JP2020506704A - 操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよびステビオール配糖体グルコシル化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
配列表の公式のコピーは、EFS−Webを介して、ファイル名「CX8−162WO3_ST25.txt」、作成日2018年1月24日、およびサイズ31,100キロバイトのASCIIフォーマットテキストファイルとして本明細書と同時に提出されている。EFS−Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも91%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも92%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも93%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号44、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも94%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも96%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも97%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号44、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号44、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088に対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、770、792、954、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3346、3502、3696、3956、4256、4550、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、6864、7324、7388、7784、および/または8088から選択されるポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、ベータ−1,2−グリコシルトランスフェラーゼおよびベータ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼから選択される。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、ウラシル−二リン酸以外の糖供与体を優先的に使用する。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、表2.1、3.1、5.1、6.1、6.3、8.1、9.1、9.2、9.4、11.1、12.1、14.1、15.1、15.2、15.3、16.1、17.1、43.1、43.2、44.2、45.1、45.3、46.1、46.2、46.3、47.1、47.2、47.3、48.1、48.2、49.1、49.3、50.1、50.2、50.3、50.4、51.1、51.2、52.1、53.1、53.3、54.1、54.2、54.3、55.1、55.2、55.3、56.1、56.2、56.3、57.1、58.1、58.2、58.3、59.1、59.3、59.3、60.1、60.2、61.1、61.2、62.1、62.2、63.1、63.2、64.1、64.2、65.1、65.2、66.1、66.2、67.1、67.2、67.3、68.1、68.2、69.1、69.2、70.1、70.2、71.1、71.2、71.3、72.1、72.2、72.3、73.1、73.2、74.1、74.2、74.3,75.1、75.2、75.3、77.1、および/または77.2に提供される操作された改変体グリコシルトランスフェラーゼを含む。本発明は、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、22、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、3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6596、6598、6600、6602、6604、6606、6608、6610、6612、6614、6616、6618、6620、6622、6624、6626、6628、6630、6632、6634、6636、6638、6640、6642、6644、6646、6648、6650、6652、6654、6656、6658、6660、6662、6664、6666、6668、6670、6672、6674、6676、6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198、7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212、7214、7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358、7360、7362、7364、7366、7368、7370、7372、7374、7376、7378、7380、7382、7384、7386、7388、7390、7392、7394、7396、7398、7400、7402、7404、7406、7408、7410、7412、7414、7416、7418、7420、7422、7424、7426、7428、7430、7432、7434、7436、7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336、8338、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366、8368、8482、8484、8486、8488、8490、8492、8494、8496、8498、8500、8502、8504、8506、8508、8510、8512、8514、8516、8518、8520、8522、8524、8526、8528、8530、8532、
8534、8536、8538 ,8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220、9222、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238、および/または9240に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供する。
L84G/H154V/L199A/S356G、Q22P/L84G/H154V/L199S/S356G、Q22P/L84G/I198S/L199K/L306V/S356G、Q22P/L84G/L199S/S356G、Q22P/L84G/I207L/S356G、Q22P/L84G/S356G、Q22P/L84V/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G、Q22P/M87H/H154L/I198S/L199K/S356G、Q22P/M87H/H154L/L199A/L306V/S356G、Q22P/M87H/H154L/P322S/S356G、Q22P/M87H/H154V/I198S/L199K/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199S/S356G、Q22P/M87H/H154V/I198S/L199S/I207L/L306V/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199A/I207L/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199K/S356G、Q22P/M87H/H154V/L199S/L306V/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199A/L306V/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199K/L306V/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199S/I207L/S356G、Q22P/M87H/I198S/L199K/S356G、Q22P/M87H/L199A/S356G、Q22P/M87H/L199K/S356G、Q22P/H154L/I198S/L199A/I207L/L306V/S356G、Q22P/H154L/I198S/L199A/S356G、Q22P/H154L/L199A/S356G、Q22P/H154V/I198S/L199S/L306V/S356G、Q22P/H154V/L199A/S356G、Q22P/H154V/L199K/I207L/L306V/S356G、Q22P/I198S/L199A/S356G、Q22P/I198S/L199K/I207L/G329C/S356G、Q22P/L199A/S356G、Q22P/I207L/S356G、Q22P/S356GおよびL84G/H154L/I198S/L199Kから選択される少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号32を参照して番号付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346および1290のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346および1290のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346および1290のいずれかを含む。
431Dおよび347D/417Rから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号232を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、F64P/L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/I233R/Y421V/R427L/Q431D、F64P/L106S/L109R/E112P/E417A/Y421V/R427A/Q431D、F64P/L106S/L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427L/Q431D、F64P/L106S/L109R/I233R/G347D/R427A/Q431D、 F64P/L106S/E112P/G347D/E417A/Y421V、F64P/L106S/R139P/S179L/I233R/E417A/R427A/Q431D、F64P/L106S/E417R/Y421V、F64P/L106S/Q431D、F64P/L106T/L109R/E112P/S131P/S179L/E417R/R427A/Q431D、F64P/L106T/L109R/E417A/Y421V/R427L/Q431D/K439P、F64P/L106T/E112P/R139P/Q159R/S179V/G204D/Y396R/E417A、F64P/L106T/E112P/Q159R/S179L/E417R/Y421V、F64P/L106T/G204D/E417A/Y421V/R427A、F64P/L109R/E112P/R139P/Q159R/S179L/E417R/Q431D、F64P/L109R/E112P/R139P/E417A、F64P/L109R/R139P/I233R/E417R/Y421V、F64P/L109R/Q159R/S179V/G204D/I233R/E417R/Y421V、F64P/L109R/E417A/Y421V、F64P/L109R/E417R/Y421V、F64P/R139P/I233R/E417R/R427L/Q431D/K439P、F64P/R139P/G347D/E417R/Y421V/R427L/Q431D、F64P/E417R/Y421V/Q431D、L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/S179L/E417A/Y421V、L106S/L109R/E112P/S131P/Q159R/G204D/G347D/E417A/Y421V/R427L、L106S/L109R/E112P/G204D/G347D/Y421V/K439P、L106S/L109R/E112P/R261P/E417R/Q431D、 L106S/L109R/E112P/G347D/R427A、L106S/L109R/R139P/R427A/Q431D、L106S/L109R/E417R/Y421V/R427L、L106S/E112P/Q159R/G204D/I233R/E417R/Y421V/R427A/Q431D、L106S/E112P/I233R/E417R、L106S/E112P/Y396R/E417R/Y421V、L106S/R139P/Q159R/I233R/G347D/E417R/Y421V/R427A/Q431D、L106S/I233R/Y421V/R427A、L106S/E417A、L106T/L109R/R139P/G347D/E417A/Y421V/R427A、L106T/L109R、L106T/L109R/R139P/I233R/E417R/Y421V、L106T/L109R/R139P/E417R、L106T/L109R/I233R/R427A/Q431D、L106T/E112P/Q159R/S179L/G204D/E417A/Y421V、L106T/E112P/Q159R/S179V/I233R/E417A/Y421V/R427L/K439P、L106T/S131P/S179L/I233R/Y421V/R427L/Q431D、L106T/R139P/Y421V、L106T/G347D/E417R/R427A/Q431D、L109R/E112P/S131P/Q159R/S179V/K439P、L109R/E112P/S131P/Q159R/E417R/Y421V、L109R/E112P/R139P/S179V/E417R/R427A、L109R/E112P/Q159R/S179V/E417R/Y421V、L109R/E112P/Q159R/E417R/R427L、L109R/E112P/S179V/G204D/I233R/E417A/Y421V/R427L、L109R/E112P/S179V/G347D/E417R、L109R/E112P/G204D/I233R/E417R、L109R/E112P/G204D/R427A、L109R/E112P/I233R/E417A/Q431D、L109R/E112P/E417A/Y421V/R427L、L109R/E112P/E417A/R427A/Q431D、L109R/S131P/R139P/S179V/R261P/Y396R/Y421V、L109R/S131P/G204D、L109R/R139P/S179L/E417R/Y421V/R427A、L109R/R139P/S179L/E417R/R427L、L109R/S179V/I233R/Y421V、L109R/G204D/E417R/Q431D、L109R/E417R/Y421V、L109R/E417R/R427A/Q431D、E112P/S131P/S179V/G204D/E417R/Y421V/R427L、E112P/S131P/S179L/G347D/E417R/Y421V、E112P/R139P/S179V/G204D/I233R/G347D/R427L、E112P/Q159R/E417R/Y421V、E112P/E417R/Y421V、S131P/S179L/I233R/E417R/R427A、R139P/I233R/E417A、Q159R/G347D/E417A/Y421V/Q431D、S179V/E417R/Y421V、I233R/E417R/Y421V/R427L/Q431DおよびG347D/E417Rから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号232を参照して番号付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374 376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、および/または498のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374 376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、および/または498のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374 376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、および/または498のいずれかを含む。
289S/435R/438Aから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号548を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、I14V/I28M/K38R/R74W/L100F/R102K/S118A/D161L/D169G/A178V/I233W/T250R/A407E/I422M/M438A、I14V/I28M/K38R/R74W/R102K/S156A/Q159M/I233W/T250A/K289S/V413L/I422M/Q424E/V435R/M438A、I14V/I28M/K38R/L100F/R102K/A110G/Q159M/D161L/I233W/H259S/D290E/D300Q/A351G/V435Q、I14V/I28M/K38R/A110G/N137G/D161L/K222R/K289S/W401L、I14V/I28M/I44V/R74W/D98P/R102K/N137G/Q159M/D161L/K185R/K222R/T250A、I14V/I28M/I44V/I92L、I14V/I28M/I44V/D161L/D169S、I14V/I28M/I44V/D375P、I14V/I28M/T54P/D161L/K185R/V413L、I14V/I28M/T54P/V365I、I14V/I28M/R74W/D98P/L100F/R102K/D161L/R173G/A178V/I233W/T250A/H259S/D290E/A407E、I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/Q159M/D161L/D169S/I233W、I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/Q159M/D161L/I233W/A351G/I422M、I14V/I28M/I92L/L100F/R102K/I422M/Q424E/V435Q、I14V/I28M/I92L/L100F/D161L/K222R/I233W/K289S/D300Q、I14V/I28M/L100F/N137G/S156A/D161L/K222R/H259S/K289S/V365I/W401L/V435R/M438A、I14V/I28M/L100F/S156A/D161L/T250R、I14V/I28M/R102K/S118A/N137G/D161L/K185R/K222R/T250R/H259P/W401L、I14V/I28M/Q159M/K289S/D290E/D300Q、 I14V/I28M/Q159M/V365I/V435Q、I14V/I28M/A351G、I14V/K38R/R74W/A110G/S156A/D161L/R173G/A178V/K222R/D300Q、I14V/K38R/L100F/R102K/D161L/R173G/A178V/K222R/T250R/D375P/W401L/V413L、I44V/R74W/L100F/R102K/D161L/I233W/V365I/V435G/M438A、I14V/R74W/A110G/Q159M/D161L/D169G/R173G/T250A/H259P/D290E/D375P/A407E/I422M、I14V/R74W/D161L/D375P/W401L、I14V/I92L/D98P/L100F/Q159M/D161L/H259P/V365I/I422M/Q424E/V435R、I14V/A110G/S156A/D161L/D375P/W401L/V435E/M438A、I14V/Q159M/D161L/V365I/V435E/M438A、I14V/D161L/K222R/T250R/H259S/K289S/D375P/W401L/V413L、I14V/D161L/K222R/T250R/V435Q/M438A、I14V/D161L/D300Q、I28M、I28M/K38R/I92L/D98P/L100F/R102K/S156A/D161L、I28M/I44V/R74W/W401L、I28M/I44V/I92L/D161L/K222R/D300Q/V413L、I28M/I44V/D98P/L100F/R102K/S118A、I28M/I44V/S118A/S156A/D161L/K222R/K289S/V435Q/M438A、I28M/I44V/K289S/D290E/A351G/I422M、I28M/I44V/V435R/M438A、I28M/T54P/I92L/Q159M/D161L/D290E、I28M/T54P/Q159M/D290E/M438A、I28M/T54P/T250R/K439N、I28M/R74W/S156A/Q159M/D161L/A178V/D300Q/V365I/V435Q/M438A、I28M/R74W/S156A/D161L/V365I/A407E、I28M/R74W/D161L/D290E/V365I、I28M/D98P/L100F/R102K/D161L/K185R/A351G/W401L/V435E/M438A、I28M/I92L/L100F/R102K/A110G/D161L/K185R/T250A/D300Q/D375P/V435Q、I28M/I92L/S118A/Q159M/K222R/T250R/H259P/D300Q/A407E、I28M/S156A/D161L/K185R/V435R/M438A、I28M/S156A/D161L/I233W/H259S/D300Q/V435R、I28M/I92L/D98P/L100F/A110G/S156A/D161L/W401L、K38R/D161L/D300Q/M438A、R74W/D98P/L100F/R102K/A110G/S118A/D161L/A178V/T250R/K289S/D290E/D300Q/V435E/M438A、R74W/D98P/L100F/R102K/S118A/S156A/Q159M/D161L/V435E/M438A、R74W/S156A/D161L/R173G/A178V/Q424E/V435E、R74W/D375P/V435G、D98P/L100F/S118A/Q159M/D161L/D300Q、D98P/L100F/S156A/Q159M/D161L/A178V/H259S/K289S/D290E/A351G/I422M、R102K/N137G/Q159M/D161L/I422M/Q424E、S118A、N137G/Q159M/D161L/K185R/D300Q/A351G/V365I/V435Q、S156A/Q159M/D161L/D169S、 Q159M/D161L/K222R/D290E/D375P/A407E、Q159M/D161L/W401LおよびD161L/H259S/K289S/V435R/M438Aから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号548を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678および680のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含み、位置は、配列番号548を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678および680のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含み、位置は、配列番号548を参照して番号付けられている。
R417P、K190R/W233K/S252E、K190R/W233K/S252E/S253G/S317R/V320I/N408R/K428R、K190R/W233K/S252E/S317R/N408R、K190R/W233K/S252E/V320I/N408R、E201P/F264A/D347K/K392H/R417P/V435R、E201P/F264A/D347K/R417P/V435R、E201P/F264A/D347P/K392H/V435Q、W233K/S252E/S253G/S317R/V320I/A427R/K428R、W233K/S252E/S253G/N408R/A427L、W233K/S252E/S317R/N408R、W233K/S252E/S317R/A427R、W233K/S252E/V320I、W233K/S252E/V320I/N408R/K428R、A348S/S374R/V435RおよびS374Rから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号5562を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、14、55、56、255、282、308、336、342、364、391、407、および422から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号5562を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、14I、55V、56A、255L、282S、308L、308Q、336Q、342W、364A、364S、391C、407C、407V、および422Qから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号5562を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、V14I、S55V、L56A、S255L、T282S、R308L、R308Q、K336Q、E342W、G364A、G364S、L391C、E407C、E407V、およびM422Qから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号5562を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号5692、5694、5696、5698、5700、5702、5704、5706、5708、5710、5712、5714、5716、5718、5720、5722、5724、5726、5728、5730、5732、5734、5736、5738、5740、5742、5744、5746、5748、5750、5752、5754、5756、5758、5760、5762、5764、5766、5768、5770、5772、5774、5776、5778、5780、5782、5784、5786、5788、5790、5792、5794、5796、5798、5800、5802、5804、5806、5808、5810、5812および5814のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号5692、5694、5696、5698、5700、5702、5704、5706、5708、5710、5712、5714、5716、5718、5720、5722、5724、5726、5728、5730、5732、5734、5736、5738、5740、5742、5744、5746、5748、5750、5752、5754、5756、5758、5760、5762、5764、5766、5768、5770、5772、5774、5776、5778、5780、5782、5784、5786、5788、5790、5792、5794、5796、5798、5800、5802、5804、5806、5808、5810、5812および5814のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号5692、5694、5696、5698、5700、5702、5704、5706、5708、5710、5712、5714、5716、5718、5720、5722、5724、5726、5728、5730、5732、5734、5736、5738、5740、5742、5744、5746、5748、5750、5752、5754、5756、5758、5760、5762、5764、5766、5768、5770、5772、5774、5776、5778、5780、5782、5784、5786、5788、5790、5792、5794、5796、5798、5800、5802、5804、5806、5808、5810、5812および5814のいずれかを含む。
L437I、R173N/A427R/L437I、K190R/W233K/S252E/L257A/K347G/R411Q/L437I、K190R/S252E、K190R/S252E/L257A/E285Q/A427R、K190R/S252E/L257A/R411Q/L437I、K190R/S252E/L257A/A427R、K190R/S374K/A427R/L437V、N195H/P272K/V320I/K439P、N195H/S317R/V320I、D198E、D198E/L292P、D198I、D198I/P244L、W233K/S252E、W233K/S252E/L257A、W233K/S252E/L257A/K347G、W233K/S252E/L257A/K347G/R411Q/L437I、W233K/S252E/L257A/A427R/L437V、W233K/S252E/E285Q、W233K/S252E/E285Q/L437V、W233K/S252E/R411Q/L437V、W233K/S252E/L437V、W233K/S374K、W233K/S374K/L437I、S252E/L257A、S252E/L257A/K347G/L437V、L257A/K347G/R411Q/L437V、D268A/R417P、E285Q/K347G/L437V、K302R/G364S、E330D/G364S、K347G/R411Q/L437I、K347G/A427R/L437V、G364S/N399D、S374K、S374K/R411Q/L437I、S374K/R411Q/L437V、N408D/R417P、R411Q/L437VおよびL437Iから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号5708を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号5816、5818、5820、5822、5824、5826、5828、5830、5832、5834、5836、5838、5840、5842、5844、5846、5848、5850、5852、5854、5856、5858、5860、5862、5864、5866、5868、5870、5872、5874、5876、5878、5880、5882、5884、5886、5888、5890、5892、5894、5896、5898、5900、5902、5904、5906、5908、5910、5912、5914、5916、5918、5920、5922、5924、5926、5928、5930、5932、5934、5936、5938、5940、5942、5944、5946、5948、5950、5952、5954、5956、5958、5960、5962、5964、5966、5968、5970、5972、5974、5976、5978、5980、5982、5984、5986、5988、5990、5992、5994、5996、5998、6000、6002、6004、6006、6008、6010、6012および6014のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号5816、5818、5820、5822、5824、5826、5828、5830、5832、5834、5836、5838、5840、5842、5844、5846、5848、5850、5852、5854、5856、5858、5860、5862、5864、5866、5868、5870、5872、5874、5876、5878、5880、5882、5884、5886、5888、5890、5892、5894、5896、5898、5900、5902、5904、5906、5908、5910、5912、5914、5916、5918、5920、5922、5924、5926、5928、5930、5932、5934、5936、5938、5940、5942、5944、5946、5948、5950、5952、5954、5956、5958、5960、5962、5964、5966、5968、5970、5972、5974、5976、5978、5980、5982、5984、5986、5988、5990、5992、5994、5996、5998、6000、6002、6004、6006、6008、6010、6012および6014のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号5816、5818、5820、5822、5824、5826、5828、5830、5832、5834、5836、5838、5840、5842、5844、5846、5848、5850、5852、5854、5856、5858、5860、5862、5864、5866、5868、5870、5872、5874、5876、5878、5880、5882、5884、5886、5888、5890、5892、5894、5896、5898、5900、5902、5904、5906、5908、5910、5912、5914、5916、5918、5920、5922、5924、5926、5928、5930、5932、5934、5936、5938、5940、5942、5944、5946、5948、5950、5952、5954、5956、5958、5960、5962、5964、5966、5968、5970、5972、5974、5976、5978、5980、5982、5984、5986、5988、5990、5992、5994、5996、5998、6000、6002、6004、6006、6008、6010、6012および6014のいずれかを含む。
E342W/G364A/S449R、V14I/L163A/T282S/R308L、V14I/T282S、V14I/T282S/R308L、V14I/T282S/E342W/G364A/L391C、V14I/T282S/G364A、V14I/T282S/G364A/L391C/E407V/S449R、V14I/T282S/N399D/E407V/S449R、V14I/E407V、S37R、I44V、P70K、Q71L/R331K、W74H、L75G、L75M、P90Q、P90S、P90T、S106Y、M108H、P112N、D114P、E115R、P131V、L138V、P139A、P139R、P139S、S156C、P158D/T282S/E407V、P158D/T282S/E407V/S449R、P158D/G364A/N399D/E407V/S449R、P158D/G364A/S449R、E162A、L163A/D198E/T282S/E342W、L163A/T282S/R308L/G364A/N399D、L163A/T282S/N399D/E407V、L163A/T282S/E407V/S449R、L174P、D198E/T282S/R308L/E342W、D198E/T282S/E407V、D198E/R308L、K247C、K247L、H248C、H248L、H248W、S254Q、D258N、T282S/R308L/E342W/G364A/S449R、T282S/R308L/S449R、V365I、D389A、D389E、D389S、L401F/E402L、D416L、D416S、A427K、A427R、L429W、K432L、A433LおよびS456Rから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号5976を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6016、6018、6020、6022、6024、6026、6028、6030、6032、6034、6036、6038、6040、6042、6044、6046、6048、6050、6052、6054、6056、6058、6060、6062、6064、6066、6068、6070、6072、6074、6076、6078、6080、6082、6084、6086、6088、6090、6092、6094、6096、6098、6100、6102、6104、6106、6108、6110、6112、6114、6116、6118、6120、6122、6124、6126、6128、6130、6132、6134、6136、6138、6140、6142、6144、6146、6148、6150、6152、6154、6156、6158、6160、6162、6164、6166、6168、6170、6172、6174、6176、6178、6180、6182、6184、6186、6188、6190、6192、6194、6196、6198、6200、6202、6204、6206、6208、6210、6212、6214、6216、6218、6220、6222、6224、6226、6228、6230、6232、6234、6236、6238、6240、6242、6244、6246、6248、6250、6252、6254、6256、6258および6260のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6016、6018、6020、6022、6024、6026、6028、6030、6032、6034、6036、6038、6040、6042、6044、6046、6048、6050、6052、6054、6056、6058、6060、6062、6064、6066、6068、6070、6072、6074、6076、6078、6080、6082、6084、6086、6088、6090、6092、6094、6096、6098、6100、6102、6104、6106、6108、6110、6112、6114、6116、6118、6120、6122、6124、6126、6128、6130、6132、6134、6136、6138、6140、6142、6144、6146、6148、6150、6152、6154、6156、6158、6160、6162、6164、6166、6168、6170、6172、6174、6176、6178、6180、6182、6184、6186、6188、6190、6192、6194、6196、6198、6200、6202、6204、6206、6208、6210、6212、6214、6216、6218、6220、6222、6224、6226、6228、6230、6232、6234、6236、6238、6240、6242、6244、6246、6248、6250、6252、6254、6256、6258および6260のいずれかを含む。
本発明はまた、操作されたグリコシルトランスフェラーゼであって、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列が、14/113/158、14/113/158/163、14/113/158/163/190/257/308/342、14/113/158/163/437、14/113/158/308/317/330/449、14/113/163/190/308/317、14/113/163/257/308/342/437/449、14/113/163/257/437、14/113/163/308/317/320/322/330/449、14/113/320/437/449、14/158、14/158/163/190/257/308/317/330/437、14/158/163/190/342/437、14/158/163/257、14/158/163/257/308/449、14/158/257/308/437/449、14/158/317/320/330/437、14/163/317/320、14/190、14/190/257/317/320/322、14/257/308/320/322/330、14/257/308/322/330/437、14/317、14/330、14/449、19、29/375、41、45、46、71、72、80、81、83、84、85、88、95、105、113/158/163/190/257/437、113/158/163/190/308/317/322、113/158/163/190/308/320、113/158/163/257/308/317/322/437/449、113/158/190/257/320、113/158/190/320/322/449、113/158/320/322/437、113/257/308、113/257/317/322/437、155、158/163、158/163/190/257/308/342/449、158/163/308、158/163/322/437、158/308/320/437、158/320/437/449、163/308/330/437/449、168、190/449、197、199、202、209、243、249、263、273、317/320/322/330、322/330、366、375および383から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置が、配列番号6138を参照して番号付けられている、操作されたグリコシルトランスフェラーゼも提供する。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、14I/113S/158P、14I/113S/158P/163A、14I/113S/158P/163A/190R/257Q/308L/342W、14I/113S/158P/163A/437I、14I/113S/158P/308L/317R/330D/449R、14I/113S/163A/190R/308L/317R、14I/113S/163A/257Q/308L/342W/437I/449R、14I/113S/163A/257Q/437I、14I/113S/163A/308L/317R/320I/322L/330D/449R、14I/113S/320I/437I/449R、14I/158P、14I/158P/163A/190R/257Q/308L/317R/330D/437I、14I/158P/163A/190R/342W/437I、14I/158P/163A/257Q、14I/158P/163A/257Q/308L/449R、14I/158P/257Q/308L/437I/449R、14I/158P/317R/320I/330D/437I、14I/163A/317R/320I、14I/190R、14I/190R/257Q/317R/320I/322L、14I/257Q/308L/320I/322L/330D、14I/257Q/308L/322L/330D/437I、14I/317R、14I/330D、14I/449R、19Q、29M/375P、41A、45L、46S、71V、72S、72T、80P、81T、83A、83K、83N、83S、83T、84D、84H、84N、85L、88A、88C、88H、88K、88T、95N、105A、113S/158P/163A/190R/257Q/437I、113S/158P/163A/190R/308L/317R/322L、113S/158P/163A/190R/308L/320I、113S/158P/163A/257Q/308L/317R/322L/437I/449R、113S/158P/190R/257Q/320I、113S/158P/190R/320I/322L/449R、113S/158P/320I/322L/437I、113S/257Q/308L、113S/257Q/317R/322L/437I、155L、158P/163A、158P/163A/190R/257Q/308L/342W/449R、158P/163A/308L、158P/163A/322L/437I、158P/308L/320I/437I、158P/320I/437I/449R、163A/308L/330D/437I/449R、168C、168T、190R/449R、197K、199E、199H、199M、199Q、199Y、202H、202Q、202T、202V、209T、243I、249S、263T、273A、273H、273R、317R/320I/322L/330D、322L/330D、366C、366L、366S、366T、366V、375A、375P、375T、375Vおよび383Vから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6138を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、V14I/E113S/D158P、V14I/E113S/D158P/L163A、V14I/E113S/D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/E342W、V14I/E113S/D158P/L163A/L437I、V14I/E113S/D158P/R308L/S317R/E330D/S449R、V14I/E113S/L163A/K190R/R308L/S317R、V14I/E113S/L163A/L257Q/R308L/E342W/L437I/S449R、V14I/E113S/L163A/L257Q/L437I、V14I/E113S/L163A/R308L/S317R/V320I/P322L/E330D/S449R、V14I/E113S/V320I/L437I/S449R、V14I/D158P、V14I/D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/S317R/E330D/L437I、V14I/D158P/L163A/K190R/E342W/L437I、V14I/D158P/L163A/L257Q、V14I/D158P/L163A/L257Q/R308L/S449R、V14I/D158P/L257Q/R308L/L437I/S449R、V14I/D158P/S317R/V320I/E330D/L437I、V14I/L163A/S317R/V320I、V14I/K190R、V14I/K190R/L257Q/S317R/V320I/P322L、V14I/L257Q/R308L/V320I/P322L/E330D、V14I/L257Q/R308L/P322L/E330D/L437I、V14I/S317R、V14I/E330D、V14I/S449R、V19Q、L29M/D375P、S41A、F45L、H46S、Q71V、D72S、D72T、T80P、H81T、P83A、P83K、P83N、P83S、P83T、G84D、G84H、G84N、A85L、R88A、R88C、R88H、R88K、R88T、H95N、E105A、E113S/D158P/L163A/K190R/L257Q/L437I、E113S/D158P/L163A/K190R/R308L/S317R/P322L、E113S/D158P/L163A/K190R/R308L/V320I、E113S/D158P/L163A/L257Q/R308L/S317R/P322L/L437I/S449R、E113S/D158P/K190R/L257Q/V320I、E113S/D158P/K190R/V320I/P322L/S449R、E113S/D158P/V320I/P322L/L437I、E113S/L257Q/R308L、E113S/L257Q/S317R/P322L/L437I、V155L、D158P/L163A、D158P/L163A/K190R/L257Q/R308L/E342W/S449R、D158P/L163A/R308L、D158P/L163A/P322L/L437I、D158P/R308L/V320I/L437I、D158P/V320I/L437I/S449R、L163A/R308L/E330D/L437I/S449R、P168C、P168T、K190R/S449R、Q197K、A199E、A199H、A199M、A199Q、A199Y、I202H、I202Q、I202T、I202V、E209T、L243I、Y249S、V263T、S273A、S273H、S273R、S317R/V320I/P322L/E330D、P322L/E330D、A366C、A366L、A366S、A366T、A366V、D375A、D375P、D375T、D375VおよびN383Vから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6138を参照して番号付けられている。
および421から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6288を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、5S/449R、6P、10K、25I/449R、25M/449R、25Q/449R、25S、69A、69M/449R、87A/449R、87E、87K、87Q、87R、91L、91N/449R、91Q、91T/449R、91V、144Q/449R、153T/449R、153V、159K、159R/449R、172S、172T/449R、212L/449R、233A、233C、233G、233L/449R、233M/449R、233Q/449R、233R、233S、233V、288P/449R、303C、303V、317Y、347P/449R、361C、369Kおよび421Iから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6288を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、T5S/S449R、E6P、R10K、L25I/S449R、L25M/S449R、L25Q/S449R、L25S、D69A、D69M/S449R、M87A/S449R、M87E、M87K、M87Q、M87R、I91L、I91N/S449R、I91Q、I91T/S449R、I91V、M144Q/S449R、A153T/S449R、A153V、Q159K、Q159R/S449R、H172S、H172T/S449R、A212L/S449R、W233A、W233C、W233G、W233L/S449R、W233M/S449R、W233Q/S449R、W233R、W233S、W233V、E288P/S449R、Q303C、Q303V、S317Y、K347P/S449R、T361C、V369KおよびV421Iから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6288を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6462、6464、6466、6468、6470、6472、6474、6476、6478、6480、6482、6484、6486、6488、6490、6492、6494、6496、6498、6500、6502、6504、6506、6508、6510、6512、6514、6516、6518、6520、6522、6524、6526、6528、6530、6532、6534、6536、6538、6540、6542、6544、6546、6548、6550、6552、6554、6556、6558、6560、6562、6564、6566、6568、6570、6572、6574、6576、6578、6580、6582、6584、6586、6588、6590、6592、6594、6596、6598、6600、6602、6604、6606、6608、6610、6612、6614、6616、6618、6620、6622、6624、6626、6628、6630、6632、6634、6636、6638、6640、6642、6644、6646、6648、6650、6652、6654、6656、6658、6660、6662、6664、6666、6668、6670、6672、6674および6676のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6462、6464、6466、6468、6470、6472、6474、6476、6478、6480、6482、6484、6486、6488、6490、6492、6494、6496、6498、6500、6502、6504、6506、6508、6510、6512、6514、6516、6518、6520、6522、6524、6526、6528、6530、6532、6534、6536、6538、6540、6542、6544、6546、6548、6550、6552、6554、6556、6558、6560、6562、6564、6566、6568、6570、6572、6574、6576、6578、6580、6582、6584、6586、6588、6590、6592、6594、6596、6598、6600、6602、6604、6606、6608、6610、6612、6614、6616、6618、6620、6622、6624、6626、6628、6630、6632、6634、6636、6638、6640、6642、6644、6646、6648、6650、6652、6654、6656、6658、6660、6662、6664、6666、6668、6670、6672、6674および6676のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6462、6464、6466、6468、6470、6472、6474、6476、6478、6480、6482、6484、6486、6488、6490、6492、6494、6496、6498、6500、6502、6504、6506、6508、6510、6512、6514、6516、6518、6520、6522、6524、6526、6528、6530、6532、6534、6536、6538、6540、6542、6544、6546、6548、6550、6552、6554、6556、6558、6560、6562、6564、6566、6568、6570、6572、6574、6576、6578、6580、6582、6584、6586、6588、6590、6592、6594、6596、6598、6600、6602、6604、6606、6608、6610、6612、6614、6616、6618、6620、6622、6624、6626、6628、6630、6632、6634、6636、6638、6640、6642、6644、6646、6648、6650、6652、6654、6656、6658、6660、6662、6664、6666、6668、6670、6672、6674および6676のいずれかを含む。
