S26E/A164E/A165E/A213E/R586E、R71Q/R158T/R222L/R356H、R71Q/R222L/R236S、R71Q/R319K/R356H/R606S、G117E/R158E/A213E/G332E/A608E、G117E/A164E/A707E、G117E/A213E/H365E/P517E、G117E/Q311E/G332E、G117E/A608E、A122D、A122D/F160M/L282M/R550S、A122D/F160W/T161Q/R167E/R550M、A122D/F160W/T161Q/L282M/R550Q、A122D/F160W/L282M/Q381S/R550M、A122D/F160W/R550M、A122D/F160W/R550Q/L636Q、A122D/R167E、A122D/L282M/Q381S/R550M、A122D/L282M/R550Q、A122D/R550M、A122E/F160I/R167E/L282M/Q381H/R550Q/L636Q、A122E/F160M/T161Q/L282M/Q381S/R550M/L636Q、A122E/F160M/R550Q/L636Q、A122E/F160W/T161Q/R167E/R550S、A122E/F160W/T161Q/L282M/Q381S/R550S、A122E/F160W/T161Q/R550M/L636Q、A122E/F160W/L282M/Q381S、A122E/F160W/Q381S/R550M/L636Q、A122E/F160W/Q381S/R550Q、A122E/T161Q/R550Q、A122E/R167E/R550M、A122E/L282M/R550M/L636Q、A122E/L282M/R550Q、A122E/L282M/R550S、A122E/Q381S/E706K、A122E/R550Q、R137K/R319K/R570H、G157A/A253T/T519L、F160M/T161Q、F160M/T161Q/L282M/Q381S/R550M、F160M/T161Q/L282M/R550Q、F160M/L282M、F160M/L282M/Q381S/R550M、F160M/L282M/R550M/L636Q、F160W/T161Q/L282M/R550M、F160W/T161Q/L282M/R550Q、F160W/T161Q/R550Q/L636Q/A735V、F160W/R167E/L282M/Q381S/L636Q、F160W/L282M/Q381S/R550M、F160W/Q381S/R550Q/L636Q/A681V、T161Q/L282M/R550Q/L636Q、T161Q/Q381S/R550Q、A165E/Q311E、R167E/L282M/L636Q、R167E/R550Q、A213E/H365E/P517E/A707E、R236S、A253G/T519L、A253T/T519L、A253T/T519L/L563V、A253T/T519L/S635D、A253T/T519L/S635E、A253T/L563V/S635R、A253V/T519G、A253V/T519L、V270L/I322V/P517A、V270L/I367V/F452Y/P517A/E613Q/I700F/L750M、V270L/F452Y/P517A/I700F/L750M、V270L/R570H、L282M/Q381S/R550S、L282M/R550Q、R356H/R570H、Q381S/R550Q、Q381S/R550S、P517A、P517A/L562I/L750M、P517A/T640N、T519L/L563V、R550M/L636Q、R550Q及L562I,其中該位置係根據序列辨識編號:1582予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770及1772。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770及1772。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770及1772。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:63/536、117/122/270/540/681、181/536/548、181/536/548/705、181/548/705、270/681、347/532、347/536/548/705、407/570/681、407/681、536、536/548、536/548/699、536/705、548、548/580、548/705、580、681、699及705,其中該位置係根據序列辨識編號:1764予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:63I/536L、117E/122D/270L/540M/681A、181N/536L/548P、181N/536L/548P/705M、181N/548P/705P、270L/681A、347R/532Y、347R/536L/548P/705P、407I/570H/681A、407T/681A、536L、536L/548P、536L/548P/699F、536L/705M、548P、548P/580M、548P/705P、580M、681A、699F、705M及705P,其中該位置係根據序列辨識編號:1764予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:A63I/E536L、G117E/A122D/V270L/L540M/V681A、G181N/E536L/A548P、G181N/E536L/A548P/H705M、G181N/A548P/H705P、V270L/V681A、N347R/S532Y、N347R/E536L/A548P/H705P、L407I/R570H/V681A、L407T/V681A、E536L、E536L/A548P、E536L/A548P/H699F、E536L/H705M、A548P、A548P/L580M、A548P/H705P、L580M、V681A、H699F、H705M及H705P,其中該位置係根據序列辨識編號:1764予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818及1820。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818及1820。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818及1820。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:13、17、18、30、37、52、57、60、71、85、87、90、98、99、118、129、164、180、183、347/434/517/562/640/681、347/434/532/562/640/681、347/434/550/562/681、347/434/681、347/517/532/681、347/532/550/640/681/699、347/536/562/681、347/550/580/681、347/550/681、347/681、365、388、389、415、433、434/517/532/681、517/681、531、532/681、535、536/580/681、539、562/681、589、606、608、707、711、727、738、748、765、769及789,其中該位置係根據序列辨識編號:1804予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:13H、13K、13N、17R、18G、30H、37G、37R、52G、52P、52R、52W、57R、57W、60L、71G、71Q、85H、87H、87L、90H、98L、99I、118G、118N、129A、129G、129T、164S、164T、180P、183P、347R/434H/517A/562I/640N/681A、347R/434H/532Y/562I/640N/681A、347R/434H/550I/562I/681A、347R/434H/681A、347R/517A/532Y/681A、347R/532Y/550I/640N/681A/699F、347R/536L/562I/681A、347R/550I/580M/681A、347R/550I/681A、347R/681A、365W、388K、388R、389G、415H、433K、433P、434H/517A/532Y/681A、517A/681A、531A、531R、531T、532Y/681A、535A、535H、535S、536L/580M/681A、539A、539R、562I/681A、589S、606A、606H、606I、606L、606M、606Q、606V、608P、707G、711K、727K、738S、748T、765A、765S、769K、769R、789N及789R,其中該位置係根據序列辨識編號:1804予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:P13H、P13K、P13N、D17R、A18G、S30H、Q37G、Q37R、D52G、D52P、D52R、D52W、P57R、P57W、D60L、R71G、R71Q、V85H、E87H、E87L、R90H、V98L、E99I、A118G、A118N、E129A、E129G、E129T、A164S、A164T、D180P、N183P、N347R/Y434H/P517A/L562I/T640N/V681A、N347R/Y434H/S532Y/L562I/T640N/V681A、N347R/Y434H/Q550I/L562I/V681A、N347R/Y434H/V681A、N347R/P517A/S532Y/V681A、N347R/S532Y/Q550I/T640N/V681A/H699F、N347R/E536L/L562I/V681A、N347R/Q550I/L580M/V681A、N347R/Q550I/V681A、N347R/V681A、H365W、L388K、L388R、A389G、K415H、L433K、L433P、Y434H/P517A/S532Y/V681A、P517A/V681A、S531A、S531R、S531T、S532Y/V681A、P535A、P535H、P535S、E536L/L580M/V681A、S539A、S539R、L562I/V681A、G589S、R606A、R606H、R606I、R606L、R606M、R606Q、R606V、A608P、A707G、R711K、E727K、E738S、E748T、D765A、D765S、Q769K、Q769R、A789N及A789R,其中該位置係根據序列辨識編號:1804予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982及1984。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982及1984。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982及1984。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:17/52/87/118/129/388/589/738/765、17/52/87/118/129/589/738、17/52/87/118/129/589/738/765、17/52/87/118/129/589/765、17/52/87/129/388/589、17/52/87/129/388/589/738、17/52/87/129/738、17/52/87/388/589/765、17/52/87/589/738/765、17/52/118/129/265/589/765、17/52/118/129/388/589/738/765、17/52/118/129/589/738/765、17/52/118/129/738/765、17/52/118/388/589/738、17/52/118/388/589/738/765、17/52/118/388/738/765、17/52/129/388/589/738、17/52/129/388/589/738/765、17/52/129/589、17/52/129/589/738、17/52/129/589/765、17/52/129/653/738/765、17/52/129/738、17/52/129/738/765、17/52/388/589/738、17/52/388/589/738/765、17/52/589/738/765、17/52/589/765、17/87/118/388/738、17/87/129/388/738、17/118/129/388/738/765、17/129/589、17/129/589/738、17/129/589/738/765、17/129/738/765、17/388/589/738、17/589/738、17/589/765、17/738/765、52/84/129/388/738/765、52/87/118/129/388/765、52/87/118/388/589/738、52/87/118/589/738/765、52/87/129/388/738/765、52/87/129/765、52/87/589/738、52/87/738、52/118/129/589/738、52/118/129/765、52/118/388/589/738、52/118/388/738/765、52/129/589/738/765、52/129/589/765、52/129/738、52/388/738/765、52/589/738、52/589/738/765、52/738/765、84/129/589/738/765、87/118/129/765、87/129/388/589及589/738/765,其中該位置係根據序列辨識編號:1840予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:17R/52G/87H/118N/129G/589S/738S、17R/52G/87H/118N/129T/589S/765S、17R/52G/87H/129T/388K/589S/738S、17R/52G/87H/129T/738S、17R/52G/87H/388K/589S/765S、17R/52G/118N/129T/388K/589S/738S/765S、17R/52G/118N/388K/738S/765S、17R/52G/129G/589S/738S、17R/52G/129T/388K/589S/738S、17R/52G/129T/589S、17R/52G/129T/653H/738S/765S、17R/52G/589S/765S、17R/52P/87H/118N/129T/388K/589S/738S/765S、17R/52P/87H/118N/129T/589S/738S/765S、17R/52P/87H/129G/388K/589S、17R/52P/87H/129T/388K/589S/738S、17R/52P/87H/589S/738S/765S、17R/52P/118N/129T/265T/589S/765S、17R/52P/118N/129T/589S/738S/765S、17R/52P/118N/129T/738S/765S、17R/52P/118N/388K/589S/738S、17R/52P/118N/388K/589S/738S/765S、17R/52P/129G/388K/589S/738S/765S、17R/52P/129G/738S/765S、17R/52P/129T/589S/765S、17R/52P/129T/738S、17R/52P/388K/589S/738S、17R/52P/388K/589S/738S/765S、17R/52P/589S/738S/765S、17R/87H/118N/388K/738S、17R/87H/129T/388K/738S、17R/118N/129T/388K/738S/765S、17R/129T/589S、17R/129T/589S/738S、17R/129T/589S/738S/765S、17R/129T/738S/765S、17R/388K/589S/738S、17R/589S/738S、17R/589S/765S、17R/738S/765S、52G/84A/129T/388K/738S/765S、52G/87H/118N/589S/738S/765S、52G/87H/129T/388K/738S/765S、52G/87H/738S、52G/118N/388K/589S/738S、52G/118N/388K/738S/765S、52G/129G/589S/765S、52G/388K/738S/765S、52G/589S/738S/765S、52G/738S/765S、52P/87H/118N/129T/388K/765S、52P/87H/118N/388K/589S/738S、52P/87H/129G/765S、52P/87H/589S/738S、52P/118N/129T/589S/738S、52P/118N/129T/765S、52P/129T/589S/738S/765S、52P/129T/738S、52P/589S/738S、52P/589S/738S/765S、84A/129T/589S/738S/765S、87H/118N/129T/765S、87H/129T/388K/589S及589S/738S/765S,其中該位置係根據序列辨識編號:1840予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:D17R/D52G/E87H/A118N/E129G/G589S/E738S、D17R/D52G/E87H/A118N/E129T/G589S/D765S、D17R/D52G/E87H/E129T/L388K/G589S/E738S、D17R/D52G/E87H/E129T/E738S、D17R/D52G/E87H/L388K/G589S/D765S、D17R/D52G/A118N/E129T/L388K/G589S/E738S/D765S、D17R/D52G/A118N/L388K/E738S/D765S、D17R/D52G/E129G/G589S/E738S、D17R/D52G/E129T/L388K/G589S/E738S、D17R/D52G/E129T/G589S、D17R/D52G/E129T/R653H/E738S/D765S、D17R/D52G/G589S/D765S、D17R/D52P/E87H/A118N/E129T/L388K/G589S/E738S/D765S、D17R/D52P/E87H/A118N/E129T/G589S/E738S/D765S、D17R/D52P/E87H/E129G/L388K/G589S、D17R/D52P/E87H/E129T/L388K/G589S/E738S、D17R/D52P/E87H/G589S/E738S/D765S、D17R/D52P/A118N/E129T/S265T/G589S/D765S、D17R/D52P/A118N/E129T/G589S/E738S/D765S、D17R/D52P/A118N/E129T/E738S/D765S、D17R/D52P/A118N/L388K/G589S/E738S、D17R/D52P/A118N/L388K/G589S/E738S/D765S、D17R/D52P/E129G/L388K/G589S/E738S/D765S、D17R/D52P/E129G/E738S/D765S、D17R/D52P/E129T/G589S/D765S、D17R/D52P/E129T/E738S、D17R/D52P/L388K/G589S/E738S、D17R/D52P/L388K/G589S/E738S/D765S、D17R/D52P/G589S/E738S/D765S、D17R/E87H/A118N/L388K/E738S、D17R/E87H/E129T/L388K/E738S、D17R/A118N/E129T/L388K/E738S/D765S、D17R/E129T/G589S、D17R/E129T/G589S/E738S、D17R/E129T/G589S/E738S/D765S、D17R/E129T/E738S/D765S、D17R/L388K/G589S/E738S、D17R/G589S/E738S、D17R/G589S/D765S、D17R/E738S/D765S、D52G/G84A/E129T/L388K/E738S/D765S、D52G/E87H/A118N/G589S/E738S/D765S、D52G/E87H/E129T/L388K/E738S/D765S、D52G/E87H/E738S、D52G/A118N/L388K/G589S/E738S、D52G/A118N/L388K/E738S/D765S、D52G/E129G/G589S/D765S、D52G/L388K/E738S/D765S、D52G/G589S/E738S/D765S、D52G/E738S/D765S、D52P/E87H/A118N/E129T/L388K/D765S、D52P/E87H/A118N/L388K/G589S/E738S、D52P/E87H/E129G/D765S、D52P/E87H/G589S/E738S、D52P/A118N/E129T/G589S/E738S、D52P/A118N/E129T/D765S、D52P/E129T/G589S/E738S/D765S、D52P/E129T/E738S、D52P/G589S/E738S、D52P/G589S/E738S/D765S、G84A/E129T/G589S/E738S/D765S、E87H/A118N/E129T/D765S、E87H/E129T/L388K/G589S及G589S/E738S/D765S,其中該位置係根據序列辨識編號:1840予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14、15、18/362、20、24、26、33、33/154、46、50、54、58、59、59/72、79、81、92、93、97/154、104、105、130、134、154、165、175、185、212、213、218、241、256、263、316、319、349、360、362、364、390、393、434、480、498、530、534、534/739、542、603及652,其中該位置係根據序列辨識編號:1840予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:14K、15A、15I、15P、18V/362A、20M、24S、26A、26E、26I、26T、33H/154C、33L、33P、33S、46G、46I、46R、46T、46V、50R、54M、58M、59A、59C、59N/72N、59R、59S、59V、59W、79H、79Y、81G、81I、81L、92G、93T、97V/154S、104T、105S、130Y、134A、134P、154A、154E、154R、154S、165I、165L、165T、175G、175T、185L、212Y、213V、218A、218N、218Q、218S、218T、218V、241T、256G、263S、263Y、316H、316T、319S、349D、349R、349T、360D、360E、360R、362E、364S、390M、393H、434G、434R、480P、480V、498L、498Q、530F、534G、534K、534L、534R、534T、534W、534W/739K、542W、603A、603E、603H、603Q、603S、652K、652L、652R、652S及652T,其中該位置係根據序列辨識編號:1840予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:R14K、S15A、S15I、S15P、A18V/I362A、L20M、V24S、S26A、S26E、S26I、S26T、Q33H/H154C、Q33L、Q33P、Q33S、Q46G、Q46I、Q46R、Q46T、Q46V、G50R、D54M、L58M、E59A、E59C、E59N/D72N、E59R、E59S、E59V、E59W、W79H、W79Y、P81G、P81I、P81L、H92G、V93T、A97V/H154S、D104T、E105S、D130Y、V134A、V134P、H154A、H154E、H154R、H154S、A165I、A165L、A165T、S175G、S175T、M185L、W212Y、A213V、D218A、D218N、D218Q、D218S、D218T、D218V、L241T、S256G、M263S、M263Y、V316H、V316T、R319S、Q349D、Q349R、Q349T、G360D、G360E、G360R、I362E、P364S、E390M、S393H、Y434G、Y434R、I480P、I480V、E498L、E498Q、P530F、E534G、E534K、E534L、E534R、E534T、E534W、E534W/E739K、F542W、G603A、G603E、G603H、G603Q、G603S、G652K、G652L、G652R、G652S及G652T,其中該位置係根據序列辨識編號:1840予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316及2318。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316及2318。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316及2318。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:57/71/87/347/434/562/606、57/71/129/180/434/536/562、57/71/129/434/531/536/562、57/71/129/531/532/536/539/606、57/71/562/606/711/789、57/71/789、57/87/180/531/532/562/606/612/711、57/87/347/562、57/90/129/562、57/90/129/562/711、57/96/129/180/531/532/550/562、57/129/347/531/532/539/562/711/747、57/129/347/536/550/562/711/789、57/129/347/550/711、57/129/531/539/562/789、57/129/536/606/789、57/129/606、57/180/562、57/180/562/606/612、57/347/434/531/532/539/789、57/434/550/562/606/612/789、57/531/532/536/562、57/562/606/711、57/562/711、71/129/180/347/531/539/550、71/129/180/434/532/536/539/711/789、71/129/531、71/129/606、71/347/532/550/562/711、71/347/536/562/612/789、71/536/539/562、87/189/532/536/562/711/789、87/347/531/606/789、87/347/536/539/550、90/129/539/550/606、129/180/434/562/711/789、129/180/606/711/789、129/347/562、129/536/539/562、129/539/562/789、129/550、129/550/562、129/562/606/711、180/532、180/550/606、347/531/550/711、347/536/539/550/711/789、347/536/562/606/612、347/550/562/606、434/531/539/550/562/711、434/550、531/532/536/539/562/711/789、531/532/536/550/562/606/789、531/532/562/606/711、532/539/550及562/711,其中該位置係根據序列辨識編號:2064予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:57W/71Q/87H/347R/434H/562I/606H、57W/71Q/129G/531R/532Y/536L/539R/606H、57W/71Q/129T/180P/434H/536L/562I、57W/71Q/129T/434H/531R/536L/562I、57W/71Q/562I/606M/711K/789N、57W/71Q/789N、57W/87H/180P/531R/532Y/562I/606M/612A/711K、57W/87H/347R/562I、57W/90H/129G/562I、57W/90H/129T/562I/711K、57W/96Q/129T/180P/531R/532Y/550I/562I、57W/129G/531R/539R/562I/789N、57W/129G/536L/606M/789N、57W/129T/347R/531R/532Y/539R/562I/711K/747V、57W/129T/347R/536L/550I/562I/711K/789N、57W/129T/347R/550I/711K、57W/129T/606M、57W/180P/562I、57W/180P/562I/606H/612A、57W/347R/434H/531R/532Y/539R/789N、57W/434H/550I/562I/606H/612A/789N、57W/531R/532Y/536L/562I、57W/562I/606M/711K、57W/562I/711K、71Q/129T/180P/347R/531R/539R/550I、71Q/129T/180P/434H/532Y/536L/539R/711K/789N、71Q/129T/531R、71Q/129T/606M、71Q/347R/532Y/550I/562I/711K、71Q/347R/536L/562I/612A/789N、71Q/536L/539R/562I、87H/189D/532Y/536L/562I/711K/789N、87H/347R/531R/606M/789N、87H/347R/536L/539R/550I、90H/129T/539R/550I/606H、129G/550I、129G/550I/562I、129G/562I/606M/711K、129T/180P/434H/562I/711K/789N、129T/180P/606M/711K/789N、129T/347R/562I、129T/536L/539R/562I、129T/539R/562I/789N、129T/550I/562I、180P/532Y、180P/550I/606M、347R/531R/550I/711K、347R/536L/539R/550I/711K/789N、347R/536L/562I/606M/612A、347R/550I/562I/606H、434H/531R/539R/550I/562I/711K、434H/550I、531R/532Y/536L/539R/562I/711K/789N、531R/532Y/536L/550I/562I/606M/789N、531R/532Y/562I/606H/711K、532Y/539R/550I及562I/711K,其中該位置係根據序列辨識編號:2064予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:P57W/R71Q/E87H/N347R/Y434H/L562I/R606H、P57W/R71Q/E129G/S531R/S532Y/E536L/S539R/R606H、P57W/R71Q/E129T/D180P/Y434H/E536L/L562I、P57W/R71Q/E129T/Y434H/S531R/E536L/L562I、P57W/R71Q/L562I/R606M/R711K/A789N、P57W/R71Q/A789N、P57W/E87H/D180P/S531R/S532Y/L562I/R606M/E612A/R711K、P57W/E87H/N347R/L562I、P57W/R90H/E129G/L562I、P57W/R90H/E129T/L562I/R711K、P57W/L96Q/E129T/D180P/S531R/S532Y/Q550I/L562I、P57W/E129G/S531R/S539R/L562I/A789N、P57W/E129G/E536L/R606M/A789N、P57W/E129T/N347R/S531R/S532Y/S539R/L562I/R711K/A747V、P57W/E129T/N347R/E536L/Q550I/L562I/R711K/A789N、P57W/E129T/N347R/Q550I/R711K、P57W/E129T/R606M、P57W/D180P/L562I、P57W/D180P/L562I/R606H/E612A、P57W/N347R/Y434H/S531R/S532Y/S539R/A789N、P57W/Y434H/Q550I/L562I/R606H/E612A/A789N、P57W/S531R/S532Y/E536L/L562I、P57W/L562I/R606M/R711K、P57W/L562I/R711K、R71Q/E129T/D180P/N347R/S531R/S539R/Q550I、R71Q/E129T/D180P/Y434H/S532Y/E536L/S539R/R711K/A789N、R71Q/E129T/S531R、R71Q/E129T/R606M、R71Q/N347R/S532Y/Q550I/L562I/R711K、R71Q/N347R/E536L/L562I/E612A/A789N、R71Q/E536L/S539R/L562I、E87H/G189D/S532Y/E536L/L562I/R711K/A789N、E87H/N347R/S531R/R606M/A789N、E87H/N347R/E536L/S539R/Q550I、R90H/E129T/S539R/Q550I/R606H、E129G/Q550I、E129G/Q550I/L562I、E129G/L562I/R606M/R711K、E129T/D180P/Y434H/L562I/R711K/A789N、E129T/D180P/R606M/R711K/A789N、E129T/N347R/L562I、E129T/E536L/S539R/L562I、E129T/S539R/L562I/A789N、E129T/Q550I/L562I、D180P/S532Y、D180P/Q550I/R606M、N347R/S531R/Q550I/R711K、N347R/E536L/S539R/Q550I/R711K/A789N、N347R/E536L/L562I/R606M/E612A、N347R/Q550I/L562I/R606H、Y434H/S531R/S539R/Q550I/L562I/R711K、Y434H/Q550I、S531R/S532Y/E536L/S539R/L562I/R711K/A789N、S531R/S532Y/E536L/Q550I/L562I/R606M/A789N、S531R/S532Y/L562I/R606H/R711K、S532Y/S539R/Q550I及L562I/R711K,其中該位置係根據序列辨識編號:2064予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:21、25/112、41、89、91、112、186、200、226、259、318、330、485、487、641、674、684、688、763及764,其中該位置係根據序列辨識編號:2064予以編號。
在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:21Q、25T/112W、41K、89L、89M、91C、91G、112Q、112R、186V、200A、226V、259G、318A、330A、485A、485S、487I、487K、487R、487T、487V、641L、674A、684G、684H、684M、684T、688A、688F、688G、688H、688Q、763L及764R,其中該位置係根據序列辨識編號:2064予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:R21Q、A25T/G112W、A41K、V89L、V89M、I91C、I91G、G112Q、G112R、L186V、V200A、P226V、D259G、P318A、S330A、G485A、G485S、Q487I、Q487K、Q487R、Q487T、Q487V、V641L、S674A、F684G、F684H、F684M、F684T、L688A、L688F、L688G、L688H、L688Q、V763L及L764R,其中該位置係根據序列辨識編號:2064予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500及2502。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500及2502。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500及2502。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:33/47/59/81/175/530/534/550/606、33/58/59/81/130/480/530/534/550/652、33/58/59/480/530/534/550、33/58/154/480/534/550/603/606、33/59/480/530/534/550/606、33/79/81/175/530/534、33/79/81/175/530/534/603、33/79/154/480/530/534/550、33/81/130/480/530/534/550、33/81/175/530/534/542/550/652、33/130/530/534/550、33/154/480/530/534/603/606、33/154/534、33/530/534/550、58/59/79/175/480/534/550/652、59/154/530/534/550、79/81/480/530/534/550/603/606/652、81/480/530/534/550及130/480/530/534/550/603/606,其中該位置係根據序列辨識編號:2432予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:33H/47P/59A/81L/175G/530F/534W/550I/606M、33H/58M/59A/81G/130Y/480V/530F/534W/550I/652K、33H/58M/59A/480P/530F/534W/550I、33H/58M/154A/480P/534W/550I/603A/606M、33H/59A/480P/530F/534W/550I/606M、33H/79H/81G/175G/530F/534W、33H/79H/81L/175G/530F/534W/603Q、33H/79H/154A/480P/530F/534W/550I、33H/81G/130Y/480V/530F/534W/550I、33H/81I/175G/530F/534W/542W/550I/652R、33H/130Y/530F/534W/550I、33H/154A/480P/530F/534W/603Q/606M、33H/154A/534W、33H/530F/534W/550I、58M/59A/79H/175G/480P/534W/550I/652R、59A/154A/530F/534W/550I、79H/81I/480P/530F/534W/550I/603E/606M/652R、81G/480V/530F/534W/550I及130Y/480V/530F/534W/550I/603Q/606M,其中該位置係根據序列辨識編號:2432予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q33H/L47P/E59A/
P81L/S175G/P530F/E534W/Q550I/R606M、Q33H/L58M/
E59A/P81G/D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I/G652K、Q33H/L58M/E59A/I480P/P530F/E534W/Q550I、Q33H/L58M/H154A/I480P/E534W/Q550I/G603A/R606M、Q33H/E59A/I480P/P530F/E534W/Q550I/R606M、Q33H/W79H/P81G/S175G/P530F/E534W、Q33H/W79H/P81L/S175G/P530F/E534W/G603Q、Q33H/W79H/H154A/I480P/P530F/E534W/Q550I、Q33H/P81G/D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I、Q33H/P81I/S175G/P530F/E534W/F542W/Q550I/G652R、Q33H/D130Y/P530F/E534W/Q550I、Q33H/H154A/I480P/P530F/E534W/G603Q/R606M、Q33H/H154A/E534W、Q33H/P530F/E534W/Q550I、L58M/E59A/W79H/S175G/I480P/E534W/Q550I/G652R、E59A/H154A/P530F/E534W/Q550I、W79H/P81I/I480P/P530F/E534W/Q550I/G603E/R606M/G652R、P81G/I480V/P530F/E534W/Q550I及D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I/G603Q/R606M,其中該位置係根據序列辨識編號:2432予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:25、42、70、75、77、106、199、265、267、380、410、561、642及758,其中該位置係根據序列辨識編號:2432予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:25E、25G、25L、42H、42S、42T、70H、70N、70R、70S、70V、75T、75W、77L、77W、106W、199A、265A、265Q、267I、380T、410S、561I、561V、642V、758Q及758R,其中該位置係根據序列辨識編號:2432予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:A25E、A25G、A25L、D42H、D42S、D42T、F70H、F70N、F70R、F70S、F70V、M75T、M75W、F77L、F77W、Y106W、T199A、S265A、S265Q、V267I、A380T、T410S、L561I、L561V、A642V、G758Q及G758R,其中該位置係根據序列辨識編號:2432予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592及2594。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592及2594。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592及2594。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:41、41/71、41/71/112、41/71/112/259/485/487/684/688、41/71/112/259/485/688、41/71/259/485/532、41/71/485、41/71/485/532/684、41/71/487、41/71/487/532/684、41/71/532、41/71/532/684、41/71/684、41/84/259/485/487、41/91/112/485、41/91/112/485/487/532/684、41/91/112/485/532/684、41/91/485、41/112、41/112/259/485/487、41/112/259/487/532/684、41/112/485/684、41/112/487/684、41/112/532、41/112/684/688、41/259/485、41/259/485/487、41/259/485/487/532/684、41/259/485/487/684/688、41/259/532、41/485、41/485/487、41/485/487/684/688、41/485/532、41/485/532/688、41/485/684/688、41/487/684、41/532、41/684、41/684/688、44/112/684/688、71/112/259/485/487/684、71/112/485/688、71/485/684/688、71/532、71/684/688、112、112/259、112/259/532/684/688、112/259/684/688、112/485/684、112/485/684/688、226/487/684/688、259/485/487/684、259/485/532、259/487/684/688、259/532、485、485/487、485/487/532、485/487/532/684、485/487/684、485/487/684/688、485/532、485/684、485/684/688、532、532/684/688、684及684/688,其中該位置係根據序列辨識編號:2510予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:41K、41K/71Q、41K/71Q/112Q、41K/71Q/112Q/259G/485A/688Q、41K/71Q/112W/259G/485S/487R/684H/688Q、41K/71Q/259G/485A/532Y、41K/71Q/485A、41K/71Q/485A/532Y/684H、41K/71Q/487R、41K/71Q/487R/532Y/684H、41K/71Q/532Y、41K/71Q/532Y/684H、41K/71Q/684H、41K/84A/259G/485A/487I、41K/91C/112Q/485S、41K/91C/112Q/485S/487K/532Y/684H、41K/91C/112Q/485S/532Y/684H、41K/91C/485S、41K/112Q/259G/485S/487R、41K/112Q/259G/487R/532Y/684H、41K/112Q/485S/684H、41K/112Q/487I/684H、41K/112Q/532Y、41K/112Q/684H/688A、41K/112W、41K/259G/485A/487I、41K/259G/485A/487R/532Y/684H、41K/259G/485A/487R/684H/688A、41K/259G/485S、41K/259G/532Y、41K/485A、41K/485A/487K、41K/485A/487R、41K/485A/532Y、41K/485A/532Y/688G、41K/485S/487I/684M/688G、41K/485S/684M/688A、41K/487I/684M、41K/487R/684M、41K/532Y、41K/684H、41K/684M/688A、44C/112W/684H/688A、71Q/112Q/259G/485A/487R/684M、71Q/112W/485S/688A、71Q/485S/684M/688Q、71Q/532Y、71Q/684M/688A、112Q、112Q/259G/532Y/684M/688G、112Q/259G/684M/688Q、112Q/485S/684H、112Q/485S/684H/688G、112Q/485S/684M/688G、112W、112W/259G、226V/487I/684M/688A、259G/485S/487K/684H、259G/485S/532Y、259G/487I/684M/688G、259G/532Y、485A、485A/487R、485A/532Y、485A/684H/688G、485A/684M、485S、485S/487I/684H/688Q、485S/487I/684M、485S/487K/532Y、485S/487R/532Y/684H、485S/684M/688G、532Y、532Y/684H/688Q、684H及684M/688Q,其中該位置係根據序列辨識編號:2510予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:A41K、A41K/R71Q、A41K/R71Q/G112Q、A41K/R71Q/G112Q/D259G/G485A/L688Q、A41K/R71Q/G112W/D259G/G485S/Q487R/F684H/L688Q、A41K/R71Q/D259G/G485A/S532Y、A41K/R71Q/G485A、A41K/R71Q/G485A/S532Y/F684H、A41K/R71Q/Q487R、A41K/R71Q/Q487R/S532Y/F684H、A41K/R71Q/S532Y、A41K/R71Q/S532Y/F684H、A41K/R71Q/F684H、A41K/G84A/D259G/G485A/Q487I、A41K/I91C/G112Q/G485S、A41K/I91C/G112Q/G485S/Q487K/S532Y/F684H、A41K/I91C/G112Q/G485S/S532Y/F684H、A41K/I91C/G485S、A41K/G112Q/D259G/G485S/Q487R、A41K/G112Q/D259G/Q487R/S532Y/F684H、A41K/G112Q/G485S/F684H、A41K/G112Q/Q487I/F684H、A41K/G112Q/S532Y、A41K/G112Q/F684H/L688A、A41K/G112W、A41K/D259G/G485A/Q487I、A41K/D259G/G485A/Q487R/S532Y/F684H、A41K/D259G/G485A/Q487R/F684H/L688A、A41K/D259G/G485S、A41K/D259G/S532Y、A41K/G485A、A41K/G485A/Q487K、A41K/G485A/Q487R、A41K/G485A/S532Y、A41K/G485A/S532Y/L688G、A41K/G485S/Q487I/F684M/L688G、A41K/G485S/F684M/L688A、A41K/Q487I/F684M、A41K/Q487R/F684M、A41K/S532Y、A41K/F684H、A41K/F684M/L688A、R44C/G112W/F684H/L688A、R71Q/G112Q/D259G/G485A/Q487R/F684M、R71Q/G112W/G485S/L688A、R71Q/G485S/F684M/L688Q、R71Q/S532Y、R71Q/F684M/L688A、G112Q、G112Q/D259G/S532Y/F684M/L688G、G112Q/D259G/F684M/L688Q、G112Q/G485S/F684H、G112Q/G485S/F684H/L688G、G112Q/G485S/F684M/L688G、G112W、G112W/D259G、P226V/Q487I/F684M/L688A、D259G/G485S/Q487K/F684H、D259G/G485S/S532Y、D259G/Q487I/F684M/L688G、D259G/S532Y、G485A、G485A/Q487R、G485A/S532Y、G485A/F684H/L688G、G485A/F684M、G485S、G485S/Q487I/F684H/L688Q、G485S/Q487I/F684M、G485S/Q487K/S532Y、G485S/Q487R/S532Y/F684H、G485S/F684M/L688G、S532Y、S532Y/F684H/L688Q、F684H及F684M/L688Q,其中該位置係根據序列辨識編號:2510予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:7/12、12、27、29、44、45、47、48、51、55、72、95、100、116、136、139、176、178、198、201、205、205/485、207、208、280、303、317、343、358、361、440、478、611、615、630、675、724、756及788,其中該位置係根據序列辨識編號:2510予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:7K/12L、12C、12N、12Q、12S、12V、27R、29A、29G、29L、29P、44L、44V、45A、45C、45G、45L、45S、45V、47C、47D、47I、47L、47N、47T、47V、48A、48V、51P、51S、55D、55S、72E、95D、95L、95N、95T、95V、100K、100P、100Q、116A、116F、136A、136F、136K、136N、136P、136Q、139K、176M、176R、176T、176V、178H、198A、198R、201S、205R/485S、205S、207K、208K、280G、303V、317I、343A、343N、358P、358S、361A、361L、361T、440R、478H、478I、478Q、611A、615C、615K、615L、615M、630M、675C、724G、724K、724S、756C及788K,其中該位置係根據序列辨識編號:2510予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q7K/D12L、D12C、D12N、D12Q、D12S、D12V、Q27R、D29A、D29G、D29L、D29P、R44L、R44V、E45A、E45C、E45G、E45L、E45S、E45V、P47C、P47D、P47I、P47L、P47N、P47T、P47V、P48A、P48V、Y51P、Y51S、I55D、I55S、D72E、Q95D、Q95L、Q95N、Q95T、Q95V、E100K、E100P、E100Q、L116A、L116F、R136A、R136F、R136K、R136N、R136P、R136Q、R139K、L176M、L176R、L176T、L176V、R178H、Q198A、Q198R、Q201S、T205R/G485S、T205S、P207K、R208K、K280G、R303V、E317I、H343A、H343N、E358P、E358S、R361A、R361L、R361T、P440R、R478H、R478I、R478Q、R611A、R615C、R615K、R615L、R615M、L630M、S675C、H724G、H724K、H724S、V756C及H788K,其中該位置係根據序列辨識編號:2510予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762及7764。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762及7764。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762及7764。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8/25/55/95/208/358/440/517/788、12/45/47、12/45/47/48/51/136/142/630、12/45/47/51/136/139/630/758、12/45/47/136/139/142/675/758、12/45/51/136/139/630/675/756/758、12/45/51/630/756、12/48/51/136/139/758、12/136/139/142/756/758、12/136/142、12/630/756、25/29/208/440、25/100/154/208/440/517/705/788、25/517、29/208/361/517/788、42/198/199/480/532/539/561、42/198/532/561、42/198/532/561/724、42/199/480/532/561、42/259/480/561、42/259/480/652、42/480/561、42/480/561/724、42/561、47/51/136/756/758、55、55/410/440/603/788、55/517、55/517/788、70、70/642、77/176/487/615/642、95/603、106/199/539/561/652、116、136/139/142、154/361/440/517/603/788、176、198/199/480/561、198/199/480/561/724、198/199/561/724、198/480/561、198/480/724、199/532/539/561/652/724、259/480、267/611/642、280/440/517、380、480/561/652、480/561/652/724/764、480/724、517、532/539/561、532/561/724、603及642,其中該位置係根據序列辨識編號:7506予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:8R/25E/55D/95T/208K/358S/440V/517P/788K、12N/45A/47I/51P/136P/139K/630M/758R、12N/45A/51P/136P/139K/630M/675C/756C/758Q、12N/48A/51P/136Q/139K/758Q、12N/136Q/142N、12S/45A/51P/630M/756C、12S/630M/756C、12V/45A/47I/48A/51S/136Q/142N/630M、12V/45A/47I/136Q/139K/142N/675C/758Q、12V/45A/47L、12V/136Q/139K/142N/756C/758Q、25E/29P/208K/440R、25E/100K/154A/208K/440R/517P/705M/788K、25E/517P、29P/208K/361T/517P/788K、42T/198R/199A/480V/532Y/539R/561V、42T/198R/532Y/561I/724K、42T/198R/532Y/561V、42T/199A/480V/532Y/561V、42T/259G/480V/561V、42T/259G/480V/652K、42T/480P/561I、42T/480V/561I/724K、42T/561I、47I/51S/136Q/756C/758Q、55D、55D/410S/440R/603E/788K、55D/517P、55D/517P/788K、70N、70N/642V、77L/176M/487K/615M/642V、95T/603E、106W/199A/539R/561I/652R、116F、136P/139K/142N、154A/361T/440R/517P/603E/788K、176T、198R/199A/480P/561I、198R/199A/480P/561V/724K、198R/199A/561V/724G、198R/480P/561I、198R/480V/724K、199A/532Y/539R/561I/652R/724S、259G/480V、267I/611Q/642V、280G/440R/517P、380T、480V/561V/652R、480V/561V/652R/724K/764R、480V/724K、517P、532Y/539R/561V、532Y/561I/724K、603E及642V,其中該位置係根據序列辨識編號:7506予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:Q8R/A25E/I55D/Q95T/R208K/E358S/P440V/A517P/H788K、D12N/E45A/P47I/Y51P/R136P/R139K/L630M/G758R、D12N/E45A/Y51P/R136P/R139K/L630M/S675C/V756C/G758Q、D12N/P48A/Y51P/R136Q/R139K/G758Q、D12N/R136Q/S142N、D12S/E45A/Y51P/L630M/
V756C、D12S/L630M/V756C、D12V/E45A/
P47I/P48A/Y51S/R136Q/S142N/L630M、D12V/E45A/
P47I/R136Q/R139K/S142N/S675C/G758Q、D12V/
E45A/P47L、D12V/R136Q/R139K/S142N/V756C/
G758Q、A25E/D29P/R208K/P440R、A25E/E100K/
H154A/R208K/P440R/A517P/P705M/H788K、A25E/A517P、D29P/R208K/R361T/A517P/H788K、D42T/Q198R/T199A/I480V/S532Y/S539R/L561V、D42T/Q198R/S532Y/L561I/H724K、D42T/Q198R/S532Y/L561V、D42T/T199A/I480V/S532Y/L561V、D42T/D259G/I480V/L561V、D42T/D259G/I480V/G652K、D42T/I480P/L561I、D42T/I480V/L561I/H724K、D42T/L561I、P47I/Y51S/R136Q/V756C/G758Q、I55D、I55D/T410S/P440R/G603E/H788K、I55D/A517P、I55D/A517P/H788K、F70N、F70N/A642V、F77L/L176M/Q487K/R615M/A642V、Q95T/G603E、Y106W/T199A/S539R/L561I/G652R、L116F、R136P/R139K/S142N、H154A/R361T/P440R/A517P/
G603E/H788K、L176T、Q198R/T199A/I480P/L561I、Q198R/T199A/I480P/L561V/H724K、Q198R/T199A/L561V/H724G、Q198R/I480P/L561I、Q198R/I480V/H724K、T199A/S532Y/S539R/L561I/
G652R/H724S、D259G/I480V、V267I/R611Q/A642V、K280G/P440R/A517P、A380T、I480V/L561V/G652R、I480V/L561V/G652R/H724K/L764R、I480V/H724K、A517P、S532Y/S539R/L561V、S532Y/L561I/H724K、G603E及A642V,其中該位置係根據序列辨識編號:7506予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478及8480。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478及8480。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478及8480。
本發明亦提供經工程處理之蔗糖合成酶,其中該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:12/45/95/136/139/199/517/630/756、12/45/95/136/756、12/45/136/139/199/517/603、12/45/136/139/208/603/630/756、12/45/136/139/517/603/756、12/45/136/139/517/630/642/756、12/45/136/139/517/756、12/45/136/139/603/756、12/45/136/139/642/756、12/45/136/176/517/603/630/642、12/45/136/208/517/630/756、12/45/136/517/603/642/756/789、12/45/136/517/630/642/756、12/45/136/603/756、12/45/136/630/642、12/45/139/176/208/517/603/630、12/45/139/199/208/603、12/45/139/517/756、12/45/139/756、12/45/176/603/630/642/756、12/45/199/208/517/603/630/756、12/45/208/517/603/642/756、12/95/136/139/517/603/756、12/95/139/517/630/756、12/95/139/517/642、12/95/139/630/642、12/95/199/517/642、12/95/517/630/756、12/95/630/756、12/136、12/136/139/176/517/603/630、12/136/139/176/517/603/756、12/136/139/176/630/756、12/136/139/176/642、12/136/139/176/756、12/136/139/199/208/517/603/756、12/136/139/199/208/517/630/642/756、12/136/139/208/517、12/136/139/517、12/136/139/517/603/630/642/756、12/136/139/517/603/630/756、12/136/139/517/603/756、12/136/139/517/630、12/136/139/517/630/642、12/136/139/517/630/642/756、12/136/139/517/756、12/136/139/603/630、12/136/139/603/630/642、12/136/139/603/630/756、12/136/139/603/642/756、12/136/139/630、12/136/139/630/642/756、12/136/139/630/756、12/136/139/642/756、12/136/176/208/517/603/630/756、12/136/176/517/642、12/136/176/603/756、12/136/199/208/517/603/642/756、12/136/199/208/630/642、12/136/199/517/756、12/136/208、12/136/208/603/642、12/136/517/603/630/642、12/136/517/603/630/756、12/136/517/630、12/136/517/630/642、12/136/517/642、12/136/517/642/756、12/136/517/756、12/136/603/630/642/756、12/136/603/630/756、12/136/603/642、12/136/603/642/756、12/136/603/756、12/136/630、12/136/630/756、12/139/176/517/603/630/756、12/139/176/630/756、12/139/199/208/642、12/139/199/517/630/756、12/139/208/517、12/139/208/642、12/139/517/603/642/756、12/139/517/630/642/756、12/139/517/642、12/139/603/642/756、12/139/603/756、12/139/630/642、12/139/630/642/756、12/139/630/756、12/176/517/603/630、12/176/517/630/642/756、12/176/517/756、12/176/603/630/756、12/176/603/756、12/199/208/517/642、12/199/630/642/756、12/199/642/756、12/199/756、12/208/517/603/623/630/642、12/208/603/630/756、12/208/630/756、12/517/603/630/642/756、12/517/603/630/756、12/517/603/756、12/517/630/642/756、12/517/642/756、12/603/630/756、12/603/642/756、12/603/756、12/630/642/756、12/630/756、25/176/198/532/539、116/142/198/434/440、136/139/176/199/208/517/630/642、136/139/176/517/630/642/756、136/139/199/517/603/756、136/139/208/517/630/756、136/139/208/603/630/756、136/139/517/603/630/642/756、136/139/517/603/642/756、136/139/517/603/756、136/139/517/756、136/139/603、136/139/630/642/756、136/517/756、136/603/756、136/630/642、136/630/756、136/642、136/642/756、136/756、139/199/208/517/630/756、139/199/517/642、139/208/517/630/642/756、139/517/603/756、139/517/630/756、139/642/756、154/532/652/788、199/517/603/630/756、208/517/630/642/756、517/603/630/642/756、517/630/756、603/630/756及603/756,其中該位置係根據序列辨識編號:8420予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:12N/45A/95T/136Q/139K/199A/517P/630M/756C、12N/45A/136Q/139K/199A/517P/603E、12N/45A/136Q/139K/517P/603E/756C、12N/45A/136Q/139K/517P/630M/642V/756C、12N/45A/136Q/139K/603E/756C、12N/45A/136Q/139K/642V/756C、12N/45A/136Q/208K/517P/630M/756C、12N/45A/136Q/517P/630M/642V/756C、12N/45A/136Q/603E/756C、12N/45A/136Q/630M/642V、12N/45A/139K/199A/208K/603E、12N/45A/139K/517P/756C、12N/45A/199A/208K/517P/603E/630M/756C、12N/95T/136Q/139K/517P/603Q/756C、12N/95T/139K/517P/642V、12N/95T/139K/630M/642V、12N/95T/199A/517P/642V、12N/95T/517P/630M/756C、12N/136Q、12N/136Q/139K/176T/517P/603Q/756C、12N/136Q/139K/176T/630M/756C、12N/136Q/139K/176T/642V、12N/136Q/139K/199A/208K/517P/630M/642V/756C、12N/136Q/139K/517P、12N/136Q/139K/517P/630M/642V、12N/136Q/139K/517P/630M/642V/756C、12N/136Q/139K/517P/756C、12N/136Q/139K/603E/630M、12N/136Q/139K/603Q/642V/756C、12N/136Q/139K/630M、12N/136Q/139K/642V/756C、12N/136Q/176T/603Q/756C、12N/136Q/199A/208K/517P/603E/642V/756C、12N/136Q/199A/517P/756C、12N/136Q/208K、12N/136Q/517P/630M、12N/136Q/603E/642V、12N/136Q/603E/642V/756C、12N/136Q/603Q/630M/756C、12N/136Q/603Q/642V/756C、12N/136Q/603Q/756C、12N/139K/199A/208K/642V、12N/139K/199A/517P/630M/756C、12N/139K/208K/517P、12N/139K/517P/603Q/642V/756C、12N/139K/603E/642V/756C、12N/139K/603Q/756C、12N/139K/630M/642V、12N/139K/630M/642V/756C、12N/139K/630M/756C、12N/176T/517P/603E/630M、12N/176T/517P/630M/642V/756C、12N/176T/517P/756C、12N/199A/208K/517P/642V、12N/199A/630M/642V/756C、12N/199A/642V/756C、12N/208K/517P/603E/623N/630M/642V、12N/208K/630M/756C、12N/517P/603E/756C、12N/517P/603Q/630M/756C、12N/517P/630M/642V/756C、12N/603E/642V/756C、12N/603Q/630M/756C、12N/603Q/642V/756C、12N/603Q/756C、12N/630M/642V/756C、12S/45A/95T/136Q/756C、12S/45A/136Q/139K/208K/603E/630M/756C、12S/45A/136Q/139K/517P/756C、12S/45A/136Q/176T/517P/603E/630M/642V、12S/45A/136Q/517P/603Q/642V/756C/789V、12S/45A/139K/176T/208K/517P/603E/630M、12S/45A/139K/517P/756C、12S/45A/139K/756C、12S/45A/176T/603Q/630M/642V/756C、12S/45A/208K/517P/603E/642V/756C、12S/95T/139K/517P/630M/756C、12S/95T/630M/756C、12S/136Q/139K/176T/517P/603Q/630M、12S/136Q/139K/176T/756C、12S/136Q/139K/199A/208K/517P/603E/756C、12S/136Q/139K/208K/517P、12S/136Q/139K/517P/603E/630M/642V/756C、12S/136Q/139K/517P/603E/630M/756C、12S/136Q/139K/517P/603E/756C、12S/136Q/139K/517P/603Q/630M/642V/756C、12S/136Q/139K/517P/603Q/756C、12S/136Q/139K/517P/630M、12S/136Q/139K/517P/630M/642V、12S/136Q/139K/603Q/630M/642V、12S/136Q/139K/603Q/630M/756C、12S/136Q/139K/630M/642V/756C、12S/136Q/139K/630M/756C、12S/136Q/176T/208K/517P/603E/630M/756C、12S/136Q/176T/517P/642V、12S/136Q/199A/208K/630M/642V、12S/136Q/208K/603Q/642V、12S/136Q/517P/603Q/630M/642V、12S/136Q/517P/603Q/630M/756C、12S/136Q/517P/630M/642V、12S/136Q/517P/642V、12S/136Q/517P/642V/756C、12S/136Q/517P/756C、12S/136Q/603E/756C、12S/136Q/603Q/630M/642V/756C、12S/136Q/630M、12S/136Q/630M/756C、12S/139K/176T/517P/603Q/630M/756C、12S/139K/176T/630M/756C、12S/139K/208K/642V、12S/139K/517P/630M/642V/756C、12S/139K/517P/642V、12S/139K/603Q/756C、12S/176T/603E/756C、12S/176T/603Q/630M/756C、12S/199A/756C、12S/208K/603Q/630M/756C、12S/517P/603Q/630M/642V/756C、12S/517P/630M/642V/756C、12S/517P/642V/756C、12S/603Q/630M/756C、12S/630M/756C、25E/176M/198R/532Y/539R、116F/142N/198R/434H/440R、136Q/139K/176T/199A/208K/517P/630M/642V、136Q/139K/176T/517P/630M/642V/756C、136Q/139K/199A/517P/603E/756C、136Q/139K/208K/517P/630M/756C、136Q/139K/208K/603Q/630M/756C、136Q/139K/517P/603E/642V/756C、136Q/139K/517P/603Q/630M/642V/756C、136Q/139K/517P/603Q/756C、136Q/139K/517P/756C、136Q/139K/603Q、136Q/139K/630M/642V/756C、136Q/517P/756C、136Q/603Q/756C、136Q/630M/642V、136Q/630M/756C、136Q/642V、136Q/642V/756C、136Q/756C、139K/199A/208K/517P/630M/756C、139K/199A/517P/642V、139K/208K/517P/630M/642V/756C、139K/517P/603Q/756C、139K/517P/630M/756C、139K/642V/756C、154A/532Y/652R/788K、199A/517P/603Q/630M/756C、208K/517P/630M/642V/756C、517P/603E/630M/642V/756C、517P/630M/756C、603E/630M/756C及603Q/756C,其中該位置係根據序列辨識編號:8420予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:D12N/E45A/Q95T/R136Q/R139K/T199A/A517P/L630M/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/T199A/A517P/G603E、D12N/E45A/R136Q/R139K/A517P/G603E/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/G603E/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/A642V/V756C、D12N/E45A/R136Q/R208K/A517P/L630M/V756C、D12N/E45A/R136Q/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/E45A/R136Q/G603E/V756C、D12N/E45A/R136Q/L630M/A642V、D12N/E45A/R139K/T199A/R208K/G603E、D12N/E45A/R139K/A517P/V756C、D12N/E45A/T199A/R208K/A517P/G603E/L630M/V756C、D12N/Q95T/R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C、D12N/Q95T/R139K/A517P/A642V、D12N/Q95T/R139K/L630M/A642V、D12N/Q95T/T199A/A517P/A642V、D12N/Q95T/A517P/L630M/V756C、D12N/R136Q、D12N/R136Q/R139K/L176T/A517P/G603Q/V756C、D12N/R136Q/R139K/L176T/L630M/V756C、D12N/R136Q/R139K/L176T/A642V、D12N/R136Q/R139K/T199A/R208K/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/R136Q/R139K/A517P、D12N/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V、D12N/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/R136Q/R139K/A517P/V756C、D12N/R136Q/R139K/G603E/L630M、D12N/R136Q/R139K/G603Q/A642V/V756C、D12N/R136Q/R139K/L630M、D12N/R136Q/R139K/A642V/V756C、D12N/R136Q/L176T/G603Q/V756C、D12N/R136Q/T199A/R208K/A517P/G603E/A642V/V756C、D12N/R136Q/T199A/A517P/V756C、D12N/R136Q/R208K、D12N/R136Q/A517P/L630M、D12N/R136Q/G603E/A642V、D12N/R136Q/G603E/A642V/V756C、D12N/R136Q/G603Q/L630M/V756C、D12N/R136Q/G603Q/A642V/V756C、D12N/R136Q/G603Q/V756C、D12N/R139K/T199A/R208K/A642V、D12N/R139K/T199A/A517P/L630M/V756C、D12N/R139K/R208K/A517P、D12N/R139K/A517P/G603Q/A642V/V756C、D12N/R139K/G603E/A642V/V756C、D12N/R139K/G603Q/V756C、D12N/R139K/L630M/A642V、D12N/R139K/L630M/A642V/V756C、D12N/R139K/L630M/V756C、D12N/L176T/A517P/G603E/L630M、D12N/L176T/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/L176T/A517P/V756C、D12N/T199A/R208K/A517P/A642V、D12N/T199A/L630M/A642V/V756C、D12N/T199A/A642V/V756C、D12N/R208K/A517P/G603E/H623N/L630M/A642V、D12N/R208K/L630M/V756C、D12N/A517P/G603E/V756C、D12N/A517P/G603Q/L630M/V756C、D12N/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/G603E/A642V/V756C、D12N/G603Q/L630M/V756C、D12N/G603Q/A642V/V756C、D12N/G603Q/V756C、D12N/L630M/A642V/V756C、D12S/E45A/Q95T/R136Q/V756C、D12S/E45A/R136Q/R139K/R208K/G603E/L630M/V756C、D12S/E45A/R136Q/R139K/A517P/V756C、D12S/E45A/R136Q/L176T/A517P/G603E/L630M/A642V、D12S/E45A/R136Q/A517P/G603Q/A642V/V756C/A789V、D12S/E45A/R139K/L176T/R208K/A517P/G603E/L630M、D12S/E45A/R139K/A517P/V756C、D12S/E45A/R139K/V756C、D12S/E45A/L176T/G603Q/L630M/A642V/V756C、D12S/E45A/R208K/A517P/G603E/A642V/V756C、D12S/Q95T/R139K/A517P/L630M/V756C、D12S/Q95T/L630M/V756C、D12S/R136Q/R139K/L176T/A517P/G603Q/L630M、D12S/R136Q/R139K/L176T/V756C、D12S/R136Q/R139K/T199A/R208K/A517P/G603E/V756C、D12S/R136Q/R139K/R208K/A517P、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/L630M/A642V/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/L630M/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/L630M、D12S/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V、D12S/R136Q/R139K/G603Q/L630M/A642V、D12S/R136Q/R139K/G603Q/L630M/V756C、D12S/R136Q/R139K/L630M/A642V/V756C、D12S/R136Q/R139K/L630M/V756C、D12S/R136Q/L176T/R208K/A517P/G603E/L630M/V756C、D12S/R136Q/L176T/A517P/A642V、D12S/R136Q/T199A/R208K/L630M/A642V、D12S/R136Q/R208K/G603Q/A642V、D12S/R136Q/A517P/G603Q/L630M/A642V、D12S/R136Q/A517P/G603Q/L630M/V756C、D12S/R136Q/A517P/L630M/A642V、D12S/R136Q/A517P/A642V、D12S/R136Q/A517P/A642V/V756C、D12S/R136Q/A517P/V756C、D12S/R136Q/G603E/V756C、D12S/R136Q/G603Q/L630M/A642V/V756C、D12S/R136Q/L630M、D12S/R136Q/L630M/V756C、D12S/R139K/L176T/A517P/G603Q/L630M/V756C、D12S/R139K/L176T/L630M/V756C、D12S/R139K/R208K/A642V、D12S/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C、D12S/R139K/A517P/A642V、D12S/R139K/G603Q/V756C、D12S/L176T/G603E/V756C、D12S/L176T/G603Q/L630M/V756C、D12S/T199A/V756C、D12S/R208K/G603Q/L630M/V756C、D12S/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C、D12S/A517P/L630M/A642V/V756C、D12S/A517P/A642V/V756C、D12S/G603Q/L630M/V756C、D12S/L630M/V756C、A25E/L176M/Q198R/S532Y/S539R、L116F/S142N/Q198R/Y434H/P440R、R136Q/R139K/L176T/T199A/R208K/A517P/L630M/A642V、R136Q/R139K/L176T/A517P/L630M/A642V/V756C、R136Q/R139K/T199A/A517P/G603E/V756C、R136Q/R139K/R208K/A517P/L630M/V756C、R136Q/R139K/R208K/G603Q/L630M/V756C、R136Q/R139K/A517P/G603E/A642V/V756C、R136Q/R139K/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C、R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C、R136Q/R139K/A517P/V756C、R136Q/R139K/G603Q、R136Q/R139K/L630M/A642V/V756C、R136Q/A517P/V756C、R136Q/G603Q/V756C、R136Q/L630M/A642V、R136Q/L630M/V756C、R136Q/A642V、R136Q/A642V/V756C、R136Q/V756C、R139K/T199A/R208K/A517P/L630M/V756C、R139K/T199A/A517P/A642V、R139K/R208K/A517P/L630M/A642V/V756C、R139K/A517P/G603Q/V756C、R139K/A517P/L630M/V756C、R139K/A642V/V756C、H154A/S532Y/G652R/H788K、T199A/A517P/G603Q/L630M/V756C、R208K/A517P/L630M/A642V/V756C、A517P/G603E/L630M/A642V/V756C、A517P/L630M/V756C、G603E/L630M/V756C及G603Q/V756C,其中該位置係根據序列辨識編號:8420予以編號。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少90%同一性的一序列:序列辨識編號:8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104及9106。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含與下列中任一者至少95%同一性的一序列:序列辨識編號:8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104及9106。在一些具體例中,該經工程處理之蔗糖合成酶的多肽序列包含下列中任一者:序列辨識編號:8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104及9106。
本發明亦提供經工程處理之醣基轉移酶,其為NDP-醣基轉移酶,其中該經工程處理之NDP-醣基轉移酶為選自於下列的NDP-醣基轉移酶:ADP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(AGTs)、CDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(CGTs)、GDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(GGTs)、TDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(TGTs)及IDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(IGTs)。在一些具體例中,該經工程處理之NDP-醣基轉移酶為ADP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶。在一些具體例中,該經工程處理之NDP-醣基轉移酶不是UDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶。
本發明亦提供經工程處理之多核苷酸,其編碼至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶多肽。在一些具體例中,該編碼至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶的該經工程處理之多核苷酸與下列包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性:序列辨識編號:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997、999、1001、1003、1005、1007、1009、1011、1013、1015、1017、1019、1021、1023、1025、1027、1029、1031、1033、1035、1037、1039、1041、1043、1045、1047、1049、1051、1053、1055、1057、1059、1061、1063、1065、1067、1069、1071、1073、1075、1077、1289、1291、1293、2595、2597、2599、2601、2603、2605、2607、2609、2611、2613、2615、2617、2619、2621、2623、2625、2627、2629、2631、2633、2635、2637、2639、2641、2643、2645、2647、2649、2651、2653、2655、2657、2659、2661、2663、2665、2667、2669、2671、2673、2675、2677、2679、2681、2683、2685、2687、2689、2691、2693、2695、2697、2699、2701、2703、2705、2707、2709、2711、2713、2715、2717、2719、2721、2723、2725、2727、2729、2731、2733、2735、2737、2739、2741、2743、2745、2747、2749、2751、2753、2755、2757、2759、2761、2763、2765、2767、2769、2771、2773、2775、2777、2779、2781、2783、2785、2787、2789、2791、2793、2795、2797、2799、2801、2803、2805、2807、2809、2811、2813、2815、2817、2819、2821、2823、2825、2827、2829、2831、2833、2835、2837、2839、2841、2843、2845、2847、2849、2851、2823、2855、2857、2859、2861、2863、2865、2867、2869、2871、2873、2875、2877、2879、2881、2883、2885、2887、2889、2891、2893、2895、2897、2899、2901、2903、2905、2907、2909、2911、2913、2915、2917、2919、2921、2923、2925、2927、2829、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967、2969、2971、2973、2975、2977、2979、2981、2983、2985、2987、2989、2991、2993、2995、2997、2999、3001、3003、3005、3007、3009、3011、3013、3015、3017、3019、3021、3023、3025、3027、3029、3031、3033、3035、3037、3039、3041、3043、3045、3047、3049、3051、3053、3055、3057、3059、3061、3063、3065、3067、3069、3071、3073、3075、3077、3079、3081、3083、3085、3087、3089、3091、3093、3095、3097、3099、3101、3103、3105、3107、3109、3111、3113、3115、3117、3119、3121、3123、3125、3127、3129、3131、3133、3135、3137、3139、3141、3143、3145、3147、3149、3151、3153、3155、3157、3159、3161、3163、3165、3167、3169、3171、3173、3175、3177、3179、3181、3183、3185、3187、3189、3191、3193、3195、3197、3199、3201、3203、3205、3207、3209、3211、3213、3215、3217、3219、3221、3223、3225、3227、3229、3231、3233、3235、3237、3239、3241、3243、3245、3247、3249、3251、3253、3255、3257、3259、3261、3263、3265、3267、3269、3271、3273、3275、3277、3279、3281、3283、3285、3287、3289、3291、3293、3295、3297、3299、3301、3303、3305、3307、3309、3311、3313、3315、3317、3319、3321、3323、3325、3327、3329、3331、3333、3335、3337、3339、3341、3343、3345、3347、3349、3351、3353、3355、3357、3359、3361、3363、3365、3367、3369、3371、3373、3375、3377、3379、3381、3383、3385、3387、3389、3391、3393、3395、3397、3399、3401、3403、3405、3407、3409、3411、3413、3415、3417、3419、3421、3423、3425、3427、3429、3431、3433、3435、3437、3439、3441、3443、3445、3447、3449、3451、3453、3455、3457、3459、3461、3463、3465、3467、3469、3471、3473、3475、3477、3479、3481、3483、3485、3487、3489、3491、3493、3495、3497、3499、3501、3503、3505、3507、3509、3511、3513、3515、3517、3519、3521、3523、3525、3527、3529、3531、3533、3535、3537、3539、3541、3543、3545、3547、3549、3551、3553、3555、3557、3559、3561、3563、3565、3567、3569、3571、3573、3575、3577、3579、3581、3583、3585、3587、3589、3591、3593、3595、3597、3599、3601、3603、3605、3607、3609、3611、3613、3615、3617、3619、3621、3623、3625、3627、3629、3631、3633、3635、3637、3639、3641、3643、3645、3647、3649、3651、3653、3655、3657、3659、3661、3663、3665、3667、3669、3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本發明亦提供經工程處理之多核苷酸,其編碼至少一種本文所提供的經工程處理之蔗糖合成酶多肽。在一些具體例中,該編碼至少一種本文所提供的至少一經工程處理之蔗糖合成酶的該經工程處理之多核苷酸與下列包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性:序列辨識編號:1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1115、1117、1119、1121、1123、1125、1127、1129、1131、1133、1135、1137、1139、1141、1143、1145、1147、1149、1151、1153、1155、1157、1159、1161、1163、1165、1167、1169、1171、1173、1175、1177、1179、1181、1183、1185、1187、1189、1191、1193、1195、1197、1199、1201、1203、1205、1207、1209、1211、1213、1215、1217、1219、1221、1223、1225、1227、1229、1231、1233、1235、1237、1239、1241、1243、1245、1247、1249、1251、1253、1255、1257、1259、1261、1263、1265、1267、1269、1271、1273、1275、1277、1279、1281、1283、1285、1287、1295、1297、1299、1301、1303、1305、1307、1309、1311、1313、1315、1317、1319、1321、1323、1325、1327、1329、1331、1333、1335、1337、1339、1341、1343、1345、1347、1349、1351、1353、1355、1357、1359、1361、1363、1365、1367、1369、1371、1373、1375、1377、1379、1381、1383、1385、1387、1389、1391、1393、1395、1397、1399、1401、1403、1405、1407、1409、1411、1413、1415、1417、1419、1421、1423、1425、1427、1429、1431、1433、1435、1437、1439、1441、1443、1445、1447、1449、1451、1453、1455、1457、1459、1461、1463、1465、1467、1469、1471、1473、1475、1477、1479、1481、1483、1485、1487、1489、1491、1493、1495、1497、1499、1501、1503、1505、1507、1509、1511、1513、1515、1517、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1531、1533、1535、1537、1539、1541、1543、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1569、1571、1573、1575、1577、1579、1581、1583、1585、1587、1589、1591、1593、1595、1597、1599、1601、1603、1605、1607、1609、1611、1613、1615、1617、1619、1621、1623、1625、1627、1629、1631、1633、1635、1637、1639、1641、1643、1645、1647、1649、1651、1653、1655、1657、1659、1661、1663、1665、1667、1669、1671、1673、1675、1677、1679、1681、1683、1685、1687、1689、1691、1693、1695、1697、1699、1701、1703、1705、1707、1709、1711、1713、1715、1717、1719、1721、1723、1725、1727、1729、1731、1733、1735、1737、1739、1741、1743、1745、1747、1749、1751、1753、1755、1757、1759、1761、1763、1765、1767、1769、1771、1773、1775、1777、1779、1781、1783、1785、1787、1789、1791、1793、1795、1797、1799、1801、1803、1805、1807、1809、1811、1813、1815、1817、1819、1821、1823、1825、1827、1829、1831、1833、1835、1837、1839、1841、1843、1845、1847、1849、1851、1853、1855、1857、1859、1861、1863、1865、1867、1869、1871、1873、1875、1877、1879、1881、1883、1885、1887、1889、1891、1893、1895、1897、1899、1901、1903、1905、1907、1909、1911、1913、1915、1917、1919、1921、1923、1925、1927、1929、1931、1933、1935、1937、1939、1941、1943、1945、1947、1949、1951、1953、1955、1957、1959、1961、1963、1965、1967、1969、1971、1973、1975、1977、1979、1981、1983、1985、1987、1989、1991、1993、1995、1997、1999、2001、2003、2005、2007、2009、2011、2013、2015、2017、2019、2021、2023、2025、2027、2029、2031、2033、2035、2037、2039、2041、2043、2045、2047、2049、2051、2053、2055、2057、2059、2061、2063、2065、2067、2069、2071、2073、2075、2077、2079、2081、2083、2085、2087、2089、2091、2093、2095、2097、2099、2101、2103、2105、2107、2109、2111、2113、2115、2117、2119、2121、2123、2125、2127、2129、2131、2133、2135、2137、2139、2141、2143、2145、2147、2149、2151、2153、2155、2157、2159、2161、2163、2165、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2189、2191、2193、2195、2197、2199、2201、2203、2205、2207、2209、2211、2213、2215、2217、2219、2221、2223、2225、2227、2229、2231、2233、2235、2237、2239、2241、2243、2245、2247、2249、2251、2253、2255、2257、2259、2261、2263、2265、2267、2269、2271、2273、2275、2277、2279、2281、2283、2285、2287、2289、2291、2293、2295、2297、2299、2301、2303、2305、2307、2309、2311、2313、2315、2317、2319、2321、2323、2325、2327、2329、2331、2333、2335、2337、2339、2341、2343、2345、2347、2349、2351、2353、2355、2357、2359、2361、2363、2365、2367、2369、2371、2373、2375、2377、2379、2381、2383、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、2421、2423、2425、2427、2429、2431、2433、2435、2437、2439、2441、2443、2445、2447、2449、2451、2453、2455、2457、2459、2461、2463、2465、2467、2469、2471、2473、2475、2477、2479、2481、2483、2485、2487、2489、2491、2493、2495、2497、2499、2501、2503、2505、2507、2509、2511、2513、2515、2517、2519、2521、2523、2525、2527、2529、2531、2533、2535、2537、2539、2541、2543、2545、2547、2549、2551、2553、2555、2557、2559、2561、2563、2565、2567、2569、2571、2573、2575、2577、2579、2581、2583、2585、2587、2589、2591、2593、7437、7439、7441、7443、7445、7447、7449、7451、7453、7455、7457、7459、7461、7463、7465、7467、7469、7471、7473、7475、7477、7479、7481、7483、7485、7487、7489、7491、7493、7495、7497、7499、7501、7503、7505、7507、7509、7511、7513、7515、7517、7519、7521、7523、7525、7527、7529、7531、7533、7535、7537、7539、7541、7543、7545、7547、7549、7551、7553、7555、7557、7559、7561、7563、7565、7567、7569、7571、7573、7575、7577、7579、7581、7583、7585、7587、7589、7591、7593、7595、7597、7599、7601、7603、7605、7607、7609、7611、7613、7615、7617、7619、7621、7623、7625、7627、7629、7631、7633、7635、7637、7639、7641、7643、7645、7647、7649、7651、7653、7655、7657、7659、7661、7663、7665、7667、7669、7671、7673、7675、7677、7679、7681、7683、7685、7687、7689、7691、7693、7695、7697、7699、7701、7703、7705、7707、7709、7711、7713、7715、7717、7719、7721、7723、7725、7727、7729、7731、7733、7735、7737、7739、7741、7743、7745、7747、7749、7751、7753、7755、7757、7759、7761、7763、8369、8371、8373、8375、8377、8379、8381、8383、8385、8387、8389、8391、8393、8395、8397、8399、8401、8403、8405、8407、8409、8411、8413、8415、8417、8419、8421、8423、8425、8427、8429、8431、8433、8435、8437、8439、8441、8443、8445、8447、8449、8451、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本發明亦提供載體,其包含至少一種本文所提供的經工程處理之多核苷酸。在一些具體例中,該載體進一步包含至少一控制序列。
本發明亦提供宿主細胞,其包含至少一種本文所提供的經工程處理之多肽。在一些具體例中,該宿主細胞包含至少一種本文所提供的載體。在一些具體例中,該宿主細胞係選自於真核及原核生物體。在一些額外的具體例中,該宿主細胞係大腸桿菌。
本發明亦提供用於生產至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶變異體的方法,其包含在本文提供的該宿主細胞能生產該經工程處理之醣基轉移酶變異體的條件下,培養該宿主細胞。在一些具體例中,該方法進一步包含回收該經工程處理之醣基轉移酶變異體的步驟。
本發明亦提供包含至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶變異體及/或蔗糖合成酶變異體之組成物。在一些具體例中,該組成物包含至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶變異體。
本發明亦提供用於生產至少一種本文所提供的經工程處理之蔗糖合成酶變異體的方法,其包含在本文提供的該宿主細胞能生產該經工程處理之蔗糖合成酶變異體的條件下,培養該宿主細胞。在一些具體例中,該方法進一步包含回收該經工程處理之蔗糖合成酶變異體的步驟。在一些具體例中,該組成物包含至少一種本文所提供的經工程處理之蔗糖合成酶變異體。
本發明亦提供用於醣基化一受質的方法,其包含:提供至少一受質、至少一選自於本文所提供的偶數序列的經工程處理之醣基轉移酶(glycosyl transferase);在該受質能醣基化而生產至少一醣基化產物的條件下,使該受質與該醣基轉移酶接觸。在一些具體例中,該受質包含至少一甜菊糖。在一些具體例中,醣基化產物包含至少一單醣基化及/或多醣基化產物。關於產物醣基化的程度本發明不打算受限於任何限制(諸如,二醣基化、三醣基化及更高醣基化位準的產物均可用於本發明)。
本發明提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D及甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及該醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D受質、NDP-葡萄糖及醣基轉移酶。在一些另外的具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及醣基轉移酶。於一些本具體例之中,該NDP-葡萄糖係選自於ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖,及/或IDT-葡萄糖。在一些額外的具體例中,該NDP-葡萄糖不是UDP-葡萄糖。
本發明提供用於生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及醣基轉移酶。在一些具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷A的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該NDP-葡萄糖係選自於ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖,及/或IDT-葡萄糖。在一些額外的具體例中,該NDP-葡萄糖不是UDP-葡萄糖。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷D的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷D的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該NDP-葡萄糖係選自於ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖,及/或IDT-葡萄糖。在一些額外的具體例中,該NDP-葡萄糖不是UDP-葡萄糖。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及醣基轉移酶。在一些具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D受質、ADP-葡萄糖及醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及醣基轉移酶。在一些具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷A的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷D的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷D的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,該NDP係選自於ADP、CDP、TDP、GDP,及/或IDT。在一些額外的具體例中,該NDP不是UDP。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及醣基轉移酶。在一些具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷A的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,本發明提供用於生產甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及ADP-醣基轉移酶。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,該NDP係選自於ADP、CDP、TDP、GDP,及/或IDT。在一些額外的具體例中,該NDP不是UDP。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷D的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷D的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,該NDP係選自於ADP、CDP、TDP、GDP,及/或IDT。在一些額外的具體例中,該NDP不是UDP。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及醣基轉移酶,其中該甜菊苷受質包含至少一甜菊苷及/或一甜菊苷及rebA的混合物。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,該NDP係選自於ADP、CDP、TDP、GDP,及/或IDT。在一些額外的具體例中,該NDP不是UDP。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、至少一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶,於能先生產甜菊糖苷A,接而生產甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I,且最終生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊苷受質、NDP及醣基轉移酶。於一些本具體例中,該經工程處理之醣基轉移酶包含ADP-醣基轉移酶。在一些額外的具體例中,該NDP係選自於ADP、CDP、TDP、GDP,及/或IDT。在一些額外的具體例中,該NDP不是UDP。
於本發明用於生產甜菊糖苷的方法之一些具體例中,該方法係以一鍋反應的方式來進行。在一些額外的具體例中,該方法係按順序進行。於一些額外的具體例中,該方法進一步包含重複該方法的步驟。在一些另外的具體例中,於重複步驟的期間內回收蔗糖。在一些額外的具體例中,回收至少一經工程處理之醣基轉移酶及/或其他反應組分。在一些額外的具體例中,該甜菊苷受質係從甜菊(
Stevia rebaudiana)萃取,而於一些任擇的具體例中,該甜菊苷受質係經合成生產,以及於還有一些另外的具體例中,該甜菊苷受質係天然及/或合成生產的甜菊苷之混合物。於本方法一些另外的具體例中,至少一經工程處理之醣基轉移酶係固定化的。於本方法一些額外的具體例中,蔗糖合成酶係固定化的。於還有一些額外的具體例中,至少一醣基轉移酶及/或蔗糖合成酶係固定化的。於本方法一些另外的具體例中,生產包括果糖的一反應產物。在一些具體例中,從反應產物移去果糖。於再一些額外的具體例中,該方法進一步包含一清洗步驟。在一些具體例中,該清洗步驟包含使產自該方法的該甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I,及/或甜菊糖苷D暴露於一溶劑。在一些具體例中,該溶劑為水。於更進一步的具體例中,該方法進一步包含至少一管柱層析步驟。在一些具體例中,產自該方法的該甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I,及/或甜菊糖苷D進行至少一管柱層析步驟。於本方法一些額外的具體例中,該至少一經工程處理之醣基轉移酶為本文提供的β-1,2醣基轉移酶。於本方法一些另外的具體例中,至少一經工程處理之醣基轉移酶為本文提供的β-1,3醣基轉移酶。於本方法再一些額外的具體例中,至少一經工程處理之醣基轉移酶為本文提供的β-1,2醣基轉移酶以及至少一額外的經工程處理之醣基轉移酶為本文提供的β-1,3醣基轉移酶。於本方法一些另外的具體例中,可以使用至少一種本文所提供的經工程處理之蔗糖合成酶。
於此所提供的方法中,至少一經工程處理之醣基轉移酶包含一多肽序列,其與下列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性:序列辨識編號:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、22、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、 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於此所提供的方法中,至少一經工程處理之醣基轉移酶包含多肽序列,其與下列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性:序列辨識編號:1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762、7764、8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478、8480、8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104,及/或9106可以使用。
本發明亦提供甜菊糖苷及包含依據本文提供的方法所生產的甜菊糖苷之組成物。在一些具體例中,甜菊糖苷為甜菊糖苷M,而於一些任擇的具體例中,甜菊糖苷為甜菊糖苷A,以及於更進一步的具體例中,甜菊糖苷為甜菊糖苷I,以及在一些額外的具體例中,甜菊糖苷為甜菊糖苷D。在一些另外的具體例中,本發明提供依據本文提供的方法所生產的甜菊糖苷之混合物,包括甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I,及/或甜菊糖苷D之混合物,以甜菊糖苷及其他感興趣的組分之任何濃度的組合。在一些具體例中,本發明提供組成物其包含甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I,及/或甜菊糖苷D之混合物,以甜菊糖苷及其他感興趣的組分之任何濃度的組合。更確切地,本發明不打算限定於依據本發明的方法所生產的甜菊糖苷之任何特定的組合或混合物。
本發明提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之NDP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D及甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及NDP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之NDP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D受質、NDP-葡萄糖及NDP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之NDP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷I受質、NDP-葡萄糖及NDP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之NDP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及NDP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之NDP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及NDP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之NDP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及NDP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷D的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之NDP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷D的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP-葡萄糖及NDP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D受質、ADP-葡萄糖及ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷I受質、ADP-葡萄糖及ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷D的方法,其包含提供一甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,及/或118,在能生產甜菊糖苷D的條件下,組合該甜菊苷受質、ADP-葡萄糖及ADP-醣基轉移酶。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊糖苷D受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷D受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及ADP-醣基轉移酶。在一些具體例中,該蔗糖合成酶為本文提供的一經工程處理之蔗糖合成酶。在一些具體例中,可以使用除蔗糖以外的糖與合適的合成酶組合。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及ADP-醣基轉移酶。在一些具體例中,該蔗糖合成酶為本文提供的一經工程處理之蔗糖合成酶。在一些具體例中,可以使用除蔗糖以外的糖與合適的合成酶組合。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷A的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及ADP-醣基轉移酶。在一些具體例中,該蔗糖合成酶為本文提供的一經工程處理之蔗糖合成酶。在一些具體例中,可以使用除蔗糖以外的糖與合適的合成酶組合。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷I的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷A及/或甜菊糖苷I的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及ADP-醣基轉移酶。在一些具體例中,該蔗糖合成酶為本文提供的一經工程處理之蔗糖合成酶。在一些具體例中,可以使用除蔗糖以外的糖與合適的合成酶組合。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷D的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷D的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及一ADP-醣基轉移酶。在一些具體例中,蔗糖合成酶為本文提供的一經工程處理之蔗糖合成酶。在一些具體例中,可以使用除蔗糖以外的糖與合適的合成酶組合。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、蔗糖合成酶及ADP-醣基轉移酶,其中該甜菊苷受質包含至少一甜菊苷及/或一甜菊苷及rebA的混合物。在一些具體例中,該蔗糖合成酶為本文提供的一經工程處理之蔗糖合成酶。在一些具體例中,可以使用除蔗糖以外的糖與合適的合成酶組合。
本發明亦提供用於生產甜菊糖苷M的方法,其包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、至少一蔗糖合成酶及至少一種本文所提供的經工程處理之ADP-醣基轉移酶,於能先生產甜菊糖苷A,接著生產甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I,並最終生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊苷受質、NDP及ADP-醣基轉移酶。在一些具體例中,該方法進一步包含蔗糖及蔗糖合成酶。在一些具體例中,該蔗糖合成酶為本文提供的一經工程處理之蔗糖合成酶。
在一些具體例中,本發明提供的方法係以一鍋反應的方式來進行,而於一些任擇的具體例中,該方法係於多個反應容器內進行。在一些具體例中,該方法係以順序的方式於單一及/或多個反應容器內進行。在一些具體例中,該方法步驟予以重複(即,該方法步驟中的一些或全體有多個疊代)。在一些具體例中,於重複步驟的期間內回收蔗糖。在一些額外的具體例中,回收經工程處理之醣基轉移酶及/或其他反應組分(諸如,輔助因子)。於本方法之一些具體例中,該甜菊苷受質係從甜菊(
Stevia rebaudiana)萃取,而於一些任擇的方法中,該甜菊苷受質係經合成生產。在一些另外的具體例中,該醣基轉移酶係固定化的。在一些額外的具體例中,該蔗糖合成酶係固定化的。在一些另外的具體例中,該醣基轉移酶及/或蔗糖合成酶係固定化的。於本方法之一些具體例中,生產出果糖。在一些額外的具體例中,從反應產物移去果糖。
本發明亦提供包含至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶變異體的組成物。本發明亦提供包含至少一種如本文所提供的非天然存在的醣基轉移酶變異體的組成物。
本發明亦提供用於醣基化一受質以生產一種β醣基化產物的方法,其包含下列步驟:提供至少一醣基基團予體、至少一醣基基團受體及至少一醣基轉移酶酵素;在該醣基基團受體能醣基化而生產具有β-葡萄糖鍵結之至少一產物的條件下,使該醣基基團予體及醣基基團受體與該醣基轉移酶酵素接觸。於本方法之一些具體例中,該醣基基團予體為核苷酸二磷酸糖,舉例而言腺嘌呤二磷酸葡萄糖(ADP-葡萄糖)。於本方法一些另外的具體例中,該醣基基團予體係選自於醣基、烷氧基、羧基、胺基羰基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、羧基烷基、胺基烷基、鹵烷基、烷基硫基烷基、雜環烷基、雜芳基及雜芳基烷基基團。於本方法一些再額外的具體例中,具有β-葡萄糖鍵結之產物為甜菊糖。於本方法一些另外的具體例中,醣基基團受體係甜菊糖苷D,醣基基團予體係ADP-葡萄糖,以及具有β-葡萄糖鍵結之產物為甜菊糖苷M。於本方法一些另外的具體例中,醣基基團受體係甜菊苷,醣基基團予體係ADP-葡萄糖,以及具有β-葡萄糖鍵結之產物為甜菊糖苷A或甜菊糖苷I。
本發明亦提供用於生產核苷二磷酸葡萄糖的方法,其包含下列步驟:提供一種核苷二磷酸依賴性合成酶、一核苷二磷酸及該合成酶的一雙醣、參醣或寡醣受質;於能使該醣分裂而生產一較低分子量醣及核苷二磷酸葡萄糖的條件下,使該合成酶、核苷二磷酸及該醣接觸。於本方法之一些具體例中,此方法係與先前所述的方法組合。於本方法之一些額外的具體例中,核苷二磷酸為ADP,核苷二磷酸葡萄糖為ADP-葡萄糖,以及合成酶受質為蔗糖。
較佳實施例之詳細說明
本發明提供經工程處理之醣基轉移酶(GT)酵素、具有GT活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶(SuS)酵素、具有SuS活性的多肽,及編碼此等酵素的多核苷酸,以及包含此等多核苷酸及多肽的載體及宿主細胞。本發明亦提供包含該GT酵素的組成物及使用該經工程處理之GT酵素來製造具有β-葡萄糖鍵結之產物的方法。本發明進一步提供組成物及用於生產甜菊糖苷(譬如,甜菊糖苷M、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I及甜菊糖苷D)的方法。本發明亦提供包含該SuS酵素的組成物及使用其等的方法。亦提供用於生產GT及SuS酵素的方法。
除非另有定義,否則於此所使用的所有技術與科學術語一般而言具有相同的含義,如同此發明所屬之技藝的一般技藝人士所理解者。一般而言,於此所使用的命名法以及以下所述之細胞培養的實驗室程序、分子遺傳學、微生物學、有機化學、分析化學及核酸化學為本技藝眾所周知且通常使用的該等。此等技術為眾所周知的且描述於熟悉此藝者眾所周知的許多文本和參考文獻中。標準技術或其修改係使用於化學合成及化學分析中。於本文上文或下文二者,提及之所有專利、專利申請案、文章及出版物,皆在此明確地併入本文以作為參考資料。
縱然與本文所述之方法及材料相似或相當之任何合適的該等能用於本發明之實施,但是本文還是描述一些方法及材料。應理解本發明並不限於所述之特定方法、方案及試劑,因此等可有所變化,取決於熟悉此藝者使用其等的上下文。因此,立即定義如下的術語係引用整體發明予以更完整地說明。
應理解前述一般說明及下列詳細說明為例示性及僅供解釋並且不限制本發明。本文使用之節標題係僅僅為了編制的目的以及不被解釋為限制所說明的主題。數值範圍包括該範圍界定的數字。因而,本文所揭示之每個數值範圍打算包含落在此較廣的數值範圍內之每個較窄的數值範圍,好似此較窄的數值範圍全部明確寫於此一樣。本文所揭示之每個最大(或最小)數值限制也打算包括每個較小的(或高的)數值限制,好似此較小的(或高的)數值限制明確寫於此一樣。
縮寫
遺傳編碼的胺基酸使用的縮寫為習用的且如下:
胺基酸 | 三個字母縮寫 | 一個字母縮寫 |
丙胺酸 | Ala | A |
精胺酸 | Arg | R |
天冬醯胺酸 | Asn | N |
天冬胺酸 | Asp | D |
半胱胺酸 | Cys | C |
麩胺酸 | Glu | E |
麩醯胺酸 | Gln | Q |
甘胺酸 | Gly | G |
組胺酸 | His | H |
異白胺酸 | Ile | I |
白胺酸 | Leu | L |
離胺酸 | Lys | K |
甲硫胺酸 | Met | M |
苯丙胺酸 | Phe | F |
脯胺酸 | Pro | P |
絲胺酸 | Ser | S |
蘇胺酸 | Thr | T |
色胺酸 | Trp | W |
酪胺酸 | Tyr | Y |
纈胺酸 | Val | V |
當使用三個字母縮寫時,除非前面特別加上「L」或「D」或從使用縮寫的上下文中清楚得知,否則胺基酸關於α-碳(C
α)可以為L-或D-組態。舉例而言,就「Ala」表示丙胺酸而未具體指定關於α-碳的組態而言,「D-Ala」及「L-Ala」分別表示D-丙胺酸及L-丙胺酸。當使用一個字母縮寫時,大寫字母表示胺基酸關於α-碳為L-組態且小寫字母表示胺基酸關於α-碳為D-組態。舉例而言,「A」表示L-丙胺酸且「a」表示D-丙胺酸。當多肽序列呈現為一個字母或三個字母縮寫的字符串(或其混合物)時,序列係按照慣例以胺基(N)至羧基(C)方向來呈現。
遺傳編碼的核苷使用的縮寫為習用的且如下:腺苷(A);鳥苷(G);胞苷(C);胸苷(T);及尿苷(U)。除非有特別的描述,否則縮寫的核苷可以為核醣核苷或2’-去氧核醣核苷。核苷在個別基礎或集體基礎上可以指定為核醣核苷或2’-去氧核醣核苷。當核酸序列呈現為一個字母縮寫的字符串時,序列係按照慣例以5’至3’方向來呈現,且沒有標明磷酸。
定義
根據本發明,除非另有明確定義,否則本文之說明所使用的技術與科學術語具有熟悉此藝者通常理解相同的含義。因而,以下術語意在具有以下含義。
當於本文中使用,單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數的指示對象,除非上下文另有明確說明。因而,舉例而言提及「一多肽」包括超過一個多肽。
同樣地,「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(including)」係可互換且不打算為限制性的。因而,當於本文中使用,術語「包含(comprising)」及其同源詞係以其等之包容性意義使用(即,相等於術語「包括(including)」及其相應的同源詞)。
會進一步瞭解到各種具體例使用術語「包含(comprising)」的說明之處,熟悉此藝者會明瞭在某些特定的情況下,一具體例可以任擇地使用表達方式「基本上由...組成」或「由...組成」來描述。
當於本文中使用,術語「約」意指一特定的數值之允收誤差。在某些情況下「約」意指一給定值範圍之0.05%、0.5%、1.0%或2.0%之內。在某些情況下,「約」意指一給定值之1、2、3或4個標準偏差內。
當於本文中使用,「EC」編號係指國際生化及分子生物聯盟的命名委員會之酵素命名。IUBMB為根據酵素催化的化學反應為基礎之酵素生化分類系統。
當於本文中使用,「ATCC」係指美國菌種保存中心,其之生物資源庫保存品(biorepository collection)包括基因及菌株。
當於本文中使用,「NCBI」係指國家生物技術資訊中心及其提供的序列資料庫。
「蛋白質」、「多肽」及「胜肽」於本文中可交換使用以意指由一醯胺鍵共價鏈結的至少2個胺基酸之聚合物,無論長度或轉譯後修飾(諸如,醣化或磷酸化)與否。此定義包括D-及L-胺基酸,及D-與L-胺基酸之混合物,以及包含D-與L-胺基酸,及D-與L-胺基酸之混合物的聚合物。
「胺基酸」於本文中係以IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議、其等一般知曉的三個字母符號或以一個字母符號代碼來引用。同樣地,核苷酸可以以其等一般接受的單一字母代碼來引用。
當於本文中使用,「多核苷酸」及「核酸」係指共價鏈結在一起的二個或更多個核苷酸。多核苷酸可以完全由核醣核苷酸組成(即,RNA)、完全由2’去氧核醣核苷酸組成(即,DNA),或由核醣核苷酸及2’去氧核醣核苷酸之混合物組成。雖然核苷典型會經由標準的磷酸二酯鍵聯鏈結在一起,但多核苷酸可以包括一或更多非標準的鍵聯。多核苷酸可以是單股或雙股,或可以包括單股區域及雙股區域二者。並且,雖然多核苷酸典型會由天然存在的編碼核鹼基組成(即,腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶),但其可以包括一或更多經修飾及/或合成的核鹼基,例如,舉例而言,肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤等等。在一些具體例中,此等經修飾或合成的核鹼基為編碼胺基酸序列的核鹼基。
當於本文中使用,「核苷」係指包含一種核鹼基(即,一種含氮鹼)及一種5碳糖(諸如,核糖或去氧核糖)的醣苷胺。核苷之非限制性的實例包括胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、胸苷及肌苷。相反地,術語「核苷酸」係指包含一種核鹼基、一種5碳糖及一或更多磷酸基團的醣苷胺。在一些具體例中,核苷可由激酶予以磷酸化以產生核苷酸。
當於本文中使用,「核苷二磷酸」係指包含一種核鹼基(即,一種含氮鹼)、一種5碳糖(諸如,核糖或去氧核糖)及一種二磷酸鹽(即,焦磷酸鹽)部分的醣苷胺。於本文之一些具體例中,「核苷二磷酸」縮寫為「NDP」。核苷二磷酸之非限制性的實例包括胞苷二磷酸(CDP)、尿苷二磷酸(UDP)、腺苷二磷酸(ADP)、鳥苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)及肌苷二磷酸。術語「核苷」及「核苷酸」在某些情況下可交換使用。
當於本文中使用,「編碼序列」係指一種核酸(諸如,基因)的部分其編碼一蛋白質的胺基酸序列。
當於本文中使用,術語「生物催化作用」、「生物催化」、「生物轉變(biotransformation)」、及「生物合成」係指使用酵素於有機化學物執行化學反應。
當於本文中使用,「醣基轉移酶」(GT)係指一種多肽其具有從活化的糖予體轉移醣基殘基至單體及聚合型受體分子的酵素能力。在一些具體例中,醣基轉移酶稱為「醣基轉移酶變異體」或「醣基轉移酶組合變異體」。在一些具體例中,「醣基轉移酶」係指分類EC 2.4.1.17之UDP-葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferase)酵素,其催化葡萄糖從UDP-α-D-葡萄糖醛酸(也被稱為UDP-葡萄糖)轉移至受體,釋放UDP且形成受體β-D-葡萄糖苷酸(β-D-glucuronoside)。碳水化合物活性酵素資料庫(CAZy)提供持續更新的醣基轉移酶家族清單。在一些具體例中,醣基轉移酶包括,但不限於,分類於GT1家族的酵素。於一些較佳具體例中,本發明之醣基轉移酶變異體優先使用ADP-葡萄糖。在一些額外的具體例中,本發明之醣基轉移酶酵素不使用UDP-葡萄糖。在一些另外的具體例中,本發明之醣基轉移酶變異體使用ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖,及/或IDT-葡萄糖,但不用UDP-葡萄糖。因而,於一些較佳具體例中,本發明提供ADP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(ADP-醣基轉移酶;AGTs)、CDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(CDP-醣基轉移酶;CGTs)、GDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(GDP-醣基轉移酶;GGTs)、TDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(TDP-醣基轉移酶;TGTs)以及IDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(IDP-醣基轉移酶;IGTs)。
當於本文中使用,「NDP-醣基轉移酶」(NDP-GT)係指一種多肽其具有從一活化的糖予體,該糖予體為NDP,轉移醣基殘基至單體及聚合型受體分子的酵素能力。在一些具體例中,NDP-醣基轉移酶一般稱為「醣基轉移酶」。更確切地,當於本文中使用,術語「醣基轉移酶」包含NDP-醣基轉移酶,包括,但不限於ADP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(ADP-醣基轉移酶;AGTs)、CDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(CDP-醣基轉移酶;CGTs)、GDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(GDP-醣基轉移酶;GGTs)、TDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(TDP-醣基轉移酶;TGTs)以及IDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(IDP-醣基轉移酶;IGTs)。在一些具體例中,本發明之醣基轉移酶酵素使用ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖,及/或IDT-葡萄糖,但不用UDP-葡萄糖。於一些額外的具體例中該酵素稱為「變異體」或「組合變異體」(諸如,ADP-醣基轉移酶變異體)。
當於本文中使用,「轉醣基化(transglycosylation)」係指一種反應其中一醣基殘基係由一雙醣、參醣或寡醣予體轉移至一非醣基化或醣基化受體分子。
當於本文中使用,「轉葡萄糖苷化」係指一種轉醣基化反應其中轉移的醣基殘基係葡萄糖且雙醣、參醣或寡醣予體含葡萄糖。
當於本文中使用,「醣基化」係指一醣基殘基及一受體分子之間醣苷鍵聯之形成。
當於本文中使用,「葡萄糖苷化」係指一葡萄糖殘基及一受體分子之間醣苷鍵聯之形成。
當於本文中使用,「醣基」係指一有機基團,其為藉由從一單醣、低寡醣或寡醣衍生物的環形移去半縮醛羥基基團所獲得的單價自由基或取代基結構。醣基基團與無機酸(諸如,磷酸)反應而形成酯(諸如,葡萄糖 1-磷酸酯)。
當於本文中使用,「醣苷」係指一種分子其中一碳水化合物(諸如糖)經由一醣苷鍵與另一官能基結合。可水解醣苷以生產一種糖及一種非糖(即,配醣基)組分。
當於本文中使用,術語「甜菊糖」係指一種甜菊醇(steviol)之醣苷,包括但不限於,天然存在的甜菊糖(諸如,甜菊苷、甜菊單糖苷(steviolmonoside)、甜菊二糖苷(steviolbioside)、甜茶苷(rubusoside)、衛矛醇苷B(dulcoside B)、衛矛醇苷A、甜菊糖苷B、甜菊糖苷G、甜菊糖苷C、甜菊糖苷F、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I、甜菊糖苷E、甜菊糖苷H、甜菊糖苷L、甜菊糖苷K、甜菊糖苷J、甜菊糖苷M(亦稱為甜菊糖苷X)、甜菊糖苷D、甜菊糖苷N、甜菊糖苷O),以及合成的甜菊糖(諸如,酵素葡萄糖苷化的甜菊糖),及其等之組合。甜菊醇及其之醣苷之化學結構如下(見,WO 2013/176738)。
當於本文中使用,「甜菊苷受質」係指包含至少一甜菊糖之任何合適的材料。“
甜菊醇及其之醣苷之化學結構 | ||
醣苷 | R 1 | R 2 |
甜菊醇 | H | H |
甜菊糖單糖苷 | H | Glc β1- |
甜菊單葡萄糖基酯(Steviol monoglucosyl ester) | Glc β1- | H |
甜茶苷 | Glc β1- | Glc β1- |
甜菊二糖苷 | H | Glc β(1-2) Glc β1- |
衛矛醇苷A | Glc β1- | Rhaα(1-2) Glc β1- |
甜菊苷 | Glc β1- | Glc β(1-2) Glc β1- |
甜菊糖苷B | H | Glc β(1-2)[Glc β(1-3)] Glc β1- |
甜菊糖苷C | Glc β1- | Rhaα(1-2)[Glc β(1-3)] Glc β1- |
甜菊糖苷A | Glc β1- | Glc β(1-2)[Glc β(1-3)] Glc β1- |
甜菊糖苷D | Glc β(1-2) Glc β1- | Glc β(1-2)[Glc β(1-3)] Glc β1- |
甜菊糖苷I | Glc β(1-3) Glc β1- | Glc β(1-2)[Glc β(1-3)] Glc β1- |
甜菊糖苷M | Glc β(1-2)[Glc β(1-3)] Glc β1- | Glc β(1-2)[Glc β(1-3)] Glc β1- |
(Glc=葡萄糖,Rha=鼠李糖) |
當於本文中使用,「蔗糖合成酶」係指一種醣基轉移酶酵素(EC 2.4.1.1.13)其可逆催化化學反應NDP-葡萄糖+ D-果糖成為NDP及蔗糖。在一些具體例中,本發明提供喜溫嗜酸硫桿菌(
Acidithiobacillus caldus)蔗糖合成酶(“AcSuS”)之變異體。在一些具體例中,此等酵素稱為「蔗糖合成酶變異體」、「SuS」、「SUS」、「SuS變異體」、「SUS變異體」、「蔗糖合成酶組合變異體」或「SuS組合變異體」或「SUS組合變異體」。在一些具體例中,此等變異體優先使用除了尿苷以外的NDPs(即,ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖,及/或IDT-葡萄糖,而非UDP-葡萄糖)。在一些具體例中,此等變異體不使用UDP-葡萄糖。
當於本文中使用,術語「一鍋反應」係指感興趣的甜菊糖苷於一反應容器內生產。在一些具體例中,該術語用來提及從起始材料生產rebM,起始材料包括但不限於rebA及/或甜菊苷加上其他甜菊糖苷(諸如,rebD及/或rebI)之中間生產。在一些具體例中,甜菊苷轉化為RebA、RebA轉化為RebD及/或RebI以及RebD及/或RebI轉化為Reb M,係以多重酵素級聯的方式於一反應容器內進行。
當於本文中使用,「野生型」及「天然存在的」係指在自然界發現的形式。舉例而言野生型多肽或多核苷酸序列為一生物體內存在的一序列,其可單離自自然界的來源且其沒有被人為操縱有意修改。
當於本文中使用,「重組」、「經工程處理」及「非天然存在的」於用來提及細胞、核酸或多肽時,係指一種材料或相應於該材料的天然或原始形式之材料,其業已以自然界不會存在的方式予以修飾。在一些具體例中,該細胞、核酸或多肽與天然存在的細胞、核酸或多肽完全相同,但是自合成材料及/或藉由重組技術操縱予以生產或衍生。非限制性的實例包括,尤其是,表現並未於原始(非重組)細胞形式中表現之基因或表現不正常位準之原始基因的重組細胞。
於此使用術語「序列同一性百分比(%)」係意指多核苷酸或多肽之間的比較,且係藉由跨越一比較窗口上比較兩個最佳排列比對序列而決定,其中在比較窗口內的多核苷酸或多肽序列部分針對兩序列的最佳排列比對,當與參考序列相比時可能包含添加或缺失(意即,間隙)。百分比之計算可藉由確定在兩者序列中同一性的核酸鹼基或胺基酸殘基發生的位置數目以產生匹配位置的數目,將匹配位置的數目除以該比較窗口中的位置總數並將該結果乘以100以產生序列同一性的百分比。任擇地,百分比之計算可藉由確定在兩者序列中同一性的核酸鹼基或胺基酸殘基發生的位置數目或是核酸鹼基或胺基酸殘基與間隙排列對齊發生同一性的位置數目以產生匹配位置的數目,將匹配位置的數目除以該比較窗口中的位置總數並將該結果乘以100以產生序列同一性的百分比。熟悉此藝者已知多種可用以對準兩序列之已確立的演算法。用於比較最佳對準序列的方法可藉由任何合適的方法來進行,如本技藝已知者,包括,但不限於,Smith and Waterman之區域同質性演算法(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981])、Needleman and Wunsch 之同質性比對演算法(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970])、Pearson and Lipman之相似度方法之搜尋(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988])、這些演算法之電腦化完成(諸如,GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA於GCG Wisconsin Software Package),或目視檢查。適用於決定序列同一性與序列類似度百分比之演算法之範例包括,但不限於BLAST與BLAST 2.0演算法,其分別描述於Altschul等人(分別參見Altschul等人,J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990];及Altschul等人,Nucl. Acids Res., 3389-3402 [1977])。用於進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心網站而公開獲得。此演算法涉及先於詢問序列內確認W長度之短字元與數據庫序列中相同長度的字元比對時,可匹配或滿足一些正值門檻積分T,以確認高積分序列對(HSPs)。T稱為鄰近字元積分門檻(參見Altschul等人,如上所述)。這些初始鄰近命中字元作用類似種子用於啟動搜尋以尋找包含其等之更長HSPs。命中的字元繼而自各序列往雙方向延伸直到累計的序列比對積分增加為止。就核苷酸序列而言,累計積分係使用參數M(匹配殘基對之報酬積分;永遠>0)與N(未匹配殘基之懲罰積分;永遠<0)來計算。就胺基酸序列而言,積分矩陣係用於計算累計積分。當累計的比對積分從其最大值達成值下降X量;由於累計一個或多個負分殘基比對,使累計的積分變成零或以下;或到達任一序列之終點,則命中的字元在各方向之延伸即可停止。BLAST演算法參數W、T與X決定了比對敏感性與速度。BLASTN程式(就核苷酸序列而言)使用預設之字元長度(W)11,期望值(E)10,M=5,N=-4,以及二股之比較。就胺基酸序列而言,BLASTP程式使用預設字元長度(W)3,期望值(E)10,以及BLOSUM62積分矩陣(參見,Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989])。例示性序列比對及序列同一性%之判定可以利用GCG Wisconsin Software package之BESTFIT或GAP程式、使用提供的預設參數(Accelrys, Madison WI)來進行。
當於本文中使用,「參考序列」係指一確定的序列使用作一序列及/或活性比較的基礎。一種參考序列可為一個較大序列的子集,舉例而言,全長基因或多肽序列的一節段。一般而言,一種參考序列為長度至少20個核苷酸或胺基酸殘基,長度至少25個殘基,長度至少50個殘基,長度至少100個殘基或全長的核酸或多肽。因為二種多核苷酸或多肽可能各(1)包含一序列(即,完整序列的一部分)其於二個序列之間是相似的,以及(2)可能進一步包含一序列其於二個序列之間是相異的,所以二個(或更多個)多核苷酸或多肽之間的序列比較典型地係藉由跨越一「比較窗口」上比較二種多核苷酸或多肽以確認且比較局部區域的序列相似性而完成。在一些具體例中,一種「參考序列」可以一初級胺基酸序列為基礎,其中該參考序列為一序列其於初級序列可有一或更多變化。
當於本文中使用,「比較窗口」係指至少約20個連續核苷酸位置或胺基酸殘基之概念上的區段,其中一序列可為與具有至少20個連續核苷酸或胺基酸之參考序列比較且其中比較窗口中的部分序列針對兩序列的最佳排列比對,當與參考序列(參考序列不包含添加或缺失)相比時可能包含20百分比或更小的添加或缺失(意即間隙)。比較窗口可比20個連續殘基更長,且包括,選擇性地為30、40、50、100或更長的窗口。
當於本文中使用,「相應於」、「根據」及「相對於」使用於一給定的胺基酸或多核苷酸序列的編號之上下文時,係指當與參考序列比較時一指定的參考序列殘基的編號。換言之,一給定聚合物的殘基編號或殘基位置係關於參考序列來標明而非該給定的胺基酸或多核苷酸序列內殘基的實際數字位置。舉例而言,一給定的胺基酸序列,諸如一種經工程處理之醣基轉移酶之胺基酸序列,能藉由導入間隙至參考序列來排列比對以使二序列間的殘基匹配最佳化。於此等情況中,縱然存在間隙,但該給定的胺基酸或多核苷酸序列內殘基的編號係關於已經排列比對之參考序列來進行。
當於本文中使用,「實質同一性」意指多核苷酸或多肽序列,當其與跨越具有至少20個殘基位置之比較窗口,時常為跨越具有至少30-50個殘基之窗口的參考序列相比時,具有至少80百分比的序列同一性、至少85百分比的同一性、至少89至95百分比之間的同一性,或更多通常為,至少99百分比的同一性,其中序列同一性百分比的計算係藉由比較參考序列與包括跨越比較窗口之參考序列總計20百分比或更小的缺失或添加之序列來計算。於一些應用於多肽的特定具體例中,術語「實質同一性」意指二個多肽序列於最佳排列時,諸如藉由GAP或BESTFIT程式使用預設間隙權重,共享至少80百分比的序列同一性,較佳至少89百分比的序列同一性、至少95百分比的序列同一性或更多(諸如,99百分比的序列同一性)。在一些具體例中,序列比較時非同一性的殘基位置與恆定的核苷酸取代是不同的。
當於本文中使用,「胺基酸差異」及「殘基差異」係指於多肽序列的一位置處之胺基酸殘基相對於參考序列的對應位置處之胺基酸殘基之差異。在某些情況下參考序列有一組胺酸標籤,但是相對於相等的參考序列沒有組胺酸標籤的編號保持不變。胺基酸差異的位置一般於此稱為“Xn”,其中n係指作為殘基差異基礎的參考序列之對應位置處。舉例而言,「與序列辨識編號:4相比時於位置X93處之殘基差異」係指於相應於序列辨識編號:4的位置93處之多肽位置處的胺基酸殘基之差異。因而,設若序列辨識編號:4的參考序列於位置93處有一絲胺酸,那麼「與序列辨識編號:4相比時於位置X93處之殘基差異」一絲胺酸之外的任何殘基之胺基酸取代於相應於序列辨識編號:4的位置93之多肽位置處。於本文大多數情況下,於一位置處的特定胺基酸殘基差異係表示為“XnY”,其中“Xn”具體指定如上所述相應的位置,以及“Y”為該經工程處理之多肽中找到的胺基酸單字母識別符(即,與參考多肽相比不同的殘基)。在某些情況下(諸如,實施例提出的表中),本發明亦提供由常規符號“AnB”表示之特定胺基酸差異,其中A為參考序列的殘基之單字母識別符,“n”為參考序列的殘基位置號碼,以及B為該經工程處理之多肽的序列殘基取代的單字母識別符。在某些情況下,本發明之多肽相對於參考序列可包括一或更多胺基酸殘基差異,其等係以相對於參考序列存在殘基差異之指定位置的清單來表示。在一種多肽之特定殘基位置可使用超過一種胺基酸的一些具體例中,各種可用的胺基酸殘基係以“/”隔開(諸如,X307H/X307P或X307H/P)。亦可使用斜線來表示一給定的變異體內之多種取代(即,一給定的序列,諸如一組合變異體內存在超過一種取代)。在一些具體例中,本發明包括經工程處理之多肽序列,其包含一或更多胺基酸差異,其包含守恆性或非守恆性胺基酸取代。在一些額外的具體例中,本發明提供經工程處理之多肽序列,其包含守恆性或非守恆性胺基酸取代二者。
當於本文中使用,「守恆性胺基酸取代」係指以具有相似側鏈的不同殘基取代一殘基,且因而典型地涉及以相同或相似胺基酸定義類的胺基酸取代多肽之胺基酸。作為例子而不是限制,在一些具體例中,分別用另一脂族胺基酸(諸如,丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸)取代具有脂族側鏈的一胺基酸;用有羥基側鏈的另一胺基酸(諸如,絲胺酸及蘇胺酸)取代具有羥基側鏈的一胺基酸;用有芳族側鏈的另一胺基酸(諸如,苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及組胺酸)取代具有芳族側鏈的胺基酸;用有鹼性側鏈的另一胺基酸(諸如,離胺酸及精胺酸)取代具有鹼性側鏈的一胺基酸;用有酸性側鏈的另一胺基酸(諸如,天冬胺酸或麩胺酸)取代具有酸性側鏈的一胺基酸;及/或用另一疏水性或親水性胺基酸取代一疏水性或親水性胺基酸。
當於本文中使用,「非守恆性取代」係指以具有顯著不同側鏈性質的胺基酸取代取代多肽之胺基酸。非守恆性取代可使用介於定義組之間,而非在定義組內,的胺基酸且影響(a)取代區域內的胜肽骨幹結構(諸如,脯胺酸取代甘胺酸)(b)電荷或疏水性,或是(c)大部分側鏈。作為例子而不是限制,例示性非守恆性取代可以為用有鹼性或脂族胺基酸取代酸性胺基酸;用小的胺基酸取代芳族胺基酸;以及用一疏水性胺基酸取代一親水性胺基酸。
當於本文中使用,「缺失」係指藉由從參考多肽移去一或更多個胺基酸來修飾多肽。缺失可以包含移去構成參考酵素之1或更多個胺基酸、2或更多個胺基酸、5或更多個胺基酸、10或更多個胺基酸、15或更多個胺基酸或20或更多個胺基酸,高達胺基酸總數的10%或高達胺基酸總數的20%,同時保留酵素活性及/或保留一種經工程處理之醣基轉移酶酵素改良的性質。缺失可以針對多肽的內部部分及/或終端部分。於各種具體例中,缺失可以包含連續節段或可以為不連續的。缺失典型地以胺基酸序列內之“-“來表示。
當於本文中使用,「插入」係指藉由從參考多肽添加一或更多個胺基酸來修飾多肽。插入可以於多肽的內部部分,或直達羧基或胺基端部分。於本文中使用插入包括如本技藝已知的融合蛋白質。插入可以為胺基酸的連續節段或是被天然存在的多肽之一或更多個胺基酸分隔開。
「功能片段」及「生物活性片段」於本文中可交換使用以指一多肽其有胺基端及/或羧基端刪失及/或內部刪失,但剩餘的胺基酸序列和與之進行比較的序列內相應的位置完全相同(諸如,本發明之一種全長經工程處理之醣基轉移酶素),且保留全長多肽之實質全部的活性。
當於本文中使用,「經單離的多肽」係指一種多肽其與天然伴隨的其他污染物實質分離(諸如,蛋白質、脂質及多核苷酸)。該術語包含已經從其等天然存在的環境或表現系統(諸如,宿主細胞內或經由活體外合成)移去或純化的多肽。重組醣基轉移酶多肽可存在於細胞內、存在於培養基內或製備呈各種形式,諸如溶解產物或經單離的製備物。確切而言,在一些具體例中,重組醣基轉移酶多肽可以為經單離的多肽。
當於本文中使用,「實質純的多肽」或「純化的蛋白質」係指一種組成物,其中目標種類包含以莫耳或重量%計之存在的大分子種類之至少約50百分比時,該多肽種類為所存在之主要種類(亦即,以莫耳或重量為基礎,在組成物中比任何其他個別大分子種類更充足),且一般而言為實質純化的組成物。然而,在一些具體例中,含醣基轉移酶的組成物包含小於50%純(諸如,約10%、約20%、約30%、約40%或約50%)之醣基轉移酶。一般而言,實質純的醣基轉移酶組成物包含該組成物內存在以莫耳或重量%計之所有大分子種類之約60%或更多、約70%或更多、約80%或更多、約90%或更多、約95%或更多,及約98%或更多。在一些具體例中,若組成物基本上係由單一大分子種類組成,則將目標種類純化至基本均質(即,藉由習知偵測方法不能偵測出組成物中之污染物種類)。不將溶劑種類、小分子(<500道爾頓)及元素離子種類視為大分子種類。在一些具體例中,該經單離的重組醣基轉移酶多肽為實質純的多肽組成物。
當於本文中使用,「改良的酵素性質」係指一種酵素之至少一改良的性質。在一些具體例中,本發明提供經工程處理之醣基轉移酶多肽,其與參考醣基轉移酶多肽及/或野生型醣基轉移酶多肽及/或另一種經工程處理之醣基轉移酶多肽相比時表現出任何酵素性質之改良。因而,可以決定且比較各種醣基轉移酶多肽,包括野生型,以及經工程處理之醣基轉移酶之間的「改良」位準。改良的性質包括舉例而言,但不限於,對此類性質如增加的蛋白質表現、增加的熱活動、增加的熱穩定性、增加的pH活性、增加的穩定性、增加的酵素活性、增加的受質特異性或親和力、增加的比活性、增加的受質抗性或終產物抑制、增加的化學穩定性、改良的化學選擇性、改良的溶劑穩定性、對酸性pH的耐量增加、對蛋白分解活性的耐量增加(即,對蛋白分解靈敏度降低)、降低的聚集作用、增加的溶解度,以及改變的溫度剖面圖。於額外的具體例中,該術語用於提及至少一改良的蔗糖合成酶酵素性質。在一些具體例中,本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶多肽,其與參考蔗糖合成酶多肽及/或野生型蔗糖合成酶多肽及/或另一種經工程處理之蔗糖合成酶多肽相比時表現出任何酵素性質之改良。因而,可以決定且比較各種蔗糖合成酶多肽,包括野生型,以及經工程處理之蔗糖合成酶之間的「改良」位準。
當於本文中使用,「增加的酵素活性」及「提高的催化活性」係指與參考酵素相比之下,經工程處理之多肽改良的性質,其可以以比活性的增加為代表(諸如,生產的產物/時間/重量蛋白質)或受質變成產物的轉化百分比增加(諸如,使用指定量的酵素、於指定的時間週期內起始量的受質變成產物之轉化百分比)。在一些具體例中,該術語係指與參考醣基轉移酶酵素相比之下,本文提供的經工程處理之醣基轉移酶多肽之改良的性質,其可以以比活性的增加為代表(諸如,生產的產物/時間/重量蛋白質)或受質變成產物的轉化百分比增加(諸如,使用指定量的醣基轉移酶、於指定的時間週期內起始量的受質變成產物之轉化百分比)。在一些具體例中,該術語係用於提及本文提供的改良的蔗糖合成酶酵素。實施例中提供決定本發明的經工程處理之醣基轉移酶及蔗糖合成酶之酵素活性的例示性方法。任何酵素活性有關的性質可能會受到影響,包括經典的酵素性質
K
m 、
V
ma 或
k
cat ,其等之改變會導致增加的酵素活性。舉例而言,酵素活性的改良可以為比天然存在的醣基轉移酶或衍生出該醣基轉移酶多肽的另一種經工程處理之醣基轉移酶,從相應的野生型酵素之酵素活性約1.1倍,至2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多倍的酵素活性一樣多。
當於本文中使用,「轉化」係指一種受質變成相應產物的酵素轉化(或生物轉變)。「轉化百分比」係指於指定的情況下、在指定的時間週期內轉化成產物的受質百分比。因而,醣基轉移酶多肽的「酵素活性」或「活性」可表達為在特定的時間週期內受質變成產物的「轉化百分比」。
具有「通用性質(generalist properties)」之酵素(或「通用酵素(generalist enzymes)」)係指與親本序列相比之下,對於範圍廣泛的受質表現出改良的活性之酵素。通用酵素不一定要對每種可能的受質展現出改良的活性。在一些具體例中,本發明提供具有通用性質之醣基轉移酶變異體,因為相對於親本基因,其等對於範圍廣泛立體及電子上多樣的受質展現出相似或改良的活性。此外,本文提供的通用酵素係經工程處理以得到改良跨越範圍廣泛的多樣分子來增加代謝物/產物之生產。
術語「嚴格的雜交條件」於本文中使用係指核酸雜交體穩定的條件。如同熟悉此藝者已知的,雜交體的穩定性係反映在雜交體的熔化溫度(
T
m )。一般說來,雜交體的穩定性係離子強度、溫度、G/C含量及存在的離液劑(chaotropic agent)之函數。多核苷酸的
T
m 值可使用已知的預測熔化溫度的方法來計算(參見諸如,Baldino等人,Meth. Enzymol., 168:761-777 [1989];Bolton等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390 [1962];Bresslauer等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8893-8897 [1986];Freier等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377 [1986];Kierzek等人,Biochem., 25:7840-7846 [1986];Rychlik等人, Nucl. Acids Res., 18:6409-6412 [1990] (勘誤表,Nucl. Acids Res., 19:698 [1991]);Sambrook等人,
如上所述);Suggs等人,1981,
inDevelopmental Biology Using Purified Genes, Brown等人[eds.], pp. 683-693, Academic Press, Cambridge, MA [1981];及Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259 [1991])。在一些具體例中,該多核苷酸編碼本文所揭示之多肽且在確定的條件下,諸如中度嚴格或高度嚴格條件下,與編碼本發明之一種經工程處理之醣基轉移酶酵素之序列的互補物雜交。
當於本文中使用,「雜交嚴格度」係與核酸雜交之雜交條件有關,諸如清洗條件。一般而言,雜交反應係於較低嚴格性條件下執行,接著變化但更高嚴格性的條件下清洗而完成。術語「中度嚴格雜交」係指允許標靶-DNA與和標靶DNA有約60%同一性,較佳約75%同一性,約85%同一性之互補核酸結合的條件,加上和標靶多核苷酸有大於約90%同一性。例示性中度嚴格條件為相當於以下的條件:在42℃下於50%甲醯胺、5×丹哈特氏溶液(Denhart's solution)、5×SSPE、0.2% SDS內雜交,接著在42℃下於0.2×SSPE、0.2% SDS下清洗。「高度嚴格雜交」一般係指離一確定的多核苷酸序列於溶液條件下判定的熱熔化溫度
T
m ,約10℃或更少的條件。在一些具體例中,高度嚴格條件係指允許僅在65℃下於0.018M NaCl內形成穩定的雜交體之該等核酸序列的雜交條件(即,設若雜交體在65℃下於0.018M NaCl內不穩定,則其於高度嚴格性條件下不穩定,如本文所考慮的)。可以通過,舉例而言,相當於以下的條件來提供高度嚴格性條件:在42℃下於50%甲醯胺、5×丹哈特氏溶液、5×SSPE、0.2% SDS內雜交,接著在65℃下於0.1×SSPE及0.1% SDS內清洗。另一高度嚴格性條件為相當於以下的條件下雜交:在65℃下於含有0.1% (w/v) SDS之5X SSC內雜交且在65℃下於含有0.1% SDS之0.1x SSC內清洗。其他高度嚴格性雜交條件,以及中度嚴格條件,係描述在上面引用的參考文獻中。
當於本文中使用,「密碼子最佳化」係指改變編碼一蛋白質之多核苷酸之密碼子成特定生物體優先使用的該等,以使得編碼的蛋白質於感興趣的生物體內有效地表現。縱然遺傳密碼因為多數胺基酸均由幾個密碼子,稱為「同物異名」或「同義的」密碼子,為代表而為簡併的,但是特定生物體的密碼子使用是非隨機且偏向特定的密碼子三聯碼是眾所周知的。關於給定的基因、一般功能或祖先起源的基因、高度表現的蛋白質相對於低複本數的蛋白質及生物體基因組的聚集體蛋白質編碼區域,此密碼子使用偏差可能是更高的。在一些具體例中,編碼醣基轉移酶酵素的多核苷酸可予以密碼子最佳化用於在所選來表現的宿主生物體內最佳生產。
當於本文中使用,「偏好」、「最佳」及「高密碼子使用偏差」密碼子當單獨或組合使用時係可交換地提及,比蛋白質編碼區域內編碼相同胺基酸的其他密碼子更高的使用頻率之密碼子。可就單一基因、一組共同功能或來源的基因、高度表現的基因、整個有機體的聚集體蛋白質編碼區域內之密碼子頻率、相關有機體的聚集體蛋白質編碼區域內之密碼子頻率或其等之組合的密碼子使用,來判定偏好密碼子。隨著基因表現位準而增加頻率的密碼子典型為供表現之最佳密碼子。各種各樣決定特定生物體的密碼子頻率(諸如,密碼子使用、相對同義的密碼子使用)及密碼子偏好的方法為已知的,包括多變量分析,舉例而言,使用群聚分析或對應分析,及基因使用的密碼子之有效數(參見諸如,GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package;CodonW, Peden, University of Nottingham;McInerney, Bioinform., 14:372-73 [1998];Stenico等人,Nucl. Acids Res., 222437-46 [1994];以及Wright, Gene 87:23-29 [1990])。可取得許多不同生物體的密碼子使用表(參見諸如,Wada等人,Nucl. Acids Res., 20:2111-2118 [1992];Nakamura等人,Nucl. Acids Res., 28:292 [2000];Duret,等人,如上所述;Henaut and Danchin,
in Escherichia coliand
Salmonella, Neidhardt,等人(eds.), ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066 [1996])。獲得密碼子使用的資料來源可依靠能編碼蛋白質之任何可用的核苷酸序列。此等資料組包括實際上已知編碼表現蛋白質的核酸序列(諸如,完整蛋白質編碼序列-CDS)、表現序列標籤(ESTS)或基因組序列的預測編碼區域(參見諸如,Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis,第8章,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [ 2001];Uberbacher, Meth. Enzymol., 266:259-281 [1996];及Tiwari等人,Comput. Appl. Biosci., 13:263-270 [1997])。
當於本文中使用,「控制序列」包括對本發明之多核苷酸及/或多肽表現必需或有利之所有組份。各控制序列對編碼該多肽的核酸序列可以為原始或外來的。此等控制序列包括,但不限於,前導子、聚腺苷酸化序列、原胜肽(propeptide)序列、啟動子序列、訊號胜肽序列、起始序列及轉錄終止子。最少,控制序列包括啟動子以及轉錄及轉譯終止訊號。可將控制序列裝配鏈接子以用於引導專一性限切位置,促進控制序列與編碼多肽的核酸序列之編碼區域黏接之目的。
「可操縱地鏈接」係在此定義為一組態,其中一控制序列是相對於感興趣的多核苷酸適當地放置(即,呈功能關係)在一位置,使得控制序列可引導或調節感興趣的多核苷酸及/或多肽之表現。
「啟動子序列」係指一核酸序列被宿主細胞辨識以表現感興趣的多核苷酸,諸如編碼序列。啟動子序列包含轉錄控制序列,其媒介感興趣的多核苷酸之表現。啟動子可為任何在所選擇之宿主細胞中顯示轉錄活性的核酸序列,其包括突變的、截短的與雜交的啟動子,且可獲得自編碼對宿主細胞為同源或異源性、細胞外或細胞內的多肽之基因。
用語「合適的反應條件」係指酵素轉化反應溶液的該等條件(諸如,酵素裝載量、受質裝載量、溫度、pH、緩衝劑、共溶劑(co-solvents)範圍,等等),本發明的醣基轉移酶多肽於該等條件下能使一受質轉化成所欲的產物化合物。於此提供一些例示性「合適的反應條件」。
當於本文中使用,「裝載量」,諸如於「化合物裝載量」或「酵素裝載量」中係指反應開始時反應混合物內一組分的濃度或量。
當於本文中使用,於酵素轉化反應方法的上下文中「受質」係指本文提供的經工程處理之酵素(諸如,經工程處理之醣基轉移酶多肽)作用的化合物或分子。
當於本文中使用,術語「生質」、「生質基質」、「纖維素生質」、「纖維素原料」及「纖維素基質」係指含纖維素的任何材料。生質可以衍生自植物、動物或微生物,且可包括,但不限於農業、工業及林業殘留物、工業及城市廢棄物,以及為能量目的栽培的陸生及水生作物。纖維素基質之實例包括,但不限於,木頭、木漿、紙漿、玉米纖維、玉米粒、玉米芯、作物殘渣如玉米殼、玉米稈、草、小麥、小麥秸稈、大麥、大麥秸稈、乾草、米、稻草、柳枝稷(switchgrass)、廢紙、紙和紙漿加工廢物、木本或草本植物、水果或蔬菜果肉、玉米芯、酒粕、草、稻殼、棉花、大麻、亞麻、瓊麻(sisal)、甘蔗渣、高梁、大豆、柳枝稷、由碾磨穀粒、樹木、樹枝、根、葉、木片、鋸木屑、灌木及灌木叢、蔬菜、水果及花獲得的組分以及其等任何合適的混合物。在一些具體例中,纖維素生質包含,但不限於栽培作物(諸如,草,包括C4草,諸如柳枝稷(switch grass)、繩草(cord grass)、黑麥草、芒草、柳條蘆(reed canary grass),或是其等之任一組合)、糖加工殘留物例如但不限於蔗渣(諸如,甘蔗渣、甜菜渣[諸如,甜菜],或是其等之一組合)、農業殘留物(諸如,大豆秸稈、玉米稈、玉米纖維、稻草、甘蔗秸稈、米、稻殼、大麥秸稈、玉米芯、小麥秸稈、油菜籽秸稈、燕麥秸稈、燕麥殼、玉米纖維、大麻、亞麻、瓊麻、棉花,或是其等之任一組合)、水果果肉、蔬菜果肉、酒粕、林業生質(諸如,木頭、木漿、紙漿、回收木漿纖維、鋸木屑、硬木諸如白楊木、針葉樹,或是其等之任一組合)。此外,在一些具體例中,纖維素生質包含纖維素廢料及/或林業廢料,包括但不限於,紙和紙漿加工廢物、新聞用紙、卡紙板等等。在一些具體例中,纖維素生質包含一種纖維,而於一些任擇的具體例中,纖維素生質包含源於不同纖維素生質的纖維混合物。在一些具體例中,生質亦可包含表現木質酶及/或纖維素酶酵素之基因轉殖植物(參見諸如,US 2008/0104724,在此併入以作為參考資料)。
當於本文中使用,術語「漿料」係指一種水溶液其中一或更多種固體組分諸如纖維素基質,分散於水溶液內。
當於本文中使用,當反應期間存在一特定組分(諸如,GH酵素),與在相同條件下、以相同受質及其他取代基但沒有感興趣的組分進行之反應相比,造成更多產物產出時,發生源自一反應的產物(諸如,甜菊糖)產量「增加」的情況。
當於本文中使用,當受質內存在的二種單醣之間的至少一些醣苷鍵經水解藉此先前結合的二種單體相互分離時,發生「水解」纖維素或其他多醣。
設若一特定酵素的量與參與催化反應的其他酵素相比小於約2%、約1%或約0.1%(wt/wt),則該反應被稱為「實質沒有」該特定酵素。
當於本文中使用,「分餾」一種液體(諸如,培養肉湯)係指應用一種分離方法(諸如,鹽沉澱、管柱層析、粒徑篩析及過濾)或是此等方法之組合來提供一種溶液,該溶液內所欲蛋白質(諸如,甜菊糖苷)比起始的液體產物,佔溶液內總蛋白質更大的百分率。
當於本文中使用,「起始組成物」係指包含至少一種基質之任何組成物。在一些具體例中,起始組成物包含任何纖維素基質。
於一些任擇的具體例中,術語「起始組成物」係指包含至少一甜菊糖之任何組成物,其中甜菊糖之一或更多者作用為生物轉變之受質。在一些具體例中,起始組成物係提供為水溶液。在一些具體例中,起始組成物包含選自於下列的至少一種甜菊糖:甜菊苷、甜菊單糖苷(steviolmonoside)、甜菊二糖苷(steviolbioside)、甜茶苷(rubusoside)、衛矛醇苷B(dulcoside B)、衛矛醇苷A、甜菊糖苷B、甜菊糖苷G、甜菊糖苷C、甜菊糖苷F、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I、甜菊糖苷E、甜菊糖苷H、甜菊糖苷L、甜菊糖苷K、甜菊糖苷J、甜菊糖苷M(亦稱為甜菊糖苷X)、甜菊糖苷D、甜菊糖苷N、甜菊糖苷O,以及合成的甜菊糖(諸如,酵素葡萄糖苷化的甜菊糖),在一些具體例中,起始組成物包含二種或多種甜菊糖。在一些具體例中,起始組成物包含從甜菊(
Stevia rebaudiana)植物材料(諸如,葉)純化獲得的萃取物。於一些任擇的具體例中,起始組成物包含市售的甜菊(stevia)萃取物。額外的起始組成物包含用於單離及純化甜菊糖的方法之副產物。在一些具體例中,起始組成物包含純化或部分純化的甜菊糖受質。在一些具體例中,起始組成物包含大於約99重量%的一特定甜菊糖。
在一些具體例中,起始組成物包含至少一種醣苷及一纖維素組分作為受質以生產至少一甜菊糖(諸如,甜菊糖苷A、D等等)。
當於本文中使用,於酵素轉化方法的上下文中「產物」係指一酵素多肽作用於受質而產生的化合物或分子。當於本文中使用,在一些具體例中,該術語係指醣基轉移酶多肽作用於受質而產生的化合物或分子。在一些具體例中,本發明提供的產物為甜菊糖。在一些具體例中,該產物包含選自於下列的至少一種甜菊糖:甜菊苷、甜菊單糖苷(steviolmonoside)、甜菊二糖苷(steviolbioside)、甜茶苷(rubusoside)、衛矛醇苷B(dulcoside B)、衛矛醇苷A、甜菊糖苷B、甜菊糖苷G、甜菊糖苷C、甜菊糖苷F、甜菊糖苷A、甜菊糖苷I、甜菊糖苷E、甜菊糖苷H、甜菊糖苷L、甜菊糖苷K、甜菊糖苷J、甜菊糖苷M(亦稱為甜菊糖苷X)、甜菊糖苷D、甜菊糖苷N、甜菊糖苷O,以及合成的甜菊糖(諸如,酵素葡萄糖苷化的甜菊糖)。
當於本文中使用該術語「培養」係指於任何合適的條件(諸如,使用液體、凝膠或固態培養基)下使微生物細胞族群生長。
重組多肽可使用本技藝已知的任何合適的方法來生產。可選殖編碼感興趣的野生型多肽的基因至載體內,諸如質體,及表現於所欲的宿主內,諸如大腸桿菌等等。重組多肽變異體可藉由本技藝已知的各種方法來產生。更確切地,有各種各樣熟悉此藝者眾所周知不同的致突變技術。此外,亦可從許多商業分子生物學供應商獲得致突變套組。於確定的胺基酸製造特定取代(定點)、基因局部區域之特定或隨機突變(位置特異性),或於整個基因之隨機致突變(諸如,飽和致突變(saturation mutagenesis))的方法是可利用的。熟悉此藝者已知許多合適的方法來產生酵素變異體,包括但不限於使用PCR之單股DNA或雙股DNA之定點致突變、盒式致突變(cassette mutagenesis)、基因合成、易誤PCR、改組(shuffling)及化學飽和致突變,或本技藝已知的任何其他合適的方法。致突變及定向演化方法可很容易應用至編碼酵素的多核苷酸來產生變異體庫其可用來表現、篩選及檢定。任何合適的致突變及定向演化方法均可用於本發明且係本技藝廣為人知的(參見諸如,美國專利編號5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、5,837,458、5,928,905、6,096,548、6,117,679、6,132,970、6,165,793、6,180,406、6,251,674、6,265,201、6,277,638、6,287,861、6,287,862、6,291,242、6,297,053、6,303,344、6,309,883、6,319,713、6,319,714、6,323,030、6,326,204、6,335,160、6,335,198、6,344,356、6,352,859、6,355,484、6,358,740、6,358,742、6,365,377、6,365,408、6,368,861、6,372,497、6,337,186、6,376,246、6,379,964、6,387,702、6,391,552、6,391,640、6,395,547、6,406,855、6,406,910、6,413,745、6,413,774、6,420,175、6,423,542、6,426,224、6,436,675、6,444,468、6,455,253、6,479,652、6,482,647、6,483,011、6,484,105、6,489,146、6,500,617、6,500,639、6,506,602、6,506,603、6,518,065、6,519,065、6,521,453、6,528,311、6,537,746、6,573,098、6,576,467、6,579,678、6,586,182、6,602,986、6,605,430、6,613,514、6,653,072、6,686,515、6,703,240、6,716,631、6,825,001、6,902,922、6,917,882、6,946,296、6,961,664、6,995,017、7,024,312、7,058,515、7,105,297、7,148,054、7,220,566、7,288,375、7,384,387、7,421,347、7,430,477、7,462,469、7,534,564、7,620,500、7,620,502、7,629,170、7,702,464、7,747,391、7,747,393、7,751,986、7,776,598、7,783,428、7,795,030、7,853,410、7,868,138、7,783,428、7,873,477、7,873,499、7,904,249、7,957,912、7,981,614、8,014,961、8,029,988、8,048,674、8,058,001、8,076,138、8,108,150、8,170,806、8,224,580、8,377,681、8,383,346、8,457,903、8,504,498、8,589,085、8,762,066、8,768,871、9,593,326,及所有相關的US,以及PCT與非US對應物;Ling等人,Anal. Biochem
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在一些具體例中,致突變處理後獲得的酵素克隆(clones)係藉由使酵素製備物接受一確定的溫度(或其他檢定條件)且測量熱處理或其他合適的檢定條件後剩餘的酵素活性的量來進行篩選。繼而自該基因單離含編碼多肽的多核苷酸之克隆、定序以識別核苷酸序列的改變(若有的話),以及用於表現該酵素於宿主細胞內。由表現庫測量酵素活性能使用本技藝已知的任何合適的方法來執行(諸如,標準生化技術,如HPLC分析)。
變異體產生之後,可篩選其等任何所欲的性質(諸如,高或增加的活性、或低或降低的活性、增加的熱活性、增加的熱穩定性,及/或酸性pH穩定性等等)。在一些具體例中,「重組醣基轉移酶多肽」(於此亦稱為「經工程處理之醣基轉移酶多肽」、「變異體醣基轉移酶酵素」、「醣基轉移酶變異體」及「醣基轉移酶組合變異體」均可使用。在一些具體例中,「重組蔗糖合成酶多肽」(亦稱為「經工程處理之蔗糖合成酶多肽」、「變異體蔗糖合成酶酵素」、「蔗糖合成酶變異體」及「蔗糖合成酶組合變異體」均可使用。
當於本文中使用,一種「載體」為一種DNA建構物用於導入DNA序列至細胞內。在一些具體例中,載體為表現載體其可操縱地鏈接到合適的控制序列能影響該DNA序列編碼的多肽於合適的宿主內之表現。在一些具體例中,一種「表現載體」有一啟動子序列可操縱地鏈接到該DNA序列(諸如,轉基因)以驅動宿主細胞內之表現,以及在一些具體例中,亦包含一轉錄終止子序列。
當於本文中使用,術語「表現」包括涉及生產多肽的任何步驟,包括但不限於,轉錄、轉錄後修飾、轉譯及轉譯後修飾。在一些具體例中,該術語亦包含自一細胞分泌該多肽。
當於本文中使用,術語「生產」係指由細胞生產蛋白質及/或其他化合物。該術語的意圖是包含涉及生產多肽的任何步驟,包括但不限於,轉錄、轉錄後修飾、轉譯及轉譯後修飾。在一些具體例中,該術語亦包含自一細胞分泌該多肽。
當於本文中使用,一種胺基酸或核苷酸序列(諸如,啟動子序列、訊號胜肽、終止子序列等等)對其可操縱地鏈接的另一序列可為「異源性的」,設若二序列本質上是不相關的。舉例而言一種「異源性多核苷酸」為藉由實驗室技術導入宿主細胞的任何多核苷酸,以及包括由宿主細胞移去、接受實驗室操控然後再導入宿主細胞的多核苷酸。
當於本文中使用,術語「宿主細胞」及「宿主株」係指合適包含本文提供的DNA(諸如,編碼醣基轉移酶變異體的多核苷酸)之表現載體的宿主。在一些具體例中,該宿主細胞為已經使用本技藝已知的重組DNA技術建構的載體予以轉形或轉染的原核或真核細胞。
術語「結構類似物」意指一種多肽其與一參考多肽有超過70%的序列同一性但是小於100%的序列同一性(諸如,超過75%、78%、80%、83%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性)。在一些具體例中,結構類似物意指多肽其含一或更多非天然存在的胺基酸殘基,包括,但不限於:高精胺酸、鳥胺酸及正纈胺酸,以及天然存在的胺基酸。在一些具體例中,結構類似物也包括一或更多D-胺基酸殘基及非胜肽鍵聯於二種或多種胺基酸殘基之間。
術語「有效量」意指足以產生所欲結果的量。本技藝的普通技術人員之一者可利用常規實驗來判定有效量。
術語「經單離的」及「純化的」用於提及一分子(諸如,一經單離的核酸、多肽等等)或其他組分,其已遠離天然有關聯的至少一種其他組分。術語「純化的」不要求絕對純度,而其意思是相對的定義。
當於本文中使用,「立體選擇性」意指於化學或酵素反應中一種立體異構物而不是另一者會優先形成。立體選擇性可以是部分的,其中一種立體異構物比另一種更偏好形成,或者可以是全面的,其中只有形成一種立體異構物。當立體異構物為鏡像異構物時,立體選擇性稱為鏡像選擇性,一種鏡像異構物在兩者的總和中之分數(fraction) (典型地報告稱為百分率)。本技藝通常任擇地報告(典型為百分率)為依據公式[主要鏡像異構物-次要鏡像異構物]/[主要鏡像異構物+次要鏡像異構物]計算出的鏡像異構物超越量(“e.e.”)。立體異構物為非鏡像異構物時,立體選擇性稱為非鏡像選擇性,二種非鏡像異構物混合物中的一種非鏡像異構物之分數(典型地報告稱為百分率),通常或者報告為非鏡像異構物超越量(“d.e.”)。鏡像異構物超越量及非鏡像異構物超越量為立體異構物超越量之類型。
當於本文中使用,「位置選擇性」及「位置選擇性反應」意指一種反應,其中製作或打斷一方向的鍵優先於所有其他可能的方向的情況發生於該反應中。設若一位置的反應產物占優勢而不是其他位置反應產物,則反應可為完全(100%)位置選擇性設若區別是完全的、實質位置選擇性(至少75%),或部分位置選擇性(x%,其中百分率取決於感興趣的反應而定)。
當於本文中使用,「熱穩定的」意指一種醣基轉移酶多肽其暴露於提高的溫度(諸如,40-80℃)一段時間週期(諸如0.5-24 h)後,與野生型酵素暴露於相同提高的溫度後相比,維持相似的活性(舉例而言超過60%至80%)。
當於本文中使用,「溶劑穩定的」意指一種醣基轉移酶多肽其暴露於各種濃度(諸如5-99%)的溶劑(乙醇、異丙醇、二甲亞碸[DMSO]、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基三級丁基醚等等)一段時間週期(諸如0.5-24 h)後,與野生型酵素暴露於相同濃度的相同溶劑相比,維持相似的活性(舉例而言超過60%至80%)。
當於本文中使用,「熱及溶劑穩定的」意指一種醣基轉移酶多肽其為熱穩定及溶劑穩定的。
當於本文中使用,「還原劑」意指一種能夠轉化Fe
+3成Fe
+2的化合物或製劑。例示性還原劑為抗壞血酸,其一般係呈L-抗壞血酸形式。
當於本文中使用,「選擇性的」及「選擇性地」意指隨後描述的事件或情況可能會或可能不會發生,以及該描述包括該事件或情況會發生的例子及不會發生的例子。本技藝的一般技藝人士會理解到就描述為含有一或更多個選擇性的取代基之任何分子而言,只有立體上可實施及/或合成可行的化合物打算被包括在內。「選擇性取代的」意指在一個術語或一系列化學基團中所有後續的修飾劑。
醣基化
醣基化能改變天然及合成產物的許多性質,包括穩定性、藥效學、溶解度及膜運輸。本發明提供適合由各種的配醣基及醣基化受質產生新的醣基化化合物之組成物、方法及酵素。在一些具體例中,本發明提供由容易獲得的前驅體有效產生已知醣基化化合物的構件。在某些情況下,醣基化係通過化學合成方法實現。然而,此等方法典型地需要非所欲的化學物及方法以及能導致混合產物(諸如,帶有位置不正確及/或非所欲變旋異構組態的鍵聯)。此外,碳水化合物化學需要多重保護及去保護步驟。
相反地,醣基化酵素可於溫和條件下有活性且可於單一步驟內賦予高位置選擇性及立體特異性。許多天然存在的醣基化代謝物係使用醣基轉移酶從各種的糖核苷轉移糖部分而於活體內生產。許多分子,包括具抗微生物、抗腫瘤、天然的甜味特性等等之許多次級代謝物,包含非核糖體胜肽、聚乙醯(polyketide),或以β-醣苷鍵聯修飾之萜類骨幹形成。萃取自植物,甜菊(
Stevia rebaudianaBertoni)的許多二萜醣苷,含有β-鍵聯的葡萄糖分子。當然,此等分子係使用UDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶酵素在活體內予以醣基化。本發明提供一種方法(參見,圖1),其中使用一種新的經工程處理之醣基轉移酶以從核苷二磷酸葡萄糖轉移葡萄糖部分至一受質(諸如,甜菊糖苷D或甜菊苷),以生產一或更多β-葡萄糖鍵聯的產物(諸如,甜菊糖苷M、甜菊糖苷A或甜菊糖苷I)。然而,當在活體內使用,UDP-葡萄糖可能過於昂貴及/或不可得。於一些額外的具體例中,一種合成酶(諸如,蔗糖合成酶或海藻糖合成酶)作用於相反的方向以從核苷二磷酸及葡萄糖予體(諸如,蔗糖、海藻糖或澱粉)形成核苷二磷酸葡萄糖化合物。
因而,醣基化可以使用來生產天然甜味劑,諸如衍生自甜草本,甜菊(
Stevia rebaudianaBertoni)的該等。如上所述,此植物生產許多二萜醣苷其特徵為優於許多其他高效力甜味劑之高強度甜味及感覺性質。上述的甜醣苷,有共通的配醣基(即,甜菊醇(steviol)),以及於C13及C19位置處之碳水化合物殘基的數目及種類有所不同。甜菊糖不止在其等之分子結構,還有其等之味覺性質彼此不同。通常,據報導甜菊苷比蔗糖甜89-143倍,而據報導甜菊糖苷A比蔗糖甜85至242倍之間(參見諸如,Kasai等人,Nippon Kagaku Kaishi, 1981:726-735 [1981])。於此等一般化合物中,甜菊糖苷A有最澀的、最苦的且最持久的餘味。因而,其具有主要的甜菊糖最有利的感官屬性且已經商品化。然而,甜菊糖苷A只構成單離自甜菊(
Stevia rebaudianaBertoni)的總醣苷之較小的部分(約20%),且甜菊苷(約70%)及甜菊糖組成其餘部分(參見諸如,FAO, Chemical and Technical Assessment, 63
rdJECFA, Steviol Glycosides [2004])。天然存在但更少的化合物甜菊糖苷M,也被稱為甜菊糖苷X,比蔗糖更甜200-350倍且相對於甜菊糖苷A餘味降低(參見諸如,Prakash等人,Food, 3:162-175 [2014])。因而,對甜菊糖苷M,舉例而言作為天然甜味劑,有商業化的興趣,但目前沒有合成此化合物可行的商業途徑。
經工程處理之醣基轉移酶多肽
本發明提供醣基轉移酶多肽、編碼該多肽的多核苷酸、製備該多肽的方法,以及使用該多肽的方法。有關該多肽之說明處,應理解其亦描述編碼該多肽的多核苷酸。在一些具體例中,本發明提供具有與野生型GT酵素相比,有改良的性質之經工程處理、非天然存在的GT酵素。任何合適的反應條件均可用於本發明。在一些具體例中,使用方法來分析該經工程處理多肽的改良性質以進行轉移酶反應。在一些具體例中,反應條件關於多肽的濃度或量、受質、輔受質、緩衝劑、共溶劑、pH、包括溫度及反應時間的條件,及/或多肽固定化於撐體上的條件係予以修飾,如下面及實施例中進一步描述的。
在一些具體例中,本文所述之經工程處理之GT多肽與野生型GT酵素相比,具有改良的性質例如甜菊糖轉化成另外的醣基化甜菊糖(諸如,甜菊苷轉化成甜菊糖苷A或甜菊糖苷D轉化成甜菊糖苷M)以及使用於腺嘌呤二磷酸葡萄糖或其他核苷二磷酸。在一些具體例中,該經工程處理之GT酵素包含胺基酸序列,其與下列相比有一或更多殘基差異:序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、4256、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、684、7388,及/或8088。在一些具體例中,該經工程處理之GT酵素為β-1,2醣基轉移酶變異體,其與下列相比有一或更多殘基差異:序列辨識編號:758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、7324,及/或7784。在一些具體例中,該經工程處理之GT酵素為β-1,3醣基轉移酶變異體,其與下列相比有一或更多殘基差異:序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088。在一些另外的具體例中,經工程處理之GT多肽為環狀排列(circular permuted)蛋白質,其中在基因層面併入一胜肽鏈接子於N-及C-末端之間以及選擇新的胺基酸位置為新的N-及C-末端位址。在一些具體例中,該環狀排列GT酵素包含胺基酸序列,其與下列相比有一或更多殘基差異:序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088。在一些具體例中,該環狀排列GT酵素包含胺基酸序列,其與序列辨識編號:32相比有一或更多殘基差異。在一些具體例中,該GT酵素包含至少一種在此陳述的序列。在一些具體例中,本發明提供經工程處理之醣基轉移酶,其包含與下列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之多肽序列:序列辨識編號:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、22、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、 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,8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220、9222、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238,及/或9240。在一些額外的具體例中,本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶,其包含與下列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之多肽序列:序列辨識編號:1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762、7764、8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478、8480、8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104,及9106。
在一些具體例中,使用額外的反應組分或額外的技術來補充該反應條件。在一些具體例中,此等包括採取措施以穩定或預防酵素的不活化,降低產物抑制,轉移反應平衡成為葡萄糖苷化的產物形成。
在一些另外的具體例中,上述任一轉化受質化合物成產物化合物的方法可進一步包含選自於下列的一或更多步驟:萃取;單離;純化;及產物化合物的結晶、過濾或冷凍乾燥。用於由以上揭示的方法所生產的生物催化反應混合物予以萃取、單離、純化及/或結晶葡萄糖苷化的產物之方法、技術及方案為通常技藝者已知的及/或經由常規實驗來使用。此外,以下實施例提供解說性的方法。
經工程處理之蔗糖合成酶多肽
本發明提供經工程處理之蔗糖合成酶(SuS)多肽、編碼該多肽的多核苷酸、製備該多肽的方法,以及使用該多肽的方法。有關該多肽之說明處,應理解其亦描述編碼該多肽的多核苷酸。在一些具體例中,本發明提供具有與野生型SuS酵素相比,有改良的性質之經工程處理、非天然存在的SuS酵素。任何合適的反應條件均可用於本發明。在一些具體例中,使用方法來分析該經工程處理多肽的改良性質以進行合成酶反應。在一些具體例中,反應條件關於經工程處理之SuS的濃度或量、受質、緩衝劑、溶劑、pH、包括溫度及反應時間的條件,及/或經工程處理之SuS多肽固定化於撐體上的條件係予以修飾,如下面及實施例中進一步描述的。
在一些具體例中,本文所述之經工程處理之SuS多肽與野生型SuS酵素相比,具有改良的性質例如本文所述之反應內。在一些具體例中,該經工程處理之SuS酵素包含胺基酸序列,其與下列相比有一或更多殘基差異:序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。
在一些具體例中,本發明提供經工程處理之SuS酵素,其中該SuS酵素之多肽與下列包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性:序列辨識編號:1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762、7764、8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478、8480、8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104,及9106。
在一些具體例中,使用額外的反應組分或額外的技術來補充該反應條件。在一些具體例中,此等包括採取措施以穩定或預防酵素的不活化,降低產物抑制,轉移反應平衡成為葡萄糖苷化的產物形成。
在一些另外的具體例中,上述任一轉化受質化合物成產物化合物的方法可進一步包含選自於下列的一或更多步驟:萃取、單離、純化、結晶、過濾及/或產物化合物的冷凍乾燥。用於由本文提供的方法所生產的生物催化反應混合物予以萃取、單離、純化及/或結晶產物(諸如甜菊糖苷)之方法、技術及方案為通常技藝者已知的及/或經由常規實驗來使用。此外,以下實施例提供解說性的方法。
編碼經工程處理之多肽的多核苷酸、表現載體及宿主細胞
本發明提供編碼本文所述之經工程處理之酵素多肽的多核苷酸。在一些具體例中,該多核苷酸係可操縱地鏈接到控制基因表現之一或更多種異源性調節序列以創造一種能表現編碼該多肽的重組多核苷酸。在一些具體例中,含有至少一種編碼該經工程處理之酵素多肽的異源性多核苷酸之表現建構物被導入至合適的宿主細胞,以表現相應的酵素多肽。
一種蛋白質序列的可用性及相應於各種胺基酸之密碼子的知識會提供所有能編碼該主題多肽的多核苷酸之說明,這對於本領域技術人員來說是顯而易見的。遺傳密碼的簡併性,其中相同的胺基酸係由任擇或同義的密碼子來編碼,允許製造非常大量的核酸,所有的核酸均編碼一種經工程處理之酵素(諸如,GT或SuS)多肽。因而,本發明提供用於生產可以做到的編碼本文所述之酵素多肽的各個及每一個可能的酵素多核苷酸的變異之方法及組成物,其係藉由根據可能的密碼子選擇來選擇組合,以及所有此等變異將被視為具體揭示本文所述之任何多肽,包括實施例提出的胺基酸序列(諸如,於各種的表中)。
在一些具體例中,密碼子較佳予以最佳化供所選用於蛋白質生產的宿主細胞使用。舉例而言,細菌內使用較佳的密碼子典型地用於細菌內表現。所以,編碼該經工程處理之酵素多肽的密碼子最佳化多核苷酸於全長編碼區域中約40%、50%、60%、70%、80%、90%或大於90%的密碼子位置含有較佳的密碼子。
在一些具體例中,該酵素多核苷酸編碼一種經工程處理之多肽,其具有本文所揭示的性質之酵素活性,其中該多肽包含一胺基酸序列,其與選自於本文提供的序列辨識編號之參考序列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的同一性,或任何變異體的胺基酸序列(諸如,實施例提供的該等),以及與參考多核苷酸相比有一或更多殘基差異,或實施例內揭示的任何變異體之胺基酸序列(舉例而言1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或是更多的胺基酸殘基位置)。在一些具體例中,該參考多肽序列係選自序列辨識編號:4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784,及/或8088。於一些任擇的具體例中,該參考多肽序列係選自序列辨識編號:74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506,及/或8420。
在一些具體例中,該參考多核苷酸序列係選自序列辨識編號:3、7、31、231、347、547、561、695、757、769、791、953、1001、1053、2599、2717、2813、2883、3015、3081、3243、3345、3501、3695、3955、4255、4549、4683、4837、4875、5065、5289、5371、5561、5707、5975、6137、6287、6467、6863、7323、7387、7783,及/或8087。在一些具體例中,該參考多核苷酸序列係選自序列辨識編號:757、769、791、953、1001、1053、2599、2717、2813、2883、3015、3081、3243、3345、3501、3695、3955、4255、4549、7323,及/或7783,而於一些任擇的具體例中,該參考多核苷酸序列係選自序列辨識編號:3、7、31、231、347、547、561、695、4683、4837、4875、5065、5289、5371、5561、5707、5975、6137、6287、6467、6863、7387,及/或8087。於還有一些額外的具體例中,該參考多核苷酸序列係選自序列辨識編號:73、1079、1157、1221、1391、1455、1581、1763、1803、1839、2063、2431、2509、7505,及/或8419。
在一些具體例中,編碼至少一種本文所提供的經工程處理之醣基轉移酶的該經工程處理之多核苷酸與下列包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性:序列辨識編號:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997、999、1001、1003、1005、1007、1009、1011、1013、1015、1017、1019、1021、1023、1025、1027、1029、1031、1033、1035、1037、1039、1041、1043、1045、1047、1049、1051、1053、1055、1057、1059、1061、1063、1065、1067、1069、1071、1073、1075、1077、1289、1291、1293、2595、2597、2599、2601、2603、2605、2607、2609、2611、2613、2615、2617、2619、2621、2623、2625、2627、2629、2631、2633、2635、2637、2639、2641、2643、2645、2647、2649、2651、2653、2655、2657、2659、2661、2663、2665、2667、2669、2671、2673、2675、2677、2679、2681、2683、2685、2687、2689、2691、2693、2695、2697、2699、2701、2703、2705、2707、2709、2711、2713、2715、2717、2719、2721、2723、2725、2727、2729、2731、2733、2735、2737、2739、2741、2743、2745、2747、2749、2751、2753、2755、2757、2759、2761、2763、2765、2767、2769、2771、2773、2775、2777、2779、2781、2783、2785、2787、2789、2791、2793、2795、2797、2799、2801、2803、2805、2807、2809、2811、2813、2815、2817、2819、2821、2823、2825、2827、2829、2831、2833、2835、2837、2839、2841、2843、2845、2847、2849、2851、2823、2855、2857、2859、2861、2863、2865、2867、2869、2871、2873、2875、2877、2879、2881、2883、2885、2887、2889、2891、2893、2895、2897、2899、2901、2903、2905、2907、2909、2911、2913、2915、2917、2919、2921、2923、2925、2927、2829、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967、2969、2971、2973、2975、2977、2979、2981、2983、2985、2987、2989、2991、2993、2995、2997、2999、3001、3003、3005、3007、3009、3011、3013、3015、3017、3019、3021、3023、3025、3027、3029、3031、3033、3035、3037、3039、3041、3043、3045、3047、3049、3051、3053、3055、3057、3059、3061、3063、3065、3067、3069、3071、3073、3075、3077、3079、3081、3083、3085、3087、3089、3091、3093、3095、3097、3099、3101、3103、3105、3107、3109、3111、3113、3115、3117、3119、3121、3123、3125、3127、3129、3131、3133、3135、3137、3139、3141、3143、3145、3147、3149、3151、3153、3155、3157、3159、3161、3163、3165、3167、3169、3171、3173、3175、3177、3179、3181、3183、3185、3187、3189、3191、3193、3195、3197、3199、3201、3203、3205、3207、3209、3211、3213、3215、3217、3219、3221、3223、3225、3227、3229、3231、3233、3235、3237、3239、3241、3243、3245、3247、3249、3251、3253、3255、3257、3259、3261、3263、3265、3267、3269、3271、3273、3275、3277、3279、3281、3283、3285、3287、3289、3291、3293、3295、3297、3299、3301、3303、3305、3307、3309、3311、3313、3315、3317、3319、3321、3323、3325、3327、3329、3331、3333、3335、3337、3339、3341、3343、3345、3347、3349、3351、3353、3355、3357、3359、3361、3363、3365、3367、3369、3371、3373、3375、3377、3379、3381、3383、3385、3387、3389、3391、3393、3395、3397、3399、3401、3403、3405、3407、3409、3411、3413、3415、3417、3419、3421、3423、3425、3427、3429、3431、3433、3435、3437、3439、3441、3443、3445、3447、3449、3451、3453、3455、3457、3459、3461、3463、3465、3467、3469、3471、3473、3475、3477、3479、3481、3483、3485、3487、3489、3491、3493、3495、3497、3499、3501、3503、3505、3507、3509、3511、3513、3515、3517、3519、3521、3523、3525、3527、3529、3531、3533、3535、3537、3539、3541、3543、3545、3547、3549、3551、3553、3555、3557、3559、3561、3563、3565、3567、3569、3571、3573、3575、3577、3579、3581、3583、3585、3587、3589、3591、3593、3595、3597、3599、3601、3603、3605、3607、3609、3611、3613、3615、3617、3619、3621、3623、3625、3627、3629、3631、3633、3635、3637、3639、3641、3643、3645、3647、3649、3651、3653、3655、3657、3659、3661、3663、3665、3667、3669、3671、3673、3675、3677、3679、3681、3683、3685、3687、3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在一些額外的具體例中,編碼至少一種本文所提供的經工程處理之蔗糖合成酶的該經工程處理之多核苷酸與下列包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性:序列辨識編號:1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1115、1117、1119、1121、1123、1125、1127、1129、1131、1133、1135、1137、1139、1141、1143、1145、1147、1149、1151、1153、1155、1157、1159、1161、1163、1165、1167、1169、1171、1173、1175、1177、1179、1181、1183、1185、1187、1189、1191、1193、1195、1197、1199、1201、1203、1205、1207、1209、1211、1213、1215、1217、1219、1221、1223、1225、1227、1229、1231、1233、1235、1237、1239、1241、1243、1245、1247、1249、1251、1253、1255、1257、1259、1261、1263、1265、1267、1269、1271、1273、1275、1277、1279、1281、1283、1285、1287、1295、1297、1299、1301、1303、1305、1307、1309、1311、1313、1315、1317、1319、1321、1323、1325、1327、1329、1331、1333、1335、1337、1339、1341、1343、1345、1347、1349、1351、1353、1355、1357、1359、1361、1363、1365、1367、1369、1371、1373、1375、1377、1379、1381、1383、1385、1387、1389、1391、1393、1395、1397、1399、1401、1403、1405、1407、1409、1411、1413、1415、1417、1419、1421、1423、1425、1427、1429、1431、1433、1435、1437、1439、1441、1443、1445、1447、1449、1451、1453、1455、1457、1459、1461、1463、1465、1467、1469、1471、1473、1475、1477、1479、1481、1483、1485、1487、1489、1491、1493、1495、1497、1499、1501、1503、1505、1507、1509、1511、1513、1515、1517、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1531、1533、1535、1537、1539、1541、1543、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1569、1571、1573、1575、1577、1579、1581、1583、1585、1587、1589、1591、1593、1595、1597、1599、1601、1603、1605、1607、1609、1611、1613、1615、1617、1619、1621、1623、1625、1627、1629、1631、1633、1635、1637、1639、1641、1643、1645、1647、1649、1651、1653、1655、1657、1659、1661、1663、1665、1667、1669、1671、1673、1675、1677、1679、1681、1683、1685、1687、1689、1691、1693、1695、1697、1699、1701、1703、1705、1707、1709、1711、1713、1715、1717、1719、1721、1723、1725、1727、1729、1731、1733、1735、1737、1739、1741、1743、1745、1747、1749、1751、1753、1755、1757、1759、1761、1763、1765、1767、1769、1771、1773、1775、1777、1779、1781、1783、1785、1787、1789、1791、1793、1795、1797、1799、1801、1803、1805、1807、1809、1811、1813、1815、1817、1819、1821、1823、1825、1827、1829、1831、1833、1835、1837、1839、1841、1843、1845、1847、1849、1851、1853、1855、1857、1859、1861、1863、1865、1867、1869、1871、1873、1875、1877、1879、1881、1883、1885、1887、1889、1891、1893、1895、1897、1899、1901、1903、1905、1907、1909、1911、1913、1915、1917、1919、1921、1923、1925、1927、1929、1931、1933、1935、1937、1939、1941、1943、1945、1947、1949、1951、1953、1955、1957、1959、1961、1963、1965、1967、1969、1971、1973、1975、1977、1979、1981、1983、1985、1987、1989、1991、1993、1995、1997、1999、2001、2003、2005、2007、2009、2011、2013、2015、2017、2019、2021、2023、2025、2027、2029、2031、2033、2035、2037、2039、2041、2043、2045、2047、2049、2051、2053、2055、2057、2059、2061、2063、2065、2067、2069、2071、2073、2075、2077、2079、2081、2083、2085、2087、2089、2091、2093、2095、2097、2099、2101、2103、2105、2107、2109、2111、2113、2115、2117、2119、2121、2123、2125、2127、2129、2131、2133、2135、2137、2139、2141、2143、2145、2147、2149、2151、2153、2155、2157、2159、2161、2163、2165、2167、2169、2171、2173、2175、2177、2179、2181、2183、2185、2187、2189、2191、2193、2195、2197、2199、2201、2203、2205、2207、2209、2211、2213、2215、2217、2219、2221、2223、2225、2227、2229、2231、2233、2235、2237、2239、2241、2243、2245、2247、2249、2251、2253、2255、2257、2259、2261、2263、2265、2267、2269、2271、2273、2275、2277、2279、2281、2283、2285、2287、2289、2291、2293、2295、2297、2299、2301、2303、2305、2307、2309、2311、2313、2315、2317、2319、2321、2323、2325、2327、2329、2331、2333、2335、2337、2339、2341、2343、2345、2347、2349、2351、2353、2355、2357、2359、2361、2363、2365、2367、2369、2371、2373、2375、2377、2379、2381、2383、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419、2421、2423、2425、2427、2429、2431、2433、2435、2437、2439、2441、2443、2445、2447、2449、2451、2453、2455、2457、2459、2461、2463、2465、2467、2469、2471、2473、2475、2477、2479、2481、2483、2485、2487、2489、2491、2493、2495、2497、2499、2501、2503、2505、2507、2509、2511、2513、2515、2517、2519、2521、2523、2525、2527、2529、2531、2533、2535、2537、2539、2541、2543、2545、2547、2549、2551、2553、2555、2557、2559、2561、2563、2565、2567、2569、2571、2573、2575、2577、2579、2581、2583、2585、2587、2589、2591、2593、7437、7439、7441、7443、7445、7447、7449、7451、7453、7455、7457、7459、7461、7463、7465、7467、7469、7471、7473、7475、7477、7479、7481、7483、7485、7487、7489、7491、7493、7495、7497、7499、7501、7503、7505、7507、7509、7511、7513、7515、7517、7519、7521、7523、7525、7527、7529、7531、7533、7535、7537、7539、7541、7543、7545、7547、7549、7551、7553、7555、7557、7559、7561、7563、7565、7567、7569、7571、7573、7575、7577、7579、7581、7583、7585、7587、7589、7591、7593、7595、7597、7599、7601、7603、7605、7607、7609、7611、7613、7615、7617、7619、7621、7623、7625、7627、7629、7631、7633、7635、7637、7639、7641、7643、7645、7647、7649、7651、7653、7655、7657、7659、7661、7663、7665、7667、7669、7671、7673、7675、7677、7679、7681、7683、7685、7687、7689、7691、7693、7695、7697、7699、7701、7703、7705、7707、7709、7711、7713、7715、7717、7719、7721、7723、7725、7727、7729、7731、7733、7735、7737、7739、7741、7743、7745、7747、7749、7751、7753、7755、7757、7759、7761、7763、8369、8371、8373、8375、8377、8379、8381、8383、8385、8387、8389、8391、8393、8395、8397、8399、8401、8403、8405、8407、8409、8411、8413、8415、8417、8419、8421、8423、8425、8427、8429、8431、8433、8435、8437、8439、8441、8443、8445、8447、8449、8451、8453、8455、8457、8459、8461、8463、8465、8467、8469、8471、8473、8475、8477、8479、8797、8799、8801、8803、8805、8807、8809、8811、8813、8815、8817、8819、8821、8823、8825、8827、8829、8831、8833、8835、8837、8839、8841、8843、8845、8847、8849、8851、8853、8855、8857、8859、8861、8863、8865、8867、8869、8871、8873、8875、8877、8879、8881、8883、8885、8887、8889、8891、8893、8895、8897、8899、8901、8903、8905、8907、8909、8911、8913、8915、8917、8919、8921、8923、8925、8927、8929、8931、8933、8935、8937、8939、8941、8943、8945、8947、8949、8951、8953、8955、8957、8959、8961、8963、8965、8967、8969、8971、8973、8975、8977、8979、8981、8983、8985、8987、8989、8991、8993、8995、8997、8999、9001、9003、9005、9007、9009、9011、9013、9015、9017、9019、9021、9023、9025、9027、9029、9031、9033、9035、9037、9039、9041、9043、9045、9047、9049、9051、9053、9055、9057、9059、9061、9063、9065、9067、9069、9071、9073、9075、9077、9079、9081、9083、9085、9087、9089、9091、9093、9095、9097、9099、9101、9103,及/或9105。
在一些具體例中,該多核苷酸能於高度嚴格條件下與選自於本文提供的任何多核苷酸序列之參考多核苷酸序列,或其互補物,或編碼本文提供的任何變異體酵素多肽之多核苷酸序列雜交。在一些具體例中,能於高度嚴格條件下雜交的該多核苷酸編碼一種酵素多肽,其包含一胺基酸序列,其與參考序列相比有一或更多殘基差異。
在一些具體例中,一種編碼本文之任一經工程處理之酵素多肽之經單離的多核苷酸係以各種方式操作以促進酵素多肽之表現。在一些具體例中,編碼該酵素多肽之多核苷酸包含表現載體,其中存在一或更多控制序列來調節該酵素多核苷酸及/或多肽之表現。視所用的表現載體而定,該經單離的多核苷酸在插入載體之前操作可能為合乎需要或必需的。使用重組DNA方法來修飾多核苷酸及核酸序列之技術係本技藝廣為人知的。在一些具體例中,控制序列包括尤其是,啟動子、前導子序列、聚腺苷酸化序列、原胜肽(propeptide)序列、訊號胜肽序列及轉錄終止子。在一些具體例中,根據宿主細胞選擇來選擇合適的啟動子。關於細菌宿主細胞,引導本揭示之核酸建構物的轉錄之適合啟動子,包括,但不限於獲得自以下者之啟動子:大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌(
Streptomyces coelicolor)瓊脂分解酵素基因(dagA)、枯草桿菌菌果聚醣蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)、地衣桿菌
α-澱粉酶基因(amyL)、脂肪嗜熱桿菌產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、芽孢枯草桿菌(
Bacillus amyloliquefaciens) α-澱粉酶基因(amyQ)、地衣桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草桿菌xylA與xylB基因以及原核生物性β-內醯胺酶基因(參見諸如,Villa-Kamaroff等人,Proc. Natl Acad. Sci.