243I/331K/365I/366C/429W/432L、45L/84N/168T/190R/199Q/254A/273R/365I/366C、45L/163A/168T/190R/199Q/366C/429W/432L、45L/163A/168T/197K/263T/331K/365I/366C、72T/81T/83S/84N/88T/155L/163A/168T/190R/366C、72T/81T/83S/84N/88T/155L/190R、72T/81T/83S/84N/88T/155L/190R/273R/331K/366V/432L、72T/81T/83S/84N/88T/155L/273R/331K/375P、72T/81T/83S/84N/88T/155L/366C、72T/81T/83S/84N/88T/163A/168T/190R/243I/263T/331K/366C、72T/81T/83S/84N/88T/163A/168T/263T/331K/375P、72T/81T/84N/190R/248W、72T/83S/84N/88T/202H/254A/273R/366C/375P、72T/83S/84N/197K/202H/243I/263T/365I/366C、72T/83S/88T/243I/263T/331K/365I/366C、72T/155L/163A/168T/190R/366V/432L/433A、72T/155L/190R、72T/155L/190R/263T/331K/366C、72T/155L/190R/366C、72T/155L/273R/331K/375P/432L、72T/243I/248W/263T/366V/432L/433A、72T/243I/248W/273R/366V/432L/433A、72T/243I/248W/366V/432L/433A、72T/248W、81T/83S/84N/88T/155L/163A/168T/273R/331K/375P、81T/83S/84N/88T/155L/190R/263T/331K/366C、81T/83S/84N/88T/155L/263T/366V/375P、81T/83S/84N/88T/155L/366C、81T/83S/84N/88T/190R/263T/375P、81T/83S/84N/88T/263T/273R/331K/366C/432L、81T/83S/169D/190R/263T、81T/83S/190R/263T/365I/366C、81T/83S/202H/365I/366C/402L、81T/88T/375P/402L、83S/88T/155L/273R/366V/375P、84N/155L/168T/197K/199Q/331K/366V/375P/383V/402L、84N/168T/197K/202H/263T/366C、84N/197K/366C/402L、155L/168T/190R/197K/199Q/366C、155L/168T/375P、155L/263T/366C/432L/433A、190R/199Q/202H/331K/366C、197K/199Q/202H、197K/202H/248W、197K/248W、199Q/263T/331K/365I/366C、248W/375P、365I/366Cおよび365I/375P/402Lから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6468を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/K190R/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/S273R/R331K/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/R331K/A366C/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/H248W/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/R331K/A366V/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/R88T/V155L/P168T/K190R/R331K/A366C/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/R88T/V155L/P168T/K190R/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/R88T/K190R/V263T/S273R/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/K190R/L243I/V263T/S273R/R331K/A366C/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/L243I/H248W/S273R/R331K/A366V/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/P168T/V263T/A366C/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/L163A/R331K/A366C/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/L243I/H248W/S273R/R331K/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/H248W/V263T/R331K、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/S273R/R331K/A366V/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/S273R/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/K190R/S273R/A366C/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/H248W/V263T/S273R/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/V263T/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/V263T/D375P、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/S273R/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V155L/R331K/A366V/D375P/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/V263T/S273R/R331K、S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/K190R/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V263T/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/D72T/V263T/A366C/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/D72T/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/P168T/K190R/L243I/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/P168T/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/S273R/R331K/A366C、S37R/S41A/F45L/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/V263T/S273R/R331K/A366C/D375P、S37R/S41A/F45L/V155L/L163A/P168T/V263T/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/V155L/P168T/H248W/S273R/R331K/D375P、S37R/S41A/F45L/V155L/K190R/R331K/A366V/D375P、S37R/S41A/F45L/V155L/A366C、S37R/S41A/F45L/V155L/A366C/K432L/L433A、S37R/S41A/F45L/V155L/D375P、S37R/S41A/F45L/L243I/H248W/S273R/R331K、S37R/S41A/F45L/V263T/R331K/D375P/K432L、S37R/S41A/F45L/R331K/A366V/K432L/L433A、S37R/D72T/H81T/P83S/R88T/V155L/K190R、S37R/D72T/Q197K/S273R/R331K/D375P/K432L、S37R/P83S/V263T/V365I/A366V/D375P、S37R/K190R/I202H、S41A/F45L/D72T/V155L/V263T/R331K/A366V/D375P/K432L/L433A、S41A/F45L/L163A/P168T/L243I/H248W/S273R/A366C/K432L、F45L/D72T/G84N/R88T/Q197K/D375P、F45L/D72T/R88T/A366C、F45L/D72T/L163A/I202H/V365I/A366V/D375P、F45L/D72T/P168T/L243I/R331K/V365I/A366C/L429W/K432L、F45L/G84N/P168T/K190R/A199Q/S254A/S273R/V365I/A366C、F45L/L163A/P168T/K190R/A199Q/A366C/L429W/K432L、F45L/L163A/P168T/Q197K/V263T/R331K/V365I/A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/K190R/A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R/S273R/R331K/A366V/K432L、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/S273R/R331K/D375P、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/K190R/L243I/V263T/R331K/A366C、D72T/H81T/P83S/G84N/R88T/L163A/P168T/V263T/R331K/D375P、D72T/H81T/G84N/K190R/H248W、D72T/P83S/G84N/R88T/I202H/S254A/S273R/A366C/D375P、D72T/P83S/G84N/Q197K/I202H/L243I/V263T/V365I/A366C、D72T/P83S/R88T/L243I/V263T/R331K/V365I/A366C、D72T/V155L/L163A/P168T/K190R/A366V/K432L/L433A、D72T/V155L/K190R、D72T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C、D72T/V155L/K190R/A366C、D72T/V155L/S273R/R331K/D375P/K432L、D72T/L243I/H248W/V263T/A366V/K432L/L433A、D72T/
L243I/H248W/S273R/A366V/K432L/L433A、D72T/L243I/H248W/A366V/K432L/L433A、D72T/H248W、H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/L163A/P168T/S273R/R331K/D375P、H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/K190R/V263T/R331K/A366C、H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/V263T/A366V/D375P、H81T/P83S/G84N/R88T/V155L/A366C、H81T/P83S/G84N/R88T/K190R/V263T/D375P、H81T/P83S/G84N/R88T/V263T/S273R/R331K/A366C/K432L、H81T/P83S/E169D/K190R/V263T、H81T/P83S/K190R/V263T/V365I/A366C、H81T/P83S/I202H/V365I/A366C/E402L、H81T/R88T/D375P/E402L、P83S/R88T/V155L/S273R/A366V/D375P、G84N/V155L/P168T/Q197K/A199Q/R331K/A366V/D375P/N383V/E402L、G84N/P168T/Q197K/I202H/V263T/A366C、G84N/Q197K/A366C/E402L、V155L/P168T/K190R/Q197K/A199Q/A366C、V155L/P168T/D375P、V155L/V263T/A366C/K432L/L433A、K190R/A199Q/I202H/R331K/A366C、Q197K/A199Q/I202H、Q197K/I202H/H248W、Q197K/H248W、A199Q/V263T/R331K/V365I/A366C、H248W/D375P、V365I/A366CおよびV365I/D375P/E402Lから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6468を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、2、3、4、9、53/437、61、64、72/170、72/405、94、96、98、113、118、118/120、120、129、134/158、158、165、170、171、173、183、193、214、214/222、222、226、229、234、253、265、269、272、289、296、300、302、304、322、322/407、330、390、395/439、396、398、399、403、405、408、411、412、423、428、434、435、438、439、442、444、448、449、452および454から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6468を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、2F、2H、2K、2M、2Q、2R、2V、3F、3L、3M、4N、4S、9A、9G、9K、9M、9S、53E/437T、61Q、64L、64M、72E/170A、72E/405S、94R、96C、96K、98E、98S、98T、113D、113G、113P、118C、118T/120V、118V、120V、129P、134E/158N、158T、165L、170A、170G、170H、170P、170V、171A、171L、171P、171Q、173I、173K、173L、173S、183I、183L、183P、193F、214K、214R、214R/222H、222A、222N、222Q、222R、226S、229M、229Q、234N、234S、234T、253D、253E、253N、253P、253T、253V、265H、269L、269M、269N、269R、272S、289D、289G、289N、289R、296Q、300A、300E、302G、304K、304P、322A、322G、322K、322P、322P/407I、322S、322T、322V/407I、330S、390I、390R、395I/439V、396T、396V、398S、399P、399Q、399S、403V、405A、405D、405P、405S、405T、408D、408K、408S、411H、411K、411T、412K、423T、428E、428G、428I、428L、428N、428Q、428R、428S、428T、428V、428Y、434E、434G、435A、435D、435E、435G、435I、435K、435L、435N、435S、435V、435Y、438E、438R、438S、439A、439E、439G、439H、439M、439R、439W、442F、442T、444A、448K、448Q、449G、449L、449S、452Tおよび454Vから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6468を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、P2F、P2H、P2K、P2M、P2Q、P2R、P2V、N3F、N3L、N3M、T4N、T4S、V9A、V9G、V9K、V9M、V9S、K53E/I437T、S61Q、F64L、F64M、D72E/D170A、D72E/E405S、K94R、G96C、G96K、D98E、D98S、D98T、S113D、S113G、S113P、A118C、A118T/L120V、A118V、L120V、A129P、D134E/P158N、P158T、Y165L、D170A、D170G、D170H、D170P、D170V、K171A、K171L、K171P、K171Q、R173I、R173K、R173L、R173S、M183I、M183L、M183P、Y193F、S214K、S214R、S214R/K222H、K222A、K222N、K222Q、K222R、E226S、L229M、L229Q、R234N、R234S、R234T、S253D、S253E、S253N、S253P、S253T、S253V、Q265H、Q269L、Q269M、Q269N、Q269R、P272S、K289D、K289G、K289N、K289R、R296Q、D300A、D300E、K302G、S304K、S304P、L322A、L322G、L322K、L322P、L322P/V407I、L322S、L322T、L322V/V407I、E330S、V390I、V390R、V395I/P439V、Y396T、Y396V、E398S、N399P、N399Q、N399S、R403V、E405A、E405D、E405P、E405S、E405T、N408D、N408K、N408S、R411H、R411K、R411T、R412K、R423T、K428E、K428G、K428I、K428L、K428N、K428Q、K428R、K428S、K428T、K428V、K428Y、D434E、D434G、R435A、R435D、R435E、R435G、R435I、R435K、R435L、R435N、R435S、R435V、R435Y、A438E、A438R、A438S、P439A、P439E、P439G、P439H、P439M、P439R、P439W、S442F、S442T、Y444A、E448K、E448Q、R449G、R449L、R449S、S452TおよびI454Vから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号6468を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198、7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212および7214のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198,7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212および7214のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号6678、6680、6682、6684、6686、6688、6690、6692、6694、6696、6698、6700、6702、6704、6706、6708、6710、6712、6714、6716、6718、6720、6722、6724、6726、6728、6730、6732、6734、6736、6738、6740、6742、6744、6746、6748、6750、6752、6754、6756、6758、6760、6762、6764、6766、6768、6770、6772、6774、6776、6778、6780、6782、6784、6786、6788、6790、6792、6794、6796、6798、6800、6802、6804、6806、6808、6810、6812、6814、6816、6818、6820、6822、6824、6826、6828、6830、6832、6834、6836、6838、6840、6842、6844、6846、6848、6850、6852、6854、6856、6858、6860、6862、6864、6866、6868、6870、6872、6874、6876、6878、6880、6882、6884、6886、6888、6890、6892、6894、6896、6898、6900、6902、6904、6906、6908、6910、6912、6914、6916、6918、6920、6922、6924、6926、6928、6930、6932、6934、6936、6938、6940、6942、6944、6946、6948、6950、6952、6954、6956、6958、6960、6962、6964、6966、6968、6970、6972、6974、6976、6978、6980、6982、6984、6986、6988、6990、6992、6994、6996、6998、7000、7002、7004、7006、7008、7010、7012、7014、7016、7018、7020、7022、7024、7026、7028、7030、7032、7034、7036、7038、7040、7042、7044、7046、7048、7050、7052、7054、7056、7058、7060、7062、7064、7066、7068、7070、7072、7074、7076、7078、7080、7082、7084、7086、7088、7090、7092、7094、7096、7098、7100、7102、7104、7106、7108、7110、7112、7114、7116、7118、7120、7122、7124、7126、7128、7130、7132、7134、7136、7138、7140、7142、7144、7146、7148、7150、7152、7154、7156、7158、7160、7162、7164、7166、7168、7170、7172、7174、7176、7178、7180、7182、7184、7186、7188、7190、7192、7194、7196、7198,7200、7202、7204、7206、7208、7210、7212および7214のいずれかを含む。
K428I/I437L、D300A/Q303V/R308L、D300A/R308L/E405P/R411T、R308LおよびL322Sから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号7388を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、41、56、61、72、76、87、88、107、139、156、338、および407から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号7388を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、41E、56D、61D、61E、72P、76S、87E、88L、88M、107L、107V、139N、156S、338V、および407Tから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号7388を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、A41E、L56D、S61D、S61E、T72P、R76S、M87E、R88L、R88M、A107L、A107V、K139N、C156S、C338V、およびV407Tから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号7388を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366および8368のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366および8368のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7946、7948、7950、7952、7954、7956、7958、7960、7962、7964、7966、7968、7970、7972、7974、7976、7978、7980、7982、7984、7986、7988、7990、7992、7994、7996、7998、8000、8002、8004、8006、8008、8010、8012、8014、8016、8018、8020、8022、8024、8026、8028、8030、8032、8034、8036、8038、8040、8042、8044、8046、8048、8050、8052、8054、8056、8058、8060、8062、8064、8066、8068、8070、8072、8074、8076、8078、8080、8082、8084、8086、8088、8090、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366および8368のいずれかを含む。
9234、9236、9238および9240のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号8482、8484、8486、8488、8490、8492、8494、8496、8498、8500、8502、8504、8506、8508、8510、8512、8514、8516、8518、8520、8522、8524、8526、8528 ,8530 ,8532、8534、8536、8538 ,8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238および9240のいずれかを含む。
160/161/198、121/126/128/161/369、126/128/155/160/161、126/128/155/160/161/199、126/128/155/161/199、126/128/160/161/369、126/128/160/198/369、126/128/160/199/369、126/128/160/369、126/128/161/199/369、126/128/161/369、126/128/369、126/160/161/199/369、126/160/198/369、126/196/198/369、126/198/369、126/199/369、126/369、128/155/160/161、128/155/160/161/199、128/155/160/198、128/155/199、128/160/161/369、128/161/199/369、128/198/199/369、128/199/369、128/369、155/161/198/199、155/199、160/161/369、161/198/369、161/369および199/369から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3082を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、20Y/126H/128A/155R/161T、20Y/126H/128A/161T、20Y/126H/155R/160S/198P、20Y/126H/160S、20Y/126H/160S/161T、20Y/126Q/128A/160S/161T、20Y/126Q/128A/160S/161T/198H、20Y/126Q/128A/161T/198H/199A、20Y/126Q/155R/161G、20Y/126Q/161G、20Y/128A/155R/160S/161T/198H、20Y/128A/155R/161T/199A、20Y/128A/155R/199A、20Y/128A/160S/161T/198P、20Y/155R/160S、20Y/155R/160S/161G、20Y/155R/161T、20Y/155R/161T/199A、20Y/160S/161T/198H、121F/126H/128A/161T/369N、126H/128A/155R/160S/161T、126H/128A/160S/198H/369N、126H/128A/161G/199A/369N、126H/128A/161G/369N、126H/128A/369N、126H/160S/161G/199A/369N、126H/160S/198P/369N、126H/196V/198P/369N、126Q/128A/155R/160S/161T/199A、126Q/128A/155R/161G/199A、126Q/128A/160S/161T/369N、126Q/128A/160S/199A/369N、126Q/128A/160S/369N、126Q/198P/369N、126Q/199A/369N、126Q/369N、128A/155R/160S/161T、128A/155R/160S/161T/199A、128A/155R/160S/198P、128A/155R/199A、128A/160S/161G/369N、128A/161G/199A/369N、128A/198H/199A/369N、128A/199A/369N、128A/369N、155R/161G/198H/199A、155R/199A、160S/161G/369N、160S/161T/369N、161T/198P/369N、161T/369Nおよび199A/369Nから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3082を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、W20Y/L126H/P128A/F155R/R161T、W20Y/L126H/P128A/R161T、W20Y/L126H/F155R/K160S/G198P、W20Y/L126H/K160S、W20Y/L126H/K160S/R161T、W20Y/L126Q/P128A/K160S/R161T、W20Y/L126Q/P128A/K160S/R161T/G198H、W20Y/L126Q/P128A/R161T/G198H/N199A、W20Y/L126Q/F155R/R161G、W20Y/L126Q/R161G、W20Y/P128A/F155R/K160S/R161T/G198H、W20Y/P128A/F155R/R161T/N199A、W20Y/P128A/F155R/N199A、W20Y/P128A/K160S/R161T/G198P、W20Y/F155R/K160S、W20Y/F155R/K160S/R161G、W20Y/F155R/R161T、W20Y/F155R/R161T/N199A、W20Y/K160S/R161T/G198H、V121F/L126H/P128A/R161T/P369N、L126H/P128A/F155R/K160S/R161T、L126H/P128A/K160S/G198H/P369N、L126H/P128A/R161G/N199A/P369N、L126H/P128A/R161G/P369N、L126H/P128A/P369N、L126H/K160S/R161G/N199A/P369N、L126H/K160S/G198P/P369N、L126H/A196V/G198P/P369N、L126Q/P128A/F155R/K160S/R161T/N199A、L126Q/P128A/F155R/R161G/N199A、L126Q/P128A/K160S/R161T/P369N、L126Q/P128A/K160S/N199A/P369N、L126Q/P128A/K160S/P369N、L126Q/G198P/P369N、L126Q/N199A/P369N、L126Q/P369N、P128A/F155R/K160S/R161T、P128A/F155R/K160S/R161T/N199A、P128A/F155R/K160S/G198P、P128A/F155R/N199A、P128A/K160S/R161G/P369N、P128A/R161G/N199A/P369N、P128A/G198H/N199A/P369N、P128A/N199A/P369N、P128A/P369N、F155R/R161G/G198H/N199A、F155R/N199A、K160S/R161G/P369N、K160S/R161T/P369N、R161T/G198P/P369N、R161T/P369NおよびN199A/P369Nから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3082を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3182、3184、3186、3188、3190、3192、3194、3196、3198、3200、3202、3204、3206、3208、3210、3212、3214、3216、3218、3220、3222、3224、3226、3228、3230、3232、3234、3236、3238、3240、3242、3244、3246、3248、3250、3252、3254、3256、3258、3260、3262、3264、3266、3268、3270、3272、3274、3276、3278、3280、3282、3284、3286、3288、3290、3292、3294、3296、3298、3300、3302、3304、3306、3308、3310、3312、3314、3316、3318、3320、3322、3324、3326、3328、3330、3332、3334、3336、3338、3340、3342、3344、3346、3348、3350、3352、3354、3356、3358、3360、3362、3364、3366、3368、3370、3372、3374、3376、3378、3380、3382、3384、3386、3388、3390、3392、3394、3396、3398、3400、3402、3404、3406、3408、3410、3412、3414、3416、3418、3420、3422、3424、3426、3428、3430、3432、3434、3436、3438、3440、3442、3444、3446、3448、3450、3452、3454、3456、3458、3460、3462、3464、3466、3468、3470、
3472、3474、3476、3478、3480、3482、3484、3486、3488および3490のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3182、3184、3186、3188、3190、3192、3194、3196、3198、3200、3202、3204、3206、3208、3210、3212、3214、3216、3218、3220、3222、3224、3226、3228、3230、3232、3234、3236、3238、3240、3242、3244、3246、3248、3250、3252、3254、3256、3258、3260、3262、3264、3266、3268、3270、3272、3274、3276、3278、3280、3282、3284、3286、3288、3290、3292、3294、3296、3298、3300、3302、3304、3306、3308、3310、3312、3314、3316、3318、3320、3322、3324、3326、3328、3330、3332、3334、3336、3338、3340、3342、3344、3346、3348、3350、3352、3354、3356、3358、3360、3362、3364、3366、3368、3370、3372、3374、3376、3378、3380、3382、3384、3386、3388、3390、3392、3394、3396、3398、3400、3402、3404、3406、3408、3410、3412、3414、3416、3418、3420、3422、3424、3426、3428、3430、3432、3434、3436、3438、3440、3442、3444、3446、3448、3450、3452、3454、3456、3458、3460、3462、3464、3466、3468、3470、3472、3474、3476、3478、3480、3482、3484、3486、3488および3490のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3182、3184、3186、3188、3190、3192、3194、3196、3198、3200、3202、3204、3206、3208、3210、3212、3214、3216、3218、3220、3222、3224、3226、3228、3230、3232、3234、3236、3238、3240、3242、3244、3246、3248、3250、3252、3254、3256、3258、3260、3262、3264、3266、3268、3270、3272、3274、3276、3278、3280、3282、3284、3286、3288、3290、3292、3294、3296、3298、3300、3302、3304、3306、3308、3310、3312、3314、3316、3318、3320、3322、3324、3326、3328、3330、3332、3334、3336、3338、3340、3342、3344、3346、3348、3350、3352、3354、3356、3358、3360、3362、3364、3366、3368、3370、3372、3374、3376、3378、3380、3382、3384、3386、3388、3390、3392、3394、3396、3398、3400、3402、3404、3406、3408、3410、3412、3414、3416、3418、3420、3422、3424、3426、3428、3430、3432、3434、3436、3438、3440、3442、3444、3446、3448、3450、3452、3454、3456、3458、3460、3462、3464、3466、3468、3470、3472、3474、3476、3478、3480、3482、3484、3486、3488および3490のいずれかを含む。
3646、3648、3650および3652のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3492、3494、3496、3498、3500、3502、3504、3506、3508、3510、3512、3514、3516、3518、3520、3522、3524、3526、3528、3530、3532、3534、3536、3538、3540、3542、3544、3546、3548、3550、3552、3554、3556、3558、3560、3562、3564、3566、3568、3570、3572、3574、3576、3578、3580、3582、3584、3586、3588、3590、3592、3594、3596、3598、3600、3602、3604、3606、3608、3610、3612、3614、3616、3618、3620、3622、3624、3626、3628、3630、3632、3634、3636、3638、3640、3642、3644、3646、3648、3650および3652のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3492、3494、3496、3498、3500、3502、3504、3506、3508、3510、3512、3514、3516、3518、3520、3522、3524、3526、3528、3530、3532、3534、3536、3538、3540、3542、3544、3546、3548、3550、3552、3554、3556、3558、3560、3562、3564、3566、3568、3570、3572、3574、3576、3578、3580、3582、3584、3586、3588、3590、3592、3594、3596、3598、3600、3602、3604、3606、3608、3610、3612、3614、3616、3618、3620、3622、3624、3626、3628、3630、3632、3634、3636、3638、3640、3642、3644、3646、3648、3650および3652のいずれかを含む。
223、223/243、235、237、239、240、243、244、248、249、301、323、330、352、364、426、および427から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3696を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、3N、8R、8V、50P、50V、61N、61Y、62A、101L、137R、158W、161L、164A、164E、164F、164L、176P、176Q、176T、193F、223A、223L/243G、235R、237A、237L、239F、239G、239M、239P、239Q、239Y、240V、243G、243H、243R、243S、243Y、244N、248T、249G、249H、301A、323T、330C、352A、364Q、426L、427Sおよび427Tから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3696を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、H3N、S8R、S8V、I50P、I50V、E61N、E61Y、K62A、A101L、Q137R、F158W、R161L、H164A、H164E、H164F、H164L、R176P、R176Q、R176T、D193F、T223A、T223L/D243G、Q235R、P237A、P237L、T239F、T239G、T239M、T239P、T239Q、T239Y、E240V、D243G、D243H、D243R、D243S、D243Y、D244N、I248T、D249G、D249H、Q301A、D323T、H330C、S352A、M364Q、A426L、R427SおよびR427Tから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3696を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3900、3902、3904、3906、3908、3910、3912、3914、3916、3918、3920、3922、3924、3926、3928、3930、3932、3934、3936、3938、3940、3942、3944、3946、3948、3950、3952、3954、3956、3958、3960、3962、3964、3966、3968、3970、3972、3974、3976、3978、3980、3982、3984、3986、3988、3990、3992、3994、3996、3998、4000、4002、4004、4006、4008、4010、4012、4014、4016、4018、4020、4022、4024、4026、4028、4030、4032、4034、4036、4038、4040、4042、4044、4046、4048、4050、4052、4054、4056、4058、4060、4062、4064、4066、4068、4070、4072、4074、4076、4078、4080、4082、4084、4086、4088、4090、4092、4094、4096、4098、4100、4102、4104、4106、4108、4110、4112、4114、4116、4118、4120、4122、4124、4126、4128、4130、4132、4134、4136、4138、4140、4142、4144および4146のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3900、3902、3904、3906、3908、3910、3912、3914、3916、3918、3920、3922、3924、3926、3928、3930、3932、3934、3936、3938、3940、3942、3944、3946、3948、3950、3952、3954、3956、3958、3960、3962、3964、3966、3968、3970、3972、3974、3976、3978、3980、3982、3984、3986、3988、3990、3992、3994、3996、3998、4000、4002、4004、4006、4008、4010、4012、4014、4016、4018、4020、4022、4024、4026、4028、4030、4032、4034、4036、4038、4040、4042、4044、4046、4048、4050、4052、4054、4056、4058、4060、4062、4064、4066、4068、4070、4072、4074、4076、4078、4080、4082、4084、4086、4088、4090、4092、4094、4096、4098、4100、4102、4104、4106、4108、4110、4112、4114、4116、4118、4120、4122、4124、4126、4128、4130、4132、4134、4136、4138、4140、4142、4144および4146のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号3900、3902、3904、3906、3908、3910、3912、3914、3916、3918、3920、3922、3924、3926、3928、3930、3932、3934、3936、3938、3940、3942、3944、3946、3948、3950、3952、3954、3956、3958、3960、3962、3964、3966、3968、3970、3972、3974、3976、3978、3980、3982、3984、3986、3988、3990、3992、3994、3996、3998、4000、4002、4004、4006、4008、4010、4012、4014、4016、4018、4020、4022、4024、4026、4028、4030、4032、4034、4036、4038、4040、4042、4044、4046、4048、4050、4052、4054、4056、4058、4060、4062、4064、4066、4068、4070、4072、4074、4076、4078、4080、4082、4084、4086、4088、4090、4092、4094、4096、4098、4100、4102、4104、4106、4108、4110、4112、4114、4116、4118、4120、4122、4124、4126、4128、4130、4132、4134、4136、4138、4140、4142、4144および4146のいずれかを含む。
11L、12I、12L、41H、44H、44S/187T、45Y、55A、55G、55L、56R、57G、57H、57P、65C、65G、65P、65Q、65R、66L、70W、72V、73H、73S、74M/238V、82S、83R、85W、103H、103Q、111F、113S、114G、114I、117N、117S、132G、135E、138K、138S、138T、140C、140G、159N、160D、160Q、160T、162L、167L、182I、182L、182Q、182T、182V、182Y、214H、214T、220G、220S、222F、223D、226Q、236L、236T、236V、238A、238G、238I、238R、238S、238T、256R、286G、299V、309P、309R、309S、309T、387P、387Q、387R、388A、388S、389A、389G、389L、389V、391A、391L、391S、391V、393P、393T、406G、406S、408L、408T、412G、412R、418A、418H、418M、422L、429D、430P、449G、449H、449L、449R、449S、450Nおよび450Vから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3956を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Q11D、Q11L、T12I、T12L、F41H、Y44H、Y44S/K187T、L45Y、I55A、I55G、I55L、K56R、K57G、K57H、K57P、N65C、N65G、N65P、N65Q、N65R、S66L、V70W、L72V、P73H、P73S、L74M/M238V、P82S、H83R、H85W、K103H、K103Q、K111F、L113S、Q114G、Q114I、K117N、K117S、Q132G、L135E、G138K、G138S、G138T、P140C、P140G、L159N、K160D、K160Q、K160T、P162L、P167L、R182I、R182L、R182Q、R182T、R182V、R182Y、K214H、K214T、T220G、T220S、L222F、T223D、K226Q、D236L、D236T、D236V、M238A、M238G、M238I、M238R、M238S、M238T、E256R、N286G、E299V、K309P、K309R、K309S、K309T、D387P、D387Q、D387R、E388A、E388S、D389A、D389G、D389L、D389V、R391A、R391L、R391S、R391V、H393P、H393T、T406G、T406S、P408L、P408T、I412G、I412R、R418A、R418H、R418M、K422L、E429D、E430P、Y449G、Y449H、Y449L、Y449R、Y449S、K450NおよびK450Vから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号3956を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号4148、4150、4152、4154、4156、4158、4160、4162、4164、4166、4168、4170、4172、4174、4176、4178、4180、4182、4184、4186、4188、4190、4192、4194、4196、4198、4200、4202、4204、4206、4208、4210、4212、4214、4216、4218、4220、4222、4224、4226、4228、4230、4232、4234、4236、4238、4240、4242、4244、4246、4248、4250、4252、4254、4256、4258、4260、4262、4264、4266、4268、4270、4272、4274、4276、4278、4280、4282、4284、4286、4288、4290、4292、4294、4296、4298、4300、4302、4304、4306、4308、4310、4312、4314、4316、4318、4320、4322、4324、4326、4328、4330、4332、4334、4336、4338、4340、4342、4344、4346、4348、4350、4352、4354、4356、4358、4360、4362、4364、4366、4368、4370、4372、4374、4376、4378、4380、4382、4384、4386、4388、4390、4392、4394、4396、4398、4400、4402、4404、4406、4408、4410、4412、4414、4416、4418、4420、4422、4424、4426、4428、4430、4432、4434、4436、4438、4440、4442、4444、4446、4448、4450、4452、4454、4456、4458、4460、4462、4464、4466、4468、4470、4472、4474、4476、4478、4480、4482、4484、4486、4488、4490、4492、4494および4496のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号4148、4150、4152、4154、4156、4158、4160、4162、4164、4166、4168、4170、4172、4174、4176、4178、4180、4182、4184、4186、4188、4190、4192、4194、4196、4198、4200、4202、4204、4206、4208、4210、4212、4214、4216、4218、4220、4222、4224、4226、4228、4230、4232、4234、4236、4238、4240、4242、4244、4246、4248、4250、4252、4254、4256、4258、4260、4262、4264、4266、4268、4270、4272、4274、4276、4278、4280、4282、4284、4286、4288、4290、4292、4294、4296、4298、4300、4302、4304、4306、4308、4310、4312、4314、4316、4318、4320、4322、4324、4326、4328、4330、4332、4334、4336、4338、4340、4342、4344、4346、4348、4350、4352、4354、4356、4358、4360、4362、4364、4366、4368、4370、4372、4374、4376、4378、4380、4382、4384、4386、4388、4390、4392、4394、4396、4398、4400、4402、4404、4406、4408、4410、4412、4414、4416、4418、4420、4422、4424、4426、4428、4430、4432、4434、4436、4438、4440、4442、4444、4446、4448、4450、4452、4454、4456、4458、4460、4462、4464、4466、4468、4470、4472、4474、4476、4478、4480、4482、4484、4486、4488、4490、4492、4494および4496のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号4148、4150、4152、4154、4156、4158、4160、4162、4164、4166、4168、4170、4172、4174、4176、4178、4180、4182、4184、4186、4188、4190、4192、4194、4196、4198、4200、4202、4204、4206、4208、4210、4212、4214、4216、4218、4220、4222、4224、4226、4228、4230、4232、4234、4236、4238、4240、4242、4244、4246、4248、4250、4252、4254、4256、4258、4260、4262、4264、4266、4268、4270、4272、4274、4276、4278、4280、4282、4284、4286、4288、4290、4292、4294、4296、4298、4300、4302、4304、4306、4308、4310、4312、4314、4316、4318、4320、4322、4324、4326、4328、4330、4332、4334、4336、4338、4340、4342、4344、4346、4348、4350、4352、4354、4356、4358、4360、4362、4364、4366、4368、4370、4372、4374、4376、4378、4380、4382、4384、4386、4388、4390、4392、4394、4396、4398、4400、4402、4404、4406、4408、4410、4412、4414、4416、4418、4420、4422、4424、4426、4428、4430、4432、4434、4436、4438、4440、4442、4444、4446、4448、4450、4452、4454、4456、4458、4460、4462、4464、4466、4468、4470、4472、4474、4476、4478、4480、4482、4484、4486、4488、4490、4492、4494および4496のいずれかを含む。
Y449H、T406G、R418A/R427S、R427S、R427S/E429DおよびY449Lから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号4550を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358および7360のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358および7360のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7216、7218、7220、7222、7224、7226、7228、7230、7232、7234、7236、7238、7240、7242、7244、7246、7248、7250、7252、7254、7256、7258、7260、7262、7264、7266、7268、7270、7272、7274、7276、7278、7280、7282、7284、7286、7288、7290、7292、7294、7296、7298、7300、7302、7304、7306、7308、7310、7312、7314、7316、7318、7320、7322、7324、7326、7328、7330、7332、7334、7336、7338、7340、7342、7344、7346、7348、7350、7352、7354、7356、7358および7360のいずれかを含む。
49/406/408、51、64、71、76、97、100、108、108/172、109、112、117/157/301、118、118/406/408、119、119/172、130、133、134、141、157、169、172/420、172/437、179、181、259、274、275、287、288、333/398、333/406/408、338、356、357、376、381、385、394/420、396、397/406/408、398、401、406/408、410、417、420、434、437および441から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号7324を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、2T、4F、11L/44H、11L/71P、11L/71T、11L/287S、11L/441S、37G、40Q、42A、42A/141P、42D/138C、42G、43A、43L、43M、43T、46C、46L、46Q、46T、47N、48S/398V、49G、49K、49N/406G/408A、51M、51Q、51V、64A、64F、64G、64L、64Q、64R、64V、71T、76H、76L、97L、97V、100R、108G/172H、108T、109L、109V、109Y、112N、112Q、112R、112T、112V、117R/157T/301R、118A、118A/406G/408A、118I、118L、118S、118V、119A、119G、119S、119T/172H、130S、133H、133L、133R、133S、134S、141G、141Q、141S、157C、157E、157T、169E、172H/420L、172H/437D、179I、179R、181H、181T、259T、274Q、274T、275L、287A、287K、287L、287S、288P、333S/398T、333S/406G/408A、338S、356S、356T、357T、376G、376M、376N、376R、376S、381C、385A、394H/420W、396A、396S、397L/406G/408A、398H、398K、398L、398M、398R、401T、406G/408A、410R、417C、417S、420F、420L、434C、437G、437Vおよび441Lから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号7324を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、H2T、H4F、Q11L/Y44H、Q11L/E71P、Q11L/E71T、Q11L/V287S、Q11L/Q441S、A37G、G40Q、V42A、V42A/A141P、V42D/G138C、V42G、I43A、I43L、I43M、I43T、V46C、V46L、V46Q、V46T、S47N、T48S/A398V、A49G、A49K、A49N/S406G/P408A、N51M、N51Q、N51V、S64A、S64F、S64G、S64L、S64Q、S64R、S64V、E71T、E76H、E76L、T97L、T97V、K100R、N108G/R172H、N108T、F109L、F109V、F109Y、I112N、I112Q、I112R、I112T、I112V、K117R/N157T/Q301R、P118A、P118A/S406G/P408A、P118I、P118L、P118S、P118V、D119A、D119G、D119S、D119T/R172H、A130S、V133H、V133L、V133R、V133S、A134S、A141G、A141Q、A141S、N157C、N157E、N157T、P169E、R172H/I420L、R172H/E437D、D179I、D179R、M181H、M181T、V259T、D274Q、D274T、M275L、V287A、V287K、V287L、V287S、N288P、N333S/A398T、N333S/S406G/P408A、G338S、G356S、G356T、V357T、V376G、V376M、V376N、V376R、V376S、A381C、V385A、R394H/I420W、E396A、E396S、I397L/S406G/P408A、A398H、A398K、A398L、A398M、A398R、L401T、S406G/P408A、G410R、V417C、V417S、I420F、I420L、A434C、E437G、E437VおよびQ441Lから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号7324を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336および8338のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330
、8332、8334、8336および8338のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号7766、7768、7770、7772、7774、7776、7778、7780、7782、7784、7786、7788、7790、7792、7794、7796、7798、7800、7812、7814、7816、7818、7820、7822、7824、7826、7828、7830、7832、7834、7836、7838、7840、7842、7844、7846、7848、7850、7852、7854、7856、7858、7860、7862、7864、7866、7868、7870、7872、7874、7876、7878、7880、7882、7884、7886、7888、7890、7892、7894、7896、7898、7900、7902、7904、7906、7908、7910、7912、7914、7916、7918、7920、7922、7924、7926、7928、7930、7932、7934、7936、7938、7940、7942、7944、8092、8094、8096、8098、8100、8102、8104、8106、8108、8110、8112、8114、8116、8118、8120、8122、8124、8126、8128、8130、8132、8134、8136、8138、8140、8142、8144、8146、8148、8150、8152、8154、8156、8158、8160、8162、8164、8166、8168、8170、8172、8174、8176、8178、8180、8182、8184、8186、8188、8190、8192、8194、8196、8198、8200、8202、8204、8206、8208、8210、8212、8214、8216、8218、8220、8222、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336および8338のいずれかを含む。
8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220および9222のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、配列番号8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220および9222のいずれかを含む。
2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762、7764、8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478、8480、8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104、および/または9106に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたスクロースシンターゼも提供する。
R129E/I215F/I372V/I756VおよびI170L/I264V/I267Vから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号1158を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、および/または1288のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、および/または1288のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、および/または1288のいずれかを含む。
一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564および1566のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564および1566のいずれかを含む。
A253T/T519L/S635D、A253T/T519L/S635E、A253T/L563V/S635R、A253V/T519G、A253V/T519L、V270L/I322V/P517A、V270L/I367V/F452Y/P517A/E613Q/I700F/L750M、V270L/F452Y/P517A/I700F/L750M、V270L/R570H、L282M/Q381S/R550S、L282M/R550Q、R356H/R570H、Q381S/R550Q、Q381S/R550S、P517A、P517A/L562I/L750M、P517A/T640N、T519L/L563V、R550M/L636Q、R550QおよびL562Iから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号1582を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770および1772のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770および1772のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770および1772のいずれかを含む。
/G589SおよびG589S/E738S/D765Sから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号1840を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、14、15、18/362、20、24、26、33、33/154、46、50、54、58、59、59/72、79、81、92、93、97/154、104、105、130、134、154、165、175、185、212、213、218、241、256、263、316、319、349、360、362、364、390、393、434、480、498、530、534、534/739、542、603および652から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号1840を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、14K、15A、15I、15P、18V/362A、20M、24S、26A、26E、26I、26T、33H/154C、33L、33P、33S、46G、46I、46R、46T、46V、50R、54M、58M、59A、59C、59N/72N、59R、59S、59V、59W、79H、79Y、81G、81I、81L、92G、93T、97V/154S、104T、105S、130Y、134A、134P、154A、154E、154R、154S、165I、165L、165T、175G、175T、185L、212Y、213V、218A、218N、218Q、218S、218T、218V、241T、256G、263S、263Y、316H、316T、319S、349D、349R、349T、360D、360E、360R、362E、364S、390M、393H、434G、434R、480P、480V、498L、498Q、530F、534G、534K、534L、534R、534T、534W、534W/739K、542W、603A、603E、603H、603Q、603S、652K、652L、652R、652Sおよび652Tから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号1840を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、R14K、S15A、S15I、S15P、A18V/I362A、L20M、V24S、S26A、S26E、S26I、S26T、Q33H/H154C、Q33L、Q33P、Q33S、Q46G、Q46I、Q46R、Q46T、Q46V、G50R、D54M、L58M、E59A、E59C、E59N/D72N、E59R、E59S、E59V、E59W、W79H、W79Y、P81G、P81I、P81L、H92G、V93T、A97V/H154S、D104T、E105S、D130Y、V134A、V134P、H154A、H154E、H154R、H154S、A165I、A165L、A165T、S175G、S175T、M185L、W212Y、A213V、D218A、D218N、D218Q、D218S、D218T、D218V、L241T、S256G、M263S、M263Y、V316H、V316T、R319S、Q349D、Q349R、Q349T、G360D、G360E、G360R、I362E、P364S、E390M、S393H、Y434G、Y434R、I480P、I480V、E498L、E498Q、P530F、E534G、E534K、E534L、E534R、E534T、E534W、E534W/E739K、F542W、G603A、G603E、G603H、G603Q、G603S、G652K、G652L、G652R、G652SおよびG652Tから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号1840を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316および2318のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316および2318のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316および2318のいずれかを含む。
615L、615M、630M、675C、724G、724K、724S、756Cおよび788Kから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号2510を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Q7K/D12L、D12C、D12N、D12Q、D12S、D12V、Q27R、D29A、D29G、D29L、D29P、R44L、R44V、E45A、E45C、E45G、E45L、E45S、E45V、P47C、P47D、P47I、P47L、P47N、P47T、P47V、P48A、P48V、Y51P、Y51S、I55D、I55S、D72E、Q95D、Q95L、Q95N、Q95T、Q95V、E100K、E100P、E100Q、L116A、L116F、R136A、R136F、R136K、R136N、R136P、R136Q、R139K、L176M、L176R、L176T、L176V、R178H、Q198A、Q198R、Q201S、T205R/G485S、T205S、P207K、R208K、K280G、R303V、E317I、H343A、H343N、E358P、E358S、R361A、R361L、R361T、P440R、R478H、R478I、R478Q、R611A、R615C、R615K、R615L、R615M、L630M、S675C、H724G、H724K、H724S、V756CおよびH788Kから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号2510を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762および7764のいずれかに対して少なくとも90%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762および7764のいずれかに対して少なくとも95%同一である配列を含む。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、配列番号7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762および7764のいずれかを含む。
136Q/139K/199A/208K/517P/603E/756C、12S/136Q/139K/208K/517P、12S/136Q/139K/517P/603E/630M/642V/756C、12S/136Q/139K/517P/603E/630M/756C、12S/136Q/139K/517P/603E/756C、12S/136Q/139K/517P/603Q/630M/642V/756C、12S/136Q/139K/517P/603Q/756C、12S/136Q/139K/517P/630M、12S/136Q/139K/517P/630M/642V、12S/136Q/139K/603Q/630M/642V、12S/136Q/139K/603Q/630M/756C、12S/136Q/139K/630M/642V/756C、12S/136Q/139K/630M/756C、12S/136Q/176T/208K/517P/603E/630M/756C、12S/136Q/176T/517P/642V、12S/136Q/199A/208K/630M/642V、12S/136Q/208K/603Q/642V、12S/136Q/517P/603Q/630M/642V、12S/136Q/517P/603Q/630M/756C、12S/136Q/517P/630M/642V、12S/136Q/517P/642V、12S/136Q/517P/642V/756C、12S/136Q/517P/756C、12S/136Q/603E/756C、12S/136Q/603Q/630M/642V/756C、12S/136Q/630M、12S/136Q/630M/756C、12S/139K/176T/517P/603Q/630M/756C、12S/139K/176T/630M/756C、12S/139K/208K/642V、12S/139K/517P/630M/642V/756C、12S/139K/517P/642V、12S/139K/603Q/756C、12S/176T/603E/756C、12S/176T/603Q/630M/756C、12S/199A/756C、12S/208K/603Q/630M/756C、12S/517P/603Q/630M/642V/756C、12S/517P/630M/642V/756C、12S/517P/642V/756C、12S/603Q/630M/756C、12S/630M/756C、25E/176M/198R/532Y/539R、116F/142N/198R/434H/440R、136Q/139K/176T/199A/208K/517P/630M/642V、136Q/139K/176T/517P/630M/642V/756C、136Q/139K/199A/517P/603E/756C、136Q/139K/208K/517P/630M/756C、136Q/139K/208K/603Q/630M/756C、136Q/139K/517P/603E/642V/756C、136Q/139K/517P/603Q/630M/642V/756C、136Q/139K/517P/603Q/756C、136Q/139K/517P/756C、136Q/139K/603Q、136Q/139K/630M/642V/756C、136Q/517P/756C、136Q/603Q/756C、136Q/630M/642V、136Q/630M/756C、136Q/642V、136Q/642V/756C、136Q/756C、139K/199A/208K/517P/630M/756C、139K/199A/517P/642V、139K/208K/517P/630M/642V/756C、139K/517P/603Q/756C、139K/517P/630M/756C、139K/642V/756C、154A/532Y/652R/788K、199A/517P/603Q/630M/756C、208K/517P/630M/642V/756C、517P/603E/630M/642V/756C、517P/630M/756C、603E/630M/756Cおよび603Q/756Cから選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、位置は、配列番号8420を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、D12N/E45A/Q95T/R136Q/R139K/T199A/A517P/L630M/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/T199A/A517P/G603E、D12N/E45A/R136Q/R139K/A517P/G603E/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/G603E/V756C、D12N/E45A/R136Q/R139K/A642V/V756C、D12N/E45A/R136Q/R208K/A517P/L630M/V756C、D12N/E45A/R136Q/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/E45A/R136Q/G603E/V756C、D12N/E45A/R136Q/L630M/A642V、D12N/E45A/R139K/T199A/R208K/G603E、D12N/E45A/R139K/A517P/V756C、D12N/E45A/T199A/R208K/A517P/G603E/L630M/V756C、D12N/Q95T/R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C、D12N/Q95T/R139K/A517P/A642V、D12N/Q95T/R139K/L630M/A642V、D12N/Q95T/T199A/A517P/A642V、D12N/Q95T/A517P/L630M/V756C、D12N/R136Q、D12N/R136Q/R139K/L176T/A517P/G603Q/V756C、D12N/R136Q/R139K/L176T/L630M/V756C、D12N/R136Q/R139K/L176T/A642V、D12N/R136Q/R139K/T199A/R208K/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/R136Q/R139K/A517P、D12N/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V、D12N/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/R136Q/R139K/A517P/V756C、D12N/R136Q/R139K/G603E/L630M、D12N/R136Q/R139K/G603Q/A642V/V756C、D12N/R136Q/R139K/L630M、D12N/R136Q/R139K/A642V/V756C、D12N/R136Q/L176T/G603Q/V756C、D12N/R136Q/T199A/R208K/A517P/G603E/A642V/V756C、D12N/R136Q/T199A/A517P/V756C、D12N/R136Q/R208K、D12N/R136Q/A517P/L630M、D12N/R136Q/G603E/A642V、D12N/R136Q/G603E/A642V/V756C、D12N/R136Q/G603Q/L630M/V756C、D12N/R136Q/G603Q/A642V/V756C、D12N/R136Q/G603Q/V756C、D12N/R139K/T199A/R208K/A642V、D12N/R139K/T199A/A517P/L630M/V756C、D12N/R139K/R208K/A517P、D12N/R139K/A517P/G603Q/A642V/V756C、D12N/R139K/G603E/A642V/V756C、D12N/R139K/G603Q/V756C、D12N/R139K/L630M/A642V、D12N/R139K/L630M/A642V/V756C、D12N/R139K/L630M/V756C、D12N/L176T/A517P/G603E/L630M、D12N/L176T/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/L176T/A517P/V756C、D12N/T199A/R208K/A517P/A642V、D12N/T199A/L630M/A642V/V756C、D12N/T199A/A642V/V756C、D12N/R208K/A517P/G603E/H623N/L630M/A642V、D12N/R208K/L630M/V756C、D12N/A517P/G603E/V756C、D12N/A517P/G603Q/L630M/V756C、D12N/A517P/L630M/A642V/V756C、D12N/G603E/A642V/V756C、D12N/G603Q/L630M/V756C、D12N/G603Q/A642V/V756C、D12N/G603Q/V756C、D12N/L630M/A642V/V756C、D12S/E45A/Q95T/R136Q/V756C、D12S/E45A/R136Q/R139K/R208K/G603E/L630M/V756C、D12S/E45A/R136Q/R139K/A517P/V756C、D12S/E45A/R136Q/L176T/A517P/G603E/L630M/A642V、D12S/E45A/R136Q/A517P/G603Q/A642V/V756C/A789V、D12S/E45A/R139K/L176T/R208K/A517P/G603E/L630M、D12S/E45A/R139K/A517P/V756C、D12S/E45A/R139K/V756C、D12S/E45A/L176T/G603Q/L630M/A642V/V756C、D12S/E45A/R208K/A517P/G603E/A642V/V756C、D12S/Q95T/R139K/A517P/L630M/V756C、D12S/Q95T/L630M/V756C、D12S/R136Q/R139K/L176T/A517P/G603Q/L630M、D12S/R136Q/R139K/L176T/V756C、D12S/R136Q/R139K/T199A/R208K/A517P/G603E/V756C、D12S/R136Q/R139K/R208K/A517P、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/L630M/A642V/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/L630M/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603E/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603Q/L630M/A642V/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/G603Q/V756C、D12S/R136Q/R139K/A517P/L630M、D12S/R136Q/R139K/A517P/L630M/A642V、D12S/R136Q/R139K/G603Q/L630M/A642V、D12S/R136Q/R139K/G603Q/L630M/
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8839、8841、8843、8845、8847、8849、8851、8853、8855、8857、8859、8861、8863、8865、8867、8869、8871、8873、8875、8877、8879、8881、8883、8885、8887、8889、8891、8893、8895、8897、8899、8901、8903、8905、8907、8909、8911、8913、8915、8917、8919、8921、8923、8925、8927、8929、8931、8933、8935、8937、8939、8941、8943、8945、8947、8949、8951、8953、8955、8957、8959、8961、8963、8965、8967、8969、8971、8973、8975、8977、8979、8981、8983、8985、8987、8989、8991、8993、8995、8997、8999、9001、9003、9005、9007、9009、9011、9013、9015、9017、9019、9021、9023、9025、9027、9029、9031、9033、9035、9037、9039、9041、9043、9045、9047、9049、9051、9053、9055、9057、9059、9061、9063、9065、9067、9069、9071、9073、9075、9077、9079、9081、9083、9085、9087、9089、9091、9093、9095、9097、9099、9101、9103、および/または9105に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を含む。
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本発明を参照して、本明細書の説明に使用する科学技術用語は、別のものを具体的に定義していない限り、当業者によって一般的に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「ワンポット反応」は、1つの反応容器中での目的のレバウジオシドの産生を指す。一部の実施形態では、用語は、rebAおよび/またはステビオシドを含むがこれらに限定されない開始材料から、他のレバウジオシド(例えば、rebDおよび/またはrebI)の中間体の産生を伴うrebMの産生に関連して使用される。一部の実施形態では、ステビオシドのRebAへの変換、RebAのRebDおよび/またはRebIへの変換、ならびにRebDおよび/またはRebIのRebMへの変換は、1つの反応容器において多酵素カスケードとして実施される。
グリコシル化は、安定性、薬力学、溶解度、および膜輸送を含む天然および合成産物の多くの特性を変更し得る。本発明は、様々なアグリコンおよびグリコシル化基質から新規グリコシル化化合物を生成するのに適した組成物、方法、および酵素を提供する。一部の実施形態では、本発明は、容易に得られる前駆体から既知のグリコシル化化合物を効率的に生成する手段を提供する。一部の例では、グリコシル化は、化学合成法を通して達成される。しかし、これらの方法は典型的に、望ましくない化学物質およびプロセスを必要とし、混合産物(例えば、不正確な位置での結合および/または望ましくないアノマー配置を有する)をもたらし得る。さらに、炭水化物化学は、複数の保護および脱保護ステップを必要とする。
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。記載がポリペプチドに関する場合、これはまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載すると理解すべきである。一部の実施形態では、本発明は、野生型GT酵素と比較して改善された特性を有する、操作された天然に存在しないGT酵素を提供する。任意の適した反応条件を本発明において使用する。一部の実施形態では、方法を使用して、トランスフェラーゼ反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析する。一部の実施形態では、反応条件は、以下におよび実施例にさらに説明するように、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補基質、緩衝液、共溶媒、pH、温度および反応時間を含む条件、ならびに/またはポリペプチドが固相支持体に固定される条件によって調整される。
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、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、7438、7440、7442、7444、7446、7448、7450、7452、7454、7456、7458、7460、7462、7464、7466、7468、7470、7472、7474、7476、7478、7480、7482、7484、7486、7488、7490、7492、7494、7496、7498、7500、7502、7504、7506、7508、7510、7512、7514、7516、7518、7520、7522、7524、7526、7528、7530、7532、7534、7536、7538、7540、7542、7544、7546、7548、7550、7552、7554、7556、7558、7560、7562、7564、7566、7568、7570、7572、7574、7576、7578、7580、7582、7584、7586、7588、7590、7592、7594、7596、7598、7600、7602、7604、7606、7608、7610、7612、7614、7616、7618、7620、7622、7624、7626、7628、7630、7632、7634、7636、7638、7640、7642、7644、7646、7648、7650、7652、7654、7656、7658、7660、7662、7664、7666、7668、7670、7672、7674、7676、7678、7680、7682、7684、7686、7688、7690、7692、7694、7696、7698、7700、7702、7704、7706、7708、7710、7712、7714、7716、7718、7720、7722、7724、7726、7728、7730、7732、7734、7736、7738、7740、7742、7744、7746、7748、7750、7752、7754、7756、7758、7760、7762、7764、8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478、8480、8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104および9106に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたスクロースシンターゼを提供する。
本発明は、操作されたスクロースシンターゼ(SuS)ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。記載がポリペプチドに関する場合、これはまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載すると理解すべきである。一部の実施形態では、本発明は、野生型SuS酵素と比較して改善された特性を有する、操作された天然に存在しないSuS酵素を提供する。任意の適した反応条件を本発明において使用する。一部の実施形態では、方法を使用して、シンターゼ反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析する。一部の実施形態では、反応条件は、以下におよび実施例にさらに説明するように、操作されたSuSの濃度もしくは量、基質、緩衝液、溶媒、pH、温度および反応時間を含む条件、ならびに/または操作されたSuSポリペプチドが固相支持体に固定される条件によって調整される。
8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104および9106に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を含む、操作されたSuS酵素を提供する。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
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8865、8867、8869、8871、8873、8875、8877、8879、8881、8883、8885、8887、8889、8891、8893、8895、8897、8899、8901、8903、8905、8907、8909、8911、8913、8915、8917、8919、8921、8923、8925、8927、8929、8931、8933、8935、8937、8939、8941、8943、8945、8947、8949、8951、8953、8955、8957、8959、8961、8963、8965、8967、8969、8971、8973、8975、8977、8979、8981、8983、8985、8987、8989、8991、8993、8995、8997、8999、9001、9003、9005、9007、9009、9011、9013、9015、9017、9019、9021、9023、9025、9027、9029、9031、9033、9035、9037、9039、9041、9043、9045、9047、9049、9051、9053、9055、9057、9059、9061、9063、9065、9067、9069、9071、9073、9075、9077、9079、9081、9083、9085、9087、9089、9091、9093、9095、9097、9099、9101、9103、および/または9105に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を含む。
グルコシル化活性を有するUGT酵素の合成、最適化、およびアッセイ
本実施例では、グルコシル化活性を有するUGT酵素の合成、最適化およびアッセイに使用する方法を記載する。
ステビオールビオシドをグルコシル化してレバウジオシドBにすること、およびステビオシドをグルコシル化してレバウジオシドAにすることが報告されている(例えば、Richmanら、Plant J.、41巻:56〜67頁[2005年]を参照されたい)、野生型Stevia rebaudianaポリペプチド(配列番号2)をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号1)をコドン最適化し、配列番号3の遺伝子として合成した。この合成遺伝子(配列番号3)をpCK110900ベクター系にクローニングし(例えば、これによって本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願公開第2006/0195947号を参照されたい)、その後、E.coli W3110(ΔfhuA)において発現させた。E.coli株W3110にlacプロモーターの制御下でUGT酵素を発現させた。
振とうフラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスにおいて使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振とうフラスコ粉末(SFP)を生成した。酵素の振とうフラスコ粉末(SFP)調製物により、HTPアッセイで使用される細胞溶解物と比較してより精製された酵素の調製物(例えば、総タンパク質の>30%に至るまで)がもたらされ、より濃縮された酵素溶液を使用することが可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するE.coliの単一のコロニーを、30μg/mlのクロラムフェニコールおよび1%グルコースを含有するLuria Bertaniブロス5mL中に接種した。細胞をインキュベーター中、30℃、250rpmで振とうしながら終夜(少なくとも16時間)成長させた。培養物を、1Lフラスコ中、30μg/mlのCAMを含有するTerrific Broth(12g/Lのバクトトリプトン、24g/Lの酵母抽出物、4mL/Lのグリセロール、65mMのリン酸カリウム、pH7.0、1mMのMgSO4)250mLに、600nmにおける光学濃度(OD600)0.2まで希釈し、30℃で成長させた。
SFPを再構成して20g/Lの粉末を提供した。次いで、これらのストック50μLを、3mMのMgSO4および1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)を伴い、2mMのウリジンジホスホグルコースを伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、総反応体積200μL中に希釈した。反応を、30℃、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら16〜18hにわたって実施した。
上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化されたステビオシド産物を、LC−MS/MSにより、以下の計器およびパラメータを用いて検出した:
配列番号4のGT改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号4に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置が変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号3によってコードされるGT(すなわち、配列番号4)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド12種の第1のラウンド(「ラウンド1」)をもたらした。
細胞を96ウェルプレート中に採集し、1%グルコースおよび30μg/mLのCAMを含有するLB培地中、30℃、200rpm、85%湿度で終夜成長させた。次いで、終夜成長物20μLを、30μg/mLのCAMを含有するTB成長培地380μLを含有するディープウェルプレートに移し、1mMのIPTGを用いて誘導し、30℃、200rpm、85%湿度で18hインキュベートした。細胞培養物を4000rpm、4℃で10分遠心分離し、培地を廃棄した。こうして得られた細胞ペレットを−80℃で凍結させ、溶解緩衝液(20mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5中、0.5g/Lのリゾチームおよび0.5g/LのPMBS)250μL中に、タイタープレート振とう機において、室温、低スピードで振とうしながら2hにわたって溶解させた。次いで、プレートを4000rpm、4℃で20min遠心分離し、清澄化された溶解物上清を下記のHTPアッセイ反応に使用した。
配列番号3改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物200μL中溶解物50μLの溶解物添加量、50%エタノール中20mMのストック溶液からの1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)の基質添加量、および0.5mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら18h。反応物を、100μL/ウェルの0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、4℃で10分遠心分離し、上清を実施例1、表1.1に記載の通りHPLC−MS/MSによって分析した。