USA 75: 3727-3731 [1978]),以及
tac啟動子(參見諸如,DeBoer等人,Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983])。用於絲狀真菌宿主細胞之例示性啟動子,包括,但不限於獲得自以下者之基因的啟動子:米麴黴菌TAKA澱粉酶、米氏假根毛黴(
Rhizomucor miehei)天冬胺酸蛋白酶、黑麴菌中性α-澱粉酶、黑麴菌酸穩定性
α-澱粉酶、黑麴菌或泡盛麴菌葡萄糖澱粉酶(glaA)、米氏假根毛黴(
Rhizomucor miehei)脂酶、米麴黴菌鹼性蛋白酶、米麴黴菌丙醣磷酸異構酶、小巢狀麴菌
(Aspergillus nidulans)乙醯胺酶及尖鐮孢菌類胰蛋白酶蛋白酶(參見諸如,WO 96/00787),以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴菌中性α-澱粉酶及米麴黴菌丙醣磷酸異構酶之基因的啟動子之雜交體),及其突變、截短與雜交啟動子。例示性酵母菌細胞啟動子可以為獲得自以下者之基因:啤酒酵母菌烯醇酶(ENO-1)、啤酒酵母菌半乳糖激酶(GAL1)、啤酒酵母菌乙醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH2/GAP)及啤酒酵母菌3-磷酸甘油酸激酶。其他對酵母菌宿主細胞有用的啟動子係本技藝已知的(參見諸如,Romanos等人,Yeast 8:423-488 [1992])。
在一些具體例中,控制序列亦可為合適的轉錄終止子序列(即,被宿主細胞辨識以終止轉錄的序列)。在一些具體例中,終止子序列係可操縱地鏈接到編碼該酵素多肽的核酸序列之3'末端。在所選擇的宿主細胞中起作用之任何合適的終止子皆可用於本發明中。用於絲狀真菌宿主細胞的例示性轉錄終止子可獲得自來自以下者之基因:米麴黴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、小巢狀麴菌
(Aspergillus nidulans)鄰胺苯甲酸合成酶、黑麴菌中性α-葡萄糖苷酶及尖鐮孢菌類胰蛋白酶蛋白酶。用於酵母菌宿主細胞的例示性終止子可獲得自來自以下者之基因:啤酒酵母菌烯醇酶、啤酒酵母菌細胞色素C(CYC1)及啤酒酵母菌甘油醛-3-磷酸去氫酶。其他對酵母菌宿主細胞有用的終止子係本技藝已知的(參見諸如,Romanos等人,
如上所述)。
在一些具體例中,控制序列亦可為合適的前導子序列(即mRNA的未轉譯區域,其對宿主細胞之轉譯作用很重要)。在一些具體例中,前導子序列係可操縱地鏈接到編碼該酵素多肽的核酸序列之5'末端。在所選擇的宿主細胞中起作用之任何合適的前導子皆可用於本發明中。用於絲狀真菌宿主細胞的例示性前導子係獲得自來自以下者之基因:米麴黴菌TAKA澱粉酶及小巢狀麴菌
(Aspergillus nidulans)丙醣磷酸異構酶。用於酵母菌宿主細胞之合適的前導子係獲得自來自以下者之基因:啤酒酵母菌烯醇酶(ENO-1)、啤酒酵母菌3-磷酸甘油酸激酶、啤酒酵母菌α-因子及啤酒酵母菌乙醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH2/GAP)。
在一些具體例中,控制序列亦可為聚腺苷酸化序列(即,可操縱地鏈接到核酸序列3'末端的序列且其,當轉錄時,被宿主細胞辨認為將聚腺苷殘基加至所轉錄mRNA的訊號)。在所選擇的宿主細胞中起作用之任何合適的聚腺苷酸化序列可用於本發明。用於絲狀真菌宿主細胞之例示性聚腺苷酸化序列包括,但不限於下列之基因:米麴黴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、小巢狀麴菌
(Aspergillus nidulans)鄰胺苯甲酸合成酶、尖鐮孢菌類胰蛋白酶蛋白酶及黑麴菌α-葡萄糖苷酶。對酵母菌宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列係已知的(參見諸如,Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995])。
在一些具體例中,控制序列亦為訊號胜肽(即,一編碼區域其編碼一連接至一多肽的胺基末端之胺基酸序列並引導所編碼多肽至細胞的分泌途徑)。在一些具體例中,核酸序列的編碼序列之5'端可天然地包含一訊號胜肽編碼區域,其天然地以符合轉譯閱讀框架的方式與編碼該所分泌多肽之編碼區域的區段連接。任擇地,在一些具體例中,編碼序列之5'端包含一訊號胜肽編碼區域,其對該編碼序列為外來的。可使用引導所表現多肽進入所選擇宿主細胞分泌路徑之任何合適的訊號胜肽編碼區域來表現經工程處理之多肽。對細菌宿主細胞有效的訊號胜肽編碼區域係獲得自以下基因的訊號胜肽編碼區域,包括但不限於:芽孢桿菌NCIB 11837產麥芽糖澱粉酶、脂肪嗜熱桿菌
α-澱粉酶、地衣桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣桿菌β-內醯胺酶、脂肪嗜熱桿菌中性蛋白酶(nprT、npfS、nprM)與枯草桿菌prsA。另外的訊號胜肽係本技藝已知的(參見諸如,Simonen and Palva,
Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993])。在一些具體例中,對絲狀真菌宿主細胞有效的訊號胜肽編碼區域係獲得自以下基因的訊號胜肽編碼區域,包括但不限於:米麴黴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖中性澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、米氏假根毛黴(
Rhizomucor miehei)天冬胺酸蛋白酶、傲慢腐質菌纖維素酶(
Humicola insolenscellulase)及絨毛狀腐殖菌(
Humicola lanuginosa)脂酶。對酵母菌宿主細胞有用的訊號胜肽包括但不限於獲得自以下者的基因:啤酒酵母菌α-因子及啤酒酵母菌轉化酶。
在一些具體例中,控制序列亦為原胜肽(propeptide)編碼區域,其編碼位於一多肽之胺基末端的胺基酸序列。所得胜肽稱為「酶原(proenzyme)」、「多肽原(propolypeptide」」或「酶原(zymogen)」。多肽原可藉由將原胜肽自多肽原催化或自催化裂解而轉化為成熟活性多肽。原胜肽編碼區域可獲得自任何適合來源的基因,包括,但不限於枯草桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草桿菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒酵母菌α-因子、米氏假根毛黴(
Rhizomucor miehei)天冬胺酸蛋白酶與嗜熱毀絲黴蟲漆酶(
Myceliophthora thermophila laccase)(參見諸如,WO 95/33836)。當訊號胜肽與原胜肽區兩者均存在於多肽的胺基末端時,則原胜肽區位於多肽的胺基末端後方且訊號胜肽區位於原胜肽區之胺基末端後方。
在一些具體例中,亦使用調節序列。此等序列使該多肽可對應宿主細胞的生長而調節其表現。調節系統的實例係那些導致基因的表現對化學或物理刺激,包括調節性化合物的存在,起反應而開啟或關閉者。在原核宿主細胞方面,合適的調節序列包括,但不限於
lac、
tac與
trp操縱子系統。在酵母宿主細胞方面,合適的調節系統包括,但不限於ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌方面,合適的調節序列包括,但不限於TAKA α-澱粉酶啟動子、黑麴菌葡萄糖澱粉酶啟動子及米麴黴菌葡萄糖澱粉酶啟動子。
在另一個態樣中,本發明係針對一種重組表現載體,其包含編碼一經工程處理之酵素多肽的一多核苷酸,及一或更多表現調節區域例如啟動子與終止子、複製原點等等,取決於其等待導入的宿主類型。在一些具體例中,本文所述之各種核酸及控制序列係連接在一起以產生重組表現載體,其包括一或更多個適宜限制位點以允許在此等位點處插入或取代編碼該酵素多肽的核酸序列。任擇地,在一些具體例中,本發明的核酸序列係藉由將包含該序列的核酸序列或核酸建構物插入用於表現的適合載體而表現。於一些涉及創造表現載體的具體例中,該編碼序列係置於該載體內以使得該編碼序列係可操縱地鏈接到用於表現之合適的控制序列。
重組表現載體可為任何合適的載體(例如,質體或病毒),其可方便地接受重組DNA程序且可引起該酵素多核苷酸序列的表現。載體的選擇典型地會根據該載體與該載體被導入的宿主細胞間的相容性。該載體可為線性或封閉環狀質體。
在一些具體例中,該表現載體為自主複製載體(即,以染色體外實體存在,且其複製獨立於染色體複製的載體,例如質體、染色體外因子、袖珍染色體或人工染色體)。載體可含有用於確保自我複製的任何構件。於一些任擇的具體例中,載體可為當導入至宿主細胞中時,被併入基因組中並與其已併入的染色體一起複製的載體。此外,在一些具體例中,可使用單一載體或質體或一起含有欲導入至宿主細胞之基因組中的整體DNA的二或更多個載體或質體,及/或轉位子。
在一些具體例中,該表現載體可含一或更多種可選擇標記,其允許容易選擇經轉形的細胞。一「可選擇標記」是一基因,其之產物提供除生物或病毒的抗性、對重金屬的抗性、原營性(prototrophy)至營養缺陷型(auxotrophs)以及類似者。細菌的可選擇標記之實例包括,但不限於來自枯草桿菌或地衣桿菌的
dal基因或給予抗生素抗性的標記,例如胺苄青黴素、康微素、氯黴素或四環素。適合用於酵母菌宿主細胞的標記包括,但不限於ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1與URA3。用於絲狀真菌宿主細胞之可選擇標記包括,但不限於amdS(乙醯胺酶;諸如,來自小巢狀麴菌
( A. nidulans )或米麴黴菌)、argB(鳥胺酸甲胺醯基轉移酶)、bar(甲基次膦酸(phosphinothricin)乙醯轉移酶;諸如,來自吸水鏈黴菌(S
. hygroscopicus))、hph(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(血苷-5'-磷酸去羧基酶;諸如,來自小巢狀麴菌
( A. nidulans )或米麴黴菌)、sC(硫酸鹽腺苷轉移酶)以及trpC(鄰胺苯甲酸合成酶)以及其均等物。在另一個態樣中,本發明提供一種宿主細胞,其包含編碼至少一種本發明之經工程處理之酵素多肽的至少一多核苷酸,該多核苷酸可操縱地鏈接到用於表現該經工程處理之酵素多肽於宿主細胞之一或更多個控制序列。適用於表現本發明之表現載體所編碼的多肽之宿主細胞係本技藝廣為人知的且包括但不限於,細菌細胞,諸如大腸桿菌、河流弧菌(
Vibrio fluvialis)、鏈黴菌及鼠傷寒沙氏桿菌細胞;真菌細胞,諸如酵母菌細胞(諸如,啤酒酵母菌或巴斯德畢赤酵母菌(
Pichia pastoris)(ATCC存取編號201178));昆蟲細胞如果蠅(
Drosophila)S2及夜盜蛾(
Spodoptera)Sf9細胞;動物細胞如CHO、COS、BHK、293及黑色素瘤(Bowes melanoma)細胞;及植物細胞。例示性宿主細胞亦包括各種大腸桿菌菌株(諸如,W3110 (ΔfhuA)及BL21)。
因此,在另一個態樣中,本發明提供生產該經工程處理之酵素多肽的方法,該方法包含在合適表現該多肽的條件下培養一宿主細胞,該宿主細胞能表現編碼該經工程處理之酵素多肽的多核苷酸。在一些具體例中,該方法進一步包含單離及/或純化該酵素多肽的步驟,如本文所述。
適合宿主細胞的培養基及生長條件係本技藝廣為人知的。預期的是導入表現該酵素多肽的多核苷酸至細胞內之任何合適的方法均可用於本發明。合適的技術包括,但不限於電穿孔、基因槍粒子轟擊、脂質體媒介的轉染、氯化鈣轉染及原生質體融合。
下列代表性實施例闡明本發明的各種特徵及具體例,其等旨在說明而不是限制。
實驗
下列實施例,包括實驗及取得的結果,僅提供用於說明的目的而不被解釋為限制本發明。更確切地,以下所述的許多試劑及設備有各種合適的來源。本發明不打算受限於任何特定來源的任何試劑或設備項目。
以下的實驗揭示內容中,應用下列縮寫:M(莫耳);mM(毫莫耳)、uM及μΜ(微莫耳);nM(奈莫耳);mol(莫耳);gm及g(公克);mg(毫克);ug及μg(微克);L及1(公升);ml及mL(毫升);cm(厘米);mm(毫米);um及μιη (微米);sec.(秒);min(s) (分鐘);h(s)及hr(s) (小時);U(單位);MW(分子量);rpm(每分鐘轉數);psi及PSI(每平方吋磅);℃(攝氏溫度);RT及rt(室溫);CV(變異係數);CAM及cam(氯黴素);PMBS(硫酸多黏菌素B);IPTG(異丙基 β-D-l-硫代半乳哌喃糖苷);LB(溶菌肉湯(Luria broth));TB(極品肉湯(terrific broth));SFP(搖動燒瓶粉末);CDS(編碼序列);DNA(去氧核糖核酸);RNA(核糖核酸);nt(核苷酸;多核苷酸);aa(胺基酸;多肽);大腸桿菌W3110(通常使用的實驗室大腸桿菌株,可得自於大腸桿菌基因庫存中心(Coli Genetic Stock Center) [CGSC],New Haven,CT);AcSus(喜溫嗜酸硫桿菌(
Acidithiobacillus caldus)蔗糖合成酶);SUS、SuS及SuSy(蔗糖合成酶(sucrose synthase),也被稱為蔗糖合成酶(sucrose synthetase));NDP(核苷二磷酸);腺苷二磷酸(ADP);胞苷二磷酸(CDP);鳥苷二磷酸(GDP);胸苷二磷酸(TDP);尿苷二磷酸(UDP);肌苷二磷酸(IDP);GT(醣基轉移酶);UGT(UDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶);NGT(NDP-核苷二磷酸-依賴性醣基轉移酶);AGT(ADP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶);CGT(CDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶);GGT(GDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶);TGT(TDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶);IGT(IDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶);UGT(UDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶);reb(甜菊糖苷);rebA(甜菊糖苷A);rebD(甜菊糖苷D);rebI(甜菊糖苷I);rebM(甜菊糖苷M);“Reb A 60”為甜菊苷及甜菊糖苷A分別~1:2之混合物;HTP(高通量);HPLC(高壓液相層析法); HPLC-UV(HPLC-紫外-可見光偵檢器);1H NMR(質子核磁共振光譜法);HSQC NMR(異核單量子相干光譜法(heteronuclear single quantum coherence spectroscopy) NMR);COSY NMR(同核相關光譜法(homonuclear correlation spectroscopy)NMR);Acorn(Acorn NMR, Livermore, CA);FIOPC(相較於陽性對照的倍數改進(fold improvements over positive control));Sigma及Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO);Difco(Difco實驗室,BD診斷系統,Detroit, MI); Microfluidics(Microfluidics, Westwood, MA);ChromaDex(ChromaDex, Inc., Irvine, CA); Life Technologies(Life Technologies, a part of Fisher Scientific,Waltham, MA);Amresco(Amresco, LLC, Solon, OH);Carbosynth(Carbosynth, Ltd., Berkshire, UK); Varian(Varian Medical Systems, Palo Alto, CA);Agilent(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA);以及Thermotron(Thermotron, Inc., Holland, MI)。
實施例1
具葡萄糖苷化活性的UGT酵素之合成、最佳化及檢定
於此實施例說明具葡萄糖苷化活性的UGT酵素之合成、最佳化及檢定中使用的方法。
基因合成及最佳化:
據報導會使甜菊二糖苷(steviolbioside)予以葡萄糖苷化成甜菊糖苷B以及使甜菊苷予以葡萄糖苷化成甜菊糖苷A之編碼野生型甜菊(
Stevia rebaudiana)多肽(序列辨識編號:2)的多核苷酸序列(序列辨識編號:1) (參見諸如,Richman等人,Plant J., 41:56-67 [2005]),係予以密碼子最佳化且合成為具序列辨識編號:3之基因。將此合成基因(序列辨識編號:3)選殖至pCK110900載體系統內(參見諸如,US Pat. Appln. Publn. No. 2006/0195947,其係在此併入以作為參考資料)且隨後表現於大腸桿菌W3110 (ΔfhuA)內。大腸桿菌株W3110於lac啟動子的控制下表現UGT酵素。
搖動燒瓶粉末(SFP)之生產:
使用一種搖動燒瓶程序來產生用於本文所述之生物催化方法內使用的特徵化檢定之醣基轉移酶多肽搖動燒瓶粉末(SFP)。酵素之搖動燒瓶粉末(SFP)製備物與HTP檢定中使用的細胞溶解產物相比,提供更純的酵素製備物(諸如,達到>30%的總蛋白質),且亦允許使用更濃縮的酵素溶液。含編碼感興趣的經工程處理之多肽之質體的單一菌落的大腸桿菌接種至含30 μg/ml氯黴素及1%葡萄糖的5 mL溶菌肉湯(Luria Bertani broth)內。細胞於30℃培養器內以250rpm搖動生長過夜(至少16小時)。培養物於1 L燒瓶內經稀釋至含有30 μg/ml CAM之250 mL極品肉湯(Terrific Broth) (12 g/L細菌用胰蛋白腖、24 g/L酵母萃取物、4 mL/L甘油、65 mM磷酸鉀、pH 7.0、1 mM MgS04)內達600 nm(OD600)0.2的光密度且允許於30℃下生長。
當培養物之OD600為0.6至0.8時,藉由添加IPTG達終濃度1 mM來誘導醣基轉移酶之表現。接而繼續培育過夜(至少16小時)。藉由離心(5000 rpm,15 min,4 ℃)來收穫細胞並丟棄上清液。使細胞小丸再懸浮於pH 7.5、二倍體積的25 mM三乙醇胺緩衝劑內,以及通經一MICROFLUIDIZER®高壓均質器(Microfluidics),加上標準的大腸桿菌溶解設定且維持於4 ℃。藉由離心(10,000 rpm,45分鐘,4 ℃)以移去細胞碎片。收集澄清的溶解產物上清液且於-80℃下冷凍,然後進行His-親和力純化及透析以生產純化的蛋白質或是冷凍乾燥以生產乾燥的粗製蛋白質搖動燒瓶粉末。
甜菊苷葡萄糖苷化之SFP檢定:
復原SFP以提供20 g/L的粉末。接而,50 μL的此等儲備物稀釋於200μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5,加上3 mM MgSO4及1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度),加上2 mM尿苷二磷酸葡萄糖。該反應係於一種Thermotron®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時16-18h予以執行。
HPLC-MS/MS分析:
用0.5體積/體積乙腈加上0.2% 甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。藉由LC-MS/MS及下列設備與參數來偵測上清液內的醣基化甜菊苷產物:
表1.1 甜菊糖之HPLC-MS/MS分析 | |
設備 | Agilent HPLC 1200系列,Sciex 4000 QTrap |
管柱 | Poroshell 120 EC C18 50 x 3.0 mm,2.7 μm及Poroshell 120 EC C18 5 x 3.0,2.7 μm保護管柱(Agilent Technologies, Inc.) |
移動相 | 梯度(A:0.1%甲酸配於水,B:0.1%甲酸配於甲醇) |
流率 | 0.8 mL/m |
運行時間 | 6 m |
峰滯留時間 | 甜菊糖苷A:2.35 m |
管柱溫度 | 40 ℃ |
注入體積 | 10 μL |
MS偵測 | MRM 990/828(用於甜菊醇四糖苷(steviol tetraglycosides),諸如甜菊糖苷A),1152/828(用於甜菊醇五糖苷,諸如甜菊糖苷D),1314/828(甜菊醇六糖苷,諸如甜菊糖苷M),828/666(用於甜菊醇三糖苷,諸如甜菊苷),666/504(甜菊醇二糖苷,諸如甜茶苷(rubusoside)) |
MS條件 | 模式:MRM;CUR:30;IS:4750;CAD:高;TEM:550 ℃;GS1:50;GS2:50;DP:150;EP:10;CXP:14;DT:50 ms用於每次轉換。關於前三次轉換CE:85;關於最後兩次轉換CE:60。 |
偵測序列辨識編號:4的活性。如上所述的檢定樣本之LC-MS/MS分析中觀察到高的甜菊苷轉化為甜菊糖苷A(即,>95%)。
實施例2
序列辨識編號:4之GT變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:4之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3編碼之GT(即,序列辨識編號:4)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與酵素某些結構特徵有關的位置受到致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養(plated)、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第一輪(“第1輪(Round 1)”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的12種經工程處理之GT變異體多肽。
HTP生長、表現及溶解產物製備
挑選細胞至96孔平盤且在30 ℃、200 rpm、85%濕度下於含1%葡萄糖及30 μg/mL CAM的LB培養基內生長過夜。接而,20 μL的過夜生長轉移至深孔平盤,其包含含有30 μg/mL CAM的380 μL TB生長培養基,用1 mM IPTG來誘導,以及在30 ℃、200 rpm、85%濕度下培育18 h。細胞培養物係以4 ℃、4000 rpm離心10 m,並丟棄培養基。從而獲得的細胞小丸於-80℃下冷凍,以及溶解於250 μL溶解緩衝劑(0.5 g/L溶菌酶及0.5 g/L PMBS配於20 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5)內伴隨於室溫下、在滴定板搖動器上低速搖動2 h。平盤接而以4000 rpm及4 ℃下離心20 min以及澄清的溶解產物上清液使用於以下所述之HTP檢定反應中。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊苷之HTP檢定:
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:50 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於200 μL反應以及加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)之受質裝載量,以及0.5 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,30℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時18h。用100 μL/孔乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應,於4 ℃離心10 m,且如實施例1,表1.1中所述藉由HPLC-MS/MS來分析上清液。
於野生型UGT76G1(序列辨識編號:4)及ADP-葡萄糖存在下、由甜菊苷形成甜菊糖苷A與無酵素對照無異。與序列辨識編號:4之野生型酵素相比,確定醣基轉移酶變異體多肽會由甜菊苷加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A。經工程處理之多肽列於表2.1中。雖然親本及變異體建構物含有N-末端組胺酸標籤供親和力純化,但為相對於未貼標籤的參考序列清楚起見,突變予以編號。如實施例1中所述使搖動燒瓶規模的培養物生長供用於蛋白質純化。具有表2.1內所顯示,相對於序列辨識編號:4之下列胺基酸突變之變異體係予以分析。
純化的蛋白質特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析:
表2.1 變異體及RebA位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異 (相對於序列辨識編號:4) | 增加的RebA a |
5/6 | V309R | ++ |
7/8 | R10-/V309R | ++ |
9/10 | S361G | ++ |
11/12 | V309S | ++ |
13/14 | L307V | + |
15/16 | S283T | + |
17/18 | V309L | + |
19/20 | Y278L/T284I/R311G/V339A/N360G | + |
21/22 | V309N | + |
23/24 | R262L | + |
25/26 | V339A/S361G | + |
27/28 | V344I/S361G | + |
29/30 | R262K | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.3倍;以及“++”=至少1.3倍,但小於1.6倍增加的生產。 |
首先,如實施例1中所述使250 mL搖動燒瓶培養物生長、誘導、溶解、組胺酸-親和力純化、透析,以及以甘油1:1稀釋,以生產純化的蛋白質。接而,50 μL此等蛋白質稀釋於200μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)或甜菊糖苷D(Sigma,>93%純度)及0.5 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時16h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。
表2.2 純化的第1輪變異體及RebA及RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
7/8 | R10-/V309R | +++ | + |
9/10 | S361G | ++ | - |
11/12 | V309S | ++ | + |
13/14 | L307V | ++ | - |
15/16 | S283T | +++ | - |
29/30 | R262K | - | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於1.5倍;“+”=生產至少1.5倍,但小於2.5倍;“++”=至少2.5倍,但小於3.5倍;以及“+++”=至少3.5倍增加的生產。 |
帶有突變R10-及V309R、S361G、V309S、L307V及S283T之變異體(序列辨識編號:8、10、12、14及16),以高於以上陰性對照的位準及序列辨識編號:2的位準自甜菊苷及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A。帶有突變R10-及V309R之變異體(序列辨識編號:8)及帶有突變V309S之變異體(序列辨識編號:12)以高於陰性對照及序列辨識編號:2的位準自甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。因而,此等經工程處理之ADP-醣基轉移酶酵素提供新的生物催化試劑供用於新的方法用於甜菊苷進行β-葡萄糖苷化成甜菊糖苷A,以及甜菊糖苷D進行β-葡萄糖苷化成甜菊糖苷M。帶有突變R10-及V309R之變異體(序列辨識編號:8)對於甜菊苷及甜菊糖苷D二者及作為輔受質之ADP-葡萄糖有最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:7)用於進一步的定向演化。
實施例3
序列辨識編號:8之ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:8之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:7編碼之GT(即,序列辨識編號:8)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與第1輪改良的活性有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用實施例2描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第二輪(“第2輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的20種經工程處理之GT變異體多肽。經工程處理之多肽列於表3.1中。雖然親本及變異體建構物含有N-末端組胺酸標籤供親和力純化,但為相對於未貼標籤的參考序列清楚起見,突變予以編號。如實施例1中所述使搖動燒瓶規模的培養物生長供用於蛋白質純化,關於具有如以下所示,相對於序列辨識編號:8於表3.1內所顯示的胺基酸突變之變異體,係予以分析。
純化的蛋白質的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表3.1 變異體及RebA位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:8) | 增加的RebA a |
31/32 | T283Q/T318E/W337S/S360G | +++ |
33/34 | E112S/T172S/T283Q/T318E | ++ |
35/36 | T283Q | ++ |
37/38 | T283Q/S360G | ++ |
39/40 | T283Q/L306V/R308S/S360G | + |
41/42 | S282T/T283Q/Q431E | + |
43/44 | N137K/T283Q | + |
45/46 | T318E | + |
47/48 | E112S/R261S/T318E | + |
49/50 | N137K/T283Q/Q431E | + |
51/52 | S282T/T283Q | + |
53/54 | L163K/T318E | + |
55/56 | T283Q/L306V/W337S/A426V | + |
57/58 | R261S/T283Q/W337F | + |
59/60 | E112S/S282T/T283Q/Q431E | + |
61/62 | R261S/W337S | + |
63/64 | Q431E | + |
65/66 | S360G | + |
67/68 | Q269T/T318E | + |
69/70 | R261S/T283Q/L306V/W337F | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍;“++”=至少1.5倍,但小於2倍;以及“+++”=至少2倍增加的生產。 |
蛋白質係如實施例2中所述予以純化、檢定及分析。
表3.2 純化的第2輪變異體及RebA及RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異 (相對於序列辨識編號:8) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
31/32 | T283Q/T318E/W337S/S360G | +++ | +++ |
33/34 | E112S/T172S/T283Q/T318E | + | ++ |
35/36 | T283Q | + | + |
37/38 | T283Q/S360G | + | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於3倍;以及“+++”=至少3倍增加的生產。 |
表3.2中所有的變異體(序列辨識編號:32、34、36及38)都以比序列辨識編號:8更多的量,自甜菊苷及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A以及自甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。帶有突變T283Q、T318E、W337S及S360G之變異體(序列辨識編號:32)對於甜菊苷及甜菊糖苷D二者及作為輔受質之ADP-葡萄糖有最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:31)用於進一步的定向演化。
純化的蛋白質的特徵化檢定及由NDP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷之分析
為了描繪序列辨識編號:4相對於序列辨識編號:32之核苷酸二磷酸特異性的輪廓,執行下列實驗。首先,50 μL純化的蛋白質稀釋於200μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)及0.5 mM ADP-葡萄糖、UDP-葡萄糖或TDP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時16h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。序列辨識編號:32加上ADP-葡萄糖比序列辨識編號:4生產再多13倍的甜菊糖苷A,加上UDP-葡萄糖生產90%同樣多的甜菊糖苷A,以及加上TDP-葡萄糖生產22%同樣多的甜菊糖苷A。與序列辨識編號:3編碼的醣基轉移酶(即,序列辨識編號:4)相比,序列辨識編號:31編碼的醣基轉移酶(即,序列辨識編號:32)具有實質經修飾的NDP-葡萄糖特異性。
序列辨識編號:31編碼的GT對於甜菊糖苷D及NDP-葡萄糖之比活性判定
為了描繪序列辨識編號:32之核苷酸二磷酸特異性的輪廓,執行下列實驗。首先,5 μL純化的蛋白質稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及2 mM ADP-葡萄糖、UDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖或GDP-葡萄糖的。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時1-18h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2% 甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後,藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。序列辨識編號:31編碼的醣基轉移酶(即,序列辨識編號:32),相對於ADP-葡萄糖,加上GDP-葡萄糖生產50%同樣多的甜菊糖苷M,加上UDP-葡萄糖生產70%同樣多的甜菊糖苷M,以及加上TDP-葡萄糖生產低於檢測限度的量。GT序列辨識編號:32加上甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖之比活性(所形成的RebM μmol/純化的蛋白質mg/min)比用UDP-葡萄糖之比活性更高1.4倍。因而,序列辨識編號:31編碼的醣基轉移酶(即,序列辨識編號:32)為一種新的腺嘌呤二磷酸葡萄糖依賴性醣基轉移酶,或“AGT”。
實施例4
以經工程處理之AGT序列辨識編號:32及原位形成ADP-葡萄糖進行甜菊苷轉變成甜菊糖苷A
於此實施例中,說明評估原位形成ADP-葡萄糖用於甜菊糖之葡萄糖苷化的實驗(參見,圖1)。
基因合成及最佳化
據報導會優先使用ADP-葡萄糖以在可逆轉化中捐獻一葡萄糖給果糖來形成蔗糖之編碼野生型喜溫嗜酸硫桿菌(
Acidithiobacillus caldus)蔗糖合成酶及嗜熱聚球藻(
Thermosynechococcus elongatus)蔗糖合成酶多肽(分別為序列辨識編號:72及74)的多核苷酸序列(參見諸如,Diricks等人,Appl. Microbiol. Biotechnol., 99:8465-74 [2015]及Figueroa等人,FEBS Lett., 587: 165-9 [2013]),係予以密碼子最佳化且合成為具序列辨識編號:71及73之基因。將此等合成基因(序列辨識編號:71及73)獨立選殖至pCK110900載體系統內(參見諸如,US Pat. Appln. Publn. No. 2006/0195947,其係在此併入以作為參考資料),且隨後表現於大腸桿菌W3110 (ΔfhuA)內。大腸桿菌株W3110於lac啟動子的控制下表現該等酵素。以搖動燒瓶規模使該等菌株生長並溶解供用於His-親和力蛋白質純化,其等係以如實施例1中所述方式來執行。
純化的AGT及蔗糖合成酶之偶聯檢定
為了檢查藉由偶聯一蔗糖合成酶(SuS)與序列辨識編號:31編碼之AGT(即,序列辨識編號:32)之NDP回收的潛力,執行下列實驗。首先,20 μL純化的蔗糖合成酶多肽(序列辨識編號:72或74)及30 μL純化的AGT多肽(序列辨識編號:32)稀釋於200μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、5 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)、200 mM蔗糖,以及5 mM腺苷二磷酸(ADP)、胞苷二磷酸(CDP)、鳥苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)或尿苷二磷酸(UDP) (Sigma,所有5種均>93%純度)。 反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時16h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。
上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。
在序列辨識編號:32及SuS(序列辨識編號:74)方面,以ADP、UDP及GDP形成可比較量的甜菊糖苷A,且CDP及TDP幾乎沒有形成甜菊糖苷A。在序列辨識編號:32及SuS(序列辨識編號:72)方面,以ADP形成的甜菊糖苷A位準可比得上SuS(序列辨識編號:74)加上ADP形成的甜菊糖苷A位準。以UDP形成的甜菊糖苷A的量小於以ADP形成的甜菊糖苷A量的20%,且以GT(序列辨識編號:32)及SuS(序列辨識編號:72)及CDP、GDP或TDP幾乎沒有形成甜菊糖苷A。此等結果證明序列辨識編號:72及74二者均能由蔗糖於原位產生ADP-葡萄糖且可以與AGT(序列辨識編號:32)一起利用蔗糖及ADP作為輔受質,而非更昂貴的受質ADP-葡萄糖用於甜菊糖之葡萄糖苷化。此外,序列辨識編號:72亦可與GDP及UDP一起使用。於涉及ADP-選擇性偶聯系統的一些具體例中,可以使用序列辨識編號:74。
實施例5
序列辨識編號:32之ADP-醣基轉移酶環狀排列變異體
此實施例說明用於設計、建構及評估衍生自序列辨識編號:32之GT多肽供用於甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用的實驗。序列辨識編號:31編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中N-及C-末端係於編碼序列內鏈接以及選擇與酵素某些結構特徵有關的位置作為新的蛋白質N-末端。此環狀排列變異體庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供“第3.2輪”具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的17種經工程處理之GT環狀排列變異體多肽。變異體中無一者的活性比未排列的序列辨識編號:32更高,而表5.1中列出的17種經工程處理之多肽的活性均比無酵素陰性對照更高。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊苷之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:31變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於200 μL反應以及加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)之受質裝載量,及0.5 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,30℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4h。用100 μL/孔乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應,於4 ℃離心10 m,且如實施例1,表1.1中所述藉由HPLC-MS/MS來分析上清液。
經工程處理之多肽列於表5.1中。雖然親本及變異體建構物含有N-末端組胺酸標籤供親和力純化,但為相對於未貼標籤的參考序列清楚起見,突變予以編號。帶有相對於序列辨識編號32:71、170、259及401之下列第一個胺基酸之變異體,係如實施例1中所述係以搖動燒瓶規模的培養物予以生長供用於蛋白質純化。此等變異體代表為來自蛋白質最有區別的區域之環狀排列。
純化的環狀排列GTs對於甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖之比活性判定
表5.1 環狀排列第3.2輪變異體 | |
序列辨識編號:(nt/aa) | 第一個胺基酸位置(相對於序列辨識編號:32) |
75/76 | 70 |
77/78 | 71 |
79/80 | 72 |
81/82 | 73 |
83/84 | 74 |
85/86 | 75 |
87/88 | 169 |
89/90 | 170 |
91/92 | 171 |
93/94 | 174 |
95/96 | 194 |
97/98 | 198 |
99/100 | 259 |
101/102 | 260 |
103/104 | 370 |
105/106 | 401 |
107/108 | 403 |
首先,10 μL純化的蛋白質稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及2 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時1-4h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。
上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。於4種環狀排列中,序列辨識編號:106有最高的比活性(所形成的RebM μmol/純化的蛋白質mg/min),其次是序列辨識編號:100,及序列辨識編號:90。序列辨識編號:78有幾乎檢測不到的活性。因而,序列辨識編號:105編碼的醣基轉移酶(即,序列辨識編號:106)於此等實施例中經確定為最佳候選者環狀排列AGT用於進一步的定向演化。
實施例6
序列辨識編號:32之ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:32之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:31編碼之GT(即,序列辨識編號:32)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與酵素某些結構特徵有關的位置受到致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第三輪(“第3.1輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的60種經工程處理之GT變異體多肽。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:32變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於200 μL反應以及加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之0.5 mM甜菊糖苷D或1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)之受質裝載量,以及0.5 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,30℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4h。用100 μL/孔的乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應,於4 ℃離心10 m,且如實施例1,表1.1中所述藉由HPLC-MS/MS來分析上清液。
經工程處理之多肽列於表6.1中。雖然親本及變異體建構物含有N-末端組胺酸標籤供親和力純化,但為相對於未貼標籤的參考序列清楚起見,突變予以編號。具有相對於序列辨識編號:32,表6.1內所顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例1中所述使搖動燒瓶規模的培養物生長供用於蛋白質純化。
純化的蛋白質的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表6.1 第3.1輪變異體及RebA/RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:32) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
109/110 | L84A | + | |
111/112 | L199G | + | |
113/114 | L84G | +++ | |
115/116 | M87A | + | |
117/118 | L199Q | + | |
119/120 | L199D | + | |
121/122 | I207L | + | |
123/124 | M87H | ++ | |
125/126 | I198M | + | |
127/128 | L199S | +++ | |
129/130 | H154Q | + | |
131/132 | S191R | + | |
133/134 | I198S | + | |
135/136 | L199K | +++ | |
137/138 | H154L | +++ | |
139/140 | L199A | +++ | |
141/142 | H154V | ++ | |
143/144 | I198V | + | |
145/146 | H154A | + | |
147/148 | Q22A | ++ | |
149/150 | Q22L | + | |
151/152 | Q22P | +++ | |
153/154 | S356G | +++ | |
155/156 | Q22H | + | |
157/158 | L306V | + | |
159/160 | T262G | + | |
161/162 | D169T | + | |
163/164 | G347D | + | |
165/166 | S179V | + | |
167/168 | Q159M | + | |
169/170 | I233R | + | |
171/172 | Y396R | ++ | |
173/174 | E6P | + | |
175/176 | R139P | ++ | |
177/178 | Y421V | + | |
179/180 | R261W | + | |
181/182 | L106S | ++ | |
183/184 | N137G | ++ | |
185/186 | A97S | ++ | |
187/188 | R74W | + | |
189/190 | A110S | + | |
191/192 | R261P | +++ | |
193/194 | Q159R | + | |
195/196 | N195G | + | |
197/198 | E417R | + | |
199/200 | L106T | + | |
201/202 | R427A | + | |
203/204 | F64P | + | |
205/206 | H259Q | + | |
207/208 | R261H | + | |
209/210 | E417P | + | |
211/212 | K4P | + | |
213/214 | V435Q | + | |
215/216 | L106G | + | |
217/218 | L106D | + | |
219/220 | R261A | + | |
221/222 | E417A | + | |
223/224 | E112P | + | |
225/226 | V435R | + | |
227/228 | E112A | + | |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:32之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於3倍;以及“+++”=至少3倍增加的生產。 |
首先,1 μL純化的蛋白質稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及2 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時1-30 h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。表6.2內所述甜菊苷及甜菊糖苷D之比活性係由反應進度曲線的線性部分依照所形成的產物μmol/min/純化的蛋白質mg來判定。
表6.2 第3.1輪變異體對於甜菊苷及RebD之比活性 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:32) | μmol RebA/ min-mg a | μmol RebM/ min-mg a |
113/114 | L84G | + | ++ |
123/124 | M87H | - | - |
127/128 | L199S | - | ++ |
151/152 | Q22P | + | +++ |
153/154 | S356G | + | +++ |
157/158 | L306V | - | ++ |
a增加的比活性位準係相對於序列辨識編號:32之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“ =活性小於1.5倍;“+”=活性至少1.5倍,但小於3倍;“++”=至少3倍,但小於6倍;以及“+++”=至少6倍增加的活性。 |
序列辨識編號:31編碼之GT(即,序列辨識編號:32)定向演化係藉由建構變異體基因庫來繼續進行,其中與以上改良的活性有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以上描述的高通量(HTP)檢定來篩選甜菊糖苷D以提供第3.3輪具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的59種經工程處理之GT變異體多肽。經工程處理之多肽列於表6.3中。具有相對於序列辨識編號:32,表6.3內所顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例1中所述使搖動燒瓶規模的培養物生長供用於蛋白質純化。
純化的蛋白質的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表6.3 第3.3輪變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:32) | 增加的RebM a |
229/230 | Q22P/L84G/H154L/I198S/L199A/S356G | ++++ |
231/232 | Q22P/L84G/H154L/L199A/S356G | ++++ |
233/234 | Q22P/L84G/H154L/I198S/L199S/S356G | ++++ |
235/236 | Q22P/L84V/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G | ++++ |
237/238 | Q22P/L84G/H154V/I198S/L199A/L306V/S356G | ++++ |
239/240 | Q22P/L84G/H154L/I198S/L199K/S356G | ++++ |
241/242 | Q22P/L84G/H154L/L199S/S356G | ++++ |
243/244 | Q22P/L84G/M87H/H154L/I198S/L199S/L306V/S356G | ++++ |
245/246 | Q22P/L84G/H154V/L199A/L306V/S356G | ++++ |
247/248 | Q22P/L84G/M87H/H154L/I198S/L199A/S356G | ++++ |
249/250 | Q22P/L84G/H154V/I198S/L199K/L306V/S356G | ++++ |
251/252 | Q22P/L84G/M87H/H154L/L199K/L306V/S356G | ++++ |
253/254 | Q22P/L84G/H154V/L199S/S356G | ++++ |
255/256 | Q22P/M87H/H154L/L199A/L306V/S356G | +++ |
257/258 | Q22P/L84G/M87H/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G | +++ |
259/260 | Q22P/L84G/I198S/L199K/L306V/S356G | +++ |
261/262 | Q22P/L84G/H154V/L199A/S356G | +++ |
263/264 | Q22P/H154L/I198S/L199A/I207L/L306V/S356G | +++ |
265/266 | Q22P/H154L/L199A/S356G | +++ |
267/268 | Q22P/H154L/I198S/L199A/S356G | +++ |
269/270 | Q22P/L84G/M87H/H154V/L199K/L306V/S356G | +++ |
271/272 | Q22P/M87H/H154V/I198S/L199S/I207L/L306V/S356G | +++ |
273/274 | Q22P/L84G/H154L/I207L/L306V/S356G | +++ |
275/276 | Q22P/L84G/H154L/L306V/S356G | +++ |
277/278 | Q22P/M87H/H154V/L199S/S356G | ++ |
279/280 | Q22P/M87H/L199A/S356G | ++ |
281/282 | Q22P/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G | ++ |
283/284 | Q22P/L84G/M87H/L199A/L306V/S356G | ++ |
285/286 | Q22P/M87H/H154V/L199A/I207L/S356G | ++ |
287/288 | Q22P/L84G/L199S/S356G | ++ |
289/290 | Q22P/L84G/H154L/I198S/L199A/I207L/L306V | ++ |
291/292 | Q22P/M87H/H154L/I198S/L199K/S356G | ++ |
293/294 | Q22P/L84G/M87H/I198S/L199K/S356G | ++ |
295/296 | Q22P/H154V/L199A/S356G | ++ |
297/298 | Q22P/M87H/H154V/L199K/S356G | ++ |
299/300 | Q22P/H154V/L199K/I207L/L306V/S356G | ++ |
301/302 | Q22P/L84G/I207L/S356G | ++ |
303/304 | Q22P/M87H/H154V/L199S/L306V/S356G | ++ |
305/306 | Q22P/M87H/L199K/S356G | ++ |
307/308 | Q22P/M87H/I198S/L199K/L306V/S356G | ++ |
309/310 | Q22P/M87H/H154L/P322S/S356G | ++ |
311/312 | Q22P/M87H/I198S/L199K/S356G | + |
313/314 | Q22P/L84G/H154L/L199K/I207L | + |
315/316 | Q22P/M87H/I198S/L199S/I207L/S356G | + |
317/318 | Q22P/L84G/M87H/I198S/L199A/L306V/S356G | + |
319/320 | Q22P/L84G/M87H/I198S/L199S/S356G | + |
321/322 | Q22P/L84G/M87H/I198S/L199S/L306V/S356G | + |
323/324 | Q22P/L199A/S356G | + |
325/326 | Q22P/L84G/H154L/I198S/L199A/L306V | + |
327/328 | L84G/H154L/I198S/L199K | + |
329/330 | Q22P/L84G/M87H/L199S/S356G | + |
331/332 | Q22P/L84G/M87H/H154L/S356G | + |
333/334 | Q22P/I198S/L199K/I207L/G329C/S356G | + |
335/336 | Q22P/M87H/H154V/I198S/L199K/S356G | + |
337/338 | Q22P/I198S/L199A/S356G | + |
339/340 | Q22P/M87H/I198S/L199A/L306V/S356G | + |
341/342 | Q22P/I207L/S356G | + |
343/344 | Q22P/L84G/S356G | + |
345/346 | Q22P/L84G/H154V/I198S/L199K | + |
1289/1290 b | Q22P/S356G | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:32之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於100倍;參考多肽; “+”=生產至少100倍且小於300倍;“++”=至少300倍,但小於600倍;“+++”=至少600倍,但小於900倍;以及“++++”=大於900倍增加的生產。 b不含對甜菊糖苷D轉化成甜菊糖苷M特異的多樣性;可用於作為經工程處理之生物催化劑以使甜菊苷轉化成甜菊糖苷A。 |
首先,2 μL純化的蛋白質稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及2 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時1-18 h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。
上清液內的醣基化產物於用水1:50稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。表6.4內所述之比活性係由反應進度曲線的線性部分,甜菊苷係依照所形成的甜菊糖苷A產物μmol/min/純化的蛋白質mg來判定以及甜菊糖苷D係依照所形成的甜菊糖苷M產物μmol/min/純化的蛋白質mg來判定。表6.4內列出的酵素連同0.8 g/L甜菊苷或1.3 g/L rebD、2莫耳過量的ADP-葡萄糖,及35-77 mg/L純化的蛋白質,於不到18 h內催化RebD轉化成RebM達>99%轉化以及以>85%之轉化來催化甜菊苷轉化成RebA及RebI的混合物。
實施例7
以AGT(序列辨識編號:232)進行甜菊糖苷D轉變成甜菊糖苷M
表6.4 第3.3輪變異體對於甜菊苷及RebD之比活性 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:32) | μmol RebA/ min-mg a | μmol RebM/ min-mg b |
229/230 | Q22P/L84G/H154L/I198S/L199A/S356G | + | ++ |
231/232 | Q22P/L84G/H154L/L199A/S356G | ++ | +++ |
233/234 | Q22P/L84G/H154L/I198S/L199S/S356G | ++ | ++ |
237/238 | Q22P/L84G/H154V/I198S/L199A/L306V/S356G | ++ | ++ |
243/244 | Q22P/L84G/M87H/H154L/I198S/L199S/L306V/S356G | + | + |
253/254 | Q22P/L84G/H154V/L199S/S356G | +++ | + |
a增加的比活性位準係相對於序列辨識編號:32之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少參考多肽的活性位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於4倍;以及“+++”=至少4倍增加的活性。 b增加的活性位準係相對於序列辨識編號:32之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“ =活性小於10倍;“+”=活性至少10倍,但小於15倍;“++”=至少15倍,但小於20倍;以及“+++”=至少20倍增加的活性。 |
如實施例1中所述使250 mL搖動燒瓶培養物生長用於多肽序列辨識編號:232之蛋白質純化。繼而,50%甘油儲備物2.4 mL稀釋於250-mL擋板燒瓶內的60 mL總反應體積中,其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl2、2 mM ADP-葡萄糖,及1 mM甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)。反應係於一種Innova
®搖動培養器內、以250 RPM在30 ℃下搖動歷時2 h來執行且用0.12 mL甲酸來驟冷至pH<4。反應係藉由10,000 RPM於4 ℃離心10 m來沈澱。添加6 g XAD-4樹脂(Sigma)至上清液內且於搖動燒瓶內培育歷時2 h。過濾樹脂且用16.3 mL 50:24:26 水:ACN:EtOH藉由培育4 h來沖提以及予以再過濾。用10 mL 50:50水:EtOH執行第二次沖提且與第一次沖提組合。沖提液係藉由旋轉蒸發器予以濃縮至約6 mL、過濾通過WHATMAN
®UNIPREP
®無注射器過濾器,以及藉由HPLC使用表7.1內所述的設備與參數予以分餾。於滯留時間5.8-6.2 m時從C18管柱手工收集餾分。匯集餾分、藉由旋轉蒸發器予以濃縮,以及冷凍乾燥。使樣本再懸浮於1.5 mL乙醇內且於一種攪拌板上於80 ℃培育歷時2h,藉由旋轉蒸發器予以濃縮,以及於40 ℃真空下乾燥14 h。使樣本再懸浮於吡啶-
d5內且使用於1H、COSY,及HSQC NMR光譜擷取係藉由Acorn NMR來執行。
表7.1 甜菊糖之半製備HPLC分餾 | |
設備 | Agilent HPLC 1200系列 |
管柱 | Higgins C18 250 x 10 mm, 5 μm (Higgins Analytical) |
移動相 | 等度68:32 A:B A:0.1%甲酸配於水 B:0.1%甲酸配於甲醇 |
流率 | 2.5 mL/m |
運行時間 | 10 m |
峰滯留時間 | 甜菊糖苷M 6.00 m |
管柱溫度 | 40 ℃ |
注入體積 | 100 μL |
UV偵測 | 210 nm (用於甜菊糖) 254 nm (用於有機污染物) |
單離的產物係根據其光譜與可靠的甜菊糖苷M標準品之光譜(ChromaDex,HPLC之純度95.6%)的同一性判定為甜菊糖苷M。依據
1H NMR,樣本內可交換的質子比標準品及含有少量甲基污染物的樣本內的該等更廣。除此以外,樣本及標準品之光譜為同一性的。除此少量雜質之外,樣本及標準品之COSY及HSQC光譜為同一性的。從
1H及
1H-
13C HSQC光譜明顯出現六種變旋異構質子[δ
H6.44,δ
H5.85,δ
H5.524,δ
H5.518,δ
H5.49,δ
H5.34]證實了結構內存在六種糖單元且符合標準,表示β-變旋異構組態。於C2’及C3’羥基位置處附著之糖係由糖I內相對較低的H-2’(δ
H4.54)及H-3’(δ
H5.15)化學位移支持,暗示於C-19處之2,3-支鏈-D-葡萄糖三碳糖基(2,3-branched-D-glucotriosyl)取代基(碳編號參見圖2)。峰標定係列於表7.2中且係從
1H、COSY及HSQC光譜以及與文獻相比來判定(參見諸如,Prakash等人,Nat. Prod. Comm., 11:1523-6 [2013])。
實施例8
序列辨識編號:232之ADP-醣基轉移酶變異體
表7.2 酵素生產的甜菊糖苷M配於C 5D 5N之NMR光譜. | |||
位置 | δ 13C, ppm | δ 1H, ppm | 1H多重性( J, Hz) |
1 | 40.3 | 0.77 | t(12.1) |
1 | 40.3 | 1.79 | m |
2 | 19.6 | 1.37 | m |
2 | 19.6 | 2.27 | m |
3 | 38.4 | 1.04 | m |
3 | 38.4 | 2.32 | d(13.0) |
4 | 零(Null) | ||
5 | 57.3 | 1.08 | d(13.9) |
6 | 23.5 | 2.26 | m |
6 | 23.5 | 2.44 | q(12.6) |
7 | 42.6 | 1.45 | m |
7 | 42.6 | 1.83 | m |
8 | 零 | ||
9 | 54.3 | 0.93 | d(8.49) |
10 | 零 | ||
11 | 20.2 | 1.67 | m |
11 | 20.2 | 1.79 | m |
12 | 38.5 | 1.88 | m |
12 | 38.5 | 2.78 | m |
13 | 零 | ||
14 | 43.3 | 2.05 | m |
14 | 43.3 | 2.77 | m |
15 | 46.5 | 1.9 | d(17) |
15 | 46.5 | 2.06 | m |
16 | 零 | ||
17 | 104.9 | 4.92 | s |
17 | 104.9 | 5.72 | s |
18 | 28.2 | 1.32 | s |
19 | 零 | ||
20 | 16.7 | 1.41 | s |
1' | 94.9 | 6.44 | d(8.2) |
2' | 77 | 4.55 | m |
3' | 88.7 | 5.15 | t(8.5) |
4' | 70.1 | 4.22 | m |
5' | 78.6 | 4.15 | m |
6' | 61.7 | 4.22 | m |
6' | 61.7 | 4.35 | m |
1'' | 96.3 | 5.52 | d(7.8) |
2'' | 81.5 | 4.15 | m |
3'' | 88 | 5.01 | 被水遮蔽 |
4'' | 70.3 | 4.1 | m |
5'' | 77.7 | 3.98 | m |
6'' | 62.5 | 4.23 | m |
6'' | 62.5 | 4.35 | m |
1''' | 104.7 | 5.52 | d(7.6) |
2''' | 75.8 | 4.2 | m |
3''' | 78.6 | 4.17 | m |
4''' | 73.2 | 4.01 | m |
5''' | 77.5 | 3.76 | ddd(3.1, 6.3, 9.5) |
6''' | 64 | 4.3 | m |
6''' | 64 | 4.53 | m |
1'''' | 104 | 5.49 | d(8.0) |
2'''' | 75.6 | 4 | m |
3'''' | 77.7 | 4.53 | m |
4'''' | 71.3 | 4.19 | m |
5'''' | 77.9 | 4.02 | m |
6'''' | 62.1 | 4.24 | m |
6'''' | 62.1 | 4.35 | m |
1''''' | 104.2 | 5.86 | d(7.5) |
2''''' | 75.5 | 4.24 | m |
3''''' | 78.4 | 4.24 | m |
4''''' | 73.6 | 4.14 | m |
5''''' | 77.8 | 3.94 | ddd(3.0, 6.6, 9.6) |
6''''' | 64 | 4.36 | m |
6''''' | 64 | 4.65 | d(9.1) |
1'''''' | 104.2 | 5.34 | d(8.1) |
2'''''' | 75.5 | 3.98 | m |
3'''''' | 78 | 4.4 | m |
4'''''' | 71.1 | 4.15 | m |
5'''''' | 78.1 | 3.88 | m |
6'''''' | 62 | 4.14 | m |
6'''''' | 62 | 4.35 | m |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:232之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:231編碼之GT(即,序列辨識編號:232)定向演化係藉由建構基因庫來進行,其中與第3輪改良的活性有關的表面殘基突變係予以重組。此庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第四輪(“第4輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的76種經工程處理之GT變異體多肽。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:232變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:2.5 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應以及加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之0.5 mM甜菊糖苷D(ChromaDex,>94%純度)之受質裝載量,以及0.5 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,30℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1h。藉由1:10稀釋該試料來驟冷反應然後用50 μL/孔乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應,於4 ℃離心10 m,以及以水1:10稀釋上清液且藉由如實施例1,表1.1中所述的HPLC-MS/MS來分析。
經工程處理之多肽列於表8.1中。雖然親本及變異體建構物含有N-末端組胺酸標籤供親和力純化,但為相對於未貼標籤的參考序列清楚起見,突變予以編號。帶有序列辨識編號:348、350、352、354、356、364、408及428之變異體係如實施例1中所述係以搖動燒瓶規模的培養物予以生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表8.1第4輪變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:232) | 增加的RebM a |
347/348 | L109R/S131P/R139P/S179V/R261P/Y396R/Y421V | +++ |
349/350 | L106T/L109R/R139P/G347D/E417A/Y421V/R427A | +++ |
351/352 | L109R/E112P/S179V/G204D/I233R/E417A/Y421V/R427L | +++ |
353/354 | F64P/L109R/E112P/R139P/E417A | ++ |
355/356 | L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/G204D/G347D/E417A/Y421V/R427L | ++ |
357/358 | L109R/E112P/R139P/S179V/E417R/R427A | ++ |
359/360 | F64P/L106S/R139P/S179L/I233R/E417A/R427A/Q431D | ++ |
361/362 | F64P/L106S/L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427L/Q431D | ++ |
363/364 | L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/S179L/E417A/Y421V | ++ |
365/366 | F64P/L109R/R139P/I233R/E417R/Y421V | ++ |
367/368 | L106S/E112P/Q159R/G204D/I233R/E417R/Y421V/R427A/Q431D | ++ |
369/370 | L106S/L109R/E112P/R261P/E417R/Q431D | ++ |
371/372 | L106S/E417A | ++ |
373/374 | L109R/E112P/Q159R/S179V/E417R/Y421V | ++ |
375/376 | L106T/G347D/E417R/R427A/Q431D | ++ |
377/378 | F64P/L109R/E112P/R139P/Q159R/S179L/E417R/Q431D | ++ |
379/380 | E112P/S131P/S179L/G347D/E417R/Y421V | ++ |
381/382 | F64P/L106T/E112P/Q159R/S179L/E417R/Y421V | ++ |
383/384 | F64P/L106S/L109R/E112P/E417A/Y421V/R427A/Q431D | + |
385/386 | L106S/L109R/E112P/G347D/R427A | + |
387/388 | F64P/R139P/G347D/E417R/Y421V/R427L/Q431D | + |
389/390 | F64P/L109R/Q159R/S179V/G204D/I233R/E417R/Y421V | + |
391/392 | F64P/L106T/G204D/E417A/Y421V/R427A | + |
393/394 | S179V/E417R/Y421V | + |
395/396 | F64P/L106S/E417R/Y421V | + |
397/398 | E112P/Q159R/E417R/Y421V | + |
399/400 | L109R/E112P/E417A/R427A/Q431D | + |
401/402 | L106S/E112P/I233R/E417R | + |
403/404 | L109R/E112P/I233R/E417A/Q431D | + |
405/406 | L109R/E112P/S131P/Q159R/E417R/Y421V | + |
407/408 | L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427A | + |
409/410 | L106T/R139P/Y421V | + |
411/412 | L109R/E112P/E417A/Y421V/R427L | + |
413/414 | E112P/E417R/Y421V | + |
415/416 | F64P/R139P/I233R/E417R/R427L/Q431D/K439P | + |
417/418 | L106T/E112P/Q159R/S179L/G204D/E417A/Y421V | + |
419/420 | I233R/E417R/Y421V/R427L/Q431D | + |
421/422 | L106S/I233R/Y421V/R427A | + |
423/424 | L109R/S179V/I233R/Y421V | + |
425/426 | F64P/L106T/E112P/R139P/Q159R/S179V/G204D/Y396R/E417A | + |
427/428 | L109R/G204D/E417R/Q431D | + |
429/430 | F64P/L109R/E417R/Y421V | + |
431/432 | L109R/E112P/S179V/G347D/E417R | + |
433/434 | F64P/L106S/L109R/I233R/G347D/R427A/Q431D | + |
435/436 | L106S/L109R/R139P/R427A/Q431D | + |
437/438 | L106S/R139P/Q159R/I233R/G347D/E417R/Y421V/R427A/Q431D | + |
439/440 | L106S/E112P/Y396R/E417R/Y421V | + |
441/442 | L106S/L109R/E112P/G204D/G347D/Y421V/K439P | + |
443/444 | R139P/I233R/E417A | + |
445/446 | L109R/E417R/Y421V | + |
447/448 | L109R/E417R/R427A/Q431D | + |
449/450 | L109R/S131P/G204D | + |
451/452 | G347D/E417R | + |
453/454 | L106T/L109R/R139P/E417R | + |
455/456 | L106T/L109R/I233R/R427A/Q431D | + |
457/458 | L106S/L109R/E417R/Y421V/R427L | + |
459/460 | L109R/E112P/G204D/I233R/E417R | + |
461/462 | Q159R/G347D/E417A/Y421V/Q431D | + |
463/464 | L106T/L109R | + |
465/466 | L109R/E112P/S131P/Q159R/S179V/K439P | + |
467/468 | F64P/L106S/E112P/G347D/E417A/Y421V | + |
469/470 | L109R/E112P/Q159R/E417R/R427L | + |
471/472 | L109R/E112P/G204D/R427A | + |
473/474 | F64P/L106T/L109R/E112P/S131P/S179L/E417R/R427A/Q431D | + |
475/476 | F64P/L106S/Q431D | + |
477/478 | F64P/E417R/Y421V/Q431D | + |
479/480 | L106T/L109R/R139P/I233R/E417R/Y421V | + |
481/482 | E112P/S131P/S179V/G204D/E417R/Y421V/R427L | + |
483/484 | L106T/E112P/Q159R/S179V/I233R/E417A/Y421V/R427L/K439P | + |
485/486 | F64P/L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/I233R/Y421V/R427L/Q431D | + |
487/488 | S131P/S179L/I233R/E417R/R427A | + |
489/490 | F64P/L109R/E417A/Y421V | + |
491/492 | L109R/R139P/S179L/E417R/R427L | + |
493/494 | F64P/L106T/L109R/E417A/Y421V/R427L/Q431D/K439P | + |
495/496 | E112P/R139P/S179V/G204D/I233R/G347D/R427L | + |
497/498 | L106T/S131P/S179L/I233R/Y421V/R427L/Q431D | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:232之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.6倍,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於2.4倍;以及“+++”=至少2.4倍增加的生產。 |
執行一時間過程實驗以特徵化經工程處理之第4輪變異體對於甜菊苷及甜菊糖苷D之活性。添加1 g/L的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、2.5% v/v乙醇加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及1 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30 ℃下搖動歷時0.5-2 h予以執行。藉由添加50 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:50於水內且如實施例1,表1.1內所述藉由LC-MS/MS來分析甜菊糖。所有的8種變異體對於甜菊苷及甜菊糖苷D二者都具有比序列辨識編號:232更高的活性。相對於序列辨識編號:232,該等變異體於1小時時間點自甜菊苷生產甜菊糖苷A之位準係列於表8.2中。
表8.2 第4輪變異體SFP對甜菊苷之活性 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:232) | 增加的RebA a |
355/356 | L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/G204D/G347D/E417A/Y421V/R427L | +++ |
351/352 | L109R/E112P/S179V/G204D/I233R/E417A/Y421V/R427L | ++ |
427/428 | L109R/G204D/E417R/Q431D | ++ |
347/348 | L109R/S131P/R139P/S179V/R261P/Y396R/Y421V | ++ |
363/364 | L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/S179L/E417A/Y421V | ++ |
349/350 | L106T/L109R/R139P/G347D/E417A/Y421V/R427A | + |
407/408 | L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427A | + |
353/354 | F64P/L109R/E112P/R139P/E417A | + |
a增加的生產位準係於1 h時間點相對序列辨識編號:232之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.5倍,但小於2倍; “++”=至少2倍,但小於3倍;及“+++”=至少3倍增加的生產。 |
8種經工程處理之變異體對於甜菊糖苷D的活性明顯比序列辨識編號:232的活性更高,但是其等於時間過程中沒有很好地相互區分。因而,執行一後續實驗如下:添加0.03-1 g/L劑量反應曲線的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、2.5% v/v乙醇加上1 mM甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及1 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30 ℃下搖動歷時0.5 h予以執行。藉由添加50 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:67於水內且如實施例1,表1.1內所述藉由LC-MS/MS來分析甜菊糖。第4輪變異體SFP於0.0625 g/L SFP裝載量對於甜菊糖苷D之活性係列於表8.3中。
實施例9
序列辨識編號:348之ADP-醣基轉移酶變異體
表8.3 第4輪變異體SFP對甜菊糖苷D之活性 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:232) | 增加的RebM a |
349/350 | L106T/L109R/R139P/G347D/E417A/Y421V/R427A | + |
407/408 | L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427A | - |
355/356 | L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/G204D/G347D/E417A/Y421V/R427L | - |
353/354 | F64P/L109R/E112P/R139P/E417A | + |
347/348 | L109R/S131P/R139P/S179V/R261P/Y396R/Y421V | +++ |
363/364 | L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/S179L/E417A/Y421V | - |
a增加的生產位準係以0.0625 g/L SFP及30 min、測量為µmol RebM/mg SFP-min且相對於序列辨識編號:232定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於3倍;“+++”=至少3倍,但小於4倍;以及“+++”=至少4倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:348之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:347編碼之GT(即,序列辨識編號:348)定向演化係藉由建構基因庫來進行,其中與前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組且其中從公開可得的數據庫辨識出的同源物係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第五輪(“第5輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽,6個來自基因庫5.01(表9.1)及18個來自該輪剩餘的基因庫(表9.2)。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:348變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積由前幾輪用的250 uL增加至400 uL,以及溶解產物予以稀釋10倍。關於第5.01輪,以10 μL溶解產物配於100 μL反應以及加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)之受質裝載量及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,40 ℃於一種Thermotron滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1h。藉由添加10 μL試料90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且於4 ℃離心10 m。使上清液稀釋1:10於水內且藉由如同表9.3中所述RapidFire SPE-MS/MS(Agilent)來分析。關於第5輪剩餘的庫,溶解產物稀釋4倍而非10倍、使用50 mM磷酸鉀緩衝劑pH 7來代替Tris-HCl,溫度為50 ℃,反應時間為2 h,以及甜菊苷及甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)二者都執行檢定。
經工程處理之多肽列於表9.1及表9.2中。雖然親本及變異體建構物含有N-末端組胺酸標籤供親和力純化,但為相對於未貼標籤的參考序列清楚起見,突變予以編號。序列辨識編號:500係如實施例1中所述以搖動燒瓶規模的培養物予以生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表9.1 第5.01輪變異體及RebA位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:348) | 增加的RebA a |
499/500 | L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A/Q431D | +++ |
501/502 | G204D/G347D/R396Y/E417R/Q431D | ++ |
503/504 | L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A | ++ |
505/506 | E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A/Q431D | + |
507/508 | L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R | + |
509/510 | E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:348之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準10倍,但小於20倍;“++”=至少20倍,但小於30倍;以及“+++”=至少30倍增加的生產。 |
表9.2 額外的第5輪變異體及RebA及RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異 (相對於序列辨識編號:348) | 增加的RebA a | 增加的RebM b |
511/512 | N137G/D161L/V435R | ++++ | ++++ |
513/514 | K38R/A178V/W401L | ++ | ++++ |
515/516 | R74W/R102K/N137G/D161L/H259S/K289S | ++ | + |
517/518 | I14V/L100F | ++ | ++++ |
519/520 | D290E/A351G/W401L | ++ | +++ |
521/522 | I28M/I44V/V365I/A407E | ++ | +++ |
523/524 | K185R/D290E/W401L/I422M | ++ | ++ |
525/526 | D98P/I233W | ++ | +++ |
527/528 | T54P/V413L | ++ | +++ |
529/530 | R102K/D161L/T250A/V435E | ++ | ++ |
531/532 | I92L/S118A | ++ | ++ |
533/534 | K38R/S118A/D290E/A351G/D375P/W401L/I422M | ++ | ++ |
535/536 | N137G/D169G | + | ++ |
537/538 | K38R/D290E/A351G/W401L/I422M | + | + |
539/540 | V435Q/M438A | + | ++ |
541/542 | Q159M/D169S/R173G/D300Q/Q424E/M438A | + | + |
543/544 | S118A/S156A/A178V/D290E/D375P/W401L/I422M | + | ++ |
545/546 | A110G/K222R/T250R/H259P/V435G | + | + |
a增加的RebA生產位準係相對於序列辨識編號:348之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於3倍;“++”=生產至少3倍,但小於6倍;“+++”=至少6倍,但小於9倍;以及“++++”=至少9倍增加的生產。 b增加的RebM生產位準係相對於序列辨識編號:348之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於15倍;“++”=生產至少15倍,但小於30倍;“+++”=至少30倍,但小於45倍;以及“++++”=至少45倍增加的生產。 |
表9.3 甜菊糖偵測之RapidFire SPE-MS/MS條件 Agilent RapidFire條件 | |||||||
緩衝劑A | 0.1%甲酸配於LC/MS等級水;1.5 mL/min流率 | ||||||
緩衝劑B | 0.1%甲酸配於LC/MS等級甲醇;0.5 mL/min流率 | ||||||
水清洗 | 水 | ||||||
有機清洗 | 乙腈 | ||||||
SPE匣 | Agilent RapidFire匣A(C4) | ||||||
RF狀態1 | 600 ms | ||||||
RF狀態2 | 2500 ms | ||||||
RF狀態3 | 0 | ||||||
RF狀態4 | 5000 ms | ||||||
RF狀態5 | 1000 ms | ||||||
Agilent噴射流源參數 | |||||||
乾燥氣體溫度 | 325 ℃ | ||||||
乾燥氣體流量 | 7 L/min | ||||||
霧化器壓力 | 50 psi | ||||||
鞘流氣體溫度 | 300 ℃ | ||||||
鞘流氣體流量 | 12 L/min | ||||||
毛細管電壓 | +4000 V | ||||||
噴嘴電壓 | +500 V | ||||||
Agilent 6470三段四極MRM參數 | |||||||
化合物 | Q1 | Q3 | 暫停 | 碎裂(Fragmentor) | CE | CAV | |
甜菊苷 | 827.4 | 665.3 | 50 | 150 | 50 | 5 | |
RebA | 989.5 | 827.5 | 50 | 300 | 60 | 5 | |
RebD或RebI | 1151.7 | 827.5 | 50 | 285 | 55 | 5 | |
RebM | 1313.7 | 827.5 | 50 | 350 | 70 | 5 | |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第5輪變異體序列辨識編號:500,相對於序列辨識編號:348,對於甜菊苷及甜菊糖苷D之活性。添加0.03-1 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、2.5% v/v乙醇加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及1 mM ADP-葡萄糖。反應係於40 ℃熱循環儀內歷時0.5 h予以執行,以及用50 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:67於水內且如實施例1,表1.1內所述藉由LC-MS/MS來分析甜菊糖。以1 g/L裝載量,序列辨識編號:500自如序列辨識編號:348之甜菊苷生產>1.2倍一樣多的甜菊糖苷A,以及自甜菊糖苷D生產>1.07倍一樣多的甜菊糖苷M。隨後,將序列辨識編號:499(即,500)予以再選殖以略去N-末端組胺酸標籤,以高通量表現,以及平盤以400 μL予以溶解。對所生成含有變異體序列辨識編號:548的粉末,相對於序列辨識編號:500變異體,進行檢定,其係以2.5 μL溶解產物添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM MgCl
2、2.5% v/v乙醇加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及1 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®搖動培養器內、以300 RPM在50 ℃下執行歷時4 h,且藉由添加10 μL試料至90 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且如表9.3內所述藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析甜菊糖。於此等條件下,序列辨識編號:548變異體自如序列辨識編號:500變異體之甜菊苷生產接近1.5倍多的甜菊糖苷A,以及自甜菊糖苷D生產超過1.6倍多的甜菊糖苷M。
隨後,製備含序列辨識編號:548變異體之搖動燒瓶粉末,且其相對於序列辨識編號:348變異體進行檢定。添加0.25-10 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM MgCl
2、2 mM ADP-葡萄糖,及1 g/L甜菊糖苷A 60(60%甜菊糖苷A,>35%甜菊苷)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)。反應係於一種熱循環儀內40 ℃歷時1 h予以執行,以及藉由添加10 µL試料至90 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且如實施例1,表1.1內所述藉由LC-MS/MS來分析甜菊糖。序列辨識編號:548變異體達到>65%轉化甜菊糖苷A 60成甜菊糖苷A及甜菊糖苷I的混合物及接近完全的轉化甜菊糖苷D成甜菊糖苷M。以0.25 g/L搖動燒瓶粉末裝載量,序列辨識編號:548變異體達到如序列辨識編號:348變異體之甜菊糖苷D轉化的1.4倍,以及甜菊糖苷A 60轉化的2.2倍。
AGT酵素之表現分析
六輪用於甜菊糖之β-1,3-葡萄糖苷化之經工程處理之AGT多肽係藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳來分析以判定相關蛋白質表現位準。以1x LDS裝載緩衝劑及1x還原劑(Life Technologies)來製備樣本。4-12% Bis-Tris丙烯醯胺凝膠(Life Technologies)每道裝載5 µg來自搖動燒瓶規模培養物的冷凍乾燥可溶粗製溶解產物且用MES展開緩衝液以200 V展開25 min,以及電泳帶係使用ImageJ分析軟體予以定量。相關表現位準列於表9.4中。序列辨識編號:547/548、499/500及347/348為明顯更好的表現基因及/或明顯更好折疊/更穩定的蛋白質。因而,此等基因比野生型基因生產更多的蛋白質。
實施例10
以AGT(序列辨識編號:500)進行甜菊糖苷A轉變成甜菊糖苷I
表9.4 經工程處理之AGT變異體的蛋白質位準 | |
序列辨識編號: | 增加的蛋白質 a |
548 | +++ |
500 | ++ |
348 | ++ |
232 | + |
32 | - |
8 | - |
a增加的蛋白質位準係相對於序列辨識編號:4之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少參考多肽位準的帶強度,但小於2倍;“++”=至少2倍的帶強度,但小於4倍;以及“+++”=至少4倍增加的帶強度。 |
此實施例說明等比增大使用序列辨識編號:500變異體進行甜菊糖苷A轉變成甜菊糖苷I的反應,以及甜菊糖苷I之單離與特徵化。一種10 mL總體積的反應,其含有5 g/L的序列辨識編號:500變異體冷凍乾燥搖動燒瓶粉末、50 mM磷酸鉀緩衝劑pH 7、10.3 mM氯化鎂、10 g/L甜菊糖苷A(>97%純度),及10.3 mM ADP-葡萄糖(Sigma),係於一種攪拌板上以300 RPM及35℃攪拌歷時89 h。反應開始時為透明的,以及反應結束時其為白色乳液。使試料稀釋1:10於水內,以及添加10 µL稀釋的試料至90 µL乙腈加上0.2%甲酸且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且如實施例1,表1.1內所述藉由LC-MS/MS來分析甜菊糖。此分析確認以高轉化生產甜菊糖苷I。因為其之低溶解度,甜菊糖苷I沉澱。因而,藉由移去上清液來進行單離、用最少量的水使沉澱物再懸浮,且離心。重複此清洗步驟二次,以及刮掉白色沉澱物表面上的棕色沉澱物。冷凍乾燥該材料且以Acorn NMR予以分析。使該材料溶解於吡啶-
d5內,以及用Varian Inova 500 NMR分光計來執行
1H 1-D、
13C DEPT-135、
1H-
13C HSQC NMR實驗。NMR光譜完全符合文獻報導之甜菊糖苷I(參見表10.1)。碳有編號之甜菊糖苷I的結構參見圖3。
實施例11
序列辨識編號:548之ADP-醣基轉移酶變異體
表10.1 甜菊糖苷I之NMR特徵化 | |||
位置 | δ 13C, ppm a | δ 1H, ppm | 1H多重性( J,Hz) |
1 | 40.4 | 0.73 | t(13.4) |
1 | 40.4 | 1.74 | m |
2 | 19.1 | 1.42 | m |
2 | 19.1 | 2.18 | m |
3 | 38.2 | 1.02 | M |
3 | 38.2 | 2.35 | m |
4 | - | - | |
5 | 57 | 1.03 | m |
6 | 21.9 | 1.88 | m |
6 | 21.9 | 2.32 | m |
7 | 41.5 | 1.29 | m |
7 | 41.5 | 1.31 | m |
8 | - | - | |
9 | 53.9 | 0.88 | d(7.2) |
10 | - | - | |
11 | 20.3 | 1.69 | m |
11 | 20.3 | 1.7 | m |
12 | 37 | 1.97 | m |
12 | 37 | 2.27 | m |
13 | - | - | |
14 | 44.1 | 1.79 | m |
14 | 44.1 | 2.59 | d(11.9) |
15 | 47.4 | 2.05 | Brs |
16 | - | - | |
17 | 104.5 | 5.02 | s |
17 | 104.5 | 5.66 | s |
18 | 28.1 | 1.22 | s |
19 | - | - | |
20 | 15.4 | 1.27 | s |
1' | 95 | 6.14 | d(8.2) |
2' | 72.3 | 4.17 | m |
3' | 89.4 | 4.25 | m |
4' | 69 | 4.23 | m |
5' | 77.8 | 3.91 | m |
6' | 61.4 | 4.33 | m |
6' | 61.4 | 4.25 | m |
1'' | 97.8 | 5.05 | d(7.8) |
2'' | 80.4 | 4.32 | m |
3'' | 87.5 | 4.17 | m |
4'' | 69.9 | 3.95 | m |
5'' | 77.3 | 3.79 | m |
6'' | 62.3 | 4.16 | m |
6'' | 62.3 | 4.49 | m |
1''' | 104.4 | 5.55 | d(7.7) |
2''' | 76 | 4.18 | m |
3''' | 78.3 | 4.26或4.23 | m |
4''' | 71.9 | 4.22 | m |
5''' | 78.5 | 3.92 | m |
6''' | 62.9 | 4.39 | m |
6''' | 62.9 | 4.51 | m |
1'''' | 104.5 | 5.35 | d(7.9) |
2'''' | 75.1或75.3 | 4.03 | m |
3'''' | 78.3 | 4.26 | m |
4'''' | 71.2或71.4 | 4.12 | m |
5'''' | 78.3 | 4.11 | m |
6'''' | 62.1 | 4.24 | m |
6'''' | 62.1 | 4.56 | m |
1''''' | 104.8 | 5.26 | d(7.9) |
2''''' | 75.1或75.3 | 4.03 | M |
3''''' | 78.3 | 4.26或4.23 | M |
4''''' | 71.2或71.4 | 4.12 | M |
5''''' | 78.3 | 4 | M |
6''''' | 62.2 | 4.24 | M |
6''''' | 62.2 | 4.54 | M |
a乾燥材料係於一種Varian Inova 500 NMR儀器上、藉由 1H、DEPT-135及HSQC配於吡啶- d5來特徵化。光譜係與文獻光譜(參見諸如,Prakash等人,Molecules, 19(11): 17345-55 [2014])相比俾以標定峰。 13C訊號來自DEPT-135。一些峰位移太近不能判斷標定;當此發生時列出兩個選項。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:548之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:547編碼之GT(即,序列辨識編號:548)定向演化係藉由建構基因庫來進行,其中與前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組。此庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第六輪(“第6輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的66種經工程處理之GT變異體多肽(表11.1)。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:548變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 uL,且溶解產物稀釋4倍。以10 μL溶解產物配於100 μL反應且加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)之受質裝載量,及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,50 ℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4h。藉由添加10 μL試料90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且於4 ℃離心10 m。使上清液稀釋1:10於水內且如同表9.3中所述藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析。前84種變異體係使用1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)、1 mM甜菊糖苷A(>97%純度)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)、以相同條件再測試。生成的經工程處理之GT變異體多肽列於表11.1中。具有序列辨識編號:554、562、568及576之變異體係如實施例1中所述係以搖動燒瓶規模的培養物予以生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表11.1 第6輪變異體及RebA、RebI及RebM位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:548) | 增加的RebA a | 增加的RebI a | 增加的RebM a |
549/550 | I28M/R74W/D161L/D290E/V365I | +++ | +++ | + |
551/552 | I28M/I44V/I92L/D161L/K222R/D300Q/V413L | +++ | + | + |
553/554 | I28M/R74W/S156A/D161L/V365I/A407E | +++ | ++ | + |
555/556 | I28M/R74W/S156A/Q159M/D161L/A178V/D300Q/V365I/V435Q/M438A | +++ | + | + |
557/558 | I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/Q159M/D161L/I233W/A351G/I422M | +++ | + | + |
559/560 | I14V/R74W/D161L/D375P/W401L | +++ | - | + |
561/562 | I14V/I28M/K38R/R74W/L100F/R102K/S118A/D161L/D169G/A178V/I233W/T250R/A407E/I422M/M438A | +++ | + | + |
563/564 | I28M/K38R/I92L/D98P/L100F/R102K/S156A/D161L | +++ | + | + |
565/566 | I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/Q159M/D161L/D169S/I233W | +++ | - | + |
567/568 | I28M/I44V/S118A/S156A/D161L/K222R/K289S/V435Q/M438A | +++ | + | - |
569/570 | I28M/I92L/L100F/R102K/A110G/D161L/K185R/T250A/D300Q/D375P/V435Q | +++ | - | + |
571/572 | I14V/I28M/I44V/D161L/D169S | +++ | + | + |
573/574 | I28M/S156A/D161L/I233W/H259S/D300Q/V435R | +++ | ++ | + |
575/576 | I14V/I28M/T54P/D161L/K185R/V413L | +++ | ++ | + |
577/578 | I14V/I28M/K38R/L100F/R102K/A110G/Q159M/D161L/I233W/H259S/D290E/D300Q/A351G/V435Q | ++ | + | + |
579/580 | I28M/S156A/D161L/K185R/V435R/M438A | ++ | ++ | + |
581/582 | I28M/I92L/D98P/L100F/A110G/S156A/D161L/W401L | ++ | - | - |
583/584 | I28M/D98P/L100F/R102K/D161L/K185R/A351G/W401L/V435E/M438A | ++ | - | + |
585/586 | I14V/I28M/L100F/N137G/S156A/D161L/K222R/H259S/K289S/V365I/W401L/V435R/M438A | ++ | + | + |
587/588 | I14V/I28M/I92L/L100F/D161L/K222R/I233W/K289S/D300Q | ++ | - | + |
589/590 | R102K/N137G/Q159M/D161L/I422M/Q424E | ++ | - | + |
591/592 | I14V/I28M/L100F/S156A/D161L/T250R | ++ | + | + |
593/594 | I14V/I28M/R74W/D98P/L100F/R102K/D161L/R173G/A178V/I233W/T250A/H259S/D290E/A407E | ++ | - | - |
595/596 | I14V/I28M/K38R/A110G/N137G/D161L/K222R/K289S/W401L | ++ | - | - |
597/598 | I28M/T54P/I92L/Q159M/D161L/D290E | ++ | + | + |
599/600 | I14V/I28M/I44V/R74W/D98P/R102K/N137G/Q159M/D161L/K185R/K222R/T250A | ++ | - | - |
601/602 | I14V/I28M/R102K/S118A/N137G/D161L/K185R/K222R/T250R/H259P/W401L | ++ | - | + |
603/604 | Q159M/D161L/K222R/D290E/D375P/A407E | ++ | - | + |
605/606 | I14V/A110G/S156A/D161L/D375P/W401L/V435E/M438A | ++ | - | + |
607/608 | I14V/I92L/D98P/L100F/Q159M/D161L/H259P/V365I/I422M/Q424E/V435R | ++ | - | + |
609/610 | K38R/D161L/D300Q/M438A | ++ | - | + |
611/612 | R74W/S156A/D161L/R173G/A178V/Q424E/V435E | ++ | - | - |
613/614 | R74W/D98P/L100F/R102K/S118A/S156A/Q159M/D161L/V435E/M438A | ++ | - | - |
615/616 | I14V/Q159M/D161L/V365I/V435E/M438A | ++ | - | - |
617/618 | N137G/Q159M/D161L/K185R/D300Q/A351G/V365I/V435Q | ++ | - | - |
619/620 | I14V/R74W/A110G/Q159M/D161L/D169G/R173G/T250A/H259P/D290E/D375P/A407E/I422M | ++ | - | - |
621/622 | I14V/D161L/K222R/T250R/H259S/K289S/D375P/W401L/V413L | ++ | - | - |
623/624 | Q159M/D161L/W401L | ++ | - | - |
625/626 | I44V/R74W/L100F/R102K/D161L/I233W/V365I/V435G/M438A | ++ | - | - |
627/628 | I14V/D161L/D300Q | + | - | - |
629/630 | I28M/I44V/R74W/W401L | + | + | - |
631/632 | I14V/D161L/K222R/T250R/V435Q/M438A | + | - | - |
633/634 | R74W/D98P/L100F/R102K/A110G/S118A/D161L/A178V/T250R/K289S/D290E/D300Q/V435E/M438A | + | - | - |
635/636 | S156A/Q159M/D161L/D169S | + | - | - |
637/638 | I14V/K38R/L100F/R102K/D161L/R173G/A178V/K222R/T250R/D375P/W401L/V413L | + | - | - |
639/640 | D98P/L100F/S156A/Q159M/D161L/A178V/H259S/K289S/D290E/A351G/I422M | + | - | - |
641/642 | I14V/K38R/R74W/A110G/S156A/D161L/R173G/A178V/K222R/D300Q | + | - | - |
643/644 | D98P/L100F/S118A/Q159M/D161L/D300Q | + | - | - |
645/646 | I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/I422M/Q424E/V435Q | + | +++ | + |
647/648 | I14V/I28M/Q159M/V365I/V435Q | + | +++ | + |
649/650 | I28M/I92L/S118A/Q159M/K222R/T250R/H259P/D300Q/A407E | + | + | + |
651/652 | D161L/H259S/K289S/V435R/M438A | + | - | - |
653/654 | I28M | + | ++ | + |
655/656 | I28M/T54P/Q159M/D290E/M438A | + | ++ | + |
657/658 | I14V/I28M/Q159M/K289S/D290E/D300Q | + | ++ | + |
659/660 | I28M/I44V/K289S/D290E/A351G/I422M | + | +++ | + |
661/662 | I28M/I44V/V435R/M438A | + | ++ | + |
663/664 | I14V/I28M/I44V/I92L | + | ++ | + |
665/666 | I14V/I28M/A351G | + | ++ | + |
667/668 | I28M/I44V/D98P/L100F/R102K/S118A | + | ++ | + |
669/670 | I14V/I28M/I44V/D375P | + | + | + |
671/672 | I14V/I28M/T54P/V365I | + | +++ | + |
673/674 | I14V/I28M/K38R/R74W/R102K/S156A/Q159M/I233W/T250A/K289S/V413L/I422M/Q424E/V435R/M438A | + | ++ | + |
675/676 | R74W/D375P/V435G | + | - | - |
677/678 | S118A | + | + | - |
679/680 | I28M/T54P/T250R/K439N | - | ++ | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:548之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍;“++”=至少1.5倍,但小於2倍;以及“+++”=至少2倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第6輪變異體對於甜菊苷及甜菊糖苷D之活性。添加0.03-1 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM MgCl
2、2.5% v/v乙醇加上1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)及1 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron滴定板搖動器內、以300 RPM在50 ℃下執行歷時1 h,且用150 µL水稀釋反應然後藉由轉移12.5 µL至87.5 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:20於水內且如實施例9,表9.3內所述藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析甜菊糖。酵素之相對生產力列於表11.2內。
實施例12
序列辨識編號:562之ADP-醣基轉移酶變異體
表11.2 第6輪變異體SFP對甜菊苷及甜菊糖苷D之活性 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:548) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
576 | I14V/I28M/T54P/D161L/K185R/V413L | +++ | ++ |
568 | I28M/I44V/S118A/S156A/D161L/K222R/K289S/V435Q/M438A | +++ | ++ |
554 | I28M/R74W/S156A/D161L/V365I/A407E | ++++ | + |
562 | I14V/I28M/K38R/R74W/L100F/R102K/S118A/D161L/D169G/A178V/I233W/T250R/A407E/I422M/M438A | ++ | ++ |
a增加的活性位準係以0.0625 g/L SFP及 60 min、以µmol RebA或RebM/mg SFP-min、測量為相對於序列辨識編號:548的倍數變化且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少參考多肽的活性位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於3倍;“+++”=至少3倍,但小於4倍;以及“++++”=至少4倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:562之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:561編碼之GT(即,序列辨識編號:562)定向演化係藉由建構基因庫來進行,其中與前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組。此庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第七輪(“第7輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的37種經工程處理之GT變異體多肽(表12.1)。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:562變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 uL,以及溶解產物稀釋4倍。以10 μL溶解產物配於100 μL反應以及加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)之受質裝載量,及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,50 ℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1h。藉由添加10 μL試料90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且於4 ℃離心10 m。使上清液稀釋1:10於水內且如同表9.3中所述藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析。前84種變異體係使用1 mM甜菊苷(ChromaDex,>94%純度)、1 mM甜菊糖苷A(>97%純度)或甜菊糖苷D(ChromaDex,>93%純度)、以相同條件再測試。生成的經工程處理之GT變異體多肽列於表12.1中。
實施例13
具葡萄糖苷化活性的醣基轉移酶酵素之合成、最佳化及檢定
表12.1 第7輪變異體及RebA、RebI及RebM位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:562) | 增加的RebA a | 增加的RebI b | 增加的RebM b |
681/682 | I75L/M87W/A110G/N137G/G169S/S191R/A199K/K208A/Q209G/K289S/V435Q | +++ | - | - |
683/684 | M87W/G169S/S191R/A199K/I207L/Q209G/W401L/V413L | +++ | - | - |
685/686 | I44V/M87W/N137G/Q159M/G169S/S191R/A199K/K208D | +++ | - | - |
687/688 | I44V/M87W/A199K/K208A | +++ | - | - |
689/690 | M87W/I92L/Q159M/S191R/A199K/K208A/Q209G/K289S/D290E | +++ | - | - |
691/692 | N137G/I198M/A199K/I207L/K208D/A426V/V435R | ++ | ++ | + |
693/694 | I75L/S76R/M87W/S191R/Q197R/A199K/Q209G/D300Q | ++ | - | - |
695/696 | I75L/S76R/M87W/S191R | ++ | ++ | + |
697/698 | V19L/I75L/S76R/M87W/I92L/A199K/I207L/K208A | ++ | - | - |
699/700 | N137G/A199K/K208A/Q209G/D290E/V435R | ++ | - | - |
701/702 | G169S/Q197R/A199K/I207L/Q209G/K222R/D300Q/V413L/V435R | ++ | - | - |
703/704 | G169S/S191R/Q197R/A199K/I207L/K208D | ++ | - | - |
705/706 | I75L/A110G/Q197R/A199K/K208A/D290E/D300Q/W401L/V413L | ++ | - | - |
707/708 | I92L/N137G/S191R/A199K/Q209G | ++ | - | - |
709/710 | M87W/I92L/A110G/G169S/A199K/I207L/Q209G/D290E/D300Q | ++ | - | - |
711/712 | S76R/I92L/A199K/Q209G | + | - | - |
713/714 | M87W/N137G/V435R | + | ++++ | + |
715/716 | I44V/S76R/Q197R/A199K/K208D/A351G | + | - | - |
717/718 | I75L/M87W/D300Q | + | +++ | + |
719/720 | V19L/I44V/A110G/S191R/I198M/A199K/K208A/D300Q/V365I | + | - | + |
721/722 | I44V/M87W/I92L/N137G/Q159M/A199K/Q209G | + | - | - |
723/724 | I75L/S76R/M87W/I92L/D290E/D300Q | + | ++ | - |
725/726 | M87W/S191R/I198M/A199K/K222R/P244L/K289S/D300Q/V435R | + | - | - |
727/728 | M87W/I92L/K208A/W401L | + | + | - |
729/730 | Q197R/I198M/A199K/K208D/Q209G | + | - | - |
731/732 | M87W/I92L/Q159M/G169S/S191R/I198M/D290E/V413L/V435Q | + | - | - |
733/734 | S191R/I207L/K208A/K289S/D290E/V413L/V435Q | + | + | ++ |
735/736 | N137G/V365I | + | ++ | + |
737/738 | V19L/M87W/I92L/S191R/A199K/Q209G/V413L/V435Q | + | - | - |
739/740 | I75L/S76R/M87W/I92L | + | - | - |
741/742 | I75L/M87W/I92L/G169S/I207L/K208A/D300Q/V413L/V435Q | + | + | - |
743/744 | I44V/M87W/N137G/S191R/Q197R/Q209G/K289S/W401L | + | - | - |
745/746 | I92L/Q197R/A199K/I207L/K208D/W401L | + | - | - |
747/748 | I75L/M87W/A110G/S191R/Q197R/I198M/I207L/K208D/K289S/D290E/D300Q/W401L/V413L | + | - | - |
749/750 | Q159M/Q197R/A199K/I207L/Q209G | + | - | - |
751/752 | M87L/I92L/Q197R/I198M/A199K/K208D/D300Q | + | - | - |
753/754 | M87W/V435R | + | - | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:562之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準; “+”=生產至少參考多肽的位準,但小於3倍;“++”=至少3倍,但小於5倍;以及“+++”=至少5倍增加的生產。 b增加的生產位準係相對於序列辨識編號:562之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準; “+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍;“++”=至少1.5倍,但小於2倍;“+++”=至少2倍,但小於2.5倍;以及“++++”=至少2.5倍增加的生產。 |
於此實施例中,說明具葡萄糖苷化活性的UGT酵素之合成、最佳化及檢定中使用的方法。
基因合成及最佳化
編碼來自日本稻(
Oryza sativa Japonica)、馬鈴薯(
Solanum tuberosum)、寧夏枸杞(
Lycium barbarum)及蕃茄(
Solanum lycopersicum)的醣基轉移酶之多核苷酸序列係予以密碼子最佳化且合成為具序列辨識編號:755、757、759、761、763、765及767之基因。將此等合成基因選殖至pCK110900載體系統內(參見諸如,US Pat. Appln. Publn. No. 2006/0195947,其係在此併入以作為參考資料)且隨後表現於大腸桿菌W3110 (ΔfhuA)內。大腸桿菌株W3110於lac啟動子的控制下表現UGT酵素。
搖動燒瓶粉末(SFP)之生產
使用一種搖動燒瓶程序來產生用於本文所述之生物催化方法內使用的特徵化檢定之醣基轉移酶多肽搖動燒瓶粉末(SFP)。酵素之搖動燒瓶粉末(SFP)製備物與HTP檢定中使用的細胞溶解產物相比,提供更純的酵素製備物(諸如,達到>30%的總蛋白質),且亦允許使用更濃縮的酵素溶液。含編碼感興趣的經工程處理之多肽之質體的單一菌落的大腸桿菌接種至含30 μg/ml氯黴素及1%葡萄糖的5 mL溶菌肉湯(Luria Bertani broth)內。細胞於30℃培養器內以250rpm搖動生長過夜(至少16小時)。培養物於1 L燒瓶內經稀釋至含有30 μg/ml CAM之250 mL極品肉湯(12 g/L細菌用胰蛋白腖、24 g/L酵母萃取物、4 mL/L甘油、65 mM磷酸鉀、pH 7.0、1 mM MgSO
4)內達600 nm(OD600)0.2的光密度且允許於30℃下生長。
當培養物之OD600為0.6至0.8時,藉由添加IPTG達終濃度1 mM來誘導醣基轉移酶之表現。接而繼續培育過夜(至少16小時)。藉由離心(5000 rpm,15 min,4 ℃)來收穫細胞並丟棄上清液。使細胞小丸再懸浮於pH 7.5、二倍體積的25 mM三乙醇胺緩衝劑內,以及通經一MICROFLUIDIZER®高壓均質器(Microfluidics),加上標準的大腸桿菌溶解設定且維持於4 ℃。藉由離心(10,000 rpm,45分鐘,4 ℃)以移去細胞碎片。收集澄清的溶解產物上清液且於-80℃下冷凍,然後進行His-親和力純化及透析以生產純化的蛋白質或是冷凍乾燥以生產乾燥的粗製蛋白質搖動燒瓶粉末。
以純化的蛋白質進行之甜菊糖苷A的葡萄糖苷化檢定
首先,50 μL純化的蛋白質稀釋於50 mM Tris-HCl緩衝劑pH 7.5、3 mM氯化鎂、1 mM甜菊糖苷A,及0.5 mM尿苷二磷酸葡萄糖組成的200μL總反應體積內。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時18h予以執行。使用煮沸的酵素反應作為陰性對照。用90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷10μL的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化甜菊糖苷A產物係如實施例1,表1.1內所述藉由LC-MS/MS予以偵測。
序列辨識編號:756、758、762及768偵測到自甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D。一些酵素亦生產甜菊糖苷D之區域選擇異構物(regioisomer),很可能為6-鏈接的分子甜菊糖苷D2。儘管可溶性表現很差,但序列辨識編號:758展現出高的比活性及對於在甜菊糖受質內生產β-1,2-葡萄糖鍵結之良好的選擇性。
以搖動燒瓶粉末進行甜菊糖苷A葡萄糖苷化之檢定
冷凍乾燥的搖動燒瓶粉末復原成20 mg/mL。接而,10 μL的此等儲備物稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀(KPhos)緩衝劑、pH 7,加上3 mM MgCl
2、1 mM甜菊糖苷A(>97%純度),及2 mM尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在40 ℃下搖動歷時16-18h予以執行。序列辨識編號:758偵測到超過陰性對照的活性。於LC-MS/MS分析中觀察到很少甜菊糖苷A轉化成甜菊糖苷D(即,<10%)。
實施例14
序列辨識編號:758之GT變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:758之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:757編碼之GT(即,序列辨識編號:758)定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行,其中與酵素表面殘基有關的位置受到致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第一輪(“第1輪”)具有對於甜菊糖之β-1,2-葡萄糖基轉移酶活性的10種經工程處理之GT變異體多肽。
HTP生長、表現及溶解產物製備
挑選細胞至96孔平盤且在30 ℃、200 rpm、85%濕度下於含1%葡萄糖及30 μg/mL CAM的LB肉湯內生長過夜。接而,20 μL的過夜生長轉移至一深孔平盤,其包含含有30 μg/mL CAM的380 μL TB生長培養基,用1 mM IPTG來誘導,以及在30 ℃、200 rpm、85%濕度下培育18 h。細胞培養物係以4 ℃、4000 rpm離心10 m,並丟棄培養基。從而獲得的細胞小丸於-80℃下冷凍,以及溶解於250 μL溶解緩衝劑(0.5 g/L溶菌酶及0.5 g/L PMBS配於20 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5)內伴隨於室溫下、在滴定板搖動器上低速搖動2 h。平盤接而以4000 rpm及4 ℃離心20 min以及澄清的溶解產物上清液使用於以下所述之HTP檢定反應中。
甜菊糖苷A葡萄糖苷化之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:757變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應以及加上配於50%乙醇來自20 mM儲備物溶液之1 mM甜菊糖苷A(Sigma,>96%純度)之受質裝載量,及0.5 mM UDP-葡萄糖(Sigma,>98%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,30℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4h。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由4℃離心10 m來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:20稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。辨識出自甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D的量比序列辨識編號:758更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表14.1中。搖動燒瓶規模的培養物係如實施例1中所述予以生長供用於冷凍乾燥粉末之生產用於帶有相對於序列辨識編號:758,表14.1中顯示的下列胺基酸突變之變異體分析。
搖動燒瓶溶解產物的特徵化檢定及甜菊糖苷A葡萄糖苷化之分析
表14.1第1輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:758) | 增加的RebD a |
769/770 | R69H/Y173N/V243A/M383V/T399A | +++ |
771/772 | Y173H/P175S/N191D/M365I/M383V/T399A | +++ |
773/774 | I56T/N191D/L354I/M383V/T399A | +++ |
775/776 | R69H/Y173N/P175S/V243A/M246K/L354I/M365I/M383V/T399A | +++ |
777/778 | F70L/N225G/I413V | ++ |
779/780 | F70L/N225G/E247G | ++ |
781/782 | F70L/N225G/M246P/E409K/I413V | ++ |
783/784 | F70L/Q115S/N225G/E409K | ++ |
785/786 | H74T/K310D/G396E/N424S | ++ |
787/788 | H74T/G396E | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於3倍;“++”=至少3倍,但小於5倍;以及“+++”=至少5倍增加的生產。 |
首先,使250 mL搖動燒瓶培養物生長、誘導及溶解。如實施例1中所述藉由離心移去細胞碎片,以及收集澄清的溶解產物上清液。繼而,10 μL的溶解產物稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5、3 mM MgCl
2、1 mM甜菊糖苷A(Sigma,>96%純度),及2 mM UDP-葡萄糖(Sigma,>98%純度)的。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時0-18h予以執行。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷如上所述的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:20稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。
表14.2 第1輪變異體之搖動燒瓶特徵化及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:758) | 增加的RebD a |
769/770 | R69H/Y173N/V243A/M383V/T399A | + |
771/772 | Y173H/P175S/N191D/M365I/M383V/T399A | + |
777/778 | F70L/N225G/I413V | - |
779/780 | F70L/N225G/E247G | - |
785/786 | H74T/K310D/G396E/N424S | - |
787/788 | H74T/G396E | - |
a增加的生產位準係相對於4 h時序列辨識編號:758之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;及“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍增加的生產。 |
相應於序列辨識編號:770及772的變異體自甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D的量,比序列辨識編號:758的變異體更多。序列辨識編號:770之變異體對於RebA展現出最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:769)用於進一步的定向演化。
實施例15
序列辨識編號:770之ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:770變異體之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:769編碼之GT(即,序列辨識編號:770)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行。基因庫與實施例14中辨識出的有利突變(第1輪)重組,組合併入來自公開可得的數據庫之同源物多樣性,或是酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第二輪(“第2輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。10種經工程處理之變異體係自重組的有利突變辨識出(表15.1),19種自飽和致突變作用辨識出(表15.2),以及53種自表面殘基及同源物多樣性辨識出(表15.3)。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖苷A之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:769變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應以及加上1 mM甜菊糖苷A(Sigma,>96%純度)之受質裝載量以及4 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,30℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時18h。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由4℃離心10 m來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。辨識出自甜菊糖苷A加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的量比序列辨識編號:770更多之醣基轉移酶變異體多肽。來自重組的有利突變之經工程處理之多肽係列於表15.1中。來自飽和致突變庫之經工程處理之多肽係列於表15.2中。
甜菊糖苷A之葡萄糖苷化的HTP檢定
表15.1 組合的第2輪AGT變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:770) | 增加的RebD a |
789/790 | Y24E/S28N/F262Y/C264S | ++++ |
791/792 | Y24E/S28N/F262Y/C264S/K423E | +++ |
793/794 | S28N/F262Y/C264S | +++ |
795/796 | F262Y/C264S | ++ |
797/798 | C264S/I291V | + |
799/800 | Y24E/C264S/A294V | + |
801/802 | S28N | + |
803/804 | S28N/K423E | + |
805/806 | Y24E/S28N/F262Y | + |
807/808 | Y24E/S28N | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:770之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.2倍,但小於3倍;“++”=至少3倍,但小於6倍;“+++”=至少6倍,但小於9倍;以及“++++”=至少9倍增加的生產。 |
表15.2 飽和致突變第2輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:770) | 增加的RebD a |
809/810 | Y24V | ++++ |
811/812 | C264A | ++++ |
813/814 | Y24L | +++ |
815/816 | S28L | ++ |
817/818 | Y269S | ++ |
819/820 | H366Q | ++ |
821/822 | H366T | ++ |
823/824 | S28G | + |
825/826 | N32C | + |
827/828 | K325G | + |
829/830 | Y269W | + |
831/832 | N32S | + |
833/834 | M351L | + |
835/836 | H366L | + |
837/838 | N32R | + |
839/840 | C264G | + |
841/842 | K325H | + |
843/844 | F341V | + |
845/846 | S28K | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:770之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於3倍;“+++”=至少3倍,但小於4倍;以及 “++++”=至少4倍增加的生產。 |
剩餘的第2輪組合庫篩選如下:於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:769變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應或加上10 μL 4倍稀釋的溶解產物配於100 μL反應,加上1 mM甜菊糖苷A(Sigma,>96%純度)之受質裝載量及1 mM UDP-葡萄糖(Sigma,>98%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,40℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1-2h。用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應或用90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷10μL的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:100或1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。辨識出自甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D的量比序列辨識編號:770更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽係列於表15.3中。
甜菊糖苷I之葡萄糖苷化的HTP檢定
表15.3 額外的組合第2輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:770) | 增加的RebD a |
847/848 | I56T/F70L/N191D/M246K/L354I/M365I | +++ |
849/850 | H69Q/F70L/N191D/M246K/L354I/M365I | +++ |
851/852 | P175S/M246K/L354I | +++ |
853/854 | P175S | +++ |
855/856 | I56T/F70L/P175S/M246K/L354I | ++ |
857/858 | I56T/H69Q/P175S/N191D/M246K/L354I | ++ |
859/860 | I56T/F70L/P175S/N191D/L354I/M365I | ++ |
861/862 | I56T/F70L/N191D/L354I | ++ |
863/864 | P175S/N191D | ++ |
865/866 | P175S/L354I | ++ |
867/868 | I56T/H69Q/F70L/M246K/L354I | ++ |
869/870 | F70L/N191D/M246K/L354I/M365I | ++ |
871/872 | I56T/H69Q/F70L/P175S/L354I | ++ |
873/874 | P175S/M246K/L354I/M365I | ++ |
875/876 | P175S/N191D/M246K/L354I/M365I | ++ |
877/878 | H69Q/P175S/N191D/M246K/L354I | ++ |
879/880 | P175S/N191D/L354I | ++ |
881/882 | F70L/P175S/N191D/M246K/L354I/M365I | ++ |
883/884 | H69Q/F70L/L354I/M365I | ++ |
885/886 | I56T/H69Q/M246K/L354I | ++ |
887/888 | H69Q/P175S/L354I | + |
889/890 | I56T/H69Q/F70L/N191D/M246K/L354I/M365I | + |
891/892 | I56T/H69Q/F70L/P175S/N191D/M246K/L354I | + |
893/894 | I56T/P175S/M246K | + |
895/896 | I56T/P175S/L354I/M365I | + |
897/898 | I56T/H69Q/P175S/M246K/L354I | + |
899/900 | I56T/N191D/M246K/L354I | + |
901/902 | L354I/M365I | + |
903/904 | M246K/L354I | + |
905/906 | I56T/P175S/L354I | + |
907/908 | I56T/F70L/P175S/M246K/M365I | + |
909/910 | I56T/M246K | + |
911/912 | I56T/H69Q/M246K/M365I | + |
913/914 | I126F/C220L | + |
915/916 | I56T/H69Q/P175S/M246K/L354I/M365I | + |
917/918 | I126F/K403R | + |
919/920 | I56T/M246K/L354I/M365I | + |
921/922 | I56T/L354I | + |
923/924 | F70L/N191D/M246K/M365I | + |
925/926 | H69Q/L354I | + |
927/928 | I56T/H69Q/F70L/P175S/N191D/M246K | + |
929/930 | H69Q/M246K/L354I/M365I | + |
931/932 | I126F | + |
933/934 | H69Q | + |
935/936 | H69Q/F70L/P175S/N191D/M246K/L354I/M365I | + |
937/938 | P175S/N191D/L354I/M365I | + |
939/940 | F70L | + |
941/942 | N191D/M246K/L354I | + |
943/944 | F70L/P175S/N191D/L354I/M365I | + |
945/946 | I56T/F70L/P175S/N191D/M246K/L354I | + |
947/948 | H69Q/F70L/M246K | + |
949/950 | L354I | + |
951/952 | I56T/F70L/P175S/N191D/M246K | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:770之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.5倍,但小於3倍;“++”=至少3倍,但小於4.5倍;以及“+++”=至少4.5倍增加的生產。 |
來自第2輪飽和致突變庫的88種變異體篩選如下:於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:769變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應加上1 mM甜菊糖苷I(如實施例10中所述製備自甜菊糖苷A)之受質裝載量以及1 mM UDP-葡萄糖(Sigma,>98%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,40℃於一種Thermotron滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時66 h。藉由添加10 μL的反應至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如表15.5內所述的設備與參數予以偵測。辨識出自甜菊糖苷I生產甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:770更多之醣基轉移酶變異體多肽。前兩名經工程處理之多肽為序列辨識編號:1292及1294,其相對於序列辨識編號:770分別具有突變F156R及G199H。
搖動燒瓶規模的培養物係如實施例1中所述予以生長用於生產SFP供用於表15.4中顯示的胺基酸突變之變異體(相對於序列辨識編號:770)分析。
SFP的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
復原搖動燒瓶粉末以提供20 g/L的粉末。接而,10 μL的此等儲備物稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM Tris-HCl緩衝劑、pH 7.5,加上3 mM MgCl
2、1 mM甜菊糖苷A(Sigma,>96%純度),及4 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在30℃下搖動歷時0-19h予以執行。反應係如實施例14內所述予以驟冷及沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:100稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。
表15.4 第2輪變異體之搖動燒瓶粉末特徵化及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:770) | 增加的RebD a |
789/790 | Y24E/S28N/F262Y/C264S | +++ |
791/792 | Y24E/S28N/F262Y/C264S/K423E | +++ |
793/794 | S28N/F262Y/C264S | ++ |
795/796 | F262Y/C264S | ++ |
a增加的生產位準係於0.5 h時相對序列辨識編號:770之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於5倍;“++”=至少5倍,但小於10倍;以及“+++”=至少10倍增加的生產。 |
表15.4中所有的變異體(即,序列辨識編號:790、792、794及796的變異體)自甜菊糖苷A加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的量,比序列辨識編號:770更多。因而,此等經工程處理之ADP-醣基轉移酶酵素提供新的生物催化試劑供用於甜菊糖苷A進行β-葡萄糖苷化成甜菊糖苷D。於此等實驗中,序列辨識編號:792的變異體,對於甜菊糖苷A及作為輔受質之ADP-葡萄糖具有最高的起始活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:791)用於進一步的定向演化。
實施例16
序列辨識編號:792之ADP-醣基轉移酶變異體
表15.5 甜菊糖之HPLC-MS/MS分析 | |
設備 | Agilent HPLC 1200系列,Sciex 4000 QTrap |
管柱 | Poroshell 120 EC C18 50 x 3.0 mm,2.7 μm及Poroshell 120 EC C18 5 x 3.0,2.7 μm保護管柱(Agilent Technologies, Inc.) |
移動相 | 梯度(A:0.1%甲酸配於水,B:0.1%甲酸配於甲醇) |
流率 | 0.8 mL/m |
運行時間 | 9.2 m |
峰滯留時間 | 甜菊糖苷M:4.37 m 甜菊糖苷I:6.70 m 其他葡萄糖苷化的甜菊糖苷I產物:4.8 m 二級葡萄糖苷化的甜菊糖苷I產物:6.7 m |
管柱溫度 | 40 ℃ |
注入體積 | 10 μL |
MS偵測 | MRM 990/828(用於甜菊醇四糖苷,諸如甜菊糖苷A),1152/828(用於甜菊醇五糖苷,諸如甜菊糖苷D),1314/828(甜菊醇六糖苷,諸如甜菊糖苷M),828/666(用於甜菊醇三糖苷,諸如甜菊苷),666/504(甜菊醇二糖苷,諸如甜茶苷) |
MS條件 | 模式:MRM;CUR:30;IS:4750;CAD:高;TEM:550 ℃;GS1:50;GS2:50;DP:150;EP:10;CXP:14;DT:50 ms用於每次轉換。關於前三次轉換CE:85;關於最後兩次轉換CE:60。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:792之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:791編碼之GT(即,序列辨識編號:792)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與以上前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第三輪(“第3輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖苷A之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:792變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應以及加上1 mM甜菊糖苷A(>97%純度)之受質裝載量及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM KPhos緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,40℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時5-6 h。繼而,用90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷10μL的反應、以4 ℃離心10 m,且上清液係如實施例9,表9.3內所述藉由RapidFire-MS/MS來分析。辨識出自甜菊糖苷A加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的量比序列辨識編號:792更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表16.1中。搖動燒瓶規模的培養物係如實施例1中所述予以生長供用於SFP生產用於表16.1中顯示、相對於序列辨識編號:792的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表16.1 第3輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:792) | 增加的RebD a |