まず、250mL振とうフラスコ培養物を、実施例1に記載の通り、成長させ、誘導し、溶解させ、ヒスチジン−アフィニティー精製し、透析し、グリセロールを用いて1:1希釈して、精製タンパク質を作製した。次いで、これらのタンパク質50μLを、1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)またはレバウジオシドD(Sigma、>93%の純度)および0.5mMのADP−グルコースを伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、総反応体積200μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら16hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。
配列番号8のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号8に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。ラウンド1における活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号7によってコードされるGT(すなわち、配列番号8)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、実施例2に記載のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド20種の第2のラウンド(「ラウンド2」)をもたらした。操作されたポリペプチドを表3.1に列挙する。親および改変体構築物はアフィニティー精製のためのN末端ヒスチジンタグを含有するが、明確にするために、タグが付されていない参照配列と比べて変異が番号付けられている。下記の通り配列番号8と比べて表3.1に示されているアミノ酸変異を有する改変体に関してタンパク質精製のために実施例1に記載の通り成長させた振とうフラスコ規模の培養物を分析した。
配列番号4の配列番号32と比べたヌクレオチド二リン酸特異性をプロファイリングするために、以下の実験を実施した。まず、精製タンパク質50μLを、1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)および0.5mMのADP−グルコース、UDP−グルコース、またはTDP−グルコースを伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、総反応体積200μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら16hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。配列番号32は、配列番号4よりも、ADP−グルコースを用いると13倍多くのレバウジオシドAを産生させ、UDP−グルコースを用いると90%程度のレバウジオシドAを産生させ、TDP−グルコースを用いると22%程度のレバウジオシドAを産生させた。配列番号31によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ(すなわち、配列番号32)は、配列番号3によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ(すなわち、配列番号4)と比較して実質的に改変されたNDP−グルコース特異性を有する。
配列番号32のヌクレオチド二リン酸特異性をプロファイリングするために、以下の実験を実施した。まず、精製タンパク質5μLを、1mMのレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および2mMのADP−グルコース、UDP−グルコース、TDP−グルコース、またはGDP−グルコースを伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら1〜18hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。配列番号31によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ(すなわち、配列番号32)は、ADP−グルコースと比べて、GDP−グルコースを用いると50%程度のレバウジオシドMを産生させ、UDP−グルコースを用いると70%程度のレバウジオシドMを産生させ、TDP−グルコースを用いると検出限界を下回る量のレバウジオシドMを産生させた。レバウジオシドDおよびADP−グルコースを用いたGT配列番号32の比活性(毎分精製タンパク質1mg毎に形成されるRebMのμmol)は、UDP−グルコースを用いた場合の比活性の1.4倍であった。したがって、配列番号31によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ(すなわち、配列番号32)は、新しいアデニンジホスホグルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ、または「AGT」である。
操作されたAGT配列番号32を用いたステビオシドからレバウジオシドAへの転換およびADP−グルコースのin situ形成
本実施例では、ステビオール配糖体をグルコシル化するためのADP−グルコースのin situ形成を評価するための実験(図1を参照されたい)を記載する。
可逆的変換においてフルクトースにグルコースを供与してスクロースを形成するためにADP−グルコースを優先的に利用することが報告されている(例えば、Diricksら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、99巻:8465〜74頁[2015年]およびFigueroaら、FEBS Lett.、587巻:165〜9頁[2013年]を参照されたい)、野生型Acidithiobacillus caldusスクロースシンターゼおよびThermosynechococcus elongatusスクロースシンターゼポリペプチド(それぞれ配列番号72および74)をコードするポリヌクレオチド配列を、コドン最適化し、配列番号71および73の遺伝子として合成した。これらの合成遺伝子(配列番号71および73)をpCK110900ベクター系に個別にクローニングし(例えば、これによって本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願公開第2006/0195947号を参照されたい)、その後、E.coli W3110(ΔfhuA)において発現させた。E.coli株W3110に当該酵素をlacプロモーターの制御下で発現させた。当該株を振とうフラスコ規模で成長させ、Hisアフィニティータンパク質精製のために溶解させ、これは、実施例1に記載の通り実施した。
スクロースシンターゼ(SuS)と配列番号31によってコードされるAGT(すなわち、配列番号32)をカップリングすることによるNDP再利用の潜在性を調査するために、以下の実験を実施した。まず、精製されたスクロースシンターゼポリペプチド(配列番号72または74)20μLおよび精製されたAGTポリペプチド(配列番号32)30μLを、1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)、200mMのスクロース、および5mMのアデノシン二リン酸(ADP)、シチジン二リン酸(CDP)、グアノシン二リン酸(GDP)、チミジン二リン酸(TDP)、またはウリジン二リン酸(UDP)(Sigma、5種全て>93%の純度)を伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、5mMのMgCl2、総反応体積200μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら16hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。
配列番号32のADP−グリコシルトランスフェラーゼ循環置換改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体をグルコシル化するための、配列番号32に由来するGTポリペプチドの設計、構築、および評価に関する実験を記載する。配列番号31によってコードされるGTの定向進化を、N末端およびC末端がコード配列内で連結しており、酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置が当該タンパク質の新しいN末端として選択された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、この循環置換改変体のライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT循環置換改変体ポリペプチド17種の「ラウンド3.2」をもたらした。非順列(unpermuted)配列番号32よりも高い活性を有する改変体はなかったが、表5.1に列挙されている17種の操作されたポリペプチドは、酵素を伴わない陰性対照よりも高い活性を有した。
配列番号31改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物200μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、50%エタノール中20mMのストック溶液からの1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)の基質添加量、および0.5mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、100μL/ウェルの0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、4℃で10分遠心分離し、上清を実施例1、表1.1に記載の通りHPLC−MS/MSによって分析した。
まず、精製タンパク質10μLを、1mMのレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および2mMのADP−グルコースを伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら1〜4hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。
配列番号32のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号32に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置が変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号31によってコードされるGT(すなわち、配列番号32)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド60種の第3のラウンド(「ラウンド3.1」)をもたらした。
配列番号32改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物200μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、50%エタノール中20mMのストック溶液からの0.5mMのレバウジオシドDまたは1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)の基質添加量および0.5mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、100μL/ウェルの0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、4℃で10分遠心分離し、上清を実施例1、表1.1に記載の通りHPLC−MS/MSによって分析した。
まず、精製タンパク質1μLを、1mMのステビオシド(Chromadex、>94%の純度)またはレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および2mMのADP−グルコースを伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら1〜30hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。ステビオシドおよびレバウジオシドDについて表6.2に記載されている比活性を、反応進行曲線の直線部分から毎分精製タンパク質1mg毎に形成される産物のμmolとして決定した。
まず、精製タンパク質2μLを、1mMのレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および2mMのADP−グルコースを伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら1〜18hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。
AGT(配列番号232)を用いたレバウジオシドDからレバウジオシドMへの転換
実施例1に記載の通り、ポリペプチド配列番号232のタンパク質精製のために振とうフラスコ培養物250mLを成長させた。次いで、50%グリセロールストック2.4mLを、50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、2mMのADP−グルコース、および1mMのレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)を伴う250mLのバッフルフラスコ中、総反応体積60mLに希釈した。Innova(登録商標)振とうインキュベーター中、30℃、250RPMで振とうしながら2hにわたって反応を実施し、ギ酸0.12mLを用いてクエンチしてpH<4にした。反応物を4℃、10,000RPMで10分の遠心分離によって沈殿させた。XAD−4樹脂(Sigma)6gを上清に添加し、振とうフラスコ中で2hインキュベートした。樹脂を濾過し、50:24:26の水:ACN:EtOH、16.3mLを用い、4hインキュベートし、再濾過することによって溶出させた。第2の溶出を50:50の水:EtOH、10mLを用いて実施し、これを濾過し、第1の溶出と組み合わせた。溶出液を回転蒸発によって約6mLまで濃縮し、WHATMAN(登録商標)UNIPREP(登録商標)シリンジレスフィルターを通して濾過し、表7.1に記載されている計器およびパラメータを使用してHPLCによって分画した。C18カラムから、保持時間5.8〜6.2分で画分を手動で採取した。画分をプールし、回転蒸発によって濃縮し、凍結乾燥した。次いで、試料をエタノール1.5mLに再懸濁させ、撹拌プレート上、80℃で2hインキュベートし、回転蒸発によって濃縮し、真空下、40℃で14h乾燥させた。試料をピリジン−d5に再懸濁させ、Acorn NMRにより実施された1H、COSY、およびHSQC NMRスペクトル取得のために使用した。
配列番号232のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号232に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号231によってコードされるGT(すなわち、配列番号232)の定向進化を、ラウンド3における活性改善に関連する表面残基変異が組み換えられたライブラリーを構築することによって行った。次いで、このライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド76種の第4のラウンド(「ラウンド4」)をもたらした。
配列番号232改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物2.5μLの溶解物添加量を用い、50%エタノール中20mMのストック溶液からの0.5mMのレバウジオシドD(ChromaDex、>94%の純度)の基質添加量および0.5mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を、アッセイを1:10に希釈し、次いで、50μL/ウェルの0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチすることによってクエンチし、4℃で10分遠心分離し、上清を水中に1:10希釈し、実施例1、表1.1に記載の通りHPLC−MS/MSによって分析した。
操作されたラウンド4改変体のステビオシドおよびレバウジオシドDに対する活性を特徴付けるためにタイムコース実験を実施した。1g/Lの振とうフラスコ粉末(SFP)を、1mMのステビオシド(Chromadex、>94%の純度)またはレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および1mMのADP−グルコースを伴う、50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、2.5%v/vエタノールを含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中30℃、300RPMで振とうしながら0.5〜2hにわたって反応を実施した。反応物を、0.2%ギ酸含有アセトニトリル50μLを添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に1:50希釈し、ステビオール配糖体に関して実施例1、表1.1に記載の通りLC−MS/MSによって分析した。8種の改変体全てがステビオシドおよびレバウジオシドDの両方に対して配列番号232よりも高い活性を有した。1時間の時点での、配列番号232と比べた、改変体によってステビオシドから産生されたレバウジオシドAのレベルを表8.2に列挙する。
配列番号348のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号348に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号347によってコードされるGT(すなわち、配列番号348)の定向進化を、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられ、かつ公的に利用可能なデータベース内のホモログから同定された変異が組み換えられたライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、6種がライブラリー5.01(表9.1)に由来し、18種がラウンドの残りのライブラリー(表9.2)に由来する、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第5のラウンド(「ラウンド5」)をもたらした。
配列番号348改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を前のラウンドで使用した250uLから400uLまで増大させ、溶解物を10倍に希釈した。ラウンド5.01に関しては、反応物100μL中溶解物10μLを用い、50%エタノール中20mMのストック溶液からの1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)の基質添加量、および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotronタイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を、アッセイ物10μlを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、4℃で10分遠心分離した。上清を水中に1:10希釈し、表9.3に記載の通りRapidFire SPE−MS/MS(Agilent)によって分析した。残りのラウンド5ライブラリーに関しては、溶解物を10倍ではなく4倍に希釈し、Tris−HClの代わりに50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7を使用し、温度を50℃にし、反応時間を2hにし、ステビオシドおよびレバウジオシドD(Chromadex、>93%)の両方を用いてアッセイを実施した。
振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施して、操作されたラウンド5改変体配列番号500の、配列番号348と比べたステビオシドおよびレバウジオシドDに対する活性を特徴付けた。0.03〜1g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、1mMのステビオシド(Chromadex、>94%の純度)またはレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および1mMのADP−グルコースを伴う、50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、2.5%v/vエタノールを含有する総反応体積100μLに添加した。サーモサイクラー中、40℃で0.5hにわたって反応を実施し、反応物を、0.2%ギ酸含有アセトニトリル50μLを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に1:67希釈し、ステビオール配糖体に関して実施例1、表1.1に記載の通りLC−MS/MSによって分析した。1g/Lの添加量では、配列番号500は、配列番号348の>1.2倍のレバウジオシドAをステビオシドから産生させ、>1.07倍のレバウジオシドMをレバウジオシドDから産生させた。その後、配列番号499(すなわち、500)を再クローニングしてN末端ヒスチジンタグを削除し、ハイスループットに発現させ、プレートを400μL中に溶解させた。改変体配列番号548を含有する、得られた粉末を、配列番号500改変体と比べてアッセイし、これは、溶解物2.5μLを、1mMのステビオシド(Chromadex、>94%の純度)またはレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および1mMのADP−グルコースを伴う、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、2.5%v/vエタノールを含有する総反応体積100μLに添加することを伴った。Thermotron(登録商標)振とうインキュベーター中、50℃、300RPMで4hにわたって反応を実施し、反応物を、アッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、ステビオール配糖体に関して表9.3に記載の通りRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。これらの条件下で、配列番号548改変体は、配列番号500改変体のほぼ1.5倍のレバウジオシドAをステビオシドから産生させ、1.6倍を超えるレバウジオシドMをレバウジオシドDから産生させた。
ステビオール配糖体のβ−1,3−グルコシル化のための、第6のラウンドの操作されたAGTポリペプチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、相対的なタンパク質発現レベルを決定した。1×LDSローディング緩衝液および1×還元剤(Life Technologies)を用いて試料を調製した。4〜12%Bis−Trisアクリルアミドゲル(Life Technologies)を振とうフラスコ規模の培養物由来の凍結乾燥させた可溶性粗溶解物のレーン当たり5μgでローディングし、MES泳動緩衝液を200Vで25minにわたって泳動し、ImageJ解析ソフトウェアを使用してバンドを定量化した。相対的な発現レベルを表9.4に列挙する。配列番号547/548、499/500、および347/348は、有意により良好に発現した遺伝子および/または有意により良好にフォールディングされた/より安定なタンパク質である。したがって、これらの遺伝子は、野生型遺伝子よりも多くのタンパク質を産生させた。
AGT(配列番号500)を用いたレバウジオシドAからレバウジオシドIへの転換
本実施例では、配列番号500改変体を使用してレバウジオシドAをレバウジオシドIに転換する反応のスケールアップ、ならびにレバウジオシドIの単離および特徴付けを記載する。総体積10mLを有する、5g/Lの配列番号500改変体凍結乾燥振とうフラスコ粉末、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、10.3mMの塩化マグネシウム、10g/LのレバウジオシドA(>97%の純度)、および10.3mMのADP−グルコース(Sigma)を含有する反応物を撹拌プレート上、300RPMおよび35℃で89h撹拌した。反応物は反応開始時には透明であり、反応の終わりまでに白色エマルションになった。アッセイ物を水中に1:10希釈し、希釈したアッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加し、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、ステビオール配糖体に関して実施例1、表1.1に記載の通りLC−MS/MSによって分析した。この分析により、レバウジオシドIの高い変換での産生が確認された。レバウジオシドIは、溶解度が低いので、底に沈んだ。したがって、上清を除去し、沈渣を最小体積の水に再懸濁させ、遠心分離することによって単離を行った。この洗浄ステップを2回繰り返し、白色沈渣の表面の褐色沈渣を削ぎ落した。材料を凍結乾燥させ、Acorn NMRによって分析した。材料をピリジン−d5中に溶解させ、1H 1−D、13C DEPT−135、1H−13C HSQC NMR実験をVarian Inova 500 NMR分光計を用いて実施した。NMRスペクトルはレバウジオシドIに関する文献による報告と完全に一致した(表10.1参照)。炭素が番号付けられたレバウジオシドIの構造に関しては図3を参照されたい。
配列番号548のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号548に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号547によってコードされるGT(すなわち、配列番号548)の定向進化を、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられたライブラリーを構築することによって行った。次いで、このライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド66種の第6のラウンド(「ラウンド6」)をもたらした(表11.1)。
配列番号548改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積は400uLであり、溶解物を4倍に希釈した。アッセイを、反応物100μL中溶解物10μLを用い、50%エタノール中20mMのストック溶液からの1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)の基質添加量、および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いて行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、アッセイ物10μlを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、4℃で10分遠心分離した。上清を水中に1:10希釈し、表9.3に記載の通りRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。上位84種の改変体を、同じ条件を用い、1mMのステビオシド(Chromadex、>94%の純度)、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、またはレバウジオシドD(Chromadex、>93%の純度)を使用して再試験した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表11.1に列挙する。配列番号554、562、568、および576を有する改変体について、実施例1に記載の通り振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施して、操作されたラウンド6改変体のステビオシドおよびレバウジオシドDに対する活性を特徴付けた。0.03〜1g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、1mMのステビオシド(Chromadex、>94%の純度)またはレバウジオシドD(ChromaDex、>93%の純度)および1mMのADP−グルコースを伴う、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、2.5%v/vエタノールを含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotronタイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで1hにわたって反応を実施し、反応物を水150μLで希釈し、次いで、12.5μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル87.5μLに移すことによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に1:20希釈し、ステビオール配糖体に関して実施例9、表9.3に記載の通りRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。酵素の相対的な産生力を表11.2に列挙する。
配列番号562のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号562に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号561によってコードされるGT(すなわち、配列番号562)の定向進化を、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられたライブラリーを構築することによって行った。次いで、このライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド37種の第7のラウンド(「ラウンド7」)をもたらした(表12.1)。
配列番号562改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積は400uLであり、溶解物を4倍に希釈した。アッセイを、反応物100μL中溶解物10μLを用い、50%エタノール中20mMのストック溶液からの1mMのステビオシド(ChromaDex、>94%の純度)の基質添加量、および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いて行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を、アッセイ物10μlを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、4℃で10分遠心分離した。上清を水中に1:10希釈し、表9.3に記載の通りRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。上位84種の改変体を、同じ条件を用い、1mMのステビオシド(Chromadex、>94%の純度)、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、またはレバウジオシドD(Chromadex、>93%の純度)を使用して再試験した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表12.1に列挙する。
グルコシル化活性を有するグリコシルトランスフェラーゼ酵素の合成、最適化、およびアッセイ
本実施例では、グルコシル化活性を有するUGT酵素の合成、最適化およびアッセイに使用する方法を記載する。
Oryza sativa Japonica、Solanum tuberosum、Lycium barbarum、およびSolanum lycopersicum由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列をコドン最適化し、配列番号755、757、759、761、763、765、および767の遺伝子として合成した。これらの合成遺伝子を、pCK110900ベクター系にクローニングし(例えば、これによって参照により組み込まれる米国特許出願公開第2006/0195947号を参照されたい)、その後、E.coli W3110(ΔfhuA)において発現させた。E.coli株W3110にlacプロモーターの制御下でUGT酵素を発現させた。
振とうフラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスにおいて使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振とうフラスコ粉末(SFP)を生成した。酵素の振とうフラスコ粉末(SFP)調製物により、HTPアッセイで使用される細胞溶解物と比較してより精製された酵素の調製物(例えば、総タンパク質の>30%に至るまで)がもたらされ、より濃縮された酵素溶液を使用することが可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するE.coliの単一のコロニーを、30μg/mlのクロラムフェニコールおよび1%グルコースを含有するLuria Bertaniブロス5mL中に接種した。細胞をインキュベーター中、30℃、250rpmで振とうしながら終夜(少なくとも16時間)成長させた。培養物を、1Lフラスコ中、30μg/mlのCAMを含有するTerrific Broth(12g/Lのバクトトリプトン、24g/Lの酵母抽出物、4mL/Lのグリセロール、65mMのリン酸カリウム、pH7.0、1mMのMgSO4)250mL中に、600nmにおける光学濃度(OD600)が0.2になるまで希釈し、30℃で成長させた。
まず、精製タンパク質50μLを50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMの塩化マグネシウム、1mMのレバウジオシドA、および0.5mMのウリジンジホスホグルコースからなる総反応体積200μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら18hにわたって反応を実施した。煮沸した酵素反応物を陰性対照として使用した。反応物10μLを、0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化されたレバウジオシドA産物を実施例1、表1.1に記載の通りLC−MS/MSによって検出した。
凍結乾燥振とうフラスコ粉末を20mg/mLに再構成した。次いで、これらのストック10μLを、3mMのMgCl2、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、および2mMのウリジンジホスホグルコース(UDP−グルコース)を伴う、50mMのリン酸カリウム(KPhos)緩衝液、pH7、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら 16〜18hにわたって反応を実施した。配列番号758について、陰性対照を超える活性が検出された。LC−MS/MS分析ではレバウジオシドDへのレバウジオシドAの低変換(すなわち、<10%)が観察された。
配列番号758のGT改変体
本実施例では、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号758に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号757によってコードされるGT(すなわち、配列番号758)の定向進化を、酵素の表面残基に関連する位置が変異誘発に供された改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ステビオール配糖体に対するβ−1,2−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド10種の第1のラウンド(「ラウンド1」)をもたらした。
細胞を96ウェルプレート中に採集し、1%グルコースおよび30μg/mLのCAMを含有するLB培地中、30℃、200rpm、85%湿度で終夜成長させた。次いで、終夜成長物20μLを、30μg/mLのCAMを含有するTB成長培地380μLを含有するディープウェルプレートに移し、1mMのIPTGを用いて誘導し、30℃、200rpm、85%湿度で18hインキュベートした。細胞培養物を4000rpm、4℃で10分遠心分離し、培地を廃棄した。こうして得られた細胞ペレットを−80℃で凍結させ、室温、タイタープレート振とう機で2h、低スピードで振とうしながら溶解緩衝液(20mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5中、0.5g/Lのリゾチームおよび0.5g/LのPMBS)250μL中に溶解させた。次いで、プレートを4000rpmおよび4℃で20min遠心分離し、清澄化された溶解物上清を下記のHTPアッセイ反応に使用した。
配列番号757改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、50%エタノール中20mMのストック溶液からの1mMのレバウジオシドA(Sigma、>96%の純度)の基質添加量、および0.5mMのUDP−グルコース(Sigma、>98%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら4h。0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いて反応物をクエンチし、4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:20希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。レバウジオシドAからレバウジオシドDを配列番号758よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表14.1に列挙する。配列番号758と比べて表14.1に示されている以下のアミノ酸変異を有する改変体を分析するための凍結乾燥粉末産生のために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例1に記載の通り成長させた。
まず、250mL振とうフラスコ培養物を成長させ、誘導し、溶解させた。細胞残屑を実施例1に記載の通り遠心分離によって除去し、清澄化された溶解物上清を採取した。次いで、溶解物10μLを、50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、1mMのレバウジオシドA(Sigma、>96%の純度)、および2mMのUDP−グルコース(Sigma、>98%の純度)の総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら0〜18hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:20希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。
配列番号770のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号770改変体に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号769によってコードされるGT(すなわち、配列番号770)の定向進化を行った。ライブラリーは、実施例14において同定された有益な変異(ラウンド1)を組み換えたか、公的に利用可能なデータベース内のホモログ由来の多様性がコンビナトリアルに組み入れられたか、または酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第2のラウンド(「ラウンド2」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から10種同定され(表15.1)、飽和変異誘発から19種が同定され(表15.2)、表面残基およびホモログ多様性から53種が同定された(表15.3)。
配列番号769改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、1mMのレバウジオシドA(Sigma、>96%の純度)の基質添加量および4mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら18h。0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いて反応物をクエンチし、4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。レバウジオシドAからレバウジオシドDをADP−グルコースを用いて配列番号770よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。組み換えられた有益な変異由来の操作されたポリペプチドを表15.1に列挙する。飽和変異誘発ライブラリー由来の操作されたポリペプチドを表15.2に列挙する。
残りのコンビナトリアルラウンド2ライブラリーを以下の通りスクリーニングした:配列番号769改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量または反応物100μL中4倍希釈溶解物10μLを用い、1mMのレバウジオシドA(Sigma、>96%の純度)の基質添加量および1mMのUDP−グルコース(Sigma、>98%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら1〜2h。反応物を0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチしたか、または、反応物10μLを、0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:100または1:10希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。レバウジオシドAからレバウジオシドDを配列番号770よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表15.3に列挙する。
ラウンド2飽和変異誘発ライブラリー由来の88種の改変体を以下の通りスクリーニングした:配列番号769改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、1mMのレバウジオシドI(実施例10に記載の通りレバウジオシドAから調製されたもの)の基質添加量および1mMのUDP−グルコース(Sigma、>98%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotronタイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら66h。反応物を、反応物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、LC−MS/MSにより、表15.5に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。レバウジオシドIからレバウジオシドMを配列番号770よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。上位2種の操作されたポリペプチドは、配列番号770と比べてそれぞれ変異F156RおよびG199Hを有する配列番号1292および1294であった。
振とうフラスコ粉末を再構成して20g/Lの粉末を提供した。次いで、これらのストック10μLを、3mMのMgCl2、1mMのレバウジオシドA(Sigma、>96%の純度)、および4mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)を伴う50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、30℃、300RPMで振とうしながら0〜19hにわたって反応を実施した。反応物を実施例14に記載の通りクエンチし、沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:100希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。
配列番号792のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号792に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。上記の前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号791によってコードされるGT(すなわち、配列番号792)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第3のラウンド(「ラウンド3」)をもたらした。
配列番号792改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)の基質添加量および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのKPhos緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら5〜6h。次いで、反応物10μLを、0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLを用いてクエンチし、4℃で10分遠心分離し、上清を実施例9、表9.3に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。レバウジオシドAからレバウジオシドDをADP−グルコースを用いて配列番号792よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表16.1に列挙する。振とうフラスコ規模の培養物を、表16.1に示されている改変体を配列番号792と比べて分析するためのSFP産生のために実施例1に記載の通り成長させた。
振とうフラスコ粉末を再構成して20g/Lの粉末を提供した。次いで、これらのストック10μLを、3mMのMgCl2、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、および2mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)を伴う50mMのKPhos緩衝液、pH7、総反応体積100μL中に希釈した。
レバウジオシドIからレバウジオシドMへのグルコシル化を含めたステビオール配糖体グルコシル化のための、配列番号954のADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号954に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。上記の前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号953によってコードされるGT(すなわち、配列番号954)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第4のラウンド(「ラウンド4」)をもたらした。
実施例13に記載の通り、溶解緩衝液400μLを用いて細胞を溶解させた。配列番号954改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物20μLの溶解物添加量を用い、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)の基質添加量および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのKPhos緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を実施例16に記載の通りクエンチし、上清を実施例9、表9.3に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。レバウジオシドAからレバウジオシドDをADP−グルコースを用いて配列番号954よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表17.1に列挙する。振とうフラスコ規模の培養物を、表17.1に示されている以下のアミノ酸変異を有する改変体(配列番号150と比べて)を分析するためのSFP産生のために実施例1に記載の通り成長させた。
振とうフラスコ粉末を再構成して50g/Lの粉末を提供した。次いで、これらのストック1μLを、3mMのMgCl2、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、および2mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)を伴う50mMのKPhos緩衝液、pH7、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら2hにわたって反応を実施した。次いで、反応物を水中に1:5希釈し、希釈した反応物25μLを、0.2%ギ酸含有アセトニトリル75μLを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、RapidFire−MS/MSにより、実施例9、表9.3に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。
振とうフラスコ粉末を再構成して50g/Lの粉末を提供した。次いで、これらのストック2μLを、3mMのMgCl2、1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、および2mMのUDP−グルコース(Sigma、>98%の純度)を伴う50mMのKPhos緩衝液、pH7、総反応体積100μL中に希釈した。Thermotronタイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら20hにわたって反応を実施した。次いで、反応物を、0.5体積/体積の0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いてクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:20希釈した後、LC−MS/MSにより、実施例15、表15.5に記載の計器およびパラメータを用いて検出した。
配列番号74のスクロースシンターゼ改変体
本実施例では、スクロースおよびADPからのADP−グルコースの産物の改善のための、配列番号73に由来するスクロースシンターゼ(SuS)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号73によってコードされるSuS(すなわち、配列番号74)の定向進化を、酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置が飽和変異誘発に供され、公的に利用可能なデータベース内のホモログ由来の多様性が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、37種の、ADP−グルコースの合成に対する活性が改善された操作されたSuS改変体ポリペプチドの第1のラウンド(「ラウンド1」)をもたらした。