953/954 | F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/L354I/H366Q/E423K | ++++ |
955/956 | F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/H366Q/E423K | ++++ |
957/958 | F70L/I126F/N191D/M246K/L354I/H366Q | +++ |
959/960 | F70L/I126F/P175S/N191D/M246K/K325H/L354I/H366Q | +++ |
961/962 | F70L/I126F/M246K/L354I/H366Q | +++ |
963/964 | F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/L354I/E423K | +++ |
965/966 | F70L/I126F/M246K/P330Q/H366Q | +++ |
967/968 | F70L/I126F/P175S/K325H/P330Q/M351L/L354I/H366Q | +++ |
969/970 | E24L/N32S/Y269S/A382G/I385V/D389E/L402I/I406M | ++ |
971/972 | E24L/N32S/P330Q | ++ |
973/974 | E24L/N32S/S264A/Y269S/P330Q/L402V/K403R | ++ |
975/976 | E24L/N32S/S264A/P330Q | ++ |
977/978 | I126F/T211E/T260V/E423K | ++ |
979/980 | I126F/C220L/T260V | ++ |
981/982 | E24L/N32S/Y269S/K403R | ++ |
983/984 | E24L/N32S/Y269S | ++ |
985/986 | I126F/C220L/I316V | ++ |
987/988 | E24L/N32S/S264A/Y269S/A382G/K403R/I406M | ++ |
989/990 | C220L/T260V/E423K | ++ |
991/992 | I126F/T211E/C220L/G253D/I316V/I342L | ++ |
993/994 | I126F/T211E/C220L/D275Q/V279L/L323V | ++ |
995/996 | C220L/T260V | + |
997/998 | I56V/C220L/T260V/E423K | + |
999/1000 | E24L/S264A/Y269S/D389E/L402V/I406M | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:792之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準之1.4倍,但小於2.8倍;“++”=至少2.8倍,但小於4.2倍;“+++”=至少4.2倍,但小於5.6倍;以及“++++”=至少5.6倍增加的生產。 |
復原搖動燒瓶粉末以提供20 g/L的粉末。接而,10 μL的此等儲備物稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM KPhos緩衝劑、pH 7,加上3 mM MgCl
2、1 mM甜菊糖苷A(Sigma,>97%純度),及2 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)。
反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在40℃下搖動歷時0-21h予以執行。反應係如以上所述予以驟冷及沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例1,表1.1內所述的設備與參數予以偵測。
表16.2 第3輪變異體之搖動燒瓶粉末特徵化及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異 (相對於序列辨識編號:792) | 增加的RebD a |
953/954 | F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/L354I/H366Q/E423K | +++ |
955/956 | F70L/I126F/N191D/M246K/K325H/M351L/H366Q/E423K | ++ |
989/990 | C220L/T260V/E423K | +++ |
a增加的生產位準係於2 h時相對序列辨識編號:792之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=生產至少2倍,但小於3倍;以及“+++”=至少3倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表16.2中所有的變異體(即,序列辨識編號:954、956及990)自甜菊糖苷A及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的量,都比序列辨識編號:792更多。於此等實驗中序列辨識編號:954之變異體對於甜菊糖苷A及作為輔受質之ADP-葡萄糖有最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:953)用於進一步的定向演化。
實施例17
序列辨識編號:954的ADP-醣基轉移酶變異體之甜菊糖葡萄糖苷化,包括甜菊糖苷I進行葡萄糖苷化成甜菊糖苷M
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:954之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:953編碼之GT(即,序列辨識編號:954)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與以上前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第四輪(“第4輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖苷A之HTP檢定
細胞係如實施例13中所述用400 µL溶解緩衝劑予以溶解。於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:954變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:20 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應以及加上1 mM甜菊糖苷A(>97%純度)之受質裝載量及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM KPhos緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,40℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。反應係如實施例16內所述予以驟冷,且上清液係如實施例9,表9.3內所述藉由RapidFire-MS/MS來分析。辨識出自甜菊糖苷A加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的量比序列辨識編號:954更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表17.1中。搖動燒瓶規模的培養物係如實施例1中所述予以生長供用於SFP生產用於表17.1中顯示的下列胺基酸突變之變異體(相對於序列辨識編號:954)之分析。
SFP的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表17.1 第4輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:954) | 增加的RebD a |
1001/1002 | P175S/T211E/S264A/V279L/I316V/L323V | ++++ |
1003/1004 | T211E/I385V/D389E | ++++ |
1005/1006 | I56V/T211E/S264A/I316V/D389E | +++ |
1007/1008 | I56V/P175S/A197P/G253D/I385V/D389E | +++ |
1009/1010 | A197P/T211E/L402I | +++ |
1011/1012 | T211E/L402I/K403R | +++ |
1013/1014 | P175S/T211E/V279L/L323V/P330Q/L402I/K403R/I406M | ++ |
1015/1016 | P175S/A197P/T211E/S264A/P330Q | ++ |
1017/1018 | P175S/T211E/L323V/A382G/L402I/K403R/I406M | ++ |
1019/1020 | P175S/T211E/K403R/I406M | ++ |
1021/1022 | I56V/P175S/A197P/T211E/P330Q/A382G/I385V | + |
1023/1024 | P175S/S264A/L323V/P330Q | + |
1025/1026 | A197P/V279L/L323V | + |
1027/1028 | N162R/C220L/W226V/N367W | + |
1029/1030 | I56V/S264A/I385V/D389E | + |
1031/1032 | E24L/N32S/F126A/E198P/M201G/N367W | + |
1033/1034 | I56V/T211E/V279L/L323V/P330Q/L402I | + |
1035/1036 | N32S/H97G/E198P/Q202G/W226V/T260V | + |
1037/1038 | E24L/N32S/E198P/M201G/W226V | + |
1039/1040 | I56V/P175S/S264A/A382G/I385V/D389E/L402V/I406M | + |
1041/1042 | E198P/M201G/N367W | + |
1043/1044 | E24L/N32S/L146A/W226V | + |
1045/1046 | D389E | + |
1047/1048 | M201G/Q202G/N367W | + |
1049/1050 | T211E/A382G/I406M | + |
1051/1052 | E24L/N32S/E198P/M201G/C220L/W226V | + |
1053/1054 | H97G/Q202G/N367W | + |
1055/1056 | E24L/H97G/T260V/N367W | + |
1057/1058 | P175S/S264A/I316V/L323V/P330Q/K403R/I406M | + |
1059/1060 | A197P/T211E/I316V/I342L/I406M | + |
1061/1062 | N32S/Q202G/N367W | + |
1063/1064 | A197P/T211E/I316V/A382G/D389E/L402I/K403R | + |
1065/1066 | N32S/W226V/N367W | + |
1067/1068 | I56V/T211E/G253D/I316V/L323V | + |
1069/1070 | E24L/N32S/F126A/E198P/Q202G/C220L/W226V/T260V/Y269S | + |
1071/1072 | E198P/Q202G/C220L/Y269S/N367W | + |
1073/1074 | P175S/S264A/I316V/D389E/L402V/ | + |
1075/1076 | E24L/N32S/H97G/N162R/Q202G | + |
1077/1078 | I56V/A197P/S264A/V279L/P330Q/A382G/D389E/L402V/K403R/I406M | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:954之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.3倍,但小於2.6倍;“++”=至少2.6倍,但小於3.9倍;“+++”=至少3.9倍,但小於5.2倍;以及“++++”=至少5.2倍增加的生產。 |
復原搖動燒瓶粉末以提供50 g/L的粉末。接而,1 μL的此等儲備物稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM KPhos緩衝劑、pH 7,加上3 mM MgCl
2、1 mM甜菊糖苷A(>97%純度),及2 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在40℃下搖動歷時2 h予以執行。反應繼而以水稀釋1:5,以及25 μL稀釋的反應藉由75 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由RapidFire-MS/MS、加上如實施例9,表9.3內所述設備與參數予以偵測。
表17.2 第4輪變異體之搖動燒瓶粉末特徵化及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:954) | 增加的RebD a |
1053/1054 | H97G;Q202G/N367W | +++ |
1031/1032 | E24L/N32S/F126A/E198P/M201G/N367W | +++ |
1027/1028 | N162R/C220L/W226V/N367W | ++ |
1051/1052 | E24L/N32S/E198P/M201G/C220L/W226V | ++ |
1057/1058 | P175S/S264A/I316V/L323V/P330Q/K403R/I406M | ++ |
1013/1014 | P175S/T211E/V279L/L323V/P330Q/L402I/K403R/I406M | + |
1001/1002 | P175S/T211E/S264A/V279L/I316V/L323V | + |
1029/1030 | I56V/S264A/I385V/D389E | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:954之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍;“++”=至少1.5倍,但小於2倍;以及“+++”=至少2倍增加的生產。 |
於此等實驗中,除了序列辨識編號:1030,表17.2中所有其他的變異體(序列辨識編號:1054、1032、1028、1052、1058、1014及1002)自甜菊糖苷A及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的量,都比序列辨識編號:954更多。於此等實驗中帶有突變H97G、Q202G及N367W的變異體(序列辨識編號:1054),相對於序列辨識編號:954,對於甜菊糖苷A及作為輔受質之ADP-葡萄糖有最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:1053)用於進一步的定向演化。
SFP的特徵化檢定及由UDP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷I之分析
復原搖動燒瓶粉末以提供50 g/L的粉末。接而,2 μL的此等儲備物稀釋於100μL總反應體積內其具有50 mM KPhos緩衝劑、pH 7,加上3 mM MgCl
2、1 mM甜菊糖苷A(>97%純度),及2 mM UDP-葡萄糖(Sigma,>98%純度)。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在40℃下搖動歷時20 h予以執行。繼而用0.5體積/體積乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:20稀釋後藉由LC-MS/MS、加上如實施例15,表15.5內所述的設備與參數予以偵測。
表17.3 第4輪變異體之搖動燒瓶粉末特徵化及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:954) | 增加的RebM a |
1001/1002 | P175S/T211E/S264A/V279L/I316V/L323V | ++ |
1013/1032 | E24L/N32S/F126A/E198P/M201G/N367W | + |
1057/1058 | P175S/S264A/I316V/L323V/P330Q/K403R/I406M | + |
1013/1014 | P175S/T211E/V279L/L323V/P330Q/L402I/K403R/I406M | - |
1020/1030 | I56V/S264A/I385V/D389E | - |
1051/1052 | E24L/N32S/E198P/M201G/C220L/W226V | - |
1053/1054 | H97G/Q202G/N367W | - |
1027/1028 | N162R/C220L/W226V/N367W | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:954之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.2倍;以及“++”=至少1.2倍增加的生產。 |
序列辨識編號:954及表17.3中全部的變異體(序列辨識編號:1054、1032、1028、1052、1014、1002及1030)以高於陰性對照的位準,自甜菊糖苷I及UDP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。序列辨識編號:1002、1032及1058以等於或高於序列辨識編號:954的位準自甜菊糖苷I及UDP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。帶有突變P175S、T211E、S264A、V279L、I316V及L323V之變異體(序列辨識編號:1002),相對於序列辨識編號:954,對於甜菊糖苷I及作為輔受質之UDP-葡萄糖有最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:1001)用於進一步的定向演化供轉變(transformation)甜菊糖苷I成甜菊糖苷M。
實施例18
序列辨識編號:74之蔗糖合成酶變異體
此實施例說明用於改良由蔗糖及ADP生產ADP-葡萄糖、衍生自序列辨識編號:73之蔗糖合成酶(SuS)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:73編碼之SuS(即,序列辨識編號:74)定向演化係藉由建構基因庫來進行,其中與酵素某些結構特徵有關的位置受到致突變作用且來自公開可得的數據庫之同源物多樣性係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第一輪(“第1輪(Round 1)”)具有對於合成ADP-葡萄糖之改良活性的37種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:73變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應以及加上配於水來自60%儲備物溶液之30% w/v蔗糖(Sigma)之受質裝載量及2 mM ADP(Sigma,>95%)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM Tris-HCl緩衝劑,pH 7.5,3 mM MgCl
2,30℃於一種熱循環儀內歷時2 h。於95℃歷時10分鐘來熱驟冷反應,然後藉由自文獻改編的比色D-果糖去氫酶檢定來分析(參見諸如,Ameyama等人,J. Bacteriol., 145:814-823 [1981];及Ameyama, Meth. Enzymol., 89:20-29 [1982])。簡言之,於具有20 µL樣本的96孔平盤上執行一種過夜酵素偶聯檢定,稀釋以使果糖濃度<1 g/L、20 µL 100 mM鐵氰化鉀(SigmaP-8131),及160 µL 0.8單位/mL果糖去氫酶(SigmaF4892)溶解於pH 4.6 McIlvaine緩衝劑加上0.1%曲拉通(Triton)X-100。此反應定量轉化果糖成K
4Fe(CN)
6,其繼而予以比色定量其係藉由添加67 µL過夜反應至33 µL終止溶液(0.3% w/v十二基硫酸鈉,SigmaL-4509,8.1% v/v磷酸,SigmaP-6560,及0.5% w/v硫酸鐵,SigmaF-1135)以及搖動20分鐘以允許完全轉化K
4Fe(CN)
6成普魯士藍,於一平盤讀數器上以690 nm波長讀取吸光度。
初級檢定後,具有較高的果糖,且因而比序列辨識編號:74更高的化學計量ADP-葡萄糖,形成活性之84種經工程處理之蔗糖合成酶(SuS)變異體多肽係以較低的受質裝載量2% w/v蔗糖(Sigma)及1 mM ADP(Sigma,>95%)之輔受質裝載量予以三重複篩選。經工程處理之多肽列於表18.1中。
實施例19
序列辨識編號:1080之蔗糖合成酶變異體
表18.1 第1輪SUS變異體及果糖位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:74) | 增加的果糖 a |
1079/1080 | A4E/Y33Q/L47H/A52D/V343H/F532S | +++ |
1081/1082 | A4E/L47H/A52D/F532S | +++ |
1083/1084 | A4E/I113Q/F532S | ++ |
1085/1086 | V343S/F532S | ++ |
1087/1088 | R615L/A789D | ++ |
1089/1090 | Q7T | ++ |
1091/1092 | R722Y | ++ |
1093/1094 | R615E | ++ |
1095/1096 | A4E/L9T/Q349H/F532S | ++ |
1097/1098 | A4E/V343H | ++ |
1099/1100 | A4E/P13R/I113Q | ++ |
1101/1102 | R221H | ++ |
1103/1104 | A4E/P13R/I113Q/V343H/F532S | + |
1105/1106 | A4E/P13R/F532S | + |
1107/1108 | R44K | + |
1109/1110 | A4E/P13R/I113Q/F532S | + |
1111/1112 | A4E/Y33Q/I113Q | + |
1113/1114 | V695L | + |
1115/1116 | Q8M | + |
1117/1118 | G117D/R440T | + |
1119/1120 | R440T | + |
1121/1122 | H788E | + |
1123/1124 | R478T | + |
1125/1126 | R611V | + |
1127/1128 | R615T | + |
1129/1130 | Q95S | + |
1131/1132 | F532R | + |
1133/1134 | Q444K | + |
1135/1136 | R440P | + |
1137/1138 | R478V | + |
1139/1140 | R615C | + |
1141/1142 | F532T | + |
1143/1144 | Q444T | + |
1145/1146 | R136S | + |
1147/1148 | R583Q | + |
1149/1150 | R615V | + |
1151/1152 | R221A | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:74之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍;“++”=至少1.5倍,但小於2.5倍;以及“+++”=至少2.5倍增加的生產。 |
藉由建構與以上改良的活性有關的突變重組之變異體基因庫以及與額外同源物多樣性重組的變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:1079編碼之SuS(即,序列辨識編號:1080)定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用實施例18中所述較低的受質裝載量之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第二輪(“第2輪”)具有生產ADP-葡萄糖之活性的34種經工程處理之SuS變異體多肽。
初級篩選後,於相同條件及下列修飾下,42種變異體係以二重複再測試以及56種變異體係以三重複再測試:50 mM Tris-HCl pH 7.5改成50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7且溫度增加至50℃。實施例18中所述之果糖去氫酶檢定係使用來定量果糖生產作為化學計量ADP-葡萄糖之替代物。生成的經工程處理之多肽列於表19.1中。具有表19.1內所顯示的胺基酸突變之變異體(相對於序列辨識編號:1080)係如實施例1中所述以搖動燒瓶規模的培養物生長供用於蛋白質特徵化。
SuS搖動燒瓶粉末的特徵化以及藉由SuS自蔗糖及ADP生產的ADP-葡萄糖進行的甜菊糖苷A之葡萄糖苷化之偶聯檢定
表19.1 第2輪SuS變異體及果糖位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1080) | 增加的果糖 a |
1153/1154 | R136S/R440P/Q444T/R478T/G603S | ++ |
1155/1156 | V68A/R129E/S248A/I595V/V600I/I756V | ++ |
1157/1158 | I113L/A225E/R266N/R415K | ++ |
1159/1160 | V68A/R129E/S248A | ++ |
1161/1162 | M75V/A105E/R154H/I215F/I264V/A345T | ++ |
1163/1164 | A225E/I372V/E534H | ++ |
1165/1166 | R85V/I170L/A225E/R266N/E534H | ++ |
1167/1168 | Q95S/Q444T/R478V/G603S/M792S | ++ |
1169/1170 | H47L/R221H | ++ |
1171/1172 | I87E/T125E/N230D/I267V/W375Y/I464F/T708A | ++ |
1173/1174 | R440P/Q444T/R583Q/K724H/H788E | + |
1175/1176 | Q95S/R478T/K724H | + |
1177/1178 | R266N | + |
1179/1180 | R136S/R440T/Q444T/R478V/R583Q/H788E | + |
1181/1182 | R440T/R478V | + |
1183/1184 | R306L/P358E/N703Y/Q776E | + |
1185/1186 | R136S/Q444T/R478V/R583Q/H788E/M792S | + |
1187/1188 | L98V/S250D | + |
1189/1190 | Q95S/R440T/R478V/K724H/H788E/M792S | + |
1191/1192 | Q95S/Q201E/R478V/R583Q/K724H/H788E | + |
1193/1194 | R93V/D477K/A635S | + |
1195/1196 | M75V/A105E/A345T/T410S/Q769R | + |
1197/1198 | M75V/A105E/P530L | + |
1199/1200 | M75V/A345T/P530L | + |
1201/1202 | Q8M/R221H | + |
1203/1204 | V466I | + |
1205/1206 | Q95S/R136S/H788E | + |
1207/1208 | P358E/L636Q/V737I | + |
1209/1210 | R93V/R129E/S506P/R550H/I595V/A719C/I756V | + |
1211/1212 | V68A/G189R/I272L/V316I/D477K/A719C/I756V | + |
1213/1214 | V126L/V314L/N499H/D549E/G589E/R755G | + |
1215/1216 | Q95S/Q444T/R478V/K724H/H788E | + |
1217/1218 | Q95S/R385L/R478V/R583Q/H788E | + |
1219/1220 | V68A/D146N/S248A/V387I/S506P/R550H | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1080之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.2倍;以及“++”=至少1.2倍增加的生產。 |
首先,復原SuS冷凍乾燥的搖動燒瓶粉末於水中且添加範圍自0.025-1 g/L終濃度的蛋白質於總反應體積內。反應條件如下:50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM MgCl
2、加上1 mM甜菊糖苷A(Sigma,>97%純度)、10 mM蔗糖(Sigma),及1 mM ADP(Sigma)。為了催化由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A所添加的GT為2 g/L終濃度之序列辨識編號:548配於100 μL總反應體積。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1 h予以執行。藉由添加10 μL的試料至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷以上所述的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上如實施例9,表9.3內所述的設備與參數予以偵測。偶聯搖動燒瓶粉末檢定中自甜菊糖苷A生產的甜菊糖苷I之相對位準係列於表19.2中。
實施例20
序列辨識編號:1158之蔗糖合成酶變異體
表19.2 偶聯檢定內第2輪搖動燒瓶粉末特徵化 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1080) | RebI位準 a |
1161/1162 | M75V/A105E/R154H/I215F/I264V/A345T | ++ |
1153/1154 | R136S/R440P/Q444T/R478T/G603S | + |
1165/1166 | R85V/I170L/A225E/R266N/E534H | + |
1157/1158 | I113L/A225E/R266N/R415K | + |
1163/1164 | A225E/I372V/E534H | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1080之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於0.8倍;“+”=生產至少0.8倍,但小於1.2倍;以及“++”=至少1.2倍增加的生產。 |
藉由建構與以上改良的活性有關的突變重組之變異體基因庫來繼續序列辨識編號:1157編碼之SuS(即,序列辨識編號:1158)定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第三輪(“第3輪”)具有生產ADP-葡萄糖之活性的34種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列高通量(HTP)酵素偶聯檢定來篩選基因庫:10 μL SuS溶解產物及2 g/L GT序列辨識編號:548配於100 μL反應體積加上1 mM甜菊糖苷A(>97%純度)之受質裝載量以及1 mM ADP(Sigma,>95%)及10 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1 h。藉由添加10 μL的試料至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷以上所述的反應且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上如實施例9,表9.3內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,顯示出與GT對於甜菊糖苷A偶聯的活性之56種經工程處理之SuS變異體係以相同條件及減少2.5倍的溶解產物裝載量以三重複再測試。生成的經工程處理之多肽列於表20.1中。
帶有表20.1中顯示的胺基酸突變之變異體(相對於序列辨識編號:1158)係如實施例1中所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
SuS搖動燒瓶粉末的特徵化以及藉由SuS自蔗糖及ADP生產的ADP-葡萄糖進行的甜菊糖苷A之葡萄糖苷化之偶聯檢定
表20.1 第3輪變異體及RebI位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1158) | RebI位準 a |
1221/1222 | R85V/I87E/A105E/I215F/I267V/I756V | ++++ |
1223/1224 | H47L/R85V/T125E/I372V/R583Q/A635S/I756V | ++++ |
1225/1226 | H47L/R85V/I87E/R154H/I756V | ++++ |
1227/1228 | R85V/I87E/R129E/W375Y/I756V/Q776E | +++ |
1229/1230 | V68A/R93V/L98V/R136S/S248A/S250D/P358E/R440P/E534H/K724H | +++ |
1231/1232 | H47L/R85V/I87E/A105E/T125E/A635S | +++ |
1233/1234 | H47L/R129E/I170L/A635S | +++ |
1235/1236 | Q8M/R136S/S248A/R478V/H788E | +++ |
1237/1238 | H47L/R85V/A105E/R129E/Q201E/N230D/I267V/R583Q | ++ |
1239/1240 | H47L/M75V/R85V/A105E/T125E/R129E/I170L/A635S | ++ |
1241/1242 | M75V/R85V/R129E/R154H/I264V/W375Y | ++ |
1243/1244 | I87E/T125E/R129E/I170L/N230D/I756V | ++ |
1245/1246 | H47L/M75V/R85V/I264V/I267V/I372V/K415R/A635S | ++ |
1247/1248 | H47L/R85V/I170L/I756V | ++ |
1249/1250 | Q8M/Q95S/L98V/R440P/R478V/E534H/V600I/H788E | ++ |
1251/1252 | Q8M/V68A/L98V/R221H/S248A/S250D/R440P/D477K/E534H/I595V/K724H | ++ |
1253/1254 | Q8M/V68A/Q95S/L98V/P358E/R478T/I595V/K724H/M792S | ++ |
1255/1256 | Q95S/R440P/Q444T/K724H/H788E | ++ |
1257/1258 | I87E/R154H/R306L/W375Y/I756V | ++ |
1259/1260 | I170L/I264V/I267V | ++ |
1261/1262 | M75V/R85V/I87E/A105E/I264V/I267V/R583Q/T708A | ++ |
1263/1264 | Q8M/R93V/Q95S/L98V/R136S/R221H/I595V/V600I/H788E | ++ |
1265/1266 | V68A/R93V/Q95S/P358E/R440T/Q444T/R478V/E534H/I595V/G603S | ++ |
1267/1268 | H47L/R154H/I372V/W375Y/R583Q/A635S/T708A/I756V | ++ |
1269/1270 | H47L/M75V/R85V/A105E/W375Y/I756V/Q776E | ++ |
1271/1272 | R129E/I215F/I372V/I756V | ++ |
1273/1274 | V68A/R93V/Q95S/Q444T/H788E | ++ |
1275/1276 | H47L/M75V/R85V/I87E/I170L/I372V/I756V | ++ |
1277/1278 | Q8M/R93V/Q95S/L113I/S250D/R440T/I595V/V600I/K724H/H788E | + |
1279/1280 | H47L/M75V/R85V/I87E/R129E/W375Y/Q776E | + |
1281/1282 | R93V/Q95S/L98V/E534H/M792S | + |
1283/1284 | Q8M/V68A/H788E | + |
1285/1286 | H47L/T125E/R129E/W375Y/I756V/Q776E | + |
1287/1288 | R85V/T125E/I215F/W375Y/K415R/A635S/Q776E | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1158之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍;“++”=生產至少1.5倍,但小於2倍;“+++”=生產至少2倍,但小於2.5倍;以及“++++”=至少2.5倍增加的生產。 |
首先,復原SuS冷凍乾燥的搖動燒瓶粉末於水中且添加範圍自0.025-5 g/L終濃度的蛋白質於總反應體積內。反應條件如下:50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM MgCl
2、加上1 g/L甜菊糖苷D、10 mM蔗糖(Sigma),及1 mM ADP(Sigma)。為了催化由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A所添加的GT為1 g/L終濃度之序列辨識編號:561/562配於100 μL總反應體積。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1 h予以執行。藉由添加10 μL的試料至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷以上所述的反應且藉由離心來沈澱。上清液內的醣基化產物於用水1:10稀釋後藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上如實施例9,表9.3內所述的設備與參數予以偵測。偶聯搖動燒瓶粉末檢定內自甜菊糖苷D生產的甜菊糖苷M之相對位準係列於表20.2中。
SuS酵素之表現分析
表20.2 偶聯檢定內第3輪搖動燒瓶粉末特徵化 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1158) | RebM位準 a |
1225/1226 | H47L/R85V/I87E/R154H/I756V | ++ |
1221/1222 | R85V/I87E/A105E/I215F/I267V/I756V | ++ |
1229/1230 | V68A/R93V/L98V/R136S/S248A/S250D/P358E/R440P/E534H/K724H | + |
1227/1228 | R85V/I87E/R129E/W375Y/I756V/Q776E | + |
1223/1224 | H47L/R85V/T125E/I372V/R583Q/A635S/I756V | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1158之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.7倍;以及“++”=至少1.7倍增加的生產。 |
用於以蔗糖進行ADP回收的三輪經工程處理之SuS多肽係藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳來分析以判定相對蛋白質表現位準。以1x LDS裝載緩衝劑及1x還原劑(Life Technologies)來製備樣本。4-12% Bis-Tris丙烯醯胺凝膠(Life Technologies)每道裝載5 µg來自搖動燒瓶規模培養物的冷凍乾燥可溶粗製溶解產物且用MES展開緩衝液以200 V展開25 min,以及電泳帶係使用ImageJ分析軟體予以定量。相對表現位準列於表20.3中。序列辨識編號:1079/1080、1157/1158及1221/1222為明顯更好的表現基因及/或明顯更好折疊/更穩定的蛋白質。此等比野生型基因生產更多的蛋白質。
實施例21
以AGT及ACSuS轉變甜菊苷成甜菊糖苷A
表20.3 經工程處理之SuS變異體的蛋白質位準 | |
序列辨識編號:(nt/aa) | 增加的蛋白質 a |
1079/1080 | +++ |
1157/1158 | ++ |
1221/1222 | ++ |
a增加的蛋白質位準係相對於序列辨識編號:74之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少參考多肽位準的帶強度,但小於2倍;“++”=至少2倍的帶強度,但小於3倍;以及“+++”=至少3倍增加的帶強度。 |
於此實施例中,說明進行實驗以使用AGT及ACSuS來生產甜菊糖苷A。使用的緩衝劑為50 mM pH 7.0磷酸鉀加上3 mM MgSO
4。以緩衝劑製備酵素及蔗糖儲備物溶液(400 g/L)。“Reb A 60”為甜菊苷及甜菊糖苷A分別 ~1:2的混合物。將250 µL的8 g/L β-1,3-GT序列辨識編號:1290儲備物溶液、250 µL的2 g/L SuS序列辨識編號:1158儲備物溶液及500 µL的50 g/L Reb A 60及2.6 g/L ADP儲備物溶液配於400 g/L蔗糖,於大氣下添加至小瓶內。最終組成為25 g/L Reb A 60、200 g/L蔗糖、2 g/L序列辨識編號:1290、0.5 g/L序列辨識編號:1158,及1.3 g/L(3 mM)的ADP。所生成的澄清均質溶液於大氣下攪拌(反應隨著沈澱物形成逐漸變混濁)。反應的進展之後是取等分試樣且用1:1乙腈/水來驟冷。於4000 rpm/r.t./5 min離心後,澄清均質上清液係藉由HPLC使用表21.1及表21.2內列出的設備與參數予以分析。48 h之後,反應混合物由>90% Reb A組成(表21.3)。
實施例22
以AGT及ACSuS轉變甜菊苷成甜菊糖苷A以及甜菊糖苷A成甜菊糖苷D
表21.1 分析HPLC方法甜菊糖 | |
設備 | Agilent HPLC 1100系列 |
管柱 | 3.5 x 50 mm 3.5 µm Waters XBridge苯基管柱 |
移動相 | 等度65:35 A:B A:0.1%甲酸配於水 B:0.1%甲酸配於甲醇 |
流率 | 2.4 mL/m |
運行時間 | 12 m |
峰滯留時間 | 甜菊糖苷D:3.7 m 甜菊糖苷M:4.7 m 甜菊苷:8.8 m 甜菊糖苷A及I:9.9 m |
管柱溫度 | 50 ℃ |
注入體積 | 10 μL |
UV偵測 | 210 nm |
表21.2 分析HPLC方法甜菊糖 | |
設備 | Thermo Ultimate 3000 UPLC with CAD |
管柱 | 3.2 x 250 mm 3.5 µm Restek Pinnacle II胺基管柱 |
移動相 | 等度22:78 A:B A:水 B:乙腈 |
流率 | 2.0 mL/m |
運行時間 | 12 m |
峰滯留時間 | 果糖:1.7 m 葡萄糖:2.0 m 甜菊苷:2.6 m 蔗糖:3.1 m 甜菊糖苷A: 4.2 m 甜菊糖苷I:6.6 m 甜菊糖苷D:10.0 m 甜菊糖苷M:10.7 m |
管柱溫度 | 50 ℃ |
注入體積 | 10 μL |
UV偵測 | 210 nm用於有機化合物 CAD用於糖類 |
表21.3甜菊苷轉化成甜菊糖苷A與時間的關係 | ||
t [h] | 甜菊苷% | Reb A% |
0 | 36 | 64 |
1 | 35 | 65 |
2 | 33 | 67 |
4 | 31 | 69 |
8 | 27 | 73 |
24 | 18 | 82 |
48 | 8 | 92 |
72 | 6 | 94 |
於此實施例中,說明進行實驗以生產甜菊糖苷A及甜菊糖苷D。將250 µL的20 g/L β-1,3-GT序列辨識編號:1290儲備物溶液、250 µL的40 g/L β-1,2-GT序列辨識編號:954儲備物溶液及500 µL的20 g/L Reb A 60、2.6 g/L ADP及1 g/L SuS序列辨識編號:1158儲備物溶液配於400 g/L蔗糖,於大氣下添加至小瓶內。使用的緩衝劑為50 mM pH 7.0磷酸鉀加上3 mM MgSO
4。以緩衝劑製備酵素及蔗糖儲備物溶液(400 g/L)。最終組成為10 g/L Reb A 60、200 g/L蔗糖、5 g/L序列辨識編號:1290、10 g/L序列辨識編號:954、0.5 g/L序列辨識編號:1158,及1.3 g/L (3 mM)的ADP。所生成的澄清均質溶液於大氣下攪拌(反應隨著沈澱物形成逐漸變混濁)。反應的進展之後是取等分試樣且用1:1乙腈/水來驟冷。於4000 rpm/r.t./5 min離心後,澄清均質上清液係藉由HPLC使用表21.1及表21.2內列出的設備與參數予以分析。24 h之後,觀察到沒有甜菊苷殘留且形成16%的Reb D(表22.1)。
實施例23
以AGT及ACSuS轉變甜菊糖苷D成甜菊糖苷M
表22.1甜菊苷及甜菊糖苷A轉化成甜菊糖苷A及甜菊糖苷D | |||
t [h] | 甜菊苷% | Reb A% | Reb D% |
0 | 35 | 65 | 0 |
1 | 27 | 70 | 3 |
2 | 25 | 70 | 5 |
4 | 23 | 72 | 5 |
8 | 15 | 79 | 6 |
24 | 0 | 84 | 16 |
於此實施例中,說明進行實驗以使用AGT及ACSuS變異體以從甜菊糖苷D生產甜菊糖苷M。將100 mg的Reb D、250 µL的80 g/L β-1,3-GT序列辨識編號:548儲備物溶液、250 µL的10 g/L SuS序列辨識編號:1158儲備物溶液及500 µL的2.6 g/L ADP儲備物溶液配於400 g/L蔗糖,於大氣下添加至小瓶內。使用的緩衝劑為50 mM pH 7.0磷酸鉀加上3 mM MgSO
4。以緩衝劑製備酵素及蔗糖儲備物溶液(400 g/L)。最終組成為100 g/L Reb D、200 g/L蔗糖、20 g/L序列辨識編號:548、2.5 g/L序列辨識編號:1158,及1.3 g/L(3 mM)的ADP。所生成的濃漿料於大氣下攪拌。反應的進展之後是取等分試樣且用1:1乙腈/水來驟冷。於4000 rpm/r.t./5 min離心後,澄清均質上清液係藉由HPLC使用表21.1及表21.2內列出的設備與參數予以分析。48 h之後,反應混合物由>90% Reb M組成(表23.1)。
實施例24
以AGT及ACSuS轉變甜菊苷成甜菊糖苷A、甜菊糖苷A成甜菊糖苷D,以及甜菊糖苷D成甜菊糖苷M
表23.1甜菊糖苷D轉化成甜菊糖苷M與時間的關係. | |
t [h] | Reb M% |
0 | 0 |
1 | 16 |
2 | 28 |
4 | 40 |
8 | 52 |
24 | 79 |
32 | 88 |
48 | 94 |
於此實施例中,說明進行實驗以從甜菊苷生產甜菊糖苷A、從甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D,以及從甜菊糖苷D生產甜菊糖苷M。將250 µL的20 g/L β-1,3-GT序列辨識編號:1290儲備物溶液、250 µL的40 g/L β-1,2-GT序列辨識編號:954儲備物溶液,及500 µL的50 g/L Reb A 60、2.6 g/L ADP、5 g/L β-1,3-GT 序列辨識編號:548,及1 g/L SuS序列辨識編號:1158儲備物溶液,配於400 g/L蔗糖,於大氣下添加至小瓶內。使用的緩衝劑為50 mM pH 7.0磷酸鉀加上3 mM MgSO
4。以緩衝劑製備酵素及蔗糖儲備物溶液(400 g/L)。最終組成為25 g/L Reb A 60、200 g/L蔗糖、5 g/L序列辨識編號:1290、10 g/L序列辨識編號:954、2.5 g/L序列辨識編號:548、0.5 g/L序列辨識編號:1158及1.3 g/L(3 mM)的ADP。所生成的澄清均質溶液於大氣下攪拌(反應隨著沈澱物形成逐漸變混濁)。反應的進展之後是取等分試樣且用1:1乙腈/水來驟冷。於4000 rpm/r.t./5 min離心後,澄清均質上清液係藉由HPLC使用表21.1及表21.2內列出的設備與參數予以分析。24 h之後,觀察到<5%甜菊苷殘留且形成9%的Reb M(表24.1)。
實施例25
AGT及/或ACSuS的固定化
表24.1甜菊苷及甜菊糖苷A轉化成葡萄糖苷化的產物與時間的關係 | |||||
t [h] | 甜菊苷% | Reb A% | Reb D% | Reb I% | Reb M% |
0 | 35 | 65 | 0 | 0 | 0 |
1 | 29 | 71 | 0 | 0 | 0 |
2 | 26 | 73 | 0 | 1 | 0 |
4 | 2 | 97 | 0 | 1 | 0 |
8 | 8 | 91 | 0 | 1 | 0 |
24 | 1 | 70 | 0 | 18 | 9 |
於此實施例中,說明進行實驗以固定化AGT(諸如,序列辨識編號:1290、954及/或548變異體)及/或ACSuS變異體(諸如,序列辨識編號:1158)。添加酵素溶液,不論是單獨或酵素的組合(即,AGT及/或ACSuS酵素),及撐體至一容器。撐體為陽離子、陰離子、疏水性、親水性──有或沒有存在共價鍵形成官能基,例如硫醇、醇、胺、烯烴、烷基鹵化物及/或環氧化物。撐體為個別聚合物樹脂或非晶形(奈米)黏土或活性碳。當適合產物單離/酵素再回收時會使用磁性顆粒。反應係在有或沒有戊二醛的情況下進行。撐體進行酵素吸取之後進行布拉德福檢定(Bradford assay)。任擇地,將撐體裝入管柱內且酵素溶液流通過管柱,設若需要加上再回收,直到達成所欲程度的酵素捕獲。在一些具體例中,所有感興趣的酵素都固定於相同的反應容器內相同的撐體上,然而於一些任擇的具體例中,酵素分別固定於個別的容器或是其等之組合。在一些具體例中,固定化酵素係經由過濾單離或於添加緩衝劑、蔗糖、ADP及受質立即使用以固定化反應混合物。
實施例26
以固定化的AGT及/或ACSuS轉變甜菊苷成甜菊糖苷A以及再回收糖溶液
於此實施例中,說明使用固定化的AGT(諸如,序列辨識編號:1290)及ACSuS(諸如,序列辨識編號:1158)轉變甜菊苷成甜菊糖苷A,以及糖溶液再回收。添加固定化的β-1,3-GT(諸如,序列辨識編號:1290)及固定化的SuS(諸如,序列辨識編號:1158)至一容器。任擇地,在一些具體例中,其中一種酵素係以固定化形式使用且另一種係以溶液形式使用。添加緩衝劑、蔗糖、ADP及受質(即,甜菊苷或Reb A 60)之後,監測反應直到達成所欲的轉化。在一些具體例中,產物及固定化的酵素係經由過濾單離。在一些具體例中,固定化的酵素進一步經由離心、粒度過濾或磁性取回而與產物分離並且再利用。使糖濾液返回容器用於下一次迭代。
實施例27
以固定化的AGT及/或ACSuS轉變甜菊糖苷A成甜菊糖苷D以及再回收糖溶液
於此實施例中,說明進行實驗以用固定化的AGT及ACSuS從甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D,以及糖溶液再回收。添加固定化的β-1,2-GT(諸如,序列辨識編號:954)及固定化的SuS(諸如,序列辨識編號:1158)至一容器。任擇地,在一些具體例中,其中一種酵素係以固定化形式使用且另一種係以溶液形式使用。添加緩衝劑、蔗糖、ADP及受質(即,甜菊苷或Reb A 60)之後,監測反應直到達成所欲的轉化。在一些具體例中,產物及固定化的酵素係經由過濾單離。在一些具體例中,固定化的酵素進一步經由離心、粒度過濾或磁性取回而與產物分離並且再利用。使糖濾液返回容器用於下一次迭代。
實施例28
以固定化的AGT及/或ACSuS轉變甜菊糖苷D成甜菊糖苷M以及再回收糖溶液
於此實施例中,說明進行實驗以用固定化的AGT及ACSuS從甜菊糖苷D生產甜菊糖苷M,以及糖溶液再回收。添加固定化的β-1,3-GT(諸如,序列辨識編號:548)及固定化的SuS(諸如,序列辨識編號:1158)至一容器。任擇地,在一些具體例中,其中一種酵素係以固定化形式使用且另一種係以溶液形式使用。添加緩衝劑、蔗糖、ADP及Reb D之後,監測反應直到達成所欲的轉化。在一些具體例中,產物及固定化的酵素係經由過濾單離。在一些額外的具體例中,固定化的酵素進一步經由離心、粒度過濾或磁性取回而與產物分離並且再利用。使糖濾液返回容器用於下一次迭代。
實施例29
以固定化的AGT及ACSuS轉變甜菊苷成甜菊糖苷A及甜菊糖苷A成甜菊糖苷D以及再回收糖溶液
於此實施例中,說明進行實驗以用固定化的AGT及ACSuS從甜菊苷生產甜菊糖苷A,以及從甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D,以及糖溶液再回收。添加固定化的β-1,3-GT(諸如,序列辨識編號:1290)及β-1,2-GT(諸如,序列辨識編號:954)及固定化的SuS(諸如,序列辨識編號:1158)至一容器。任擇地,在一些具體例中,此等酵素中一或二種係以固定化形式使用且其他係以溶液形式使用。添加緩衝劑、蔗糖、ADP及受質(即,甜菊苷或Reb A 60)之後,監測反應直到達成所欲的轉化。在一些具體例中,產物及固定化的酵素係經由過濾單離。在一些具體例中,固定化的酵素進一步經由離心、粒度過濾或磁性取回而與產物分離並且再利用。使糖濾液返回容器用於下一次迭代。
實施例30
以固定化的AGT及ACSuS轉變甜菊苷成甜菊糖苷A、甜菊糖苷A成甜菊糖苷D及甜菊糖苷D成甜菊糖苷M以及再回收糖溶液
添加固定化的β-1,3-GT(諸如,序列辨識編號:1290)、β-1,2-GT(諸如,序列辨識編號:954)、β-1,3-GT(諸如,序列辨識編號:548),及固定化的SuS(諸如,序列辨識編號:1158)至一容器。任擇地,在一些具體例中,此等酵素中一、二或三種係以固定化形式使用且其他係以溶液形式使用。添加緩衝劑、蔗糖、ADP及受質(即,甜菊苷或Reb A 60)之後,監測反應直到達成所欲的轉化。在一些具體例中,產物及固定化的酵素係經由過濾單離。在一些具體例中,固定化的酵素進一步經由離心、粒度過濾或磁性取回而與產物分離並且再利用。使糖濾液返回容器用於下一次迭代。
實施例31
序列辨識編號:1222之蔗糖合成酶變異體
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組之變異體基因庫來繼續序列辨識編號:1222編碼之SuS的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第四輪(“第4輪”)具有生產ADP-葡萄糖之活性的49種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷D之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用250 µL的Tris-HCl、pH 7.5,加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物20x至Tris-HCl,pH 7.5。繼而,組合10 μL稀釋的SuS溶解產物及2 g/L GT序列辨識編號:696(Rd8BB)於100 μL反應體積加上~1 mM甜菊糖苷D之受質裝載量及1 Mm ADP(Sigma,>95%)及10 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。藉由添加10 μL的試料混合物至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷以上所述的反應,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋10x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上如表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。
表31.1 甜菊糖偵測之RapidFire SPE-MS/MS條件 Agilent RapidFire條件 | ||||||||
緩衝劑A | 0.1%甲酸配於LC/MS等級水;1.5 mL/min流率 | |||||||
緩衝劑B | 0.1%甲酸配於LC/MS等級甲醇;0.8 mL/min流率 | |||||||
水清洗 | 水 | |||||||
有機清洗 | 乙腈 | |||||||
SPE匣 | Agilent RapidFire匣A(C4) | |||||||
RF狀態1 | 600 ms | |||||||
RF狀態2 | 2500 ms | |||||||
RF狀態3 | 0 | |||||||
RF狀態4 | 5000 ms | |||||||
RF狀態5 | 1000 ms | |||||||
Agilent噴射流源參數 | ||||||||
乾燥氣體溫度 | 300 ℃ | |||||||
乾燥氣體流量 | 10 L/min | |||||||
霧化器壓力 | 45 psi | |||||||
鞘流氣體溫度 | 350 ℃ | |||||||
鞘流氣體流量 | 11 L/min | |||||||
毛細管電壓 | +3500 V | |||||||
噴嘴電壓 | +2000 V | |||||||
Agilent 6470三段四極MRM參數 | ||||||||
化合物 | Q1 | Q3 | 暫停 | 碎裂(Fragmentor) | CE | CAV | ||
甜菊苷 | 827.4 | 665.3 | 50 | 150 | 50 | 5 | ||
RebA | 989.5 | 827.5 | 50 | 350 | 60 | 5 | ||
RebD或RebI | 1151.7 | 827.5 | 50 | 350 | 55 | 5 | ||
RebM | 1313.7 | 827.5 | 50 | 350 | 70 | 5 | ||
分析之後,辨識出49種經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷D偶聯的改良活性。生成的經工程處理之多肽列於表31.2中。帶有表31.3中顯示的胺基酸突變之變異體係如以下所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末(SFP)之生產
表31.2 SUS第4輪變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1222) | 增加的RebM a |
1295/1296 | H47L/I372V/A635S/Q776E | + |
1297/1298 | H47L/R93V/L98V/P358E/R583Q/A635S | + |
1299/1300 | V68A/R93V/R154H/P358E/I372V/R440P/Q776E | + |
1301/1302 | I372V/W375Y/Q776E | + |
1303/1304 | H47L/L98V/R129E/P358E/I372V/W375Y/H438Q/E534H | + |
1305/1306 | R154H/E534H/A635S/K724H | + |
1307/1308 | R93V/R154H/S248A/K724H | + |
1309/1310 | H47L/R93V/P358E/I372V/W375Y/Q776E | + |
1311/1312 | V68A/R136S/K724H | + |
1313/1314 | H47L/P358E/A635S/Q776E | + |
1315/1316 | L98V/E534H/R583Q/A635S | + |
1317/1318 | R93V/L98V/T125E/R154H/S250D/R440P | + |
1319/1320 | R93V/L98V/R154H/A635S/Q776E | +++ |
1321/1322 | R129E/R154H/S248A/S250D/P358E/W375Y/E534H/A635S | +++ |
1323/1324 | R93V/T125E/R154H/R440P/E534H | ++ |
1325/1326 | R93V/L98V/E534H | + |
1327/1328 | R93V/L98V/R154H/S250D/P358E/W375Y/E534H | ++ |
1329/1330 | H47L/L98V/I372V/W375Y | ++ |
1331/1332 | H47L/R93V/L98V/R154H/I372V/W375Y/Q776E | +++ |
1333/1334 | H47L/R93V/R129E/R136S/R154H/S250D/I372V/E534H/A635S/K724H | + |
1335/1336 | R93V/R129E/S250D/P358E/I372V/W375Y/R583Q | + |
1337/1338 | V68A/W375Y/R440P/E534H/K724H/Q776E | + |
1339/1340 | H47L/T125E/R154H | +++ |
1341/1342 | R93V/L98V/T125E/R154H/S248A | ++ |
1343/1344 | V68A/R154H/E534H/A635S | ++ |
1345/1346 | H47L/R93V/R129E/R136S/W375Y/E534H/R583Q | ++ |
1347/1348 | V68A/R129E/R583Q/K724H | ++ |
1349/1350 | H47L/R93V/L98V/R136S/R154H/E772G/Q776E | +++ |
1351/1352 | H47L/R136S/R583Q/Q776E | ++ |
1353/1354 | R154H/S250D/P358E/W375Y/R583Q | +++ |
1355/1356 | H47L/R129E/S248A/S250D/I372V/W375Y/E534H/K724H | + |
1357/1358 | W375Y/A635S | + |
1359/1360 | H47L/P358E/R440P/K724H | + |
1361/1362 | R129E/R136S/W375Y | + |
1363/1364 | H47L/V68A/R93V/L98V/P358E/R440P | + |
1365/1366 | L98V/R129E/W375Y/R583Q | + |
1367/1368 | R93V/P358E/E534H/A635S | + |
1369/1370 | E534H/R583Q | + |
1371/1372 | H47L/V68A/R154H/I372V/W375Y | + |
1373/1374 | R129E/P358E/I372V/A635S | ++ |
1375/1376 | H47L/R129E/R136S/I372V/W375Y/E534H | ++ |
1377/1378 | R93V/L98V/R129E/R154H/S248A | ++ |
1379/1380 | V68A/R129E/R440P | +++ |
1381/1382 | R154H/P358E/W375Y/E534H/Q776E | +++ |
1383/1384 | H47L/L98V/R129E/W375Y/E534H/A635S/K724H/Q776E | ++ |
1385/1386 | V68A/R154H/P358E/W375Y | ++ |
1387/1388 | V68A/R93V/L98V/R129E/P358E/W375Y/K724H | ++ |
1389/1390 | R129E/R136S/R154H/S248A/S250D/I372V/W375Y/E534H | ++ |
1391/1392 | H47L/R93V/P358E/I372V/W375Y/R440P/K724H | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1222之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少2倍,但小於3.05倍;“++”=生產至少3.05倍,但小於3.29倍;以及“+++”=至少3.29倍增加的生產。 |
使用一種搖動燒瓶程序來產生用於本文所述之生物催化方法內使用的特徵化檢定之醣基轉移酶多肽搖動燒瓶粉末(SFP)。酵素之搖動燒瓶粉末(SFP)製備物與HTP檢定中使用的細胞溶解產物相比,提供更純的酵素製備物(諸如,達到>30%的總蛋白質),且亦允許使用更濃縮的酵素溶液。含編碼感興趣的經工程處理之多肽之質體的單一菌落的大腸桿菌接種至含30 μg/ml氯黴素及1%葡萄糖的5 mL溶菌肉湯內。細胞於30℃培養器內以250rpm搖動生長過夜(至少16小時)。培養物於1 L燒瓶內經稀釋至含有30 μg/ml CAM之250 mL極品肉湯(12 g/L細菌用胰蛋白腖、24 g/L酵母萃取物、4 mL/L甘油、65 mM磷酸鉀、pH 7.0、1 mM MgS0
4)內達600 nm(OD600)0.2的光密度,且允許於30℃下生長。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷D之分析
執行一實驗以特徵化經工程處理之第4輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷D形成甜菊糖苷M之活性。添加0.125 g/L濃度的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM氯化鎂、1 g/L甜菊糖苷D、10 mM蔗糖、1 mM ADP及2 g/L GT序列辨識編號:734。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1h予以執行。藉由添加10 μL的反應混合物至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋10x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上如表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。至少3種變異體具有比序列辨識編號:1222更高的活性。該等變異體自甜菊糖苷D生產甜菊糖苷M相對於序列辨識編號:1222之位準係列於表31.3中。帶有,相對於序列辨識編號:1222,突變H47L、R93V、P358E、I372V、W375Y、R440P及K724H之變異體(序列辨識編號:1392),具有最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:1391)用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例32
序列辨識編號:1392之蔗糖合成酶變異體
表31.3 SUS第4輪SFP變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1222) | 增加的RebM a |
1391/1392 | H47L/R93V/P358E/I372V/W375Y/R440P/K724H | + |
1349/1350 | H47L/R93V/L98V/R136S/R154H/E772G/Q776E | + |
1381/1382 | R154H/P358E/W375Y/E534H/Q776E | + |
1365/1366 | L98V/R129E/W375Y/R583Q | + |
1379/1380 | V68A/R129E/R440P | + |
1391/1392 | H47L/R93V/P358E/I372V/W375Y/R440P/K724H | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1222之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.04倍,但小於1.2倍更大的生產力。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組之變異體基因庫來繼續序列辨識編號:1391編碼之SuS的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第五輪(“第5輪”)具有生產ADP-葡萄糖之活性的86種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷D之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物25-60x至Tris-HCl,pH 7.5。10 μL稀釋的SuS溶解產物及2 g/L GT序列辨識編號:4684(Rd9BB)於100 μL反應體積加上~1 mM甜菊糖苷D之受質裝載量及1 mM ADP(Sigma,>95%)及10 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl2,50℃於一種Thermotron®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1 h。藉由添加10 μL的試料至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷以上所述的反應,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋10x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。
分析之後,辨識出86種經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷D偶聯的改良活性。生成的經工程處理之多肽列於表32.1中。帶有表32.2中顯示的胺基酸突變之變異體係如以下所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷D之分析
表32.1 SUS第5輪變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1392) | 增加的RebM a |
1395/1396 | G54D/A97V/A118N/N307E/G694N/L727E/A738E | + |
1397/1398 | A97V/A118N/H442N/G694N/L727E/A738E | + |
1399/1400 | Y17D/F684H | + |
1401/1402 | Y17D/Y434H/F684H | + |
1403/1404 | Y17D/Y357K/Y434H/F519T/F684H | ++ |
1405/1406 | Y17D/Y357K/P364R/Y434H/F519T/F684H | ++ |
1407/1408 | R550I | + |
1409/1410 | V68A/L98V/R129E/R136S | ++ |
1411/1412 | R136S/G603D | ++ |
1413/1414 | L98V/R136S/R154H/A635S | ++ |
1415/1416 | V68A/R136S/E534H/A635S | ++ |
1417/1418 | V68A/R154H | ++ |
1419/1420 | V68A/R129E/R136S/R154H | ++ |
1421/1422 | L98V/R129E/R136S/R154H/A635S | +++ |
1423/1424 | V68A/L98V/R154H/E534H/A635S | ++ |
1425/1426 | L98V/R154H | + |
1427/1428 | R136S/E534H/A635S | + |
1429/1430 | L98V/R154H/E534H | ++ |
1431/1432 | V68A/L98V/R136S/R154H/A635S | ++ |
1433/1434 | R129E/A635S | + |
1435/1436 | R129E/R154H/A635S | +++ |
1437/1438 | V68A/L98V/R154H/E534H | + |
1439/1440 | V68A/R129E/R136S | + |
1441/1442 | V68A/R129E/R136S/R154H/I464F/A635S | +++ |
1443/1444 | L98V/R129E/R154H | +++ |
1445/1446 | R154H/A635S | ++ |
1447/1448 | R129E/R154H/E534H | ++ |
1449/1450 | R154H | + |
1451/1452 | L98V/R136S/A635S | ++ |
1453/1454 | V68A/R136S/R154H/E534H/A635S | +++ |
1455/1456 | V68A/L98V/R129E/R154H/A635S | +++ |
1457/1458 | V68A/R129E/R154H | ++ |
1459/1460 | V68A/R154H/A635S | ++ |
1461/1462 | V68A/L98V/R154H | + |
1463/1464 | L98V/R136S/E534H/A635S | ++ |
1465/1466 | V68A/L98V/R136S/R154H/E534H/A635S | +++ |
1467/1468 | L98V/R129E/E534H/A635S | ++ |
1469/1470 | V68A/L98V/R129E/R136S/R154H | ++ |
1471/1472 | R129E/R136S/E534H | + |
1473/1474 | V68A/R129E/R136S/E534H/A635S | +++ |
1475/1476 | V68A/R129E/R154H/D765H | +++ |
1477/1478 | L98V/R129E/R154H/E534H/A635S | +++ |
1479/1480 | V68A/R136S/A635S | ++ |
1481/1482 | V68A/L98V/R129E/R136S/R154H/E534H | ++ |
1483/1484 | R129E/R136S/A635S | +++ |
1485/1486 | R136S/R154H/A635S | +++ |
1487/1488 | L98V/R129E/R136S/E534H | + |
1489/1490 | L98V/R129E/R136S/R154H | ++ |
1491/1492 | R136S/A635S | ++ |
1493/1494 | R132C/R136S/R154H/E534H/A635S | ++ |
1495/1496 | L98V/R129E/R136S/A635S | +++ |
1497/1498 | R129E/R136S/R154H/A635S | +++ |
1499/1500 | R129E/R136S | + |
1501/1502 | V68A/R154H/E534H/A635S | +++ |
1503/1504 | V68A/L98V/R129E/R154H/E534H | +++ |
1505/1506 | F160W | + |
1507/1508 | S161Q | + |
1509/1510 | F160M | + |
1511/1512 | A635E | + |
1513/1514 | A253G | + |
1515/1516 | F160E | + |
1517/1518 | F160A | + |
1519/1520 | Q381S | + |
1521/1522 | R550M | + |
1523/1524 | F519A | + |
1525/1526 | P785D | + |
1527/1528 | R167E | + |
1529/1530 | L563V | + |
1531/1532 | A635D | ++ |
1533/1534 | P285A | + |
1535/1536 | R550Q | + |
1537/1538 | F519L | + |
1539/1540 | F519T | + |
1541/1542 | A635R | + |
1543/1544 | F519G | + |
1545/1546 | G157A | ++ |
1547/1548 | A122E | + |
1549/1550 | S564A | +++ |
1551/1552 | A122D | + |
1553/1554 | R550S | + |
1555/1556 | A253T | + |
1557/1558 | F160S | + |
1559/1560 | F160N | + |
1561/1562 | F519S | + |
1563/1564 | G157F | + |
1565/1566 | A253V | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1392之參考多肽來判定且定義如下:“+”=生產至少1.2倍,但小於1.54倍; “++”=至少1.54倍,但小於1.73倍;以及“+++”=生產至少1.73倍大於參考多肽的位準。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第4輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷D形成甜菊糖苷M之活性。添加0.05 g/L濃度的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM氯化鎂、1 g/L甜菊糖苷D、10 mM蔗糖、1 mM ADP,及2 g/L GT序列辨識編號:4684。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1-2 h予以執行。藉由稀釋2.5x於水內來溶解反應,藉由添加10 μL稀釋的反應至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.33x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。表32.2中所有的變異體都具有比序列辨識編號:1392更高的活性。該等變異體自甜菊糖苷D生產甜菊糖苷M相對於序列辨識編號:1392之位準係列於表32.2中。選擇相對於序列辨識編號:1392、帶有突變V68A、L98V、R129E、R154H及A635S(序列辨識編號:1455)的變異體,用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例33
序列辨識編號:1456之蔗糖合成酶變異體
表32.2 SUS第5輪SFP變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1392) | 增加的RebM a |
1393/1394 | R154Q/S161T | + |
1397/1398 | A97V/A118N/H442N/G694N/L727E/A738E | + |
1405/1406 | Y17D/Y357K/P364R/Y434H/F519T/F684H | +++ |
1407/1408 | R550I | + |
1455/1456 | V68A/L98V/R129E/R154H/A635S | ++ |
1477/1478 | L98V/R129E/R154H/E534H/A635S | + |
1497/1498 | R129E/R136S/R154H/A635S | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1392之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.12倍;“++”=生產至少1.12倍,但小於1.20倍;以及“+++”=生產至少1.20倍更大。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組之變異體基因庫來繼續序列辨識編號:1455編碼之SuS的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第六輪(“第6輪”)具有生產ADP-葡萄糖之活性的16種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5,加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物30x至Tris-HCl,pH 7.5。繼而,組合10 μL稀釋的SuS溶解產物及1 g/L GT序列辨識編號:2814(Rd8BB)於100 μL反應體積加上4.5 mM甜菊糖苷A 97之受質裝載量及0.25 mM ADP(Sigma,>95%)及10 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6.5,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1 h。藉由添加10 μL的試料混合物至90 μL水來溶解以上所述的反應,藉由添加10 μL溶解的試料混合物至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋7.3x於水內,且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。
分析之後,辨識出16種經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性。生成的經工程處理之多肽列於表33.1中。帶有表33.2中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例31所述,以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表33.1 SUS第6輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1456) | 增加的RebD a |
1567/1568 | Y17D/G54D/A524T/R550I/L727E | + |
1569/1570 | Y17D/Y434H/A524T/F684H | + |
1571/1572 | Y17D/A738E | + |
1573/1574 | Y17D/G54D/A97V/R136P/E329Q/R550I/F684H/A738E | + |
1575/1576 | G54D/A97V/Y434H/A524T/R550I/F684H/L727E | + |
1577/1578 | Y17D/S161T/Y434H/A524T/R766H | ++ |
1579/1580 | E329Q/R550I/F684H/L727E/A738E | + |
1581/1582 | Y17D/G54D/S161T/F519T/L727E/A738E | ++ |
1583/1584 | Y17D/Y434H/A738E | +++ |
1585/1586 | G54D/A97V/S161T/Y434H/H442N | +++ |
1587/1588 | G54D/R136P/H442N/R550I | ++ |
1589/1590 | Y17D/G54D/A97V/E329Q/A524T/F684H | ++ |
1591/1592 | G54D/Y434H/A524T/A738E | ++ |
1593/1594 | Y17D/H442N/A524T/R550I/F684H/E721K | + |
1595/1596 | Y17D/L727E | +++ |
1597/1598 | A97V/R136P/F519T/R550I/L727E/A738E | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1456之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.4倍,但小於1.5倍;“++”=大於1.5倍,但小於1.54倍;以及“+++”=大於1.54倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第6輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A形成甜菊糖苷D之活性。添加0.01 g/L濃度的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6.5、4.5 mM甜菊糖苷A 97、30 mM蔗糖、0.25 mM ADP,及1 g/L GT序列辨識編號:2814。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1-2 h予以執行。藉由稀釋10x於水內來溶解反應,藉由添加10 μL稀釋的反應至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋4.4x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。至少4種變異體具有比序列辨識編號:1456更高的活性。該等變異體自甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D相對於序列辨識編號:1456之位準係列於表33.2中。選擇相對於序列辨識編號:1456,帶有突變Y17D、G54D、S161T、F519T、L727E、及A738E之變異體(序列辨識編號:1582),用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例34
序列辨識編號:1582之蔗糖合成酶變異體
表33.2 SUS第6輪SFP變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1456) | 增加的RebD a |
1577/1578 | Y17D/S161T/Y434H/A524T/R766H | + |
1581/1582 | Y17D/G54D/S161T/F519T/L727E/A738E | + |
1583/1584 | Y17D/Y434H/A738E | + |
1595/1596 | Y17D/L727E | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1456之參考多肽來判定且定義如下:“+”=比參考多肽的位準生產大於1.15及1.36倍之間的位準生產。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組之變異體基因庫來繼續序列辨識編號:1581編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第七輪(“第7輪”)具有生產ADP-葡萄糖之活性的87種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選組合庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解,以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物~90x至Tris-HCl,pH 7.5。繼而,組合10 μL稀釋的SuS溶解產物及1 g/L GT序列辨識編號:2884(Rd9BB)於100 μL反應體積加上4.5-7.5 mM甜菊糖苷A 97之受質裝載量及0.2-0.25 mM ADP(Sigma,>95%)及30 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,55℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。藉由添加10 μL的試料至90-190 μL水來溶解以上所述的反應,藉由添加10 μL溶解的試料至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋4.4-6.7x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。
分析之後,辨識出87種經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性。生成的經工程處理之多肽列於表34.1中。帶有表34.2中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例31所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表34.1 SUS第7輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1582) | 增加的RebD a |
1599/1600 | L562I | ++ |
1601/1602 | V270L/F452Y/P517A/I700F/L750M | + |
1603/1604 | P517A/L562I/L750M | + |
1605/1606 | V270L/I367V/F452Y/P517A/E613Q/I700F/L750M | ++ |
1607/1608 | V270L/R570H | + |
1609/1610 | P517A | + |
1611/1612 | V270L/I322V/P517A | + |
1613/1614 | L562I | + |
1615/1616 | P517A/T640N | + |
1617/1618 | R71Q/R222L/R236S | ++ |
1619/1620 | R14D/R137K/R356H/R745L | + |
1621/1622 | R14D/R570H/R745L | +++ |
1623/1624 | R236S | ++ |
1625/1626 | R356H/R570H | +++ |
1627/1628 | R71Q/R158T/R222L/R356H | + |
1629/1630 | R14D/R570H | + |
1631/1632 | R137K/R319K/R570H | + |
1633/1634 | R71Q/R319K/R356H/R606S | + |
1635/1636 | S26E/A164E/A165E/A213E/R586E | +++ |
1637/1638 | G117E/A608E | ++ |
1639/1640 | A213E/H365E/P517E/A707E | ++ |
1641/1642 | G117E/R158E/A213E/G332E/A608E | + |
1643/1644 | S26E/G117E/H365E | + |
1645/1646 | G117E/A164E/A707E | + |
1647/1648 | A165E/Q311E | ++ |
1649/1650 | G117E/Q311E/G332E | ++ |
1651/1652 | G117E/A213E/H365E/P517E | + |
1653/1654 | A253G/T519L | + |
1655/1656 | T519L/L563V | ++ |
1657/1658 | A253T/T519L | + |
1659/1660 | A253V/T519G | ++ |
1661/1662 | A253V/T519L | + |
1663/1664 | A253T/T519L/L563V | + |
1665/1666 | A253T/T519L/S635E | ++ |
1667/1668 | A253T/L563V/S635R | ++ |
1669/1670 | G157A/A253T/T519L | ++ |
1671/1672 | A253T/T519L/S635D | +++ |
1673/1674 | A122E/R550Q | + |
1675/1676 | A122D/R167E | + |
1677/1678 | F160W/L282M/Q381S/R550M | + |
1679/1680 | A122E/F160I/R167E/L282M/Q381H/R550Q/L636Q | ++ |
1681/1682 | A122D/F160M/L282M/R550S | + |
1683/1684 | F160M/T161Q/L282M/R550Q | ++ |
1685/1686 | A122D/R167E | + |
1687/1688 | L282M/R550Q | ++ |
1689/1690 | F160W/T161Q/L282M/R550M | +++ |
1691/1692 | F160M/L282M/R550M/L636Q | +++ |
1693/1694 | A122D/L282M/Q381S/R550M | +++ |
1695/1696 | A122D/R550M | +++ |
1697/1698 | A122D | +++ |
1699/1700 | A122E/L282M/R550Q | +++ |
1701/1702 | T161Q/L282M/R550Q/L636Q | +++ |
1703/1704 | A122E/F160M/T161Q/L282M/Q381S/R550M/L636Q | +++ |
1705/1706 | R167E/R550Q | ++ |
1707/1708 | A122D/L282M/R550Q | + |
1709/1710 | R167E/L282M/L636Q | + |
1711/1712 | L282M/Q381S/R550S | +++ |
1713/1714 | Q381S/R550S | + |
1715/1716 | T161Q/Q381S/R550Q | + |
1717/1718 | A122E/R167E/R550M | +++ |
1719/1720 | R550Q | ++ |
1721/1722 | F160M/T161Q/L282M/Q381S/R550M | ++ |
1723/1724 | A122E/F160W/Q381S/R550M/L636Q | + |
1725/1726 | F160M/L282M/Q381S/R550M | ++ |
1727/1728 | A122D/F160W/T161Q/L282M/R550Q | + |
1729/1730 | F160M/T161Q | +++ |
1731/1732 | Q381S/R550Q | + |
1733/1734 | A122E/F160W/Q381S/R550Q | ++ |
1735/1736 | A122D/F160W/T161Q/R167E/R550M | ++ |
1737/1738 | F160W/T161Q/L282M/R550Q | +++ |
1739/1740 | A122E/F160W/T161Q/R167E/R550S | ++ |
1741/1742 | A122D/F160W/R550M | + |
1743/1744 | F160W/T161Q/R550Q/L636Q/A735V | + |
1745/1746 | F160W/R167E/L282M/Q381S/L636Q | ++ |
1747/1748 | A122E/F160M/R550Q/L636Q | + |
1749/1750 | A122E/F160W/T161Q/L282M/Q381S/R550S | + |
1751/1752 | A122E/F160W/L282M/Q381S | + |
1753/1754 | A122D/F160W/L282M/Q381S/R550M | + |
1755/1756 | A122E/F160W/T161Q/R550M/L636Q | + |
1757/1758 | A122E/T161Q/R550Q | + |
1759/1760 | A122E/L282M/R550M/L636Q | ++ |
1761/1762 | A122E/Q381S/E706K | ++ |
1763/1764 | F160W/Q381S/R550Q/L636Q/A681V | +++ |
1765/1766 | R550M/L636Q | + |
1767/1768 | A122E/L282M/R550S | + |
1769/1770 | A122D/F160W/R550Q/L636Q | + |
1771/1772 | F160M/L282M | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1582之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.42倍;“++”=至少1.42倍,但小於1.60倍;以及“+++”=至少1.60倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第7輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A來形成甜菊糖苷D之活性。添加0.02 g/L濃度的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、7.5 mM甜菊糖苷A 97、30 mM蔗糖、0.2 mM ADP,及1 g/L GT序列辨識編號:2884。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1 h予以執行。藉由稀釋20x於水內來溶解反應,藉由添加10 μL稀釋的反應至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋4.4x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。至少3種變異體具有比序列辨識編號:1582更高的活性。該等變異體自甜菊糖苷A生產甜菊糖苷D相對於序列辨識編號:1582之位準係列於表34.2中。選擇相對於序列辨識編號:1582,帶有突變F160W、Q381S、R550Q、L636Q及A681V之變異體(序列辨識編號:1764),用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例35
序列辨識編號:1764之蔗糖合成酶變異體
表34.2 SUS第7輪SFP變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1582) | 增加的RebD a |
1599/1600 | L562I | + |
1615/1616 | P517A/T640N | + |
1763/1764 | F160W/Q381S/R550Q/L636Q/A681V | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1582之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產1.1及1.25倍之間更大的活性。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用之變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:1763編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第八及第九輪(“第8輪”及“第9輪”)具有生產ADP-葡萄糖之活性的24種經工程處理之SuS變異體多肽。
第8輪由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選組合庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解,以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物15x至Tris-HCl,pH 7.5。繼而,組合10 μL稀釋的SuS溶解產物及1 g/L GT序列辨識編號:2884(Rd9BB)於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A 97之受質裝載量及0.2 mM ADP(Sigma,>93%)及45 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,55℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。藉由添加10 μL的試料至390 μL水來溶解以上所述的反應,藉由添加20 μL溶解的試料至180 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。沒有辨識出相對於序列辨識編號:1764實質改良的組合變異體,所以使用相同的骨幹產生另一組組合及飽和致突變庫,且此組稱為“第9輪”。
第9輪由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選組合庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解,以及藉由離心使澄清。將未稀釋溶解產物(飽和致突變庫)或32x(第9輪組合庫)添加至Tris-HCl,pH 7.5。第9輪庫溶解產物在62℃預培育1 h(組合庫)或3.75 h(飽和致突變庫)以熱挑戰該酵素。繼而,組合10 μL稀釋的SuS溶解產物及1 g/L GT序列辨識編號:3244(Rd12B)於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A 97之受質裝載量、0.2 mM ADP(Sigma,>95%)、45 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9 mM果糖(Sigma)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2-3 h。藉由添加10 μL的試料至390 μL水來溶解以上所述的反應,藉由添加20 μL溶解的試料至180 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出24種經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性。生成的經工程處理之多肽列於表35.1中。帶有表35.2中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例31所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表35.1 SUS第9輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1764) | 增加的RebD a |
1773/1774 | E536L | +++ |
1775/1776 | H705P | ++ |
1777/1778 | L580M | + |
1779/1780 | H699F | +++ |
1781/1782 | N347R/S532Y | +++ |
1783/1784 | H705M | + |
1785/1786 | A548P | ++ |
1787/1788 | V681A | +++ |
1789/1790 | L407I/R570H/V681A | + |
1791/1792 | V270L/V681A | ++ |
1793/1794 | G117E/A122D/V270L/L540M/V681A | + |
1795/1796 | L407T/V681A | ++ |
1797/1798 | E536L/H705M | + |
1799/1800 | A548P/L580M | + |
1801/1802 | N347R/E536L/A548P/H705P | ++ |
1803/1804 | G181N/A548P/H705P | +++ |
1805/1806 | A63I/E536L | + |
1807/1808 | A548P/H705P | + |
1809/1810 | L580M | + |
1811/1812 | E536L/A548P/H699F | + |
1813/1814 | G181N/E536L/A548P/H705M | + |
1815/1816 | G181N/E536L/A548P | ++ |
1817/1818 | E536L/A548P | + |
1819/1820 | E536L | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1764之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.5倍,但小於2.4倍; “++”=至少2.4倍,但小於3.0倍;以及“+++”=至少3.0倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第9輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A形成甜菊糖苷D之活性。添加0.006-0.2 g/L濃度的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊糖苷A (>97%純度)、45 mM蔗糖、9 mM果糖、0.2 mM ADP,及1 g/L GT序列辨識編號:3244。反應於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、於無預培育的情況下以300 RPM在50℃下搖動歷時2 h予以執行,或是SFP係以10x終濃度在62℃下於pH 6磷酸鉀緩衝劑內預培育歷時1 h,然後在60℃反應歷時2 h。藉由稀釋40x於水內來溶解反應,藉由稀釋10x至乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。表35.2中列出的全部8種變異體都具有比序列辨識編號:1764更高的活性。帶有相對於序列辨識編號:1764,突變G181N、A548P、H705P的變異體(序列辨識編號:1804),具有最有利的突變且被選擇用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例36
序列辨識編號:1804之蔗糖合成酶變異體
表35.2 SUS第9輪SFP變異體及RebD位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1764) | 增加的RebD,50℃ a | 增加的RebD,60℃ a |
1787/1788 | V681A | ++ | +++ |
1791/1792 | V270L/V681A | ++ | +++ |
1793/1794 | G117E/A122D/V270L/L540M/V681A | + | + |
1795/1796 | L407T/V681A | + | +++ |
1803/1804 | G181N/A548P/H705P | ++ | +++ |
1807/1808 | A548P/H705P | ++ | +++ |
1809/1810 | L580M | + | + |
1815/1816 | G181N/E536L/A548P | + | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1764之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.1倍,但小於1.7倍; “++”=生產至少1.7倍,但小於2.3倍;以及“+++”=生產至少2.3倍更大。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用之變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:1803編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第十輪(“第10輪”)具有增高的生產ADP-葡萄糖之活性的82種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5,加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物20x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,以及在64℃(組合庫)或65℃(飽和致突變庫)預培育15分鐘。繼而,10 μL稀釋的SuS溶解產物及0.5-1 g/L GT序列辨識編號:3696或3502,分別使用於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A(>97%純度)、0.2 mM ADP(Sigma,>93%)、45 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9 mM果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時3 h。藉由稀釋40x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋10x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性且列於表36.1中。帶有表36.2中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例31所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表36.1 SUS第10輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1804) | 增加的RebD a |
1821/1822 | N347R/Q550I/V681A | + |
1823/1824 | N347R/S532Y/Q550I/T640N/V681A/H699F | + |
1825/1826 | N347R/V681A | + |
1827/1828 | N347R/Y434H/P517A/L562I/T640N/V681A | + |
1829/1830 | N347R/P517A/S532Y/V681A | + |
1831/1832 | N347R/Y434H/V681A | + |
1833/1834 | E536L/L580M/V681A | + |
1835/1836 | N347R/Q550I/L580M/V681A | + |
1837/1838 | N347R/E536L/L562I/V681A | + |
1839/1840 | P517A/V681A | + |
1841/1842 | S532Y/V681A | + |
1843/1844 | Y434H/P517A/S532Y/V681A | + |
1845/1846 | N347R/Y434H/S532Y/L562I/T640N/V681A | + |
1847/1848 | L562I/V681A | + |
1849/1850 | N347R/Y434H/Q550I/L562I/V681A | + |
1851/1852 | A389G | ++ |
1853/1854 | S539A | +++ |
1855/1856 | L433K | ++ |
1857/1858 | R71Q | +++ |
1859/1860 | E87L | ++ |
1861/1862 | P13K | ++ |
1863/1864 | D765A | ++ |
1865/1866 | Q37R | ++ |
1867/1868 | R90H | ++ |
1869/1870 | D60L | + |
1871/1872 | S531T | ++ |
1873/1874 | Q37G | + |
1875/1876 | S539R | +++ |
1877/1878 | D17R | +++ |
1879/1880 | P535S | + |
1881/1882 | R606H | ++ |
1883/1884 | V98L | + |
1885/1886 | L388K | ++ |
1887/1888 | P57W | +++ |
1889/1890 | P535H | + |
1891/1892 | P13H | + |
1893/1894 | E727K | + |
1895/1896 | V85H | + |
1897/1898 | R606A | ++ |
1899/1900 | A789R | + |
1901/1902 | A789N | + |
1903/1904 | A18G | + |
1905/1906 | P13N | + |
1907/1908 | K415H | + |
1909/1910 | S531R | +++ |
1911/1912 | R711K | +++ |
1913/1914 | R606Q | ++ |
1915/1916 | R606L | + |
1917/1918 | R606M | ++ |
1919/1920 | R606I | + |
1921/1922 | D52P | +++ |
1923/1924 | D52W | + |
1925/1926 | S30H | + |
1927/1928 | E87H | ++ |
1929/1930 | A118N | ++ |
1931/1932 | Q769K | +++ |
1933/1934 | E129G | +++ |
1935/1936 | D52R | ++ |
1937/1938 | E99I | + |
1939/1940 | E129A | + |
1941/1942 | L433P | ++ |
1943/1944 | E748T | + |
1945/1946 | A164T | + |
1947/1948 | A707G | ++ |
1949/1950 | P57R | ++ |
1951/1952 | A608P | ++ |
1953/1954 | A118G | + |
1955/1956 | P535A | + |
1957/1958 | D180P | + |
1959/1960 | Q769R | + |
1961/1962 | N183P | +++ |
1963/1964 | R71G | ++ |
1965/1966 | R606V | ++ |
1967/1968 | E129T | +++ |
1969/1970 | A164S | ++ |
1971/1972 | L388R | ++ |
1973/1974 | H365W | + |
1975/1976 | D52G | +++ |
1977/1978 | G589S | +++ |
1979/1980 | E738S | +++ |
1981/1982 | D765S | +++ |
1983/1984 | S531A | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1804之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.3倍,但小於2倍; “++”=至少2倍,但小於2.36倍;以及“+++”=至少2.36倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第10輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A形成甜菊糖苷D之活性。搖動燒瓶粉末(SFP)被製成0.06-2 g/L配於pH 6之磷酸鉀緩衝劑內,且一等分試樣於一種熱循環儀內以64 ℃預培育歷時15分鐘。繼而,此等SFP 10 µL稀釋物,不論是經預培育或是未經預培育,添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM 甜菊糖苷A(>97%純度)、45 mM蔗糖、9 mM果糖、0.2 mM ADP,及1 g/L GT序列辨識編號:3696。於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時3 h來執行反應,未經預培育的SFP樣本於55℃下以及經預培育的SFP於60℃下進行。藉由稀釋40x於水內來溶解反應,藉由稀釋10x至乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。表36.2中列出的所有7種變異體於預培育條件下具有比序列辨識編號:1804更高的活性,以及於55℃條件下除了一個以外全體也具有更高的活性。帶有相對於序列辨識編號:1804,突變P517A及V681A的變異體(序列辨識編號:1840)是兩種條件下改良得最好的,是以其被選擇用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例37
序列辨識編號:1840之蔗糖合成酶變異體
表36.2 SUS第10輪SFP變異體及RebD位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1804) | 增加的RebD 55 ℃ a | 增加的RebD 60 ℃ a |
1821/1822 | N347R/Q550I/V681A | + | ++ |
1823/1824 | N347R/S532Y/Q550I/T640N/V681A/H699F | - | + |
1827/1828 | N347R/Y434H/P517A/L562I/T640N/V681A | + | ++ |
1831/1832 | N347R/Y434H/V681A | + | ++ |
1837/1838 | N347R/E536L/L562I/V681A | + | ++ |
1839/1840 | P517A/V681A | ++ | +++ |
1845/1846 | N347R/Y434H/S532Y/L562I/T640N/V681A | + | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1804之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準; “+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.5倍;“++”=生產至少1.5倍,但小於2倍;以及“+++”=生產至少2倍更大。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用之變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:1839編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第十一輪(“第11輪”)具有增高的生產ADP-葡萄糖之活性的167種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5,加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解,以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物10-20x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,以及在66℃預培育15分鐘。繼而,10 μL稀釋、預培育的SuS溶解產物及0.5 g/L GT序列辨識編號:3696或3956,使用於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A(>97%純度)、0.2 mM ADP(Amresco,>93%)、45 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9 mM果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。藉由稀釋40x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5-10x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋於水內達~10 µM甜菊糖且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性且列於表37.1及37.2中。帶有表37.3中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例31所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表37.1 SUS第11輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1840) | 增加的RebD a |
1985/1986 | D17R/E129T/G589S | + |
1987/1988 | D17R/G589S/E738S | ++ |
1989/1990 | D17R/E129T/G589S/E738S | + |
1991/1992 | D17R/E129T/G589S/E738S/D765S | +++ |
1993/1994 | D52P/E129T/G589S/E738S/D765S | +++ |
1995/1996 | D52P/E129T/E738S | + |
1997/1998 | D52P/A118N/E129T/D765S | + |
1999/2000 | D17R/D52P/E87H/G589S/E738S/D765S | +++ |
2001/2002 | E87H/E129T/L388K/G589S | + |
2003/2004 | D17R/D52G/E129T/R653H/E738S/D765S | + |
2005/2006 | D17R/E738S/D765S | + |
2007/2008 | D17R/D52G/E87H/E129T/L388K/G589S/E738S | ++ |
2009/2010 | D17R/L388K/G589S/E738S | ++ |
2011/2012 | D17R/D52P/E129T/E738S | ++ |
2013/2014 | D17R/D52P/E129T/G589S/D765S | ++ |
2015/2016 | D17R/D52P/E87H/E129G/L388K/G589S | +++ |
2017/2018 | D52G/A118N/L388K/G589S/E738S | +++ |
2019/2020 | D52P/E87H/A118N/E129T/L388K/D765S | ++ |
2021/2022 | D52G/G84A/E129T/L388K/E738S/D765S | + |
2023/2024 | D17R/D52P/A118N/E129T/S265T/G589S/D765S | ++ |
2025/2026 | D17R/D52P/A118N/L388K/G589S/E738S/D765S | +++ |
2027/2028 | D17R/D52G/E129G/G589S/E738S | + |
2029/2030 | D17R/D52G/E129T/L388K/G589S/E738S | +++ |
2031/2032 | D17R/E87H/A118N/L388K/E738S | + |
2033/2034 | D52G/L388K/E738S/D765S | + |
2035/2036 | D17R/D52G/A118N/L388K/E738S/D765S | + |
2037/2038 | D17R/D52P/E129G/E738S/D765S | + |
2039/2040 | D17R/D52P/E87H/A118N/E129T/G589S/E738S/D765S | + |
2041/2042 | D52P/E87H/A118N/L388K/G589S/E738S | ++ |
2043/2044 | G84A/E129T/G589S/E738S/D765S | + |
2045/2046 | D17R/D52G/G589S/D765S | + |
2047/2048 | D17R/D52P/G589S/E738S/D765S | +++ |
2049/2050 | D17R/D52G/E87H/E129T/E738S | + |
2051/2052 | D17R/D52G/E87H/A118N/E129T/G589S/D765S | ++ |
2053/2054 | D17R/D52P/A118N/E129T/G589S/E738S/D765S | ++ |
2055/2056 | D52G/E87H/E738S | + |
2057/2058 | D17R/D52G/E87H/A118N/E129G/G589S/E738S | + |
2059/2060 | D17R/D52P/E129G/L388K/G589S/E738S/D765S | ++ |
2061/2062 | D17R/D52P/E87H/A118N/E129T/L388K/G589S/E738S/D765S | + |
2063/2064 | D17R/D52P/L388K/G589S/E738S/D765S | ++ |
2065/2066 | D17R/D52P/E87H/E129T/L388K/G589S/E738S | + |
2067/2068 | D52G/E87H/E129T/L388K/E738S/D765S | + |
2069/2070 | D17R/D52G/E87H/L388K/G589S/D765S | + |
2071/2072 | D17R/D52P/A118N/L388K/G589S/E738S | ++ |
2073/2074 | D17R/G589S/D765S | + |
2075/2076 | D52G/E87H/A118N/G589S/E738S/D765S | ++ |
2077/2078 | D52G/E738S/D765S | + |
2079/2080 | D52P/G589S/E738S/D765S | ++ |
2081/2082 | D52P/E87H/E129G/D765S | +++ |
2083/2084 | D17R/E129T/E738S/D765S | ++ |
2085/2086 | D17R/D52P/L388K/G589S/E738S | +++ |
2087/2088 | D17R/A118N/E129T/L388K/E738S/D765S | + |
2089/2090 | D52P/A118N/E129T/G589S/E738S | ++ |
2091/2092 | D52G/A118N/L388K/E738S/D765S | + |
2093/2094 | G589S/E738S/D765S | ++ |
2095/2096 | D17R/D52G/A118N/E129T/L388K/G589S/E738S/D765S | ++ |
2097/2098 | D52G/E129G/G589S/D765S | + |
2099/2100 | D52P/G589S/E738S | +++ |
2101/2102 | D52G/G589S/E738S/D765S | +++ |
2103/2104 | D52P/E87H/G589S/E738S | +++ |
2105/2106 | D17R/D52P/A118N/E129T/E738S/D765S | + |
2107/2108 | D17R/D52G/E129T/G589S | + |
2109/2110 | D17R/E87H/E129T/L388K/E738S | + |
2111/2112 | E87H/A118N/E129T/D765S | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1840之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少11倍,但小於14.9倍; “++”=至少14.9倍,但小於18.3倍;以及“+++”=至少18.3倍增加的生產。 |
表37.2 SUS第11輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1840) | 增加的RebD a |
2113/2114 | R14K | ++ |
2115/2116 | I480V | ++ |
2117/2118 | M263Y | ++ |
2119/2120 | D218V | + |
2121/2122 | H154A | +++ |
2123/2124 | G360R | + |
2125/2126 | E534W/E739K | +++ |
2127/2128 | G603H | + |
2129/2130 | E59N/D72N | ++ |
2131/2132 | Q33S | + |
2133/2134 | V134P | ++ |
2135/2136 | P81I | +++ |
2137/2138 | S393H | ++ |
2139/2140 | V134A | ++ |
2141/2142 | E390M | + |
2143/2144 | P364S | + |
2145/2146 | Y434R | + |
2147/2148 | W212Y | + |
2149/2150 | S15I | + |
2151/2152 | V316T | + |
2153/2154 | P530F | +++ |
2155/2156 | H92G | + |
2157/2158 | S175G | +++ |
2159/2160 | G652L | +++ |
2161/2162 | E534R | +++ |
2163/2164 | G603S | +++ |
2165/2166 | S26I | + |
2167/2168 | H154R | + |
2169/2170 | E105S | + |
2171/2172 | E59R | + |
2173/2174 | D130Y | +++ |
2175/2176 | F542W | ++ |
2177/2178 | S26E | + |
2179/2180 | S15P | + |
2181/2182 | W79Y | ++ |
2183/2184 | P81L | +++ |
2185/2186 | A165L | + |
2187/2188 | P81G | ++ |
2189/2190 | I362E | + |
2191/2192 | G603A | ++ |
2193/2194 | E534W | +++ |
2195/2196 | G652S | ++ |
2197/2198 | D218T | ++ |
2199/2200 | D218A | ++ |
2201/2202 | L20M | + |
2203/2204 | R319S | + |
2205/2206 | S15A | + |
2207/2208 | E59W | + |
2209/2210 | E59S | + |
2211/2212 | G652T | +++ |
2213/2214 | L241T | ++ |
2215/2216 | D218N | ++ |
2217/2218 | H154E | + |
2219/2220 | Y434G | ++ |
2221/2222 | Q46V | + |
2223/2224 | Q46R | + |
2225/2226 | W79H | ++ |
2227/2228 | G652K | +++ |
2229/2230 | Q33H/H154C | +++ |
2231/2232 | M263S | + |
2233/2234 | A165I | + |
2235/2236 | V93T | + |
2237/2238 | G603E | +++ |
2239/2240 | Q349R | ++ |
2241/2242 | I480P | ++ |
2243/2244 | E534L | +++ |
2245/2246 | E534G | +++ |
2247/2248 | E59C | + |
2249/2250 | A213V | + |
2251/2252 | Q33P | + |
2253/2254 | Q46T | + |
2255/2256 | E534K | +++ |
2257/2258 | E59A | ++ |
2259/2260 | Q46I | + |
2261/2262 | L58M | + |
2263/2264 | E534T | +++ |
2265/2266 | G50R | + |
2267/2268 | G652R | +++ |
2269/2270 | S256G | ++ |
2271/2272 | A97V/H154S | ++ |
2273/2274 | V316H | ++ |
2275/2276 | V24S | + |
2277/2278 | G360E | + |
2279/2280 | E498Q | + |
2281/2282 | G360D | + |
2283/2284 | Q349T | ++ |
2285/2286 | S175T | + |
2287/2288 | G603Q | ++ |
2289/2290 | A18V/I362A | ++ |
2291/2292 | H154S | + |
2293/2294 | D104T | + |
2295/2296 | S26A | ++ |
2297/2298 | Q46G | + |
2299/2300 | Q33L | + |
2301/2302 | D218S | ++ |
2303/2304 | A165T | + |
2305/2306 | Q349D | + |
2307/2308 | D54M | + |
2309/2310 | S26T | + |
2311/2312 | E498L | + |
2313/2314 | M185L | + |
2315/2316 | D218Q | ++ |
2317/2318 | E59V | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1840之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.2倍,但小於1.62倍;“++”=至少1.62倍,但小於2.4倍;以及“+++”=至少2.4倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第11輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A形成甜菊糖苷D之活性。搖動燒瓶粉末(SFP)被製成0.03-1 g/L配於pH 6之磷酸鉀緩衝劑內,且一等分試樣於一種熱循環儀內以66 ℃預培育歷時15分鐘。繼而,此等SFP 10 µL稀釋物,不論是經預培育或是未經預培育,添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM 甜菊糖苷A(>97%純度)、45 mM蔗糖、9 mM果糖、0.2 mM ADP,及0.5 g/L GT序列辨識編號:3956。於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時4 h來執行反應,未經預培育的SFP樣本於55℃下以及經預培育的SFP於60℃下進行。藉由稀釋40x於水內來溶解反應,藉由稀釋10x至乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。表37.3中列出的所有8種變異體於預培育條件下具有比序列辨識編號:1840更高的活性,以及除了三個以外全體也於55℃條件下具有更高的活性。帶有突變D17R、D52P、L388K、G589S、E738S及D765S的變異體(序列辨識編號:2064),其於兩種條件下相對於序列辨識編號:1840均有改良,被選擇用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例38
序列辨識編號:2064之蔗糖合成酶變異體
表37.3 SUS第11輪SFP變異體及RebD位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1840) | 增加的RebD,55℃ a | 增加的RebD,60℃ a |
1999/2000 | D17R/D52P/E87H/G589S/E738S/D765S | - | ++ |
2017/2018 | D52G/A118N/L388K/G589S/E738S | - | ++ |
2025/2026 | D17R/D52P/A118N/L388K/G589S/E738S/D765S | - | ++ |
2047/2048 | D17R/D52P/G589S/E738S/D765S | + | +++ |
2059/2060 | D17R/D52P/E129G/L388K/G589S/E738S/D765S | + | +++ |
2063/2064 | D17R/D52P/L388K/G589S/E738S/D765S | + | +++ |
2099/2100 | D52P/G589S/E738S | + | ++ |
2103/2104 | D52P/E87H/G589S/E738S | + | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1840之參考多肽來判定且定義如下:“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=生產至少2倍,但小於3.2倍;以及“+++”=生產比參考多肽的位準至少3.2倍更大。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用之變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:2063編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第十二輪(“第12輪”)具有增高的生產ADP-葡萄糖之活性的92種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5,加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解,以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物10x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,以及在68℃預培育15分鐘。繼而,10 μL稀釋、預培育的SuS溶解產物及0.5 g/L GT序列辨識編號:3956或4256使用於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A(>97%純度)、0.2 mM ADP(Amresco,>93%)、37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9 mM果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。藉由稀釋40x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋7.5x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性且列於表38.1及38.2中。帶有表38.3中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例31所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表38.1 SUS第12輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2064) | 增加的RebD a |
2319/2320 | P57W/S531R/S532Y/E536L/L562I | ++ |
2321/2322 | E129T/Q550I/L562I | + |
2323/2324 | R71Q/E129T/D180P/Y434H/S532Y/E536L/S539R/R711K/A789N | + |
2325/2326 | E87H/N347R/E536L/S539R/Q550I | + |
2327/2328 | P57W/N347R/Y434H/S531R/S532Y/S539R/A789N | + |
2329/2330 | P57W/E129G/E536L/R606M/A789N | + |
2331/2332 | R71Q/E129T/R606M | + |
2333/2334 | N347R/S531R/Q550I/R711K | ++ |
2335/2336 | P57W/E87H/N347R/L562I | + |
2337/2338 | N347R/E536L/L562I/R606M/E612A | + |
2339/2340 | E129T/E536L/S539R/L562I | + |
2341/2342 | S531R/S532Y/E536L/Q550I/L562I/R606M/A789N | + |
2343/2344 | E129T/D180P/Y434H/L562I/R711K/A789N | + |
2345/2346 | P57W/R90H/E129G/L562I | + |
2347/2348 | P57W/R71Q/E129G/S531R/S532Y/E536L/S539R/R606H | ++ |
2349/2350 | R90H/E129T/S539R/Q550I/R606H | + |
2351/2352 | R71Q/E129T/S531R | + |
2353/2354 | P57W/L562I/R606M/R711K | ++ |
2355/2356 | Y434H/S531R/S539R/Q550I/L562I/R711K | + |
2357/2358 | P57W/E129G/S531R/S539R/L562I/A789N | + |
2359/2360 | P57W/E129T/N347R/E536L/Q550I/L562I/R711K/A789N | + |
2361/2362 | P57W/E129T/R606M | + |
2363/2364 | E129T/D180P/R606M/R711K/A789N | + |
2365/2366 | P57W/R90H/E129T/L562I/R711K | ++ |
2367/2368 | E129G/Q550I | + |
2369/2370 | P57W/R71Q/L562I/R606M/R711K/A789N | + |
2371/2372 | E87H/G189D/S532Y/E536L/L562I/R711K/A789N | + |
2373/2374 | L562I/R711K | ++ |
2375/2376 | P57W/R71Q/E129T/D180P/Y434H/E536L/L562I | ++ |
2377/2378 | P57W/R71Q/E87H/N347R/Y434H/L562I/R606H | +++ |
2379/2380 | R71Q/E536L/S539R/L562I | +++ |
2381/2382 | P57W/E129T/N347R/Q550I/R711K | ++ |
2383/2384 | P57W/L96Q/E129T/D180P/S531R/S532Y/Q550I/L562I | ++ |
2385/2386 | E87H/N347R/S531R/R606M/A789N | + |
2387/2388 | D180P/S532Y | + |
2389/2390 | S531R/S532Y/E536L/S539R/L562I/R711K/A789N | +++ |
2391/2392 | R71Q/N347R/S532Y/Q550I/L562I/R711K | +++ |
2393/2394 | P57W/D180P/L562I/R606H/E612A | + |
2395/2396 | P57W/R71Q/A789N | + |
2397/2398 | P57W/Y434H/Q550I/L562I/R606H/E612A/A789N | ++ |
2399/2400 | P57W/E87H/D180P/S531R/S532Y/L562I/R606M/E612A/R711K | ++ |
2401/2402 | S531R/S532Y/L562I/R606H/R711K | ++ |
2403/2404 | E129G/L562I/R606M/R711K | +++ |
2405/2406 | P57W/R71Q/E129T/Y434H/S531R/E536L/L562I | +++ |
2407/2408 | N347R/Q550I/L562I/R606H | +++ |
2409/2410 | E129T/N347R/L562I | ++ |
2411/2412 | P57W/D180P/L562I | ++ |
2413/2414 | E129T/S539R/L562I/A789N | ++ |
2415/2416 | N347R/E536L/S539R/Q550I/R711K/A789N | ++ |
2417/2418 | D180P/Q550I/R606M | +++ |
2419/2420 | Y434H/Q550I | +++ |
2421/2422 | P57W/E129T/N347R/S531R/S532Y/S539R/L562I/R711K/A747V | + |
2423/2424 | R71Q/N347R/E536L/L562I/E612A/A789N | ++ |
2425/2426 | R71Q/E129T/D180P/N347R/S531R/S539R/Q550I | + |
2427/2428 | S532Y/S539R/Q550I | +++ |
2429/2430 | E129G/Q550I/L562I | +++ |
2431/2432 | P57W/L562I/R711K | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2064之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少15倍,但小於38.25倍;“++”=至少38.25倍,但小於50.3倍增加的生產;以及 “+++”=至少50.3倍增加的生產。 |
表38.2 SUS第12輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2064) | 增加的RebD a |
2433/2434 | V641L | + |
2435/2436 | L688H | + |
2437/2438 | Q487K | +++ |
2439/2440 | A41K | ++ |
2441/2442 | F684M | ++ |
2443/2444 | L186V | + |
2445/2446 | I91G | + |
2447/2448 | G112Q | ++ |
2449/2450 | V89M | + |
2451/2452 | Q487T | ++ |
2453/2454 | F684G | + |
2455/2456 | F684T | + |
2457/2458 | A25T/G112W | ++ |
2459/2460 | P226V | + |
2461/2462 | L764R | +++ |
2463/2464 | L688G | ++ |
2465/2466 | L688A | +++ |
2467/2468 | V763L | + |
2469/2470 | F684H | ++ |
2471/2472 | S330A | + |
2473/2474 | R21Q | + |
2475/2476 | G112R | + |
2477/2478 | D259G | + |
2479/2480 | V200A | + |
2481/2482 | Q487V | + |
2483/2484 | Q487R | ++ |
2485/2486 | L688Q | +++ |
2487/2488 | P318A | + |
2489/2490 | G485A | ++ |
2491/2492 | G485S | ++ |
2493/2494 | V89L | + |
2495/2496 | I91C | ++ |
2497/2498 | L688F | +++ |
2499/2500 | Q487I | +++ |
2501/2502 | S674A | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2064之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少2倍,但小於3.7倍;“++”=至少3.7倍,但小於6.4倍;以及“+++”=至少6.4倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第12輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A形成甜菊糖苷D之活性。搖動燒瓶粉末(SFP)被製成0.03-1 g/L配於pH 6之磷酸鉀緩衝劑內,且一等分試樣於一種熱循環儀內以68 ℃預培育歷時15分鐘。繼而,此等SFP 10 µL稀釋物,不論是經預培育或是未經預培育,添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM 甜菊糖苷A(>97%純度)、37.5 mM蔗糖、9 mM果糖、0.2 mM ADP,及0.5 g/L GT序列辨識編號:4256。於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時4 h來執行反應,未經預培育的SFP樣本於55℃下以及經預培育的SFP於60℃下進行。藉由稀釋40x於水內來溶解反應,藉由稀釋10x至乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。於冷凍乾燥之前,以澄清的搖動燒瓶溶解產物進行進一步熱穩定性特徵化如下:以緩衝劑溶解產物稀釋400x且於55-70℃梯度下於熱循環儀內培育歷時16-18 h。為了判定剩餘的活性%,預培育的溶解產物係如上所述以甜菊苷或甜菊糖苷D且於55℃下培育4 h予以檢定。剩餘的活性百分比表達為高溫下的活性除以最低的預培育溫度下的活性。表38.3中列出的所有7種變異體於預培育條件下具有比序列辨識編號:2064更高的活性,以及二種也於55℃條件下不那麼有害。帶有突變P57W、L562I及R711K的變異體(序列辨識編號:2432),其於所有條件下相對於序列辨識編號:2064均有改良且含有來自第10輪飽和致突變篩選最優良的突變,被選擇用於進一步的定向演化供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化。
實施例39
序列辨識編號:2432之蔗糖合成酶變異體
表38.3 SUS第12輪SFP變異體及RebD位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2064) | 增加的RebD,55 ℃ a | 增加的RebD,60 ℃ a | 剩餘的活性% b |
2333/2334 | N347R/S531R/Q550I/R711K | - | ++ | ++ |
2373/2374 | L562I/R711K | - | +++ | + |
2389/2390 | S531R/S532Y/E536L/S539R/L562I/R711K/A789N | - | ++ | ++ |
2405/2406 | P57W/R71Q/E129T/Y434H/S531R/E536L/L562I | - | ++ | +++ |
2427/2428 | S532Y/S539R/Q550I | + | +++ | ++ |
2429/2430 | E129G/Q550I/L562I | - | ++ | ++ |
2431/2432 | P57W/L562I/R711K | + | +++ | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2064之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準0.8倍;“+”=生產至少0.8倍,但小於1.2倍;“++”=生產至少1.2倍,但小於4.7倍;以及“+++”=生產至少4.7倍增加。 b各變異體剩餘的活性百分比係於65℃預培育16-18 h後,相對於各變異體於55℃預培育後的生產予以判定且定義如下:“-“= 小於55℃預培育後剩餘活性的55%; “+”=剩餘活性的至少55%,但小於活性的65%;“++”=剩餘活性的至少65%,但小於活性的75%;以及“+++”=剩餘活性的至少75%。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的活性有關的突變重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用之變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:2431編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第十三輪(“第13輪”)具有增高的生產ADP-葡萄糖之活性的46種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5,加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。於組合庫方面,稀釋溶解產物10x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,以及在73℃預培育15分鐘。於飽和致突變庫方面,稀釋溶解產物20x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,以及在62℃預培育17.5小時。繼而,10 μL稀釋、預培育的SuS溶解產物及0.5 g/L GT序列辨識編號:4256或4550使用於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A(>97%純度)、0.2 mM ADP(Amresco,>93%)、37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9 mM果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時3-4 h。藉由稀釋40x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋7.5x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性且列於表39.1及39.2中。帶有表39.3中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例31所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表39.1 SUS第13輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2432) | 增加的RebD a |
2503/2504 | Q33H/H154A/I480P/P530F/E534W/G603Q/R606M | + |
2505/2506 | L58M/E59A/W79H/S175G/I480P/E534W/Q550I/G652R | + |
2507/2508 | Q33H/L58M/E59A/P81G/D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I/G652K | ++ |
2509/2510 | Q33H/L47P/E59A/P81L/S175G/P530F/E534W/Q550I/R606M | +++ |
2511/2512 | Q33H/D130Y/P530F/E534W/Q550I | + |
2513/2514 | Q33H/L58M/E59A/I480P/P530F/E534W/Q550I | ++ |
2515/2516 | E59A/H154A/P530F/E534W/Q550I | + |
2517/2518 | Q33H/W79H/P81L/S175G/P530F/E534W/G603Q | + |
2519/2520 | Q33H/L58M/H154A/I480P/E534W/Q550I/G603A/R606M | ++ |
2521/2522 | Q33H/P81G/D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I | ++ |
2523/2524 | Q33H/W79H/P81G/S175G/P530F/E534W | + |
2525/2526 | P81G/I480V/P530F/E534W/Q550I | + |
2527/2528 | Q33H/E59A/I480P/P530F/E534W/Q550I/R606M | +++ |
2529/2530 | Q33H/H154A/E534W | + |
2531/2532 | W79H/P81I/I480P/P530F/E534W/Q550I/G603E/R606M/G652R | ++ |
2533/2534 | Q33H/W79H/H154A/I480P/P530F/E534W/Q550I | ++ |
2535/2536 | Q33H/P530F/E534W/Q550I | + |
2537/2538 | D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I/G603Q/R606M | + |
2539/2540 | Q33H/P81I/S175G/P530F/E534W/F542W/Q550I/G652R | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2432之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.2倍,但小於5.2倍;“++”=至少5.2倍,但小於30倍;以及“+++”=至少30倍增加的生產。 |