配列番号73改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、水中60%ストック溶液からの30%w/vスクロース(Sigma)の基質添加量および2mMのADP(Sigma、>95%)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのTris−HCl緩衝液、pH7.5、3mMのMgCl2、サーモサイクラー中、30℃で2h。反応物を、95℃で10分にわたって熱クエンチし、次いで、文献から適応させた比色定量D−フルクトースデヒドロゲナーゼアッセイによって分析した(例えば、Ameyamaら、J. Bacteriol.、145巻:814〜823頁[1981年];およびAmeyama、Meth. Enzymol.、89巻:20〜29頁[1982年]を参照されたい)。簡単に述べると、フルクトース濃度が<1g/Lになるように希釈した試料20μL、100mMのフェリシアン化カリウム(Sigma P−8131)20μL、および0.8単位/mLのフルクトースデヒドロゲナーゼ(Sigma F4892)160μLを0.1%Triton X−100を伴うpH4.6、McIlvaine緩衝液に溶解させた96ウェルプレートにおいて終夜酵素カップリングアッセイを行った。この反応ではフルクトースがK4Fe(CN)6に定量的に変換され、次いでこれを、終夜反応物67μLを停止液(0.3%w/vドデシル硫酸ナトリウム、Sigma L−4509、8.1%v/vリン酸、Sigma P−6560、および0.5%w/v硫酸第二鉄、Sigma F−1135)33μLに添加し、20分にわたって振とうしてK4Fe(CN)6をプルシアンブルーに完全に変換させ、波長690nmにおけるその吸光度をプレートリーダーで読み取ることによって比色定量により定量化する。
配列番号1080のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1079によってコードされるSuS(すなわち、配列番号1080)の定向進化を、上記の活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーおよび追加的なホモログ多様性が組み換えられたライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、実施例18に記載のハイスループット(HTP)アッセイを使用し、低基質負荷量でスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性を有する操作されたSuS改変体ポリペプチド34種の第2のラウンド(「ラウンド2」)をもたらした。
まず、SuS凍結乾燥振とうフラスコ粉末を水中に再構成し、総反応体積中タンパク質0.025〜1g/Lにわたる最終濃度に添加した。反応条件は以下の通りであった:1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、10mMのスクロース(Sigma)、および1mMのADP(Sigma)を伴う、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2。ADP−グルコースからレバウジオシドAへのグルコシル転移を触媒するために添加したGTは、配列番号548、総反応体積100μL中、最終濃度2g/Lであった。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、アッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、実施例9、表9.3に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。カップリング振とうフラスコ粉末アッセイにおいてレバウジオシドAから産生されたレバウジオシドIの相対レベルを表19.2に列挙する。
配列番号1158のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1157によってコードされるSuS(すなわち、配列番号1158)の定向進化を、上記の活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性を有する操作されたSuS改変体ポリペプチド34種の第3のラウンド(「ラウンド3」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のハイスループット(HTP)酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした:1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)の基質添加量ならびに1mMのADP(Sigma、>95%)および10mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量を伴う、反応体積100μL中、SuS溶解物10μLおよび2g/LのGT配列番号548。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。上記の反応物を、アッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、ステビオール配糖体産物を、実施例9、表9.3に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性を示した操作されたSuS改変体ポリペプチド56種を、同じ条件を用い、溶解物負荷量を2.5分の1に減少させて、3連で再試験した。得られた操作されたポリペプチドを表20.1に列挙する。
まず、SuS凍結乾燥振とうフラスコ粉末を水中に再構成し、総反応体積中タンパク質0.025〜5g/Lにわたる最終濃度に添加した。反応条件は以下の通りであった:1g/LのレバウジオシドD、10mMのスクロース(Sigma)、および1mMのADP(Sigma)を伴う、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2。ADP−グルコースからレバウジオシドAへのグルコシル転移を触媒するために添加したGTは、配列番号561/562、総反応体積100μL中最終濃度1g/Lであった。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1hにわたって反応を実施した。上記の反応物を、アッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化された産物を、水中に1:10希釈した後、実施例9、表9.3に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。カップリング振とうフラスコ粉末アッセイにおいてレバウジオシドDから産生されたレバウジオシドMの相対レベルを表20.2に列挙する。
スクロースを用いたADP再利用のための操作されたSuSポリペプチドの3ラウンドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、相対的なタンパク質発現レベルを決定した。1×LDSローディング緩衝液および1×還元剤(Life Technologies)を用いて試料を調製した。4〜12%Bis−Trisアクリルアミドゲル(Life Technologies)を、振とうフラスコ規模の培養物由来の凍結乾燥させた可溶性粗溶解物のレーン当たり5μgでローディングし、MES泳動緩衝液を200Vで25minにわたって泳動し、ImageJ解析ソフトウェアを使用してバンドを定量化した。相対的な発現レベルを表20.3に列挙する。配列番号1079/1080、1157/1158、および1221/1222は、有意により良好に発現した遺伝子および/または有意により良好にフォールディングされた/より安定なタンパク質である。これらは、野生型遺伝子よりも多くのタンパク質を産生する。
AGTおよびACSuSを用いたステビオシドからレバウジオシドAへの転換
本実施例では、AGTおよびACSuSを使用してレバウジオシドAを産生するために行った実験を記載する。使用した緩衝液は、3mMのMgSO4を伴う50mMのpH7.0リン酸カリウムであった。酵素およびスクロースストック溶液(400g/L)を緩衝液中に調製した。「Reb A 60」は、ステビオシドとレバウジオシドAそれぞれ約1:2の混合物であった。空気下のバイアルに、400g/Lのスクロース中、8g/Lのβ−1,3−GT配列番号1290ストック溶液250μL、2g/LのSuS配列番号1158ストック溶液250μLならびに50g/LのReb A 60および2.6g/LのADPストック溶液500μLを添加した。最終組成は、25g/LのReb A 60、200g/Lのスクロース、2g/Lの配列番号1290、0.5g/Lの配列番号1158、および1.3g/L(3mM)のADPであった。得られた清澄な均一の溶液を空気下で撹拌した(沈殿物が形成されるに伴って反応物が徐々に濁った)。アリコートを取ることによって反応の進行を追跡し、1:1アセトニトリル/水を用いてクエンチした。4000rpm/r.t./5minで遠心分離した後、清澄な均一の上清を、表21.1および表21.2に列挙されている計器およびパラメータを使用してHPLCによって分析した。48h後、反応混合物は、>90%Reb Aからなった(表21.3)。
AGTおよびACSuSを用いたステビオシドからレバウジオシドAへの転換およびレバウジオシドAからレバウジオシドDへの転換
AGTおよびACSuSを用いたレバウジオシドDからレバウジオシドMへの転換
本実施例では、AGTおよびACSuS改変体を使用してレバウジオシドDからレバウジオシドMを産生するために行った実験を記載する。空気下のバイアルに、400g/Lのスクロース中、Reb D、100mg、80g/Lのβ−1,3−GT配列番号548ストック溶液250μL、10g/LのSuS配列番号1158ストック溶液250μLおよび2.6g/LのADPストック溶液500μLを添加した。使用した緩衝液は、3mMのMgSO4を伴う50mMのpH7.0リン酸カリウムであった。酵素およびスクロースストック溶液(400g/L)を緩衝液中に調製した。最終組成は、100g/LのReb D、200g/Lのスクロース、20g/Lの配列番号548、2.5g/Lの配列番号1158、および1.3g/L(3mM)のADPであった。得られた濃いスラリーを空気下で撹拌した。アリコートを取ることによって反応の進行を追跡し、1:1アセトニトリル/水を用いてクエンチした。4000rpm/r.t./5minで遠心分離した後、清澄な均一の上清を、表21.1および表21.2に列挙されている計器およびパラメータを使用してHPLCによって分析した。48h後、反応混合物は、>90%Reb Mからなった(表23.1)。
AGTおよびACSuSを用いたステビオシドからレバウジオシドAへの転換、レバウジオシドAからレバウジオシドDへの転換、およびレバウジオシドDからレバウジオシドMへの転換
本実施例では、ステビオシドからレバウジオシドAを産生し、レバウジオシドAからレバウジオシドDを産生し、レバウジオシドDからレバウジオシドMを産生するために行った実験を記載する。空気下のバイアルに、400g/Lのスクロース中、20g/Lのβ−1,3−GT配列番号1290ストック溶液250μL、40g/Lのβ−1,2−GT配列番号954ストック溶液250μL、ならびに50g/LのReb A 60、2.6g/LのADP、5g/Lのβ−1,3−GT配列番号548、および1g/LのSuS配列番号1158ストック溶液500μLを添加した。使用した緩衝液は、3mMのMgSO4を伴う50mMのpH7.0リン酸カリウムであった。酵素およびスクロースストック溶液(400g/L)を緩衝液中に調製した。最終組成は、25g/LのReb A 60、200g/Lのスクロース、5g/Lの配列番号1290、10g/Lの配列番号954、2.5g/Lの配列番号548、0.5g/Lの配列番号1158および1.3g/L(3mM)のADPであった。得られた清澄な均一の溶液を空気下で撹拌した(沈殿物が形成されるに伴って反応物が徐々に濁った)。アリコートを取ることによって反応の進行を追跡し、1:1アセトニトリル/水を用いてクエンチした。4000rpm/r.t./5minで遠心分離した後、清澄な均一の上清を、表21.1および表21.2に列挙されている計器およびパラメータを使用してHPLCによって分析した。24h後、<5%ステビオシドが残っており、9%のReb Mの形成が観察された(表24.1)。
AGTおよび/またはACSuSの固定化
本実施例では、AGT(例えば、配列番号1290、954、および/または548の改変体)および/またはACSuS改変体(例えば、配列番号1158)を固定化するために行った実験を記載する。容器に、単独でまたは酵素の組合せとして(すなわち、AGTおよび/またはACSuS酵素)のいずれかの酵素溶液、および固体支持体を添加する。固体支持体は、カチオン性、アニオン性、疎水性、親水性であり、チオール、アルコール、アミン、オレフィン、ハロゲン化アルキルおよび/またはエポキシドなどの、共有結合を形成する官能基の存在を伴うまたは伴わない。固体支持体は、別個のポリマー樹脂または無定形(ナノ)粘土または活性炭のいずれかである。産物の単離/酵素の再利用に適する場合には磁気粒子が使用される。反応は、グルタルアルデヒドの存在下または不在下で行われる。固体支持体による酵素取り込みの進行をBradfordアッセイによって追跡する。あるいは、固体支持体をカラム内に充填し、酵素溶液をカラムを通して流し、必要であれば、所望の程度の酵素捕捉に到達するまで、再利用する。一部の実施形態では目的の酵素全てを同じ反応容器中で同じ固体支持体上に固定化するが、一部の代替的な実施形態では酵素を別々の容器に個別に固定化するか、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、固定化された酵素を濾過によって単離するか、または、緩衝液、スクロース、ADPおよび基質を固定化反応混合物に添加することによってすぐに使用する。
固定化されたAGTおよび/またはACSuSならびに糖溶液の再利用を用いたステビオシドからレバウジオシドAへの転換
本実施例では、固定化されたAGT(例えば、配列番号1290)およびACSuS(例えば、配列番号1158)、ならびに糖溶液の再利用を使用した、ステビオシドからレバウジオシドAへの転換を記載する。容器に、固定化されたβ−1,3−GT(例えば、配列番号1290)および固定化されたSuS(例えば、配列番号1158)を添加する。あるいは、一部の実施形態では、酵素の一方を固定化された形態で使用し、他方を溶液形態で使用する。緩衝液、スクロース、ADPおよび基質(すなわち、ステビオシドまたはReb A 60)の添加後、所望の変換に到達するまで反応をモニタリングする。一部の実施形態では、産物および固定化された酵素を濾過によって単離する。一部の実施形態では、固定化された酵素を、遠心分離、粒子サイズ濾過または磁気回収のいずれかによって産物からさらに分離し、再使用する。糖濾液を次の反復のために容器に戻す。
固定化されたAGTおよび/またはACSuSならびに糖溶液の再利用を用いた、レバウジオシドAからレバウジオシドDへの転換
本実施例では、固定化されたAGTおよびACSuS、ならびに糖溶液の再利用を用いてレバウジオシドDからレバウジオシドDを産生するために行った実験を記載する。容器に、固定化されたβ−1,2−GT(例えば、配列番号954)および固定化されたSuS(例えば、配列番号1158)を添加する。あるいは、一部の実施形態では、酵素の一方を固定化された形態で使用し、他方を溶液形態で使用する。緩衝液、スクロース、ADPおよび基質(ステビオシドまたはReb A 60)の添加後、所望の変換に到達するまで反応をモニタリングする。一部の実施形態では、産物および固定化された酵素を濾過によって単離する。一部の実施形態では、固定化された酵素を、遠心分離、粒子サイズ濾過または磁気回収のいずれかによって産物からさらに分離し、再使用する。糖濾液を次の反復のために容器に戻す。
固定化されたAGTおよび/またはACSuSならびに糖溶液の再利用を用いた、レバウジオシドDからレバウジオシドMへの転換
本実施例では、固定化されたAGTおよびACSuS、ならびに糖溶液の再利用を用いてレバウジオシドDからレバウジオシドMを産生するために行った実験を記載する。容器に、固定化されたβ−1,3−GT(例えば、配列番号548)および固定化されたSuS(例えば、配列番号1158)を添加する。あるいは、一部の実施形態では、酵素の一方を固定化された形態で使用し、他方を溶液形態で使用する。緩衝液、スクロース、ADPおよびReb Dの添加後、所望の変換に到達するまで反応をモニタリングする。一部の実施形態では、産物および固定化された酵素を濾過によって単離する。一部のさらなる実施形態では、固定化された酵素を、遠心分離、粒子サイズ濾過または磁気回収のいずれかによって産物からさらに分離し、再使用する。糖濾液を次の反復のために容器に戻す。
固定化されたAGTおよびACSuSならびに糖溶液の再利用を用いたステビオシドからレバウジオシドAへの転換およびレバウジオシドAからレバウジオシドDへの転換
本実施例では、固定化されたAGTおよびACSuS、ならびに糖溶液の再利用を用いて、ステビオシドからレバウジオシドAを産生し、レバウジオシドAからレバウジオシドDを産生するために行った実験を記載する。容器に、固定化されたβ−1,3−GT(例えば、配列番号1290)およびβ−1,2−GT(例えば、配列番号954)および固定化されたSuS(例えば、配列番号1158)を添加する。あるいは、これらの酵素の1つまたは2つを固定化された形態で使用し、他の酵素を溶液形態で使用する。緩衝液、スクロース、ADPおよび基質(ステビオシドまたはReb A 60)の添加後、所望の変換に到達するまで反応をモニタリングする。一部の実施形態では、産物および固定化された酵素を濾過によって単離する。一部の実施形態では、固定化された酵素を、遠心分離、粒子サイズ濾過または磁気回収のいずれかによって産物からさらに分離し、再使用する。糖濾液を次の反復のために容器に戻す。
固定化されたAGTおよびACSuSならびに糖溶液の再利用を用いた、ステビオシドからレバウジオシドAへの転換、レバウジオシドAからレバウジオシドDへの転換、およびレバウジオシドDからレバウジオシドMへの転換
容器に、固定化されたβ−1,3−GT(例えば、配列番号1290)、β−1,2−GT(例えば、配列番号954)、β−1,3−GT(例えば、配列番号548)、および固定化されたSuS(例えば、配列番号1158)を添加する。あるいは、一部の実施形態では、これらの酵素のうちの1つ、2つまたは3つを固定化された形態で使用し、他の酵素を溶液形態で使用する。緩衝液、スクロース、ADPおよび基質(ステビオシドまたはReb A 60)の添加後、所望の変換に到達するまで反応をモニタリングする。一部の実施形態では、産物および固定化された酵素を濾過によって単離する。一部の実施形態では、固定化された酵素を、遠心分離、粒子サイズ濾過または磁気回収のいずれかによって産物からさらに分離し、再使用する。糖濾液を次の反復のために容器に戻す。
配列番号1222のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1222によってコードされるSuSの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性を有する操作されたSuS改変体ポリペプチド49種の第4のラウンド(「ラウンド4」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、250μLに溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物をTris−HCl、pH7.5中に20倍希釈した。次いで、希釈したSuS溶解物10μLおよび2g/LのGT配列番号696(Rd8BB)を、約1mMのレバウジオシドDの基質添加量ならびに1MmのADP(Sigma、>95%)および10mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量と共に、反応体積100μLに組み合わせた。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら2h。上記の反応物を、アッセイ混合物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に10倍希釈し、ステビオール配糖体産物を表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。
振とうフラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスにおいて使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振とうフラスコ粉末(SFP)を生成した。酵素の振とうフラスコ粉末(SFP)調製物により、HTPアッセイで使用される細胞溶解物と比較してより精製された酵素の調製物(例えば、総タンパク質の>30%に至るまで)がもたらされ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するE.coliの単一のコロニーを、30μg/mlのクロラムフェニコールおよび1%グルコースを含有するLuria Bertaniブロス5mL中に接種した。細胞をインキュベーター中、30℃、250rpmで振とうしながら終夜(少なくとも16時間)成長させた。培養物を、1Lフラスコ中、30μg/mlのCAMを含有するTerrific Broth(12g/Lのバクトトリプトン、24g/Lの酵母抽出物、4mL/Lのグリセロール、65mMのリン酸カリウム、pH7.0、1mMのMgSO4)250mLに、600nmにおける光学濃度(OD600)0.2まで希釈し、30℃で成長させた。
レバウジオシドDからのレバウジオシドMの形成を容易にするための、操作されたラウンド4 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMの塩化マグネシウム、1g/LのレバウジオシドD、10mMのスクロース、1mMのADP、および2g/LのGT配列番号734を含有する総反応体積100μLに0.125g/Lの濃度で添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1hにわたって反応を実施した。反応物を、反応混合物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に10倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。少なくとも3種の改変体が配列番号1222よりも高い活性を有した。配列番号1222と比べた、改変体によってレバウジオシドDから産生されたレバウジオシドMのレベルを表31.3に列挙する。変異H47L、R93V、P358E、I372V、W375Y、R440P、およびK724Hを有する改変体(配列番号1392)が、配列番号1222と比べて、最も高い活性を有した。したがって、コードするポリヌクレオチド(配列番号1391)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号1392のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1391によってコードされるSuSの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性を有する操作されたSuS改変体ポリペプチド86種の第5のラウンド(「ラウンド5」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLに溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物を、約1mMのレバウジオシドDの基質添加量ならびに1mMのADP(Sigma、>95%)および10mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量を伴う、反応体積100μL中、Tris−HCl、pH7.5、希釈したSuS溶解物10μLおよび2g/LのGT配列番号4684(Rd9BB)中に25〜60倍希釈した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。上記の反応物を、アッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に10倍希釈し、ステビオール配糖体産物を表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。
レバウジオシドDからのレバウジオシドMの形成を容易にするための、操作されたラウンド4 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMの塩化マグネシウム、1g/LのレバウジオシドD、10mMのスクロース、1mMのADP、および2g/LのGT配列番号4684を含有する総反応混合物体積100μLに、0.05g/Lの濃度で添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1〜2hにわたって反応を実施した。反応物を、水中に2.5倍希釈することによって可溶化し、希釈した反応物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.33倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。表32.2の改変体の全てが配列番号1392よりも高い活性を有した。配列番号1392と比べた、改変体によってレバウジオシドDから産生されたレバウジオシドMのレベルを表32.2に列挙する。配列番号1392と比べて変異V68A、L98V、R129E、R154H、およびA635Sを有する改変体(配列番号1455)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号1456のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1455によってコードされるSuSの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性を有する操作されたSuS改変体ポリペプチド16種の第6のラウンド(「ラウンド6」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLに溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物をTris−HCl、pH7.5中に30倍希釈した。次いで、希釈したSuS溶解物10μLおよび1g/LのGT配列番号2814(Rd8BB)を、4.5mMのレバウジオシドA97の基質添加量ならびに0.25mMのADP(Sigma、>95%)および10mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量と共に、反応体積100μLに組み合わせた。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。上記の反応物を、アッセイ混合物10μLを水90μLに添加することによって可溶化し、可溶化したアッセイ混合物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に7.3倍希釈し、ステビオール配糖体産物を表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド6 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、4.5mMのレバウジオシドA97、30mMのスクロース、0.25mMのADP、および1g/LのGT配列番号2814を含有する総反応体積100μLに0.01g/Lの濃度で添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1〜2hにわたって反応を実施した。反応物を、水中に10倍希釈することによって可溶化し、希釈した反応物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に4.4倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。少なくとも4種の改変体が配列番号1456よりも高い活性を有した。配列番号1456と比べた、改変体によってレバウジオシドAから産生されたレバウジオシドDのレベルを表33.2に列挙する。配列番号1456と比べて変異Y17D、G54D、S161T、F519T、L727E、およびA738Eを有する改変体(配列番号1582)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号1582のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1581によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性を有する操作されたSuS改変体ポリペプチド87種の第7のラウンド(「ラウンド7」)をもたらした。
コンビナトリアルライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物をTris−HCl、pH7.5中に約90倍希釈した。次いで、希釈したSuS溶解物10μLおよび1g/LのGT配列番号2884(Rd9BB)を、4.5〜7.5mMのレバウジオシドA97の基質添加量ならびに0.2〜0.25mMのADP(Sigma、>95%)および30mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量と共に、反応体積100μLに組み合わせた。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら2h。上記の反応物を、アッセイ物10μLを水90〜190μLに添加することによって可溶化し、可溶化したアッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に4.4〜6.7倍希釈し、ステビオール配糖体産物を表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド7 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、7.5mMのレバウジオシドA97、30mMのスクロース、0.2mMのADP、および1g/LのGT配列番号2884を含有する総反応体積100μLに0.02g/Lの濃度で添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1hにわたって反応を実施した。反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、希釈した反応物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に4.4倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。少なくとも3種の改変体が配列番号1582よりも高い活性を有した。配列番号1582と比べた、改変体によってレバウジオシドAから産生されたレバウジオシドDのレベルを表34.2に列挙する。配列番号1582と比べて変異F160W、Q381S、R550Q、L636Q、およびA681Vを有する改変体(配列番号1764)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号1764のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1763によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性を有する操作されたSuS改変体ポリペプチド24種の第8のラウンドおよび第9のラウンド(「ラウンド8」および「ラウンド9」)をもたらした。
コンビナトリアルライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物をTris−HCl、pH7.5中に15倍希釈した。次いで、希釈したSuS溶解物10μLおよび1g/LのGT配列番号2884(Rd9BB)を、15mMのレバウジオシドA97の基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>93%)および45mMのスクロース(ショ糖)の補基質添加量と共に、反応体積100μLに組み合わせた。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら2h。上記の反応物を、アッセイ物10μLを水390μLに添加することによって可溶化し、可溶化したアッセイ物20μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル180μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体産物を表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。配列番号1764と比べて実質的に改善されたコンビナトリアル改変体は同定されず、したがって、別のコンビナトリアルおよび飽和変異誘発ライブラリーの組を、同じ骨格を使用して生成し、この組を「ラウンド9」と名付けた。
コンビナトリアルライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。希釈していない溶解物(飽和変異誘発ライブラリー)または32×(ラウンド9コンビナトリアルライブラリー)をTris−HCl、pH7.5に添加した。ラウンド9ライブラリー溶解物を62℃で1h(コンビナトリアルライブラリー)または3.75h(飽和変異誘発ライブラリー)プレインキュベートして酵素を熱的に攻撃した。次いで、希釈したSuS溶解物10μLおよび1g/LのGT配列番号3244(Rd12B)を、15mMのレバウジオシドA97の基質添加量、0.2mMのADP(Sigma、>95%)、45mMのスクロース(ショ糖)、および9mMのフルクトース(Sigma)の補基質添加量と共に、反応体積100μLに組み合わせた。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら2〜3h。上記の反応物を、アッセイ物10μLを水390μLに添加することによって可溶化し、可溶化したアッセイ物20μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル180μLに添加することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体産物を表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを24種同定した。得られた操作されたポリペプチドを表35.1に列挙する。表35.2に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例31に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド9 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、45mMのスクロース、9mMのフルクトース、0.2mMのADP、および1g/LのGT配列番号3244を含有する総反応体積100μLに0.006〜0.2g/Lの濃度で添加した。プレインキュベーションを伴わずに、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら2hにわたって反応を実施した、またはSFPをpH6リン酸カリウム緩衝液中10倍の最終濃度、62℃で1hプレインキュベートした後、60℃で反応を2h行った。反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に10倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。表35.2に列挙されている改変体8種全てが配列番号1764よりも高い活性を有した。配列番号1764と比べて変異G181N、A548P、H705Pを有する改変体(配列番号1804)が最も有益な変異を有し、これを、スクロースからADPにグルコシルを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号1804のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1803によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性が増大した操作されたSuS改変体ポリペプチド82種の第10のラウンド(「ラウンド10」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物をリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中に20倍希釈し、64℃(コンビナトリアルライブラリー)または65℃(飽和変異誘発ライブラリー)で15分プレインキュベートした。次いで、希釈したSuS溶解物10μLおよびそれぞれ0.5〜1g/LのGT配列番号3696または3502を、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、0.2mMのADP(Sigma、>93%)、45mMのスクロース(ショ糖)、および9mMのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら3h。上記の反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に10倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体産物を表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定し、それらが表36.1に列挙されている。表36.2に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例31に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド10 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)をリン酸カリウム緩衝液、pH6中0.06〜2g/Lに構成し、アリコートをサーモサイクラー中、64℃で15分プレインキュベートした。次いで、これらのSFP希釈物10μLをプレインキュベートするかまたはプレインキュベートせずに、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、45mMのスクロース、9mMのフルクトース、0.2mMのADP、および1g/LのGT配列番号3696を含有する総反応体積100μLに添加した。プレインキュベートしていないSFP試料については55℃で、およびプレインキュベートしたSFPについては60℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら3hにわたって反応を実施した。反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に10倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。プレインキュベートした条件下では表36.2に列挙されている改変体7種全てが配列番号1804よりも高い活性を有し、55℃条件下では1種を除いて全てが同様に高い活性を有した。変異P517AおよびV681Aを有する改変体(配列番号1840)が両方の条件下で配列番号1804と比べて最も改善され、したがって、これを、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号1840のスクロースシンターゼ改変体
配列番号1839によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性が増大した操作されたSuS改変体ポリペプチド167種の第11のラウンド(「ラウンド11」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物をリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中10〜20倍希釈し、66℃で15分プレインキュベートした。次いで、希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μLおよび0.5g/LのGT配列番号3696または3956を、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、0.2mMのADP(Amresco、>93%)、45mMのスクロース(ショ糖)、および9mMのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。上記の反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中5〜10倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に希釈して、約10μMのステビオール配糖体およびステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定し、それらが表37.1および37.2に列挙されている。表37.3に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例31に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド11 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)をリン酸カリウム緩衝液、pH6中0.03〜1g/Lに構成し、アリコートをサーモサイクラー中66℃で15分プレインキュベートした。次いで、これらのSFP希釈物10μLをプレインキュベートするかまたはプレインキュベートせずに、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、45mMのスクロース、9mMのフルクトース、0.2mMのADP、および0.5g/LのGT配列番号3956を含有する総反応体積100μLに添加した。プレインキュベートしていないSFP試料については55℃で、およびプレインキュベートしたSFPについては60℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4hにわたって反応を実施した。反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に10倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。プレインキュベートした条件下では表37.3に列挙されている改変体8種全てが配列番号1840よりも高い活性を有し、55℃条件下では3種を除いて全てが同様に高い活性を有した。両方の条件下で配列番号1840と比べて改善された、変異D17R、D52P、L388K、G589S、E738S、およびD765Sを有する改変体(配列番号2064)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号2064のスクロースシンターゼ改変体
配列番号2063によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性が増大した操作されたSuS改変体ポリペプチド92種の第12のラウンド(「ラウンド12」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物をリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中に10倍希釈し、68℃で15分プレインキュベートした。次いで、希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μLおよび0.5g/LのGT配列番号3956または4256を、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、0.2mMのADP(Amresco、>93%)、37.5mMのスクロース(ショ糖)、および9mMのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。上記の反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に7.5倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定し、それらが表38.1および38.2に列挙されている。表38.3に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例31に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド12 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)をリン酸カリウム緩衝液、pH6中0.03〜1g/Lに構成し、アリコートをサーモサイクラー中、68℃で15分プレインキュベートした。次いで、これらのSFP希釈物10μLをプレインキュベートするかまたはプレインキュベートせずに、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、37.5mMのスクロース、9mMのフルクトース、0.2mMのADP、および0.5g/LのGT配列番号4256を含有する総反応体積100μLに添加した。プレインキュベートしていないSFP試料については55℃で、およびプレインキュベートしたSFPについては60℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4hにわたって反応を実施した。反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に10倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。凍結乾燥前に、以下の通り、清澄化した振とうフラスコ溶解物を用いてさらなる熱安定性特徴付けを行った:溶解物を緩衝液中に400倍希釈し、サーモサイクラー中、55〜70℃の勾配で16〜18hインキュベートした。%残存活性を決定するために、プレインキュベートした溶解物を、ステビオシドまたはレバウジオシドDのいずれか、および55℃で4hのインキュベーションを用いて上記の通りアッセイした。パーセント残存活性を、高温での活性を最低プレインキュベート温度での活性で割ったものとして表した。プレインキュベートした条件下では表38.3に列挙されている改変体7種全てが配列番号2064よりも高い活性を有し、55℃条件下では、2種が同様に有害性が低かった。全ての条件下で配列番号2064と比べて改善され、かつラウンド10飽和変異誘発スクリーニング由来の上位の変異を含有した、変異P57W、L562I、およびR711Kを有する改変体(配列番号2432)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号2432のスクロースシンターゼ改変体
配列番号2431によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性が増大した操作されたSuS改変体ポリペプチド46種の第13のラウンド(「ラウンド13」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。コンビナトリアルライブラリーに関しては、溶解物をリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中に10倍希釈し、73℃で15分プレインキュベートした。飽和変異誘発ライブラリーに関しては、溶解物をリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中に20倍希釈し、62℃で17.5時間プレインキュベートした。次いで、希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μLおよび0.5g/LのGT配列番号4256または4550を、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、0.2mMのADP(Amresco、>93%)、37.5mMのスクロース(ショ糖)、および9mMのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら3〜4h。上記の反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に7.5倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定し、それらが表39.1および39.2に列挙されている。表39.3に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例31に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド13 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)をリン酸カリウム緩衝液、pH6中0.03〜1g/Lに構成し、アリコートをサーモサイクラー中、73℃で15分プレインキュベートした。次いで、これらのSFP希釈物10μLをプレインキュベートするかまたはプレインキュベートせずに、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのレバウジオシドA(>97%の純度)、37.5mMのスクロース、9mMのフルクトース、0.2mMのADP、および0.5g/LのGT配列番号4550を含有する総反応体積100μLに添加した。プレインキュベートしていないSFP試料については55℃で、およびプレインキュベートしたSFPについては60℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4hにわたって反応を実施した。反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に3.3倍希釈し、ステビオール配糖体に関して表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。凍結乾燥前に、以下の通り、清澄化した振とうフラスコ溶解物を用いてさらなる熱安定性特徴付けを行った:溶解物を緩衝液中に400倍希釈し、サーモサイクラー中、62〜78℃の勾配で16.7hインキュベートした。パーセント残存活性を決定するために、プレインキュベートした溶解物を、ステビオシドまたはレバウジオシドDのいずれか、および60℃で4hのインキュベーションを用いて上記の通りアッセイした。パーセント残存活性を、高温での活性を最低プレインキュベート温度での活性で割ったものとして表した。表39.3に列挙されている改変体8種全てが少なくとも1つの条件下で配列番号2432よりも高い活性を有し、5種が全ての条件下で改善された。配列番号2432と比べて全ての条件下で改善された変異Q33H、L47P、E59A、P81L、S175G、P530F、E534W、Q550I、およびR606Mを有する改変体(配列番号2510)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用について最良の酵素として選択した。
配列番号2510のスクロースシンターゼ改変体
配列番号2509によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性が増大した操作されたSuS改変体ポリペプチド164種の第14のラウンド(「ラウンド14」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物を14.5g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中に35倍希釈し、73℃で15分プレインキュベートした。次いで、希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μL、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号4550、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号6864を、20g/LのRebA60、0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)、40g/Lのスクロース(ショ糖)、および9.6g/Lのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。上記の反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に15倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定し、それらが表40.1および40.2に列挙されている。表40.3に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例1に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド14 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、リン酸カリウム緩衝液、pH6中、14.5g/LのRebA60において0.03〜1g/Lに構成し、アリコートをサーモサイクラー中、73℃で15分プレインキュベートした。次いで、希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μL、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号4550、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号6864を、20g/LのRebA60、0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)、40g/Lのスクロース(ショ糖)、および9.6g/Lのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。上記の反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に15倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。表40.3に列挙されている改変体8種全てが配列番号2510よりも高い活性を有した。配列番号2510と比べて最も改善された、変異A41K、G112Q、G485S、およびF684Hを有する改変体(配列番号7506)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用について最良の酵素として選択した。
配列番号7506のスクロースシンターゼ改変体
配列番号7505によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性が増大した操作されたSuS改変体ポリペプチド56種の第15のラウンド(「ラウンド15」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物を14.5g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中に50倍希釈し、73℃で15分プレインキュベートした。次いで、希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μL、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号4550、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号6864を、20g/LのRebA60、0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)、40g/Lのスクロース(ショ糖)、および9.6g/Lのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。上記の反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に20倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定し、それらが表41.1に列挙されている。表41.2に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例1に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を容易にするための、操作されたラウンド15 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、リン酸カリウム緩衝液、pH6中、14.5g/LのRebA60において0.03〜1g/Lに構成し、アリコートをサーモサイクラー中、73℃で15分プレインキュベートした。希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μL、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号4550、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号6864を、20g/LのRebA60、0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)、40g/Lのスクロース(ショ糖)、および9.6g/Lのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。上記の反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に20倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。表41.2に列挙されている改変体8種全てが配列番号7506よりも高い活性を有した。配列番号7506と比べて最も改善された、変異D42T、I480V、L561I、およびH724Kを有する改変体(配列番号8420)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用について最良の酵素として選択した。
配列番号8420のスクロースシンターゼ改変体
配列番号8419によってコードされるスクロースシンターゼの定向進化を、進化のより早期のラウンドにおける産生の改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって継続した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースの生成に対する活性が増大した操作されたSuS改変体ポリペプチド155種の第16のラウンド(「ラウンド16」)をもたらした。
ライブラリーを、以下のHTP酵素カップリングアッセイを使用してスクリーニングした。ペレット化したE.coli培養物を、1mMの硫酸マグネシウムおよび0.5mg/mLのリゾチームおよび硫酸ポリミキシンB(PMBS)を伴うTris−HCl、pH7.5、400μLを用いて溶解させ、遠心分離によって清澄化した。溶解物を14.5g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中に30倍希釈し、75℃で1時間プレインキュベートした。次いで、希釈し、プレインキュベートしたSuS溶解物10μL、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号7784、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号8088を、20g/LのRebA60、0.025g/LのADP(Amresco、超高純度)、40g/Lのスクロース(ショ糖)、および9.6g/Lのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。上記の反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に20倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。分析後、GTとカップリングしてレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定し、それらが表42.1に列挙されている。表42.2に示されているアミノ酸変異を有する改変体について、振とうフラスコ規模の培養物をタンパク質特徴付けのために実施例1に記載の通り成長させた。
レバウジオシドAからのレバウジオシドMの形成を容易にするための、操作されたラウンド16 SUS改変体のスクロースおよびADPに対する活性を特徴付けるための実験を実施した。振とうフラスコ粉末(SFP)を、リン酸カリウム緩衝液、pH6中、14.5g/LのRebA60において0.03〜1g/Lに構成し、アリコートを75℃で1時間プレインキュベートした。希釈し、プレインキュベートしたかまたはプレインキュベートしていないSuS溶解物10μL、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号7784、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号8088を、20g/LのRebA60、0.025g/LのADP(Amresco、超高純度)、40g/Lのスクロース(ショ糖)、および9.6g/Lのフルクトースと共に、反応体積100μLで使用した。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。上記の反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清を水中に20倍希釈し、ステビオール配糖体産物を、表31.1に記載の計器およびパラメータを用いてRapidFire SPE−MS/MSによって検出した。表42.2に列挙されている改変体8種全てが、プレインキュベーション後に配列番号8420よりも高い産生を有した。配列番号8420と比べて最も改善された、変異D12S、R136Q、R139K、A517P、G603Q、L630M、A642V、およびV756Cを有する改変体(配列番号8910)を、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用について最良の酵素として選択した。
配列番号1054のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号1054に由来するGTポリペプチド(β1,2GT)の進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号1053によってコードされるGTの定向進化を、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられたライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド26種の第5のラウンド(「ラウンド5」)をもたらした。
配列番号1053改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を4倍に希釈した。1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)の基質添加量および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を伴う反応体積100μL中10μLの希釈した溶解物を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を水中に1:5希釈し、次いで、希釈したアッセイ物25μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル75μLに添加することによってクエンチした。得られた混合物を4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:5希釈し、表31.1に記載の通りRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。レバウジオシドAからレバウジオシドDをADP−グルコースを用いて産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定し、操作されたポリペプチドを表43.1に列挙する。表43.2に列挙されている改変体について、実施例31に記載の通り振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド5改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.006〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、1mMのレバウジオシドA、および1mMのADP−グルコースを含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで1hにわたって反応を実施した。反応物を水中に1:5希釈し、次いで、希釈したアッセイ物25μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル75μLに添加することによってクエンチし、4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:5希釈し、ステビオール配糖体に関してRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。0.05g/LのSFPの添加量でのラウンド5改変体のレバウジオシドAに対する活性を表43.2に列挙する。表43.2に列挙されている改変体6種全てが配列番号1054よりも高い活性を有した。変異E24L、N162R、E198P、M201G、T211E、W226V、L323V、およびL351Mを有する改変体(配列番号2600)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号2599)をレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
レバウジオシドIをグルコシル化してレバウジオシドMにするための配列番号1002のグリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号1002に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号1001によってコードされるGTの定向進化を、前のラウンドにおけるレバウジオシドIに対するグリコシルトランスフェラーゼ活性の改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、UDP−グルコースおよびレバウジオシドIに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドのラウンド(ラウンド5 RebI)をもたらした。
溶解緩衝液250μLを用いて細胞を溶解させた。配列番号1002改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、1mMのレバウジオシドIの基質添加量および1mMのUDP−グルコース(Sigma、>98%の純度)の補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのKPhos緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら18h。反応物を、アッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチした。得られた混合物を4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:5希釈し、表44.1に記載の通りLC−MS/MSによって分析した。UDP−グルコースを用いてレバウジオシドIからレバウジオシドMを配列番号1002よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表44.2に列挙する。
配列番号2600のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号2600に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号2599によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、酵素の表面残基に関連する変異および前のラウンドにおける活性改善に関連する有益な変異を組み換えたか、公的に利用可能なデータベース内のホモログ由来の多様性がコンビナトリアルに組み入れられたか、または酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第6のラウンド(「ラウンド6」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異およびホモログ多様性から24種同定され(表45.1)、飽和変異誘発から21種が同定された(表45.2)。
配列番号2600改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を40倍希釈した。1mMのレバウジオシドA(>97%の純度)の基質添加量および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の補基質添加量を伴う反応体積100μL中10μLの希釈した溶解物を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、45℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を水中に1:5希釈し、次いで、希釈したアッセイ物25μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル75μLに添加することによってクエンチした。得られた混合物を4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:5希釈し、RapidFire SPE−MS/MSによって分析した。レバウジオシドAからレバウジオシドDをADP−グルコースを用いて産生させ、コンビナトリアルライブラリーから同定された操作された改変体を表45.1に列挙する。飽和変異誘発ライブラリーからの上位84種の改変体を50℃、3連で上記の通り再試験した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表45.2に列挙する。表45.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド6改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.003〜0.1g/LのレベルのSFPを用いて実施例40に記載の通り実験を実施した。0.025g/LのSFPの添加量でのレバウジオシドAに対するラウンド6改変体の変換を表45.3に列挙する。表45.3に列挙されている改変体5種全てが配列番号2600よりも高い活性を有した。変異H2−、H7E、A12S、R15K、P175S、T260V、およびE318Dを有する改変体(配列番号2718)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号2717)をレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号2718のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号2718に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号2717によってコードされるGTの定向進化を、前のラウンドにおける活性または発現の改善に関連する有益な変異が組み換えられた改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。別のライブラリーは、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第7のラウンド(「ラウンド7」)をもたらした。組み換えられた有益な変異から操作された改変体が25種同定され(表46.1)、飽和変異誘発から操作された改変体が29種同定された(表46.2)。
配列番号2717改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を10倍に希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.2g/LのSUS SFP配列番号1392を用い、7.5mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに1mMのADP(Sigma、>95%)および15mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら2h。反応物を水中に1:10希釈し、次いで、希釈したアッセイ物10μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル90μLに添加することによってクエンチした。得られた混合物を4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、表31.1に記載の通りRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。残りの2つのラウンド7ライブラリーに関しては、0.2g/LのSUS SFP配列番号1456 SFPおよび30mMのスクロースを使用したことを例外として、上記の通りスクリーニングを実施した。組み換えられた有益な変異に由来する、SuSとカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作された改変体を表46.1に列挙する。飽和変異誘発ライブラリー由来の上位の改変体を、0.8mMのADPを使用し、反応物を水中に1:20希釈し、次いで、希釈したアッセイ物20μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル80μLに添加することによってクエンチしたことを除いて上記の手順を使用して、3連で再試験した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表46.2に列挙する。表46.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド7改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.002〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、2mMのレバウジオシドA、および2mMのADP−グルコースを含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで1hにわたって反応を実施した。反応物を水中に1:5希釈し、次いで、希釈したアッセイ物25μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル75μLに添加することによってクエンチし、4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、ステビオール配糖体に関してRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。0.025g/LのSFPの添加量でのレバウジオシドAに対するラウンド7改変体の変換を表46.3に示す。表46.3に列挙されている改変体7種全てが配列番号2718よりも高い活性を有した。変異K14R、I56K、R194P、I238M、I315V、F325M、A326V、P329A、R330H、およびE399Qを有する改変体(配列番号2814)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号2813)をレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号2814のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号2814に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号2813によってコードされるGTの定向進化を、前のラウンドにおける活性改善に関連する有益な変異が組み換えられ、酵素のある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第8のラウンド(「ラウンド8」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から16種同定され(表47.1)、飽和変異誘発から18種が同定された(表47.2)。
配列番号2813改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を20倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.2g/LのSUS SFP配列番号1456を用い、7.5mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.4mMのADP(Sigma、>95%)および30mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を水中に1:20希釈し、次いで、希釈したアッセイ物20μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル80μLに添加することによってクエンチした。得られた混合物を4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、RapidFire SPE−MS/MSによって分析した。SuSとカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表47.1に列挙する。ラウンド8飽和変異誘発ライブラリーに関しては、0.2g/LのSUS SFP配列番号1582、0.2mMのADP、および以下の反応条件:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら2hを使用したことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。このライブラリー由来の上位56種の改変体を、0.15g/LのSUS SFP配列番号1582を使用したことを除いて同じアッセイ条件を使用して、3連で再試験した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表47.2に列挙する。表47.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド8改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.002〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、8mMのレバウジオシドA、0.4mMのADP、30mMのスクロース、および0.2g/LのSUS SFP配列番号1456を含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで1hにわたって反応を実施した。反応物を水中に1:20希釈し、次いで、希釈したアッセイ物20μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル80μLに添加することによってクエンチし、4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、ステビオール配糖体に関してRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。0.1g/LのSFPの添加量でのレバウジオシドAに対するラウンド8改変体の変換を表47.3に示す。表47.3に列挙されている改変体8種全てが配列番号2814よりも高い活性を有した。変異N31RおよびD388Eを有する改変体(配列番号2884)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号2883)をレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号2884のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号2884に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号2883によってコードされるGTの定向進化を、前のラウンドにおける活性改善に関連する有益な変異が組み換えられた改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド33種の第9のラウンド(「ラウンド9」)をもたらした。
配列番号2883改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を20倍希釈した。反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.15g/LのSUS SFP配列番号1582を用い、7.5mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および24mMのスクロース(Sigma)の補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら2h。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。SuSとカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表48.1に列挙する。表48.2に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド9改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.002〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、8mMのレバウジオシドA、0.4mMのADP、24mMのスクロース、および0.15g/LのSUS SFP配列番号1582を含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで1hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.05g/LのSFPの添加量でのレバウジオシドAに対するラウンド9改変体の変換を表48.2に示す。表48.2に列挙されている改変体6種全てが配列番号2884よりも高い活性を有した。変異S11Q、E65N、H132Q、N135L、N138G、S223T、およびN391Rを有する改変体(配列番号3016)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号3015)が最も改善され、これらをレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号3016のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号3016に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号3015によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第10のラウンド(「ラウンド10」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から40種同定され、(表49.1)飽和変異誘発から40種が同定された(表49.2)。
配列番号3015改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を20倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.15g/LのSUS SFP配列番号1764を用い、8mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および24mMのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を水中に1:20希釈し、次いで、希釈したアッセイ物20μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル80μLに添加することによってクエンチした。得られた混合物を4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、RapidFire SPE−MS/MSによって分析した。SuSとカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表49.1に列挙する。ラウンド10飽和変異誘発ライブラリーに関しては、溶解物を10倍に希釈し、以下の反応条件:Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら2hを使用したことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表49.2に列挙する。表49.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド10改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.002〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、8mMのレバウジオシドA、0.4mMのADP、24mMのスクロース、および0.15g/LのSUS SFP配列番号1764を含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで1hにわたって反応を実施した。反応物を水中に1:20希釈し、次いで、希釈したアッセイ物20μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル80μLに添加することによってクエンチし、4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:10希釈し、ステビオール配糖体に関してRapidFire SPE−MS/MSによって分析した。0.25g/LのSFPの添加量でのラウンド10改変体のレバウジオシドAに対する活性を表49.3に示す。表49.3に列挙されている改変体5種全てが配列番号3016よりも高い活性を有した。変異K58R、I122L、V176R、T400V、K425R、S426A、I427R、およびS446Rを有する改変体(配列番号3082)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号3081)が最も改善され、これらをレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号3082のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号3082に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号3081によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第11のラウンド(「ラウンド11」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から50種同定され(表50.1)、飽和変異誘発から53種が同定された(表50.2)。
配列番号3081改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を20倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.15g/LのSUS SFP配列番号1764を用い、8mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および24mMのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら2h。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。SuSとカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表50.1に列挙する。ラウンド11飽和変異誘発ライブラリーに関しては、10mMのレバウジオシドAの基質添加量を使用したことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表50.2に列挙する。いくつかの改変体について、振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド11改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.006〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、10mMのレバウジオシドA、0.2mMのADP、24mMのスクロース、および0.15g/LのSUS SFP配列番号1764を含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで2hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.025g/LのSFPの添加量でレバウジオシドAに対して最も改善されたラウンド11改変体は配列番号3244であり、これは、配列番号1764と比べて変異G8S、G252D、D255P、V322L、M325L、およびK448Aを有した。この改変体、配列番号3244をさらなる定向進化のために使用した。
配列番号3081によってコードされるGTの定向進化を、前のラウンドにおけるレバウジオシドIに対するグリコシルトランスフェラーゼ活性の改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびレバウジオシドIに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドのラウンド(「ラウンド11.04」)をもたらした。溶解緩衝液400μLを用いて細胞を溶解させた。配列番号3081改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対して、反応物100μL中溶解物25μLの溶解物添加量を用い、1mMのレバウジオシドIの基質添加量および1mMのADP−グルコースの補基質添加量を用いたアッセイを実施した。以下の反応条件を使用した:50mMのKPhos緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、40℃、300RPMで振とうしながら18h。反応物を水中に1:4希釈し、次いで、希釈したアッセイ物25μLを0.2%ギ酸含有アセトニトリル75μLに添加することによってクエンチした。得られた混合物を4℃で10分遠心分離することによって沈殿させた。上清を水中に1:5希釈し、表44.1に記載の通りLC−MS/MSによって分析した。得られた、レバウジオシドIに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する52種の操作された改変体を表50.3に列挙する。
操作されたラウンド11.04改変体のレバウジオシドIに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.16〜5g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、1mMのレバウジオシドI、および1mMのADP−グルコースを含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで4hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.3g/LのSFPの添加量でのラウンド11.04改変体によるレバウジオシドMの産生レベルを表50.4に示す。表50.4に列挙されている改変体5種全てがRebIに対して配列番号3082よりも高い活性を有した。変異L126Q、P128A、F155R、K160S、R161T、およびN199Aを有する改変体(配列番号3346)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号3345)が最も改善され、これらをレバウジオシドIのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号3244のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号3244に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号3243によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第12のラウンド(「ラウンド12」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から50種同定され(表51.1)、飽和変異誘発から31種が同定された(表51.2)。
配列番号3243改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を40倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、希釈した溶解物をEppendorfサーモサイクラー中、62℃で0.5hプレインキュベートした。次いで、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.15g/LのSUS SFP配列番号1764を用い、15mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および37.5mMのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4.5h。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。SUS配列番号1764とカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表51.1に列挙する。ラウンド12飽和変異誘発ライブラリーに関しては、希釈した溶解物を65℃で0.5hプレインキュベートしたことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表51.2に列挙する。表51.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド12改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.006〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を62℃で0.5hプレインキュベートし、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのレバウジオシドA、0.2mMのADP、37.5mMのスクロース、および0.15g/LのSUS SFP配列番号1764を含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃および60℃、300RPMで4.5hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.025g/LのSFPの添加量でのレバウジオシドAに対するラウンド12改変体の変換を表51.3に列挙する。60℃では表51.3に列挙されている改変体7種全てが配列番号3244よりも高い活性を有し、および50℃では4種が有意な活性を失わなかった。変異K106A、V164H、G200A、E210V、およびG415Aを有する改変体(配列番号3502)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号3501)をレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
レバウジオシドIからレバウジオシドMを産生するための配列番号3346のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号3346に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号3345によってコードされるGTの定向進化を、酵素のある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供されたライブラリーを構築することによって行った。次いで、ライブラリーを、プレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびレバウジオシドIに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドのラウンド(「ラウンド12 RebI」)をもたらした。
配列番号3345改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、次いで、1mMのレバウジオシドIの基質添加量および1mMのADP(Sigma、>95%)および15mMのスクロースの補基質添加量を伴う反応体積100μL中溶解物25μLおよび0.1g/LのSUS SFP配列番号1804を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を実施例50に記載の通り希釈し、クエンチし、分析した。SuSとカップリングしてレバウジオシドIに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表52.1に示す。
配列番号3502のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号3502に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号3501によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第13のラウンド(「ラウンド13」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から53種同定され(表53.1)、飽和変異誘発から24種が同定された(表53.2)。
配列番号3501改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を40倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、希釈した溶解物をEppendorfサーモサイクラー中、69℃で0.8hプレインキュベートした。次いで、100μL反応体積中、希釈した溶解物10μLおよび0.15g/LのSUS SFP配列番号1764を用い、15mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および37.5mMのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。SUS配列番号1764とカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表53.1に列挙する。ラウンド13飽和変異誘発ライブラリーに関しては、希釈した溶解物を68℃で0.5hプレインキュベートし、0.1g/LのSUS SFP配列番号1804を使用し、0.1mMまたは0.2mMのADPを使用したことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表53.2に列挙する。表53.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド13改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.006〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を69℃で50minプレインキュベートし、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのレバウジオシドA、0.2mMのADP、37.5mMのスクロース、および0.1g/LのSUS SFP配列番号1804を含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotronタイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで4hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.025g/LのSFPの添加量でのレバウジオシドAに対するラウンド13改変体の変換を表53.3に列挙する。表53.3に列挙されている改変体10種全てが配列番号3502よりも高い活性を有した。変異H73P、N172R、N240E、A242I、およびE408Pを有する改変体(配列番号3696)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号3695)が最も改善され、これらをレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号3696のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号3696に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号3695によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第14のラウンド(「ラウンド14」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から75種同定され(表54.1)、飽和変異誘発から49種が同定された(表54.2)。