表39.2 SUS第13輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2432) | 增加的RebD a |
2541/2542 | L561I | +++ |
2543/2544 | D42H | + |
2545/2546 | V267I | + |
2547/2548 | T410S | ++ |
2549/2550 | F70R | ++ |
2551/2552 | F70V | + |
2553/2554 | T199A | ++ |
2555/2556 | D42S | ++ |
2557/2558 | A380T | + |
2559/2560 | G758R | + |
2561/2562 | A25G | + |
2563/2564 | A25E | ++ |
2565/2566 | D42T | +++ |
2567/2568 | F70S | + |
2569/2570 | S265A | + |
2571/2572 | F77W | ++ |
2573/2574 | M75T | + |
2575/2576 | F77L | ++ |
2577/2578 | M75W | + |
2579/2580 | F70H | + |
2581/2582 | A25L | + |
2583/2584 | L561V | +++ |
2585/2586 | Y106W | +++ |
2587/2588 | F70N | +++ |
2589/2590 | A642V | + |
2591/2592 | G758Q | ++ |
2593/2594 | S265Q | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2432之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.08倍;“++”=至少1.08倍,但小於1.16倍;以及“+++”=至少1.16倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第13輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A來形成甜菊糖苷D之活性。搖動燒瓶粉末(SFP)被製成0.03-1 g/L配於pH 6之磷酸鉀緩衝劑內,且一等分試樣於一種熱循環儀內以73 ℃預培育歷時15分鐘。繼而,此等SFP 10 µL稀釋物,不論是經預培育或是未經預培育,添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM 甜菊糖苷A(>97%純度)、37.5 mM蔗糖、9 mM果糖、0.2 mM ADP,及0.5 g/L GT序列辨識編號:4550。於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時4 h來執行反應,未經預培育的SFP樣本於55℃下以及經預培育的SFP樣本於60℃下進行。藉由稀釋40x於水內來溶解反應,藉由稀釋5x至乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋3.3x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來分析甜菊糖。於冷凍乾燥之前,以澄清的搖動燒瓶溶解產物進行進一步熱穩定性特徵化如下:以緩衝劑溶解產物稀釋400x且於62-78℃梯度下於熱循環儀內培育歷時16.7 h。為了判定剩餘的活性百分比,預培育的溶解產物係如上所述以甜菊苷或甜菊糖苷D且於60℃下培育4 h予以檢定。剩餘的活性百分比表達為高溫下的活性除以最低的預培育溫度下的活性。表39.3中列出的所有8種變異體在至少一種條件下具有比序列辨識編號:2432更高的活性,以及5種於所有條件下均有改良。帶有突變Q33H、L47P、E59A、P81L、S175G、P530F、E534W、Q550I及R606M的變異體(序列辨識編號:2510),其於所有條件下相對於序列辨識編號:2432均有改良,被選擇為供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化最佳的酵素。
實施例40
序列辨識編號:2510之蔗糖合成酶變異體
表39.3 SUS第13輪SFP變異體及RebD位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2432) | 增加的RebD,55℃ a | 增加的RebD,60℃ a | 剩餘的活性% b |
2507/2508 | Q33H/L58M/E59A/P81G/D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I/G652K | - | +++ | +++ |
2509/2510 | Q33H/L47P/E59A/P81L/S175G/P530F/E534W/Q550I/R606M | + | ++ | ++ |
2513/2514 | Q33H/L58M/E59A/I480P/P530F/E534W/Q550I | + | + | + |
2519/2520 | Q33H/L58M/H154A/I480P/E534W/Q550I/G603A/R606M | + | - | + |
2521/2522 | Q33H/P81G/D130Y/I480V/P530F/E534W/Q550I | - | + | ++ |
2527/2528 | Q33H/E59A/I480P/P530F/E534W/Q550I/R606M | + | ++ | + |
2533/2534 | Q33H/W79H/H154A/I480P/P530F/E534W/Q550I | + | + | +++ |
2539/2540 | Q33H/P81I/S175G/P530F/E534W/F542W/Q550I/G652R | + | +++ | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2432之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.6倍;“++”=生產至少1.6倍,但小於3.7倍;以及“+++”=生產至少3.7倍增加。 b各變異體剩餘的活性百分比係於66.5℃預培育16.7 h後,相對於各變異體於62℃預培育後的生產予以判定,且定義如下:“-“= 小於62℃預培育後剩餘活性的40%;“+”=剩餘活性的至少40%,但小於活性的60%;“++”=剩餘活性的至少60%,但小於活性的70%;以及“+++”=剩餘活性的至少70%。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的生產有關的突變重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用之變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:2509編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第十四輪(“第14輪”)具有增高的生產ADP-葡萄糖之活性的164種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A 60以形成甜菊糖苷M之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5,加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物35x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,加上14.5 g/L RebA60以及在73℃預培育15分鐘。繼而,10 µL稀釋預培育的SuS溶解產物,0.08 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:4550,及0.2 g/L β1,3GT SFP序列辨識編號:6864使用於100 μL反應體積內加上20 g/L RebA60、0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)、40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9.6 g/L果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋40x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋15x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性且列於表40.1及40.2中。帶有表40.3中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例1所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A 60以形成甜菊糖苷M之分析
表40.1 SUS第14輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2510) | 增加的RebM a |
7437/7438 | D259G/Q487I/F684M/L688G | + |
7439/7440 | A41K/R71Q/S532Y/F684H | +++ |
7441/7442 | A41K/G485A/Q487K | +++ |
7443/7444 | A41K/I91C/G485S | + |
7445/7446 | S532Y | ++ |
7447/7448 | G112W | + |
7449/7450 | A41K/G485A/S532Y/L688G | + |
7451/7452 | F684H | ++ |
7453/7454 | A41K/G112Q/Q487I/F684H | +++ |
7455/7456 | G112Q | ++ |
7457/7458 | G485A/F684H/L688G | + |
7459/7460 | A41K/R71Q | + |
7461/7462 | A41K/D259G/S532Y | + |
7463/7464 | A41K/G485S/Q487I/F684M/L688G | + |
7465/7466 | A41K/G112W | + |
7467/7468 | G112Q/D259G/S532Y/F684M/L688G | + |
7469/7470 | A41K/S532Y | ++ |
7471/7472 | A41K/R71Q/G112Q/D259G/G485A/L688Q | ++ |
7473/7474 | G485A/S532Y | +++ |
7475/7476 | R71Q/F684M/L688A | + |
7477/7478 | A41K/D259G/G485A/Q487R/F684H/L688A | ++ |
7479/7480 | S532Y/F684H/L688Q | + |
7481/7482 | A41K | ++ |
7483/7484 | G485S/Q487I/F684H/L688Q | + |
7485/7486 | A41K/G485A/Q487R | ++ |
7487/7488 | G112Q/G485S/F684H/L688G | + |
7489/7490 | D259G/S532Y | + |
7491/7492 | A41K/G112Q/F684H/L688A | + |
7493/7494 | A41K/G485A | ++ |
7495/7496 | A41K/R71Q/Q487R | + |
7497/7498 | A41K/R71Q/F684H | + |
7499/7500 | A41K/R71Q/G485A | ++ |
7501/7502 | A41K/D259G/G485A/Q487I | + |
7503/7504 | A41K/D259G/G485S | + |
7505/7506 | A41K/G112Q/G485S/F684H | ++ |
7507/7508 | R71Q/G485S/F684M/L688Q | + |
7509/7510 | G485A/Q487R | + |
7511/7512 | A41K/R71Q/G112Q | +++ |
7513/7514 | G485S/Q487I/F684M | + |
7515/7516 | G485S | +++ |
7517/7518 | A41K/G84A/D259G/G485A/Q487I | + |
7519/7520 | G485S/Q487K/S532Y | +++ |
7521/7522 | R71Q/S532Y | ++ |
7523/7524 | A41K/Q487R/F684M | ++ |
7525/7526 | G112Q/G485S/F684M/L688G | + |
7527/7528 | G112Q/D259G/F684M/L688Q | + |
7529/7530 | A41K/R71Q/D259G/G485A/S532Y | ++ |
7531/7532 | A41K/G112Q/S532Y | ++ |
7533/7534 | A41K/F684M/L688A | + |
7535/7536 | G485A | ++ |
7537/7538 | G485S/Q487R/S532Y/F684H | ++ |
7539/7540 | D259G/G485S/Q487K/F684H | +++ |
7541/7542 | R71Q/G112W/G485S/L688A | ++ |
7543/7544 | R71Q/G112Q/D259G/G485A/Q487R/F684M | + |
7545/7546 | A41K/R71Q/S532Y | +++ |
7547/7548 | G112W/D259G | +++ |
7549/7550 | A41K/G485A/S532Y | +++ |
7551/7552 | A41K/I91C/G112Q/G485S/Q487K/S532Y/F684H | + |
7553/7554 | A41K/Q487I/F684M | ++ |
7555/7556 | A41K/R71Q/G485A/S532Y/F684H | +++ |
7557/7558 | A41K/G112Q/D259G/Q487R/S532Y/F684H | +++ |
7559/7560 | A41K/G112Q/D259G/G485S/Q487R | ++ |
7561/7562 | D259G/G485S/S532Y | ++ |
7563/7564 | A41K/F684H | + |
7565/7566 | G485S/F684M/L688G | + |
7567/7568 | A41K/D259G/G485A/Q487R/S532Y/F684H | + |
7569/7570 | A41K/G485S/F684M/L688A | ++ |
7571/7572 | A41K/I91C/G112Q/G485S/S532Y/F684H | + |
7573/7574 | A41K/R71Q/Q487R/S532Y/F684H | +++ |
7575/7576 | G112Q/G485S/F684H | +++ |
7577/7578 | A41K/I91C/G112Q/G485S | + |
7579/7580 | G485A/F684M | + |
7581/7582 | R44C/G112W/F684H/L688A | + |
7583/7584 | P226V/Q487I/F684M/L688A | + |
7585/7586 | A41K/R71Q/G112W/D259G/G485S/Q487R/F684H/L688Q | ++ |
7587/7588 | F684M/L688Q | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2510之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.5倍,但小於2.9倍;“++”=至少2.9倍,但小於4.2倍;以及“+++”=至少4.2倍增加的生產。 |
表40.2 SUS第14輪飽和致突變變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2510) | 增加的RebM a |
7589/7590 | R136A | ++ |
7591/7592 | R615L | ++ |
7593/7594 | H343N | + |
7595/7596 | E45C | + |
7597/7598 | D12C | + |
7599/7600 | D72E | + |
7601/7602 | D12V | +++ |
7603/7604 | R478I | + |
7605/7606 | D12S | +++ |
7607/7608 | P48V | + |
7609/7610 | L176M | ++ |
7611/7612 | H343A | + |
7613/7614 | E45G | + |
7615/7616 | R136Q | ++ |
7617/7618 | D12Q | ++ |
7619/7620 | T205S | + |
7621/7622 | Q95V | ++ |
7623/7624 | H788K | ++ |
7625/7626 | E358P | + |
7627/7628 | D29G | + |
7629/7630 | Q7K/D12L | ++ |
7631/7632 | E100K | +++ |
7633/7634 | L630M | +++ |
7635/7636 | H724S | ++ |
7637/7638 | P47I | +++ |
7639/7640 | Q95N | + |
7641/7642 | I55D | ++ |
7643/7644 | P47V | + |
7645/7646 | R615K | + |
7647/7648 | R136P | +++ |
7649/7650 | R478H | ++ |
7651/7652 | E45V | ++ |
7653/7654 | D12N | +++ |
7655/7656 | R44V | + |
7657/7658 | L176R | + |
7659/7660 | R361A | + |
7661/7662 | R44L | + |
7663/7664 | R361L | + |
7665/7666 | D29P | +++ |
7667/7668 | R136K | + |
7669/7670 | P440R | ++ |
7671/7672 | L176V | + |
7673/7674 | P47C | + |
7675/7676 | E45A | +++ |
7677/7678 | L116A | ++ |
7679/7680 | R303V | + |
7681/7682 | Q27R | + |
7683/7684 | R611A | +++ |
7685/7686 | Q95T | +++ |
7687/7688 | E45L | ++ |
7689/7690 | R615C | + |
7691/7692 | D29A | ++ |
7693/7694 | P47N | + |
7695/7696 | R178H | + |
7697/7698 | H724G | ++ |
7699/7700 | R136F | +++ |
7701/7702 | P47T | + |
7703/7704 | P47L | +++ |
7705/7706 | Q95L | + |
7707/7708 | Q95D | ++ |
7709/7710 | D29L | +++ |
7711/7712 | R361T | + |
7713/7714 | L176T | + |
7715/7716 | E100P | ++ |
7717/7718 | E100Q | + |
7719/7720 | S675C | +++ |
7721/7722 | T205R/G485S | + |
7723/7724 | V756C | ++ |
7725/7726 | H724K | ++ |
7727/7728 | P47D | + |
7729/7730 | P207K | + |
7731/7732 | Q198A | + |
7733/7734 | Y51P | + |
7735/7736 | P48A | + |
7737/7738 | Q198R | ++ |
7739/7740 | I55S | + |
7741/7742 | R136N | ++ |
7743/7744 | Y51S | ++ |
7745/7746 | Q201S | + |
7747/7748 | R139K | ++ |
7749/7750 | E358S | +++ |
7751/7752 | E317I | + |
7753/7754 | R208K | + |
7755/7756 | R615M | +++ |
7757/7758 | K280G | + |
7759/7760 | E45S | ++ |
7761/7762 | L116F | +++ |
7763/7764 | R478Q | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2510之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.5倍,但小於1.92倍;“++”=至少1.92倍,但小於2.6倍;以及“+++”=至少2.6倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第14輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A形成甜菊糖苷D之活性。搖動燒瓶粉末(SFP)被製成0.03-1 g/L以14.5 g/L RebA60配於磷酸鉀緩衝劑,pH 6,且一等分試樣於一種熱循環儀內以73 ℃預培育歷時15分鐘。繼而,10 µL稀釋、預培育的SuS溶解產物,0.08 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:4550,及0.2 g/L β1,3GT SFP序列辨識編號:6864,使用於100 μL反應體積內加上20 g/L RebA60、0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)、40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9.6 g/L果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋40x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋15x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。表40.3中列出的所有8種變異體具有比序列辨識編號:2510更高的活性。帶有突變A41K、G112Q、G485S及F684H的變異體(序列辨識編號:7506),其相對於序列辨識編號:2510改良得最好,被選擇為供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化最佳的酵素。
實施例41
序列辨識編號:7506之蔗糖合成酶變異體
表40.3 SUS第14輪SFP變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2510) | 增加的RebM a |
7439/7440 | A41K/R71Q/S532Y/F684H | +++ |
7453/7454 | A41K/G112Q/Q487I/F684H | ++ |
7493/7494 | A41K/G485A | + |
7505/7506 | A41K/G112Q/G485S/F684H | +++ |
7515/7516 | G485S | + |
7549/7550 | A41K/G485A/S532Y | ++ |
7555/7556 | A41K/R71Q/G485A/S532Y/F684H | + |
7575/7576 | G112Q/G485S/F684H | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2510之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少2.1倍,但小於2.85倍;“++”=生產至少2.85倍,但小於3.1倍;以及“+++”=生產至少3.1倍增加。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的生產有關的突變重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用之變異體基因庫,來繼續序列辨識編號:7505編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第十五輪(“第15輪”)具有增高的生產ADP-葡萄糖之活性的56種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A 60以形成甜菊糖苷M之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物50x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,加上14.5 g/L RebA60以及在73℃預培育15分鐘。繼而,10 µL稀釋、預培育的SuS溶解產物,0.08 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:4550,及0.2 g/L β1,3GT SFP序列辨識編號:6864,使用於100 μL反應體積內加上20 g/L RebA60、0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)、40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9.6 g/L果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋20x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋20x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性且列於表41.1中。帶有表41.2中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例1所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A 60以形成甜菊糖苷M之分析
表41.1 SUS第15輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7506) | 增加的RebM a |
8369/8370 | D12N/E45A/P47I/Y51P/R136P/R139K/L630M/G758R | ++ |
8371/8372 | D12N/E45A/Y51P/R136P/R139K/L630M/S675C/V756C/G758Q | +++ |
8373/8374 | D12S/E45A/Y51P/L630M/V756C | ++ |
8375/8376 | R136P/R139K/S142N | ++ |
8377/8378 | D12N/R136Q/S142N | +++ |
8379/8380 | D12V/E45A/P47I/R136Q/R139K/S142N/S675C/G758Q | +++ |
8381/8382 | D12V/E45A/P47L | +++ |
8383/8384 | D12V/R136Q/R139K/S142N/V756C/G758Q | +++ |
8385/8386 | D12S/L630M/V756C | ++ |
8387/8388 | D12N/P48A/Y51P/R136Q/R139K/G758Q | +++ |
8389/8390 | D12V/E45A/P47I/P48A/Y51S/R136Q/S142N/L630M | +++ |
8391/8392 | P47I/Y51S/R136Q/V756C/G758Q | ++ |
8393/8394 | T199A/S532Y/S539R/L561I/G652R/H724S | + |
8395/8396 | S532Y/L561I/H724K | + |
8397/8398 | Q198R/I480P/L561I | ++ |
8399/8400 | Q198R/T199A/L561V/H724G | +++ |
8401/8402 | D42T/Q198R/S532Y/L561I/H724K | ++ |
8403/8404 | Y106W/T199A/S539R/L561I/G652R | ++ |
8405/8406 | I480V/L561V/G652R | ++ |
8407/8408 | Q198R/I480V/H724K | ++ |
8409/8410 | D42T/Q198R/S532Y/L561V | ++ |
8411/8412 | D42T/D259G/I480V/L561V | + |
8413/8414 | Q198R/T199A/I480P/L561I | ++ |
8415/8416 | S532Y/S539R/L561V | + |
8417/8418 | D42T/Q198R/T199A/I480V/S532Y/S539R/L561V | +++ |
8419/8420 | D42T/I480V/L561I/H724K | +++ |
8421/8422 | D42T/I480P/L561I | ++ |
8423/8424 | D42T/L561I | ++ |
8425/8426 | D259G/I480V | + |
8427/8428 | I480V/L561V/G652R/H724K/L764R | + |
8429/8430 | I480V/H724K | ++ |
8431/8432 | Q198R/T199A/I480P/L561V/H724K | ++ |
8433/8434 | D42T/D259G/I480V/G652K | + |
8435/8436 | D42T/T199A/I480V/S532Y/L561V | +++ |
8437/8438 | A25E/A517P | + |
8439/8440 | H154A/R361T/P440R/A517P/G603E/H788K | + |
8441/8442 | Q95T/G603E | + |
8443/8444 | A25E/E100K/H154A/R208K/P440R/A517P/P705M/H788K | + |
8445/8446 | A25E/D29P/R208K/P440R | + |
8447/8448 | K280G/P440R/A517P | + |
8449/8450 | A517P | + |
8451/8452 | I55D/A517P/H788K | ++ |
8453/8454 | I55D/A517P | + |
8455/8456 | I55D | + |
8457/8458 | Q8R/A25E/I55D/Q95T/R208K/E358S/P440V/A517P/H788K | + |
8459/8460 | D29P/R208K/R361T/A517P/H788K | + |
8461/8462 | G603E | + |
8463/8464 | I55D/T410S/P440R/G603E/H788K | + |
8465/8466 | A642V | + |
8467/8468 | F77L/L176M/Q487K/R615M/A642V | + |
8469/8470 | F70N/A642V | + |
8471/8472 | L116F | + |
8473/8474 | A380T | + |
8475/8476 | L176T | + |
8477/8478 | F70N | + |
8479/8480 | V267I/R611Q/A642V | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7506之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.07倍,但小於1.95倍;“++”=至少1.95倍,但小於2.4倍;以及“+++”=至少2.4倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第15輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A形成甜菊糖苷D之活性。搖動燒瓶粉末(SFP)被製成0.03-1 g/L以14.5 g/L RebA60配於磷酸鉀緩衝劑,pH 6,且一等分試樣於一種熱循環儀內以73 ℃預培育歷時15分鐘。10 µL稀釋、預培育的SuS溶解產物,0.08 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:4550,及0.2 g/L β1,3GT SFP序列辨識編號:6864,使用於100 μL反應體積內加上20 g/L RebA60、0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)、40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9.6 g/L果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋20x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋20x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。表41.2中列出的所有8種變異體具有比序列辨識編號:7506更高的活性。帶有突變D42T、I480V、L561I及H724K的變異體(序列辨識編號:8420),其相對於序列辨識編號:7506改良得最好,被選擇為供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化最佳的酵素。
實施例42
序列辨識編號:8420之蔗糖合成酶變異體
表41.2 SUS第15輪SFP變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7506) | 增加的RebM a |
8371/8372 | D12N/E45A/Y51P/R136P/R139K/L630M/S675C/V756C/G758Q | + |
8383/8384 | D12V/R136Q/R139K/S142N/V756C/G758Q | + |
8389/8390 | D12V/E45A/P47I/P48A/Y51S/R136Q/S142N/L630M | ++ |
8399/8400 | Q198R/T199A/L561V/H724G | + |
8419/8420 | D42T/I480V/L561I/H724K | +++ |
8439/8440 | H154A/R361T/P440R/A517P/G603E/H788K | +++ |
8451/8452 | I55D/A517P/H788K | ++ |
8475/8476 | L176T | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7506之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少2.1倍,但小於2.2倍;“++”=生產至少2.2倍,但小於2.3倍;以及“+++”=至少2.3倍增加。 |
藉由建構與前幾輪演化中改良的生產有關的突變重組之變異體基因庫來繼續序列辨識編號:8419編碼之蔗糖合成酶的定向演化。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選,以提供第十六輪(“第16輪”)具有增高的生產ADP-葡萄糖之活性的155種經工程處理之SuS變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A 60以形成甜菊糖苷M之HTP偶聯檢定
利用下列HTP酵素偶聯檢定來篩選基因庫。粒狀大腸桿菌培養物係用400 µL的Tris-HCl、pH 7.5加上1 mM硫酸鎂及0.5 mg/mL溶菌酶及硫酸多黏菌素B(PMBS)予以溶解以及藉由離心使澄清。稀釋溶解產物30x至磷酸鉀緩衝劑內,pH 6.0,加上14.5 g/L RebA60以及在75℃預培育1小時。繼而,10 μL稀釋、預培育的SuS溶解產物、0.08 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:7784,及0.2 g/L β1,3GT SFP序列辨識編號:8088,使用於100 μL反應體積加上20 g/L RebA60、0.025 g/L ADP(安瑞司科,超純級)、40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9.6 g/L果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋20x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋20x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。分析之後,辨識出經工程處理之SuS變異體多肽其顯示與GT對於甜菊糖苷A偶聯的改良活性且列於表42.1中。帶有表42.2中顯示的胺基酸突變之變異體係如實施例1所述以搖動燒瓶規模培養物生長供用於蛋白質特徵化。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A 60以形成甜菊糖苷M之分析
表42.1 SUS第16輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:8420) | 增加的RebM a |
8797/8798 | D12S/E45A/L176T/G603Q/L630M/A642V/V756C | + |
8799/8800 | D12N/T199A/R208K/A517P/A642V | + |
8801/8802 | D12N/E45A/R136Q/R208K/A517P/L630M/V756C | +++ |
8803/8804 | D12S/R139K/G603Q/V756C | + |
8805/8806 | R136Q/R139K/G603Q | + |
8807/8808 | R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C | +++ |
8809/8810 | D12S/R136Q/T199A/R208K/L630M/A642V | ++ |
8811/8812 | D12S/R136Q/R139K/R208K/A517P | ++ |
8813/8814 | D12N/E45A/R136Q/R139K/A642V/V756C | ++ |
8815/8816 | D12S/R139K/L176T/L630M/V756C | + |
8817/8818 | D12S/R136Q/A517P/G603Q/L630M/A642V | ++ |
8819/8820 | D12S/R136Q/R139K/L176T/V756C | + |
8821/8822 | D12N/E45A/R136Q/A517P/L630M/A642V/V756C | +++ |
8823/8824 | D12N/E45A/R136Q/G603E/V756C | + |
8825/8826 | D12S/E45A/R136Q/R139K/R208K/G603E/L630M/V756C | ++ |
8827/8828 | D12S/R136Q/L176T/R208K/A517P/G603E/L630M/V756C | +++ |
8829/8830 | D12N/L176T/A517P/V756C | + |
8831/8832 | D12S/R136Q/R208K/G603Q/A642V | + |
8833/8834 | D12N/R136Q/R139K/G603Q/A642V/V756C | +++ |
8835/8836 | D12S/R136Q/R139K/G603Q/L630M/V756C | +++ |
8837/8838 | D12S/R136Q/R139K/L176T/A517P/G603Q/L630M | +++ |
8839/8840 | D12N/R136Q/R139K/L630M | + |
8841/8842 | D12S/R136Q/R139K/A517P/L630M | ++ |
8843/8844 | D12N/R136Q/T199A/A517P/V756C | + |
8845/8846 | D12S/R136Q/R139K/T199A/R208K/A517P/G603E/V756C | +++ |
8847/8848 | D12N/E45A/R136Q/R139K/T199A/A517P/G603E | ++ |
8849/8850 | D12N/A517P/G603E/V756C | + |
8851/8852 | D12N/R136Q/G603Q/L630M/V756C | ++ |
8853/8854 | D12N/R136Q/R139K/A642V/V756C | + |
8855/8856 | D12S/R136Q/R139K/L630M/A642V/V756C | +++ |
8857/8858 | D12N/E45A/R139K/T199A/R208K/G603E | + |
8859/8860 | T199A/A517P/G603Q/L630M/V756C | + |
8861/8862 | R136Q/R139K/L176T/A517P/L630M/A642V/V756C | +++ |
8863/8864 | R136Q/R139K/L176T/T199A/R208K/A517P/L630M/A642V | ++ |
8865/8866 | D12S/R136Q/L176T/A517P/A642V | + |
8867/8868 | D12N/R139K/G603Q/V756C | + |
8869/8870 | D12N/R136Q/G603E/A642V | ++ |
8871/8872 | D12N/E45A/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C | +++ |
8873/8874 | D12S/R136Q/L630M | + |
8875/8876 | D12N/R136Q/R139K/A517P/V756C | ++ |
8877/8878 | R136Q/R139K/A517P/G603E/A642V/V756C | +++ |
8879/8880 | D12S/R136Q/R139K/G603Q/L630M/A642V | ++ |
8881/8882 | D12N/G603Q/L630M/V756C | + |
8883/8884 | D12S/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C | ++ |
8885/8886 | D12N/E45A/R136Q/R139K/G603E/V756C | ++ |
8887/8888 | D12N/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V | ++ |
8889/8890 | D12S/R136Q/R139K/L630M/V756C | ++ |
8891/8892 | D12N/Q95T/A517P/L630M/V756C | + |
8893/8894 | D12S/Q95T/R139K/A517P/L630M/V756C | ++ |
8895/8896 | D12N/E45A/T199A/R208K/A517P/G603E/L630M/V756C | + |
8897/8898 | D12N/R136Q/L176T/G603Q/V756C | + |
8899/8900 | D12S/R136Q/G603Q/L630M/A642V/V756C | ++ |
8901/8902 | D12N/T199A/L630M/A642V/V756C | + |
8903/8904 | D12N/L630M/A642V/V756C | + |
8905/8906 | D12S/R136Q/A517P/G603Q/L630M/V756C | ++ |
8907/8908 | D12N/E45A/R136Q/R139K/A517P/G603E/V756C | +++ |
8909/8910 | D12S/R136Q/R139K/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C | +++ |
8911/8912 | D12N/Q95T/R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C | ++ |
8913/8914 | D12N/R208K/L630M/V756C | + |
8915/8916 | D12N/R136Q/R139K/G603E/L630M | +++ |
8917/8918 | D12N/R136Q/A517P/L630M | +++ |
8919/8920 | R136Q/R139K/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C | +++ |
8921/8922 | D12S/R136Q/A517P/A642V/V756C | +++ |
8923/8924 | R139K/A517P/L630M/V756C | ++ |
8925/8926 | D12S/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C | ++ |
8927/8928 | A517P/G603E/L630M/A642V/V756C | + |
8929/8930 | D12N/L176T/A517P/G603E/L630M | + |
8931/8932 | D12S/A517P/A642V/V756C | ++ |
8933/8934 | D12S/E45A/Q95T/R136Q/V756C | ++ |
8935/8936 | D12N/R139K/A517P/G603Q/A642V/V756C | +++ |
8937/8938 | R136Q/A517P/V756C | + |
8939/8940 | D12N/G603Q/A642V/V756C | ++ |
8941/8942 | D12S/T199A/V756C | + |
8943/8944 | D12S/E45A/R139K/V756C | + |
8945/8946 | D12S/L176T/G603Q/L630M/V756C | ++ |
8947/8948 | D12S/R139K/R208K/A642V | + |
8949/8950 | D12N/E45A/Q95T/R136Q/R139K/T199A/A517P/L630M/V756C | +++ |
8951/8952 | D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/V756C | +++ |
8953/8954 | D12N/R136Q/T199A/R208K/A517P/G603E/A642V/V756C | +++ |
8955/8956 | R136Q/R139K/R208K/A517P/L630M/V756C | +++ |
8957/8958 | R136Q/R139K/T199A/A517P/G603E/V756C | +++ |
8959/8960 | D12S/L630M/V756C | + |
8961/8962 | D12S/G603Q/L630M/V756C | ++ |
8963/8964 | R136Q/R139K/A517P/V756C | ++ |
8965/8966 | D12N/Q95T/R139K/L630M/A642V | + |
8967/8968 | D12N/R136Q | + |
8969/8970 | D12N/R139K/T199A/A517P/L630M/V756C | +++ |
8971/8972 | R139K/A642V/V756C | + |
8973/8974 | D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/L630M/V756C | +++ |
8975/8976 | D12S/R139K/L176T/A517P/G603Q/L630M/V756C | +++ |
8977/8978 | D12N/A517P/L630M/A642V/V756C | + |
8979/8980 | D12S/R136Q/A517P/L630M/A642V | + |
8981/8982 | D12N/R139K/L630M/A642V/V756C | ++ |
8983/8984 | D12N/R136Q/R139K/L176T/A517P/G603Q/V756C | +++ |
8985/8986 | R136Q/R139K/L630M/A642V/V756C | ++ |
8987/8988 | D12S/R139K/A517P/A642V | + |
8989/8990 | D12N/R136Q/G603Q/V756C | ++ |
8991/8992 | D12N/Q95T/T199A/A517P/A642V | + |
8993/8994 | D12N/R139K/G603E/A642V/V756C | ++ |
8995/8996 | R139K/A517P/G603Q/V756C | + |
8997/8998 | D12N/R136Q/R139K/L176T/L630M/V756C | +++ |
8999/9000 | D12S/E45A/R208K/A517P/G603E/A642V/V756C | + |
9001/9002 | D12N/R136Q/G603E/A642V/V756C | ++ |
9003/9004 | D12N/A517P/G603Q/L630M/V756C | + |
9005/9006 | R139K/T199A/A517P/A642V | + |
9007/9008 | G603Q/V756C | + |
9009/9010 | D12N/R139K/L630M/V756C | ++ |
9011/9012 | D12S/R136Q/A517P/V756C | ++ |
9013/9014 | D12S/E45A/R136Q/L176T/A517P/G603E/L630M/A642V | + |
9015/9016 | R136Q/A642V | + |
9017/9018 | D12S/A517P/L630M/A642V/V756C | ++ |
9019/9020 | D12N/R136Q/R139K/L176T/A642V | ++ |
9021/9022 | D12N/R136Q/R208K | + |
9023/9024 | D12S/R136Q/G603E/V756C | ++ |
9025/9026 | D12N/R139K/T199A/R208K/A642V | + |
9027/9028 | D12N/R208K/A517P/G603E/H623N/L630M/A642V | + |
9029/9030 | A517P/L630M/V756C | + |
9031/9032 | D12S/R136Q/A517P/A642V | + |
9033/9034 | D12N/E45A/R136Q/L630M/A642V | + |
9035/9036 | D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/L630M/A642V/V756C | +++ |
9037/9038 | D12N/G603Q/V756C | + |
9039/9040 | D12S/Q95T/L630M/V756C | + |
9041/9042 | R136Q/A642V/V756C | + |
9043/9044 | D12N/R139K/L630M/A642V | + |
9045/9046 | D12N/L176T/A517P/L630M/A642V/V756C | ++ |
9047/9048 | R136Q/V756C | + |
9049/9050 | D12S/E45A/R136Q/R139K/A517P/V756C | ++ |
9051/9052 | D12N/G603E/A642V/V756C | + |
9053/9054 | R136Q/G603Q/V756C | + |
9055/9056 | D12N/R136Q/R139K/A517P | ++ |
9057/9058 | R208K/A517P/L630M/A642V/V756C | + |
9059/9060 | R136Q/L630M/A642V | + |
9061/9062 | D12N/R136Q/R139K/T199A/R208K/A517P/L630M/A642V/V756C | ++ |
9063/9064 | R139K/R208K/A517P/L630M/A642V/V756C | + |
9065/9066 | R136Q/L630M/V756C | + |
9067/9068 | D12S/E45A/R139K/A517P/V756C | + |
9069/9070 | R136Q/R139K/R208K/G603Q/L630M/V756C | ++ |
9071/9072 | D12N/T199A/A642V/V756C | + |
9073/9074 | D12S/R208K/G603Q/L630M/V756C | + |
9075/9076 | D12N/Q95T/R139K/A517P/A642V | + |
9077/9078 | D12S/L176T/G603E/V756C | + |
9079/9080 | D12N/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C | ++ |
9081/9082 | D12S/R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C | ++ |
9083/9084 | D12S/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V | ++ |
9085/9086 | D12S/R136Q/L630M/V756C | + |
9087/9088 | D12N/R139K/R208K/A517P | + |
9089/9090 | D12N/E45A/R139K/A517P/V756C | + |
9091/9092 | D12S/E45A/R136Q/A517P/G603Q/A642V/V756C/A789V | + |
9093/9094 | D12S/E45A/R139K/L176T/R208K/A517P/G603E/L630M | + |
9095/9096 | D12N/R136Q/G603Q/A642V/V756C | ++ |
9097/9098 | R139K/T199A/R208K/A517P/L630M/V756C | + |
9099/9100 | G603E/L630M/V756C | + |
9101/9102 | A25E/L176M/Q198R/S532Y/S539R | + |
9103/9104 | H154A/S532Y/G652R/H788K | + |
9105/9106 | L116F/S142N/Q198R/Y434H/P440R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:8420之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少7.8倍,但小於16倍;“++”=至少16倍,但小於22.3倍;以及“+++”=至少22.3倍增加的生產。 |
執行一實驗以特徵化經工程處理之第16輪SUS變異體作用於蔗糖及ADP以促進由甜菊糖苷A來形成甜菊糖苷M之活性。搖動燒瓶粉末(SFP)被製成0.03-1 g/L以14.5 g/L RebA60配於磷酸鉀緩衝劑,pH 6,且一等分試樣於一種熱循環儀內以75 ℃預培育歷時1小時。10 µL稀釋的、不論是經預培育或是未經預培育SuS溶解產物,0.08 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:7784,及0.2 g/L β1,3GT SFP序列辨識編號:8088,使用於100 μL反應體積內加上20 g/L RebA60、0.025 g/L ADP(Amresco,超純級)、40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar)),及9.6 g/L果糖。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋20x於水內來溶解以上所述的反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且藉由離心來沈澱。使上清液稀釋20x於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS、加上表31.1內所述的設備與參數來偵測甜菊糖產物。表42.2中列出的所有8種變異體於預培育後具有比序列辨識編號:8420更高的生產力。帶有突變D12S、R136Q、R139K、A517P、G603Q、L630M、A642V及V756C的變異體(序列辨識編號:8910),其相對於序列辨識編號:8420改良得最好,被選擇為供用於自蔗糖轉移葡萄糖至ADP的回收反應之催化最佳的酵素。
實施例43
序列辨識編號:1054之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表42.2 SUS第16輪SFP變異體及RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:8420) | 無預培育增加的RebM a | 75℃預培育增加的RebM a |
8827/8828 | D12S/R136Q/L176T/R208K/A517P/G603E/L630M/V756C | + | ++ |
8909/8910 | D12S/R136Q/R139K/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C | + | +++ |
8919/8920 | R136Q/R139K/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C | + | +++ |
8953/8954 | D12N/R136Q/T199A/R208K/A517P/G603E/A642V/V756C | - | ++ |
9035/9036 | D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/L630M/A642V/V756C | - | +++ |
9079/9080 | D12N/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C | + | +++ |
9101/9102 | A25E/L176M/Q198R/S532Y/S539R | - | ++ |
9105/9106 | L116F/S142N/Q198R/Y434H/P440R | - | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:8420之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於3倍;“++”=生產至少3倍,但小於13倍;以及“+++”=生產至少13倍增加。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:1054之GT多肽(β1,2GT)演化及篩選的實驗。序列辨識編號:1053編碼之GT定向演化係藉由建構基因庫來進行,其中與前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第五輪(“第5輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的26種經工程處理之GT變異體多肽。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖苷A之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:1053變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 μL,以及溶解產物稀釋4倍。以10 μL稀釋的溶解產物配於100 μL反應體積加上1 mM甜菊糖苷A(>97%純度)之受質裝載量以及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時1h。反應稀釋1:5於水然後藉由添加25 µL稀釋的試料至75 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷。生成的混合物藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:5於水內且如表31.1內所述藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析。辨識出自甜菊糖苷A加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的醣基轉移酶變異體多肽,以及經工程處理之多肽列於表43.1中。表43.2中列出的變異體係如實施例31中所述以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表43.1 β1,2GT第5輪變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1054) | 增加的RebD a |
2595/2596 | E24L/N162R/P175S/M201G/D275Q/I316V | + |
2597/2598 | E24L/W226V/P330Q/L351M/K403R | + |
2599/2600 | E24L/N162R/E198P/M201G/T211E/W226V/L323V/L351M | + |
2601/2602 | E24L/P175S/M201G/D275Q/I316V/L351M | + |
2603/2604 | E24L/M201G/W226V/G253D/L402I/K403R/I406M | ++ |
2605/2606 | P175S/E198P/M201G/T211E/W226V/T260V/S264A/L323V/L402I/I406M | +++ |
2607/2608 | E24L/P175S/M201G/I316V | + |
2609/2610 | E24L/P175S/T211E/I316V/P330Q | + |
2611/2612 | E24L/P175S/T211E/G253D/I316V | ++ |
2613/2614 | E24L/E198P/M201G/T211E | ++ |
2615/2616 | E24L/P175S/W226V/L323V/L351M | + |
2617/2618 | E24L/E198P/M201G | + |
2619/2620 | E24L/M201G/T211E/G253D/L323V/L351M/Q366H/D389E/L402I/K403R | + |
2621/2622 | E24L/P175S/T211E/C220L/T260V/D275Q/P330Q/D389E | + |
2623/2624 | E24L/E198P/M201G/T211E/C220L/T260V | +++ |
2625/2626 | P175S/E198P/W226V/T260V/L351M/L402I/K403R/I406M | ++ |
2627/2628 | E24L/E198P/M201G/W226V/P330Q/D389E | ++ |
2629/2630 | E24L/N32S/P175S/W226V/G253D/D275Q/I316V | + |
2631/2632 | E24L/N32S/P175S/T211E/T260V/P330Q/K403R/I406M | + |
2633/2634 | E24L/N162R/M201G/G253D/S264A/L351M/L402I/I406M | ++ |
2635/2636 | E24L/E198P/M201G/L351M | ++ |
2637/2638 | E24L/N162R/E198P/M201G/W226V/L351M | +++ |
2639/2640 | E24L/N162R/P175S/E198P/T211E/W226V/D275Q/I316V/L323V/D389E | + |
2641/2642 | E24L/P175S/E198P/T211E/W226V/G253D/I316V | +++ |
2643/2644 | E24L/E198P/M201G/C220L/D275Q/D389E/L402I/I406M | ++ |
2645/2646 | E24L/N32S/M201G/W226V/T260V/S264A/P330Q/L402I/I406M | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1054之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少4.1倍,但小於4.58倍;“++”=至少4.58倍,但小於5.17倍;以及“+++”=至少5.17倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第5輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。添加0.006-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7、3 mM MgCl
2、1 mM甜菊糖苷A,及1 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1h。反應稀釋1:5於水然後藉由添加25 µL稀釋的試料至75 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷且藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:5於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析甜菊糖。0.05 g/L SFP裝載量的第5輪變異體對於甜菊糖苷A之活性列於表43.2內。表43.2中列出的全部6種變異體都具有比序列辨識編號:1054更高的活性。帶有突變E24L、N162R、E198P、M201G、T211E、W226V、L323V及L351M的變異體(序列辨識編號:2600)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:2599)被選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例44
用於甜菊糖苷I進行葡萄糖苷化成甜菊糖苷M之序列辨識編號:1002的醣基轉移酶變異體
表43.2 β1,2GT第5輪SFP變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1054) | 增加的RebD a |
2595/2596 | E24L/N162R/P175S/M201G/D275Q/I316V | ++ |
2599/2600 | E24L/N162R/E198P/M201G/T211E/W226V/L323V/L351M | +++ |
2605/2606 | P175S/E198P/M201G/T211E/W226V/T260V/S264A/L323V/L402I/I406M | +++ |
2623/2624 | E24L/E198P/M201G/T211E/C220L/T260V | + |
2633/2634 | E24L/N162R/M201G/G253D/S264A/L351M/L402I/I406M | + |
2637/2638 | E24L/N162R/E198P/M201G/W226V/L351M | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1054之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少8.75倍,但小於10倍;“++”=至少10倍,但小於11倍;以及“+++”=至少11倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:1002之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:1001編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中前幾輪對甜菊糖苷I之醣基轉移酶活性改良有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選以提供一輪(RebI第5輪)具有對UDP-葡萄糖及甜菊糖苷I之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。
由UDP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖苷I之HTP檢定
細胞係用250 µL溶解緩衝劑予以溶解。於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:1002變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應以及加上1 mM甜菊糖苷I之受質裝載量以及1 mM UDP-葡萄糖(Sigma,>98%純度)之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM KPhos緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,40℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時18 h。藉由添加10 μL試料至90 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷反應。生成的混合物藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:5於水內且如表44.1內所述藉由LC-MS/MS來分析。辨識出自甜菊糖苷I加上UDP-葡萄糖生產甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:1002更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表44.2中。
實施例45
序列辨識編號:2600之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表44.1 甜菊糖苷I產物甜菊糖之HPLC-MS/MS分析 | |
設備 | Agilent HPLC 1200系列,Sciex 4000 QTrap |
管柱 | Poroshell 120 EC C18 50 x 3.0 mm,2.7 μm及Poroshell 120 EC C18 5 x 3.0,2.7 μm保護管柱(Agilent Technologies, Inc.) |
移動相 | 梯度(A:0.1%甲酸配於水,B:0.1%甲酸配於甲醇) |
流率 | 0.8 mL/m |
運行時間 | 9.2 m |
峰滯留時間 | 甜菊糖苷M:4.37 m 甜菊糖苷I:6.70 m 其他葡萄糖苷化的甜菊糖苷I產物:4.8 m 二級葡萄糖苷化的甜菊糖苷I產物:6.7 m |
管柱溫度 | 40 ℃ |
注入體積 | 10 μL |
MS偵測 | MRM 990/828(用於甜菊醇四糖苷(steviol tetraglycosides),諸如甜菊糖苷A),1152/828(用於甜菊醇五糖苷,諸如甜菊糖苷D),1314/828(甜菊醇六糖苷,諸如甜菊糖苷M),828/666(用於甜菊醇三糖苷,諸如甜菊苷),666/504(甜菊醇二糖苷,諸如甜茶苷) |
MS條件 | 模式:MRM;CUR:30;IS:4750;CAD:高;TEM:550 ℃;GS1:50;GS2:50;DP:150;EP:10;CXP:14;DT:50 ms用於每次轉換。關於前三次轉換CE:85;關於最後兩次轉換CE:60。 |
表44.2 β1,2GT第5輪RebI變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:1002) | 增加的RebM a |
2647/2648 | F156R | + |
2649/2650 | F156R/K161S | + |
2651/2652 | F156R/G199H/N200A | + |
2653/2654 | F156R/K161S/N162G | + |
2663/2664 | F156R/K161S/N162G | ++ |
2665/2666 | F156R/N162G/G199H | ++ |
2667/2668 | W21Y/L127H/P129A/K161S/N162G | +++ |
2669/2670 | L127Q/P129A/K161S/G199H/N200A | +++ |
2671/2672 | L127H/P129A/N162T | + |
2673/2674 | F156R/K161S/N162G | + |
2675/2676 | L127Q/P129A/K161S/N162G/G199H | +++ |
2677/2678 | F156R/K161S/N162G | ++ |
2679/2680 | W21Y/L127H/P129A/N162T/G199H/N200A | +++ |
2681/2682 | F156R/K161S/N162T | ++ |
2683/2684 | W21Y/L127H/P129A/K161S | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:1002之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少2.5倍,但小於3.13倍;“++”=至少3.13倍,但小於3.28倍;以及“+++”=至少3.28倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:2600之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:2599之定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行。基因庫與酵素表面殘基有關的位置突變以及與前幾輪改良的活性有關的有利突變予以重組,組合併入來自公開可得的數據庫之同源物多樣性,或是酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第六輪(“第6輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。24種經工程處理之變異體係自重組的有利突變及同源物多樣性辨識出(表45.1),以及21種係自飽和致突變作用辨識出(表45.2)。
由ADP-葡萄糖進行葡萄糖轉移至甜菊糖苷A之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:2600變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 μL,以及溶解產物稀釋40倍。以10 μL稀釋的溶解產物配於100 μL反應體積加上1 mM甜菊糖苷A(>97%純度)之受質裝載量以及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,45℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時1h。反應稀釋1:5於水然後藉由添加25 µL稀釋的試料至75 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷。生成的混合物藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:5於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析。自甜菊糖苷A加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷D的經工程處理之變異體及自組合庫辨識出者列於表45.1中。來自飽和致突變庫之前84種變異體係如上所述於50℃下以三重複再測試。生成的經工程處理之GT變異體多肽列於表45.2中。表45.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表45.1 β1,2GT第6輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2600) | 增加的RebD a |
2685/2686 | A12S/R15K/I57K/E318D/L402I/A435V | + |
2687/2688 | I57K/T260V/E400Q/L402I/D404S | + |
2689/2690 | I57K/L402I | + |
2691/2692 | A12S/P175S/E400Q/L402I/I406M | ++ |
2693/2694 | I57K/E400Q/L402I | + |
2695/2696 | I57K/P175S/C220L/T260V/S264A/L402I | ++ |
2697/2698 | A12S/I57K/P175S/K451N | + |
2699/2700 | H7E/A12S/E400Q/A435V | + |
2701/2702 | A12S/E318D/L402I/D404S/K451N | ++ |
2703/2704 | A12S/R15K/I57K/V71I/P175S/T260V/E400Q/L402I | +++ |
2705/2706 | A12S/E318D/L402I/D404S/I406M/K451N | +++ |
2707/2708 | A12S/P175S/T260V/S264A/E318D/E400Q | +++ |
2709/2710 | A12S/R15K/E318D/E400Q/L402I/I406M | + |
2711/2712 | T260V | + |
2713/2714 | I57K/P175S/D404G | ++ |
2715/2716 | E400Q/L402I | ++ |
2717/2718 | H2-/H7E/A12S/R15K/P175S/T260V/E318D | +++ |
2719/2720 | R15K/P175S/E318D/E400Q/L402I | ++ |
2721/2722 | I57K/C220L/T260V/E400Q/L402I/I406M | +++ |
2723/2724 | A12S/R15K/I57K/C220L/T254K/T260V/E318D/L402I | + |
2725/2726 | H7E/E318D/K451N | + |
2727/2728 | L160V/F186M/R195P | ++ |
2729/2730 | R195P | + |
2731/2732 | L152V/E192D/R195P | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2600之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.4倍,但小於1.64倍;“++”=至少1.64倍,但小於1.84倍;以及“+++”=至少1.84倍增加的生產。 |
表45.2 β1,2GT第6輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2600) | 增加的RebD a |
2733/2734 | T240A | +++ |
2735/2736 | I239F | + |
2737/2738 | R331S | + |
2739/2740 | S148A | ++ |
2741/2742 | T240P | +++ |
2743/2744 | I239E | + |
2745/2746 | A327V | +++ |
2747/2748 | V323L | + |
2749/2750 | V135A | ++ |
2751/2752 | F326M | ++ |
2753/2754 | L152V | +++ |
2755/2756 | F356G | ++ |
2757/2758 | F186V | + |
2759/2760 | N32R | ++ |
2761/2762 | D237T | + |
2763/2764 | H325R | + |
2765/2766 | R331H | + |
2767/2768 | P330A | ++ |
2769/2770 | H325G | + |
2771/2772 | I239Y | + |
2773/2774 | R331C | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2600之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.18倍,但小於1.4倍;“++”=至少1.4倍,但小於1.6倍;以及“+++”=至少1.6倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第6輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。實驗係以0.003-0.1 g/L SFP位準,如實施例40中所述方式執行。0.025 g/L SFP裝載量的第6輪變異體對於甜菊糖苷A之轉化列於表45.3內。表45.3中列出的全部5種變異體都具有比序列辨識編號:2600更高的活性。帶有突變H2-、H7E、A12S、R15K、P175S、T260V及E318D的變異體(序列辨識編號:2718)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:2717)被選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例46
序列辨識編號:2718之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表45.3 β1,2GT第6輪搖動燒瓶粉末變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2600) | 增加的RebD a |
2687/2688 | I57K/T260V/E400Q/L402I/D404S | + |
2695/2696 | I57K/P175S/C220L/T260V/S264A/L402I | + |
2703/2704 | A12S/R15K/I57K/V71I/P175S/T260V/E400Q/L402I | + |
2717/2718 | H2-/H7E/A12S/R15K/P175S/T260V/E318D | ++ |
2727/2728 | L160V/F186M/R195P | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2600之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.1倍,但小於1.6倍;以及“++”=至少1.6倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:2718之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:2717編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行,其中與前幾輪改良的活性或表現有關的有利突變予以重組。另一基因庫使酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第七輪(“第7輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出25種經工程處理之變異體(表46.1)以及自飽和致突變作用辨識出29種經工程處理之變異體(表46.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:2717變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋10倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,以10 μL稀釋的溶解產物及0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1392配於100 μL反應體積加上7.5 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及1 mM ADP(Sigma,>95%)及15 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6.5,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時2h。反應稀釋1:10於水然後藉由添加10 µL稀釋的試料至90 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷。生成的混合物藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且如表31.1內所述藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析。關於剩餘的二種第7輪基因庫,執行如上所述的篩選,除了使用0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1456
SFP及30 mM蔗糖外。來自重組的有利突變、具有SuS對於RebA偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表46.1中。來自飽和致突變庫最好的變異體係使用如上所述的程序以三重複再測試,除了使用0.8 mM ADP外,以及使反應稀釋1:20於水內然後藉由添加20 μL稀釋的分析物至80 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷。生成的經工程處理之GT變異體多肽列於表46.2中。表46.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊糖苷A之分析
表46.1 β1,2GT第7輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2718) | 增加的RebD a |
2775/2776 | F185M/R194P/D236T/T239A/F325M/A326V | ++ |
2777/2778 | K14R/M184A/F185M/R194P/D388E/E399Q/L401I | +++ |
2779/2780 | K14R/R194P | ++ |
2781/2782 | K14R/M184A/F185M/R194P/F234Y/F325M/A326V/P329A | +++ |
2783/2784 | K14R/A326V/R330H | +++ |
2785/2786 | K14R/N31R/M184A/D274Q/V322L/A326V/P329A/R330H | + |
2787/2788 | K14R/F355G | ++ |
2789/2790 | K14R/I56K/M184A/F185M/R194P/I238M/T239A/D274Q/P329A/E399Q | +++ |
2791/2792 | K14R/F185M/D236T/I238M/T239A/D274Q/V322L/A326V/P329Q/F355G/E399Q/L401I | ++ |
2793/2794 | K14R/F185M/R194P/I238M/E399Q | + |
2795/2796 | K14R/L23Q/D274Q/A326V/P329A | + |
2797/2798 | N31R/I56K/I315V/P329A/R330H | + |
2799/2800 | K14R/I56K/M184A/R194P/F234Y/I315V/A326V/P329Q/E399Q/L401I | ++ |
2801/2802 | K14R/V322L/A326V/R330H | + |
2803/2804 | S147A/D236T/I238M/D243G/I315V/P329A/R330H/E399Q/L401I | + |
2805/2806 | K14R/M184A/R194P/F355G/E399Q | ++ |
2807/2808 | K14R/I56K/G252D/D274Q/I315V/A326V/P329A/R330H/L401I | + |
2809/2810 | L23Q/N31R/S147A/M184A/F185M/I238M/G252D/F325M/P329A/R330H/D388E/L401I | ++ |
2811/2812 | K14R/F355G/E399Q | + |
2813/2814 | K14R/I56K/R194P/I238M/I315V/F325M/A326V/P329A/R330H/E399Q | ++ |
2815/2816 | I238M | + |
2817/2818 | E65D/I238T/N240S | + |
2819/2820 | E65D | + |
2821/2822 | E65D/Q114E/H132R/I238M | + |
2823/2824 | S223T/I412S | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2718之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.05倍,但小於2.5倍;“++”=至少2.5倍,但小於3倍;以及“+++”=至少3倍增加的生產。 |
表46.2 β1,2GT第7輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2718) | 增加的RebD a |
2825/2826 | N391R | ++ |
2827/2828 | K309E | ++ |
2829/2830 | E65N | +++ |
2831/2832 | M104L | + |
2833/2834 | K422R | + |
2835/2836 | I56T | + |
2837/2838 | K58R | + |
2839/2840 | S11G | +++ |
2841/2842 | L45V | ++ |
2843/2844 | N138G | ++ |
2845/2846 | N135L | ++ |
2847/2848 | N138K | +++ |
2849/2850 | H132Q | ++ |
2851/2852 | K309H | + |
2853/2854 | E430L | ++ |
2855/2856 | S11Q | +++ |
2857/2858 | E165P | + |
2859/2860 | Y449F | + |
2861/2862 | N286R | +++ |
2863/2864 | Q114R | + |
2865/2866 | E256P | + |
2867/2868 | E430V | + |
2869/2870 | I55L | + |
2871/2872 | H132S | + |
2873/2874 | I238G | + |
2875/2876 | L113V | + |
2877/2878 | E273R | + |
2879/2880 | E65S | ++ |
2881/2882 | L45F | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2718之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.3倍;“++”=至少1.3倍,但小於1.7倍;以及 “+++”至少1.7倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第7輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。添加0.002-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6.5、2 mM甜菊糖苷A,及2 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1h。反應稀釋1:5於水然後藉由添加25 µL稀釋的試料至75 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷且藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析甜菊糖。0.025 g/L SFP裝載量的第7輪變異體對於甜菊糖苷A之轉化顯示於表46.3內。表46.3中列出的全部7種變異體都具有比序列辨識編號:2718更高的活性。帶有突變K14R、I56K、R194P、I238M、I315V、F325M、A326V、P329A、R330H及E399Q的變異體(序列辨識編號:2814)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:2813)被選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例47
序列辨識編號:2814之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表46.3 β1,2GT第7輪搖動燒瓶粉末變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2718) | 增加的RebD a |
2777/2778 | K14R/M184A/F185M/R194P/D388E/E399Q/L401I | ++ |
2793/2794 | K14R/F185M/R194P/I238M/E399Q | ++ |
2799/2800 | K14R/I56K/M184A/R194P/F234Y/I315V/A326V/P329Q/E399Q/L401I | + |
2805/2806 | K14R/M184A/R194P/F355G/E399Q | + |
2809/2810 | L23Q/N31R/S147A/M184A/F185M/I238M/G252D/F325M/P329A/R330H/D388E/L401I | +++ |
2811/2812 | K14R/F355G/E399Q | ++ |
2813/2814 | K14R/I56K/R194P/I238M/I315V/F325M/A326V/P329A/R330H/E399Q | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2718之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.6倍,但小於2.3倍;“++”=至少2.3倍,但小於2.5倍;以及“+++”=至少2.5倍的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:2814之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:2813編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行,其中與前幾輪改良的活性有關的有利突變予以重組,以及其中酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第八輪(“第8輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出16種經工程處理之變異體(表47.1),以及自飽和致突變作用辨識出18種(表47.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:2813變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋20倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,以10 μL稀釋的溶解產物及0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1456配於100 μL反應體積加上7.5 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.4 mM ADP(Sigma,>95%)及30 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6.5,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1h。使反應稀釋1:20於水內然後藉由添加20 μL稀釋的試料至80 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷。形成的混合物藉由4 ℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析。所生成具有SuS對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表47.1中。關於第8輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了使用0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1582、0.2 mM ADP,且使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,55℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2h。來自此庫的前56種變異體係使用相同的檢定條件以三重複再測試,除了使用0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1582外。生成的經工程處理之GT變異體多肽列於表47.2中。表47.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表47.1 β1,2GT第8輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2814) | 增加的RebD a |
2883/2884 | N31R/D388E | ++ |
2885/2886 | M238Y/H324G/A329Q/F355G | ++ |
2887/2888 | N31R/V134A/F185M/G252D/D274Q/H324G/D388E | +++ |
2889/2890 | L23Q/N31R/F185M/H324G/L401I | + |
2891/2892 | N31R/V134A/G252D/H324G | + |
2893/2894 | N31R/V134A/M238E/G252D/V322L/H324G/D388E | ++ |
2895/2896 | H324G/A329Q/F355G/L401I | + |
2897/2898 | V134A/M184A/F185M/F234Y/D236T/T239A/D274Q/H324G/D388E | +++ |
2899/2900 | N31R/V322L | ++ |
2901/2902 | D236T | + |
2903/2904 | F234Y/D236T/M238E/V322L/H324G/F355G | +++ |
2905/2906 | V322L/H324G | + |
2907/2908 | M184A/F185M/V322L | + |
2909/2910 | N31R/D236T | + |
2911/2912 | L23Q/N31R/F185M/F355G | + |
2913/2914 | N31R/M184A/F185M/M238Y/T239A/V322L | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2814之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準1.3倍,但小於1.4倍;“++”=至少1.4倍但小於1.7倍;以及“+++”=大於1.7倍增加的生產。 |
表47.2 β1,2GT第8輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2814) | 增加的RebD a |
2915/2916 | I427R | + |
2917/2918 | S426R | +++ |
2919/2920 | V164H | ++ |
2921/2922 | I440R | ++ |
2923/2924 | M325L | +++ |
2925/2926 | V176R | +++ |
2927/2928 | V164R | + |
2929/2930 | S446R | ++ |
2931/2932 | T400V | ++ |
2933/2934 | I122L | + |
2935/2936 | S426A | +++ |
2937/2938 | V164M | + |
2939/2940 | V176K | ++ |
2941/2942 | V176N | + |
2943/2944 | V176L | + |
2945/2946 | E177A | + |
2947/2948 | G316R | + |
2949/2950 | K425R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2814之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.25倍;“++”=至少1.25倍,但小於1.35倍;以及“+++”=至少1.35倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第8輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。添加0.002-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6.5、8 mM甜菊糖苷A、0.4 mM ADP、30 mM蔗糖,及0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1456。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1h。反應稀釋1:20於水然後藉由添加20 µL稀釋的試料至80 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷且藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析甜菊糖。0.1 g/L SFP裝載量的第8輪變異體對於甜菊糖苷A之轉化顯示於表47.3內。表47.3中列出的全部8種變異體都具有比序列辨識編號:2814更高的活性。選擇帶有突變N31R及D388E的變異體(序列辨識編號:2884)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:2883)用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例48
序列辨識編號:2884之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表47.3 β1,2GT第8輪搖動燒瓶變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2814) | 增加的RebD a |
2883/2884 | N31R/D388E | +++ |
2887/2888 | N31R/V134A/F185M/G252D/D274Q/H324G/D388E | + |
2893/2894 | N31R/V134A/M238E/G252D/V322L/H324G/D388E | + |
2897/2898 | V134A/M184A/F185M/F234Y/D236T/T239A/D274Q/H324G/D388E | + |
2899/2900 | N31R/V322L | ++ |
2903/2904 | F234Y/D236T/M238E/V322L/H324G/F355G | ++ |
2909/2910 | N31R/D236T | + |
2913/2914 | N31R/M184A/F185M/M238Y/T239A/V322L | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2814之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.2倍,小於1.7倍;“++”=至少1.7倍,但小於1.9倍;以及“+++”=至少1.9倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:2884之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:2883編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行,其中與前幾輪改良的活性有關的有利突變予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第九輪(“第9輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的33種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:2883變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋20倍。以10 μL稀釋的溶解產物及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1582配於100 μL反應體積加上7.5 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及24 mM蔗糖(Sigma)之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,55℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。使反應稀釋、驟冷及如以上所述之分析。所生成具有SuS對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表48.1中。表48.2中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表48.1 β1,2GT第9輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2884) | 增加的RebD a |
2951/2952 | S11Q/K58R/E65N/M104L/P107G/N138G/N286R | + |
2953/2954 | S11G/K58R/H132Q/E165P/N286R/N391R/K422S/E430L | + |
2955/2956 | N135L/N138G/E165P/K309H/E430L | + |
2957/2958 | S11Q/E65N/M104L/P107G/N138G/E165P/N286R/N391R/E430L | ++ |
2959/2960 | P107G/Q114R/H132Q/N138G | + |
2961/2962 | S11Q/K58R | + |
2963/2964 | K58R/E65N/E165P/K309H/E430L | ++ |
2965/2966 | S11Q | + |
2967/2968 | S11Q/K58R/E65N/N135L/N138G | ++ |
2969/2970 | K58R/M104L/Q114R/E165P/N391R | + |
2971/2972 | S11Q/N138K/E165P/S223T/K309H | + |
2973/2974 | S11Q/E65N/P107G/N135L/E165P/N391R/E430L | + |
2975/2976 | S11Q/P107G/N138G | + |
2977/2978 | S11Q/E65N/N135L/N138G | + |
2979/2980 | S11G/E65N/H132Q/N391R/E430L | + |
2981/2982 | S11Q/M104L/H132Q/N138K/N391R | + |
2983/2984 | S11Q/Q114R/S223T/G252D/N286R/N391R | ++ |
2985/2986 | S11G/M104L/H132Q/N138G/K309H/N391R | ++ |
2987/2988 | S11G/K58R/M104L/P107G/Q114R/N138K/S223T/N391R | +++ |
2989/2990 | S11G/L45V/K58R/H132Q/N138G/N286R | ++ |
2991/2992 | S11G/P107G/Q114R/S223T/K309H/E430L | +++ |
2993/2994 | S11Q/H132Q/N135L/N138K/S223T/N286R | +++ |
2995/2996 | S223T/K309E | ++ |
2997/2998 | S11Q/H132Q/N138G/S223T/N286R/N391R | +++ |
2999/3000 | K58R/E65N/N138K | ++ |
3001/3002 | P107G/E430L | + |
3003/3004 | S11Q/K58R/N138G/K309E | +++ |
3005/3006 | S11G/K58R/Q114R/N286R/K309H/N391R | + |
3007/3008 | K58R/E65N/N138G/E165P | ++ |
3009/3010 | S11Q/E65N/H132Q/N135L/G252D | + |
3011/3012 | S11Q/Q114R/N135L/N138G/S223T | ++ |
3013/3014 | S11Q/K58R/E65N/P107G/N135L/S223T/N286R/N391R/E430L | + |
3015/3016 | S11Q/E65N/H132Q/N135L/N138G/S223T/N391R | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2884之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.5倍,但小於2.1倍;“++”=至少2.1倍,但小於2.5倍;以及“+++”=至少2.5倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第9輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。添加0.002-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、8 mM甜菊糖苷A、0.4 mM ADP、24 mM蔗糖,及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1582。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在55℃下搖動歷時1h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.05 g/L SFP裝載量的第9輪變異體對於甜菊糖苷A之轉化顯示於表48.2內。表48.2中列出的全部6種變異體都具有比序列辨識編號:2884更高的活性。帶有突變S11Q、E65N、H132Q、N135L、N138G、S223T及N391R的變異體(序列辨識編號:3016)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:3015)是改良得最好的以及選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例49
序列辨識編號:3016之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表48.2 β1,2GT第9輪搖動燒瓶粉末變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:2884) | 增加的RebD a |
3015/3016 | S11Q/E65N/H132Q/N135L/N138G/S223T/N391R | +++ |
2983/2984 | S11Q/Q114R/S223T/G252D/N286R/N391R | ++ |
2997/2998 | S11Q/H132Q/N138G/S223T/N286R/N391R | + |
2987/2988 | S11G/K58R/M104L/P107G/Q114R/N138K/S223T/N391R | ++ |
3011/3012 | S11Q/Q114R/N135L/N138G/S223T | + |
2975/2976 | S11Q/P107G/N138G | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:2884之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.07倍,但小於1.2倍;“++”=至少1.2倍,但小於1.85倍;以及“+++”=至少1.85倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:3016之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3015編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行。基因庫與前幾輪改良的活性有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十輪(“第10輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出40種經工程處理之變異體(表49.1),以及自飽和致突變作用辨識出40種(表49.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3015變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋20倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,以10 μL稀釋的溶解產物及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764配於100 μL反應體積加上8 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及24 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,55℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1 h。使反應稀釋1:20於水內然後藉由添加20 μL稀釋的試料至80 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷。形成的混合物藉由4 ℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析。所生成具有SuS對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表49.1中。關於第10輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了溶解產物稀釋10倍,且使用下列反應條件:60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。所生成經工程處理之GT變異體多肽列於表49.2中。表49.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表49.1 β1,2GT第10輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3016) | 增加的RebD a |
3017/3018 | K58R/I122L/I440R | + |
3019/3020 | K58R/I122L/V164H/D236T/S446R | + |
3021/3022 | K58R/P107G/I122L/V322L/T400V/K425R/I427R/I440R/S446R | ++ |
3023/3024 | K58R/P107G/D236T/T400V | + |
3025/3026 | I122L/V164H/V176R/H324G/T400V | +++ |
3027/3028 | I122L/V176R/D236T/T400V | ++ |
3029/3030 | P107G/V164H/D236T/T400V/S446R | ++ |
3031/3032 | V164H | ++ |
3033/3034 | K58R/V176R/D236T | +++ |
3035/3036 | V176R/T400V | +++ |
3037/3038 | K58R/P107G/I122L/D236T/H324G/T400V/K425R/S446R | ++ |
3039/3040 | V164H/V322L/H324G/M325L/T400V/K425R/I440R/S446R | + |
3041/3042 | I122L/T400V | +++ |
3043/3044 | K58R/V164H/V176R | +++ |
3045/3046 | P107G/I440R | + |
3047/3048 | P107G/I122L/D236T/K425R/S426A/S446R | +++ |
3049/3050 | P107G/V176R/V322L/M325L/I440R/S446R | ++ |
3051/3052 | I122L/V164H/T400V/I440R | +++ |
3053/3054 | K58R/P107G/I122L/V176R/D236T/H324G/M325L/T400V/S426R/I427R | + |
3055/3056 | I122L/V164H/T400V/I440R/S446R | + |
3057/3058 | K58R/P107G/T400V | + |
3059/3060 | H324G/T400V/K425R/S426R/I440R/S446R | ++ |
3061/3062 | I122L/I440R/S446R | +++ |
3063/3064 | V164H/S271G/K425R/S426R | ++ |
3065/3066 | V164H/T400V | ++ |
3067/3068 | P107G/D236T | ++ |
3069/3070 | K58R/P107G/V164H/T400V | ++ |
3071/3072 | K58R/I122L/M325L | + |
3073/3074 | K58R/I122L/V322L/M325L | ++ |
3075/3076 | K58R/I122L/V176R/D236T/T400V/S446R | + |
3077/3078 | K58R/V164H/H324G/K425R/I427R | + |
3079/3080 | P107G/V176R/T400V/K425R/I427R/I440R | + |
3083/3084 | K58R/D236T | + |
3085/3086 | I122L/K425R/S426R/S446R | + |
3087/3088 | I122L/V176R/H324G/T400V/I440R | + |
3089/3090 | K58R/I122L/V176R/V322L/H324G/S426A/I427R | + |
3093/3094 | I139V/G252D | + |
3095/3096 | G8S/K448A | + |
3097/3098 | I139V | + |
3099/3100 | P189R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3016之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.2倍,但小於1.43倍;“++”=至少1.43倍,但小於1.67倍;以及“+++”=至少1.67倍增加的生產。 |
表49.2 β1,2GT第10輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3016) | 增加的RebD a |
3101/3102 | N240E | +++ |
3103/3104 | A242Y | + |
3105/3106 | S9C | + |
3107/3108 | E210V | +++ |
3109/3110 | E408P | ++ |
3111/3112 | G200T | ++ |
3113/3114 | N115R | + |
3115/3116 | N172R | ++ |
3117/3118 | A242I | ++ |
3119/3120 | L116V | + |
3121/3122 | G415R | +++ |
3123/3124 | K245M | + |
3125/3126 | G200A | +++ |
3127/3128 | E411Q | + |
3129/3130 | A213G | + |
3131/3132 | G415K | ++ |
3133/3134 | T409L | +++ |
3135/3136 | N423R | +++ |
3137/3138 | N172S | + |
3139/3140 | N65S | + |
3141/3142 | K106A | ++ |
3143/3144 | Q178K | + |
3145/3146 | N423A | ++ |
3147/3148 | N447R | + |
3149/3150 | D255P | +++ |
3151/3152 | N240C | ++ |
3153/3154 | S9M | ++ |
3155/3156 | H324R/N423R | +++ |
3157/3158 | N447L | + |
3159/3160 | K416R | + |
3161/3162 | V385R | + |
3163/3164 | N115D | + |
3165/3166 | N240L | ++ |
3167/3168 | E210L | ++ |
3169/3170 | G415A | ++ |
3171/3172 | G200V | + |
3173/3174 | N240P | + |
3175/3176 | N240V | + |
3177/3178 | I412R | + |
3179/3180 | G415H | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3016之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準1.1倍,但小於1.38倍;“++”=至少1.38倍但小於1.76倍;以及“+++”=至少1.76倍的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第10輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。添加0.002-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、8 mM甜菊糖苷A、0.4 mM ADP、24 mM蔗糖,及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在60℃下搖動歷時1h。反應稀釋1:20於水然後藉由添加20 µL稀釋的試料至80 µL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷且藉由4℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:10於水內且藉由RapidFire SPE-MS/MS來分析甜菊糖。0.25 g/L SFP裝載量的第10輪變異體對於甜菊糖苷A之活性顯示於表49.3內。表49.3中列出的全部5種變異體都具有比序列辨識編號:3016更高的活性。帶有突變K58R、I122L、V176R、T400V、K425R、S426A、I427R及S446R的變異體(序列辨識編號:3082)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:3081)是改良得最好的以及選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例50
序列辨識編號:3082之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表49.3 β1,2GT第10輪搖動燒瓶變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3016) | 增加的RebD a |
3061/3062 | I122L/I440R/S446R | + |
3081/3082 | K58R/I122L/V176R/T400V/K425R/S426A/I427R/S446R | ++ |
3089/3090 | K58R/I122L/V176R/V322L/H324G/S426A/I427R | + |
3091/3092 | K448A | + |
3099/3100 | P189R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3016之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.3倍;以及“++”=至少1.3倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:3082之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3081編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與前幾輪改良的活性有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十一輪(“第11輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出50種經工程處理之變異體(表50.1),以及自飽和致突變作用辨識出53種(表50.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3081變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋20倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,以10 μL稀釋的溶解產物及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764配於100 μL反應體積加上8 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及24 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。使反應稀釋、驟冷及如以上所述之分析。所生成具有SuS對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表50.1中。關於第11輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了使用10 mM甜菊糖苷A之受質裝載量外。所生成經工程處理之GT變異體多肽列於表50.2中。數種變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表50.1 β1,2GT第11輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3082) | 增加的RebD a |
3181/3182 | V164H/G200A/D236T | +++ |
3183/3184 | G8S/I139V/G200A/D236T/N240E/D255P/N423R | +++ |
3185/3186 | P107G/D236T/N240E/M325L/I440R | + |
3187/3188 | V164H/V322L/M325L/K416R/N423R | +++ |
3189/3190 | G8S/P107G/V164H/D255P | ++ |
3191/3192 | P107G/I139V/G200A/N240E/V322L/H324G/M325L/K448A | + |
3193/3194 | G8S | ++ |
3195/3196 | V164H/P189R/D236T/N240E | ++ |
3197/3198 | V164H/D236T/N423R | + |
3199/3200 | V164H/D236T/N240E/I440R | + |
3201/3202 | G8S/P107G/I139V/V164H/G415A/K416R/I440R/K448A | + |
3203/3204 | G8S/V164H/N240E/N423R | +++ |
3205/3206 | P107G/N423R | ++ |
3207/3208 | T12S/V164H/I440R | ++ |
3209/3210 | V164H/D236T | + |
3211/3212 | G8S/I139V/V164H/G200A/D236T/N240E/V322L/I440R/K448A | ++ |
3213/3214 | V164H/P189R/N240E/G252D/G415A/N423R | + |
3215/3216 | V164H/G200A/D236T/D255P/V322L/H324G/N423R/I440R | +++ |
3217/3218 | I139V | + |
3219/3220 | G8S/P107G/I139V/D255P/V322L/M325L/G415A/K416R/I440R/K448A | +++ |
3221/3222 | V164H/P189R | + |
3223/3224 | G8S/V164H/P189R/G200A/V322L/H324G/M325L/K416R/K448A | + |
3225/3226 | G8S/D236T/N240E/G252D/K448A | + |
3227/3228 | G8S/I139V/D255P/G415A/K416R | ++ |
3229/3230 | I139V/V164H/D236T/N240E | + |
3231/3232 | P107G/N240E/G252D/N423R/K448A | ++ |
3233/3234 | G8S/I139V/V164H/D236T/K416R/N423R/I440R | + |
3235/3236 | N240E/G252D/D255P/G415A/K448A | +++ |
3237/3238 | N240E/G252D/D255P/V322L/G415A/K416R | ++ |
3239/3240 | G8S/I139V | + |
3241/3242 | V164H/G200A/D236T/N240E/H324G/K416R/I440R | + |
3243/3244 | G8S/G252D/D255P/V322L/M325L/K448A | + |
3245/3246 | G200A/D236T/V322L/M325L/K416R | + |
3247/3248 | G200A/V322L/M325L/G415A/K448A | ++ |
3249/3250 | G415A/K416R/K448A | ++ |
3251/3252 | G8S/V164H/K448A | + |
3253/3254 | I139V/D255P/M325L/G415A/I440R | ++ |
3255/3256 | P107G/I139V | + |
3257/3258 | G8S/V164H/G252D/D255P/K448A | + |
3259/3260 | G8S/V164H | + |
3261/3262 | D236T/G415A/K416R | + |
3263/3264 | G8S/P107G/V164H/N423R/I440R | + |
3265/3266 | V164H/K416R/K448A | ++ |
3267/3268 | V164H/V322L/M325L | ++ |
3269/3270 | G8S/I139V/P189R/N240E/M325L/K416R | + |
3271/3272 | G8S/N240E/N423R | +++ |
3273/3274 | D255P/N423R | +++ |
3275/3276 | M325L | + |
3277/3278 | N240E | + |
3279/3280 | H2- | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3082之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.25倍,但小於1.44倍;“++”=至少1.44倍,但小於1.62倍;以及“+++”=至少1.62倍增加的生產。 |
表50.2 β1,2GT第11輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3082) | 增加的RebD a |
3385/3386 | H73T | + |
3387/3388 | N286L | + |
3389/3390 | F355A | ++ |
3391/3392 | P75H | + |
3393/3394 | D389F | ++ |
3395/3396 | E299L | ++ |
3397/3398 | H2T | + |
3399/3400 | L113I | +++ |
3401/3402 | H73A | +++ |
3403/3404 | K309R | ++ |
3405/3406 | P237M | + |
3407/3408 | R446H | + |
3409/3410 | H2N | ++ |
3411/3412 | P237V | ++ |
3413/3414 | T406N | +++ |
3415/3416 | H73P | + |
3417/3418 | E299R | + |
3419/3420 | E256I | + |
3421/3422 | D323P | + |
3423/3424 | P189S | + |
3425/3426 | T406F | + |
3427/3428 | H2S | + |
3429/3430 | T406Q | ++ |
3431/3432 | E299A | + |
3433/3434 | K34R | ++ |
3435/3436 | N286S | +++ |
3437/3438 | D305G | + |
3439/3440 | E313D | + |
3441/3442 | E256S | ++ |
3443/3444 | H73V | + |
3445/3446 | E256T | + |
3447/3448 | E186G | +++ |
3449/3450 | K422R | ++ |
3451/3452 | G8S | + |
3453/3454 | E186I | + |
3455/3456 | T406G | + |
3457/3458 | R446P | ++ |
3459/3460 | T239A | ++ |
3461/3462 | K422S | + |
3463/3464 | E299V | + |
3465/3466 | P237L | ++ |
3467/3468 | L312V | ++ |
3469/3470 | Q114V | +++ |
3471/3472 | H3I | + |
3473/3474 | E221K | + |
3475/3476 | L72Y | ++ |
3477/3478 | L312S | +++ |
3479/3480 | Q235M | +++ |
3481/3482 | E256L | +++ |
3483/3484 | D389G | + |
3485/3486 | K422C | + |
3487/3488 | L312T | +++ |
3489/3490 | E438T | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3082之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.15倍,但小於1.2倍;“++”=至少1.2倍,但小於1.27倍;以及“+++”=至少1.27倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第11輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。添加0.006-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、10 mM甜菊糖苷A、0.2 mM ADP、24 mM蔗糖,及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在60℃下搖動歷時2h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.025 g/L SFP裝載量對於甜菊糖苷A改良得最好之第11輪變異體為序列辨識編號:3244,其相對於序列辨識編號:1764具有突變G8S、G252D、D255P、V322L、M325L及K448A。此變異體,序列辨識編號:3244,用於進一步的定向演化。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷I之HTP偶聯檢定
序列辨識編號:3081編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中前幾輪對甜菊糖苷I之醣基轉移酶活性改良有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供一輪(“第11.04輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖苷I之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。細胞係用400 µL溶解緩衝劑予以溶解。於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3081變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定:25 μL溶解產物之溶解產物裝載量配於100 μL反應且加上1 mM甜菊糖苷I之受質裝載量以及1 mM ADP-葡萄糖之輔受質裝載量。使用下列反應條件:50 mM KPhos緩衝劑,pH 6,40℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時18 h。使反應稀釋1:4於水內然後藉由添加25 μL稀釋的試料至75 μL乙腈加上0.2%甲酸來驟冷。形成的混合物藉由4 ℃離心10 m來沈澱。使上清液稀釋1:5於水內且藉由如表44.1中所述之LC-MS/MS來分析。所生成具有對於甜菊糖苷I的葡萄糖基轉移酶活性的52種經工程處理之變異體列於表50.3中。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷I之分析
表50.3 β1,2GT第11輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3082) | 增加的RebM a |
3281/3282 | L126Q/P128A/F155R/R161G/N199A | + |
3283/3284 | W20Y/P128A/K160S/R161T/G198P | + |
3285/3286 | W20Y/L126Q/P128A/K160S/R161T/G198H | + |
3287/3288 | L126Q/P128A/K160S/N199A/P369N | + |
3289/3290 | P128A/K160S/R161G/P369N | + |
3291/3292 | P128A/F155R/K160S/G198P | + |
3293/3294 | L126H/P128A/K160S/G198H/P369N | + |
3295/3296 | P128A/G198H/N199A/P369N | + |
3297/3298 | N199A/P369N | ++ |
3299/3300 | L126Q/G198P/P369N | + |
3301/3302 | W20Y/L126H/K160S | + |
3303/3304 | L126Q/N199A/P369N | + |
3305/3306 | W20Y/F155R/R161T | + |
3307/3308 | W20Y/L126H/F155R/K160S/G198P | + |
3309/3310 | F155R/R161G/G198H/N199A | + |
3311/3312 | W20Y/L126H/P128A/R161T | + |
3313/3314 | L126H/K160S/G198P/P369N | + |
3315/3316 | L126Q/P128A/K160S/P369N | + |
3317/3318 | V121F/L126H/P128A/R161T/P369N | ++ |
3319/3320 | W20Y/P128A/F155R/N199A | + |
3321/3322 | P128A/F155R/K160S/R161T/N199A | + |
3323/3324 | W20Y/F155R/K160S/R161G | + |
3325/3326 | L126H/K160S/R161G/N199A/P369N | ++ |
3327/3328 | W20Y/L126Q/P128A/R161T/G198H/N199A | + |
3329/3330 | L126H/A196V/G198P/P369N | + |
3331/3332 | P128A/F155R/K160S/R161T | ++ |
3333/3334 | W20Y/P128A/F155R/K160S/R161T/G198H | + |
3335/3336 | W20Y/L126H/P128A/F155R/R161T | ++ |
3337/3338 | P128A/N199A/P369N | ++ |
3339/3340 | R161T/G198P/P369N | ++ |
3341/3342 | W20Y/L126H/K160S/R161T | ++ |
3343/3344 | L126H/P128A/R161G/P369N | ++ |
3345/3346 | L126Q/P128A/F155R/K160S/R161T/N199A | ++ |
3347/3348 | K160S/R161G/P369N | + |
3349/3350 | K160S/R161T/P369N | ++ |
3351/3352 | W20Y/P128A/F155R/R161T/N199A | ++ |
3353/3354 | L126H/P128A/F155R/K160S/R161T | + |
3355/3356 | W20Y/L126Q/R161G | + |
3357/3358 | F155R/N199A | ++ |
3359/3360 | W20Y/L126Q/P128A/K160S/R161T | +++ |
3361/3362 | L126H/P128A/R161G/N199A/P369N | +++ |
3363/3364 | P128A/F155R/N199A | +++ |
3365/3366 | R161T/P369N | +++ |
3367/3368 | L126Q/P128A/K160S/R161T/P369N | +++ |
3369/3370 | W20Y/L126Q/F155R/R161G | +++ |
3371/3372 | L126Q/P369N | +++ |
3373/3374 | W20Y/F155R/R161T/N199A | +++ |
3375/3376 | W20Y/K160S/R161T/G198H | +++ |
3377/3378 | W20Y/F155R/K160S | +++ |
3379/3380 | L126H/P128A/P369N | ++ |
3381/3382 | P128A/P369N | ++ |
3383/3384 | P128A/R161G/N199A/P369N | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3082之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少3.24倍,但小於4.14倍;“++”=至少4.14倍,但小於6倍;以及“+++”=大於6倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第11.04輪變異體對於甜菊糖苷I之活性。添加0.16-5 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、1 mM甜菊糖苷I,及1 mM ADP-葡萄糖。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時4h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.3 g/L SFP裝載量的第11.04輪變異體之甜菊糖苷M生產位準顯示於表50.4內。表50.4中列出的全部5種變異體對於RebI都具有比序列辨識編號:3082更高的活性。帶有突變L126Q、P128A、F155R、K160S、R161T及N199A的變異體(序列辨識編號:3346)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:3345)是改良得最好的以及選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷I之葡萄糖苷化。
實施例51
序列辨識編號:3244之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表50.4 β1,2GT第11輪搖動燒瓶變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3082) | 增加的RebM a |
3295/3296 | P128A/G198H/N199A/P369N | + |
3345/3346 | L126Q/P128A/F155R/K160S/R161T/N199A | ++ |
3377/3378 | W20Y/F155R/K160S | ++ |
3381/3382 | P128A/P369N | ++ |
3379/3380 | L126H/P128A/P369N | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3082之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.15倍,但小於1.8倍;以及“++”=至少1.8倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:3244之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3243編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與前幾輪改良的活性有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十二輪(“第12輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出50種經工程處理之變異體(表51.1),以及自飽和致突變作用辨識出31種(表51.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3243變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋40倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,稀釋的溶解產物於微量離心管熱循環儀內以62 ℃預培育0.5 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764配於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及37.5 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4.5 h。使反應稀釋、驟冷及如以上所述之分析。所生成具有SUS序列辨識編號:1764對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表51.1中。關於第12輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了稀釋的溶解產物於65℃預培育0.5 h外。所生成經工程處理之GT變異體多肽列於表51.2中。表51.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表51.1 β1,2GT第12輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3244) | 增加的RebD a |
3491/3492 | K106A/N172R/G200A/E210V/N240E/A242I/E408P/G415A/K416R/N423R | ++ |
3493/3494 | N240E/A242I/G415A/N423R | ++ |
3495/3496 | N240E/A242I | +++ |
3497/3498 | V164H/N240E/A242I/G415R/N423R | + |
3499/3500 | G200A/N240E/A242I/G407S | ++ |
3501/3502 | K106A/V164H/G200A/E210V/G415A | +++ |
3503/3504 | N240E | +++ |
3505/3506 | V164H/G200A/E408P/G415A/K416R | ++ |
3507/3508 | T409L/G415R | + |
3509/3510 | G200A/E408P/T409L | ++ |
3511/3512 | E210V/N240E | +++ |
3513/3514 | V164H/N240E/A242I/E408P | + |
3515/3516 | K106A/V164H/G200A/N240E/E408P/T409L/K416R | ++ |
3517/3518 | G200A/A242I/G415A/K416R/N423R | + |
3519/3520 | K106A/V164H/E210V/N240E/E408P/T409L/K416R | + |
3521/3522 | N172R/N240E | + |
3523/3524 | N172R/N240E/A242I/G415R | + |
3525/3526 | K106A/N240E/A242I/T409L | + |
3527/3528 | K106A/V164H/E210V/E408P/T409L | + |
3529/3530 | K106A/E210V/N240E/E408P/G415R | ++ |
3531/3532 | K106A/N172R/G200A/E210V/A242I | +++ |
3533/3534 | N240E/E408P | +++ |
3535/3536 | N172R/G200A/E408P/K416R | + |
3537/3538 | K106A/N172R/E408P/T409L | ++ |
3539/3540 | V164H/N172R/N240E/A242I/G415R | ++ |
3541/3542 | V164H/N172R/A242I/E408P | + |
3543/3544 | N172R/G200A/N240E | + |
3545/3546 | N172R/G200A/E210V/N240E/E408P | + |
3547/3548 | K106A/N172R/T409L/N423R | ++ |
3549/3550 | N240E/A242I/E408P/K416R | + |
3551/3552 | K106A/N240E/A242I | ++ |
3553/3554 | N172R/E210V/G415A | ++ |
3555/3556 | V164H/N172R/G200A/E210V/A242I/T409L | + |
3557/3558 | K106A/A242I/E408P/T409L | +++ |
3559/3560 | K106A/N172R/N240E/A242I/T409L/G415R | ++ |
3561/3562 | N240E/G415R | ++ |
3563/3564 | K106A/V164H/N172R/A242I/T409L/K416R | + |
3565/3566 | G200A/E210V/N240E/A242I/T409L | + |
3567/3568 | V164H/N423R | ++ |
3569/3570 | K106A/V164H/G200A/E210V/A242I | +++ |
3571/3572 | K106A/V164H/N240E/G415A | ++ |
3573/3574 | K106A/G200A/E210V/T409L | +++ |
3575/3576 | K106A/V164H/T409L/G415A/N423R | + |
3577/3578 | K106A/V164H/N172R/G200A/T409L | + |
3579/3580 | N172R/N240E/T409L | + |
3581/3582 | K106A/N172R/A242I/K416R/N423R | + |
3583/3584 | K106A/E210V/N240E | + |
3585/3586 | K106A/N172R/A242I | + |
3587/3588 | K106A/N172R/N240E | +++ |
3589/3590 | K106A/V164H/N172R/E210V/N240E/G415R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3244之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.8倍,但小於1.9倍;“++”=至少1.9倍,但小於2.07倍;以及“+++”=至少2.07倍增加的生產。 |
表51.2 β1,2GT第12輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3244) | 增加的RebD a |
3591/3592 | C46T | + |
3593/3594 | L49M | + |
3595/3596 | L49P | +++ |
3597/3598 | V134S | + |
3599/3600 | K143P | +++ |
3601/3602 | V134A | +++ |
3603/3604 | L49A | ++ |
3605/3606 | V278L | + |
3607/3608 | V179T | + |
3609/3610 | P232T | + |
3611/3612 | C46V | +++ |
3613/3614 | S105A | ++ |
3615/3616 | L49Q | ++ |
3617/3618 | L42I | + |
3619/3620 | V179D | ++ |
3621/3622 | I290L | ++ |
3623/3624 | Q35D | ++ |
3625/3626 | L42F | ++ |
3627/3628 | V134C | ++ |
3629/3630 | L49S | ++ |
3631/3632 | Q441R | + |
3633/3634 | L42V | + |
3635/3636 | A381G | + |
3637/3638 | L401V | + |
3639/3640 | V278I | + |
3641/3642 | R14K | + |
3643/3644 | K373R | + |
3645/3646 | Q441I | + |
3647/3648 | S336A | +++ |
3649/3650 | M181L | +++ |
3651/3652 | V179A | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3244之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.29倍;“++”=至少1.29倍,但小於1.4倍;以及“+++”=生產至少1.4倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第12輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。0.006-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)於62℃預培育歷時0.5 h然後添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊糖苷A、0.2 mM ADP、37.5 mM蔗糖,及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃及60℃下搖動歷時4.5 h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.025 g/L SFP裝載量的第12輪變異體對於甜菊糖苷A之轉化列於表51.3內。表51.3中列出的全部7種變異體於60℃下都具有比序列辨識編號:3244更高的活性,以及4種於50℃下沒有失去明顯的活性。選擇帶有突變K106A、V164H、G200A、E210V及G415A的變異體(序列辨識編號:3502)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:3501)用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例52