配列番号3695改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を40倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、希釈した溶解物をEppendorfサーモサイクラー中、72℃で0.5hプレインキュベートした。次いで、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.1g/Lのスクロースシンテターゼ(SUS)SFP配列番号1804を用い、20mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および50mMのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。SuSとカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表54.1に列挙する。ラウンド14飽和変異誘発ライブラリーに関しては、溶解物を80倍希釈し、70℃で0.5hプレインキュベートしたことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表54.2に列挙する。表54.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド14改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.006〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を72℃で0.5hプレインキュベートし、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、20mMのレバウジオシドA、0.2mMのADP、50mMのスクロース、および0.1g/LのSUS SFP配列番号1804を含有する総反応体積100μLに添加した。プレインキュベートしたSFPを用いて60℃で、またはプレインキュベートしていないSFPを用いて55℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで4hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.05g/LのSFPの添加量でのラウンド14改変体によるレバウジオシドDの産生レベルを表54.3に示す。表54.3に列挙されている改変体8種のうち3種が、両方の条件下で配列番号3696よりも高い活性を有した。変異I26V、L42V、C46V、L49A、およびV134Aを有する改変体(配列番号3956)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号3955)が、両方の条件を考慮に入れて最も改善され、これらをレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号3956のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号3956に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号3955によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第15のラウンド(「ラウンド15」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から62種同定され(表55.1)、飽和変異誘発から113種が同定された(表55.2)。
配列番号3956改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を40倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、希釈した溶解物をEppendorfサーモサイクラー中、76℃で0.5hプレインキュベートした。次いで、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.1g/LのSUS SFP配列番号1840を用い、20mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および50mMのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。SUS配列番号1840とカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表55.1に列挙する。ラウンド15飽和変異誘発ライブラリーに関しては、希釈した溶解物を65℃で16hプレインキュベートし、0.1g/LのSUS SFP配列番号2064を使用したことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表55.2に列挙する。表55.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド15改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.006〜0.2g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を76℃で0.5hプレインキュベートし、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、20mMのレバウジオシドA、0.2mMのADP、50mMのスクロース、および0.1g/LのSUS SFP配列番号2064を含有する総反応体積100μLに添加した。プレインキュベートしたSFPを用いて60℃で、またはプレインキュベーションを伴わずに55℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで4hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.025g/LのSFPの添加量でのラウンド15改変体によるレバウジオシドDの産生を表55.3に列挙する。表55.3に列挙されている改変体9種のうち5種が、両方の条件下で配列番号3956よりも高い活性を有した。変異P73A、K143P、I144V、V179D、E186G、K187T、K373R、およびN423Rを有する改変体(配列番号4256)およびそれをコードするポリヌクレオチド(配列番号4255)が、両方の条件を考慮に入れて最も改善され、これらをレバウジオシドAのグルコシル化に関するさらなる定向進化のために選択した。
配列番号4256のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号4256に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号4255によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、前のラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第16のラウンド(「ラウンド16」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から27種同定され(表56.1)、飽和変異誘発から66種が同定された(表56.2)。
配列番号4255改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を40倍希釈した。前のラウンドからの有益な変異が組み換えられたライブラリーをスクリーニングするために、希釈した溶解物をEppendorfサーモサイクラー中、79℃で0.5hプレインキュベートした。次いで、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μLおよび0.05g/Lのスクロースシンテターゼ(SUS)SFP配列番号2064を用い、20mMのレバウジオシドAの基質添加量ならびに0.2mMのADP(Sigma、>95%)および50mMのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。SUS配列番号2064とカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表56.1に列挙する。ラウンド16飽和変異誘発ライブラリーに関しては、0.05g/LのスクロースシンテターゼSFP配列番号2510を使用したことを除いて上記の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表56.2に列挙する。表56.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド16改変体のレバウジオシドAに対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。0.003〜0.1g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)を79℃で0.5hプレインキュベートし、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、20mMのレバウジオシドA、0.2mMのADP、50mMのスクロース、および0.05g/LのSUS SFP配列番号2432を含有する総反応体積100μLに添加した。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで4hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.0125g/LのSFPの添加量でのラウンド16改変体によるレバウジオシドDの産生レベルを表56.3に示す。配列番号4550が最も改善され、これをレバウジオシドDを形成するためのADP−グルコースからレバウジオシドAへのグリコシル転移の触媒作用に関する最良の酵素として選択した。
配列番号4550のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号4550に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号4549によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異を組み換えた。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第17のラウンド(「ラウンド17」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から73種同定された(表57.1)。
配列番号4549改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を20g/LのレバウジオシドA 60%中に50倍または100倍希釈し、75℃で2hプレインキュベートした。次いで、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μL、0.1g/LのSUS SFP配列番号2510、および0.2g/Lのβ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号6864を用い、20g/LのレバウジオシドA 60%(RebA60)の基質添加量ならびに0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)および40g/Lのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させ、上記の通り分析するために水中に10倍希釈した。SuSとカップリングしてレバウジオシドAに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表57.1に列挙する。表57.2に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド17改変体のレバウジオシドA 60%に対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、20g/LのRebA60、0.1g/LのADP、40g/Lのスクロース、0.1g/LのSUS SFP配列番号2510、および0.2g/Lのβ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号6864を含有する総反応体積100μL中、0.0003〜0.04g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)をアッセイした。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃で、300RPMで16〜18hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.005g/LのSFPの添加量でのラウンド17改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの産生についての結果を表57.2に示す。配列番号7324が最も改善されたものと同定され、これをレバウジオシドDを形成するためのADP−グルコースからレバウジオシドAへのグリコシル転移の触媒作用に関する最良の酵素として選択した。
配列番号7324のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号7324に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号7323によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第18のラウンド(「ラウンド18」)をもたらした。操作された改変体が、組み換えられた有益な変異から90種同定され(表58.1)、飽和変異誘発から124種が同定された(表58.2)。
配列番号7323改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を20g/LのレバウジオシドA 60%中に80倍希釈し、75℃で1.5hプレインキュベートした。次いで、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μL、0.05g/LのSUS SFP配列番号7506、および0.1g/Lのβ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号7388を用い、20g/LのレバウジオシドA 60%(RebA60)の基質添加量ならびに0.05g/LのADP(Amresco、超高純度)および40g/Lのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。反応物を、水中に40倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させ、上記の通り分析するために水中に10倍希釈した。SuSとカップリングしてRebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表58.1に列挙する。ラウンド18飽和変異誘発ライブラリーに関しては、溶解物を50mMのKphos pH6中に100倍希釈し、75℃で1hプレインキュベートしたことを除いて、以前に記載の通りスクリーニングを実施した。得られた操作されたGT改変体ポリペプチドを表58.2に列挙する。表58.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド18改変体のレバウジオシドA 60%に対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、20g/LのRebA60、0.05g/LのADP、40g/Lのスクロース、0.05g/LのSUS SFP配列番号7506、および0.15g/Lのβ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号7388を含有する総反応体積100μL中、0.0013〜0.04g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)をアッセイした。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃で、300RPMで16〜18hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。0.005g/LのSFPの添加量でのラウンド18改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの産生レベルを表58.3に示す。配列番号7784を有する改変体が最も改善された改変体であった。したがって、この改変体を、レバウジオシドDを形成するためのADP−グルコースからレバウジオシドAへのグリコシル転移の触媒作用に関する最良の酵素として選択した。
配列番号7784のベータ−1,2−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号7784に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。配列番号7783によってコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異を組み換え、酵素のある特定の構造的特徴を飽和変異誘発に供した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチドの第19のラウンド(「ラウンド19」)をもたらした。操作された改変体が、コンビナトリアルライブラリーから87種同定され(表59.1)、飽和変異誘発ライブラリーから58種が同定された(表59.2)。
配列番号7783改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。溶解緩衝液の体積を400μLとし、溶解物を50mMのリン酸カリウム、pH6.0中に100倍希釈し、75℃で1hプレインキュベートした。次いで、反応体積100μL中、希釈した溶解物10μL、0.04g/LのSUS SFP配列番号8420、および0.1g/Lのβ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号8088を用い、20g/LのレバウジオシドA 60%(RebA60)の基質添加量ならびに0.025g/LのADP(Amresco、超高純度)および40g/Lのスクロースの補基質添加量を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16〜18h。反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって沈殿させ、上記の通り分析するために水中に20倍希釈した。SuSとカップリングしてRebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、得られた操作された改変体を表59.1および59.2に列挙する。表59.3に列挙されている改変体について振とうフラスコ規模の培養物を成長させ、溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。
操作されたラウンド19改変体のレバウジオシドA 60%に対する活性を特徴付けるための振とうフラスコ粉末負荷用量反応実験を実施した。50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、20g/LのRebA60またはRebA97、0.025g/LのADP、20g/L(単一基質)または40g/L(ワンポット)のスクロース、0.04g/LのSUS SFP配列番号8420、および、ワンポット反応に関してのみ0.15g/Lのβ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号8088を含有する総反応体積100μL中、0.0013〜0.04g/Lのレベルの振とうフラスコ粉末(SFP)をアッセイした。Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃で、300RPMで16〜18hにわたって反応を実施した。反応物を上記の通り希釈し、クエンチし、分析した。それぞれ0.0025g/LのSFP添加量および0.005g/LのSFP添加量でのラウンド19改変体による単一基質でのレバウジオシドDの産生レベルおよびワンポット反応でのレバウジオシドMの産生レベルを表59.3に示す。配列番号9180を有する改変体が最も改善された改変体であった。したがって、この改変体を、レバウジオシドDを形成するためのADP−グルコースからレバウジオシドAへのグリコシル転移の触媒作用に関する最良の酵素として選択した。
配列番号696のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、ADP−グルコースを使用してステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号696に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。上記の前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号695によってコードされるGT(すなわち、配列番号696)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド65種の第8のラウンド(「ラウンド8」)をもたらした。
配列番号695改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。ペレットを、25mMのTris−HCl、pH7.5中、0.5mg/mLのリゾチームおよび0.5mg/mLのPMBSを伴う溶解緩衝液400μLを用いて1.5hにわたって溶解させ、遠心分離によって清澄化した。反応物100μL中溶解物10μLを用い、5mMのレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.1g/LのSUS SFP配列番号1222、および15mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのKPhos緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら4〜5h。次いで、反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することでクエンチし、4℃で10分遠心分離し、分析のために上清を水中に5倍希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてレバウジオシドDからレバウジオシドMを配列番号696よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。大半を、ステビオシド(95%の純度)に関して3連で再試験した。操作されたポリペプチドを表60.1に列挙する。振とうフラスコ規模の培養物を、表60.2に示されている改変体を配列番号696と比べて分析するためのSFP産生のために実施例31に記載の通り成長させた。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、3mMのMgCl2、1mMのステビオシド(95%の純度)またはレバウジオシドD、および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)を伴う50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、総反応体積100μL中、0.002〜5g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1時間インキュベートした。反応物を、水で5倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に4倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号4684のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号4684に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。上記の前のラウンドにおける活性改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号4684によってコードされるGT(すなわち、配列番号4683)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド31種の第9のラウンド(「ラウンド9」)をもたらした。
配列番号4684改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化した。反応物100μL中溶解物10μLを用い、5mMのステビオシド(>95%の純度)基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.1g/LのSUS SFP配列番号1222、および15mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのKPhos緩衝液、pH7、3mMのMgCl2、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら4〜5h。反応物を実施例60に記載の通り可溶化し、クエンチし、希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いて、ステビオシドからレバウジオシドAを配列番号4684よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表61.1に列挙する。表61.2に示されている改変体を配列番号4684と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、3mMのMgCl2、1mMのステビオシド(95%の純度)またはレバウジオシドD、および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)を伴う50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7、総反応体積100μL中、0.002〜5g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1時間インキュベートした。反応物を、水で5倍希釈することによって可溶化し、アセトニトリルおよび0.2%ギ酸で4倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号4838のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号4838に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号4837によってコードされるGT(すなわち、配列番号4838)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド123種の第10のラウンド(「ラウンド10」)をもたらした。
配列番号4838改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、リン酸カリウム緩衝液、pH6.5中に4倍希釈した。反応物100μL中溶解物10μLを用い、5mMのステビオシド(>95%の純度)基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.2g/LのSUS SFP配列番号1222、および15mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を実施例60に記載の通り可溶化し、クエンチし、希釈した。試料を実施例1、表1.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。選択された改変体を、同様のアッセイで、10倍溶解物希釈、4mMのステビオシドまたはレバウジオシドD、0.375mMのADP、0.5g/Lのスクロースシンターゼ配列番号1392、30mMのスクロース、および2hのインキュベーションを用いて再試験した。in situで合成されたADP−グルコースを用いて、レバウジオシドDからレバウジオシドMを配列番号4838よりも大きな分量で産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表62.1に列挙する。表62.2に示されている改変体を配列番号4838と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例1に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、1mMのステビオシド(95%の純度)またはレバウジオシドD、および1mMのADP−グルコース(Sigma、>93%の純度)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1時間インキュベートした。反応物を、水で5倍希釈することによって可溶化し、アセトニトリルおよび0.2%ギ酸で4倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号4876のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号4876に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号4875によってコードされるGT(すなわち、配列番号4876)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド122種の第11のラウンド(「ラウンド11」)をもたらした。
配列番号4875改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、リン酸カリウム緩衝液、pH6.5中に10倍希釈した。コンビナトリアルライブラリーのアッセイを、反応物100μL中溶解物10μLを用い、4mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.2g/LのSUS SFP配列番号1456、および24mMのスクロース(ショ糖)を用いて行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1h。反応物を実施例60に記載の通り可溶化し、クエンチし、希釈した。試料を実施例1、表1.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。飽和変異誘発ライブラリーに関しては、同じアッセイを実施したが、5倍希釈した溶解物、pH6リン酸カリウム緩衝液、および55℃で1〜2hのインキュベーションを用いた。選択された改変体をまた、これらの条件下、3連で再試験した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号4876よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表63.1に列挙する。表63.2に示されている改変体を配列番号4876と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例1に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、4mMのステビオシド(95%の純度)またはレバウジオシドD、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.2g/LのSUS SFP配列番号1456、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃、300RPMで振とうしながら1時間インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号5066のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号5066に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号5065によってコードされるGT(すなわち、配列番号5066)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド40種の第12のラウンド(「ラウンド12」)をもたらした。
配列番号5066改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、リン酸カリウム緩衝液、pH6中に10倍希釈した。コンビナトリアルライブラリーのアッセイを、反応物100μL中溶解物10μLを用い、4mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1582、および24mMのスクロース(ショ糖)を用いて行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら2h。反応物を実施例63に記載の通り可溶化し、クエンチし、希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号5066よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表64.1に列挙する。表64.2に示されている改変体を配列番号5066と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、4mMのステビオシド(95%の純度)またはレバウジオシドD、0.4mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1582、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら1時間インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号5290のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号5290に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号5289によってコードされるGT(すなわち、配列番号5290)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド100種の第13のラウンド(「ラウンド13」)をもたらした。
配列番号5289改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、リン酸カリウム緩衝液、pH6中に5倍希釈した。反応物100μL中溶解物10μLを用い、4mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および24mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃、300RPMで振とうしながら2h。反応物を実施例33に記載の通り可溶化し、クエンチし、希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号5290よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表65.1に列挙する。表65.2に示されている改変体を配列番号5290と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、4mMのステビオシド(95%の純度)、レバウジオシドD、またはレバウジオシドA(97%の純度)、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃および55℃、300RPMで振とうしながら1時間インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号5372のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号5372に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号5371によってコードされるGT(すなわち、配列番号5372)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド74種の第14のラウンド(「ラウンド14」)をもたらした。
配列番号5371改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、リン酸カリウム緩衝液、pH6中に10倍希釈した。反応物100μL中溶解物10μLを用い、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および40mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら2h。実施例60に記載の通り反応物を可溶化し、クエンチし、約10μMのステビオール配糖体まで希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号5372よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表66.1に列挙する。表66.2に示されている改変体を配列番号5372と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例1に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、4mMのステビオシド(95%の純度)、レバウジオシドD、レバウジオシドE、またはレバウジオシドA(97%の純度)、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、55℃および60℃、300RPMで振とうしながら2時間インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号5562のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号5562に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された活性改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号5561によってコードされるGT(すなわち、配列番号5562)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド62種の第15のラウンド(「ラウンド15」)をもたらした。
配列番号5562改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に5倍希釈した。反応物100μL中溶解物10μLを用い、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.1〜0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および24〜40mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50または60℃、300RPMで振とうしながら2h。実施例60に記載の通り反応物を可溶化し、クエンチし、約10μMのステビオール配糖体まで希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号5562よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。コンビナトリアルライブラリー由来の操作されたポリペプチドを表67.1に列挙し、飽和変異誘発ライブラリー由来の操作されたポリペプチドを表67.2に列挙する。表67.3に示されている改変体を配列番号5562と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、10mMのステビオシド(95%の純度)またはレバウジオシドD、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃および60℃、300RPMで振とうしながら2時間インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で5倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号5708のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号5708に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号5707によってコードされるGT(すなわち、配列番号5708)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド100種の第16のラウンド(「ラウンド16」)をもたらした。
配列番号5708改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に20倍希釈した。反応物100μL中溶解物10μLを用い、10mMのステビオシド(>95%の純度)、レバウジオシドD、レバウジオシドA(>97%の純度)、またはレバウジオシドE基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および24mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら3h。実施例60に記載の通り反応物を可溶化し、クエンチし、約10μMのステビオール配糖体まで希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号5708よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表68.1に列挙する。表68.2に示されている改変体を配列番号5708と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、10mMのステビオシド(>95%の純度)、レバウジオシドD、レバウジオシドE、またはレバウジオシドA(>97%の純度)、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.15g/LのSUS SFP配列番号1764、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、50℃および60℃、300RPMで振とうしながら3時間インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で10倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号5976のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号5976に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号5975によってコードされるGT(すなわち、配列番号5976)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド123種の第17のラウンド(「ラウンド17」)をもたらした。
配列番号5976改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、緩衝液中に20倍希釈した。溶解物を熱的に攻撃するために、溶解物をサーモサイクラー中、65.5℃で15分プレインキュベートした。反応物100μL中、プレインキュベートした溶解物10μLを用い、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.1g/LのSUS SFP配列番号1804、および24mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、分析のために水で10倍希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号5976よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表69.1に列挙する。表69.2に示されている改変体を配列番号5976と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.1g/LのSUS SFP配列番号1804、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、プレインキュベーションを伴わずに55℃で、または65.5℃で15分プレインキュベートした後に60℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4時間インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で10倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号6138のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号6138に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号6137によってコードされるGT(すなわち、配列番号6138)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド100種の第18のラウンド(「ラウンド18」)をもたらした。
配列番号6137改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に20〜40倍希釈した。溶解物を熱的に攻撃するために、溶解物をサーモサイクラー中、68.6℃で15分プレインキュベートした。反応物100μL中、プレインキュベートした溶解物10μLを用い、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.1g/LのSUS SFP配列番号1840、および24mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、分析のために水で10倍希釈した。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.1g/LのSUS SFP配列番号1804、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、プレインキュベーションを伴わずに55℃で、または68.6℃で15分プレインキュベートした後60℃で、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4時間インキュベートした。反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水中に10倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。
配列番号6288のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号6288に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号6287によってコードされるGT(すなわち、配列番号6288)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド108種の第19のラウンド(「ラウンド19」)をもたらした。
配列番号6288改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に40倍希釈した。溶解物を熱的に攻撃するために、溶解物を、サーモサイクラー中、73.5℃で15分、またはThermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、65℃、300RPMで振とうしながら16hのいずれかでプレインキュベートした。反応物100μL中、プレインキュベートした溶解物10μLを用い、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2064、および24mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、分析のために水で10倍希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号6288よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。15分プレインキュベートすることでスクリーニングしたコンビナトリアルライブラリー由来の操作されたポリペプチドを表71.1に列挙し、16hプレインキュベートすることでスクリーニングした飽和変異誘発ライブラリー由来の操作されたポリペプチドを表71.2に列挙する。表71.3に示されている改変体を配列番号6288と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例1に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、10mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD、0.2mMのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2064、および24mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4時間、プレインキュベーションを伴わずに55℃で、または、73.5℃で15分プレインキュベートした後に60℃で、インキュベートした。反応物を、水中に20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で10倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。清澄化した振とうフラスコ溶解物を用い、凍結乾燥する前に以下の通りさらなる熱安定性特徴付けを行った:溶解物を緩衝液中に400倍希釈し、サーモサイクラー中、55〜70℃の勾配で16hインキュベートした。残存活性のパーセントを決定するために、プレインキュベートした溶解物を、ステビオシドまたはレバウジオシドDのいずれかを用い、60℃で4hのインキュベーションを伴って、上記の通りアッセイした。パーセント残存活性を、高温での産生を最低プレインキュベート温度での産生で割ったものとして表す。
配列番号6468のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号6468に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号6467によってコードされるGT(すなわち、配列番号6468)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド269種の第20のラウンド(「ラウンド20」)をもたらした。
配列番号6467改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に40倍希釈した。溶解物を熱的に攻撃するために、溶解物を、サーモサイクラー中、79℃で15分、またはThermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、65℃、300RPMで振とうしながら16hのいずれかでプレインキュベートした。反応物100μL中、プレインキュベートした溶解物10μLを用い、15mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD基質、0.1g/LのADP(Sigma、>93%の純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2432、および37.5mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、分析のために水で15倍希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号6468よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。15分プレインキュベートすることでスクリーニングしたコンビナトリアルライブラリー由来の操作されたポリペプチドを表72.1に列挙し、16hプレインキュベートすることでスクリーニングした飽和変異誘発ライブラリー由来の操作されたポリペプチドを表72.2に列挙する。表72.3に示されている改変体を配列番号6468と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD、0.2mMのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2432、および37.5mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.006〜0.2g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4時間、プレインキュベーションを伴わずに55℃で、または79℃で15分プレインキュベートした後に60℃で、インキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリル中に5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。凍結乾燥前に、以下の通り、清澄化した振とうフラスコ溶解物を用いてさらなる熱安定性特徴付けを行った:溶解物を緩衝液中に400倍希釈し、サーモサイクラー中、60〜75℃の勾配で16hインキュベートした。パーセント残存活性を決定するために、プレインキュベートした溶解物を、ステビオシドまたはレバウジオシドDのいずれか、および60℃で4hのインキュベーションを用いて上記の通りアッセイした。残存活性のパーセントを、高温での産生を最低プレインキュベート温度での産生で割ったものとして表す。