用於自甜菊糖苷I生產甜菊糖苷M之序列辨識編號:3346之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表51.3 β1,2GT第12輪搖動燒瓶變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3244) | 增加的RebD,60℃ a |
3501/3502 | K106A/V164H/G200A/E210V/G415A | +++ |
3515/3516 | K106A/V164H/G200A/N240E/E408P/T409L/K416R | + |
3531/3532 | K106A/N172R/G200A/E210V/A242I | ++ |
3539/3540 | V164H/N172R/N240E/A242I/G415R | ++ |
3573/3574 | K106A/G200A/E210V/T409L | +++ |
3581/3582 | K106A/N172R/A242I/K416R/N423R | ++ |
3589/3590 | K106A/V164H/N172R/E210V/N240E/G415R | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3244之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.24倍,但小於1.4倍;“++”=至少1.4倍,但小於1.5倍;以及“+++”=至少1.5倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:3346之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3345編碼之GT定向演化係藉由建構一基因庫來進行,該基因庫使酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。該庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下所述之高通量(HTP)檢定來篩選以提供一輪(“RebI第12輪”)具有對ADP-葡萄糖及甜菊糖苷I之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷M之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3345變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及繼而以25 μL溶解產物及0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1804配於100 μL反應體積加上1 mM甜菊糖苷I之受質裝載量以及1 mM ADP(Sigma,>95%)及15 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。如實施例50所述使反應稀釋、驟冷及分析。所生成具有SuS對於甜菊糖苷I偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體顯示於表52.1中。
實施例53
序列辨識編號:3502之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表52.1 β1,2GT第12輪RebI飽和致突變變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3346) | 增加的RebM a |
3759/3760 | G200T | + |
3761/3762 | F152L | + |
3763/3764 | P197D | + |
3765/3766 | P197Q | ++ |
3767/3768 | I202W | ++ |
3769/3770 | K143H | +++ |
3771/3772 | K187S | ++ |
3773/3774 | L195R | + |
3775/3776 | L195Y | ++ |
3777/3778 | G201W | ++ |
3779/3780 | Y268Q | + |
3781/3782 | P91M | + |
3783/3784 | G200P | ++ |
3785/3786 | P197W | + |
3787/3788 | L21M | + |
3789/3790 | G200E | ++ |
3791/3792 | F125C | +++ |
3793/3794 | Q127G | ++ |
3795/3796 | G201R | +++ |
3797/3798 | F264S | + |
3799/3800 | K143P/A150S | + |
3801/3802 | L21P | +++ |
3803/3804 | A130T/K187Q | +++ |
3805/3806 | I202A | + |
3807/3808 | E186V | + |
3809/3810 | G201A | ++ |
3811/3812 | L195S | + |
3813/3814 | F264T | + |
3815/3816 | G200R | +++ |
3817/3818 | F156Q | + |
3819/3820 | M364W | + |
3821/3822 | L195G | ++ |
3823/3824 | E186N | ++ |
3825/3826 | L145W | + |
3827/3828 | Q365L | +++ |
3829/3830 | G201S | ++ |
3831/3832 | Y268W | ++ |
3833/3834 | L195T | + |
3835/3836 | F125M | + |
3837/3838 | M364S | + |
3839/3840 | Y268F | ++ |
3841/3842 | G415D | + |
3843/3844 | F125V | + |
3845/3846 | L195F | +++ |
3847/3848 | F156P | ++ |
3849/3850 | P197L | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3346之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.07倍,但小於1.19倍;“++”=至少1.19倍,但小於1.33倍;以及“+++”=至少1.33倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:3502之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3501編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與前幾輪改良的活性有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十三輪(“第13輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出53種經工程處理之變異體(表53.1),以及自飽和致突變作用辨識出24種(表53.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3501變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋40倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,稀釋的溶解產物於微量離心管熱循環儀內以69℃預培育0.8 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物及0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764配於100 μL反應體積加上15 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及37.5 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。使反應稀釋、驟冷及如以上所述之分析。所生成具有SUS序列辨識編號:1764對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表53.1中。關於第13輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了稀釋的溶解產物於68℃預培育0.5 h,使用0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1804,以及使用0.1或0.2 mM ADP。所生成經工程處理之GT變異體多肽列於表53.2中。表53.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表53.1 β1,2GT第13輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3502) | 增加的RebD a |
3653/3654 | P237L | + |
3655/3656 | E186G/P237V/N286S | + |
3657/3658 | H2-/H5N/L113I/E186G/P237V/T406Q | +++ |
3659/3660 | H5N/E186G/P237V/K245T/E256I/T406Q | + |
3661/3662 | E186G/P237L | ++ |
3663/3664 | K34R/L113I/E186G/P237L/T406N | + |
3665/3666 | H5N/K34R/H73A/L113I/T406N | + |
3667/3668 | H5N/E186G/P237V/T406Q | ++ |
3669/3670 | H73A/P237V | + |
3671/3672 | H5N/L113I/P237V/T406N | + |
3673/3674 | E186G | ++ |
3675/3676 | H2-/H73A/E186G/P237V | + |
3677/3678 | H73A/E186G/P237L/T406Q | +++ |
3679/3680 | H5N/E256L/T406Q | ++ |
3681/3682 | L113I/E186G/T406Q | + |
3683/3684 | E186G/T406N | + |
3685/3686 | E186G/T406Q | + |
3687/3688 | H5N/H73A/E186G/T406N | ++ |
3689/3690 | P189S/N333H/F355A/S421Q | + |
3691/3692 | H2S/N286Q/F355A/K416R/K422R | ++ |
3693/3694 | H2S/P189S/N286Q | + |
3695/3696 | H73P/N172R/N240E/A242I/E408P | + |
3697/3698 | H73P/Q235M/N240E/E408P | + |
3699/3700 | H73P/N172R/Q235M/T239A/N240E | ++ |
3701/3702 | H73P/N172R/T239A/N240E | + |
3703/3704 | H73P/T239A/A242I | ++ |
3705/3706 | T239A/N240E | + |
3707/3708 | N172R/Q235M/N240E | + |
3709/3710 | L72Y/N172R/N240E/A242I | + |
3711/3712 | T239A/N240E/A242I/E256S/D323P | + |
3713/3714 | N240E/A242I/E256S/E438T | + |
3715/3716 | N172R/E188G/D323P | ++ |
3717/3718 | H73P/Q235M/N240E/D323P | ++ |
3719/3720 | A242I/E408P | + |
3721/3722 | T239A/N240E/E408P | +++ |
3723/3724 | H73P/N172R | + |
3725/3726 | H73P/N172R/T239A/N240E/A242I | +++ |
3727/3728 | T239A/A242I/E408P | + |
3729/3730 | L72Y/H73P/N172R/Q235M/N240E/A242I/E438T | ++ |
3731/3732 | Q235M/T239A/N240E | ++ |
3733/3734 | N172R | + |
3735/3736 | Q235M/N240E/A242I | +++ |
3737/3738 | N172R/T239A/N240E/A242I/D323P/E408P | ++ |
3739/3740 | H73P/N172R/Q235M/T239A/A242I | + |
3741/3742 | N172R/Q235M | ++ |
3743/3744 | T239A/N240E/A242I/D323P/E408P | ++ |
3745/3746 | H73P/N172R/N240E/E408P | +++ |
3747/3748 | L72Y/N172R/T239A/N240E/A242I/E408P | +++ |
3749/3750 | N172R/Q235M/T239A/E408P | + |
3751/3752 | N172R/N240E/E299A/D323P | ++ |
3753/3754 | N172R/Q235M/N240E/A242I/E438T | +++ |
3755/3756 | N172R/N240E | +++ |
3757/3758 | N172R/Q235M/T239A/N240E/A242I | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3502之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.58倍,但小於1.79倍;“++”=至少1.79倍,但小於2.07倍;以及“+++”=至少2.07倍增加的生產。 |
表53.2 β1,2GT第13輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3502) | 增加的RebD a |
3851/3852 | E186R | ++ |
3853/3854 | K187T | ++ |
3855/3856 | N199Y | + |
3857/3858 | Q132H | ++ |
3859/3860 | S153G | + |
3861/3862 | Q132T | + |
3863/3864 | A196S | + |
3865/3866 | S153A | + |
3867/3868 | Q127V | +++ |
3869/3870 | N199A | + |
3871/3872 | I144V | + |
3873/3874 | E186A | ++ |
3875/3876 | K187A | + |
3877/3878 | Q127L | + |
3879/3880 | Q132K | + |
3881/3882 | G96P | ++ |
3883/3884 | K187R | +++ |
3885/3886 | N199S | ++ |
3887/3888 | E186G | +++ |
3889/3890 | G96A | ++ |
3891/3892 | A200S | + |
3893/3894 | F156W | + |
3895/3896 | Q127I | +++ |
3897/3898 | F155M | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3502之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.15倍;“++”=至少1.15倍,但小於1.18倍;以及“+++”=至少1.18倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第13輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。0.006-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)於69℃預培育歷時50 min然後添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊糖苷A、0.2 mM ADP、37.5 mM蔗糖,及0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1804。反應係於一種Thermotron滴定板搖動器內、以300 RPM在60℃下搖動歷時4 h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.025 g/L SFP裝載量的第13輪變異體對於甜菊糖苷A之轉化列於表53.3內。表53.3中列出的全部10種變異體都具有比序列辨識編號:3502更高的活性。帶有突變H73P、N172R、N240E、A242I及E408P的變異體(序列辨識編號:3696)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:3695)是改良得最好的以及選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例54
序列辨識編號:3696之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表53.3 β1,2GT第13輪搖動燒瓶變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3502) | 增加的RebD a |
3695/3696 | H73P/N172R/N240E/A242I/E408P | +++ |
3689/3690 | P189S/N333H/F355A/S421Q | +++ |
3675/3676 | H2-/H73A/E186G/P237V | ++ |
3745/3746 | H73P/N172R/N240E/E408P | ++ |
3691/3692 | H2S/N286Q/F355A/K416R/K422R | ++ |
3657/3658 | H2-/H5N/L113I/E186G/P237V/T406Q | + |
3699/3700 | H73P/N172R/Q235M/T239A/N240E | + |
3703/3704 | H73P/T239A/A242I | + |
3693/3694 | H2S/P189S/N286Q | + |
3677/3678 | H73A/E186G/P237L/T406Q | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3502之參考多肽來判定且定義如下:相對於參考多肽,“+”=生產至少參考多肽的位準1.79倍,但小於3倍;“++”=至少3倍增加的生產但小於3.6倍;以及“+++”=至少3.6倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:3696之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3695編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與前幾輪改良的活性有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十四輪(“第14輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出75種經工程處理之變異體(表54.1),以及自飽和致突變作用辨識出49種(表54.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3695變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋40倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,稀釋的溶解產物於微量離心管熱循環儀內以72 ℃預培育0.5 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物及0.1 g/L蔗糖合成酶(SUS)SFP序列辨識編號:1804配於100 μL反應體積加上20 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及50 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。使反應稀釋、驟冷及如以上所述之分析。所生成具有SuS對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表54.1中。關於第14輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了溶解產物稀釋80倍且於70℃預培育0.5 h之外。所生成經工程處理之GT變異體多肽列於表54.2中。表54.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表54.1 β1,2GT第14輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3696) | 增加的RebD a |
3899/3900 | I26V/L42V/C46V/V134A | + |
3901/3902 | L42V/C46V/L49P/V134C/Q235R/F355A/L401V | ++ |
3903/3904 | L42I/C46V/L49S/V134C/E186G | + |
3905/3906 | I26V/L49Q/V134A | + |
3907/3908 | C46V/L49Q/V134T | + |
3909/3910 | I26V/V134T/L401V | +++ |
3911/3912 | I26V/L42V/V134C/L401V | + |
3913/3914 | L42V/C46V/L49A/V134A/L401V | + |
3915/3916 | I26V/L42I/L49Q/V134C/E186G/F355A | +++ |
3917/3918 | I26V/L42I/L49Q/V134C/L401V | ++ |
3919/3920 | I26V/L42V/L49S/V134C | + |
3921/3922 | L42V/L49A/V134C/E186G/F355A | +++ |
3923/3924 | I26V/L42V/C46V/L49A/V134C/E186G | + |
3925/3926 | L42V/C46V/L49S/T97P/V134C/L401V | ++ |
3927/3928 | L42V/C46V/L49A/V134T/E186G/F355A | + |
3929/3930 | I26V/V134A/E186G/F355A/L401V | + |
3931/3932 | L42I/C46V/L49S/E186G | + |
3933/3934 | I26V/L42V/C46V/L49A | ++ |
3935/3936 | I26V/F355A/L401V | + |
3937/3938 | L42V/V134C/E186G | ++ |
3939/3940 | L42I/C46V/L49A/V134A | ++ |
3941/3942 | L42V/L49S/V134A/E186G/L401V | ++ |
3943/3944 | E186G/F355A | + |
3945/3946 | I26V/L42V | ++ |
3947/3948 | V134C/L401V | + |
3949/3950 | L42V/L49S/V134C/F355A/L401V | + |
3951/3952 | I26V/V134A | +++ |
3953/3954 | I26V/V134C/F355A | + |
3955/3956 | I26V/L42V/C46V/L49A/V134A | +++ |
3957/3958 | L49S/V134C/F355A | + |
3959/3960 | L42V/E186G/F355A | ++ |
3961/3962 | H2-/K143P/P232T/K373R/Q441R | + |
3963/3964 | H2-/K143P/K373R/Q441R | + |
3965/3966 | H5N/P237L/K373R/K422R | + |
3967/3968 | S105A/K373R/Q441R | + |
3969/3970 | H5N/K143P/P189S/P232T/P237V/Q441R | + |
3971/3972 | K143P/P232T | + |
3973/3974 | K143P/P189S/P232T/K422R/Q441R | + |
3975/3976 | H5N/K143P/P232T/K373R/K422R/Q441R | + |
3977/3978 | S105A/K143P/P232T/P237V/K373R/K416R/K422R/Q441R | + |
3979/3980 | K143P/P237V | + |
3981/3982 | H2-/H5N/Q35D/S105A/K143P/P237V/K373R/K416R/K422R | + |
3983/3984 | P189S/P232T/K373R/K416R/K422R/Q441R | ++ |
3985/3986 | S105A/P237L/K373R/K422R/Q441R | +++ |
3987/3988 | S105A/K373R | +++ |
3989/3990 | H5N/S105A/P237V/K416R/K422R/Q441R | + |
3991/3992 | H2-/H5N/Q35D/P232T/V278L/K373R/K416R | ++ |
3993/3994 | S105A/P189S/P237V | ++ |
3995/3996 | H2-/H5N/S105A/K143P/P232T/K373R/K416R/K422R | + |
3997/3998 | H2-/H5N/V278L | +++ |
3999/4000 | P232T/P237L | ++ |
4001/4002 | P237L/K422R | + |
4003/4004 | H5N/K143P/K373R | +++ |
4005/4006 | K143P | +++ |
4007/4008 | Q35D/S105A/P189S/P232T/K373R/K416R | + |
4009/4010 | H2-/H5N/Q35D/K143P/P232T/P237L/K416R/K422R/Q441R | + |
4011/4012 | S105A/P237L/V278L/K373R/K416R/K422R | ++ |
4013/4014 | H5N/S105A/P232T/P237L/K373R/K416R/Q441R | ++ |
4015/4016 | H5N/K143P/P232T/P237L/K416R/K422R | +++ |
4017/4018 | S105A/K143P/V278L/K373R | ++ |
4019/4020 | K143P/P237L/K422R/Q441R | +++ |
4021/4022 | H5N/P232T/K416R/K422R | + |
4023/4024 | H5N/Q35D/P232T/K373R/K416R/K422R | ++ |
4025/4026 | P189S/P237L/V278I/K416R/Q441R | ++ |
4027/4028 | H5N/K143P/P237L/V278L/K373R/K416R/K422R | ++ |
4029/4030 | K143P/P189S/P237L/K373R/K416R/K422R | +++ |
4031/4032 | K143P/P189S | +++ |
4033/4034 | H5N/S105A/P237L/V278I/K422R/Q441R | + |
4035/4036 | H5N/K373R/K416R | ++ |
4037/4038 | P237V/K373R/Q441R | ++ |
4039/4040 | Q35D | + |
4041/4042 | H2-/S105A/K143P/P232T/P237L/V278L/K373R/Q441R | ++ |
4043/4044 | H5N/P189S/P237V/V278I/K373R/K416R/K422R/Q441R | + |
4045/4046 | H5N/K143P/P232T/P237L/V278L | ++ |
4047/4048 | P237V/K373R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3696之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.5倍,但小於1.75倍;“++”=至少1.75倍,但小於2倍;以及“+++”=至少2倍增加的生產。 |
表54.2 β1,2GT第14輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號: (nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3696) | 增加的RebD a |
4049/4050 | A426L | + |
4051/4052 | S352A | ++ |
4053/4054 | T239F | + |
4055/4056 | R176Q | +++ |
4057/4058 | Q235R | +++ |
4059/4060 | F158W | + |
4061/4062 | H330C | ++ |
4063/4064 | T239Y | ++ |
4065/4066 | D243Y | +++ |
4067/4068 | T239P | ++ |
4069/4070 | H164E | +++ |
4071/4072 | D249H | + |
4073/4074 | D243R | + |
4075/4076 | H3N | + |
4077/4078 | R427S | + |
4079/4080 | H164F | + |
4081/4082 | I50P | + |
4083/4084 | S8R | + |
4085/4086 | T239G | + |
4087/4088 | T239M | ++ |
4089/4090 | S8V | ++ |
4091/4092 | D249G | ++ |
4093/4094 | D243G | ++ |
4095/4096 | P237A | + |
4097/4098 | D243H | ++ |
4099/4100 | D243S | ++ |
4101/4102 | H164L | + |
4103/4104 | P237L | + |
4105/4106 | D193F | + |
4107/4108 | R176P | +++ |
4109/4110 | I50V | +++ |
4111/4112 | R176T | + |
4113/4114 | H164A | + |
4115/4116 | A101L | ++ |
4117/4118 | I248T | + |
4119/4120 | T223A | ++ |
4121/4122 | T223L/D243G | + |
4123/4124 | Q137R | ++ |
4125/4126 | R427T | ++ |
4127/4128 | E61Y | + |
4129/4130 | E240V | +++ |
4131/4132 | E61N | +++ |
4133/4134 | M364Q | + |
4135/4136 | Q301A | ++ |
4137/4138 | K62A | ++ |
4139/4140 | R161L | + |
4141/4142 | D323T | + |
4143/4144 | D244N | +++ |
4145/4146 | T239Q | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3696之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.1倍,但小於1.18倍;“++”=至少1.18倍,但小於1.24倍;以及“+++”=至少1.24倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第14輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。0.006-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)於72℃預培育歷時0.5 h然後添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、20 mM甜菊糖苷A、0.2 mM ADP、50 mM蔗糖,及0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1804。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM搖動歷時4 h,預培育的SFP係在60℃下或沒有進行預培育的SFP係在55℃下執行。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.05 g/L SFP裝載量的第14輪變異體之甜菊糖苷D生產位準係顯示於表54.3內。表54.3列出的8種變異體中的3種於兩種條件下均具有比序列辨識編號:3696更高的活性。考慮到兩種條件,帶有突變I26V、L42V、C46V、L49A及V134A的變異體(序列辨識編號:3956)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:3955)是改良得最好的以及選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例55
序列辨識編號:3956之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表54.3 β1,2GT第14輪搖動燒瓶變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3696) | 增加的RebD,60℃ a |
3899/3900 | I26V/L42V/C46V/V134A | ++ |
3921/3922 | L42V/L49A/V134C/E186G/F355A | ++ |
3955/3956 | I26V/L42V/C46V/L49A/V134A | ++ |
3961/3962 | H2-/K143P/P232T/K373R/Q441R | + |
3969/3970 | H5N/K143P/P189S/P232T/P237V/Q441R | + |
3987/3988 | S105A/K373R | + |
3997/3998 | H2-/H5N/V278L | + |
4041/4042 | H2-/S105A/K143P/P232T/P237L/V278L/K373R/Q441R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3696之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.13倍,但小於1.4倍;以及“++”=至少1.4倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:3956之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:3955編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與前幾輪改良的活性有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十五輪(“第15輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出62種經工程處理之變異體(表55.1),以及自飽和致突變作用辨識出113種(表55.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:3956變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋40倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,稀釋的溶解產物於微量離心管熱循環儀內以76 ℃預培育0.5 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物及0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1840配於100 μL反應體積加上20 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及50 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。使反應稀釋、驟冷及如以上所述之分析。所生成具有SUS序列辨識編號:1840對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表55.1中。關於第15輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了稀釋的溶解產物於65℃預培育16 h及使用0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:2064。所生成經工程處理之GT變異體多肽列於表55.2中。表55.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表55.1 β1,2GT第15輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3956) | 增加的RebD a |
4147/4148 | A49S/S153A/F155M | ++ |
4149/4150 | S153A/N199S/T406Q | + |
4151/4152 | G96A/S153A/F155M/F156W | + |
4153/4154 | G96P/Q127I/S153A/F155M | + |
4155/4156 | A49S/G96P/Q132K/F155M/P237L/V278L | + |
4157/4158 | Q132H/F155M | + |
4159/4160 | A49S/G96P/F155M/N199S/A200S/T406Q | + |
4161/4162 | G96P/Q127I/Q132H/S153A/V278L | ++ |
4163/4164 | G96P/S153A/F155M/N199S/A200S/P237L | + |
4165/4166 | S153A/F155M/A196S/N199S/P237L | + |
4167/4168 | Q127I/Q132H/F155M/F156W/T406Q | + |
4169/4170 | G96A/Q132K/S153A/F155M/F156W | + |
4171/4172 | G96A/Q132K/S153A/F155M/F156W/A200S | + |
4173/4174 | G96P/S153A/T406Q | + |
4175/4176 | Q127I/T406Q | + |
4177/4178 | Q132K/P237L | + |
4179/4180 | A49S/G96A/Q127I/Q132K/F156W/A196S | +++ |
4181/4182 | A49S/G96P/Q127I/S153A/V278L | +++ |
4183/4184 | Q127I/S153A/F155M/N199S/A200S/P237L | ++ |
4185/4186 | Q127I/Q132H/S153A/F156W | +++ |
4187/4188 | S153A/P237L | ++ |
4189/4190 | Q132K/S153A/F155M | +++ |
4191/4192 | A49S/G96P/Q132H/F155M | ++ |
4193/4194 | S153A/F155M/F156W/P237L | +++ |
4195/4196 | G96A/Q132H/S153A/F156W | +++ |
4197/4198 | G96P/Q132H/S153A/F155M/F156W | ++ |
4199/4200 | A49S/G96A/Q132H/S153A/N199S/A200S | + |
4201/4202 | G96P/Q132K/V278L | +++ |
4203/4204 | Q127I/Q132H | + |
4205/4206 | G96P/Q132H/A196S/N199S | + |
4207/4208 | G96P/Q132K/S153A/F155M | ++ |
4209/4210 | Q132H/S153A/P237L/T406Q | ++ |
4211/4212 | F155M/N199S | ++ |
4213/4214 | A49S/G96P/Q132H/S153A/F155M/F156W/P237L/V278L/T406Q | ++ |
4215/4216 | H5N/P73A/I144V/K187R/K373R/K422R | ++ |
4217/4218 | H5N/I144V/V179T/M181L/K373R/K422R | ++ |
4219/4220 | V179T/M181L/E186A | + |
4221/4222 | K143P/V179T/M181L/E186G/K187R/K422R/N423R | + |
4223/4224 | V179D/K187T/K373R/K422R | ++ |
4225/4226 | H5N/P73A/I144V/V179D/E186A/K373R/N423R | +++ |
4227/4228 | I144V/V179T/M181L/E186A/K187R/K373R | +++ |
4229/4230 | V179D/M181L/E186G/K187R/N423R | ++ |
4231/4232 | P73A/L113I/V179T/M181L/E186A/K187R | ++ |
4233/4234 | K373R/N423R | + |
4235/4236 | V179T/E186A/K187T | + |
4237/4238 | M181L/E186G/K187R/K422R/N423R | + |
4239/4240 | L113I/I144V/E186G/N423R | + |
4241/4242 | I144V/V179T/E186A/K187T/K373R | ++ |
4243/4244 | K143P/I144V/V179T/M181L/E186G/K187R/K422R | + |
4245/4246 | L113I/K373R/K422R | + |
4247/4248 | P73A/L113I/K143P/V179T/M181L/K422R | ++ |
4249/4250 | L113I/I144V/K373R | ++ |
4251/4252 | P73A/M181L/E186A/K187T | +++ |
4253/4254 | H5N/K143P/I144V/V179T/M181L/E186G/K187R/K373R | + |
4255/4256 | P73A/K143P/I144V/V179D/E186G/K187T/K373R/N423R | +++ |
4257/4258 | H5N/I144V/K373R/K422R | +++ |
4259/4260 | L113I/K143P/V179D/E186G/K187R | + |
4261/4262 | P73A/V179D/M181L/E186G/K187R/K373R | ++ |
4263/4264 | L113I/M181L/E186A/K373R/K422R | + |
4265/4266 | H5N/P73A/K143P/I144V/V179D/E186G/K187R/K422R | + |
4267/4268 | P73A/V179D/M181L/E186A/K373R/K422R | ++ |
4269/4270 | H5N/P73A/L113I/E186G/K187R/K373R/N423R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3956之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.75倍,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於2.38倍;以及“+++”=至少2.38倍增加的生產。 |
表55.2 β1,2GT第15輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3956) | 增加的RebD a |
4271/4272 | T12L | + |
4273/4274 | L222F | ++ |
4275/4276 | T220G | +++ |
4277/4278 | M238I | + |
4279/4280 | K117N | + |
4281/4282 | E388S | + |
4283/4284 | K57H | + |
4285/4286 | F41H | + |
4287/4288 | S66L | + |
4289/4290 | Y449L | +++ |
4291/4292 | P73S | ++ |
4293/4294 | L74M/M238V | + |
4295/4296 | D236L | ++ |
4297/4298 | H83R | + |
4299/4300 | N65R | + |
4301/4302 | P408T | ++ |
4303/4304 | E388A | + |
4305/4306 | K214T | + |
4307/4308 | M238G | +++ |
4309/4310 | Q132G | ++ |
4311/4312 | P82S | + |
4313/4314 | D387P | ++ |
4315/4316 | Y449H | ++ |
4317/4318 | M238A | ++ |
4319/4320 | K450V | ++ |
4321/4322 | K309T | +++ |
4323/4324 | K57G | ++ |
4325/4326 | D389G | ++ |
4327/4328 | K103Q | + |
4329/4330 | R391A | +++ |
4331/4332 | Y44H | + |
4333/4334 | K160Q | + |
4335/4336 | T406S | + |
4337/4338 | R391L | + |
4339/4340 | T406G | ++ |
4341/4342 | G138K | + |
4343/4344 | T220S | ++ |
4345/4346 | D236T | + |
4347/4348 | M238S | + |
4349/4350 | Y44S/K187T | ++ |
4351/4352 | N65Q | ++ |
4353/4354 | N286G | + |
4355/4356 | R391V | + |
4357/4358 | R418H | + |
4359/4360 | H85W | + |
4361/4362 | L135E | + |
4363/4364 | G138T | + |
4365/4366 | P140G | + |
4367/4368 | L45Y | +++ |
4369/4370 | Q11L | + |
4371/4372 | R418A | +++ |
4373/4374 | K214H | + |
4375/4376 | T223D | +++ |
4377/4378 | V70W | + |
4379/4380 | M238R | +++ |
4381/4382 | H393P | ++ |
4383/4384 | N65G | +++ |
4385/4386 | N65C | ++ |
4387/4388 | I55G | + |
4389/4390 | E299V | + |
4391/4392 | D236V | ++ |
4393/4394 | K103H | + |
4395/4396 | R182I | ++ |
4397/4398 | P408L | + |
4399/4400 | K57P | ++ |
4401/4402 | D389V | ++ |
4403/4404 | Q114I | ++ |
4405/4406 | K111F | + |
4407/4408 | Y449S | + |
4409/4410 | K309R | ++ |
4411/4412 | R182L | +++ |
4413/4414 | I55L | + |
4415/4416 | K160T | + |
4417/4418 | K117S | + |
4419/4420 | T12I | + |
4421/4422 | H393T | + |
4423/4424 | R418M | ++ |
4425/4426 | Y449R | + |
4427/4428 | K422L | ++ |
4429/4430 | K226Q | + |
4431/4432 | E430P | + |
4433/4434 | I55A | ++ |
4435/4436 | K56R | ++ |
4437/4438 | K450N | + |
4439/4440 | N65P | + |
4441/4442 | L113S | +++ |
4443/4444 | P162L | +++ |
4445/4446 | K160D | +++ |
4447/4448 | D387R | +++ |
4449/4450 | E256R | +++ |
4451/4452 | P73H | +++ |
4453/4454 | P167L | + |
4455/4456 | P140C | +++ |
4457/4458 | I412G | +++ |
4459/4460 | L159N | ++ |
4461/4462 | I412R | ++ |
4463/4464 | R391S | +++ |
4465/4466 | Q114G | + |
4467/4468 | M238T | ++ |
4469/4470 | L72V | +++ |
4471/4472 | G138S | ++ |
4473/4474 | Q11D | ++ |
4475/4476 | R182Y | + |
4477/4478 | D389A | + |
4479/4480 | K309S | + |
4481/4482 | E429D | ++ |
4483/4484 | R182Q | + |
4485/4486 | D387Q | + |
4487/4488 | K309P | ++ |
4489/4490 | D389L | + |
4491/4492 | R182V | + |
4493/4494 | Y449G | + |
4495/4496 | R182T | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3956之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.15倍,但小於1.22倍;“++”=至少1.22倍,但小於1.35倍;以及“+++”=至少1.35倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第15輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。0.006-0.2 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)於76℃預培育歷時0.5 h然後添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、20 mM甜菊糖苷A、0.2 mM ADP、50 mM蔗糖,及0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:2064。預培育的SFP係在60℃下或沒有預培育者係在55℃下、於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM歷時4h予以執行反應。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.025 g/L SFP裝載量的第15輪變異體之甜菊糖苷D生產係列於表55.3內。表55.3列出的9種變異體中的5種於兩種條件下均具有比序列辨識編號:3956更高的活性。考慮到兩種條件,帶有突變P73A、K143P、I144V、V179D、E186G、K187T、K373R及N423R的變異體(序列辨識編號:4256)及其編碼多核苷酸(序列辨識編號:4255)是改良得最好的以及選擇用於進一步的定向演化供用於甜菊糖苷A之葡萄糖苷化。
實施例56
序列辨識編號:4256之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表55.3 β1,2GT第15輪搖動燒瓶變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:3956) | 增加的RebD,60℃ a |
4149/4150 | S153A/N199S/T406Q | ++ |
4151/4152 | G96A/S153A/F155M/F156W | + |
4193/4194 | S153A/F155M/F156W/P237L | + |
4217/4218 | H5N/I144V/V179T/M181L/K373R/K422R | ++ |
4225/4226 | H5N/P73A/I144V/V179D/E186A/K373R/N423R | +++ |
4251/4252 | P73A/M181L/E186A/K187T | + |
4255/4256 | P73A/K143P/I144V/V179D/E186G/K187T/K373R/N423R | +++ |
4267/4268 | P73A/V179D/M181L/E186A/K373R/K422R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:3956之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.4倍,但小於1.75倍;“++”=至少1.75倍,但小於1.9倍;以及“+++”=至少1.9倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:4256之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:4255編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與前幾輪改良的活性有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十六輪(“第16輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出27種經工程處理之變異體(表56.1),以及自飽和致突變作用辨識出66種(表56.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:4255變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋40倍。關於篩選重組前幾輪有利突變之基因庫方面,稀釋的溶解產物於微量離心管熱循環儀內以79 ℃預培育0.5 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物及0.05 g/L蔗糖合成酶(SUS)SFP序列辨識編號:2064配於100 μL反應體積加上20 mM甜菊糖苷A之受質裝載量以及0.2 mM ADP(Sigma,>95%)及50 mM蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。使反應稀釋、驟冷及如以上所述之分析。所生成具有與SUS序列辨識編號:2064對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體係列於表56.1中。關於第16輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了使用0.05 g/L蔗糖合成酶SFP序列辨識編號:2510外。所生成經工程處理之GT變異體多肽係列於表56.2中。表56.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A之分析
表56.1 β1,2GT第16輪組合變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4256) | 增加的RebD a |
4497/4498 | R427S | + |
4499/4500 | S153A/F155M/R427T | + |
4501/4502 | S153A | + |
4503/4504 | F155M/F156W | + |
4505/4506 | K62A/S153A/F155M/F156W/L159V | +++ |
4507/4508 | S153A/F156W/L159V | + |
4509/4510 | S153A/F155M/P237L/M238T/T239F/T406Q | +++ |
4511/4512 | S153A/F156W/N199S/P237L/R427T | ++ |
4513/4514 | S153A/L159V/P237L/M238G/S352A | ++ |
4515/4516 | F156W/N199S/R427T | +++ |
4517/4518 | F156W/N199S | + |
4519/4520 | S153A/F156W/R427T | +++ |
4521/4522 | F155M/F156W/R176Q/M181L/N199S | ++ |
4523/4524 | F155M/F156W/R176Q/M238T/R427S | + |
4525/4526 | K62A/S153A/F155M/N199S/T406Q | ++ |
4527/4528 | S153A/R176Q/M181L/R427S | ++ |
4529/4530 | S153A/F155M/M238T/T239F | + |
4531/4532 | F155M/M181L/N199S/M238G/T406Q | +++ |
4533/4534 | S153A/F155M/F156W/L159V/N199S/M238G/T406Q | + |
4535/4536 | K62A/S153A/F155M/F156W/L159V/R427T | + |
4537/4538 | S153A/F155M/F156W | ++ |
4539/4540 | H164E/I375L/N433D | + |
4541/4542 | I375L | ++ |
4543/4544 | I50V/Q137R/P189G/I375L | ++ |
4545/4546 | T223A/I375L | + |
4547/4548 | Q137R/H164E/I375L | + |
4549/4550 | S8V/I375L | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4256之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.75倍,但小於2.08倍;“++”=至少2.08倍,但小於2.33倍;以及“+++”=至少2.33倍增加的生產。 |
表56.2 β1,2GT第16輪飽和致突變變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4256) | 增加的RebD a |
4551/4552 | Y449K | +++ |
4553/4554 | A106S | + |
4555/4556 | N445R | ++ |
4557/4558 | E192L | +++ |
4559/4560 | F280W | ++ |
4561/4562 | S110G | + |
4563/4564 | L116I | + |
4565/4566 | N115A | + |
4567/4568 | A106K | + |
4569/4570 | Q132R | +++ |
4571/4572 | K416R | ++ |
4573/4574 | Y449Q | + |
4575/4576 | V385S | ++ |
4577/4578 | S9G | + |
4579/4580 | A106R | ++ |
4581/4582 | T220S | + |
4583/4584 | H99R | + |
4585/4586 | T220Q | ++ |
4587/4588 | N445K | ++ |
4589/4590 | N302P | + |
4591/4592 | G395Q | +++ |
4593/4594 | N65F | ++ |
4595/4596 | V385P | +++ |
4597/4598 | E192A | + |
4599/4600 | A200S | ++ |
4601/4602 | E131C | +++ |
4603/4604 | R423L | +++ |
4605/4606 | N447L | ++ |
4607/4608 | E136R | ++ |
4609/4610 | Y449R | ++ |
4611/4612 | N302S | + |
4613/4614 | E131S | ++ |
4615/4616 | N115T | + |
4617/4618 | P335R | + |
4619/4620 | E192P | + |
4621/4622 | Q399K | + |
4623/4624 | M238L | + |
4625/4626 | K245P | ++ |
4627/4628 | D190T | +++ |
4629/4630 | Q132T | + |
4631/4632 | T12S | + |
4633/4634 | I412R | +++ |
4635/4636 | E304I | + |
4637/4638 | R272H | + |
4639/4640 | M238I | + |
4641/4642 | A170E | +++ |
4643/4644 | P335K | ++ |
4645/4646 | T220M | +++ |
4647/4648 | H68I | + |
4649/4650 | E136S | + |
4651/4652 | G10D | ++ |
4653/4654 | N257H | +++ |
4655/4656 | Q178L | + |
4657/4658 | P194F | +++ |
4659/4660 | V385A | + |
4661/4662 | Y449L | + |
4663/4664 | V385C | + |
4665/4666 | E136G | + |
4667/4668 | I242L | ++ |
4669/4670 | P408E | + |
4671/4672 | E136D | + |
4673/4674 | G7H | + |
4675/4676 | N445H | + |
4677/4678 | K402R | + |
4679/4680 | E53N | ++ |
4681/4682 | Q132G | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4256之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.07倍,但小於1.27倍;“++”=至少1.27倍,但小於1.42倍;以及“+++”=至少1.42倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第16輪變異體對於甜菊糖苷A之活性。0.003-0.1 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)於79℃預培育歷時0.5 h然後添加至100 μL總反應體積內,其含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、20 mM甜菊糖苷A、0.2 mM ADP、50 mM蔗糖,及0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2432。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在60℃下執行歷時4 h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.0125 g/L SFP裝載量的第16輪變異體之甜菊糖苷D生產位準顯示於表56.3內。序列辨識編號:4550為改良得最好且被選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊糖苷A以形成甜菊糖苷D。
實施例57
序列辨識編號:4550之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表56.3 β1,2GT第16輪搖動燒瓶變異體及RebD位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4256) | 增加的RebD a |
4549/4550 | S8V/I375L | +++ |
4539/4540 | H164E/I375L/N433D | +++ |
4497/4498 | R427S | ++ |
4545/4546 | T223A/I375L | ++ |
4515/4516 | F156W/N199S/R427T | + |
4531/4532 | F155M/M181L/N199S/M238G/T406Q | + |
4543/4544 | I50V/Q137R/P189G/I375L | + |
4501/4502 | S153A | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4256之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.3倍;“++”=至少1.3倍,但小於1.6倍;以及“+++”=至少1.6倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:4550之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:4549編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十七輪(“第17輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出73種經工程處理之變異體(表57.1)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A 60之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:4549變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋50或100倍至20 g/L甜菊糖苷A 60%且以75 ℃預培育2 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:2510及0.2 g/L β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)SFP序列辨識編號:6864配於100 μL反應體積加上20 g/L甜菊糖苷A 60%(RebA60)之受質裝載量以及0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)及40 g/L蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋40x於水內來溶解反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,藉由離心來沈澱,以及稀釋10x至水內用於如上所述之分析。所生成具有SuS對於甜菊糖苷A偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表57.1中。表57.2中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A 60之分析
表57.1 β1,2GT第17輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4550) | 增加的RebM a |
7215/7216 | R427S | ++ |
7217/7218 | N65G/P143K/Q235R/R427S | + |
7219/7220 | N65G/Q114I/K422L/R427S | + |
7221/7222 | R427S/E429D | ++ |
7223/7224 | R418A/R427S | + |
7225/7226 | N65G/Q114I/R427S | ++ |
7227/7228 | N65G/P143K | + |
7229/7230 | Y44H/A73H/Q127I/L135E | ++ |
7231/7232 | Q11L/A73S/Q132K/L135E/P408A | + |
7233/7234 | Q11L/F41H/Q132K/V278L | +++ |
7235/7236 | Q11L/Q127I/Q132K/L135E/T406S | +++ |
7237/7238 | Q132K/L135E/R182I | ++ |
7239/7240 | L45Y/T406G | ++ |
7241/7242 | R182L | + |
7243/7244 | L45Y/A73H/Q132K/L135E/R182L | +++ |
7245/7246 | L45Y/A73H/Q127I/Q132K/L135E/T406G/P408A | +++ |
7247/7248 | Q11L/F41H/Y44H/Q127I/Q132K/T406G | + |
7249/7250 | Q11L/R182L/T406S | + |
7251/7252 | L45Y/Q127I/Q132K/L135E/R182T/T406G/P408A | + |
7253/7254 | Q11L/A73H/Q127I/Q132K/T406G/P408A | +++ |
7255/7256 | A73H/Q127I | ++ |
7257/7258 | Y44H/L45Y/Q127I/Q132K/L135E/G138T/R182L/T406S/P408A | + |
7259/7260 | Q11L/F41H/L45Y/A73H/Q127I/V278L/T406G/P408A | + |
7261/7262 | Q11L/Q127I/Q132K/L135E | +++ |
7263/7264 | Q11L/L45Y/Q127I/Q132K/L135E/G138T/R182T | ++ |
7265/7266 | Y44H/L45Y/Q127I/Q132K/V278L | +++ |
7267/7268 | Y44H/A73S/Q132K/L135E/T406G/P408A | ++ |
7269/7270 | Q132K/L135E/T406G | + |
7271/7272 | F41H/A73H/Q132K/L135E/T406G | + |
7273/7274 | Q11L/Y44H/A73S/Q127I/Q132K/L135E/T406G/P408A | + |
7275/7276 | Q11L/Y44H/Q127I | + |
7277/7278 | Q11L/Y44H/Q132K/V278L/T406G | + |
7279/7280 | Q11L/Y44H/A73H/Q127I/Q132K/L135E | ++ |
7281/7282 | Q11L/Q127I/Q132K/R182T | + |
7283/7284 | Q11L/A73H/Q127I/Q132K/V278L/T406G/P408A | +++ |
7285/7286 | F41H/Y44H/L45Y/A73H/Q127I/Q132K/V278L | +++ |
7287/7288 | F41H/L45Y/Q127I/Q132K/L135E/V278L/T406S | +++ |
7289/7290 | L45Y/A73H/Q132K | +++ |
7291/7292 | Q11L/L45Y/T406G | ++ |
7293/7294 | Q11L/A73H/Q132K | ++ |
7295/7296 | L45Y/Q127I/Q132K | +++ |
7297/7298 | T406G | + |
7299/7300 | L45Y/Q132K/P408A | ++ |
7301/7302 | A73H/Q127I/Q132K | ++ |
7303/7304 | Y44H/L45Y/A73H/Q132K/L135E/T406G | ++ |
7305/7306 | Q11L/Q127I/Q132K/G138T/R182L | +++ |
7307/7308 | Q11L/A73S/Q127I/Q132K/L135E/R182L/V278L | +++ |
7309/7310 | Q11L/F41H/L45Y/Q127I/V278L/T406G | ++ |
7311/7312 | L45Y/Q127I/Q132K/L135E/R182L | ++ |
7313/7314 | Y44H/A73S/Q127I/L135E/R182L/V278L/T406G/P408A | + |
7315/7316 | Q127I | ++ |
7317/7318 | Q132K/L135E | ++ |
7319/7320 | L45Y/Q127I/L135E | ++ |
7321/7322 | Q127I/Q132K/L135E/R182I/T406G | + |
7323/7324 | Q132K/T406S | ++ |
7325/7326 | Q11L/L45Y/A73H/Q127I/L135E | + |
7327/7328 | Q11L/F41H/Y44H/Q127I/V278L/T406S | + |
7329/7330 | L45Y/A73S/V278L/T406G/P408A | ++ |
7331/7332 | Q127I/Q132K/L135E/R182L | + |
7333/7334 | Q11L/Y44H/L45Y/Q127I | + |
7335/7336 | Q11L/Q127I/Q132K/L135E/R182L | + |
7337/7338 | Q11L/Q132K/L135E/T406G/ | ++ |
7339/7340 | H164E/T220G/K309S/Y449H | + |
7341/7342 | H164E/T220G/Y449L | + |
7343/7344 | K309P/Y449L | + |
7345/7346 | K57G | + |
7347/7348 | H164E | + |
7349/7350 | Y449L | + |
7351/7352 | K309R | + |
7353/7354 | T220G/Y449H | + |
7355/7356 | K56R/K309P/Y449L | + |
7357/7358 | H164E/Y449H | + |
7359/7360 | K309T/Y449H | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4550之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.2倍,但小於1.52倍;“++”=至少1.52倍,但小於2.1倍;以及“+++”=至少2.1倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第17輪變異體對於甜菊糖苷A 60%之活性。配於100 μL總反應體積之0.0003-0.04 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)係予以檢定,總反應體積含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、20 g/L RebA60、0.1 g/L ADP、40 g/L蔗糖、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:2510,及0.2 g/L β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)SFP序列辨識編號:6864。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在60℃下執行歷時16-18 h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.005 g/L SFP裝載量的第17輪變異體於一鍋反應內之甜菊糖苷M生產結果顯示於表57.2內。辨識出序列辨識編號:7324是改良得最好的且選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊糖苷A以形成甜菊糖苷D。
實施例58
序列辨識編號:7324之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表57.2 β1,2GT第17輪搖動燒瓶變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4550) | 增加的RebM a |
7215/7216 | R427S | - |
7225/7226 | N65G/Q114I/R427S | - |
7227/7228 | N65G/P143K | + |
7265/7266 | Y44H/L45Y/Q127I/Q132K/V278L | - |
7273/7274 | Q11L/Y44H/A73S/Q127I/Q132K/L135E/T406G/P408A | - |
7285/7286 | F41H/Y44H/L45Y/A73H/Q127I/Q132K/V278L | - |
7323/7324 | Q132K/T406S | ++ |
7343/7344 | K309P/Y449L | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4550之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.15倍;以及“++”=至少1.15倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:7324之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:7323編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因組合庫來進行。基因庫與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十八輪(“第18輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組的有利突變辨識出90種經工程處理之變異體(表58.1),以及自飽和致突變作用辨識出124種(表58.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A 60之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:7323變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋80倍至20 g/L甜菊糖苷A 60%且以75 ℃預培育1.5 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:7506及0.1 g/L β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)SFP序列辨識編號:7388配於100 μL反應體積加上20 g/L甜菊糖苷A 60%(RebA60)之受質裝載量以及0.05 g/L ADP(Amresco,超純級)及40 g/L蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋40x於水內來溶解反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,藉由離心來沈澱,以及稀釋10x至水內用於如以上所述之分析。所生成具有SuS對於RebA60偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表58.1中。關於第18輪飽和致突變基因庫,執行如上所述的篩選,除了溶解產物稀釋100倍至50 mM Kphos pH6且於75 ℃預培育1 h。所生成經工程處理之GT變異體多肽列於表58.2中。表58.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A 60之分析
表58.1 β1,2GT第18輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7324) | 增加的RebM a |
7765/7766 | L116I/D190T/S406G/P408A | ++ |
7767/7768 | L116I/M238L/K245P | + |
7769/7770 | D190T/P194F/I412R | + |
7771/7772 | D190T/P194F/P335R/K416R | + |
7773/7774 | D190T/P194F | ++ |
7775/7776 | D190T/E192L/P194F | +++ |
7777/7778 | A170E/P194F/P335R/K416R | + |
7779/7780 | E192L/P194F | + |
7781/7782 | A170E/P335K/K416R | ++ |
7783/7784 | D190T/P194F/M238L/K245P | ++ |
7785/7786 | P194F | ++ |
7787/7788 | A170E/E192L/P194F/P335K | + |
7789/7790 | A170E/P194F | + |
7791/7792 | A170E/D190T/E192L/P194F | ++ |
7793/7794 | D190T | + |
7795/7796 | N115A/D190T/P194F | ++ |
7797/7798 | A170E/M238L | + |
7799/7800 | A170E/E192L | + |
7801/7802 | N115T/L116I/V278L | + |
7803/7804 | D190T/K245P/I412R | + |
7805/7806 | A170E/P335K | ++ |
7807/7808 | L116I/A170E/D190T | ++ |
7809/7810 | L116I/K416R | + |
7811/7812 | N115A/A170E/D190T/M238L/I412R | + |
7813/7814 | N115A/K245P/V278L | +++ |
7815/7816 | E192L/P194F/I242L/S406G/P408A | +++ |
7817/7818 | L116I/M238L | + |
7819/7820 | A170E/E192L/P194F/V278L | ++ |
7821/7822 | A170E | ++ |
7823/7824 | V278L | ++ |
7825/7826 | R272H/V385P | ++ |
7827/7828 | G10D/Q127I/K132R/V385P | + |
7829/7830 | G10D/A73H | + |
7831/7832 | G10D/E53N/R423L | ++ |
7833/7834 | E53N/K132G/E136R/N302P/R423L/R427S | + |
7835/7836 | G10D/K132R/N302P/V385P | +++ |
7837/7838 | G10D | + |
7839/7840 | K132G | + |
7841/7842 | A73H/V385S/R427S | +++ |
7843/7844 | A73H | +++ |
7845/7846 | V385S/R427S | + |
7847/7848 | N302P/V385S | + |
7849/7850 | G10D/E53N/R272H/R423L/R427S | + |
7851/7852 | Q127I | + |
7853/7854 | E53N/Q127I/K132R/V385S | ++ |
7855/7856 | N257H/V385S | ++ |
7857/7858 | N302P/V385P | +++ |
7859/7860 | E53N/A73H/A200S/R423L | ++ |
7861/7862 | A73H/K132R/E136R/V385S/R427S | ++ |
7863/7864 | V385S | +++ |
7865/7866 | G10D/A73H/Q127I | +++ |
7867/7868 | G7V/G10D/A73H/Q127I/K132G/V385P/R423L | ++ |
7869/7870 | R423L/R427S | +++ |
7871/7872 | A200S | +++ |
7873/7874 | A73H/V385S | +++ |
7875/7876 | E53N/Q127I/E136R/V385L | +++ |
7877/7878 | R272H/N302P | +++ |
7879/7880 | E53N/K132G/N302P/V385S/R423L/R427S | +++ |
7881/7882 | A200S/V385S | +++ |
7883/7884 | G10D/E53N/A73H/H99R | ++ |
7885/7886 | A73H/Q127I/R427S | +++ |
7887/7888 | T220M/N445K | + |
7889/7890 | N65G/T220Q/N445R/Y449K | + |
7891/7892 | Y449L | + |
7893/7894 | Q399K/S406G | + |
7895/7896 | Q399K/S406G/Y449L | +++ |
7897/7898 | P143K/K309P/N445K/N447L/Y449L | + |
7899/7900 | N65G/K402R/S406G/N445R/Y449R | ++ |
7901/7902 | P143K/K309P/K402R | + |
7903/7904 | N65G/Q399K/S406G/N447L/Y449R | + |
7905/7906 | T220Q/N445K/N447L | + |
7907/7908 | N445K/Y449L | + |
7909/7910 | K309P/Q399K/Y449L | ++ |
7911/7912 | N445R/Y449L | + |
7913/7914 | S406G/N445R/Y449K | + |
7915/7916 | N445R/N447L/Y449L | ++ |
7917/7918 | N65G/N445K/N447L/Y449R | ++ |
7919/7920 | S406G/N445R/N447L/Y449L | ++ |
7921/7922 | S406G/N445K/Y449R | +++ |
7923/7924 | N65G/A106R/N445K/N447L/Y449L | ++ |
7925/7926 | P143K/T220Q/N445K/N447L | + |
7927/7928 | K402R/N445R/Y449L | + |
7929/7930 | N65G/T220Q/K309P/N445R/N447L | + |
7931/7932 | A106R/T220Q/Q399K/K402R/S406G | + |
7933/7934 | N65G/N447L/Y449L | ++ |
7935/7936 | N447L | ++ |
7937/7938 | K309P/N445K/N447L/Y449L | + |
7939/7940 | N65G/T220Q/N445R/Y449R | + |
7941/7942 | T220Q/Q399K | + |
7943/7944 | N65G/P143K/T220Q | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7324之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.16倍;“++”=至少1.16倍,但小於1.23倍;以及“+++”=至少1.23倍增加的生產。 |
表58.2 β1,2GT第18輪飽和致突變變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7324) | 增加的RebM a |
8091/8092 | N51Q | + |
8093/8094 | A434C | + |
8095/8096 | S64R | ++ |
8097/8098 | V46Q | + |
8099/8100 | V46L | ++ |
8101/8102 | Q11L/Y44H | +++ |
8103/8104 | V46C | + |
8105/8106 | V46T | ++ |
8107/8108 | A49K | ++ |
8109/8110 | D119T/R172H | ++ |
8111/8112 | V376N | + |
8113/8114 | G410R | + |
8115/8116 | A130S | + |
8117/8118 | A49N/S406G/P408A | + |
8119/8120 | A398R | +++ |
8121/8122 | G356T | ++ |
8123/8124 | I420F | ++ |
8125/8126 | D274Q | + |
8127/8128 | Q11L/E71P | +++ |
8129/8130 | A381C | ++ |
8131/8132 | P118S | ++ |
8133/8134 | D274T | +++ |
8135/8136 | S64G | +++ |
8137/8138 | A398H | ++ |
8139/8140 | V133H | ++ |
8141/8142 | D119G | ++ |
8143/8144 | P118A | ++ |
8145/8146 | A49G | ++ |
8147/8148 | K100R | + |
8149/8150 | G338S | + |
8151/8152 | N157E | + |
8153/8154 | V259T | + |
8155/8156 | P118L | ++ |
8157/8158 | A141Q | ++ |
8159/8160 | D179I | ++ |
8161/8162 | I43T | +++ |
8163/8164 | S406G/P408A | +++ |
8165/8166 | P169E | +++ |
8167/8168 | Q441L | ++ |
8169/8170 | Q11L/V287S | +++ |
8171/8172 | N108G/R172H | +++ |
8173/8174 | V376S | +++ |
8175/8176 | G356S | + |
8177/8178 | E71T | +++ |
8179/8180 | I397L/S406G/P408A | ++ |
8181/8182 | I420L | + |
8183/8184 | Q11L/E71T | + |
8185/8186 | N51M | + |
8187/8188 | D119S | + |
8189/8190 | A398K | + |
8191/8192 | N333S/S406G/P408A | + |
8193/8194 | V287L | + |
8195/8196 | A398L | + |
8197/8198 | E437G | + |
8199/8200 | R172H/I420L | +++ |
8201/8202 | R172H/E437D | + |
8203/8204 | V42A | +++ |
8205/8206 | V287A | ++ |
8207/8208 | A141G | +++ |
8209/8210 | S47N | +++ |
8211/8212 | P118A/S406G/P408A | + |
8213/8214 | Q11L/Q441S | + |
8215/8216 | P118V | +++ |
8217/8218 | S64L | +++ |
8219/8220 | V417C | +++ |
8221/8222 | M275L | +++ |
8223/8224 | V376G | +++ |
8225/8226 | E437V | +++ |
8227/8228 | E396A | +++ |
8229/8230 | E76H | +++ |
8231/8232 | V133R | ++ |
8233/8234 | T97V | + |
8235/8236 | H2T | ++ |
8237/8238 | I112T | + |
8239/8240 | I112N | + |
8241/8242 | N157T | + |
8243/8244 | F109V | ++ |
8245/8246 | S64A | + |
8247/8248 | F109L | + |
8249/8250 | L401T | + |
8251/8252 | V133S | + |
8253/8254 | V287S | + |
8255/8256 | D119A | + |
8257/8258 | V287K | + |
8259/8260 | P118I | + |
8261/8262 | I43L | + |
8263/8264 | R394H/I420W | + |
8265/8266 | N108T | + |
8267/8268 | V376R | + |
8269/8270 | N288P | + |
8271/8272 | T48S/A398V | + |
8273/8274 | V385A | + |
8275/8276 | I112Q | + |
8277/8278 | M181H | ++ |
8279/8280 | V133L | + |
8281/8282 | A134S | ++ |
8283/8284 | N157C | + |
8285/8286 | N51V | + |
8287/8288 | N333S/A398T | + |
8289/8290 | M181T | + |
8291/8292 | T97L | ++ |
8293/8294 | E396S | ++ |
8295/8296 | H4F | + |
8297/8298 | A141S | ++ |
8299/8300 | I112V | +++ |
8301/8302 | V42D/G138C | ++ |
8303/8304 | S64V | + |
8305/8306 | E76L | + |
8307/8308 | K117R/N157T/Q301R | + |
8309/8310 | V376M | + |
8311/8312 | S64Q | + |
8313/8314 | V417S | ++ |
8315/8316 | V42A/A141P | ++ |
8317/8318 | A398M | + |
8319/8320 | A37G | + |
8321/8322 | I112R | ++ |
8323/8324 | I43M | ++ |
8325/8326 | F109Y | ++ |
8327/8328 | V357T | + |
8329/8330 | D179R | ++ |
8331/8332 | I43A | + |
8333/8334 | G40Q | + |
8335/8336 | V42G | +++ |
8337/8338 | S64F | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7324之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.1倍,但小於1.22倍;“++”=至少1.22倍,但小於1.3倍;以及“+++”=至少1.3倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第18輪變異體對於甜菊糖苷A 60%之活性。配於100 μL總反應體積之0.0013-0.04 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)係予以檢定,總反應體積含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、20 g/L RebA60、0.05 g/L ADP、40 g/L蔗糖、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:7506,及0.15 g/L β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)SFP序列辨識編號:7388。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在60℃下執行歷時16-18 h。如以上所述使反應稀釋、驟冷及分析。0.005 g/L SFP裝載量的第18輪變異體於一鍋反應內之甜菊糖苷M生產位準顯示於表58.3內。帶有序列辨識編號:7784的變異體是改良得最好的變異體。因而,其被選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊糖苷A以形成甜菊糖苷D。
實施例59
序列辨識編號:7784之β-1,2-ADP-醣基轉移酶變異體
表58.3 β1,2GT第18輪搖動燒瓶變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7324) | 增加的RebM a |
7783/7784 | D190T/P194F/M238L/K245P | ++ |
7795/7796 | N115A/D190T/P194F | ++ |
7805/7806 | A170E/P335K | - |
7813/7814 | N115A/K245P/V278L | + |
7841/7842 | A73H/V385S/R427S | - |
7869/7870 | R423L/R427S | - |
7885/7886 | A73H/Q127I/R427S | - |
7895/7896 | Q399K/S406G/Y449L | + |
7903/7904 | N65G/Q399K/S406G/N447L/Y449R | ++ |
7933/7934 | N65G/N447L/Y449L | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7324之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.08倍;以及“++”=至少1.08倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:7784之GT多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:7783編碼之GT定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行。基因庫與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及酵素某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的HTP檢定來篩選以提供第十九輪(“第19輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之GT變異體多肽。自重組庫辨識出87種經工程處理之變異體(表59.1),以及自飽和致突變庫辨識出58種(表59.2)。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP至甜菊糖苷A 60之HTP偶聯檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:7783變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解緩衝劑體積為400 µL,以及溶解產物稀釋100倍至50 mM磷酸鉀,pH 6.0,且以75 ℃預培育1 h。繼而以10 μL稀釋的溶解產物、0.04 g/L SUS SFP序列辨識編號:8420及0.1 g/L β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)SFP序列辨識編號:8088,配於100 μL反應體積加上20 g/L甜菊糖苷A 60%(RebA60)之受質裝載量以及0.025 g/L ADP(Amresco,超純級)及40 g/L蔗糖之輔受質裝載量來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16-18 h。藉由稀釋20x於水內來溶解反應,藉由稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,藉由離心來沈澱,以及稀釋20x至水內用於如以上所述之分析。所生成具有SuS對於RebA60偶聯的葡萄糖基轉移酶活性的經工程處理之變異體列於表59.1及59.2中。表59.3中列出的變異體係以搖動燒瓶規模培養物予以生長、溶解及冷凍乾燥成粉末。
搖動燒瓶粉末的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP至甜菊糖苷A 60之分析
表59.1 β1,2GT第19輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7784) | 增加的RebM a |
8623/8624 | S64R | + |
8625/8626 | I112T | +++ |
8627/8628 | Q11L/S64R/F109V | ++ |
8629/8630 | S64R/N65G/F109V | + |
8631/8632 | Q11L | ++ |
8633/8634 | S64R/N65G/I112T | ++ |
8635/8636 | S64R/N65G/I112N | ++ |
8637/8638 | F109V/I112T | + |
8639/8640 | F109V/S406G | + |
8641/8642 | F109L/I112T | + |
8643/8644 | F109V | ++ |
8645/8646 | F109V/A134S | + |
8647/8648 | I112N/N445K | + |
8649/8650 | S64R/N445K | ++ |
8651/8652 | S64R/A134S | + |
8653/8654 | F109V/N115A/P118V | +++ |
8655/8656 | N65G/I112N/N445K | + |
8657/8658 | S64R/I112N | + |
8659/8660 | Q11L/N445K | + |
8661/8662 | N65G/I112N | + |
8663/8664 | V42G/I43M | + |
8665/8666 | V46T/N51Q | + |
8667/8668 | A141P | + |
8669/8670 | A73H/A141P | +++ |
8671/8672 | A141G | ++ |
8673/8674 | A73H/N302P | ++ |
8675/8676 | E71T/A73H/A141S | ++ |
8677/8678 | E71T | ++ |
8679/8680 | E71T/N302P | + |
8681/8682 | A73H | ++ |
8683/8684 | A73H/A141G | +++ |
8685/8686 | E71T/A141P | +++ |
8687/8688 | A141S/N302P | +++ |
8689/8690 | E71T/A73H/A141G | ++ |
8691/8692 | A73H/L116I/A141P | + |
8693/8694 | N302P | + |
8695/8696 | A73H/A141S | + |
8697/8698 | A141S | + |
8699/8700 | V46L/S47N/N51Q | ++ |
8701/8702 | V42A/Y44H/E71T/A73H/L116I | ++ |
8703/8704 | A141G/N302P | + |
8705/8706 | S47N/A49G | + |
8707/8708 | S47N/N51V | + |
8709/8710 | E71T/A73H | + |
8711/8712 | I43T/A73H/A141P | + |
8713/8714 | V287L/N288P | ++ |
8715/8716 | V287S/A398T | + |
8717/8718 | V287S/Q399K | +++ |
8719/8720 | Q127I/P169E/R172H | + |
8721/8722 | V376M/A398M | + |
8723/8724 | Q399K | +++ |
8725/8726 | V287S/V376M | + |
8727/8728 | A398R | ++ |
8729/8730 | V287M | ++ |
8731/8732 | A398M/Q399K/I420F | ++ |
8733/8734 | N288P/Q399K | +++ |
8735/8736 | Q127I/P169E/A398L/Q399K | +++ |
8737/8738 | V287L/Q399K | +++ |
8739/8740 | A398M | ++ |
8741/8742 | I420F | + |
8743/8744 | A398T/Q399K | + |
8745/8746 | Q127I/V287S | + |
8747/8748 | P169E/A398T | ++ |
8749/8750 | P169E/R172H/V287S | + |
8751/8752 | Q127I | + |
8753/8754 | V376M/Q399K | + |
8755/8756 | N288P/A398K | + |
8757/8758 | Q127I/P169E/V287S | ++ |
8759/8760 | Q127I/V376M | +++ |
8761/8762 | V376M | + |
8763/8764 | Q127I/P169E/V376M/A398M/Q399K | + |
8765/8766 | A398M/Q399K | ++ |
8767/8768 | A398L/Q399K | + |
8769/8770 | P169E/R172H/A398M/Q399K | ++ |
8771/8772 | V376M/A398L | ++ |
8773/8774 | P169E/R172H/N288P | + |
8775/8776 | V287S | +++ |
8777/8778 | L116I/V287S | + |
8779/8780 | N288P | +++ |
8781/8782 | P169E/A398M/Q399K | ++ |
8783/8784 | A398R/Q399K | ++ |
8785/8786 | N288P/V376S/A398L | + |
8787/8788 | A398L | +++ |
8789/8790 | P169E/V287S | +++ |
8791/8792 | V287S/I420F/R423L/R427S | +++ |
8793/8794 | A398L/R427S | ++ |
8795/8796 | P169E/R172H/N288P/A398L/Q399K/I420F/R423L/R427S | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7784之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.1倍,但小於1.18倍;“++”=至少1.18倍,但小於1.24倍;以及“+++”=至少1.24倍增加的生產。 |
表59.2 β1,2GT第19輪飽和致突變變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7784) | 增加的RebM a |
9107/9108 | Q127A | + |
9109/9110 | L16T | ++ |
9111/9112 | I331V | ++ |
9113/9114 | V15L/R394H | ++ |
9115/9116 | Y123A | ++ |
9117/9118 | I202Y | + |
9119/9120 | A22G | + |
9121/9122 | P143G | ++ |
9123/9124 | L16A | +++ |
9125/9126 | L116I/P143R | + |
9127/9128 | G198Q | +++ |
9129/9130 | F125L | +++ |
9131/9132 | V144S | +++ |
9133/9134 | F156V | + |
9135/9136 | Y268W | +++ |
9137/9138 | Q127G | +++ |
9139/9140 | G201K | +++ |
9141/9142 | I331C | + |
9143/9144 | L116I/M350L | ++ |
9145/9146 | L36M | + |
9147/9148 | G201A | + |
9149/9150 | L116I | ++ |
9151/9152 | N199S | ++ |
9153/9154 | H93A | + |
9155/9156 | Q127V | ++ |
9157/9158 | V144G | + |
9159/9160 | L16G | + |
9161/9162 | P197H | + |
9163/9164 | G201N | + |
9165/9166 | H324R | + |
9167/9168 | N199Y | + |
9169/9170 | Y123L | +++ |
9171/9172 | G201L | + |
9173/9174 | Y123V | ++ |
9175/9176 | L13Q | + |
9177/9178 | I202A | + |
9179/9180 | G10D/V144L | +++ |
9181/9182 | Y123S | +++ |
9183/9184 | V144Q | + |
9185/9186 | G186N | ++ |
9187/9188 | Y123G | + |
9189/9190 | L116I/Y123S | ++ |
9191/9192 | G96M | + |
9193/9194 | M350L | + |
9195/9196 | V287A | ++ |
9197/9198 | T187Y | + |
9199/9200 | M203T | ++ |
9201/9202 | R14Q | + |
9203/9204 | N199R | ++ |
9205/9206 | G89A | ++ |
9207/9208 | V15A | ++ |
9209/9210 | G10D/N199G | +++ |
9211/9212 | L116I/Y123N | + |
9213/9214 | A149S | ++ |
9215/9216 | T187G | + |
9217/9218 | N199G | +++ |
9219/9220 | N199P | ++ |
9221/9222 | G10D | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7784之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.1倍,但小於1.18倍;“++”=至少1.18倍,但小於1.27倍;以及“+++”=至少1.27倍增加的生產。 |
執行一搖動燒瓶粉末裝載量劑量反應實驗以特徵化經工程處理之第19輪變異體對於甜菊糖苷A 60%之活性。配於100 μL總反應體積之0.0013-0.04 g/L位準的搖動燒瓶粉末(SFP)係予以檢定,總反應體積含有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、20 g/L RebA60或RebA97、0.025 g/L ADP、20(單一受質)或40 g/L(一鍋)蔗糖、0.04 g/L SUS SFP序列辨識編號:8420,及,僅供一鍋反應,0.15 g/L β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)SFP序列辨識編號:8088。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在60℃下歷時16-18h予以執行。使反應稀釋、驟冷及如以上所述分析。第19輪變異體分別為0.0025及0.005 g/L SFP裝載量於單一受質之甜菊糖苷D及一鍋反應內之甜菊糖苷M的生產位準顯示於表59.3內。帶有序列辨識編號:9180的變異體是改良得最好的變異體。因而,其被選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊糖苷A以形成甜菊糖苷D。
實施例60
序列辨識編號:696之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
表59.3 β1,2GT第19輪搖動燒瓶變異體及RebD與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7784) | 增加的RebD a | 增加的RebM a |
8635/8636 | S64R/N65G/I112N | - | + |
8651/8652 | S64R/A134S | ++ | ++ |
8685/8686 | E71T/A141P | + | + |
8765/8766 | A398M/Q399K | + | + |
8789/8790 | P169E/V287S | - | + |
9131/9132 | V144S | + | ++ |
9169/9170 | Y123L | - | - |
9179/9180 | G10D/V144L | + | ++ |
9181/9182 | Y123S | - | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7784之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.1倍;以及“++”=至少1.1倍增加的生產。 |
此實施例說明用於改良甜菊糖利用ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:696之β1,3-醣基轉移酶(GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:695編碼之GT(即,序列辨識編號:696)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與以上前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第八輪(“第8輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的65種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:695變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。用400 µL溶解緩衝劑含有0.5 mg/mL溶菌酶及0.5 mg/mL PMBS配於25 mM Tris-HCl pH 7.5來溶解小丸1.5 h且藉由離心使澄清。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上5 mM甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1222及15 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM KPhos緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4-5 h。繼而,藉由稀釋20x於水內來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以4 ℃離心10 m,以及上清液稀釋5x至水內用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:696更多之醣基轉移酶變異體多肽。大多數以三重複針對甜菊苷(95%純度)再測試。經工程處理之多肽列於表60.1中。搖動燒瓶規模的培養物係如實施例31中所述予以生長供用於SFP生產用於表60.2中顯示、相對於序列辨識編號:696的變異體分析。
SFP特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表60.1 β1,3GT第8輪變異體及RebM與RebA位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:696) | 增加的RebM a | 增加的RebA a |
4683/4684 | T262S/W401L | ++ | ND |
4685/4686 | I189L/M206K/K208A/V365I | ++ | ND |
4687/4688 | K185R/K208A/E230S/S252N/S255N/D290E/V365I | ++ | ND |
4689/4690 | V365I/W401L/V413L/V435Q | ++ | ND |
4691/4692 | K208A/V365I/V435Q | +++ | ND |
4693/4694 | S304P/P322S/V365I/W401L | ++ | ND |
4695/4696 | L249N | + | + |
4697/4698 | L249M | + | + |
4699/4700 | Q71R | + | + |
4701/4702 | L249S | + | + |
4703/4704 | I243L | + | + |
4705/4706 | K51A | + | ++ |
4707/4708 | K200N | + | + |
4709/4710 | L249Y | + | + |
4711/4712 | R308F | ++ | + |
4713/4714 | P339D | + | + |
4715/4716 | L249E | + | + |
4717/4718 | L78F | + | - |
4719/4720 | L78R | + | - |
4721/4722 | L249I | ++ | ++ |
4723/4724 | R88K | + | - |
4725/4726 | L78Q | + | - |
4727/4728 | L78I | + | - |
4729/4730 | C366A | + | + |
4731/4732 | F352Q | ++ | + |
4733/4734 | L245G | + | + |
4735/4736 | L78G | +++ | - |
4737/4738 | I25V | + | + |
4739/4740 | L78K | ++ | - |
4741/4742 | L78M | + | - |
4743/4744 | S374T | + | + |
4745/4746 | L249T | + | + |
4747/4748 | L78P | ++ | - |
4749/4750 | K200S | + | + |
4751/4752 | N56L | + | + |
4753/4754 | R308Y | ++ | - |
4755/4756 | H259Y | + | - |
4757/4758 | H259S | +++ | ND |
4759/4760 | T80L | +++ | ND |
4761/4762 | C366A | ++ | ND |
4763/4764 | P22L | + | - |
4765/4766 | I243M | ++ | + |
4767/4768 | I25L | +++ | + |
4769/4770 | L249H | ++ | - |
4771/4772 | I243C | + | + |
4773/4774 | S279G | +++ | +++ |
4775/4776 | H259G | ++ | + |
4777/4778 | L249P | ++ | ND |
4779/4780 | I243Y | + | - |
4781/4782 | L78P | +++ | ND |
4783/4784 | L362T | ++ | +++ |
4785/4786 | R88V | +++ | - |
4787/4788 | L78E | +++ | - |
4789/4790 | H81C | + | - |
4791/4792 | L78G | +++ | ND |
4793/4794 | I243V | ++ | ND |
4795/4796 | L157G | + | - |
4797/4798 | I243V | ++ | - |
4799/4800 | R88I | +++ | - |
4801/4802 | S364G | + | + |
4803/4804 | S282T | ++ | + |
4805/4806 | S284T | + | + |
4807/4808 | V338C | +++ | ++ |
4809/4810 | S364G | ++ | ND |
4811/4812 | L157Q | + | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:696之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.24倍;“++”=至少1.24倍,但小於1.49倍;以及“+++”=至少1.49倍增加的生產。 ND =未確定。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.002-5 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7,加上3 mM MgCl
2、1 mM甜菊苷(95%純度)或甜菊糖苷D,及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1小時予以培育。藉由以水稀釋5x內來溶解反應,稀釋4x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表60.2 β1,3GT第8輪搖動燒瓶粉末變異體及RebM與RebA位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:696) | 增加的RebM a | 增加的RebA a |
4683/4684 | T262S/W401L | + | + |
4685/4686 | I189L/M206K/K208A/V365I | + | + |
4693/4694 | S304P/P322S/V365I/W401L | - | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:696之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;以及“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.35倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表60.2中所有的變異體(序列辨識編號:4684、4686及4694)自甜菊苷加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A及/或自甜菊糖苷D加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M的量,都比序列辨識編號:696更多。選擇變異體序列辨識編號:4684用於進一步的定向演化。
實施例61
序列辨識編號:4684之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:4684之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:4684編碼之GT(即,序列辨識編號:4683)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與以上前幾輪改良的活性有關的突變係予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第九輪(“第9輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的31種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:4684變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上5 mM甜菊苷(>95%純度)受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1222,及15 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM KPhos緩衝劑,pH 7,3 mM MgCl
2,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4-5 h。使反應溶解、驟冷及稀釋如實施例60中所述。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A的量比序列辨識編號:4684更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表61.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表61.2中列出相對於序列辨識編號:4684的變異體之分析。
SFP特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表61.1 β1,3GT第9輪變異體及RebA位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4684) | 增加的RebA a |
4813/4814 | N56H/L249M/S284T/W353Y | + |
4815/4816 | K51A/I243L/L249E/R308F/W353Y | ++ |
4817/4818 | K51A/N56H/L249M/L362M/C366S | ++ |
4819/4820 | K51A/N56H/L249Y/W353Y | + |
4821/4822 | I243L/R308F/W353Y | +++ |
4823/4824 | K51A/L249Y/S284T/R308F/L362M/C366V | +++ |
4825/4826 | K51A/N56H/L249M/L362M/S364G | +++ |
4827/4828 | K51A/N56H/I243L/L249E/R308F/L362M/S364G | +++ |
4829/4830 | N56H/I243L/S364G/C366V | ++ |
4831/4832 | N56H/L249M/W353Y | ++ |
4833/4834 | N56H/L249Y | +++ |
4835/4836 | R308F/C366A | ++ |
4837/4838 | N56H/I243L/L249E/S282T/S364G/C366V | +++ |
4839/4840 | K51A/L249M | + |
4841/4842 | N56H | + |
4843/4844 | K51A/L249M/S282T/W353Y/C366S | ++ |
4845/4846 | K51A/L249E/W353Y/L362M/S364G | + |
4847/4848 | N56H/S284T/C366V | + |
4849/4850 | I243L/S282T/W353Y/L362M/S364G | + |
4851/4852 | K51A/W353Y/L362M | + |
4853/4854 | K51A/N56H | + |
4855/4856 | I243L/L249E/S282T/S284T/L362M/S364G/C366S | ++ |
4857/4858 | S282T | + |
4859/4860 | I243L/L249M/R308F/W353Y/C366A | + |
4861/4862 | K51A/N56H/I243L/L249E/S282T/W353Y/L362M/C366S | + |
4863/4864 | I243L/S282T/L362M/S364G/C366V | ++ |
4865/4866 | K51A/L249M/S282T/S284T/S364G | + |
4867/4868 | L249Y/W353Y/L362M/C366S | + |
4869/4870 | L362M/C366A | + |
4871/4872 | I243L/L249Y/W353Y/L362M/C366S | + |
4873/4874 | K51A/I243L/L249E/A348S/L362M/C366V | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4684之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.2倍,但小於1.42倍;“++”=至少1.42倍,但小於1.59倍;以及“+++”=至少1.59倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.002-5 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 7,加上3 mM MgCl
2、1 mM甜菊苷(95%純度)或甜菊糖苷D,及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1小時予以培育。藉由以水稀釋5x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋4x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。以如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表61.2 β1,3GT第9輪搖動燒瓶粉末變異體及RebM與RebA位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4684) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
4837/4838 | N56H;I243L;L249E;S282T;S364G;C366V; | ++ | +++ |
4821/4822 | I243L;R308F;W353Y; | + | ++ |
4825/4826 | K51A;N56H;L249M;L362M;S364G; | + | ++ |
4823/4824 | K51A;L249Y;S284T;R308F;L362M;C366V; | + | ++ |
4833/4834 | N56H;L249Y; | + | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4684之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.4倍;“++”=至少1.4倍,但小於2倍;以及“+++”=至少2倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表61.2中所有的變異體(即,序列辨識編號:4822、4824、4826、4834及4838)都以比序列辨識編號:4684更多的量,自甜菊苷及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A以及自甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。於此等實驗中序列辨識編號:4838之變異體對於甜菊苷及甜菊糖苷D二者及作為輔受質之ADP-葡萄糖有最高的活性。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:4837)用於進一步的定向演化。
實施例62
序列辨識編號:4838之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:4838之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:4837編碼之GT(即,序列辨識編號:4838)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十輪(“第10輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的123種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:4838變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋4x至磷酸鉀緩衝劑,pH 6.5。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上5 mM甜菊苷(>95%純度)受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1222及15 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6.5,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1h。使反應溶解、驟冷及稀釋如實施例60中所述。藉由如實施例1,表1.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。挑選的變異體亦以相似的檢定予以再測試:10x溶解產物稀釋、4 mM甜菊苷或甜菊糖苷D、0.375 mM ADP、0.5 g/L蔗糖合成酶序列辨識編號:1392、30 mM蔗糖,及2 h培育。辨識出自甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:4838更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表62.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例1中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表62.2中列出相對於序列辨識編號:4838的變異體之分析。
SFP特徵化檢定及由ADP-葡萄糖進行葡萄糖基轉移至甜菊苷或甜菊糖苷D之分析
表62.1 β1,3GT第10輪變異體及RebM與RebA位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4838) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
4875/4876 | K51A/H56L/L362M | +++ | +++ |
4877/4878 | Q177S | ++ | ++ |
4879/4880 | K51A | ++ | ++ |
4881/4882 | H56L/L362M/V366A | ++ | +++ |
4883/4884 | H56L/L243M/E249Y | +++ | +++ |
4885/4886 | K208E | ++ | ++ |
4887/4888 | A110S | ++ | +++ |
4889/4890 | K439D | ++ | + |
4891/4892 | H56L/L243M/E249M | +++ | +++ |
4893/4894 | K208I | ++ | ++ |
4895/4896 | Q265A | ++ | +++ |
4897/4898 | K208W/V320I | +++ | ++ |
4899/4900 | K208L | ++ | ++ |
4901/4902 | K200S/L243M/E249Y/H259G | ++ | +++ |
4903/4904 | K336E | ++ | +++ |
4905/4906 | K208T | ++ | +++ |
4907/4908 | K222P | +++ | +++ |
4909/4910 | H259N | ++ | ++ |
4911/4912 | K289H | ++ | +++ |
4913/4914 | R234T | ++ | ++ |
4915/4916 | W353Y/L362M | - | + |
4917/4918 | L174S | + | + |
4919/4920 | H259S | ++ | ++ |
4921/4922 | I25V/L362M/V366S | - | + |
4923/4924 | E226R | + | + |
4925/4926 | K171V | + | + |
4927/4928 | R234E | + | ++ |
4929/4930 | R88I | - | +++ |
4931/4932 | L256A | + | + |
4933/4934 | E175N | + | ++ |
4935/4936 | V428K | + | + |
4937/4938 | E226T | + | + |
4939/4940 | K439Q | ++ | + |
4941/4942 | E405Q | + | + |
4943/4944 | R88C/R173S | - | +++ |
4945/4946 | I198S | - | +++ |
4947/4948 | K208G | + | + |
4949/4950 | L163K | + | + |
4951/4952 | I198D/F313S | - | + |
4953/4954 | R234A | + | + |
4955/4956 | K171D | + | + |
4957/4958 | Q177P | + | + |
4959/4960 | I198E | - | +++ |
4961/4962 | A85E | - | ++ |
4963/4964 | Q209E/R234Q | + | + |
4965/4966 | K51A/H56L/K200S/L243M/E249I/H259G/V338C | ++ | +++ |
4967/4968 | K208N | + | ++ |
4969/4970 | I25L/H56L/W353Y | + | ++ |
4971/4972 | I198D/F313S/V428S | - | ++ |
4973/4974 | R411T | + | +++ |
4975/4976 | R234H/N408D | + | + |
4977/4978 | I198D | - | +++ |
4979/4980 | P322V | + | + |
4981/4982 | Q177K | + | + |
4983/4984 | Q209A | + | + |
4985/4986 | K51A/Q71R/E249M/S279G/S284T/L362M/V366S | + | +++ |
4987/4988 | K171E | + | ++ |
4989/4990 | K289T | + | + |
4991/4992 | K171P | + | + |
4993/4994 | L243M/V338C/L362M/V366S | + | ++ |
4995/4996 | P272D | + | + |
4997/4998 | Q159N | + | ++ |
4999/5000 | H259T | + | + |
5001/5002 | P70S/I198D/H259E/F313S | - | ++ |
5003/5004 | I25L | + | ++ |
5005/5006 | I25V/L243M/E249Y/H259G/V366A | + | +++ |
5007/5008 | S253A | + | + |
5009/5010 | I25V/L243M/E249I/L362M | + | +++ |
5011/5012 | L174E | + | ++ |
5013/5014 | K208V | + | + |
5015/5016 | I198T | - | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4838之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.34倍;“++”=至少1.34倍,但小於1.54倍;及“+++”=至少1.54倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6.5、1 mM甜菊苷(95%純度)或甜菊糖苷D,及1 mM ADP-葡萄糖(Sigma,>93%純度)。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1小時予以培育。藉由以水稀釋5x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋4x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表62.2 β1,3GT第10輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4838) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
4875/4876 | K51A/H56L/L362M | + | + |
4879/4880 | L243M/V338C/L362M/V366S | - | + |
4881/4882 | K200S/L243M/E249Y/H259G | - | - |
4909/4910 | I198D/F313S | - | ++ |
4911/4912 | P70S/I198D/H259E/F313S | - | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4838之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;及“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.3倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表62.2中的一種變異體(即,序列辨識編號:4876)以比序列辨識編號:4838更多的量,自甜菊苷加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A以及自甜菊糖苷D加上ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:4875)用於進一步的定向演化。
實施例63
序列辨識編號:4876之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:4876之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:4875編碼之GT(即,序列辨識編號:4876)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十一輪(“第11輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的122種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:4875變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋10x至磷酸鉀緩衝劑,pH 6.5。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上4 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1456及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行組合庫之檢定。使用下列反應條件:50 mM 磷酸鉀緩衝劑,pH 6.5,50℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時1h。使反應溶解、驟冷及稀釋如實施例60中所述。藉由如實施例1,表1.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。關於飽和致突變基因庫,執行相同的檢定但是以5x稀釋的溶解產物、pH 6磷酸鉀緩衝劑,及於55℃下培育1-2h。挑選的變異體亦於此等條件下以三重複再測試。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:4876更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表63.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例1中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表63.2中列出相對於序列辨識編號:4876的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表63.1 β1,3GT第11輪變異體及RebM與RebA位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4876) | 增加的RebM a | 增加的RebA a |
5017/5018 | I25L/Q209E/L243M/H259G | + | ++ |
5019/5020 | Q209E/E249M/V338C | ++ | ++ |
5021/5022 | I198D/K200S/Q209E/L243M/E249Y/K289T | ++ | - |
5023/5024 | I25L/E249I | ++ | ++ |
5025/5026 | I25L/Q209E/E249I/H259G/V366A | ++ | ++ |
5027/5028 | K200S/Q209E/V366A | ++ | + |
5029/5030 | I25L/Q209E/H259G | ++ | ++ |
5031/5032 | I25L/H259G/S279G/K289T | ++ | ++ |
5033/5034 | I25L/S279G/S284T/K289T | + | ++ |
5035/5036 | I198D | ++ | - |
5037/5038 | I25L/Q209E/S279G/V366A | + | ++ |
5039/5040 | S279G | ++ | ++ |
5041/5042 | I25L/H259G/S279G | ++ | ++ |
5043/5044 | Q209E/E249Y/S279G/S284T/K289T | + | ++ |
5045/5046 | I25L/Q209E/K289T/V366A | ++ | ++ |
5047/5048 | V366A | + | ++ |
5049/5050 | E249M/H259G | + | ++ |
5051/5052 | Q209E/E249I/H259G/K289T | ++ | ++ |
5053/5054 | K289T | ++ | ++ |
5055/5056 | Q209E/S279G/K289T | ++ | ++ |
5057/5058 | I25L/Q209E/L243M/E249Y | ++ | ++ |
5059/5060 | I25L/K200S/L243M/E249M | ++ | + |
5061/5062 | I25L | ++ | + |
5063/5064 | Q209E | ++ | ++ |
5065/5066 | Q209E/E249Y/H259G/S279G/V338C/V366A | +++ | +++ |
5067/5068 | I25L/K200S/Q209E/V338C | ++ | ++ |
5069/5070 | H259G/V366A | ++ | + |
5071/5072 | I25H/Q209E/L243M/E249Y | ++ | + |
5073/5074 | Q209E/V366A | +++ | ++ |
5075/5076 | I25L/I198D/Q209E | +++ | - |
5077/5078 | V338C | ++ | ++ |
5079/5080 | I25L/K289T | ++ | ++ |
5081/5082 | I25L/S279G/S284T | ++ | ++ |
5083/5084 | S279G/V338C | ++ | ++ |
5085/5086 | I198D/E249M/V338C | ++ | - |
5087/5088 | I25L/Q209E/L243M | ++ | ++ |
5089/5090 | K53R | ++ | + |
5091/5092 | R308T | + | ND |
5093/5094 | G364S | + | ++ |
5095/5096 | R308C | + | ND |
5097/5098 | T54P | + | ND |
5099/5100 | R308L | ++ | ++ |
5101/5102 | S55W | + | ND |
5103/5104 | K53C | + | + |
5105/5106 | K53L | + | ND |
5107/5108 | K336Y | + | ND |
5109/5110 | K247L | ++ | ++ |
5111/5112 | K53V | ++ | ++ |
5113/5114 | Q341V | + | ND |
5115/5116 | K247A | ++ | + |
5117/5118 | S55T | ++ | ++ |
5119/5120 | E342R | + | ND |
5121/5122 | K336M | + | + |
5123/5124 | T54V | ++ | ++ |
5125/5126 | L107A | ++ | + |
5127/5128 | S252Q | + | + |
5129/5130 | S254G | + | + |
5131/5132 | A426T | + | ND |
5133/5134 | R411S | + | ND |
5135/5136 | S252E | ++ | ++ |
5137/5138 | K392H | ++ | ++ |
5139/5140 | S194Q | + | ND |
5141/5142 | V34I | + | ND |
5143/5144 | L107T | ++ | + |
5145/5146 | S253G | ++ | + |
5147/5148 | L107C | + | + |
5149/5150 | P322M | + | ND |
5151/5152 | K392Q | + | + |
5153/5154 | G297A | + | ND |
5155/5156 | F327L | ++ | + |
5157/5158 | T61S | ++ | ++ |
5159/5160 | L174M | + | ND |
5161/5162 | T8D | + | ND |
5163/5164 | R411E | + | ND |
5165/5166 | M414L | + | ND |
5167/5168 | R412T | + | ND |
5169/5170 | S388V | + | ND |
5171/5172 | P322T | ++ | + |
5173/5174 | S111G | + | + |
5175/5176 | S446F | + | ND |
5177/5178 | K432T | + | ND |
5179/5180 | S253P | + | + |
5181/5182 | L141M | + | ND |
5183/5184 | K430R | + | ND |
5185/5186 | V9G | + | ND |
5187/5188 | S254M | ++ | ++ |
5189/5190 | S252A | + | ND |
5191/5192 | P322R | ++ | ND |
5193/5194 | A238K | + | ND |
5195/5196 | E321D | ++ | ND |
5197/5198 | L256D | + | + |
5199/5200 | L256T | + | ND |
5201/5202 | M108C | + | ND |
5203/5204 | S111C | + | ND |
5205/5206 | L256W | + | ND |
5207/5208 | R234H/G297A | + | ND |
5209/5210 | S254P | + | + |
5211/5212 | S449L | + | + |
5213/5214 | T8L | + | ND |
5215/5216 | R412H | + | ND |
5217/5218 | S388T | + | + |
5219/5220 | D69S | + | + |
5221/5222 | P79S | + | - |
5223/5224 | E201T | + | + |
5225/5226 | I91R | + | + |
5227/5228 | P70K | + | - |
5229/5230 | D69T | ++ | + |
5231/5232 | W87R | ++ | - |
5233/5234 | I91T | + | + |
5235/5236 | P79V | + | - |
5237/5238 | D69N | ++ | + |
5239/5240 | P158Q | + | + |
5241/5242 | I91Q | + | - |
5243/5244 | W87M | ++ | - |
5245/5246 | E73S | ++ | + |
5247/5248 | K190R | ++ | ++ |
5249/5250 | A153S | ++ | ++ |
5251/5252 | E201P | + | ++ |
5253/5254 | P79G | + | - |
5255/5256 | W87L | ++ | - |
5257/5258 | D69Q | + | + |
5259/5260 | K205P | - | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4876之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.2倍;“++”=至少1.2倍,但小於2倍;以及“+++”=至少2倍增加的生產。 ND =未確定。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6.5、4 mM甜菊苷(95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.2 g/L SUS SFP序列辨識編號:1456,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃下搖動歷時1小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表63.2 β1,3GT第11輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:4876) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
5075/5076 | I25L/I198D/Q209E | - | +++ |
5041/5042 | I25L/H259G/S279G | ++ | +++ |
5025/5026 | I25L/Q209E/E249I/H259G/V366A | + | ++ |
5065/5066 | Q209E/E249Y/H259G/S279G/V338C/V366A | ++ | ++ |
5073/5074 | Q209E/V366A | + | ++ |
5043/5044 | Q209E/E249Y/S279G/S284T/K289T | + | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:4876之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.3倍;“++”=至少1.3倍,但小於1.8倍;以及“+++”=至少1.8倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表63.2中的6種變異體(即,序列辨識編號:5076、5042、5026、5066、5074及5044)都以比序列辨識編號:4876更多的量,自甜菊苷及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A及/或自甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。序列辨識編號:5066於初級篩選表現最好(表63.1)且具有最有利的突變。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:5065)用於進一步的定向演化。由於帶有序列辨識編號:5076之變異體之高度RebD成為RebM的活性,其被用於方法開發。
實施例64
序列辨識編號:5066之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:5066之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:5065編碼之GT(即,序列辨識編號:5066)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十二輪(“第12輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的40種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:5066變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋10x至磷酸鉀緩衝劑,pH 6。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上4 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1582及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行組合庫之檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,55℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。使反應溶解、驟冷及稀釋如實施例63中所述。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:5066更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表64.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表64.2中列出相對於序列辨識編號:5066的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表64.1 β1,3GT第12輪變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5066) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
5261/5262 | I198E/G259E | - | +++ |
5263/5264 | I198D/R234Q | + | ++ |
5265/5266 | Q159N/G259E/R411T | + | + |
5267/5268 | R88I/Q159N/I198D | - | ++ |
5269/5270 | G259E | + | ++ |
5271/5272 | R88I/A110D/R234T | - | ++ |
5273/5274 | I198D | + | +++ |
5275/5276 | I198E/K200S | + | ++ |
5277/5278 | R88I | - | ++ |
5279/5280 | R88I/I198D/G259E | - | +++ |
5281/5282 | R88I/I198D/K200S/G259E | + | ++ |
5283/5284 | R88I/A110D | - | ++ |
5285/5286 | R88I/G259N | - | ++ |
5287/5288 | R88I/A110D/Q159N/I198D/R234T/G259N/Q265A | - | ++ |
5289/5290 | R88I/A110D/Q159N/I198D/G259E | + | +++ |
5291/5292 | R88I/G259E/Q265A | - | ++ |
5293/5294 | Q159N/I198E/R411T | - | ++ |
5295/5296 | A110D/G259N/Q265A/R411T | + | + |
5297/5298 | R88I/A110D/Q159N/I198E/K200S | - | +++ |
5299/5300 | R88I/A110D/I198S | - | +++ |
5301/5302 | R88I/A110D/I198D | - | +++ |
5303/5304 | R234E | + | - |
5305/5306 | R88I/I198S | - | ++ |
5307/5308 | I198D/K200S/R234E | + | - |
5309/5310 | V320I/V428K | + | ++ |
5311/5312 | K208E/V320I/V428K | + | ++ |
5313/5314 | K171E/K208E/V320I | + | +++ |
5315/5316 | K171P/Q177P | + | ++ |
5317/5318 | L174E/V320I | + | ++ |
5319/5320 | K171P/L174E/E175N/Q177P/K208W/V320I/V428K/K439D | + | - |
5321/5322 | V428K | + | - |
5325/5326 | L174E/E175N/Q177P/K208E/V320I/V428K | - | ++ |
5327/5328 | K171E/K208E/V428K | + | ++ |
5329/5330 | K171E/Q177P/E226T/V428K/K439D | + | - |
5331/5332 | K171P/E175N/Q177P/K208L/V320I/V428K | + | + |
5333/5334 | K208E/V428K | - | ++ |
5335/5336 | K171E/K208E/V320I/V428K | + | +++ |
5337/5338 | L174E/E175N/V428K | + | - |
5339/5340 | K208E | + | + |
5341/5342 | K208L/V320I/R331C/V428K | + | - |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5066之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.35倍;“++”=至少1.35倍,但小於1.8倍;以及“+++”=至少1.8倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、4 mM甜菊苷(95%純度)或甜菊糖苷D、0.4 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1582,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在55 ℃下搖動歷時1小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表64.2 β1,3GT第12輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5066) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
5279/5280 | R88I/I198D/G259E | - | ++ |
5289/5290 | R88I/A110D/Q159N/I198D/G259E | - | +++ |
5301/5302 | R88I/A110D/I198D | - | ++ |
5313/5314 | K171E/K208E/V320I | + | + |
5323/5324 | V320I/V428K | + | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5066之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於0.95倍;“+”=生產至少0.95倍,但小於1.2倍;“++”=至少1.2倍,但小於1.9倍;以及“+++”=至少1.9倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表64.2中的5種變異體(即,序列辨識編號:5280、5290、5302、5314、5324都以比序列辨識編號:5066更多的量,自甜菊苷及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A及/或自甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。序列辨識編號:5290對於甜菊糖苷D表現最好且具有最有利的突變。因而,選擇該編碼多核苷酸(序列辨識編號:5289)用於進一步的定向演化。
實施例65
序列辨識編號:5290之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:5290之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:5289編碼之GT(即,序列辨識編號:5290)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十三輪(“第13輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的100種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:5289變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋5x至磷酸鉀緩衝劑,pH 6內。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上4 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,55℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。使反應溶解、驟冷及稀釋如實施例33中所述。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:5290更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表65.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表65.2中列出相對於序列辨識編號:5290的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表65.1 β1,3GT第13輪變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5290) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
5343/5344 | R308L | + | + |
5345/5346 | K53R/T54V/S55T/A153S/E201P | + | - |
5349/5350 | K53V/K171P/R308L/K392H | + | + |
5351/5352 | I91T/E201P/K439D/Y444H | + | + |
5353/5354 | R308L/F327L/K439D | ++ | - |
5355/5356 | E73S/W87M/E201P | - | ++ |
5357/5358 | K53V/T54V/R308L/K392H | + | - |
5359/5360 | K247A/Y249I/S252E/S254M/V320I/V428K | + | - |
5361/5362 | I25L/K247L/Y249I/S252E/G364S/V428K | + | - |
5363/5364 | V428K | + | + |
5365/5366 | S253G/V320I | + | + |
5367/5368 | Y249I/S252E/S253G/S254M | + | + |
5369/5370 | S252E/S253G/S254M | + | + |
5371/5372 | I25L/T61S/V428K | + | + |
5373/5374 | K190R | + | + |
5375/5376 | T61S/K208W/S252E/S254M/V428K | + | - |
5377/5378 | L107A/K247A/Y249I/S252E/S254M/G364S | + | + |
5379/5380 | L107A/K208N/V320I/G364S/V428K | ++ | + |
5381/5382 | L107A | ++ | + |
5383/5384 | K190R/K208N/K247L/S252E/V428K | + | + |
5385/5386 | I25L/K208E/K247L/S252E/S253G/G364S/V428K | + | + |
5387/5388 | V320I | + | + |
5389/5390 | V320I/V428K | ++ | + |
5391/5392 | I25L/T61S/K208N/S252E/S253G | + | - |
5393/5394 | L107A/K247A/S252E | + | - |
5395/5396 | T61S/L107T/K208N/S252E/S253G/S254M/G364S/V428K | ++ | + |
5397/5398 | I25L/L107T/K208E/V320I/V428K | + | + |
5399/5400 | V320I/G364S/V428K | + | + |
5401/5402 | L107A/K247A/V428K | - | + |
5403/5404 | Y249I/S252E/S254M/V428K | + | - |
5405/5406 | V435Q | ++ | + |
5407/5408 | T172H | ++ | + |
5409/5410 | V435R | ++ | ++ |
5411/5412 | A427L | + | + |
5413/5414 | R296H | ND | + |
5415/5416 | K289S | ND | + |
5417/5418 | Q177P | ++ | + |
5419/5420 | G404T | ND | + |
5421/5422 | A438Q | ND | + |
5423/5424 | D431E | ND | + |
5425/5426 | V428E/D434N | ND | + |
5427/5428 | T54A | ND | + |
5429/5430 | K171T | ++ | + |
5431/5432 | W233Q/Q269R | ND | + |
5433/5434 | D431R | ND | + |
5435/5436 | E2L | + | + |
5437/5438 | D347K | ++ | + |
5439/5440 | Q424W | ND | + |
5441/5442 | S106T | ND | + |
5443/5444 | G169L | + | + |
5445/5446 | W233Q | ND | + |
5447/5448 | R417P | ++ | + |
5449/5450 | G169C | ND | + |
5451/5452 | V179A | + | + |
5453/5454 | S317R | ND | + |
5455/5456 | V428I | + | + |
5457/5458 | W233M | + | + |
5459/5460 | A251L | ND | + |
5461/5462 | V435K | ND | + |
5463/5464 | N408R | ND | + |
5465/5466 | W233C | + | + |
5467/5468 | D347H | + | + |
5469/5470 | K171S | + | + |
5471/5472 | R296Q | + | + |
5473/5474 | D300G | ND | + |
5475/5476 | G169V | ND | + |
5477/5478 | E2N | + | + |
5479/5480 | V435M | ND | + |
5481/5482 | G169Q | ND | + |
5483/5484 | W233K | ++ | + |
5485/5486 | E99P | ND | + |
5487/5488 | V428S | ND | + |
5489/5490 | V179S | ND | + |
5491/5492 | D347P | ++ | + |
5493/5494 | R296A | ND | + |
5495/5496 | Q424A | + | + |
5497/5498 | W233V | + | + |
5499/5500 | G169E | + | + |
5501/5502 | V435T | ND | + |
5503/5504 | K222A | ND | + |
5505/5506 | V428R | + | + |
5507/5508 | V428Q | ND | + |
5509/5510 | W233L | + | + |
5511/5512 | N159L | ND | + |
5513/5514 | V428F | ND | + |
5515/5516 | R38Q | - | + |
5517/5518 | F264A | ++ | + |
5519/5520 | D347R | ++ | + |
5521/5522 | R109S | ND | + |
5523/5524 | T172N | + | + |
5525/5526 | V435C | ND | + |
5527/5528 | K171V | + | + |
5529/5530 | A427R | ++ | + |
5531/5532 | F64S | + | ++ |
5533/5534 | E318T | - | + |
5535/5536 | W233G | + | + |
5537/5538 | E259T | ND | + |
5539/5540 | T7P | + | + |
5541/5542 | N68K | ND | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5290之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.3倍;以及“++”=至少1.3倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、4 mM甜菊苷(95%純度)、甜菊糖苷D或甜菊糖苷A(97%純度)、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50及55 ℃下搖動歷時1小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表65.2 β1,3GT第13輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5290) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
5347/5348 | W87M | + | + |
5355/5356 | E73S/W87M/E201P | + | + |
5363/5364 | V428K | + | + |
5371/5372 | I25L/T61S/V428K | + | + |
5385/5386 | I25L/K208E/K247L/S252E/S253G/G364S/V428K | + | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5290之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;以及“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.45倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表65.2中的5種變異體(即,序列辨識編號:5348、5356、5364、5372及5386)以比序列辨識編號:5290更多的量,自甜菊苷及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A及/或自甜菊糖苷D及ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M。選擇序列辨識編號:5372用於進一步的定向演化。
實施例66
序列辨識編號:5372之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:5372之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:5371編碼之GT(即,序列辨識編號:5372)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十四輪(“第14輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的74種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:5371變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋10x至磷酸鉀緩衝劑,pH 6。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764及40 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。使反應溶解、驟冷及稀釋成~10 µM甜菊糖如實施例60中所述。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:5372更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表66.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例1中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表66.2中列出相對於序列辨識編號:5372的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表66.1 β1,3GT第14輪變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5372) | 增加的RebM a | 增加的RebA a |
5543/5544 | W87M/Q177P/Y249I | +++ | ++ |
5545/5546 | I88R/K208E/Y249I/V320I | - | ++ |
5547/5548 | W87M/I88R/Q177P/D198E/Y249I | +++ | + |
5549/5550 | W87M/I88R | +++ | + |
5551/5552 | N159Q/D198I/K208E/V320I | +++ | +++ |
5553/5554 | W87M/D198E/A199K | ++ | ++ |
5555/5556 | W87M/D198E | +++ | ++ |
5557/5558 | I88R/V320I | + | +++ |
5559/5560 | W87M | +++ | ++ |
5561/5562 | W87M/I88R/E94K/N159Q/Q177P/K208E | +++ | ++ |
5563/5564 | W87M/K208E | +++ | ++ |
5565/5566 | I88R/Q177P/K208E | + | ++ |
5567/5568 | I88R/D198I | - | ++ |
5569/5570 | W87M/I88R/K208E | ++ | + |
5571/5572 | I88R | +++ | ++ |
5573/5574 | W87M/I88R/N159Q/D198E | +++ | + |
5575/5576 | W87M/K208E/V320I | ++ | + |
5577/5578 | Q177P/D198E | +++ | ++ |
5579/5580 | Q177P/K208E | ++ | ++ |
5581/5582 | N159Q/Q177P/K208E | +++ | ++ |
5583/5584 | W87M/N159Q/Q177P | +++ | ++ |
5585/5586 | I88R/Q177P/V320I | ++ | ++ |
5587/5588 | W87M/N159Q/V320I | ++ | + |
5589/5590 | N159Q/Q177P/D198E | +++ | ++ |
5591/5592 | W87M/V320I | +++ | + |
5593/5594 | I88R/A199K | - | ++ |
5595/5596 | I88R/A199K/K208E | - | ++ |
5597/5598 | W87M/D198E/K208E/V320I | +++ | ++ |
5599/5600 | I88R/K208E | - | ++ |
5601/5602 | I88R/Q177P | ++ | +++ |
5603/5604 | P272K | ND | + |
5605/5606 | D268G | ND | + |
5607/5608 | P158D | ND | + |
5609/5610 | E2H | ND | + |
5611/5612 | E2G | ND | + |
5613/5614 | E2P | ND | + |
5615/5616 | S374R | ND | + |
5617/5618 | S135A | ND | + |
5619/5620 | K171T | ND | + |
5621/5622 | S214L | ND | + |
5623/5624 | R173N | ND | + |
5625/5626 | L256P | ND | + |
5627/5628 | L437T | ND | + |
5629/5630 | L257Q | ND | + |
5631/5632 | L437I | ND | ++ |
5633/5634 | K222R | ND | + |
5635/5636 | D134S | ND | + |
5637/5638 | S374K | ND | ++ |
5639/5640 | N408D | ND | + |
5641/5642 | P158E | ND | + |
5643/5644 | E113S | ND | + |
5645/5646 | K392D | ND | + |
5647/5648 | Y453R | ND | + |
5649/5650 | K439A | ND | + |
5651/5652 | N195H | ND | + |
5653/5654 | K302R | ND | + |
5655/5656 | L257A | ND | + |
5657/5658 | R412H | ND | + |
5659/5660 | E330D | ND | + |
5661/5662 | R173P | ND | + |
5663/5664 | N399D | ND | + |
5665/5666 | A348C | ND | + |
5667/5668 | D134G | ND | + |
5669/5670 | K289T | ND | + |
5671/5672 | S253G | ND | + |
5673/5674 | D300G | ND | + |
5675/5676 | E73P | ND | + |
5677/5678 | F49A | ND | + |
5679/5680 | D268H | ND | ++ |
5681/5682 | D268A | ND | + |
5683/5684 | E445T | ND | + |
5685/5686 | E73T | ND | + |
5687/5688 | R411Q | ND | + |
5689/5690 | L437V | ND | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5372之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於0.99倍;“+”=生產至少0.99倍,但小於1.25倍;“++”=至少1.25倍,但小於1.6倍;以及“+++”=至少1.6倍增加的生產。 ND =未確定。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、4 mM甜菊苷(95%純度)、甜菊糖苷D、甜菊糖苷E或甜菊糖苷A(97%純度)、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在55及60 ℃下搖動歷時2小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表66.2 β1,3GT第14輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA、RebI與RebM位準 | |||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5372) | 增加的RebA a | 增加的RebI a | 增加的RebE成rebM a | 增加的RebD成 rebM a |
5551/5552 | N159Q/D198I/K208E/V320I | + | + | ++ | + |
5561/5562 | W87M/I88R/E94K/N159Q/Q177P/K208E | + | + | +++ | ++ |
5573/5574 | W87M/I88R/N159Q/D198E | + | + | +++ | + |
5577/5578 | Q177P/D198E | + | + | ++ | + |
5581/5582 | N159Q/Q177P/K208E | + | + | +++ | + |
5589/5590 | N159Q/Q177P/D198E | + | + | +++ | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5372之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於4倍;以及“+++”=至少4倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表66.2中的6種變異體(即,序列辨識編號:5552、5562、6675、5578、5582及5590)加上ADP-葡萄糖比序列辨識編號:5372,自甜菊苷生產較多甜菊糖苷A,自甜菊糖苷A生產較少甜菊糖苷I,自甜菊糖苷E生產較多甜菊糖苷M,及/或自甜菊糖苷D生產更多量的甜菊糖苷M。序列辨識編號:5562對於全部4種反應改良得最好,是以其被選擇用於進一步的定向演化。
實施例67
序列辨識編號:5562之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:5562之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:5561編碼之GT(即,序列辨識編號:5562)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良活性有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十五輪(“第15輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的62種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:5562變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述然後稀釋5x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.1-0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764,及24-40 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,50或60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時2 h。使反應溶解、驟冷及稀釋成~10 µM甜菊糖如實施例60中所述。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:5562更多之醣基轉移酶變異體多肽。來自組合庫的經工程處理之多肽列於表67.1中,以及來自飽和致突變庫的該等列於表67.2中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表67.3中顯示出相對於序列辨識編號:5562的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表67.1 β1,3GT第15輪組合變異體及RebA位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5562) | 增加的RebA a |
5691/5692 | F64S/G169E/E201P/D347P/K392H | + |
5693/5694 | K171T/E201P/K392H/R417P | +++ |
5695/5696 | G169E/K171T/T172H/F264A/K392H/V435Q | + |
5697/5698 | G169E/T172H/E201P/F264A/D347G | ++ |
5699/5700 | I91T/E201P/F264A/D347G/K392H | ++ |
5701/5702 | G169E/T172H/E201P/D347G/K392H | ++ |
5703/5704 | G169E/K171T/E201P/F264A/K392H/V435Q | + |
5705/5706 | E201P/F264A/D347P/K392H/V435Q | ++ |
5707/5708 | G169E/T172H/E201P/F264A/D347K/K392H/V435R | ++ |
5709/5710 | E201P/F264A/D347K/K392H/R417P/V435R | + |
5711/5712 | G169E/T172H/E201P/R417P/V435R | + |
5713/5714 | F64S/T172H/F264A/D268V/D347P/K392H/R417P | + |
5715/5716 | E201P/F264A/D347K/R417P/V435R | ++ |
5717/5718 | I91T/K94E/K171T/T172H/E201P/F264A/D347G | + |
5719/5720 | K171T/T172H/E201P/F264A/K392H/R417P/V435R | +++ |
5721/5722 | K94E/E201P/F264A/D347G/V435Q | + |
5723/5724 | L107A/S252E/S317R | + |
5725/5726 | W233K/S252E/V320I | +++ |
5727/5728 | W233K/S252E/S317R/N408R | ++ |
5729/5730 | K190R/W233K/S252E/V320I/N408R | ++ |
5731/5732 | L107A/K190R/W233K/S252E/S317R/V320I | +++ |
5733/5734 | W233K/S252E/S317R/A427R | ++ |
5735/5736 | T7P/K190R/W233K/S252E/S317R/V320I/A427R/K428R | +++ |
5737/5738 | T7P/L107A/W233K/S252E/S253G | + |
5739/5740 | W233K/S252E/V320I/N408R/K428R | ++ |
5741/5742 | T7P/W233K/S252E/S253G/N408R | +++ |
5743/5744 | W233K/S252E/S253G/N408R/A427L | ++ |
5745/5746 | T7P/K190R/W233K/S252E/S253G/V320I/A427L | + |
5747/5748 | T7P/W233K/S252E/S253G/S317R/N408R/A427L | +++ |
5749/5750 | T7P/L107A/W233K/S252E/S317R/N408R | + |
5751/5752 | T7P/L107A/K190R/W233K/S252E/S253G/S317R/N408R/A427R | ++ |
5753/5754 | T7P/W233K/S252E/S317R/V320I/A427L | + |
5755/5756 | E2N/T7P/L107A/W233K/S252E/S253G/V320I | + |
5757/5758 | K190R/W233K/S252E/S253G/S317R/V320I/N408R/K428R | + |
5759/5760 | E2L/T7P/W233K/S252E/S253G/V320I/A427R/K428R | + |
5761/5762 | W233K/S252E/S253G/S317R/V320I/A427R/K428R | +++ |
5763/5764 | T7P/W233K/S252E/S317R/K428R | + |
5765/5766 | E2N/W233K/S252E/S317R/V320I | + |
5767/5768 | L107A/W233K/S252E/S253G | ++ |
5769/5770 | T7P/L107A/W233K/S252E/S317R/V320I | + |
5771/5772 | T7P/K190R/W233K/S252E/N408R/A427R | + |
5773/5774 | K190R/W233K/S252E | ++ |
5775/5776 | L107A/K190R/W233K/S252E | + |
5777/5778 | K190R/W233K/S252E/S317R/N408R | +++ |
5779/5780 | E2N/T7P/L107A/W233K/S252E/S253G/V320I/N408R/K428R | + |
5781/5782 | A348S/S374R/V435R | + |
5783/5784 | S374R | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5562之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.59倍,但小於2.8倍;“++”=至少2.8倍,但小於3.1倍;以及“+++”=至少3.1倍增加的生產。 |
表67.2 β1,3GT第15輪飽和致突變變異體及RebA與RebM位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5562) | 增加的RebA,50℃ a | 增加的RebA,60℃ a | 增加的RebM,60℃ a |
5785/5786 | L56A | - | + | ++ |
5787/5788 | S55V | - | - | + |
5789/5790 | R308Q | - | ++ | +++ |
5791/5792 | K336Q | + | - | - |
5793/5794 | G364A | + | +++ | +++ |
5795/5796 | E342W | + | + | + |
5797/5798 | T282S | ++ | +++ | +++ |
5799/5800 | R308L | + | +++ | ++ |
5801/5802 | G364S | +++ | +++ | +++ |
5803/5804 | E407C | + | + | +++ |
5805/5806 | L391C | + | ++ | +++ |
5807/5808 | E407V | ++ | ++ | +++ |
5809/5810 | V14I | ++ | ++ | ++ |
5811/5812 | S255L | + | + | + |
5813/5814 | M422Q | - | + | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5562之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.25倍;“++”=至少1.25倍,但小於1.4倍;以及“+++”=至少1.4倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、10 mM甜菊苷(95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50及60 ℃下培育歷時2小時予以執行。藉由以水稀釋20x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋5x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表67.3 β1,3GT第15輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5562) | 增加的RebA,50℃ a | 增加的RebA,60℃ a | 增加的RebM,60℃ a |
5693/5694 | K171T/E201P/K392H/R417P | + | + | ++ |
5707/5708 | G169E/T172H/E201P/F264A/D347K/K392H/V435R | + | ++ | +++ |
5713/5714 | F64S/T172H/F264A/D268V/D347P/K392H/R417P | + | + | +++ |
5719/5720 | K171T/T172H/E201P/F264A/K392H/R417P/V435R | + | ++ | ++ |
5731/5732 | L107A/K190R/W233K/S252E/S317R/V320I | - | + | +++ |
5735/5736 | T7P/K190R/W233K/S252E/S317R/V320I/A427R/K428R | - | ++ | ++ |
5761/5762 | W233K/S252E/S253G/S317R/V320I/A427R/K428R | - | + | ++ |
5777/5778 | K190R/W233K/S252E/S317R/N408R | - | + | +++ |
a增加的生產位準係以0.025 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:5562之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於2.4倍;以及“+++”=至少2.4倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表67.3中的8種變異體比序列辨識編號:5562,於50℃及/或60℃下自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及/或自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。序列辨識編號:5708對於兩種溫度下自甜菊苷轉化成甜菊糖苷A以及於60℃下轉化甜菊糖苷D成甜菊糖苷M亦有改良,是以其被選擇用於進一步的定向演化。
實施例68
序列辨識編號:5708之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:5708之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:5707編碼之GT(即,序列辨識編號:5708)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十六輪(“第16輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的100種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:5708變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋20x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。以10 μL溶解產物配於100 μL反應並加上10 mM甜菊苷(>95%純度)、甜菊糖苷D、甜菊糖苷A(>97%純度)或甜菊糖苷E受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時3 h。使反應溶解、驟冷及稀釋成~10 µM甜菊糖如實施例60中所述。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:5708更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表68.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表68.2中列出相對於序列辨識編號:5708的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表68.1 β1,3GT第16輪組合變異體及RebA位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5708) | 增加的RebA a |
5815/5816 | R173N/K190R/S252E/L257A/K347G/A427R/L437I | +++ |
5817/5818 | R173N | + |
5819/5820 | W233K/S252E/L437V | +++ |
5821/5822 | R173N/K190R/L257A/A427R/L437I | ++ |
5823/5824 | K347G/R411Q/L437I | ++ |
5825/5826 | W233K/S252E/E285Q/L437V | ++ |
5827/5828 | R173N/S252E | +++ |
5829/5830 | E285Q/K347G/L437V | + |
5831/5832 | R173N/S252E/D268H/L437V | ++ |
5833/5834 | L257A/K347G/R411Q/L437V | + |
5835/5836 | S252E/L257A/K347G/L437V | ++ |
5837/5838 | R173N/S252E/K347G/R411Q | ++ |
5839/5840 | W233K/S252E | +++ |
5841/5842 | R173N/W233K/S252E/L257A/A427R | + |
5843/5844 | W233K/S252E/L257A/A427R/L437V | + |
5845/5846 | W233K/S252E/R411Q/L437V | +++ |
5847/5848 | R173N/L257A/S374K/L437V | + |
5849/5850 | K190R/S252E/L257A/R411Q/L437I | + |
5851/5852 | R173N/K190R/L257A/S374K/L437V | + |
5853/5854 | W233K/S374K/L437I | + |
5855/5856 | K347G/A427R/L437V | ++ |
5857/5858 | K190R/W233K/S252E/L257A/K347G/R411Q/L437I | ++ |
5859/5860 | W233K/S252E/L257A/K347G | +++ |
5861/5862 | W233K/S252E/L257A/K347G/R411Q/L437I | +++ |
5863/5864 | K190R/S252E/L257A/E285Q/A427R | ++ |
5865/5866 | R173N/K190R/W233K/S252E/A427R/L437V | + |
5867/5868 | S374K/R411Q/L437V | + |
5869/5870 | R173N/W233K/L437I | + |
5871/5872 | R173N/A427R/L437I | + |
5873/5874 | S374K/R411Q/L437I | + |
5875/5876 | K190R/S252E | ++ |
5877/5878 | S252E/L257A | ++ |
5879/5880 | W233K/S374K | + |
5881/5882 | R411Q/L437V | + |
5883/5884 | S374K | + |
5885/5886 | K190R/S374K/A427R/L437V | + |
5887/5888 | L437I | ++ |
5889/5890 | R173N/S374K/L437I | ++ |
5891/5892 | K190R/S252E/L257A/A427R | + |
5893/5894 | W233K/S252E/L257A | ++ |
5895/5896 | W233K/S252E/E285Q | + |
5897/5898 | L163A/L257Q/K302R/G364S | ++ |
5899/5900 | K302R/G364S | ++ |
5901/5902 | E2P/K4T/P158D/L163A/G364S/S449R | +++ |
5903/5904 | E2P/P158D/L163R | + |
5905/5906 | E2P/L163R/G364S/Y453R | + |
5907/5908 | E2P/K4T/L163A/L257Q | ++ |
5909/5910 | G364S/N399D | ++ |
5911/5912 | E2P/K4T/L163A/G364S/Y453R | ++ |
5913/5914 | E2P/K4T/L163A/E330D/S449R | ++ |
5915/5916 | K4T/E113S/P158D/K302R/E330D/G364S | + |
5917/5918 | E2P/E113S/S449R | + |
5919/5920 | E2P/K4T/K302R | + |
5921/5922 | L163R/K302R/E330D/G364S/S449R | + |
5923/5924 | E330D/G364S | + |
5925/5926 | E2P/K4T/E113S/P158D/L163A/E330D/S449R | +++ |
5927/5928 | E2P/P158D/L163A/G364S/N399D | +++ |
5929/5930 | E2P/K4T/L163R/L257Q/E330D/N399D/S449R | ++ |
5931/5932 | E2P/E113S/L163R/S449R | + |
5933/5934 | L163A/G364S | ++ |
5935/5936 | P158D/L163A/G364S | ++ |
5937/5938 | E2P/K4T/P158D/E330D | +++ |
5939/5940 | E2P/E113S | + |
5941/5942 | E2P/K4T/L163R/K222R/K302R/E330D/G364S/S449R | + |
5943/5944 | E113S/P158D/L163A/G364S/N399D | + |
5945/5946 | K4T/E113S/L163A/G364S/N399D | ++ |
5947/5948 | E2P/K4T/E113S/P158D/L163R/K302R/G364S/N399D/S449R | + |
5949/5950 | E2P/K4T/L163A/G364S | +++ |
5951/5952 | K4T/P158D/L163A/G364S/N399D | ++ |
5953/5954 | E2P/E113S/L163A | + |
5955/5956 | E2P/K4T/P158D/K222R/L257Q/K302R/E330D | ++ |
5957/5958 | K4T/E113S/P158D/L163A/E330D/G364S/N399D | ++ |
5959/5960 | E2P/K4T/E113S/L163R/S449R | + |
5961/5962 | E113S/P158D/L163R/G364S/N399D | + |
5963/5964 | P158D/L163R/K302R/E330D/G364S/N399D | + |
5965/5966 | K4T/G364S/S449R | ++ |
5967/5968 | E2P/G364S/S449R | +++ |
5969/5970 | E2P/E113S/E330D/N399D | + |
5971/5972 | P158D/L163A/L257Q/E330D/G364S/S449R | + |
5973/5974 | D134S | + |
5975/5976 | L107A/N195H/R417P/K439P | +++ |
5977/5978 | N195H/P272K/V320I/K439P | + |
5979/5980 | D134S/S135A/N195H/D268A/S317R | + |
5981/5982 | N195H/S317R/V320I | + |
5983/5984 | L107A/N195H/P272K | ++ |
5985/5986 | L107A/S374T/R417P/K439P | + |
5987/5988 | L107A/D134S/S135A/N195H/R412H/R417P | + |
5989/5990 | L107A/N195H/D268A/P322L/K439P | +++ |
5991/5992 | N408D/R417P | + |
5993/5994 | D268A/R417P | + |
5995/5996 | M87W/W266L | ++ |
5997/5998 | M87W/D198E | + |
5999/6000 | D198E/L292P | +++ |
6001/6002 | M87W/H95L/D198E | + |
6003/6004 | D198I | +++ |
6005/6006 | M87W/P322S | +++ |
6007/6008 | D198I/P244L | ++ |
6009/6010 | M87W | + |
6011/6012 | D198E | + |
6013/6014 | M87W/D198I | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5708之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.05倍,但小於1.42倍;“++”=至少1.42倍,但小於1.6倍;以及“+++”=至少1.6倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、10 mM甜菊苷(>95%純度)、甜菊糖苷D、甜菊糖苷E或甜菊糖苷A(>97%純度)、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.15 g/L SUS SFP序列辨識編號:1764,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在50℃及60 ℃下搖動歷時3小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,藉由以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋10x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表68.2 β1,3GT第16輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | |||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5708) | 增加的RebA,50 ℃ a | 增加的RebA,60℃ a | 增加的RebM,60℃ a | 自E增加的RebM,60℃ a |
5815/5816 | R173N/K190R/S252E/L257A/K347G/A427R/L437I | - | +++ | - | - |
5839/5840 | W233K/S252E | - | ++ | - | + |
5845/5846 | W233K/S252E/R411Q/L437V | - | + | - | - |
5901/5902 | E2P/K4T/P158D/L163A/G364S/S449R | ++ | + | + | + |
5927/5928 | E2P/P158D/L163A/G364S/N399D | ++ | + | + | ++ |
5949/5950 | E2P/K4T/L163A/G364S | ++ | + | + | ND |
5975/5976 | L107A/N195H/R417P/K439P | ++ | ++ | + | ND |
5983/5984 | L107A/N195H/P272K | ++ | + | - | ND |
5989/5990 | L107A/N195H/D268A/P322L/K439P | +++ | + | - | ND |
5997/5998 | M87W/D198E | +++ | +++ | - | ND |
6009/6010 | M87W | +++ | +++ | - | ND |
6011/6012 | D198E | ++ | + | + | ND |
a增加的生產位準係以0.025 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:5708之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.26倍;“++”=至少1.26倍,但小於1.5倍;以及“+++”=至少1.5倍增加的生產。 ND =未確定。 |
於此等實驗中,表68.2中的13種變異體比序列辨識編號:5708,於50℃及/或60℃下自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A,及/或自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。序列辨識編號:5976於兩種溫度下轉化甜菊苷成甜菊糖苷A有最大的改良且於甜菊糖苷D轉化成甜菊糖苷M的活性沒有損失,是以其被選擇用於進一步的定向演化。
實施例69
序列辨識編號:5976之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:5976之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:5975編碼之GT(即,序列辨識編號:5976)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十七輪(“第17輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的123種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:5976變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述然後稀釋20x至緩衝劑內。為了熱挑戰溶解產物,使其等於65.5℃之熱循環儀內預培育15分鐘。以10 μL預培育的溶解產物配於100 μL反應並加上10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1804及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。藉由以水稀釋20x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以及以水稀釋10x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:5976更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表69.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表69.2中列出相對於序列辨識編號:5976的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表69.1 β1,3GT第17輪變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5976) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
6015/6016 | K4T/D198E/N399D/E407V | + | + |
6017/6018 | E2P/V14I/T282S/R308L | ++ | +++ |
6019/6020 | T282S/R308L/E342W/G364A/S449R | +++ | +++ |
6021/6022 | E2P/V14I/R308L/G364A | +++ | +++ |
6023/6024 | E2P/K4T/T282S/E342W/G364A/E407V | +++ | +++ |
6025/6026 | K4T/L163A/T282S/R308L/E407V | ++ | ++ |
6027/6028 | E2P/T282S/N399D | + | ++ |
6029/6030 | P158D/T282S/E407V | ++ | + |
6031/6032 | E2P/V14I/P158D/D198E/E407V/S449R | +++ | +++ |
6033/6034 | E2P/V14I/R308L | ++ | ++ |
6035/6036 | V14I/P158D/L163A/D198E/G364A | ++ | +++ |
6037/6038 | E2P/K4T/V14I/T282S/R308L/G364A | +++ | +++ |
6039/6040 | D198E/T282S/E407V | +++ | +++ |
6041/6042 | E2P/V14I/L163A/R308L/G364A | +++ | +++ |
6043/6044 | E2P/R308L/G364A/N399D | +++ | ++ |
6045/6046 | E2P/V14I/T282S/N399D | ++ | ++ |
6047/6048 | T282S/R308L/S449R | + | + |
6049/6050 | K4T/V14I/T282S/R308L/G364A/E407V/S449R | +++ | +++ |
6051/6052 | E2P/K4T/V14I/D198E/R308L/E407V | +++ | ++ |
6053/6054 | P158D/G364A/N399D/E407V/S449R | ++ | + |
6055/6056 | V14I/T282S/E342W/G364A/L391C | ++ | ++ |
6057/6058 | E2P/T282S/R308L/E342W/E407V | ++ | +++ |
6059/6060 | E2P/K4T/P158D/L163A/G364A/N399D/E407V | ++ | ++ |
6061/6062 | L163A/T282S/N399D/E407V | ++ | + |
6063/6064 | V14I/P158D/D198E/T282S/E342W/G364A/S449R | +++ | ++ |
6065/6066 | P158D/T282S/E407V/S449R | ++ | ++ |
6067/6068 | E2P/K4T/V14I/P158D/T282S/E407V | +++ | +++ |
6069/6070 | V14I/L163A/D198E/T282S/E342W/G364A/S449R | +++ | ++ |
6071/6072 | E2P/L163A/T282S | ++ | + |
6073/6074 | E2P/T282S | ++ | + |
6075/6076 | V14I/P158D/L163A/T282S/G364A | +++ | + |
6077/6078 | E2P/K4T/V14I/T282S/R308L/E407V | ++ | + |
6079/6080 | K4T/V14I/L163A/T282S/R308L/E342W/E407V/S449R | ++ | + |
6081/6082 | E2P/L163A/T282S/R308L/G364A | +++ | ++ |
6083/6084 | E2P/K4T/L163A/G364A/N399D/S449R | ++ | +++ |
6085/6086 | L163A/D198E/T282S/E342W | ++ | ++ |
6087/6088 | V14I/P158D/G364A | ++ | + |
6089/6090 | K4T/V14I/D198E/R308L/G364A | +++ | + |
6091/6092 | E2P/D198E/T282S/R308L/E342W | +++ | +++ |
6093/6094 | K4T/V14I/P158D/T282S/G364A/L391C/E407V | +++ | ++ |
6095/6096 | K4T/V14I/G364A/L391C | + | ++ |
6097/6098 | K4T/V14I/L163A/T282S | + | + |
6099/6100 | E2P/K4T/V14I/L163A/T282S/N399D | ++ | ++ |
6101/6102 | V14I/E407V | ++ | ++ |
6103/6104 | E2P/K4T/L163A/D198E/T282S/R308L/E342W | ++ | ++ |
6105/6106 | L163A/T282S/E407V/S449R | +++ | +++ |
6107/6108 | E2P/P158D/L163A/E407V/S449R | + | ++ |
6109/6110 | E2P/K4T/D198E/G364A/L391C/S449R | ++ | +++ |
6111/6112 | V14I/T282S | ++ | ++ |
6113/6114 | V14I/L163A/T282S/R308L | + | ++ |
6115/6116 | E2P/R308L | ++ | + |
6117/6118 | E2P/K4T/L163A/T282S/E342W/G364A | +++ | +++ |
6119/6120 | D198E/R308L | ++ | + |
6121/6122 | E2P/T282S/R308L/L391C/E407V | + | + |
6123/6124 | K4T/V14I/T282S | + | + |
6125/6126 | E2P/K4T/D198E/T282S/S449R | +++ | +++ |
6127/6128 | E2P/K4T/V14I/T282S/G364A | +++ | +++ |
6129/6130 | E2P/V14I/T282S | ++ | + |
6131/6132 | E2P/T282S/N399D/E407V | +++ | ++ |
6133/6134 | K4T/T282S/G364A/E407V | +++ | ++ |
6135/6136 | K4T/V14I/P158D/L163A/D198E/T282S/E407V | +++ | ++ |
6137/6138 | E2P/K4T/P158D/D198E/T282S/G364A/E407V | +++ | +++ |
6139/6140 | E2P/V14I/L163A/G364A/E407V | +++ | +++ |
6141/6142 | V14I/T282S/N399D/E407V/S449R | ++ | ++ |
6143/6144 | K4T/V14I/T282S/E342W/N399D/E407V | + | + |
6145/6146 | E2P/V14I/T282S/R308L/G364A | +++ | ++ |
6147/6148 | E2P/K4T/V14I/P158D/T282S/G364A/S449R | +++ | ++ |
6149/6150 | E2P/D198E/T282S/N399D | +++ | ++ |
6151/6152 | P158D/G364A/S449R | ++ | + |
6153/6154 | E2P/K4T/V14I/L163A/D198E | ++ | + |
6155/6156 | K4T/T282S/E342W/G364A/E407V | +++ | + |
6157/6158 | L163A/T282S/R308L/G364A/N399D | +++ | ++ |
6159/6160 | D198E/T282S/R308L/E342W | ++ | + |
6161/6162 | V14I/T282S/G364A | +++ | ++ |
6163/6164 | K4T/G364A | ++ | + |
6165/6166 | V14I/T282S/R308L | + | + |
6167/6168 | V14I/T282S/G364A/L391C/E407V/S449R | +++ | ++ |
6169/6170 | K4T/P158D/T282S/G364A/N399D | ++ | + |
6171/6172 | L75G | + | + |
6173/6174 | P139S | + | + |
6175/6176 | L401F/E402L | + | ++ |
6177/6178 | P131V | ND | + |
6179/6180 | L138V | ND | + |
6181/6182 | P90S | ND | + |
6183/6184 | S254Q | + | + |
6185/6186 | P139R | + | + |
6187/6188 | M108H | ND | + |
6189/6190 | S106Y | + | + |
6191/6192 | R12S | ND | + |
6193/6194 | P90T | ND | + |
6195/6196 | D416S | + | + |
6197/6198 | P139A | + | + |
6199/6200 | A427K | ND | + |
6201/6202 | I44V | ND | + |
6203/6204 | V365I | + | + |
6205/6206 | S37R | + | + |
6207/6208 | K247C | + | ++ |
6209/6210 | D258N | ND | + |
6211/6212 | E115R | + | + |
6213/6214 | Q71L/R331K | + | + |
6215/6216 | L75M | + | + |
6217/6218 | D416L | + | + |
6219/6220 | D114P | + | + |
6221/6222 | D389S | ND | + |
6223/6224 | S456R | ND | + |
6225/6226 | S456* | - | + |
6227/6228 | S156C | + | + |
6229/6230 | P70K | + | - |
6231/6232 | D389A | + | ++ |
6233/6234 | H248W | + | +++ |
6235/6236 | A427R | + | ++ |
6237/6238 | L429W | + | + |
6239/6240 | K247L | + | + |
6241/6242 | A433L | + | +++ |
6243/6244 | E162A | + | + |
6245/6246 | H248L | + | +++ |
6247/6248 | K432L | + | ++ |
6249/6250 | H248C | + | ++ |
6251/6252 | L174P | + | + |
6253/6254 | P112N | ND | + |
6255/6256 | D389E | + | ++ |
6257/6258 | P90Q | - | + |
6259/6260 | W74H | + | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:5976之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於2.75倍;以及“+++”=至少2.75倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1804,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於無預培育的情況在55 ℃下或是在65.5℃下預培育15分鐘後於60 ℃下,於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋10x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表69.2 β1,3GT第17輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:5976) | 增加的RebA, 55℃ a | 增加的RebA, 60℃ a | 增加的RebM, 60℃ a |
6147/6148 | E2P/K4T/V14I/P158D/T282S/G364A/S449R | + | ++ | ++ |
6037/6038 | E2P/K4T/V14I/T282S/R308L/G364A | + | +++ | ++ |
6137/6138 | E2P/K4T/P158D/D198E/T282S/G364A/E407V | + | +++ | ++ |
6091/6092 | E2P/D198E/T282S/R308L/E342W | + | + | + |
6067/6068 | E2P/K4T/V14I/P158D/T282S/E407V | + | ++ | ++ |
6049/6050 | K4T/V14I/T282S/R308L/G364A/E407V/S449R | + | +++ | ++ |
6023/6024 | E2P/K4T/T282S/E342W/G364A/E407V | + | +++ | ++ |
6105/6106 | L163A/T282S/E407V/S449R | + | ++ | ++ |
a增加的生產位準係以0.025 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:5976之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.3倍,但小於2.4倍;“++”=至少2.4倍,但小於4倍;以及“+++”=至少4倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表69.2中的8種變異體比序列辨識編號:5976,於55℃及/或60℃下自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及/或自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。序列辨識編號:6138於預培育接著60℃檢定的條件下於甜菊苷轉化成甜菊糖苷A有最大的改良,且亦於其他條件下也有改良,是以此變異體被選擇用於進一步的定向演化。
實施例70
序列辨識編號:6138之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:6138之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:6137編碼之GT(即,序列辨識編號:6138)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十八輪(“第18輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的100種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:6137變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋20-40x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。為了熱挑戰溶解產物,使其等於68.6℃之熱循環儀內預培育15分鐘。以10 μL預培育的溶解產物配於100 μL反應並加上10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1840及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。藉由以水稀釋20x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以及以水稀釋10x用於分析。
藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:6138更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表70.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表70.2中列出相對於序列辨識編號:6138的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表70.1 β1,3GT第18輪變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6138) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
6261/6262 | V14I/E330D | ++ | +++ |
6263/6264 | E113S/D158P/L163A/K190R/L257Q/L437I | ++ | +++ |
6265/6266 | D158P/V320I/L437I/S449R | ++ | ++ |
6267/6268 | V14I/D158P/L163A/K190R/E342W/L437I | + | +++ |
6269/6270 | V14I/K190R/L257Q/S317R/V320I/P322L | + | ++ |
6271/6272 | V14I/E113S/D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/E342W | ++ | +++ |
6273/6274 | E113S/D158P/L163A/K190R/R308L/V320I | ++ | +++ |
6275/6276 | K190R/S449R | +++ | +++ |
6277/6278 | V14I/E113S/D158P/L163A | ++ | +++ |
6279/6280 | V14I/E113S/L163A/K190R/R308L/S317R | ++ | +++ |
6281/6282 | V14I/E113S/D158P | + | ++ |
6283/6284 | E113S/D158P/K190R/V320I/P322L/S449R | ++ | +++ |
6285/6286 | E113S/L257Q/S317R/P322L/L437I | + | ++ |
6287/6288 | E113S/D158P/V320I/P322L/L437I | +++ | +++ |
6289/6290 | E113S/D158P/K190R/L257Q/V320I | ++ | +++ |
6291/6292 | P322L/E330D | ++ | +++ |
6293/6294 | S317R/V320I/P322L/E330D | ++ | +++ |
6295/6296 | V14I/S449R | ++ | +++ |
6297/6298 | V14I/E113S/D158P/R308L/S317R/E330D/S449R | +++ | +++ |
6299/6300 | V14I/E113S/D158P/L163A/L437I | +++ | +++ |
6301/6302 | D158P/R308L/V320I/L437I | +++ | +++ |
6303/6304 | V14I/D158P/L163A/L257Q/R308L/S449R | ++ | +++ |
6305/6306 | D158P/L163A/R308L | + | +++ |
6307/6308 | V14I/L257Q/R308L/V320I/P322L/E330D | ++ | +++ |
6309/6310 | E113S/D158P/L163A/L257Q/R308L/S317R/P322L/L437I/S449R | ++ | +++ |
6311/6312 | V14I/L163A/S317R/V320I | + | +++ |
6313/6314 | V14I/D158P/L257Q/R308L/L437I/S449R | +++ | +++ |
6315/6316 | L163A/R308L/E330D/L437I/S449R | ++ | +++ |
6317/6318 | D158P/L163A | ++ | +++ |
6319/6320 | V14I/D158P/L163A/L257Q | + | +++ |
6321/6322 | V14I/D158P/S317R/V320I/E330D/L437I | +++ | +++ |
6323/6324 | V14I/E113S/V320I/L437I/S449R | +++ | +++ |
6325/6326 | E113S/L257Q/R308L | ++ | +++ |
6327/6328 | E113S/D158P/L163A/K190R/R308L/S317R/P322L | ++ | +++ |
6329/6330 | V14I/K190R | + | +++ |
6331/6332 | D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/E342W/S449R | + | +++ |
6333/6334 | V14I/D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/S317R/E330D/L437I | +++ | +++ |
6335/6336 | V14I/L257Q/R308L/P322L/E330D/L437I | +++ | +++ |
6337/6338 | V14I/E113S/L163A/L257Q/L437I | +++ | +++ |
6339/6340 | V14I/S317R | + | +++ |
6341/6342 | V14I/D158P | +++ | +++ |
6343/6344 | V14I/E113S/L163A/R308L/S317R/V320I/P322L/E330D/S449R | ++ | +++ |
6345/6346 | V14I/E113S/L163A/L257Q/R308L/E342W/L437I/S449R | +++ | +++ |
6347/6348 | D158P/L163A/P322L/L437I | +++ | +++ |
6349/6350 | L29M/D375P | + | ++ |
6351/6352 | G84H | ++ | + |
6353/6354 | R88T | + | + |
6355/6356 | D375A | + | + |
6357/6358 | Q197K | + | + |
6359/6360 | I202H | + | ++ |
6361/6362 | P83S | + | + |
6363/6364 | I202T | + | + |
6365/6366 | G84N | ++ | + |
6367/6368 | A85L | + | + |
6369/6370 | V19Q | + | + |
6371/6372 | A199M | + | + |
6373/6374 | I202Q | + | ++ |
6375/6376 | N383V | + | ++ |
6377/6378 | H81T | + | + |
6379/6380 | D375V | + | + |
6381/6382 | A199Y | + | + |
6383/6384 | D72S | + | + |
6385/6386 | D375P | +++ | +++ |
6387/6388 | D72T | + | + |
6389/6390 | P83N | + | + |
6391/6392 | R88K | + | + |
6393/6394 | V155L | ++ | ++ |
6395/6396 | A199H | + | + |
6397/6398 | T80P | + | + |
6399/6400 | Q71V | + | + |
6401/6402 | P83A | + | + |
6403/6404 | E209T | + | + |
6405/6406 | A199E | + | + |
6407/6408 | P83T | + | + |
6409/6410 | I202V | + | + |
6411/6412 | G84D | + | + |
6413/6414 | R88C | + | + |
6415/6416 | A199Q | +++ | ++ |
6417/6418 | D375T | + | ++ |
6419/6420 | R88A | + | + |
6421/6422 | P83K | + | + |
6423/6424 | R88H | + | + |
6425/6426 | S41A | + | ND |
6427/6428 | A366T | + | ND |
6429/6430 | A366V | ++ | ND |
6431/6432 | E105A | + | ND |
6433/6434 | S273R | ++ | ND |
6435/6436 | S273H | ++ | ND |
6437/6438 | V263T | + | ND |
6439/6440 | P168C | + | ND |
6441/6442 | L243I | +++ | ND |
6443/6444 | H95N | + | ND |
6445/6446 | A366S | + | ND |
6447/6448 | H46S | + | ND |
6449/6450 | S273A | + | ND |
6451/6452 | A366L | ++ | ND |
6453/6454 | A366C | +++ | ND |
6455/6456 | Y249S | + | ND |
6457/6458 | F45L | + | ND |
6459/6460 | P168T | + | ND |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:6138之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於0.9倍;“+”=生產至少0.9倍,但小於1.5倍;“++”=至少1.5倍,但小於1.9倍;以及“+++”=至少1.9倍增加的生產。 ND =未確定。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.1 g/L SUS SFP序列辨識編號:1804,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於無預培育的情況在55 ℃下或是在68.6℃下預培育15分鐘後於60 ℃下,於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋10x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。
表70.2 β1,3GT第18輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6138) | 增加的RebA,60℃ a | 增加的RebM,60℃ a |
6261/6262 | V14I/E330D | + | + |
6267/6268 | V14I/D158P/L163A/K190R/E342W/L437I | + | +++ |
6287/6288 | E113S/D158P/V320I/P322L/L437I | +++ | +++ |
6299/6300 | V14I/E113S/D158P/L163A/L437I | ++ | ++ |
6333/6334 | V14I/D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/S317R/E330D/L437I | ++ | ++ |
a增加的生產位準以0.025 g/L搖動燒瓶粉末,係相對於序列辨識編號:6138之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於1.08倍;“+”=生產至少1.08倍,但小於1.5倍;“++”=至少1.5倍,但小於1.7倍;以及“+++”=至少1.7倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表70.2中的5種變異體(序列辨識編號:6262、6268、6288、6300及6334)比序列辨識編號:6138,於有預培育之60℃下自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。序列辨識編號:6288於預培育接著60℃檢定的條件下對於甜菊苷轉化成甜菊糖苷A有最大的改良,且對於甜菊糖苷D轉化成M有第二大改良,是以此變異體被選擇用於進一步的定向演化。
實施例71
序列辨識編號:6288之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:6288之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:6287編碼之GT(即,序列辨識編號:6288)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第十九輪(“第19輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的108種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:6288變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述然後稀釋40x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。為了熱挑戰溶解產物,使其等於73.5℃之熱循環儀內預培育15分鐘或者於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在65℃下搖動歷時16 h。以10 μL預培育的溶解產物配於100 μL反應並加上10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2064及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。藉由以水稀釋20x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以及以水稀釋10x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:6288更多之醣基轉移酶變異體多肽。來自15分鐘預培育篩選的組合庫的經工程處理之多肽列於表71.1中,以及來自16 h預培育篩選的飽和致突變庫的該等列於表71.2中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例1中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表71.3中列出相對於序列辨識編號:6288的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表71.1 β1,3GT第19輪組合變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6288) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
6461/6462 | S37R/Q71L/K247C/R331K/V365I/D389E/L401F/L429W | + | +++ |
6463/6464 | P139K/S156C/K247L/D389E/L401F/A427R/A433L/S449R | + | ++++ |
6465/6466 | K247L/H248W/S449R | + | ++++ |
6467/6468 | P139K/S156C/L174P/D389E/L401F/A427R/A433L/S449R | ++ | ++++ |
6469/6470 | P139K/K247C/H248W/R331K/L401F/P417Q/K432L/S449R | + | ++++ |
6471/6472 | L174P/D389E/L429W/K432L/A433L/S449R | + | ++++ |
6473/6474 | D416S/K432L/A433L | + | ++++ |
6475/6476 | S37R/H248W/D389A/L401F/L429W | + | ++++ |
6477/6478 | Q71L/H248W/V365I/D389A/L401F | + | ++++ |
6479/6480 | P139K/S156C/H248W/D389A/L401F/D416S/A427R/L429W/A433L | + | ++++ |
6481/6482 | Q71L/P139K/D389A/A427R/L429W/K432L/A433L/S449R | + | +++ |
6483/6484 | S37R/Q71L/L125M/L174P/K247C/H248W/A427R | + | ++++ |
6485/6486 | S37R/L174P/L401F/E402L/A433L/S449R | + | ++++ |
6487/6488 | S156C/D389E/L401F/E402L/D416L/K432L/A433L | ++ | ++++ |
6489/6490 | S254Q/A427R/A433L | + | +++ |
6491/6492 | S156C/S254Q/R331K/V365I/A427R/K432L/S449R | ++ | +++ |
6493/6494 | A427R/K432L/S449R | +++ | ++++ |
6495/6496 | S37R/P139K/A427R/K432L/A433L/S449R | + | +++ |
6497/6498 | P139K/H248W/E402L/D416L/A427R/A433L/S449R | + | +++ |
6499/6500 | D416L/K432L/A433L/S449R | + | ++++ |
6501/6502 | K247C/A427R/K432L | + | ++++ |
6503/6504 | H248W/L401F/L429W/K432L/A433L | + | ++++ |
6505/6506 | H248W/R331K/A427R/L429W/A433L | ++ | +++ |
6507/6508 | A427R/K432L | +++ | +++ |
6509/6510 | P139K/S254Q/L401F/D416S/A427R/A433L/S449R/ | ++ | +++ |
6511/6512 | L174P/G329P/K432L/S449R | ++ | +++ |
6513/6514 | P139K/L401F/S449R | ++ | +++ |
6515/6516 | P139K/L174P/S254Q | ++ | +++ |
6517/6518 | P139K/L174P/V365I/L401F/E402L/A427R/A433L/S449R | +++ | ++++ |
6519/6520 | D389E/L401F/A427R/K432L | +++ | +++ |
6521/6522 | Q71L/A427R/K432L/A433L/S449R | + | ++++ |
6523/6524 | S37R/P139K/G329P/V365I/A427R/A433L/S449R | ++ | ++++ |
6525/6526 | Q71L/L174P/G329P/A427R/L429W/K432L/A433L | + | ++++ |
6527/6528 | R331K/V365I/L429W/K432L/A433L/S449R | ++ | ++++ |
6529/6530 | D416L/A427R/A433L/S449R | + | ++++ |
6531/6532 | S37R/H248W/R331K/D389E/A427R/A433L | + | ++++ |
6533/6534 | S37R/P139K/L429W/K432L/A433L | ++ | ++++ |
6535/6536 | S156C/H248W/L256M | + | ++++ |
6537/6538 | K247C/H248W/L401F | ++ | ++++ |
6539/6540 | S37R/R331K/K432L/A433L | ++ | ++++ |
6541/6542 | K247C/R331K/L401F/A427R/K432L/S449R | ++ | ++++ |
6543/6544 | D389A/L401F/D416S/K432L/S449R | ++ | +++ |
6545/6546 | P139K/L174P/H248W/R331K/D389A/L401F/S449R | ++ | ++++ |
6547/6548 | L174P/K247C/H248W/D389A/L401F/K432L/A433L | + | +++ |
6549/6550 | S254Q/V365I | ++ | +++ |
6551/6552 | P139K/S156C/V365I | + | +++ |
6553/6554 | P139K/S156C/K247C/V365I/L401F/A433L/S449R | + | ++++ |
6555/6556 | Q71L/H248W/S449R | ++ | +++ |
6557/6558 | Q71L/K432L/A433L | ++ | +++ |
6559/6560 | H248W/D416L | ++ | +++ |
6561/6562 | Q71L/S254Q/A433L/S449R | ++ | +++ |
6563/6564 | A433L/S449R | ++ | +++ |
6565/6566 | K247L/L401F | ++ | +++ |
6567/6568 | H248W/V365I/D389E/A427R/L429W/K432L/S449R | ++ | +++ |
6569/6570 | Q71L/L174P/V365I/A427R/K432L | + | +++ |
6571/6572 | P139K/S156C/H248W/D389E | ++ | +++ |
6573/6574 | P139K/H248W/S254A/S449R | ++ | +++ |
6575/6576 | L174P/V365I | ++ | +++ |
6577/6578 | H248W/S449R | ++ | +++ |
6579/6580 | H248W/D416L/S449R/ | ++ | +++ |
6581/6582 | K432L | + | +++ |
6583/6584 | P139K/H248W/K432L/A433L | ++ | ++++ |
6585/6586 | V365I/L401F/E402L/L429W/K432L/A433L | + | +++ |
6587/6588 | L401F/A427R | ++ | +++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:6288之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.9倍;“++”=至少1.9倍,但小於2.5倍;“+++”=至少2.5倍,但小於7倍;以及“++++”=至少7倍增加的生產。 |
表71.2 β1,3GT第19輪飽和致突變變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6288) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
6589/6590 | M87R | + | ++ |
6591/6592 | M144Q/S449R | +++ | +++ |
6593/6594 | I91Q | + | + |
6595/6596 | I91N/S449R | - | ++ |
6597/6598 | I91T/S449R | + | + |
6599/6600 | L25M/S449R | + | ++ |
6601/6602 | D69M/S449R | + | + |
6603/6604 | M87Q | ++ | ++ |
6605/6606 | M87K | ++ | +++ |
6607/6608 | T361C | +++ | +++ |
6609/6610 | L25I/S449R | + | + |
6611/6612 | M87A/S449R | + | +++ |
6613/6614 | M87E | ++ | +++ |
6615/6616 | A153V | + | + |
6617/6618 | A153T/S449R | +++ | + |
6619/6620 | L25Q/S449R | + | ++ |
6621/6622 | L25S | + | ++ |
6623/6624 | D69A | + | + |
6625/6626 | I91V | + | ++ |
6627/6628 | I91L | + | + |
6629/6630 | W233M/S449R | ND | +++ |
6631/6632 | S317Y | ND | +++ |
6633/6634 | W233V | ND | + |
6635/6636 | W233S | ND | +++ |
6637/6638 | A212L/S449R | ND | + |
6639/6640 | W233L/S449R | ND | ++ |
6641/6642 | V369K | ND | + |
6643/6644 | V421I | ND | + |
6645/6646 | W233C | ND | ++ |
6647/6648 | W233Q/S449R | ND | +++ |
6649/6650 | E6P | ND | - |
6651/6652 | K347P/S449R | ND | + |
6653/6654 | Q159R/S449R | ND | ++ |
6655/6656 | Q159K | ND | +++ |
6657/6658 | E288P/S449R | ND | ++ |
6659/6660 | H172S | ND | + |
6661/6662 | T5S/S449R | ND | + |
6663/6664 | W233G | ND | + |
6665/6666 | Q303C | ND | + |
6667/6668 | W233A | ND | ++ |
6669/6670 | R10K | ND | + |
6671/6672 | W233R | ND | ++ |
6673/6674 | H172T/S449R | ND | + |
6675/6676 | Q303V | ND | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:6288之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.28倍;“++”=至少1.28倍,但小於1.5倍;以及“+++”=至少1.5倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、10 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2064,及24 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應於無預培育的情況在55 ℃下或是在73.5℃下預培育15分鐘後於60 ℃下,於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋10x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。於冷凍乾燥之前,以澄清的搖動燒瓶溶解產物進行進一步熱穩定性特徵化如下:以緩衝劑溶解產物稀釋400x且於55-70℃梯度下於熱循環儀內培育歷時16 h。為了判定剩餘的活性百分比,預培育的溶解產物係如上所述以甜菊苷或甜菊糖苷D且於60℃下培育4 h予以檢定。剩餘的活性百分比表達為高溫下的生產除以最低的預培育溫度下的生產。
表71.3 β1,3GT第19輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA、RebM及熱穩定性位準 | |||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6288) | 增加的RebA,55℃ a | 增加的RebA,60℃ a | 增加的RebM,60℃ a | 剩餘的活性% b |
6467/6468 | P139K/S156C/L174P/D389E/L401F/A427R/A433L/S449R | + | ++ | +++ | +++ |
6493/6494 | A427R/K432L/S449R | + | ++ | ++ | ++ |
6517/6518 | P139K/L174P/V365I/L401F/E402L/A427R/A433L/S449R | - | + | ++ | +++ |
6519/6520 | D389E/L401F/A427R/K432L | + | ++ | ++ | +++ |
6527/6528 | R331K/V365I/L429W/K432L/A433L/S449R | - | + | +++ | + |
6539/6540 | S37R/R331K/K432L/A433L | + | + | +++ | - |
6573/6574 | P139K/H248W/S254A/S449R | - | + | +++ | + |
6583/6584 | P139K/H248W/K432L/A433L | - | + | +++ | ++ |
a增加的生產位準係以0.025 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:6288之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於0.9倍;“+”=生產至少0.9倍,但小於3.2倍;“++”=至少3.2倍,但小於5.5倍;以及“+++”=至少5.5倍增加的生產。 b剩餘的活性百分比位準係於70℃預培育16 h後,相對於各變異體於55℃預培育16 h後予以判定且定義如下:“-“= 小於55℃預培育16 h後剩餘活性的20%;“+”=剩餘活性的至少20%,但小於40%;“++”=剩餘活性的至少40%,但小於60%;以及“+++”=剩餘活性的至少60%。 |
於此等實驗中,表71.3中的8種變異體比序列辨識編號:6288,於有預培育之60℃下自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。序列辨識編號:6468於預培育接著60℃檢定的條件下對於甜菊糖苷D轉化成甜菊糖苷M有最大的改良,且於16 h熱挑戰後剩餘最大百分比的活性,是以選擇此變異體用於進一步的定向演化。
實施例72
序列辨識編號:6468之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:6468之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:6467編碼之GT(即,序列辨識編號:6468)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第二十輪(“第20輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的269種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:6467變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋40x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。為了熱挑戰溶解產物,使其等於79℃之熱循環儀內預培育15分鐘或者於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM在65℃下搖動歷時16 h。以10 μL預培育的溶解產物配於100 μL反應並加上15 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D受質、0.1 g/L ADP(Sigma,>93%純度)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2432及37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。藉由以水稀釋20x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以及以水稀釋15x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:6468更多之醣基轉移酶變異體多肽。來自15分鐘預培育篩選的組合庫的經工程處理之多肽列於表72.1中,以及來自16 h預培育篩選的飽和致突變庫的該等列於表72.2中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表72.3中所示相對於序列辨識編號:6468的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表72.1 β1,3GT第20輪組合變異體及RebA與RebM位準 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6468) | 增加的RebA a | 增加的RebM a |
6677/6678 | D72T/P83S/G84N/R88T/I202H/S254A/S273R/A366C/D375P | ++ | ++ |
6679/6680 | F45L/D72T/R88T/A366C | ++ | ++ |
6681/6682 | P83S/R88T/V155L/S273R/A366V/D375P | ++ | +++ |
6683/6684 | H81T/R88T/D375P/E402L | ++ | +++ |
6685/6686 | S37R/D72T/Q197K/S273R/R331K/D375P/K432L | ++ | +++ |
6687/6688 | D72T/V155L/K190R | ++ | +++ |
6689/6690 | H248W/D375P | ++ | +++ |
6691/6692 | D72T/H248W | ++ | +++ |
6693/6694 | H81T/P83S/I202H/V365I/A366C/E402L | + | +++ |
6695/6696 | A199Q/V263T/R331K/V365I/A366C | ++ | ++ |
6697/6698 | V365I/A366C | ++ | ++ |
6699/6700 | F45L/D72T/P168T/L243I/R331K/V365I/A366C/L429W/K432L | ++ | ++ |
6701/6702 | D72T/P83S/R88T/L243I/V263T/R331K/V365I/A366C | ++ | ++ |
6703/6704 | H81T/P83S/K190R/V263T/V365I/A366C | ++ | +++ |
6705/6706 | S37R/D72T/H81T/P83S/R88T/V155L/K190R | ++ | ++ |
6707/6708 | F45L/D72T/G84N/R88T/Q197K/D375P | ++ | ++++ |
6709/6710 | G84N/Q197K/A366C/E402L | + | +++ |
6711/6712 | F45L/L163A/P168T/K190R/A199Q/A366C/L429W/K432L | ++ | ++ |
6713/6714 | G84N/V155L/P168T/Q197K/A199Q/R331K/A366V/D375P/N383V/E402L | ++ | + |
6715/6716 | K190R/A199Q/I202H/R331K/A366C | + | ++++ |
6717/6718 | S37R/K190R/I202H | + | +++ |
6719/6720 | D72T/P83S/G84N/Q197K/I202H/L243I/V263T/V365I/A366C | ++ | +++ |
6721/6722 | Q197K/A199Q/I202H | - | +++ |
6723/6724 | G84N/P168T/Q197K/I202H/V263T/A366C | + | +++ |
6725/6726 | Q197K/I202H/H248W | + | ++++ |
6727/6728 | Q197K/H248W | ++ | ++++ |
6729/6730 | S37R/P83S/V263T/V365I/A366V/D375P | ++ | +++ |
6731/6732 | F45L/L163A/P168T/Q197K/V263T/R331K/V365I/A366C | + | +++ |
6733/6734 | F45L/D72T/L163A/I202H/V365I/A366V/D375P | ++ | ++++ |
6735/6736 | D72T/H81T/G84N/K190R/H248W | ++ | +++ |
6737/6738 | H81T/P83S/E169D/K190R/V263T | ++ | +++ |
6739/6740 | F45L/G84N/P168T/K190R/A199Q/S254A/S273R/V365I/A366C | ++ | + |
6741/6742 | V365I/D375P/E402L | + | +++ |
6743/6744 | V155L/P168T/K190R/Q197K/A199Q/A366C | ++ | +++ |
6745/6746 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/L243I/H248W/S273R/R331K/K432L/L433A | + | +++ |
6747/6748 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/R331K/A366C/D375P | ++ | +++ |
6749/6750 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R | ++ | ++ |
6751/6752 | V155L/V263T/A366C/K432L/L433A | ++ | +++ |
6753/6754 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/V263T/D375P | ++ | +++ |
6755/6756 | S37R/S41A/F45L/V155L/A366C/K432L/L433A | ++ | +++ |
6757/6758 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/V263T/R331K/D375P | ++ | ++ |
6759/6760 | S37R/S41A/F45L/V155L/A366C | ++ | ++ |
6761/6762 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/L243I/H248W/S273R/R331K/A366V/K432L/L433A | + | +++ |
6763/6764 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/S273R/R331K/A366V/D375P | ++ | ++ |
6765/6766 | S37R/S41A/F45L/L243I/H248W/S273R/R331K | + | ++ |
6767/6768 | S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/V263T/S273R/R331K/A366C/D375P | ++ | ++ |
6769/6770 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/S273R/A366C | ++ | +++ |
6771/6772 | S37R/S41A/F45L/V155L/P168T/H248W/S273R/R331K/D375P | + | ++ |
6773/6774 | S37R/S41A/F45L/V155L/L163A/P168T/V263T/R331K/D375P | ++ | +++ |
6775/6776 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/R331K/A366V/D375P/K432L/L433A | ++ | +++ |
6777/6778 | S37R/S41A/F45L/V155L/K190R/R331K/A366V/D375P | ++ | +++ |
6779/6780 | H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/S273R/R331K/D375P | ++ | ++ |
6781/6782 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/K190R/L243I/V263T/R331K/A366C | ++ | ++ |
6783/6784 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/H248W/V263T/S273R/A366C | ++ | +++ |
6785/6786 | V155L/P168T/D375P | ++ | +++ |
6787/6788 | S41A/F45L/L163A/P168T/L243I/H248W/S273R/A366C/K432L | + | +++ |
6789/6790 | S37R/S41A/F45L/V155L/D375P | ++ | +++ |
6791/6792 | D72T/L243I/H248W/A366V/K432L/L433A | + | +++ |
6793/6794 | D72T/L243I/H248W/S273R/A366V/K432L/L433A | + | +++ |
6795/6796 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/V263T/R331K/D375P | ++ | +++ |
6797/6798 | D72T/V155L/S273R/R331K/D375P/K432L | ++ | +++ |
6799/6800 | D72T/L243I/H248W/V263T/A366V/K432L/L433A | ++ | +++ |
6801/6802 | S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/R331K/A366C/D375P | ++ | ++ |
6803/6804 | S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/P168T/R331K/D375P | ++ | ++ |
6805/6806 | S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/R331K/D375P | ++ | ++ |
6807/6808 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/H248W/V263T/R331K | ++ | +++ |
6809/6810 | S37R/S41A/F45L/D72T/V263T/A366C/K432L/L433A | ++ | +++ |
6811/6812 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/S273R/A366C | ++ | ++ |
6813/6814 | S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/S273R/R331K/D375P/K432L | ++ | ++ |
6815/6816 | S37R/S41A/F45L/V263T/R331K/D375P/K432L | ++ | +++ |
6817/6818 | S37R/S41A/F45L/D72T/R331K/A366C | ++ | ++ |
6819/6820 | H81T/P83S/G84N/R88T/V263T/S273R/R331K/A366C/K432L | ++ | ++ |
6821/6822 | H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/A366C | ++ | ++ |
6823/6824 | S37R/S41A/F45L/D72T/R88T/V155L/P168T/K190R/R331K/A366C/D375P/K432L | ++ | ++ |
6825/6826 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/V263T/A366C/K432L/L433A | ++ | ++ |
6827/6828 | H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/A366V/D375P | ++ | ++ |
6829/6830 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/K190R/L243I/V263T/S273R/R331K/A366C/K432L | ++ | ++ |
6831/6832 | S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/H248W/D375P | ND | + |
6833/6834 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/K190R/A366C | ++ | + |
6835/6836 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C | ++ | ++ |
6837/6838 | D72T/V155L/K190R/A366C | ++ | ++ |
6839/6840 | S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/V263T/S273R/R331K | ND | ++ |
6841/6842 | D72T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C | ++ | ++ |
6843/6844 | S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/A366C | ++ | ++ |
6845/6846 | H81T/P83S/G84N/R88T/K190R/V263T/D375P | ++ | ++ |
6847/6848 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/A366C | ++ | ++ |
6849/6850 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/S273R/R331K/D375P | ++ | ++ |
6851/6852 | S37R/S41A/F45L/R331K/A366V/K432L/L433A | ++ | + |
6853/6854 | S37R/S41A/F45L/D72T/R88T/V155L/P168T/K190R/R331K/D375P | ++ | ++ |
6855/6856 | S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/K190R/R331K/D375P | ++ | ++ |
6857/6858 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R/S273R/R331K/A366V/K432L | ++ | ++ |
6859/6860 | S41A/F45L/D72T/V155L/V263T/R331K/A366V/D375P/K432L/L433A | ++ | ++ |
6861/6862 | S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/R331K/A366V/K432L/L433A | ++ | ++ |
6863/6864 | S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/R331K/A366C | ++ | ++ |
6865/6866 | S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/P168T/K190R/L243I/R331K/A366C | ++ | + |
6867/6868 | S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/S273R/R331K/A366C | ++ | ++ |
6869/6870 | S37R/S41A/F45L/D72T/R88T/K190R/V263T/S273R/R331K/A366C | ++ | ++ |
6871/6872 | S37R/S41A/F45L/D72T/V263T/R331K/A366C | ++ | ++ |
6873/6874 | H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C | ++ | ++ |
6875/6876 | S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/S273R/A366C/D375P/K432L | ++ | ++ |
6877/6878 | D72T/V155L/L163A/P168T/K190R/A366V/K432L/L433A | ++ | ++ |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:6468之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產至少參考多肽的位準;“+”=至少參考多肽的位準,但小於2倍;“++”=至少2倍,但小於4倍;“+++”=至少4倍,但小於8倍;以及“++++”=至少8倍增加的生產。 ND =未確定。 |
表72.2 β1,3GT第20輪飽和致突變變異體及RebA位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6468) | 增加的RebA a |
6879/6880 | L322K | +++ |
6881/6882 | R435S | +++ |
6883/6884 | V9K | + |
6885/6886 | P439G | + |
6887/6888 | Q265H | + |
6889/6890 | S253D | + |
6891/6892 | S61Q | +++ |
6893/6894 | P2Q | + |
6895/6896 | P2H | + |
6897/6898 | N408S | + |
6899/6900 | P439A | ++ |
6901/6902 | K428R | ++ |
6903/6904 | D170A | + |
6905/6906 | G96K | + |
6907/6908 | D98E | + |
6909/6910 | K171Q | + |
6911/6912 | R296Q | + |
6913/6914 | A118V | ++ |
6915/6916 | L229M | + |
6917/6918 | P2K | +++ |
6919/6920 | S253P | +++ |
6921/6922 | K222Q | ++ |
6923/6924 | P439H | ++ |
6925/6926 | A118T/L120V | ++ |
6927/6928 | T4N | + |
6929/6930 | M183L | ++ |
6931/6932 | Q269N | ++ |
6933/6934 | S253T | +++ |
6935/6936 | P272S | + |
6937/6938 | R435Y | ++ |
6939/6940 | K289N | + |
6941/6942 | S253V | + |
6943/6944 | K222A | ++ |
6945/6946 | A438S | ++ |
6947/6948 | R435G | ++ |
6949/6950 | S442T | + |
6951/6952 | R435D | ++ |
6953/6954 | L322P/V407I | + |
6955/6956 | E226S | + |
6957/6958 | D170V | + |
6959/6960 | P2R | + |
6961/6962 | L322V/V407I | +++ |
6963/6964 | R173K | ++ |
6965/6966 | N399S | + |
6967/6968 | N3M | ++ |
6969/6970 | M183I | +++ |
6971/6972 | K428L | + |
6973/6974 | K302G | + |
6975/6976 | K222R | + |
6977/6978 | R435N | ++ |
6979/6980 | Q269R | +++ |
6981/6982 | R435E | +++ |
6983/6984 | V9S | ++ |
6985/6986 | S442F | +++ |
6987/6988 | Y396T | ++ |
6989/6990 | K428I | +++ |
6991/6992 | S214R | ++ |
6993/6994 | E405P | + |
6995/6996 | R234S | + |
6997/6998 | P439E | + |
6999/7000 | N3F | + |
7001/7002 | V390I | +++ |
7003/7004 | P439R | + |
7005/7006 | Y193F | ++ |
7007/7008 | R403V | ++ |
7009/7010 | K171L | + |
7011/7012 | P158T | + |
7013/7014 | N408D | + |
7015/7016 | G96C | + |
7017/7018 | K171A | ++ |
7019/7020 | Q269M | + |
7021/7022 | D300E | + |
7023/7024 | K222N | + |
7025/7026 | D170G | + |
7027/7028 | P2M | + |
7029/7030 | K428Y | + |
7031/7032 | K94R | + |
7033/7034 | L322T | ++ |
7035/7036 | E448Q | + |
7037/7038 | D98T | ++ |
7039/7040 | N3L | + |
7041/7042 | R411K | ++ |
7043/7044 | D170H | + |
7045/7046 | Q269L | + |
7047/7048 | K171P | +++ |
7049/7050 | E405S | ++ |
7051/7052 | M183P | ++ |
7053/7054 | V395I/P439V | +++ |
7055/7056 | L322S | +++ |
7057/7058 | V9A | + |
7059/7060 | R449L | + |
7061/7062 | Y165L | +++ |
7063/7064 | A438E | + |
7065/7066 | R234T | ++ |
7067/7068 | L229Q | + |
7069/7070 | K428G | ++ |
7071/7072 | N399P | +++ |
7073/7074 | F64M | + |
7075/7076 | E330S | ++ |
7077/7078 | N408K | + |
7079/7080 | D434G | + |
7081/7082 | E405T | + |
7083/7084 | N399Q | ++ |
7085/7086 | R435L | ++ |
7087/7088 | R435V | + |
7089/7090 | P2F | ++ |
7091/7092 | E448K | + |
7093/7094 | F64L | + |
7095/7096 | K53E/I437T | +++ |
7097/7098 | R411H | + |
7099/7100 | K428V | +++ |
7101/7102 | K428T | ++ |
7103/7104 | R173L | + |
7105/7106 | D98S | + |
7107/7108 | P439W | + |
7109/7110 | Y396V | + |
7111/7112 | S113P | ++ |
7113/7114 | K428Q | +++ |
7115/7116 | V9M | + |
7117/7118 | A438R | ++ |
7119/7120 | D434E | +++ |
7121/7122 | R411T | +++ |
7123/7124 | R234N | ++ |
7125/7126 | K428S | +++ |
7127/7128 | D300A | + |
7129/7130 | R173S | + |
7131/7132 | K289R | + |
7133/7134 | L322P | +++ |
7135/7136 | S113G | + |
7137/7138 | R423T | + |
7139/7140 | P439M | + |
7141/7142 | E405A | + |
7143/7144 | S214R/K222H | + |
7145/7146 | D72E/D170A | ++ |
7147/7148 | T4S | +++ |
7149/7150 | R449G | + |
7151/7152 | D134E/P158N | +++ |
7153/7154 | R435K | + |
7155/7156 | L322A | ++ |
7157/7158 | S452T | + |
7159/7160 | R412K | +++ |
7161/7162 | A118C | + |
7163/7164 | Y444A | + |
7165/7166 | E405D | + |
7167/7168 | L120V | ++ |
7169/7170 | S253E | +++ |
7171/7172 | P2V | + |
7173/7174 | D170P | ++ |
7175/7176 | K289G | + |
7177/7178 | K428E | ++ |
7179/7180 | V390R | + |
7181/7182 | S304P | + |
7183/7184 | S214K | ++ |
7185/7186 | R173I | + |
7187/7188 | S113D | +++ |
7189/7190 | R435I | +++ |
7191/7192 | D72E/E405S | ++ |
7193/7194 | R435A | + |
7195/7196 | E398S | + |
7197/7198 | I454V | ++ |
7199/7200 | R449S | + |
7201/7202 | K428N | +++ |
7203/7204 | V9G | ++ |
7205/7206 | K289D | + |
7207/7208 | S304K | ++ |
7209/7210 | L322G | ++ |
7211/7212 | A129P | + |
7213/7214 | S253N | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:6468之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=生產至少1.05倍,但小於1.14倍;“++”=至少1.14倍,但小於1.2倍;以及“+++”=至少1.2倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.006-0.2 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2432,及37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應於無預培育的情況在55 ℃下或是在79 ℃下預培育15分鐘後於60 ℃下,在一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋15x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。於冷凍乾燥之前,以澄清的搖動燒瓶溶解產物進行進一步熱穩定性特徵化如下:以緩衝劑溶解產物稀釋400x且於60-75℃梯度下於熱循環儀內培育歷時16 h。為了判定剩餘的活性百分比,預培育的溶解產物係如上所述以甜菊苷或甜菊糖苷D且於60℃下培育4 h予以檢定。剩餘的活性百分比表達為高溫下的生產除以最低的預培育溫度下的生產。
表72.3 β1,3GT第20輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA、RebM及熱穩定性位準 | |||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6468) | 增加的RebA,55 ℃ a | 增加的RebA,60 ℃ a | 增加的RebM,60 ℃ a | 剩餘的活性% b |
6739/6740 | F45L/G84N/P168T/K190R/A199Q/S254A/S273R/V365I/A366C | + | +++ | ++ | ++ |
6873/6874 | H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C | + | +++ | + | + |
6863/6864 | S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/R331K/A366C | + | ++ | ++ | + |
6755/6756 | S37R/S41A/F45L/V155L/A366C/K432L/L433A | + | +++ | ++ | ++ |
6809/6810 | S37R/S41A/F45L/D72T/V263T/A366C/K432L/L433A | + | +++ | ++ | ++ |
6743/6744 | V155L/P168T/K190R/Q197K/A199Q/A366C | + | ++ | + | + |
6695/6696 | A199Q/V263T/R331K/V365I/A366C | + | +++ | + | ++ |
6837/6838 | D72T/V155L/K190R/A366C | + | ++ | ++ | - |
6849/6850 | D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/S273R/R331K/D375P | + | ++ | + | ++ |
6707/6708 | F45L/D72T/G84N/R88T/Q197K/D375P | + | +++ | + | +++ |
6681/6682 | P83S/R88T/V155L/S273R/A366V/D375P | - | +++ | ++ | ++ |
6697/6698 | V365I/A366C | - | + | + | + |
6785/6786 | V155L/P168T/D375P | - | ++ | ++ | +++ |
6725/6726 | Q197K/I202H/H248W | - | + | ++ | ++ |
a增加的生產位準係以0.025 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:6468之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.8倍;“++”=至少1.8倍,但小於2.5倍;以及“+++”=至少2.5倍增加的生產。 b各變異體剩餘的活性百分比係於70℃預培育16 h後,相對於各變異體於60℃預培育16 h後的生產予以判定,且定義如下:“-“=小於60℃預培育16 h後剩餘活性的40%;“+”=剩餘活性的至少40%,但小於60%;“++”=剩餘活性的至少60%,但小於80%;以及“+++”=剩餘活性的至少80%。 |
於此等實驗中,表72.3中的14種變異體比序列辨識編號:6468,於有預培育之60℃下自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M,以及除四個之外全體於沒有預培育之55℃下有勝過處。序列辨識編號:6864被選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊苷及甜菊糖苷D分別用於形成甜菊糖苷A及甜菊糖苷M。
實施例73
序列辨識編號:6864之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:6864之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:6863編碼之GT(即,序列辨識編號:6864)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第二十一輪(“第21輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的37種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊糖苷A 60之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:6863變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例34中所述者然後稀釋40x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。為了熱挑戰溶解產物,使其等於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM在75℃下搖動歷時1 h予以預培育。以10 μL預培育的溶解產物配於100 μL反應並加上20 g/L甜菊糖苷A 60%受質、0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2510、0.1 g/L β-1,2-醣基轉移酶(β12GT)序列辨識編號:4550及37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時4 h。藉由以水稀釋20x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以及以水稀釋15x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊苷/甜菊糖苷D加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷A/甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:6864更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表73.1中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表73.2中所示相對於序列辨識編號:6864的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表73.1 β1,3GT第21輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6864) | 增加的RebM a |
7361/7362 | R109W/M144Q/A153V/V155L/Q159K/L433A | + |
7363/7364 | M87K/M144Q | +++ |
7365/7366 | M87K/M144Q/Q159K/T361C | + |
7367/7368 | M87K/L433A | + |
7371/7372 | M144Q | +++ |
7373/7374 | M87K/M144Q/Q159K/T361C/L433A | + |
7375/7376 | R88T/M144Q/Q159K | +++ |
7377/7378 | R88T/M144Q | ++ |
7379/7380 | T5S/D69A/I91Q/A212L/Q303V | ++ |
7381/7382 | V263T/E288P/Q303V/S317Y | ++ |
7383/7384 | T5S/E6P/D69A/E288P/Q303V | ++ |
7385/7386 | T5S/L25Q/E288P | + |
7387/7388 | T5S/E6P/I91Q/E288P/S317Y | +++ |
7389/7390 | T5S/I91Q/S317Y/V421I | + |
7391/7392 | L25Q/I91Q/V263T/E288P/Q303V | + |
7393/7394 | E288P | + |
7395/7396 | T5S/L25Q/I91Q/V263T | + |
7397/7398 | T5S/I91Q/Q303V | ++ |
7399/7400 | T5S/E288P | ++ |
7401/7402 | E6P/A212L/E288P/Q303V | + |
7403/7404 | L25Q/I91T/Q303V/S317Y/V369K | + |
7405/7406 | L25Q/V263T/S317Y | +++ |
7407/7408 | E6P/I91Q/A212L/E288P/Q303V/V369K/V421I | + |
7409/7410 | I91Q/E288P/S317Y/V369K/V421I | ++ |
7411/7412 | L25Q/I91Q/A212L/E288P | + |
7413/7414 | A212L/E288P | + |
7415/7416 | I91Q/Q303V | +++ |
7417/7418 | I91Q/E288P/Q303V/S317Y/V369K | ++ |
7419/7420 | I91Q/S317Y | ++ |
7421/7422 | T5S/I91Q/E288P/Q303V | +++ |
7423/7424 | T5S/E6P/L25I/S317Y | ++ |
7425/7426 | I91Q/V263T/S317Y/V369K | ++ |
7427/7428 | I91Q/S317Y/V369K | + |
7429/7430 | T5S/D69A/I91Q/A212L/E288P | + |
7431/7432 | T5S/L25Q/I91Q/A212L/Q303V/S317Y | ++ |
7433/7434 | E6P/E288P | + |
7435/7436 | L25Q/I91Q/S317Y/V369K | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:6864之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少1.12倍,但小於1.23倍;“++”=至少1.23倍,但小於1.33倍;以及“+++”=至少1.33倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.003-0.1 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2510,及37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、在60 ℃下以300 RPM搖動歷時4小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋15x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。於冷凍乾燥之前,以澄清的搖動燒瓶溶解產物進行進一步熱穩定性特徵化如下:溶解產物稀釋400x於50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,且於60-75℃梯度下於熱循環儀內培育歷時16 h。為了判定剩餘的活性百分比,預培育的溶解產物係如上所述以甜菊苷或甜菊糖苷D且於60℃下培育4 h予以檢定。剩餘的活性百分比表達為高溫下的生產除以最低的預培育溫度下的生產。
表73.2 β1,3GT第21輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA、RebM及熱穩定性位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:6864) | 增加的RebM,60℃ a | 增加的RebA,60℃ a | 剩餘的活性% b |
7369/7370 | M87K/M144Q | + | ++ | + |
7375/7376 | R88T/M144Q/Q159K | + | ++ | - |
7387/7388 | T5S/E6P/I91Q/E288P/S317Y | ++ | + | + |
7405/7406 | L25Q/V263T/S317Y | + | - | ++ |
7423/7424 | T5S/E6P/L25I/S317Y | - | - | + |
7431/7432 | T5S/L25Q/I91Q/A212L/Q303V/S317Y | - | - | ++ |
a增加的生產位準係以0.0125 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:6864之參考多肽來判定且定義如下:相對於參考多肽,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.15倍;“++”=至少1.15倍增加的生產。 b各變異體剩餘的活性百分比係於73.5℃預培育24 h後,相對於各變異體於60℃預培育24 h後的生產予以判定,且定義如下:“-“= 小於60℃預培育16 h後剩餘活性的20%;“+”=剩餘活性的至少20%,但小於40%;以及“++”=剩餘活性的至少40%。 |
於此等實驗中,表73.2中的5種變異體比序列辨識編號:6864,於60℃下自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。序列辨識編號:7388被選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊苷及甜菊糖苷D以分別用於形成甜菊糖苷A及甜菊糖苷M。
實施例74
序列辨識編號:7388之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:7388之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:7387編碼之GT(即,序列辨識編號:7388)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第二十二輪(“第22輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的88種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊糖苷A 60之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:7387變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例60中所述,然後稀釋20x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。為了熱挑戰溶解產物,使其等於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM在75℃下搖動歷時1 h。以10 μL預培育的溶解產物配於100 μL反應並加上20 g/L甜菊糖苷A 60%受質、0.05 g/L ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2510、0.08 g/L β-1,2-醣基轉移酶(β12GT)序列辨識編號:7324,及40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16 h。藉由以水稀釋20x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以及以水稀釋20x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊糖苷A 60加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:7388更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表74.1及表74.2中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例31中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表74.3中所示相對於序列辨識編號:7388的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表74.1 β1,3GT第22輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7388) | 增加的RebM a |
7945/7946 | M87K/M144Q | + |
7947/7948 | K53E/W233Q/Q269R/V390I/V395I/Y396T | ++ |
7949/7950 | V9G/M144Q/K331R | + |
7951/7952 | M87K/M144Q/Y396T | ++ |
7953/7954 | K53E/M144Q/W233Q/Q269R/K331R/K428I | ++ |
7955/7956 | Q269R | ++ |
7957/7958 | R37S/W233S | + |
7959/7960 | M183L/W233Q/R234N/K331R/K428I | + |
7961/7962 | V9G/R37S/S113D/Y396T | ++ |
7963/7964 | V9G/M87K | + |
7965/7966 | R37S/S113D/M144Q/Y396T | + |
7967/7968 | Q269R/K428I/I437L | ++ |
7969/7970 | S113D/W233Q/R234N | + |
7971/7972 | W233Q/Y396T/N399Q | + |
7973/7974 | K53E/R234N | ++ |
7975/7976 | M144Q/R234N/Q269R | + |
7977/7978 | D134E/K222A/V263T | ++ |
7979/7980 | V263T | ++ |
7981/7982 | D69A/D134E | ++ |
7983/7984 | D69A/V263T/D434E/A438S/P439H | + |
7985/7986 | K171P/V263T | ++ |
7987/7988 | L322S | + |
7989/7990 | D69A/V263T | ++ |
7991/7992 | H81T | +++ |
7993/7994 | K222A/V263T/R435I/S442F | + |
7995/7996 | H81T/K222A/V263T/L322S/R435E/S442F | ++ |
7997/7998 | H81T/D134E | +++ |
7999/8000 | H81T/L433A/R435I/A438R/S442F | ++ |
8001/8002 | D69A | +++ |
8003/8004 | P2K/N3M/L433A/R435E/S442F | + |
8005/8006 | D69A/H81T | + |
8007/8008 | H81T/K222A | +++ |
8009/8010 | K222A | +++ |
8011/8012 | P2K/H81T | + |
8013/8014 | D69A/P439H | +++ |
8015/8016 | S61Q/L243I/D300A/R308L/V407I/R411T | + |
8017/8018 | C156S/Y165L/H248W/D300A/Q303V/R308L | ++ |
8019/8020 | L120V/C156S/Q159K/H248W/D300A/R308L | +++ |
8021/8022 | L120V/Q159K/Q197K/V365I/R411T | + |
8023/8024 | L120V/S253T/D300A/Q303V/R308L/V407I | + |
8025/8026 | S61Q/C156S/Q159K/L163A/Y165L/L243I/H248W/S253T/D300A/Q303V/R308L | ++ |
8027/8028 | R308L | + |
8029/8030 | A85V/C156S/Q159K/L243I/H248W/S253T/R308L/E405P/V407I/R411T | +++ |
8031/8032 | S61Q/L120V/C156S/L163A/Y165L/Q197K/Q303V/R308L | + |
8033/8034 | S61Q/C156S/Q197K/S253E | +++ |
8035/8036 | Q197K/D300A/R308L/R411T | ++ |
8037/8038 | Q159K/L163A/Y165L/Q197K/S214R/L243I/D300A/Q303V/R308L/V407I | + |
8039/8040 | C156S/S214R/R308L/R411T | +++ |
8041/8042 | S61Q/S214R | + |
8043/8044 | L120V/Q159K/Q197K/R308L/V407I/R411T | ++ |
8045/8046 | S61Q/C156S/L163A/L243I/H248W/D300A/Q303V/R308L/V407I | +++ |
8047/8048 | S61Q/C156S/L163A/D300A/V365I/R411T | + |
8049/8050 | L120V/C156S/Q159K/E169D/Q197K/S214R/Q303V/R308L/V365I/E405P/V407I | ++ |
8051/8052 | L120V/R308L/V407I/R411T | + |
8053/8054 | C156S/H248W/S253T/R308L | +++ |
8055/8056 | L120V/C156S/H248W/Q303V/R308L/R411T | ++ |
8057/8058 | Q197K/S253T/R308L/V407I | + |
8059/8060 | S61Q/L120V/D300A/Q303V/V407I | +++ |
8061/8062 | L120V/Q159K/Y165L/Q197K | ++ |
8063/8064 | S61Q/V365I/E405P | + |
8065/8066 | L120V/Q197K/S253T/D300A/R308L | + |
8067/8068 | S61Q/S214R/D300A/R308L | + |
8069/8070 | L163A/Q197K/S253E/D300A/Q303V/R308L/V365I | + |
8071/8072 | L120V/Q159K | + |
8073/8074 | S61Q/L163A/D300A/Q303V/R308L/E405P/V407I/R411T | +++ |
8075/8076 | S61Q/Y165L/H248W/S253T/V407I/R411T | + |
8077/8078 | S61Q/D300A/Q303V/R308L | +++ |
8079/8080 | C156S/Q197K/H248W/D300A/R411T | ++ |
8081/8082 | D300A/Q303V/R308L | + |
8083/8084 | D300A/R308L/E405P/R411T | + |
8085/8086 | Q197K/D300A/Q303V/R308L/V365I | + |
8087/8088 | S61Q/L120V/Q159K/D300A/R308L/V407I | +++ |
8089/8090 | S61Q/D300A/Q303V/E405P | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7388之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少1.19倍,但小於1.26倍;“++”=至少1.26倍,但小於1.37倍;以及“+++”=至少1.37倍增加的生產。 |
表74.2 β1,3GT第22輪飽和致突變變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7388) | 增加的RebM a |
8339/8340 | R76S | + |
8341/8342 | A107L | ++ |
8343/8344 | C338V | ++ |
8345/8346 | T72P | +++ |
8347/8348 | S61D | +++ |
8349/8350 | L56D | + |
8351/8352 | A107V | ++ |
8353/8354 | S61E | ++ |
8355/8356 | R88M | + |
8357/8358 | R88L | ++ |
8359/8360 | C156S | + |
8361/8362 | A41E | + |
8363/8364 | K139N | + |
8365/8366 | V407T | + |
8367/8368 | M87E | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:7388之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少1.04倍,但小於1.14倍;“++”=至少1.14倍,但小於1.18倍;以及“+++”=至少1.18倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.005-0.15 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2510,及37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、在60 ℃下以300 RPM搖動歷時4小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋15x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。於冷凍乾燥之前,以澄清的搖動燒瓶溶解產物進行進一步熱穩定性特徵化如下:溶解產物稀釋20x於磷酸鉀緩衝劑內且於60-75℃梯度下於熱循環儀內培育歷時24 h。為了判定剩餘的活性百分比,預培育的溶解產物係予以檢定,其係用20 g/L甜菊糖苷A 60、0.05 g/L ADP、40 g/L蔗糖、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2510,及0.08 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:7324,配於pH 6之50 mM磷酸鉀緩衝劑,加上於60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動培育歷時16 h。使反應溶解、驟冷及稀釋如所述用於高通量檢定。剩餘的活性百分比表達為高溫下的生產除以最低的預培育溫度下的生產。
表74.3 β1,3GT第22輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA、來自RebD的RebM與來自RebA60的RebM及熱穩定性位準 | |||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:7388) | 增加的RebM,60 ℃ a | 增加的RebA,60 ℃ a | 增加的RebM (來自A60),60 ℃ a | 剩餘的活性% b |
7947/7948 | K53E/W233Q/Q269R/V390I/V395I/Y396T | + | + | ++ | - |
7949/7950 | V9G/M144Q/K331R | - | ++ | + | - |
7951/7952 | M87K/M144Q/Y396T | + | +++ | ++ | - |
7967/7968 | Q269R/K428I/I437L | + | - | + | - |
7977/7978 | D134E/K222A/V263T | + | + | ++ | + |
8007/8008 | H81T/K222A | ++ | ++ | ++ | + |
8029/8030 | A85V/C156S/Q159K/L243I/H248W/S253T/R308L/E405P/V407I/R411T | +++ | - | +++ | + |
8033/8034 | S61Q/C156S/Q197K/S253E | +++ | ++ | ++ | ++ |
8039/8040 | C156S/S214R/R308L/R411T | +++ | ++ | ++ | - |
8059/8060 | S61Q/L120V/D300A/Q303V/V407I | + | + | + | + |
8087/8088 | S61Q/L120V/Q159K/D300A/R308L/V407I | ++ | +++ | +++ | + |
a增加的生產位準係以0.019 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:7388之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.21倍;“++”=至少1.21倍,但小於1.45倍;以及“+++”=至少1.45倍增加的生產。 b各變異體剩餘的活性百分比係於73.5℃預培育24 h後,相對於各變異體於60℃預培育24 h後的生產予以判定且定義如下:“-“= 小於60℃預培育24 h後剩餘活性的33%;“+”=剩餘活性的至少33%,但小於50%;以及“++”=剩餘活性的至少50%。 |
於此等實驗中,表74.3中全部11種變異體比序列辨識編號:7388,自甜菊糖苷A 60生產較多的甜菊糖苷M,以及8種變異體亦自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。總的來說序列辨識編號:8034及8088表現最好。序列辨識編號:8088被選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊苷及甜菊糖苷D以分別用於形成甜菊糖苷A及甜菊糖苷M,因為其於一鍋檢定中優越的性能。
實施例75
序列辨識編號:8088之β-1,3-ADP-醣基轉移酶變異體
此實施例說明用於改良甜菊糖利用原位合成的ADP-葡萄糖之葡萄糖苷化作用、衍生自序列辨識編號:8088之β1,3-醣基轉移酶(β1,3GT)多肽演化及篩選的實驗。序列辨識編號:8087編碼之GT(即,序列辨識編號:8088)定向演化係藉由建構變異體基因庫來進行,其中與本發明發展期間辨識出與改良生產有關的突變予以重組以及其中某些結構特徵接受飽和致突變作用。此等庫繼而予以平盤培養、生長及利用以下描述的高通量(HTP)檢定來篩選以提供第二十三輪(“第23輪”)具有對於ADP-葡萄糖及甜菊糖之葡萄糖基轉移酶活性的80種經工程處理之GT變異體多肽。
由蔗糖進行葡萄糖轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊糖苷A 60之HTP檢定
於96孔平盤上執行表現序列辨識編號:8087變異體之澄清的大腸桿菌培養物溶解產物之檢定。溶解小丸,且使溶解產物澄清如同實施例34中所述者,然後稀釋10x至50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6。為了熱挑戰溶解產物,使其等於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、以300 RPM在75℃下搖動歷時1 h予以預培育。以10 μL預培育的溶解產物配於100 μL反應並加上20 g/L甜菊糖苷A 60%受質、0.025 g/L ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:8420、0.08 g/L β-1,2-醣基轉移酶(β12GT)序列辨識編號:7784,及40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行檢定。使用下列反應條件:50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6,60℃於一種Thermotron
®滴定板搖動器內以300 RPM搖動歷時16 h。藉由以水稀釋20x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,以及以水稀釋20x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的RapidFire-MS/MS來分析樣本。辨識出自甜菊糖苷A 60加上原位合成的ADP-葡萄糖生產甜菊糖苷M的量比序列辨識編號:8088更多之醣基轉移酶變異體多肽。經工程處理之多肽列於表75.1及表75.2中。搖動燒瓶規模培養物係如實施例1中所述予以生長、溶解、澄清及冷凍乾燥成粉末供用於表75.3中所示相對於序列辨識編號:8088的變異體之分析。
SFP的特徵化檢定及由蔗糖進行葡萄糖基轉移至ADP且繼而由ADP-葡萄糖至甜菊苷及甜菊糖苷D之分析
表75.1 β1,3GT第23輪組合變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:8088) | 增加的RebM a |
8481/8482 | M87K/Q91L/V120L/W233Q | + |
8483/8484 | M87K/Q91L/K94C/V263T/E389L | + |
8485/8486 | M87A/Q91L/K94C/W233Q/E259T | + |
8487/8488 | M87K/Q91L/K94C | + |
8489/8490 | Q91L/K94C/W233Q/E259T | + |
8491/8492 | M87A/Q91L/V120L/W233Q | + |
8493/8494 | M87K/Q91L/W233Q | + |
8495/8496 | Q91L/V120L | ++ |
8497/8498 | W233Q/E259T/E389L | +++ |
8499/8500 | Q91L/W233Q | ++ |
8501/8502 | V263T/E389L | + |
8503/8504 | Q91L/W233Q/E389L | +++ |
8505/8506 | K94C/W233Q/R411T | +++ |
8507/8508 | M87A/R435E | ++ |
8509/8510 | Q91L/W233Q/E259T/E389L | ++ |
8511/8512 | L163A/W233Q | + |
8513/8514 | M87K/Q91L/K94C/V120L | + |
8515/8516 | M87A/K94C | ++ |
8517/8518 | M87A | +++ |
8519/8520 | M87A/Q91L/L163A | ++ |
8521/8522 | W233Q/A438S | + |
8523/8524 | E259T | + |
8525/8526 | M87A/Q91L/K94C/W233Q | ++ |
8527/8528 | W233Q/E259T/V263T | ++ |
8529/8530 | Q91L/V120L/W233Q | + |
8531/8532 | M87A/K428I/D431M/R435E | ++ |
8533/8534 | V263T | +++ |
8535/8536 | L322S | + |
8537/8538 | M87A/Q91L/V120L/W233Q/R411T/D431M/R435E/I437L | ++ |
8539/8540 | M87K/Q91L/L163A/W233Q/V263T | +++ |
8541/8542 | Q91L/K94C/V120L/W233Q/E389L/D431M/A438S | + |
8543/8544 | M87A/Q91L/E259T/V263T/E389L/K428I/D431M/R435I/I437L | +++ |
8545/8546 | M144Q/E389L | + |
8547/8548 | M87A/W233Q/L322S/E389L/R411T | + |
8549/8550 | M87K/K94C/M144Q/V263T/K428I/R435E | +++ |
8551/8552 | Q91L/K94C | ++ |
8553/8554 | M87K/Q91L | + |
8555/8556 | E389L | ++ |
8557/8558 | M87K | +++ |
8559/8560 | Q91L/K94C/V120L/W233Q | ++ |
8561/8562 | W233Q | +++ |
8563/8564 | K428I/D431M/R435E | ++ |
8565/8566 | M87A/Q91L/L322S | + |
8567/8568 | M87K/Q91L/V263T/E389L | ++ |
8569/8570 | Q91L | ++ |
8571/8572 | M87A/W233Q/E389L | +++ |
8573/8574 | M87K/L163A/W233Q | ++ |
8575/8576 | M87K/Q91L/L163A/E389L | ++ |
8577/8578 | M87A/W233Q | +++ |
8579/8580 | M87K/Q91L/K94C/W233Q | + |
8581/8582 | M87K/Q91L/E389L | +++ |
8583/8584 | M87A/Q91L | ++ |
8585/8586 | M87A/Q91L/W233Q | +++ |
8587/8588 | M87K/Q91L/L163A/W233Q | ++ |
8589/8590 | M87A/E259T | + |
8591/8592 | M87A/K94C/V263T | + |
8593/8594 | M87K/Q91L/M144Q/E259T | + |
8595/8596 | M87A/Q91L/W233Q/E389L | + |
8597/8598 | M87A/V263T | + |
8599/8600 | M87A/W233Q/E259T | + |
8601/8602 | T72P/R76S/A107L/C156S | + |
8603/8604 | K53E/H81T/H195Q/Q197K | + |
8605/8606 | D69A/T72P/R76S/A107L | + |
8607/8608 | R37S/T72P/H195Q/K331R | + |
8609/8610 | H195Q/Q197K | + |
8611/8612 | T72P/R76S/A107L/H195Q/Q197K | + |
8613/8614 | R37S/T72P/R76S/H81T | + |
8615/8616 | T72P/Q269R | + |
8617/8618 | Q197K | + |
8619/8620 | R37S/T72P/R76S/A107L/C156S/K331R | + |
8621/8622 | H81T/A107L/H195Q | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:8088之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少1.3倍,但小於1.55倍;“++”=至少1.55倍,但小於1.8倍;以及“+++”=至少1.8倍增加的生產。 |
表75.2 β1,3GT第23輪飽和致突變變異體及RebM位準 | ||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:8088) | 增加的RebM a |
9223/9224 | P324D | + |
9225/9226 | V413L | + |
9227/9228 | V451Q | ++ |
9229/9230 | P324G | + |
9231/9232 | S252P | + |
9233/9234 | S111T | + |
9235/9236 | S255T | + |
9237/9238 | L328T | + |
9239/9240 | S55G | + |
a增加的生產位準係相對於序列辨識編號:8088之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“+”=至少1.05倍,但小於1.2倍;以及“++”=至少1.2倍增加的生產。 |
搖動燒瓶粉末(SFP)復原成20 g/L的濃度且稀釋成0.005-0.15 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.1 g/L ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:8420,及37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、在60 ℃下以300 RPM搖動歷時4小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋15x用於分析。藉由如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來偵測醣基化產物。以0.01-0.3 g/L SFP配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、20 g/L RebA60、0.025 g/L ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:8420、0.12 g/L β1,2GT SFP序列辨識編號:7784,及40 g/L蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))來進行一鍋反應。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、在60 ℃下以300 RPM搖動歷時16小時予以培育。藉由以水稀釋20x來溶解反應,以乙腈及0.2%甲酸稀釋5x來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋20x用於分析。
表75.3 β1,3GT第23輪搖動燒瓶粉末變異體及RebA、來自RebD的RebM與來自RebA60的RebM以及熱穩定性位準 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | 胺基酸差異(相對於序列辨識編號:8088) | 增加的RebM,60 ℃ a | 增加的RebA,60 ℃ a | 增加的RebM (來自A60),60 ℃ a |
8491/8492 | M87A/Q91L/V120L/W233Q | ++ | + | ++ |
8503/8504 | Q91L/W233Q/E389L | + | + | ++ |
8571/8572 | M87A/W233Q/E389L | + | ++ | + |
8597/8598 | M87A/V263T | ++ | + | ++ |
8611/8612 | T72P/R76S/A107L/H195Q/Q197K | ++ | - | +++ |
8621/8622 | H81T/A107L/H195Q | + | - | ++ |
a增加的生產位準係以0.019 g/L搖動燒瓶粉末,相對於序列辨識編號:8088之參考多肽來判定且定義如下:與參考多肽相比,“-“=生產小於參考多肽的位準;“+”=生產至少參考多肽的位準,但小於1.1倍;“++”=至少1.1倍,但小於1.25倍;以及“+++”=至少1.25倍增加的生產。 |
於此等實驗中,表75.3中全部11種變異體比序列辨識編號:8088,自甜菊糖苷A 60生產更多的甜菊糖苷M,以及8種變異體亦自甜菊苷生產較多的甜菊糖苷A及自甜菊糖苷D生產較多的甜菊糖苷M。序列辨識編號:8598因為其於一鍋檢定中優越的性能,所以選擇為最佳的酵素供用於自ADP-葡萄糖進行醣基轉移催化至甜菊苷及甜菊糖苷D分別用於形成甜菊糖苷A及甜菊糖苷M。
實施例76
經工程處理之醣基轉移酶及回收酵素之耐熱性
此等檢定係使用搖動燒瓶粉末來執行以決定一種經工程處理之β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT,序列辨識編號:6864)、β-1,2-醣基轉移酶(β1,2GT,序列辨識編號:4550)及蔗糖合成酶回收酵素(SUS,序列辨識編號:2510)之耐熱性。
首先,於60℃下執行一種多天穩定性檢定其係透過稀釋各酵素SFP於50 mM磷酸鉀pH 6(β1,3GT,0.5 g/L;β1,2GT,0.25 g/L;SUS,0.1 g/L)內且於檢定前培育自0至48 h可變的時間。剩餘的活性量係於此實施例所述的條件下進行檢定來決定。於β1,3GT方面,使用10 μL的0-48 h預培育的搖動燒瓶粉末配於100μL總反應體積內其具有50 mM磷酸鉀緩衝劑、pH 6、15 mM甜菊苷(>95%純度)或甜菊糖苷D、0.2 mM ADP(Amresco,超純級)輔受質、0.05 g/L SUS SFP序列辨識編號:2432,及37.5 mM蔗糖(sucrose)(蔗糖(cane sugar))。反應係於一種Thermotron
®滴定板搖動器內、在60 ℃下以300 RPM搖動歷時4小時予以培育,繼而以水稀釋20x來溶解,藉由稀釋5x至乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,藉由離心使澄清,以及以水稀釋15x用於如實施例31,表31.1中所述的SPE-QQQ來分析。於28 h,甜菊糖苷D至甜菊糖苷M之未預培育的活性剩餘60%,以及於48 h,剩餘39%的活性;於甜菊苷至甜菊糖苷A方面,28 h後剩餘34%以及48 h後剩餘19%。因而,β1,3GT序列辨識編號:6864於60 ℃之半衰期為20-40 h。於β1,2GT方面,以20 mM甜菊糖苷A(>97%純度)及50 mM蔗糖相似地執行檢定。於24 h,未預培育的活性剩餘50-74%,以及於46 h,剩餘33%的活性。因而,β1,2GT序列辨識編號:4550於60 ℃之半衰期為29-58 h。於SUS方面,以15 mM甜菊糖苷A(>97%純度)、37.5 mM蔗糖、9 mM果糖,及0.5 g/L β1,2GT序列辨識編號:4550作為偶聯酵素來相似地執行檢定。於24 h,未預培育的活性剩餘89%,以及於48 h,剩餘86%的活性。因而,SUS序列辨識編號:2510於60 ℃之半衰期>100 h。此等於60 ℃全部三者之半衰期表示與野生型酵素很大的差異,其於周圍溫度以上沒有顯著的穩定性。
其次,三種酵素各者同一性的儲備物於橫跨60-69.1℃(SUS)、59.9-79.9℃(β1,2GT)或59.7-75.1℃溫度梯度下、於熱循環儀內予以預培育24 h,以及如以上所述予以檢定以判定相對於最低的預培育溫度(全部三者均為~60°C)剩餘的活性。於β1,3GT方面,於73.5℃預培育後相對於59.7℃預培育後保留20%的活性。於β1,2GT方面,於73.6℃預培育後保留17%的活性。於SUS方面,於69.1℃預培育後保留85%的活性。達到溫度>70℃24 h的穩定性允許範圍廣泛的發酵下游加工溫度以及範圍廣泛的甜菊糖轉化溫度。透過加熱甜菊糖轉化反應,可降低微生物污染的風險以及提升甜菊糖受質及產物溶解度,增加轉化率。此外,內在反應速率可透過增高溫度而稍微增加。
第三,β1,3GT,0.1 g/L;β1,2GT,0.025 g/L;及SUS,0.01 g/L係於無預培育的情況下、在55-65℃下培育、以如上所述單一受質轉化檢定予以檢定,以決定該酵素於此溫度範圍內是否強健。對於全部三者酵素,相對於55℃,在65℃下4 h之後測量於轉化有<36%的增加或減少。
實施例77
經工程處理之醣基轉移酶及回收酵素連同額外的NDPs及NDP-葡萄糖之檢定
多種核苷二磷酸(NDPs)及核苷二磷酸-葡萄糖(NDP-葡萄糖)可與經工程處理之醣基轉移酶及回收系統一起使用。
為了確定經工程處理之β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT,序列辨識編號:6864)及β-1,2-醣基轉移酶(β1,2GT,序列辨識編號:4550)對於替代的NDP-葡萄糖予體之混雜性(promiscuity),測試3種市售的NDP-葡萄糖:ADP-葡萄糖(Amresco,超高等級)、GDP-葡萄糖(Sigma,>97%純度),及TDP-葡萄糖(Carbosynth,>95%純度)加上搖動燒瓶粉末(SFP)。於β1,3GT方面,反應係以0.025 g/L SFP配於1 mM甜菊苷(>95%純度)、1 mM NDP-葡萄糖、50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6來進行。於1、2及3 h時,藉由以水稀釋4x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且以水稀釋5x用於分析。於β1,2GT方面,反應係以0.0025 g/L SFP配於1 mM甜菊糖苷A (>97%純度)來進行,但在其他方面與上述的方法相同。表77.1中概述結果為甜菊糖受質在第一個小時之轉化百分比(%)。
表77.1 經工程處理之醣基轉移酶之NDP-葡萄糖利用 | |||
序列辨識編號:(nt/aa) | ADP-葡萄糖 a | GDP-葡萄糖 a | TDP-葡萄糖 a |
4550 | ++++ | +++ | ++ |
6864 | + | + | - |
aNDP-葡萄糖利用位準係判定為每公克搖動燒瓶粉末轉化的甜菊糖mmol且定義如下:“-“=活性小於10 mmol/g;“+”=活性介於10和30 mmol/g之間;“++”=活性介於30和50 mmol/g之間;“+++”=活性介於50和70 mmol/g之間;及“++++”=至少70 mmol/g活性。 |
為了確定經工程處理之β-1,2-醣基轉移酶(β1,2GT,序列辨識編號:4550)及蔗糖合成酶回收酵素(SUS,序列辨識編號:2510)對於替代的NDP輔助因子之混雜性,測試4種市售的NDPs:ADP(Sigma,>95%)、CDP(Sigma,>95%)、GDP(Sigma,>96%)、IDP(Sigma,>96%)。反應係以0.001 g/L SUS SFP及0.1 g/L β1,2GT SFP配於10 mM甜菊糖苷A(>97%純度)、0.2 mM NDP、50 mM磷酸鉀緩衝劑,pH 6來進行。於1、2及3 h時,藉由以水稀釋40x來溶解反應,稀釋5x於乙腈加上0.2%甲酸來驟冷,且以水稀釋5x用於分析。亦測試第2種蔗糖合成酶(序列辨識編號:72),使用10 µL純化的蛋白質甘油儲備物配於100 µL反應。表77.2中概述結果為第一個小時之NDP轉換(mmol甜菊糖苷D/mmol輔助因子)。因此等數據表明ADP/ADP-葡萄糖之使用提供有用的反應條件。此外,與其他選項(諸如,UDP/UDP-葡萄糖)相比,此等化合物從經濟角度來看是有益的。
實施例78
轉化甜菊糖苷A 60%成甜菊糖苷M的方法
表77.2 經工程處理之醣基轉移酶及回收酵素之NDP使用 | ||||
序列辨識編號:(nt/aa) | ADP a | CDP a | GDP a | IDP a |
2510 | +++ | - | - | - |
72 | ++ | - | + | + |
aNDP利用位準係判定為於1 h內每mmol輔助因子轉化的甜菊糖mmol且定義如下:“-“=活性小於1;“+”=介於1和2之間;“++”=介於2和3之間;及“+++”=大於3的輔助因子轉換。 |
Reb A 60(甜菊苷及甜菊糖苷A[reb A]以質量計~1:2之混合物)於水及蔗糖溶液中有出乎意外高的溶解度。甜菊苷及Reb A個別的水溶解度據報導是在3-5 g/L的範圍內。出乎意外地,以水或200 g/L蔗糖製備100-200 g/L的Reb A 60溶液以及在室溫下靜置一星期於該溶液中沒有沉澱產生。明顯地,於反應的過程期間,Reb D中間物及Reb M產物二者在遠遠超過其等報導的溶解度限制(分別為~0.3-0.5及3-5 g/L)的位準(約30-50 g/L)保持為可溶的(由均質反應混合物來看是很明顯的)。Reb A 60起始材料及Reb D中間物難以預料的高溶解度大幅地提升了方法的效率。
以經工程處理之β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT,序列辨識編號:6138)、β-1,2-醣基轉移酶(β1,2GT,序列辨識編號:3696)及蔗糖合成酶(SUS,序列辨識編號:1846)發展一種轉化Reb A 60成甜菊糖苷M的方法。製備一種回收儲備物溶液,其係由0.2 g/L SUS、0.1 g/L ADP,及200 g/L蔗糖配於50 mM pH 6、磷酸鉀緩衝劑組成。β1,2GT溶解於此溶液達1.6 g/L,以及獨立的β1,3GT儲備物溶解於回收儲備物溶液達2.0 g/L。繼而,放置100 mg的Reb A 60於打蘭小瓶(dram vial)內且1.6 g/L β1,2GT儲備物及2.0 g/L β1,3GT儲備物各者添加0.5 mL。所生成的均質溶液於55℃下攪拌。逐漸形成沈澱物且於24 h時反應混合物為一種白色濃漿料。HPLC分析顯示存在90-94% Reb M (~120-130 g/L Reb M)。
於另一實驗中,以上反應係於0.5 g/L的AD及10 mM的EDTA存在下進行。於此等條件下,β1,2GT及β1,3GT二者之裝載量均減少到0.4 g/L,然而仍達到>90%轉化成Reb M。當冷凍乾燥酵素粉末係以10-15 L的規模發酵生產且以60℃熱處理予以下游加工及超過濾時,在β1,2GT儲備物對β1,3GT儲備物一定的比例下,Reb A 60內95%的甜菊苷及甜菊糖苷A轉化成甜菊糖苷M。
以另一組經工程處理之β-1,3-醣基轉移酶(β1,3GT,序列辨識編號:6864)、β-1,2-醣基轉移酶(β1,2GT,序列辨識編號:4550)及蔗糖合成酶(SUS,序列辨識編號:2510)酵素發展一種轉化Reb A 60成甜菊糖苷M的方法。製備一種回收儲備物溶液,其係由0.2 g/L SUS、0.5 g/L ADP及200 g/L蔗糖配於50 mM pH 6、磷酸鉀緩衝劑加上10 mM的EDTA所組成。β1,2GT溶解於此溶液達0.6 g/L,以及獨立的β1,3GT儲備物溶解於回收儲備物溶液達1.2 g/L。繼而,放置100 mg的Reb A 60於打蘭小瓶內且0.6 g/L β1,2GT儲備物及1.2 g/L β1,3GT儲備物各者添加0.5 mL。所生成的均質溶液於60℃下攪拌。逐漸形成沈澱物且於24 h時反應混合物為一種白色濃漿料。HPLC分析顯示存在90-92% Reb M(~120-130 g/L Reb M)。使此反應縮放成2公克Reb A 60配於20 mL加上0.6 g/L β1,2GT,0.2 g/L SUS,及1.2 g/L β1,3GT加上0.5 g/L ADP及10 mM EDTA於60℃下,以及由使用JECFA法之曲線下的面積確定得到87.1% RebM。為了純化,反應混合物係於40℃下離心,輕輕倒出上清液,且以1體積的去離子水使小丸再懸浮,於20℃下離心,以及輕輕倒出上清液。重複此清洗總共4次且冷凍乾燥小丸,由使用JECFA法之曲線下的面積確定產出94.3% RebM。
本申請案所引用的所有刊物、專利、專利申請案及其他文件皆為所有目的係以其等之整體在此併入以作為參考資料,如同每一個個別刊物、專利、專利申請案或其他文件為所有目的單獨表明併入以作為參考資料。
雖然已經闡釋並說明各種特定的具體例,但是會瞭解可做出各種變化而不偏離本發明之精神及範疇。
圖1提供一種酵素反應流程圖,其中一種醣基轉移酶催化一葡萄糖苷基基團從核苷二磷酸葡萄糖(NDP-葡萄糖),舉例而言ADP-葡萄糖,轉移至受體,舉例而言R-OH,其中R為任何醣基、烷氧基、羧基、胺基羰基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、羧基烷基、胺基烷基、鹵烷基、烷基硫基烷基、雜環烷基、雜芳基或雜芳基烷基基團。於另外的具體例中,R-OH為甜菊苷或甜菊糖苷D,以及產物為甜菊糖苷A、甜菊糖苷I或甜菊糖苷M。一種核苷二磷酸依賴性合成酶催化一葡萄糖苷基基團從葡萄糖予體(諸如,蔗糖),轉移至核苷二磷酸,再生NDP-葡萄糖且釋放副產物(諸如,果糖)。
圖2提供碳有編號之甜菊糖苷M的結構。
圖3提供碳有編號之甜菊糖苷I的結構。
<110> 美商克迪科思股份有限公司(CODEXIS, INC.) <120> 經工程處理之醣基轉移酶及甜菊糖之葡萄糖苷化方法 <130> CX8-163WO3 <150> US 62/454,417 <151> 2017-02-03 <150> US 62/479,262 <151> 2017-03-30 <160> 9240 <210> 1 <211> 1326 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> UGT76G1野生型 <400> 1 atggaaaata aaacggagac caccgttcgc cggcgccgga gaataatatt attcccggta 60 ccatttcaag gccacattaa cccaattctt cagctagcca atgtgttgta ctctaaagga 120 ttcagtatca ccatctttca caccaacttc aacaaaccca aaacatctaa ttaccctcac 180 ttcactttca gattcatcct cgacaacgac ccacaagacg aacgcatttc caatctaccg 240 actcatggtc cgctcgctgg tatgcggatt ccgattatca acgaacacgg agctgacgaa 300 ttacgacgcg aactggaact gttgatgtta gcttctgaag aagatgaaga ggtatcgtgt 360 ttaatcacgg atgctctttg gtacttcgcg caatctgttg ctgacagtct taacctccga 420 cggcttgttt tgatgacaag cagcttgttt aattttcatg cacatgtttc acttcctcag 480 tttgatgagc ttggttacct cgatcctgat gacaaaaccc gtttggaaga acaagcgagt 540 gggtttccta tgctaaaagt gaaagacatc aagtctgcgt attcgaactg gcaaatactc 600 aaagagatat tagggaagat gataaaacaa acaagagcat cttcaggagt catctggaac 660 tcatttaagg aactcgaaga gtctgagctc gaaactgtta tccgtgagat cccggctcca 720 agtttcttga taccactccc caagcatttg acagcctctt ccagcagctt actagaccac 780 gatcgaaccg tttttcaatg gttagaccaa caaccgccaa gttcggtact gtatgttagt 840 tttggtagta ctagtgaagt ggatgagaaa gatttcttgg aaatagctcg tgggttggtt 900 gatagcaagc agtcgttttt atgggtggtt cgacctgggt ttgtcaaggg ttcgacgtgg 960 gtcgaaccgt tgccagatgg gttcttgggt gaaagaggac gtattgtgaa atgggttcca 1020 cagcaagaag tgctagctca tggagcaata ggcgcattct ggactcatag cggatggaac 1080 tctacgttgg aaagcgtttg tgaaggtgtt cctatgattt tctcggattt tgggctcgat 1140 caaccgttga atgctagata catgagtgat gttttgaagg taggggtgta tttggaaaat 1200 gggtgggaaa gaggagagat agcaaatgca ataagaagag ttatggtgga tgaagaagga 1260 gaatacatta gacagaatgc aagagttttg aaacaaaagg cagatgtttc tttgatgaag 1320 ggtggt 1326 <210> 2 <211> 442 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> UGT76G1野生型 <400> 2 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile 1 5 10 15 Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu 20 25 30 Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro 65 70 75 80 Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser 100 105 110 Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu 130 135 140 Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln 145 150 155 160 Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu 165 170 175 Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser 180 185 190 Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile 195 200 205 Lys Gln Thr Arg Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro 260 265 270 Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp 275 280 285 Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln 290 295 300 Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp 305 310 315 320 Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly 435 440 <210> 3 <211> 1374 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 密碼子最佳化UGT76G1 <400> 3 atggagaaca aaaccgaaac caccgtgcgt cgtcgtcgtc gtatcattct gtttccggtt 60 ccgttccagg gccacatcaa cccgattctg caactggcga acgtgctgta cagcaagggt 120 tttagcatca ccatttttca caccaacttc aacaagccga aaaccagcaa ctatccgcac 180 ttcacctttc gtttcatcct ggacaacgat ccgcaggacg agcgtattag caacctgccg 240 acccatggtc cgctggcggg tatgcgtatc ccgatcatta acgagcacgg cgcggatgaa 300 ctgcgtcgtg agctggaact gctgatgctg gcgagcgagg aagacgagga agttagctgc 360 ctgattaccg atgcgctgtg gtacttcgcg caaagcgtgg cggacagcct gaacctgcgt 420 cgtctggttc tgatgaccag cagcctgttt aacttccacg cgcacgtgag cctgccgcag 480 tttgacgagc tgggctacct ggatccggac gataaaaccc gtctggagga acaagcgagc 540 ggtttcccga tgctgaaggt taaagatatc aagagcgcgt atagcaactg gcagatcctg 600 aaagaaattc tgggcaagat gatcaagcag acccgtgcga gcagcggtgt gatttggaac 660 agctttaaag agctggagga aagcgagctg gaaaccgtta tccgtgaaat tccggcgccg 720 agcttcctga ttccgctgcc gaagcacctg accgcgagca gcagcagcct gctggaccac 780 gatcgtaccg tgttccagtg gctggaccag 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Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro 65 70 75 80 Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser 100 105 110 Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu 130 135 140 Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln 145 150 155 160 Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu 165 170 175 Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser 180 185 190 Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile 195 200 205 Lys Gln Thr Arg Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro 260 265 270 Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp 275 280 285 Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln 290 295 300 Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp 305 310 315 320 Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455 <210> 5 <211> 1374 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> UGT76G1變異體 <400> 5 atggagaaca aaaccgaaac caccgtgcgt cgtcgtcgtc gtatcattct gtttccggtt 60 ccgttccagg gccacatcaa cccgattctg caactggcga acgtgctgta cagcaagggt 120 tttagcatca ccatttttca caccaacttc aacaagccga aaaccagcaa ctatccgcac 180 ttcacctttc gtttcatcct ggacaacgat ccgcaggacg agcgtattag caacctgccg 240 acccatggtc cgctggcggg tatgcgtatc ccgatcatta acgagcacgg cgcggatgaa 300 ctgcgtcgtg agctggaact gctgatgctg gcgagcgagg aagacgagga agttagctgc 360 ctgattaccg atgcgctgtg gtacttcgcg caaagcgtgg cggacagcct gaacctgcgt 420 cgtctggttc tgatgaccag cagcctgttt aacttccacg cgcacgtgag cctgccgcag 480 tttgacgagc tgggctacct ggatccggac gataaaaccc gtctggagga acaagcgagc 540 ggtttcccga tgctgaaggt taaagatatc aagagcgcgt atagcaactg gcagatcctg 600 aaagaaattc tgggcaagat gatcaagcag acccgtgcga gcagcggtgt gatttggaac 660 agctttaaag agctggagga aagcgagctg gaaaccgtta tccgtgaaat tccggcgccg 720 agcttcctga ttccgctgcc gaagcacctg accgcgagca gcagcagcct gctggaccac 780 gatcgtaccg tgttccagtg gctggaccag caaccgccga gcagcgtgct gtacgttagc 840 tttggcagca ccagcgaggt ggacgaaaag gatttcctgg agattgcgcg tggtctggtt 900 gacagcaaac aaagctttct gtggagggtt cgtccgggct tcgtgaaggg tagcacctgg 960 gttgagccgc tgccggatgg ttttctgggc gaacgtggtc gtatcgtgaa gtgggttccg 1020 caacaagaag tgctggcgca cggcgcgatt ggtgcgttct ggacccacag cggttggaac 1080 agcaccctgg agagcgtgtg cgaaggcgtt ccgatgatct ttagcgactt cggtctggat 1140 cagccgctga acgcgcgtta catgagcgat gttctgaaag tgggcgttta tctggagaac 1200 ggctgggagc gtggtgaaat cgcgaacgcg attcgtcgtg tgatggttga cgaggaaggt 1260 gagtacatcc gtcagaacgc gcgtgttctg aagcaaaaag cggatgttag cctgatgaag 1320 ggtggcagca gctacgagag cctggaaagc ctggttagct atattagcag cctg 1374 <210> 6 <211> 458 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> UGT76G1變異體 <400> 6 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile 1 5 10 15 Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu 20 25 30 Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro 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Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp 275 280 285 Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln 290 295 300 Ser Phe Leu Trp Arg Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp 305 310 315 320 Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455 <210> 7 <211> 1371 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> UGT76G1變異體 <400> 7 atggagaaca aaaccgaaac caccgtgcgt cgtcgtcgta tcattctgtt tccggttccg 60 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aaagcgagct ggaaaccgtt 480 atccgtgaaa ttccggcgcc gagcttcctg attccgctgc cgaagcacct gaccgcgagc 540 agcagcagcc tgctggacca cgatcgtacc gtgttccagt ggctggacca gcaaccgccg 600 agcagcgtgc tgtacgttag ctttggcagc cagagcgagg tggacgaaaa ggatttcctg 660 gagattgcgc gtggtctggt tgacagcaaa caaagctttc tgtggcgcgt tcgtccgggc 720 ttcgtgaagg gtagcgagtg ggttgagccg ctgccggatg gttttctggg cgaacgtggt 780 cgtatcgtga agtctgttcc gcaacaagaa gtgctggcgc acggcgcgat tggtgcgttc 840 tggacccaca gcggttggaa cggcaccctg gagagcgtgt gcgaaggcgt tccgatgatc 900 tttagcgact tcggtctgga tcagccgctg aacgcgcgtt acatgagcga tgttctgaaa 960 gtgggcgttt atctggagaa cggctgggag cgtggtgaaa tcgcgaacgc gattcgtcgt 1020 gtgatggttg acgaggaagg tgagtacatc cgtcagaacg cgcgtgttct gaagcaaaaa 1080 gcggatgtta gcctgatgaa gggtggcagc agctacgaga gcctggaaag cctggttagc 1140 tatattagca gcctcgagca tcaccatcac catcacggtg gcagcggtat ggagaacaaa 1200 accgaaacca ccgtgcgtcg tcgtcgtatc attctgtttc cggttccgtt ccagggccac 1260 atcaacccga ttctgcaact ggcgaacgtg ctgtacagca agggttttag catcaccatt 1320 tttcacacca acttcaacaa gccgaaaacc agcaactatc cgcacttcac ctttcgtttc 1380 atcttggaca acgatccgca ggacgagtaa 1410 <210> 84 <211> 469 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 序列辨識編號:32的ADP-醣基轉移酶環狀排列變異體 <400> 84 Met Arg Ile Ser Asn Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg 1 5 10 15 Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu 20 25 30 Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu 35 40 45 Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His 65 70 75 80 Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro 85 90 95 Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu 100 105 110 Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys 115 120 125 Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys Gln Thr Arg Ala Ser Ser Gly Val 130 135 140 Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val 145 150 155 160 Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser Phe 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cgttagcttt 840 ggcagccaga gcgaggtgga cgaaaaggat ttcctggaga ttgcgcgtgg tctggttgac 900 agcaaacaaa gctttctgtg gcgcgttcgt ccgggcttcg tgaagggtag cgagtgggtt 960 gagccgctgc cggatggttt tctgggcgaa cgtggtcgta tcgtgaagtc tgttccgcaa 1020 caagaagtgc tggcgcacgg cgcgattggt gcgttctgga cccacggcgg ttggaacggc 1080 accctggaga gcgtgtgcga aggcgttccg atgatcttta gcgacttcgg tctggatcag 1140 ccgctgaacg cgcgttacat gagcgatgtt ctgaaagtgg gcgtttatct ggagaacggc 1200 tgggagcgtg gtgaaatcgc gaacgcgatt cgtcgtgtga tggttgacga ggaaggtgag 1260 tacatccgtc agaacgcgcg tgttctgaag caaaaagcgg atgttagcct gatgaagggt 1320 ggcagcagct acgagagcct ggaaagcctg gttagctata ttagcagcct g 1371 <210> 344 <211> 457 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 序列辨識編號:32的ADP-醣基轉移酶變異體 <400> 344 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu 1 5 10 15 Phe Pro Val Pro Phe Pro Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu Ala 20 25 30 Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn 35 40 45 Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr 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tccagtggct ggaccagcaa ccgccgagca gcgtgctgta cgttagcttt 840 ggcagccaga gcgaggtgga cgaatcagaa ttcctggaga ttgcgcgtgg tctggttgac 900 agcaaacaaa gctttctgtg gcgcgttcgt ccgggcttcg tgaagggtag cgagtgggtt 960 gagccgctgc cggatggttt tctgggcgaa cgtggtcgta tcgtgaagtc tgttccgcaa 1020 caagaagtgc tggcgcacga tgcgattggt gcgttctgga cccacggcgg ttggaacggc 1080 accctggaga gcgtgtgcga aggcgttccg atgatcttta gcgatttcgg tctggatcag 1140 ccgctgaacg cgcgttacat gagcgatgtt ctgaaagtgg gcgtttatct ggagaacggc 1200 tgggagcgtg gtgaaatcga aaacgcgatt cgtcgtctga tggttgaccg tgaaggtgag 1260 gtgatgcgtc aaaacgcggc ggttctgaag gataaagcgg atcagagcct ggctaagggt 1320 ggcagcagct acgagagcct ggaaagcctg gttagctata ttagcagcct g 1371 <210> 734 <211> 457 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 序列辨識編號:562的ADP-醣基轉移酶變異體 <400> 734 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Val Ile Leu 1 5 10 15 Phe Pro Val Pro Phe Pro Gly His Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala 20 25 30 Asn Val Leu Tyr Ser Arg Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn 35 40 45 Phe 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catccgtttt gtggagctgc atctgccaga attaccggaa 240 ctgccaccac attaccatac taccaacggt ttaccaccgc atctgaacca taccctgcac 300 aaggcactga agatgagcaa gccgaacttt agcaagatcc tgcaaaacct gaagccggac 360 ctggtcatct acgatattct gcaaccgtgg gcagaacatg tcgtaaacga acagaacatc 420 ccggctgtta agattctgac cagtggtgcg gcactgttta gctacttttt caacttcctg 480 aagaatccgg gtgtagaatt tccgtttccg gcgatctacc tgcctaaggt ggaacaggtg 540 aagatgcgcg agatgtttga aaaggagccg aacgaagaag atcgcttagc agaaggcaat 600 atgcagatca tgctgatgtg cacgagccgc accattgagg ctaagtacct ggactattgc 660 accgaactga gcaattggaa agttgttccg gttggtccgc catttcagga cccgattact 720 aatgatgttg acgacatgga actgattgat tggttaggca ccaaagacga gaacagtacg 780 gtctttgtgt gctttggcag cgagtacttc ctgagccgtg aagacatgga agaagtcgcg 840 ttcggcctgg agctgagcaa cgtgaacttt atctgggttg cacgctttcc gaaaggcgag 900 gaacagaatc tggaagacgt tctgccaaaa ggcttcctgg aacgcattgg tgaacgtggt 960 cgcgttctgg acaagtttgc accgcagcca cgtattctga accatccgag cacgggtggc 1020 ttcatctctc attgcggttg gaacagcgtc 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aagatttggc cgtggcttga acgctatgca 1140 caggatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt actccgatct gcattggcgg 1320 gatcatgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcttttat 1560 tttagctatg cacgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gagcgctgct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgcc acggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accatgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggct tgaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgcggaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1404 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1404 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Gly Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 caggatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt actccgatct gcattggccg 1320 gatcatgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcttttat 1560 tttagctatg cacgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gagcgctgct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accatgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggct tgaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgcggaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1540 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1540 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Tyr Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Gly Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 caggatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt actccgatct gcattggccg 1320 gatcatgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcttttat 1560 tttagctatg cacgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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gcgaaccagg tgcagataga cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtggtctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gagaactgct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accatgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggccc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1666 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1666 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu 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cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 caggatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc gcgaaccagg tgcagatagg cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtggtctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgctgct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accatgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1676 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1676 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttatgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 caggatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accatgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1686 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1686 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 50 55 60 Thr Gln Glu Ala Ile Phe Arg Asp Pro Trp Met Val Phe Ala Trp Arg 65 70 75 80 Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Val Arg Ile His Val Glu Gln Leu 85 90 95 Ala Val Glu Glu Leu Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Gln Ala Lys Glu Gly 100 105 110 Leu Val Gly Leu 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaaa 840 gttatgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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gcgaaccagg tccggatcaa cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtggtctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gtgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1802 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1802 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu 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tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accatgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1806 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1806 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ile His 50 55 60 Thr Gln Glu Ala Ile Phe Arg Asp Pro Trp Met Val Phe Ala Trp Arg 65 70 75 80 Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Val Arg Ile His Val Glu Gln Leu 85 90 95 Ala Val Glu Glu Leu Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Gln Ala Lys Glu Gly 100 105 110 Leu Val Gly Leu 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tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gtgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttctttatt 2100 gatcccaacg accatgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1812 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1812 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccacttat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc gcgaaccagg tccggatcaa cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtggtctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gtgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1938 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1938 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu 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tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gtgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagg gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 1948 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 1948 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatcc acgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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gcgaaccagg tccggatcaa cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtagcctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tgtcacgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2074 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2074 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu 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tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cagcgaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tgtcacgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2078 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2078 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Gly Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 50 55 60 Thr Gln Glu Ala Ile Phe Arg Asp Pro Trp Met Val Phe Ala Trp Arg 65 70 75 80 Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Val Arg Ile His Val Glu Gln Leu 85 90 95 Ala Val Glu Glu Leu Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Gln Ala Lys Glu Gly 100 105 110 Leu Val Gly Leu 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tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cagcgaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tgtcacgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2084 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2084 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Arg Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 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tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cagcgaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tgtcacgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2094 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2094 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 50 55 60 Thr Gln Glu Ala Ile Phe Arg Asp Pro Trp Met Val Phe Ala Trp Arg 65 70 75 80 Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Val Arg Ile His Val Glu Gln Leu 85 90 95 Ala Val Glu Glu Leu Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Gln Ala Lys Glu Gly 100 105 110 Leu Val Gly Leu 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gcgaaccagg tccggatcaa cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtggtctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2210 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2210 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu 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tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2220 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2220 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 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ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatgc gcgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc 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actctttacg tcaaaccgta 600 caatatctgg gcaccttacc acgtgaaact ccgtgggcag agtttcgtga agacatgcgt 660 cgtcgtggtt ttgaaccagg ttggggcaac accgcgggcc gtgttcgcga aaccatgcgt 720 ctgctgatgg atctgcttga ctctccgagc ccagctgccc tggagagctt cctggatcgc 780 atcccgatga ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcggatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga 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cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2240 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2240 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 50 55 60 Thr Gln Glu Ala Ile Phe Arg Asp Pro Trp Met Val Phe Ala Trp Arg 65 70 75 80 Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Val Arg Ile His Val Glu Gln Leu 85 90 95 Ala Val Glu Glu Leu Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Gln Ala Lys Glu Gly 100 105 110 Leu Val Gly Leu Gly Ala Glu Gly Glu Ala Val Leu Thr Val Asp Phe 115 120 125 Glu Asp Phe Arg Pro Val Ser Arg Arg Leu Arg Asp Glu Ser Thr Ile 130 135 140 Gly Asp Gly Leu Thr His Leu Asn Arg His Leu Ala Gly Arg Ile Trp 145 150 155 160 Thr Asp Leu Ala Ala Gly Arg Ser Gln Ile Leu Glu Phe Leu Ser Leu 165 170 175 His Arg Leu Asp Asn Gln Asn Leu Met Leu Ser Asn Gly Asn Thr Asp 180 185 190 Phe Asp Ser Leu Arg Gln Thr Val Gln Tyr Leu Gly Thr Leu Pro Arg 195 200 205 Glu Thr Pro Trp Ala Glu Phe Arg Glu Asp Met Arg Arg Arg Gly Phe 210 215 220 Glu Pro Gly Trp Gly Asn Thr Ala Gly Arg Val Arg Glu Thr Met Arg 225 230 235 240 Leu Leu Met Asp Leu Leu Asp Ser Pro Ser Pro Ala Ala Leu Glu Ser 245 250 255 Phe Leu Asp Arg Ile Pro Met Ile Ser Asn Val Leu Ile Val Ser Ile 260 265 270 His Gly Trp Phe Ala Gln Asp Lys Val Leu Gly Arg Pro Asp Thr Gly 275 280 285 Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Ala Arg Ala Leu Glu Arg Glu 290 295 300 Met Arg Asn Arg Leu Arg Gln Gln Gly Val Asp Val Glu Pro Arg Ile 305 310 315 320 Leu Ile Ala Thr Arg Leu Ile Pro Glu Ser Asp Gly Thr Thr Cys Asp 325 330 335 Gln Arg Leu Glu Pro Val His Gly Ala Glu Asn Val Arg Ile Leu Arg 340 345 350 Val Pro Phe Arg Tyr Glu Asp Gly Arg Ile His Pro His Trp Ile Ser 355 360 365 Arg Phe Lys Val Trp Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ala Ser Asp Leu Glu 370 375 380 Arg Glu Val Leu Ala Glu Leu Gly Ser Arg Pro Asp Leu Ile Ile Gly 385 390 395 400 Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Leu Ser Glu Lys Leu 405 410 415 Gly Val Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Ser Lys Tyr 420 425 430 Leu Tyr Ser Asp Leu His Trp Pro Asp His Glu Gln Asp His His Phe 435 440 445 Ala Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ala Ala Asp Ile 450 455 460 Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Asn Asp Arg Glu Ile 465 470 475 480 Gly Gln Tyr Glu Gly His Gln Asp Tyr Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg 485 490 495 Val Glu Asn Gly Ile Asp Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Ile Val Ser 500 505 510 Pro Gly Ala Asp Ala Arg Thr Tyr Phe Ser Tyr Ala Arg Thr Glu Glu 515 520 525 Arg Pro Ser Ser Leu Glu Pro Glu Ile Glu Ser Leu Leu Phe Gly Arg 530 535 540 Glu Pro Gly Pro Asp Gln Arg Gly Val Leu Glu Asp Arg Gln Lys Pro 545 550 555 560 Leu Leu Leu Ser Met Ala Arg Met Asp Arg Ile Lys Asn Leu Ser Gly 565 570 575 Leu Ala Glu Leu Tyr Gly Arg Ser Ser Arg Leu Arg Gly Leu Ala Asn 580 585 590 Leu Val Ile Ile Gly Gly His Val Asp Val Gly Asn Ser Arg Asp Ala 595 600 605 Glu Glu Arg Glu Glu Ile Arg Arg Met His Glu Ile Met Asp His Tyr 610 615 620 Gln Leu Asp Gly Gln Leu Arg Trp Val Gly Ser Gln Leu Asp Lys Thr 625 630 635 640 Val Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Val Val Ala Asp Gly Arg Gly Val Phe 645 650 655 Val Gln Pro Ala Leu Phe Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala 660 665 670 Met Ser Ser Gly Leu Pro Val Phe Ala Thr Arg Phe Gly Gly Pro Leu 675 680 685 Glu Ile Ile Glu Asp Gly Val Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Asn Asp 690 695 700 Pro Glu Ala Thr Ala Glu Arg Leu Ala Asp Phe Leu Glu Ala Ala Arg 705 710 715 720 Glu Arg Pro His Tyr Trp Glu Glu Ile Ser Asp Ala Ala Leu Ala Arg 725 730 735 Val Glu Glu Arg Tyr Thr Trp Glu Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Met Thr 740 745 750 Ile Ala Arg Val Phe Gly Phe Trp Arg Phe Val Leu Asp Arg Glu Ser 755 760 765 Gln Val Met Glu Arg Tyr Leu Gln Met Phe Arg His Leu Gln Trp Arg 770 775 780 Pro Leu Ala His Ala Val Pro Met Glu 785 790 <210> 2241 <211> 2379 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2241 atgattgaag aactgcgcca acagctgctg gatgatccgc gttcatggga tgcattcctg 60 cgtcatttag tcgcatctca gcgtgactca tggttacaga cggatttaca gcgcgcgtgc 120 gcggattttc gcgaacagct tccggaaggc tatgatgaag atattggtcc gctcgaagat 180 tttgtggcac atacccagga agcgatcttc cgtgatccgt ggatggtttt tgcgtggcgt 240 ccacgtccag gtgtttggga atatgtgcgc attcatgtag aacagctggc ggtggaggag 300 ctgagcactg atgaatatct gcaagccaaa gaaggacttg ttggcttagg tgcagaaggt 360 gaagctgttc tgacggtgga tttcgaagat tttcgtccgg ttagccgtcg tttacgcgac 420 gagagcacca ttggtgatgg tcttacccat ctgaatcgtc atttagcagg tcgcatctgg 480 actgatttag cagcaggtcg tagtcagatt ctggaatttc tgagcctgca tcgtctggat 540 aaccagaatc tgatgctgag caacggcaat accgattttg actctttacg tcaaaccgta 600 caatatctgg gcaccttacc acgtgaaact ccgtgggcag agtttcgtga agacatgcgt 660 cgtcgtggtt ttgaaccagg ttggggcaac accgcgggcc gtgttcgcga aaccatgcgt 720 ctgctgatgg atctgcttga ctctccgagc ccagctgccc tggagagctt cctggatcgc 780 atcccgatga ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagcct 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatgc gcgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgg agccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc gcgaaccagg tccggatcaa cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtggtctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2242 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2242 Met Ile Glu Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Asp Asp Pro Arg Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu 20 25 30 Gln Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp Phe Arg Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Glu Gly Tyr Asp Glu Asp Ile Gly Pro Leu Glu Asp Phe Val Ala His 50 55 60 Thr Gln Glu Ala Ile Phe Arg Asp Pro Trp Met Val Phe Ala Trp Arg 65 70 75 80 Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Val Arg Ile His Val Glu Gln Leu 85 90 95 Ala Val Glu Glu Leu Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Gln Ala Lys Glu Gly 100 105 110 Leu Val Gly Leu Gly Ala Glu Gly Glu Ala Val Leu Thr Val Asp Phe 115 120 125 Glu Asp Phe Arg Pro Val Ser Arg Arg Leu Arg Asp Glu Ser Thr Ile 130 135 140 Gly Asp Gly Leu Thr His Leu Asn Arg His Leu Ala Gly Arg Ile Trp 145 150 155 160 Thr Asp Leu Ala Ala Gly Arg Ser Gln Ile Leu Glu Phe Leu Ser Leu 165 170 175 His Arg Leu Asp Asn Gln Asn Leu Met Leu Ser Asn Gly Asn Thr Asp 180 185 190 Phe Asp Ser Leu Arg Gln Thr Val Gln Tyr Leu Gly Thr Leu Pro Arg 195 200 205 Glu Thr Pro Trp Ala Glu Phe Arg Glu Asp Met Arg Arg Arg Gly Phe 210 215 220 Glu Pro Gly Trp Gly Asn Thr Ala Gly Arg Val Arg Glu Thr Met Arg 225 230 235 240 Leu Leu Met Asp Leu Leu Asp Ser Pro Ser Pro Ala Ala Leu Glu Ser 245 250 255 Phe Leu Asp Arg Ile Pro Met Ile Ser Asn Val Leu Ile Val Ser Ile 260 265 270 His Gly Trp Phe Ala Gln Asp Lys Val Leu Gly Arg Pro Asp Thr Gly 275 280 285 Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Ala Arg Ala Leu Glu Arg Glu 290 295 300 Met Arg Asn Arg Leu Arg Gln Gln Gly Val Asp Val Glu Pro Arg Ile 305 310 315 320 Leu Ile Ala Thr Arg Leu Ile Pro Glu Ser Asp Gly Thr Thr Cys Asp 325 330 335 Gln Arg Leu Glu Pro Val His Gly Ala Glu Asn Val Gln Ile Leu Arg 340 345 350 Val Pro Phe Arg Tyr Glu Asp Gly Arg Ile His Pro His Trp Ile Ser 355 360 365 Arg Phe Lys Val Trp Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ala Ser Asp Leu Glu 370 375 380 Arg Glu Val Leu Ala Glu Leu Gly Ser Arg Pro Asp Leu Ile Ile Gly 385 390 395 400 Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Leu Ser Glu Lys Leu 405 410 415 Gly Val Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Ser Lys Tyr 420 425 430 Leu Tyr Ser Asp Leu His Trp Pro Asp His Glu Gln Asp His His Phe 435 440 445 Ala Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ala Ala Asp Ile 450 455 460 Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Asn Asp Arg Glu Pro 465 470 475 480 Gly Gln Tyr Glu Gly His Gln Asp Tyr Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg 485 490 495 Val Glu Asn Gly Ile Asp Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Ile Val Ser 500 505 510 Pro Gly Ala Asp Ala Arg Thr Tyr Phe Ser Tyr Ala Arg Thr Glu Glu 515 520 525 Arg Pro Ser Ser Leu Glu Pro Glu Ile Glu Ser Leu Leu Phe Gly Arg 530 535 540 Glu Pro Gly Pro Asp Gln Arg Gly Val Leu Glu Asp Arg Gln Lys Pro 545 550 555 560 Leu Leu Leu Ser Met Ala Arg Met Asp Arg Ile Lys Asn Leu Ser Gly 565 570 575 Leu Ala Glu Leu Tyr Gly Arg Ser Ser Arg Leu Arg Gly Leu Ala Asn 580 585 590 Leu Val Ile Ile Gly Gly His Val Asp Val Gly Asn Ser Arg Asp Ala 595 600 605 Glu Glu Arg Glu Glu Ile Arg Arg Met His Glu Ile Met Asp His Tyr 610 615 620 Gln Leu Asp Gly Gln Leu Arg Trp Val Gly Ser Gln Leu Asp Lys Thr 625 630 635 640 Val Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Val Val Ala Asp Gly Arg Gly Val Phe 645 650 655 Val Gln Pro Ala Leu Phe Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala 660 665 670 Met Ser Ser Gly Leu Pro Val Phe Ala Thr Arg Phe Gly Gly Pro Leu 675 680 685 Glu Ile Ile Glu Asp Gly Val Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Asn Asp 690 695 700 Pro Glu Ala Thr Ala Glu Arg Leu Ala Asp Phe Leu Glu Ala Ala Arg 705 710 715 720 Glu Arg Pro His Tyr Trp Glu Glu Ile Ser Asp Ala Ala Leu Ala Arg 725 730 735 Val Glu Glu Arg Tyr Thr Trp Glu Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Met Thr 740 745 750 Ile Ala Arg Val Phe Gly Phe Trp Arg Phe Val Leu Asp Arg Glu Ser 755 760 765 Gln Val Met Glu Arg Tyr Leu Gln Met Phe Arg His Leu Gln Trp Arg 770 775 780 Pro Leu Ala His Ala Val Pro Met Glu 785 790 <210> 2243 <211> 2379 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400> 2243 atgattgaag aactgcgcca acagctgctg gatgatccgc gttcatggga tgcattcctg 60 cgtcatttag tcgcatctca gcgtgactca tggttacaga cggatttaca gcgcgcgtgc 120 gcggattttc gcgaacagct tccggaaggc tatgatgaag atattggtcc gctcgaagat 180 tttgtggcac atacccagga agcgatcttc cgtgatccgt ggatggtttt tgcgtggcgt 240 ccacgtccag gtgtttggga atatgtgcgc attcatgtag aacagctggc ggtggaggag 300 ctgagcactg atgaatatct gcaagccaaa gaaggacttg ttggcttagg tgcagaaggt 360 gaagctgttc tgacggtgga tttcgaagat tttcgtccgg ttagccgtcg tttacgcgac 420 gagagcacca ttggtgatgg tcttacccat ctgaatcgtc atttagcagg tcgcatctgg 480 actgatttag cagcaggtcg tagtcagatt ctggaatttc tgagcctgca tcgtctggat 540 aaccagaatc tgatgctgag caacggcaat accgattttg actctttacg tcaaaccgta 600 caatatctgg gcaccttacc acgtgaaact ccgtgggcag agtttcgtga agacatgcgt 660 cgtcgtggtt ttgaaccagg ttggggcaac accgcgggcc gtgttcgcga aaccatgcgt 720 ctgctgatgg atctgcttga ctctccgagc ccagctgccc tggagagctt cctggatcgc 780 atcccgatga ttagcaacgt tctgatcgtg agcattcacg gatggtttgc gcaggacaag 840 gttctgggtc gtccggacac tggtggtcag gtcgtgtata ttctggatca ggcccgtgca 900 ctggaacgcg aaatgcgtaa ccgcctgcgc caacagggtg ttgatgtgga gccgcgcatt 960 ttgattgcga cccgtttaat cccggaaagt gatggcacga cttgtgacca gcgtctggag 1020 cctgtccatg gtgccgagaa tgtgcagatt ctgcgcgttc cgtttcgcta tgaggatggt 1080 cgtattcacc cgcattggat ctcacgcttc aaggtttggc cgtatcttga acgctatgca 1140 tcagatctgg aacgcgaagt tctggccgaa ttaggtagtc gtccagatct gatcatcggc 1200 aactatagcg acggtaatct ggttgcaacc ctgctgtcag aaaaattagg tgttacgcag 1260 tgcaacattg cacatgccct ggagaaaagc aagtacctgt attccgatct gcattggccg 1320 gatcacgaac aggaccatca ctttgcgtgt cagtttaccg cggatctgat cgcgatgaat 1380 gcagcagaca tcatcgtgac gagcacatac caggaaattg caggtaatga ccgcgagatc 1440 ggtcaatatg aaggtcacca ggactatact ttaccgggct tgtatcgtgt cgagaatggt 1500 attgacgtgt tcgatagcaa gtttaacatt gtgagtccgg gcgcagatgc gcgcacgtat 1560 tttagctatg cccgtactga agaacgccca tcgtctctgt tgccagaaat cgaaagtctg 1620 ctgtttggcc gcgaaccagg tccggatcaa cgtggtgttc tcgaagatcg ccagaaaccg 1680 ctgctgctgt cgatggcccg tatggatcgc atcaagaacc tgagcggtct ggccgaactg 1740 tatggtcgga gttctcgctt acgtggtctg gccaatttgg tgatcatcgg tggtcatgtt 1800 gatgtgggca atagtcgcga tgcagaagaa cgcgaagaaa tccgtcgtat gcacgagatc 1860 atggaccatt accagctgga tggtcagctg cgttgggtgg gatcgcagct ggataaaacc 1920 gtcgcgggcg aattgtatcg tgtagtggcg gatggtcgtg gcgtttttgt gcaaccagcc 1980 ctgtttgagg cgttcggcct gaccgtgatt gaggcaatga gcagtggcct gccagtgttt 2040 gcgacccgct tcggtggtcc gctggaaatc atcgaagacg gcgttagcgg cttccatatt 2100 gatcccaacg accctgaagc gaccgcagaa cgtctggccg acttcctgga agcagcgcgt 2160 gaacgtccgc actattggga ggaaattagc gatgcggctc ttgcgcgcgt cgaagaacgt 2220 tacacgtggg agcgctatgc ggaacgcttg atgaccatcg cgcgtgtttt cggcttttgg 2280 cgcttcgttc tggatcgcga atcacaggtc atggaacgct atctgcaaat gttccgccac 2340 ctgcaatggc gcccgctggc tcatgccgta ccgatggag 2379 <210> 2244 <211> 793 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>蔗糖合成酶變異體 <400>
Claims (15)
- 一種經工程處理之醣基轉移酶,其包含與序列辨識編號:4256、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3502、3346及/或3696具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是更大的序列同一性之一多肽序列。
- 如請求項1之經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的該多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:375、8/375、7、9、10、12、50/137/189/375、53、62/153/155/156/159、62/153/155/156/159/427、62/153/155/199/406、65、68、99、106、110、115、116、131、132、136、137/164/375、153、153/155/156、153/155/156/159/199/238/406、153/155/237/238/239/406、153/155/238/239、153/155/427、153/156/159、153/156/199/237/427、153/156/427、153/159/237/238/352、153/176/181/427、155/156、155/156/176/181/199、155/156/176/238/427、155/181/199/238/406、156/199、156/199/427、164/375/433、170、178、190、192、194、200、220、223/375、238、242、245、257、272、280、302、304、335、385、395、399、402、408、412、416、423、427、445、447及449,其中該等位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。
- 如請求項1或2之經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的該多肽序列在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:375L及8V/375L,其中該等位置係根據序列辨識編號:4256予以編號。
- 如請求項1之經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的該多肽序列包含: (a) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:69/173/175/243/246/354/365/383/399、69/173/243/383/399、56/191/354/383/399、70/225/246/409/413、70/115/225/409、70/225/413、70/225/247、74/310/396/424、74/396及173/175/191/365/383/399,其中該等位置係根據序列辨識編號:758予以編號; (b) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:24、24/28、24/28/262、24/28/262/264、24/28/262/264/423、24/264/294、28、28/262/264、28/423、32、56/69/70/175/191/246、56/69/70/175/191/246/354、56/69/70/175/354、56/69/70/191/246/354/365、56/69/70/246/354、56/69/175/191/246/354、56/69/175/246/354、56/69/175/246/354/365、56/69/246/354、56/69/246/365、56/70/175/191/246、56/70/175/191/246/354、56/70/175/191/354/365、56/70/175/246/354、56/70/175/246/365、56/70/191/246/354/365、56/70/191/354、56/175/246、56/175/354、56/175/354/365、56/191/246/354、56/191/354/383/399、56/246、56/246/354/365、56/354、69、69/70/175/191/246/354/365、69/70/191/246/354/365、69/70/246、69/70/354/365、69/173/175/243/246/354/365/383/399、69/173/243/383/399、69/175/191/246/354、69/175/354、69/246/354/365、69/354、70、70/115/225/409、70/175/191/246/354/365、70/175/191/354/365、70/191/246/354/365、70/191/246/365、70/225/246/409/413、70/225/247、70/225/413、74/310/396/424、74/396、126、126/220、126/403、173/175/191/365/383/399、175、175/191、175/191/246/354/365、175/191/354、175/191/354/365、175/246/354、175/246/354/365、175/354、191/246/354、246/354、262/264、264、264/29、269、325、341、351、354、354/365及366,其中該等位置係根據序列辨識編號:770予以編號; (c) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:24/32/264/269/330/402/403、24/32/264/269/382/403/406、24/32/264/330、24/32/269、24/32/269/382/385/389/402/406、24/32/269/403、24/32/330、24/264/269/389/402/406、70/126/175/191/246/325/354/366、70/126/175/325/330/351/354/366、70/126/191/246/325/351/354/366/423、70/126/191/246/325/351/354/423、 70/126/191/246/325/351/366/423、70/126/191/246/354/366、70/126/246/330/366、 70/126/246/354/366、126/211/220/253/316/342、126/211/220/275/279/323、126/211/260/423、126/220/260、126/220/316、56/220/260/423、220/260及220/260/423,其中該等位置係根據序列辨識編號:792予以編號; (d) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:24/32/97/162/202、24/32/126/198/201/367、24/32/126/198/202/220/226/260/269S、24/32/146/226、24/32/198/201/220/226、24/32/198/201/226、24/97/260/367、32/97/198/202/226/260、32/202/367、32/226/367、56/175/197/211/330/382/385、56/175/197/253/385/389、56/175/264/382/385/389/402/406、56/197/264/279/330/382/389/402/403/406、56/211/253/316/323、56/211/264/316/389、56/211/279/323/330/402、56/264/385/389、97/202/367、162/220/226/367、175/197/211/264/330、175/211/264/279/316/323、175/211/279/323/330/402/403/406、175/211/323/382/402/403/406、175/211/403/406、175/264/316/323/330/403/406、175/264/316/389/402、175/264/323/330、197/211/316/342/406、197/211/316/382/389/402/403、197/211/402、197/279/323、198/201/367、198/202/220/269/367、201/202/367、211/382/406、211/385/389、211/402/403及389,其中該等位置係根據序列辨識編號:954予以編號; (e) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:24/32/175/211/260/330/403/406、24/32/175/226/253/275/316、24/32/201/226/260/264/330/402/406、24/162/175/198/211/226/275/316/323/389、24/162/175/201/275/316、24/162/198/201/211/226/323/351、24/162/198/201/226/351、24/162/201/253/264/351/402/406、24/175/198/211/226/253/316、24/175/201/275/316/351、24/175/201/316、24/175/211/220/260/275/330/389、24/175/211/253/316、24/175/211/316/330、24/175/226/323/351、24/198/201、24/198/201/211、24/198/201/211/220/260、24/198/201/220/275/389/402/406、24/198/201/226/330/389、24/198/201/351、24/201/211/253/323/351/366/389/402/403、24/201/226/253/402/403/406、24/226/330/351/403、175/198/201/211/226/260/264/323/402/406及175/198/226/260/351/402/403/406,其中該等位置係根據序列辨識編號:1054予以編號; (f) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:21/127/129/161、21/127/129/161/162、21/127/129/162/199/200、127/129/161/162/199、127/129/161/199/200、127/129/162、156、156/161、156/161/162、156/162/199及156/199/200,其中該等位置係根據序列辨識編號:1002予以編號; (g) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:2/7/12/15/175/260/318、7/12/400/435、7/318/451、12/15/57/71/175/260/400/402、12/15/57/220/254/260/318/402、12/15/57/318/402/435、12/15/318/400/402/406、12/57/175/451、12/175/260/264/318/400、12/175/400/402/406、12/318/402/404/406/451、12/318/402/404/451、15/175/318/400/402、32、57/175/220/260/264/402、57/175/404、57/220/260/400/402/406、57/260/400/402/404、57/400/402、57/402、135、148、152、152/192/195、160/186/195、186、195、260、237、239、240、323、325、326、327、330、331、356及400/402,其中該等位置係根據序列辨識編號:2600予以編號; (h) 在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:11、14/23/274/326/329、14/31/184/274/322/326/329/330、14/56/184/185/194/238/239/274/329/399、14/56/184/194/234/315/326/329/399/401、14/56/194/238/315/325/326/329/330/399、14/56/252/274/315/326/329/330/401、14/184/185/194/234/325/326/329、14/184/185/194/388/399/401、14/184/194/355/399、14/185/194/238/399、14/185/236/238/239/274/322/326/329/355/399/401、14/194、14/322/326/330、14/326/330、14/355、14/355/399、23/31/147/184/185/238/252/325/329/330/388/401、31/56/315/329/330、45、55、56、58、65、65/114/132/238、65/238/240、104、113、114、132、135、138,147/236/238/243/315/329/330/399/401、165、185/194/236/239/325/326、223/412、238、256、273、286、309、391、422、430及449,其中該等位置係根據序列辨識編號:2718予以編號; (i) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:23/31/185/324/401、23/31/185/355、31/134/185/252/274/324/388、31/134/238/252/322/324/388、31/134/252/324、31/184/185/238/239/322、31/236、31/322、31/388、122、134/184/185/234/236/239/274/324/388、164、176、177、184/185/322、234/236/238/322/324/355、236、238/324/329/355、316、322/324、324/329/355/401、325、400、425、426、427、440及446,其中該等位置係根據序列辨識編號:2814予以編號; (j) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:11、11/45/58/132/138/286、11/58、11/58/65/104/107/138/286、11/58/65/107/135/223/286/391/430、11/58/65/135/138、11/58/104/107/114/138/223/391、11/58/114/286/309/391、11/58/132/165/286/391/422/430、11/58/138/309、11/65/104/107/138/165/286/391/430、11/65/107/135/165/391/430、11/65/132/135/138/223/391、11/65/132/135/252、11/65/132/391/430、11/65/135/138、11/104/132/138/309/391、11/104/132/138/391、11/107/114/223/309/430、11/107/138、11/114/135/138/223、11/114/223/252/286/391、11/132/135/138/223/286、11/132/138/223/286/391、11/138/165/223/309、58/65/138、58/65/138/165、58/65/165/309/430、58/104/114/165/391、107/114/132/138、107/430、135/138/165/309/430及223/309,其中該等位置係根據序列辨識編號:2884予以編號; (k) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:8/448、9、58/107/122/176/236/324/325/400/426/427、58/107/122/236/324/400/425/446、58/107/122/322/400/425/427/440/446、58/107/164/400、58/107/236/400、58/107/400、58/122/164/236/446、58/122/176/236/400/446、58/122/176/322/324/426/427、58/122/176/400/425/426/427/446、58/122/322/325、58/122/325、58/122/440、58/164/176、58/164/324/425/427、58/176/236、58/236、65、106、107/122/236/425/426/446、107/164/236/400/446、107/176/322/325/440/446、107/176/400/425/427/440、107/236、107/440、115、116、122/164/176/324/400、122/164/400/440、122/164/400/440/446、122/176/236/400、122/176/324/400/440、122/400、122/425/426/446、122/440/446、139、139/252、164、164/271/425/426、164/322/324/325/400/425/440/446、164/400、172、176/400、178、189、200、210、213、240、242、245、255、324/400/425/426/440/446、324/423、385、408、409、411、412、415、416、423、447及448,其中該等位置係根據序列辨識編號:3016予以編號; (l) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:2、3,8、8/107/139/164/415/416/440/448、8/107/139/255/322/325/415/416/440/448、8/107/164/255、8/107/164/423/440、8/139、8/139/164/200/236/240/322/440/448、8/139/164/236/416/423/440、8/139/189/240/325/416、8/139/200/236/240/255/423、8/139/255/415/416、8/164、8/164/189/200/322/324/325/416/448、8/164/240/423、8/164/252/255/448、8/164/448、8/236/240/252/448、8/240/423、8/252/255/322/325/448、12/164/440、20/126/128/155/161、20/126/128/160/161、20/126/128/160/161/198、20/126/128/161、20/126/128/161/198/199、20/126/155/160/198、20/126/155/161、20/126/160、20/126/160/161、20/126/161、20/128/155/160/161/198、20/128/155/161/199、20/128/155/199、20/128/160/161/198、20/155/160、20/155/160/161、20/155/161、20/155/161/199、20/160/161/198、34、72、73、75、107/139、107/139/200/240/322/324/325/448、107/236/240/325/440、107/240/252/423/448、107/423、113、114、121/126/128/161/369、126/128/155/160/161、126/128/155/160/161/199、126/128/155/161/199、126/128/160/161/369、126/128/160/198/369、126/128/160/199/369、126/128/160/369、126/128/161/199/369、126/128/161/369、126/128/369、126/160/161/199/369、126/160/198/369、126/196/198/369、126/198/369、126/199/369、126/369、128/155/160/161、128/155/160/161/199、128/155/160/198、128/155/199、128/160/161/369、128/161/199/369、128/198/199/369、128/199/369、128/369、139、139/164/236/240、139/255/325/415/440、155/161/198/199、155/199、160/161/369、161/198/369、161/369、164/189、164/189/236/240、164/189/240/252/415/423、164/200/236、164/200/236/240/324/416/440、164/200/236/255/322/324/423/440、164/236、164/236/240/440、164/236/423、164/322/325、164/322/325/416/423、164/416/448、186、189、199/369、200/236/322/325/416、200/322/325/415/448、221、235、236/415/416、237、239、240、240/252/255/322/415/416、240/252/255/415/448、255/423、256、286、299、305、309、312、313、323、325、355、389、406、415/416/448、422、438及446,其中該等位置係根據序列辨識編號:3082予以編號; (m) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:14、35、42、46、49、105、106/164/172/200/409、106/164/172/210/240/415、106/164/172/242/409/416、106/164/200/210/242、106/164/200/210/415、106/164/200/240/408/409/416、106/164/210/240/408/409/416、106/164/210/408/409、106/164/240/415、106/164/409/415/423、106/172/200/210/240/242/408/415/416/423、106/172/200/210/242、106/172/240、106/172/240/242/409/415、106/172/242、106/172/242/416/423、106/172/408/409、106/172/409/423、106/200/210/409、106/210/240、106/210/240/408/415、106/240/242、106/240/242/409、106/242/408/409、134、143、164/172/200/210/242/409、164/172/240/242/415、164/172/242/408、164/200/408/415/416、164/240/242/408、164/240/242/415/423、164/423、172/200/210/240/408、172/200/240、172/200/408/416、172/210/415、172/240、172/240/242/415、172/240/409、179、181、200/210/240/242/409、200/240/242/407、200/242/415/416/423、200/408/409、210/240、232、240、240/242、240/242/408/416、240/242/415/423、240/408、240/415、278、290、336、373、381、401、409/415及441,其中該等位置係根據序列辨識編號:3244予以編號; (n) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:21、91、125、127、130/187、143、143/150、145、152、156、186、187、195、197、200、201、202、264、268、364、365及415,其中該等位置係根據序列辨識編號:3346予以編號; (o) 在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/5/113/186/237/406、2/73/186/237、2/189/286、2/286/355/416/422、5/34/73/113/406、5/73/186/406、5/113/237/406、5/186/237/245/256/406、5/186/237/406、5/256/406、34/113/186/237/406、72/73/172/235/240/242/438、72/172/239/240/242/408、72/172/240/242、73/172、73/172/235/239/240、73/172/235/239/242、73/172/239/240、73/172/239/240/242、73/172/240/242/408、73/172/240/408、73/186/237/406、73/235/240/323、73/235/240/408、73/237、73/239/242、96、113/186/406、127、132、144、153、155、156、172、172/188/323、172/235、172/235/239/240/242、172/235/239/408、172/235/240、172/235/240/242/438、172/239/240/242/323/408、172/240、172/240/299/323、186、186/237、186/237/286、186/406、187、189/333/355/421,196、199、200、235/239/240、235/240/242、237、239/240、239/240/242/256/323、239/240/242/323/408、239/240/408、239/242/408、240/242/256/438及242/408,其中該等位置係根據序列辨識編號:3502予以編號; (p) 在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2/5/35/105/143/237/373/416/422、2/5/35/143/232/237/416/422/441、2/5/35/232/278/373/416、2/5/105/143/232/373/416/422、2/5/278、2/105/143/232/237/278/373/441、2/143/232/373/441、2/143/373/441、3、5/35/232/373/416/422、5/105/232/237/373/416/441、5/105/237/278/422/441、5/105/237/416/422/441、5/143/189/232/237/441、5/143/232/237/278、5/143/232/237/416/422、5/143/232/373/422/441、5/143/237/278/373/416/422、5/143/373、5/189/237/278/373/416/422/441、5/232/416/422、5/237/373/422、5/373/416、8、26/42、26/42/46/49、26/42/46/49/134、26/42/46/49/134/186、26/42/46/134、26/42/49/134、26/42/49/134/186/355、26/42/49/134/401、26/42/134/401、26/49/134、26/134、26/134/186/355/401、26/134/355、26/134/401、26/355/401、35、35/105/189/232/373/416、42/46/49/97/134/401、42/46/49/134、42/46/49/134/186、42/46/49/134/186/355、42/46/49/134/235/355/401、42/46/49/134/401、42/46/49/186、42/49/134/186/355、42/49/134/186/401、42/49/134/355/401、42/134/186、42/186/355、46/49/134、49/134/355、50、61、62、101、105/143/232/237/373/416/422/441、105/143/278/373、105/189/237、105/237/278/373/416/422、105/237/373/422/441、105/373、105/373/441、134/401、137、143、143/189、143/189/232/422/441、143/189/237/373/416/422、143/232、143/237、143/237/422/441、158、161、164、176、186/355、189/232/373/416/422/441、189/237/278/416/441、193、223、223/243、232/237、237/373、235、237、237/373/441、and 239、240、243、244、248、249、301、323、330、352、364、426及427,其中該等位置係根據序列辨識編號:3696予以編號; (q) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:5/73/113/186/187/373/423、5/73/143/144/179/186/187/422、5/73/144/179/186/373/423、5/73/144/187/373/422、5/143/144/179/181/186/187/373、5/144/179/181/373/422、5/144/373/422、11、12、41、44、44/187、45、49/96/127/132/156/196、49/96/127/153/278、49/96/132/153/155/156/237/278/406、49/96/132/153/199/200、49/96/132/155、49/96/132/155/237/278、49/96/155/199/200/406、49/153/155、55、56、57、65、66、70、72、73、73/113/143/179/181/422、73/113/179/181/186/187、73/143/144/179/186/187/373/423、73/179/181/186/187/373、73/179/181/186/373/422、73/181/186/187、74/238、82、83、85、96/127/132/153/278、96/127/153/155、96/132/153/155、96/132/153/155/156、96/132/153/155/156/200、96/132/153/156、96/132/196/199、96/132/278、96/153/155/156、96/153/155/199/200/237、96/153/406、103、111、113、113/143/179/186/187、113/144/186/423、113/144/373、113/181/186/373/422、113/373/422、114、117、127/132、127/132/153/156、127/132/155/156/406、127/153/155/199/200/237、127/406、132、132/153/155、132/153/237/406、132/155、132/237、135、138、140、143/144/179/181/186/187/422、143/179/181/186/187/422/423、144/179/181/186/187/373、144/179/186/187/373、153/155/156/237、153/155/196/199/237、153/199/406、153/237、155/199、159、160、162、167、179/181/186、179/181/186/187/423、179/186/187、179/187/373/422、181/186/187/422/423、182、214、220、222、223、226、236、238、256、286、299、309、373/423、387、388、389、391、393、406、408、412、418、422、429、430、449及450,其中該等位置係根據序列辨識編號:3956予以編號; (r) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:11/41/44/127/132/406、11/41/44/127/278/406、11/41/45/73/127/278/406/408、11/41/45/127/278/406、11/41/132/278、11/44/45/127、11/44/73/127/132/135、11/44/73/127/132/135/406/408、11/44/127、11/44/132/278/406、11/45/73/127/135、11/45/127/132/135/138/182、11/45/406、11/73/127/132/135/182/278、11/73/127/132/278/406/408、11/73/127/132/406/408、11/73/132、11/73/132/135/408、11/127/132/135、11/127/132/135/182、11/127/132/135/406、11/127/132/138/182、11/127/132/182、11/132/135/406、11/182/406、41/44/45/73/127/132/278、41/45/127/132/135/278/406、41/73/132/135/406、44/45/73/132/135/406、44/45/127/132/135/138/182/406/408、44/45/127/132/278、44/73/127/135、44/73/127/135/182/278/406/408、44/73/132/135/406/408、45/73/127/132/135/406/408、45/73/132、45/73/132/135/182、45/73/278/406/408、45/127/132、45/127/132/135/182、45/127/132/135/182/406/408、45/127/135、45/132/408、45/406、56/309/449、57、65/114/422/427、65/114/427、65/143、65/143/235/427、73/127、73/127/132、127、127/132/135/182、127/132/135/182/406、132/135、132/135/182、132/135/406、132/406、164、164/220/309/449、164/220/449、164/449、182、220/449、309、309/449、406、418/427、427、427/429及449,其中該等位置係根據序列辨識編號:4550予以編號; (s) 在選自於下列的一或多個位置處包含至少一突變或突變組:2、4、7/10/73/127/132/385/423、10、10/53/73/99、10/53/272/423/427、10/53/423、10/73、10/73/127、10/127/132/385、10/132/302/385、11/44、11/71、11/287、11/441、37、40、42、42/138、42/141、43、46、47、48/398、49、49/406/408、51、53/73/200/423、53/127/132/385、53/127/136/385、53/132/136/302/423/427、53/132/302/385/423/427、64、65/106/445/447/449、65/143/220、65/220/309/445/447、65/220/445/449、65/399/406/447/449、65/402/406/445/449、65/445/447/449、65/447/449、71、73、73/127/427、73/132/136/385/427、73/385、73/385/427、76、97、100、106/220/399/402/406、108、108/172、109、112、115/116/278、115/170/190/238/412、115/190/194、115/245/278、116/170/190、116/190/406/408、116/238、116/238/245、116/416、117/157/301、118、118/406/408、119、119/172、127、130、132、133、134、141、143/220/445/447、143/309/402、143/309/445/447/449、157、169、170、170/190/192/194、170/192、170/192/194/278、170/192/194/335、170/194、170/194/335/416、170/238、170/335、170/335/416、172/420、172/437、179、181、190、190/192/194、190/194、190/194/238/245、190/194/335/416、190/194/412、190/245/412、192/194、192/194/242/406/408、194、200、200/385、220/399、220/445、220/445/447、257/385、259、272/302、272/385、274、275、278、287、288、302/385、309/399/449、309/445/447/449、333/398、333/406/408、338、356、357、376、381、385、394/420、396、397/406/408、398、401、385、385/427、399/406、399/406/449、402/445/449、406/408、406/445/447/449、406/445/449、410、417、420、423/427、434、437、441、445/447/449、445/449、447及449,其中該等位置係根據序列辨識編號:7324予以編號;或者 (t) 在選自於下列的一或多個位置處之至少一突變或突變組:10、10/144、10/199、11、11/64/109、11/445、13、14、15、15/394、16、22、36、42/43、42/44/71/73/116、43/73/141、46/47/51、46/51、47/49、47/51、64、64/65/109、64/65/112、64/112、64/134、64/445、65/112、65/112/445、71、71/73、71/73/141、71/141、71/302、73、73/116/141、73/141、73/302、89、93、96、109、109/112、109/115/118、109/134、109/406、112、112/445、116、116/123、116/287、116/143、116/350、123、125、127、127/169/172、127/169/287、127/169/376/398/399、127/169/398/399、127/287、127/376、141、141/302、143、144、149、156、169/172/287、169/172/288、169/172/288/398/399/420/423/427、169/172/398/399、169/287、169/398、169/398/399、186、187、197、198、199、201、202、203、268、287、287/288、287/376、287/398、287/399、287/420/423/427、288、288/376/398、288/398、288/399、302、324、331、350、376、376/398、376/399、398、398/399、398/399/420、398/427、399及420,其中該等位置係根據序列辨識編號:7784予以編號。
- 如請求項1-4中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,其中: (a) 該經工程處理之醣基轉移酶優先使用除了尿嘧啶二磷酸以外的一糖予體(sugar donor);及/或 (b) 該經工程處理之醣基轉移酶為選自於下列的一NDP-醣基轉移酶:ADP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(AGTs)、CDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(CGTs)、GDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(GGTs)、TDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(TGTs)及IDP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶(IGTs),任擇地其中該經工程處理之醣基轉移酶為一ADP-葡萄糖依賴性醣基轉移酶。
- 如請求項1至5中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,其中該經工程處理之醣基轉移酶的該多肽序列包含下列表中提供的一變異體經工程處理之醣基轉移酶:14.1、15.1、15.2、15.3、16.1、17.1、43.1、43.2、44.2、45.1、45.3、46.1、46.2、46.3、47.1、47.2、47.3、48.1、48.2、49.1、49.3、50.1、50.2、50.3、50.4、51.1、51.2、52.1、53.1、53.3、54.1、54.2、54.3、55.1、55.2、55.3、56.1、56.2、56.3、57.1、58.1、58.2、58.3、59.1、59.3及/或59.3。
- 一種經工程處理之多核苷酸,其編碼至少一如請求項1-6中任一項中所提供之經工程處理之醣基轉移酶多肽。
- 一種載體,其包含至少一如請求項7之經工程處理之多核苷酸,任擇地其中該載體進一步包含至少一控制序列。
- 一種宿主細胞,其包含: (a) 至少一如請求項7之經工程處理之多核苷酸;或 (b) 至少一如請求項8之載體,任擇地其中該宿主細胞係選自於真核及原核生物體。
- 一種用於生產至少一如請求項1-6中任一項中所提供之經工程處理之醣基轉移酶的方法,其包含在如請求項9中任一項之宿主細胞能生產該經工程處理之醣基轉移酶的條件下,培養如請求項9中任一項之宿主細胞,任擇地,其中該方法進一步包含回收該經工程處理之醣基轉移酶的步驟。
- 一種組成物,其包含至少一如請求項1-6中任一項之經工程處理之醣基轉移酶。
- 一種用於下述之方法: (a) 醣基化一受質,該方法包含:提供至少一受質、至少一如請求項1-6中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,以及在該受質能醣基化而生產至少一醣基化產物的條件下,使該受質與該醣基轉移酶接觸,任擇地其中: (i) 該受質包含至少一甜菊糖;及/或 (ii) 該醣基化產物包含至少一單醣基化及/或多醣基化產物; (b) 生產甜菊糖苷M(rebaudioside M),該方法包含提供一甜菊糖苷I受質、一NDP-葡萄糖及至少一如請求項1-6中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊糖苷I受質、該NDP-葡萄糖及該醣基轉移酶; (c) 生產甜菊糖苷D,該方法包含提供一甜菊苷受質、一NDP-葡萄糖及至少一如請求項1-6中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷D的條件下組合該甜菊苷受質、該NDP-葡萄糖及該醣基轉移酶。
- 如請求項12之方法,其中: (a) 該NDP-葡萄糖係選自於ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖,及/或IDP-葡萄糖; (b) 該NDP-葡萄糖不是UDP-葡萄糖; (c) 該醣基轉移酶包含如請求項1至6中任一項之醣基轉移酶;及/或 (d) 該NDP-葡萄糖係ADP-葡萄糖。
- 一種用於生產下列的方法, (a) 甜菊糖苷D,該方法包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一如請求項1-6中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷D的條件下組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、該蔗糖合成酶及該醣基轉移酶; (b) 甜菊糖苷M,該方法包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、一蔗糖合成酶及至少一如請求項1-6中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,在能生產甜菊糖苷M的條件下組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖、該蔗糖合成酶及該醣基轉移酶;其中該甜菊苷受質包含至少一甜菊苷及/或一甜菊苷及rebA的混合物;或者 (c) 甜菊糖苷M,該方法包含提供一甜菊苷受質、NDP、蔗糖、至少一蔗糖合成酶及至少一如請求項1-6中任一項之經工程處理之醣基轉移酶,在能最先生產甜菊糖苷A、接著生產甜菊糖苷D及/或甜菊糖苷I並最終生產甜菊糖苷M的條件下,組合該甜菊苷受質、NDP、蔗糖及該醣基轉移酶。
- 如請求項14之方法,其中: (a) 該蔗糖合成酶係一包含一多肽序列的經工程處理之蔗糖合成酶,該多肽序列與SEQ ID NO:74相較具有一或多個殘基差異; (b) 該方法係以一鍋反應(one-pot reaction)的方式來進行; (c) 該方法係按順序進行; (d) 該方法進一步包含重複該方法的該等步驟;任擇地其中: (i) 該蔗糖係在重複該等步驟的期間回收;及/或 (ii) 該經工程處理之醣基轉移酶及/或其他反應組分被予以回收; (e) 該甜菊苷受質係從甜菊( Stevia rebaudiana)萃取或係經合成生產; (f) 該醣基轉移酶及/或該蔗糖合成酶係固定化的; (g) 該方法生產包括果糖的一反應產物,任擇地其中從該反應產物移去該果糖;及/或 (h) 其中該方法進一步包含一清洗步驟及/或至少一管柱層析步驟。
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