配列番号6864のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号6864に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号6863によってコードされるGT(すなわち、配列番号6864)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド37種の第21のラウンド(「ラウンド21」)をもたらした。
配列番号6863改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例34に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に40倍希釈した。溶解物を熱的に攻撃するために、溶解物をThermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、75℃、300RPMで振とうしながら1hプレインキュベートした。反応物100μL中、プレインキュベートした溶解物10μLを用い、20g/LのレバウジオシドA 60%基質、0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2510、0.1g/Lのβ−1,2−グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号4550および37.5mMのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら4h。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いて5倍希釈することによってクエンチし、分析のために水で15倍希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いてステビオシド/レバウジオシドDからレバウジオシドA/レバウジオシドMを配列番号6864よりも大きな分量で産生したグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表73.1に列挙する。表73.2に示されている改変体を配列番号6864と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD、0.2mMのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2510、および37.5mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.003〜0.1g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4時間、60℃でインキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリルで5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。凍結乾燥前に、以下の通り、清澄化した振とうフラスコ溶解物を用いてさらなる熱安定性特徴付けを行った:溶解物を、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に400倍希釈し、サーモサイクラー中、60〜75℃の勾配で16hインキュベートした。残存活性のパーセントを決定するために、プレインキュベートした溶解物を、ステビオシドまたはレバウジオシドDのいずれか、および60℃で4hのインキュベーションを用いて上記の通りアッセイした。残存活性のパーセントを、高温での産生を最低プレインキュベート温度での産生で割ったものとして表す。
配列番号7388のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号7388に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号7387によってコードされるGT(すなわち、配列番号7388)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド88種の第22のラウンド(「ラウンド22」)をもたらした。
配列番号7387改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例60に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に20倍希釈した。溶解物を熱的に攻撃するために、溶解物をThermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、75℃、300RPMで振とうしながら1hプレインキュベートした。反応物100μL中、プレインキュベートした溶解物10μLを用い、20g/LのレバウジオシドA 60%基質、0.05g/LのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2510、0.08g/Lのβ−1,2−グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号7324、および40g/Lのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16h。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いて5倍希釈することによってクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いて、配列番号7388よりも大きな分量で、レバウジオシドA 60からレバウジオシドMを産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表74.1および表74.2に列挙する。表74.3に示されている改変体を配列番号7388と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例31に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD、0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号2510、および37.5mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.005〜0.15g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4時間、60℃でインキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリルで5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。凍結乾燥前に、以下の通り、清澄化した振とうフラスコ溶解物を用いてさらなる熱安定性特徴付けを行った:溶解物を、リン酸緩衝液中に20倍希釈し、サーモサイクラー中、60〜75℃の勾配で24hインキュベートした。残存活性のパーセントを決定するために、プレインキュベートした溶解物を、50mMのリン酸カリウム緩衝液中、pH6で、20g/LのレバウジオシドA 60、0.05g/LのADP、40g/Lのスクロース、0.05g/LのSUS SFP配列番号2510、および0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号7324を用い、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら60℃で16hのインキュベーションを伴ってアッセイした。反応物を、ハイスループットアッセイに関する記載の通り、可溶化し、クエンチし、希釈した。パーセント残存活性を、高温での産生を最低プレインキュベート温度での産生で割ったものとして表した。
配列番号8088のベータ−1,3−ADP−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
本実施例では、in situで合成されたADP−グルコースを使用して、ステビオール配糖体のグルコシル化を改善するための、配列番号8088に由来するβ1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングに関する実験を記載する。本発明の開発中に同定された産生の改善に関連する変異が組み換えられ、ある特定の構造的特徴が飽和変異誘発に供された改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、配列番号8087によってコードされるGT(すなわち、配列番号8088)の定向進化を行った。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、成長させ、下記のハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP−グルコースおよびステビオール配糖体に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたGT改変体ポリペプチド80種の第23のラウンド(「ラウンド23」)をもたらした。
配列番号8087改変体を発現する清澄化されたE.coli培養溶解物の96ウェルプレートに対してアッセイを実施した。実施例34に記載の通りペレットを溶解させ、溶解物を清澄化し、次いで、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6中に10倍希釈した。溶解物を熱的に攻撃するために、溶解物をThermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、75℃、300RPMで振とうしながら1hプレインキュベートした。反応物100μL中、プレインキュベートした溶解物10μLを用い、20g/LのレバウジオシドA 60%基質、0.025g/LのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号8420、0.08g/Lのβ−1,2−グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号7784、および40g/Lのスクロース(ショ糖)を用いてアッセイを行った。以下の反応条件を使用した:50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、60℃、300RPMで振とうしながら16h。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリルを用いて5倍希釈することによってクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。試料を実施例31、表31.1に記載の通りRapidFire−MS/MSによって分析した。in situで合成されたADP−グルコースを用いて、配列番号8088よりも大きな分量で、レバウジオシドA 60からレバウジオシドMを産生させたグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。操作されたポリペプチドを表75.1および表75.2に列挙する。表75.3に示されている改変体を配列番号8088と比べて分析するために、振とうフラスコ規模の培養物を実施例1に記載の通り成長させ、溶解させ、清澄化し、凍結乾燥して粉末にした。
振とうフラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、15mMのステビオシド(>95%の純度)またはレバウジオシドD、0.1g/LのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号8420、および37.5mMのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中0.005〜0.15g/LのSFPまで希釈した。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら4時間、60℃でインキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリルで5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。グリコシル化された産物を実施例31、表31.1に記載の通りSPE−QQQによって検出した。50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6、20g/LのRebA60、0.025g/LのADP(Amresco、超高純度)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号8420、0.12g/Lのβ1,2GT SFP配列番号7784、および40g/Lのスクロース(ショ糖)の総反応体積100μL中、0.01〜0.3g/LのSFPを用いてワンポット反応を行った。反応物を、Thermotron(登録商標)タイタープレート振とう機中、300RPMで振とうしながら16時間、60℃でインキュベートした。反応物を、水で20倍希釈することによって可溶化し、0.2%ギ酸含有アセトニトリルで5倍希釈することによってクエンチし、遠心分離によって清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。
操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよび再利用酵素の熱耐性
操作されたβ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT、配列番号6864)、β−1,2−グリコシルトランスフェラーゼ(β1,2GT、配列番号4550)、およびスクロースシンターゼ再利用酵素(sucrose synthase recycling enzyme)(SUS、配列番号2510)の熱耐性を決定するために、振とうフラスコ粉末(SFP)を使用して3つのアッセイを実施した。
追加的なNDPおよびNDP−グルコースを用いた、操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよび再利用酵素のアッセイ
複数のヌクレオシド二リン酸(NDP)およびヌクレオシド二リン酸−グルコース(NDP−グルコース)を操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよび再利用系で使用することができる。
レバウジオシドA 60%をレバウジオシドMに変換するためのプロセス
Reb A 60(ステビオシドとレバウジオシドA[reb A]の質量で約1:2混合物)は、水およびスクロース溶液中への予想外に高い溶解度を有する。ステビオシドおよびReb Aの個々の水溶解度は、3〜5g/Lの範囲であることが報告されている。驚くべきことに、水中または200g/Lのスクロース中、Reb A 60の100〜200g/L溶液を調製し、室温で1週間静置しても前記溶液中に沈殿物は生じなかった。注記すべきことに、反応の過程中、Reb D中間体およびReb M産物の両方が、それらの報告された溶解度限界(約0.3〜0.5および3〜5g/L、それぞれ)をはるかに超えるレベル(ca.30〜50g/L)で可溶性のままであった(均一の反応混合物によって明らか)。プロセスの効率は、Reb A 60出発材料およびReb D中間体の予測外に高い溶解度によって著しく増強された。
Claims (131)
- 配列番号2に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチド配列を含む操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4、8、32、232、348、548、562、696、758、696、770、792、954、696、1002、1054、2600、2718、2814、2884、3016、3082、3244、3502、3346、3502、3696、4256、4684、4838、4876、5066、5290、5372、5562、5708、5976、6138、6288、6468、684、7388、および/または8088に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチドを含む、請求項1に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- ウラシル二リン酸以外の糖供与体を優先的に使用する、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、10、262、10/262、278/284/311/339/360、283、307、309、339/361、344/361、および361から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号4を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、112/172/283/318、112/261/318、112/282/283/431、137/283、137/283/431、163/318、261/283/306/337、261/283/337、261/337、269/318、282/283、282/283/431、283、283/306/308/360、283/306/337/426、283/318/337/360、283/360、318、360、および431から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号8を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、4、6、22、22/84/87/154/198/199/356、22/84/87/154/198/199/306/356、22/84/87/154/199/306/356、 22/84/87/154/356、22/84/87/154/198/199/306/356、22/84/87/154/199/306/356、22/84/87/198/199/306/356、22/84/87/198/199/356、22/84/87/198/199/306/356、 22/84/87/198/199/356、22/84/87/199/306/356、22/84/87/199/356、22/84/154/198/199/207/306、22/84/154/198/199/306、22/84/154/198/199/356、22/84/154/198/199/356、22/84/154/198/199/356、22/84/154/199/356、22/84/154/199/207、22/84/154/199/356、22/84/154/207/306/356、22/84/154/306/356、22/84/154/198/199/306/356、22/84/154/198/199、22/84/154/198/199/306/356、22/84/154/199/306/356、22/84/154/199/356、22/84/154/199/356、22/84/198/199/306/356、22/84/199/356、22/84/207/356、22/84/356、22/84/154/198/199/306/356、22/87/154/198/199/356、22/87/154/199/306/356、22/87/154/322/356、22/87/154/198/199/356、22/87/154/199/356、22/87/154/198/199/207/306/356、22/87/154/199/207/356、22/87/154/199/356、22/87/154/199/306/356、22/87/198/199/306/356、22/87/198/199/306/356、22/87/198/199/207/356、22/87/198/199/356、22/87/199/356、22/87/199/356、22/154/198/199/207/306/356、22/154/198/199/356、22/154/199/356、22/154/198/199/306/356、22/154/199/356、22/154/199/207/306/356、22/198/199/356、22/198/199/207/329/356、22/199/356、22/207/356、22/356、64、74、84、84/154/198/199、87、97、106、 110、112、137、139、154、159、 169、179、191、195、198、199、 207、233、259、261、 262、306、347、356、396、417、 421、427および435から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号32を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、64/106/109/112/131/159/233/421/427/431、64/106/109/112/417/421/427/431、64/106/109/139/179/417/421/427/431、64/106/109/233/347/427/431、64/106/112/347/417/421、64/106/139/179/233/417/427/431、64/106/417/421、64/106/431、64/106/109/112/131/179/417/427/431、64/106/109/417/421/427/431/439、64/106/112/139/159/179/204/396/417、64/106/112/159/179/417/421、64/106/204/417/421/427、64/109/112/139/159/179/417/431、64/109/112/139/417、 64/109/139/233/417/421、64/109/159/179/204/233/417/421、64/109/417/421、64/109/417/421、64/139/233/417/427/431/439、64/139/347/417/421/427/431、64/417/421/431、106/109/112/131/159/179/417/421、106/109/112/131/159/204/347/417/421/427、106/109/112/204/347/421/439、106/109/112/261/417/431、106/109/112/347/427、106/109/139/427/431、106/109/417/421/427、106/112/159/204/233/417/421/427/431、106/112/233/417、106/112/396/417/421、106/139/159/233/347/417/421/427/431、106/233/421/427、106/417、106/109/139/347/417/421/427、106/109、106/109/139/233/417/421、106/109/139/417、106/109/233/427/431、106/112/159/179/204/417/421、106/112/159/179/233/417/421/427/439、106/131/179/233/421/427/431、106/139/421、106/347/417/427/431、109/112/131/159/179/439、109/112/131/159/417/421、109/112/139/179/417/427、109/112/159/179/417/421、109/112/159/417/427、109/112/179/204/233/417/421/427、109/112/179/347/417、109/112/204/233/417、109/112/204/427、109/112/233/417/431、109/112/417/421/427、109/112/417/427/431、 109/131/139/179/261/396/421、109/131/204、109/139/179/417/421/427、109/139/179/417/427、 109/179/233/421、109/204/417/431、109/417/421、109/417/427/431、112/131/179/204/417/421/427、112/131/179/347/417/421、112/139/179/204/233/347/427、112/159/417/421、112/417/421、131/179/233/417/427、139/233/417、159/347/417/421/431、179/417/421、233/417/421/427/431および347/417から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号232を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、14/100、28/44/365/407、38/118/290/351/375/401/422、38/178/401、38/290/351/401/422、54/413、74/102/137/161/259/289、92/118、98/233、102/161/250/435、106/112/204/347/396/417、106/112/204/347/396/417/427、106/112/204/347/396/417/427/431、110/222/250/259/435、112/204/347/396/417/427、112/204/347/396/417/427/431、118/156/178/290/375/401/422、137/161/435、137/169、159/169/173/300/424/438、185/290/401/422、204/347/396/417/431、290/351/401および435/438から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号348を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、14/28/38/74/100/102/118/161/169/178/233/250/407/422/438、14/28/38/74/102/156/159/233/250/289/413/422/424/435/438、 14/28/38/100/102/110/159/161/233/259/290/300/351/435、14/28/38/110/137/161/222/289/401、14/28/44/74/98/102/137/159/161/185/222/250、14/28/44/92、14/28/44/161/169、14/28/44/375、14/28/54/161/185/413、14/28/54/365、14/28/74/98/100/102/161/173/178/233/250/259/290/407、14/28/92/100/102/159/161/169/233、14/28/92/100/102/159/161/233/351/422、14/28/92/100/102/422/424/435、14/28/92/100/161/222/233/289/300、14/28/100/137/156/161/222/259/289/365/401/435/438、14/28/100/156/161/250、14/28/102/118/137/161/185/222/250/259/401、14/28/159/289/290/300、14/28/159/365/435、14/28/35、14/38/74/110/156/161/173/178/222/300、14/38/100/102/161/173/178/222/250/375/401/413、44/74/100/102/161/233/365/435/438、14/74/110/159/161/169/173/250/259/290/375/407/422、14/74/161/375/401、14/92/98/100/159/161/259/365/422/424/435、14/110/156/161/375/401/435/438、14/159/161/365/435/438、14/161/222/250/259/289/375/401/413、14/161/222/250/435/438、14/161/300、28、28/38/92/98/100/102/156/161、28/44/74/401、28/44/92/161/222/300/413、28/44/98/100/102/118、28/44/118/156/161/222/289/435/M438、28/44/289/290/351/422、28/44/435/438、28/54/92/159/161/290、28/54/159/290/438、28/54/250/439、28/74/156/159/161/178/300/365/435/438、28/74/156/161/365/407、 28/74/161/290/365、28/92/100/102/110/161/185/250/300/375/435、28/92/98/100/110/156/161/401、28/92/118/159/222/250/259/300/407、28/156/161/185/435/438、28/156/161/233/259/300/435、 28/98/100/102/161/185/351/401/435/438、38/161/300/438、74/98/100/102/110/118/161/178/250/289/290/300/435/438、74/98/100/102/118/156/159/161/435/438、74/156/161/173/178/424/435、74/375/435、98/100/118/159/161/300、98/100/156/159/161/178/259/289/290/351/422、102/137/159/161/422/424、118、137/159/161/185/300/351/365/435、156/159/161/169、159/161/222/290/375/407、159/161/401および 161/259/289/435/438から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号548を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、19/44/110/191/198/199/208/300/365、19/75/76/87/92/199/207/208、19/87/92/191/199/209/413/435、44/76/197/199/208/351、44/87/92/137/159/199/209、44/87/137/159/169/191/199/208、44/87/137/191/197/209/289/401、44/87/199/208、75/76/87/92、75/76/87/92/290/300、75/76/87/191、75/76/87/191/197/199/209/300、75/87/92/169/207/208/300/413/435、75/87/110/137/169/191/199/208/209/289/435、75/87/110/191/197/198/207/208/289/290/300/401/413、75/87/300、75/110/197/199/208/290/300/401/413、76/92/199/209、87/92/197/198/199/208/300、 87/137/435、87/169/191/199/207/209/401/413、87/191/198/199/222/244/289/300/435、87/92/110/169/199/207/209/290/300、87/92/159/169/191/198/290/413/435、87/92/159/191/199/208/209/289/290、87/92/208/401、87/435、92/137/191/199/209、92/197/199/207/208/401、137/198/199/207/208/426/435、137/199/208/209/290/435、137/365、159/197/199/207/209、169/191/197/199/207/208、169/197/199/207/209/222/300/413/435、191/207/208/289/290/413/435および197/198/199/208/209から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号562を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたNDP−グリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、69/173/175/243/246/354/365/383/399、69/173/243/383/399、56/191/354/383/399、70/225/246/409/413、70/115/225/409、70/225/413、70/225/247、74/310/396/424、74/396および173/175/191/365/383/399から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号758を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたNDP−グリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたNDP−グリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、24、24/28、24/28/262、24/28/262/264、24/28/262/264/423、24/264/294、28、28/262/264、28/423、32、56/69/70/175/191/246、56/69/70/175/191/246/354、56/69/70/175/354、56/69/70/191/246/354/365、56/69/70/246/354、56/69/175/191/246/354、56/69/175/246/354、56/69/175/246/354/365、56/69/246/354、56/69/246/365、56/70/175/191/246、56/70/175/191/246/354、56/70/175/191/354/365、56/70/175/246/354、56/70/175/246/365、56/70/191/246/354/365、56/70/191/354、56/175/246、56/175/354、56/175/354/365、56/191/246/354、56/191/354/383/399、56/246、56/246/354/365、56/354、69、69/70/175/191/246/354/365、69/70/191/246/354/365、69/70/246、69/70/354/365、69/173/175/243/246/354/365/383/399、69/173/243/383/399、69/175/191/246/354、69/175/354、69/246/354/365、69/354、70、70/115/225/409、70/175/191/246/354/365、70/175/191/354/365、70/191/246/354/365、70/191/246/365、70/225/246/409/413、70/225/247、70/225/413、74/310/396/424、74/396、126、126/220、126/403、173/175/191/365/383/399、175、175/191、175/191/246/354/365、175/191/354、175/191/354/365、175/246/354、175/246/354/365、175/354、191/246/354、246/354、262/264、264、264/29、269、325、341、351、354、354/365および366から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号770を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたNDP−グリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、24/32/264/269/330/402/403、24/32/264/269/382/403/406、24/32/264/330、24/32/269、24/32/269/382/385/389/402/406、24/32/269/403、24/32/330、24/264/269/389/402/406、70/126/175/191/246/325/354/366、70/126/175/325/330/351/354/366、70/126/191/246/325/351/354/366/423、70/126/191/246/325/351/354/423、 70/126/191/246/325/351/366/423、70/126/191/246/354/366、70/126/246/330/366、 70/126/246/354/366、126/211/220/253/316/342、126/211/220/275/279/323、126/211/260/423、126/220/260、126/220/316、56/220/260/423、220/260および220/260/423から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号792を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、24/32/97/162/202、24/32/126/198/201/367、24/32/126/198/202/220/226/260/269S、24/32/146/226、24/32/198/201/220/226、24/32/198/201/226、24/97/260/367、32/97/198/202/226/260、32/202/367、32/226/367、56/175/197/211/330/382/385、56/175/197/253/385/389、56/175/264/382/385/389/402/406、56/197/264/279/330/382/389/402/403/406、56/211/253/316/323、56/211/264/316/389、56/211/279/323/330/402、56/264/385/389、97/202/367、162/220/226/367、175/197/211/264/330、175/211/264/279/316/323、175/211/279/323/330/402/403/406、175/211/323/382/402/403/406、175/211/403/406、175/264/316/323/330/403/406、175/264/316/389/402、175/264/323/330、197/211/316/342/406、197/211/316/382/389/402/403、197/211/402、197/279/323、198/201/367、198/202/220/269/367、201/202/367、211/382/406、211/385/389、211/402/403および389から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号954を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、24/32/175/211/260/330/403/406、24/32/175/226/253/275/316、24/32/201/226/260/264/330/402/406、24/162/175/198/211/226/275/316/323/389、24/162/175/201/275/316、24/162/198/201/211/226/323/351、24/162/198/201/226/351、24/162/201/253/264/351/402/406、24/175/198/211/226/253/316、24/175/201/275/316/351、24/175/201/316、24/175/211/220/260/275/330/389、24/175/211/253/316、24/175/211/316/330、24/175/226/323/351、24/198/201、24/198/201/211、24/198/201/211/220/260、24/198/201/220/275/389/402/406、24/198/201/226/330/389、24/198/201/351、24/201/211/253/323/351/366/389/402/403、24/201/226/253/402/403/406、24/226/330/351/403、175/198/201/211/226/260/264/323/402/406および175/198/226/260/351/402/403/406から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1054を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、21/127/129/161、21/127/129/161/162、21/127/129/162/199/200、127/129/161/162/199、127/129/161/199/200、127/129/162、156、156/161、156/161/162、156/162/199、および156/199/200から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1002を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2/7/12/15/175/260/318、7/12/400/435、7/318/451、12/15/57/71/175/260/400/402、12/15/57/220/254/260/318/402、12/15/57/318/402/435、12/15/318/400/402/406、12/57/175/451、12/175/260/264/318/400、12/175/400/402/406、12/318/402/404/406/451、12/318/402/404/451、15/175/318/400/402、32、57/175/220/260/264/402、57/175/404、57/220/260/400/402/406、57/260/400/402/404、57/400/402、57/402、135、148、152、152/192/195、160/186/195、186、195、260、237、239、240、323、325、326、327、330、331、356および400/402から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号2600を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、11、14/23/274/326/329、14/31/184/274/322/326/329/330、14/56/184/185/194/238/239/274/329/399、14/56/184/194/234/315/326/329/399/401、14/56/194/238/315/325/326/329/330/399、14/56/252/274/315/326/329/330/401、14/184/185/194/234/325/326/329、14/184/185/194/388/399/401、14/184/194/355/399、14/185/194/238/399、14/185/236/238/239/274/322/326/329/355/399/401、14/194、14/322/326/330、14/326/330、14/355、14/355/399、23/31/147/184/185/238/252/325/329/330/388/401、31/56/315/329/330、45、55、56、58、65、65/114/132/238、65/238/240、104、113、114、132、135、138、147/236/238/243/315/329/330/399/401、165、185/194/236/239/325/326、223/412、238、256、273、286、309、391、422、430および449から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号2718を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、23/31/185/324/401、23/31/185/355、31/134/185/252/274/324/388、31/134/238/252/322/324/388、31/134/252/324、31/184/185/238/239/322、31/236、31/322、31/388、122、134/184/185/234/236/239/274/324/388、164、176、177、184/185/322、234/236/238/322/324/355、236、238/324/329/355、316、322/324、324/329/355/401、325、400、425、426、427、440および446から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号2814を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、11、11/45/58/132/138/286、11/58、11/58/65/104/107/138/286、11/58/65/107/135/223/286/391/430、11/58/65/135/138、11/58/104/107/114/138/223/391、11/58/114/286/309/391、11/58/132/165/286/391/422/430、11/58/138/309、11/65/104/107/138/165/286/391/430、11/65/107/135/165/391/430、11/65/132/135/138/223/391、11/65/132/135/252、11/65/132/391/430、11/65/135/138、11/104/132/138/309/391、11/104/132/138/391、11/107/114/223/309/430、11/107/138、11/114/135/138/223、11/114/223/252/286/391、11/132/135/138/223/286、11/132/138/223/286/391、11/138/165/223/309、58/65/138、58/65/138/165、58/65/165/309/430、58/104/114/165/391、107/114/132/138、107/430、135/138/165/309/430および223/309から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号2884を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、8/448、9、58/107/122/176/236/324/325/400/426/427、58/107/122/236/324/400/425/446、58/107/122/322/400/425/427/440/446、58/107/164/400、58/107/236/400、58/107/400、58/122/164/236/446、58/122/176/236/400/446、58/122/176/322/324/426/427、58/122/176/400/425/426/427/446、58/122/322/325、58/122/325、58/122/440、58/164/176、58/164/324/425/427、58/176/236、58/236、65、106、107/122/236/425/426/446、107/164/236/400/446、107/176/322/325/440/446、107/176/400/425/427/440、107/236、107/440、115、116、122/164/176/324/400、122/164/400/440、122/164/400/440/446、122/176/236/400、122/176/324/400/440、122/400、122/425/426/446、122/440/446、139、139/252、164、164/271/425/426、164/322/324/325/400/425/440/446、164/400、172、176/400、178、189、200、210、213、240、242、245、255、324/400/425/426/440/446、324/423、385、408、409、411、412、415、416、423、447および448から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号3016を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2、3,8、8/107/139/164/415/416/440/448、8/107/139/255/322/325/415/416/440/448、8/107/164/255、8/107/164/423/440、8/139、8/139/164/200/236/240/322/440/448、8/139/164/236/416/423/440、8/139/189/240/325/416、8/139/200/236/240/255/423、8/139/255/415/416、8/164、8/164/189/200/322/324/325/416/448、8/164/240/423、8/164/252/255/448、8/164/448、8/236/240/252/448、8/240/423、8/252/255/322/325/448、12/164/440、20/126/128/155/161、20/126/128/160/161、20/126/128/160/161/198、20/126/128/161、20/126/128/161/198/199、20/126/155/160/198、20/126/155/161、20/126/160、20/126/160/161、20/126/161、20/128/155/160/161/198、20/128/155/161/199、20/128/155/199、20/128/160/161/198、20/155/160、20/155/160/161、20/155/161、20/155/161/199、20/160/161/198、34、72、73、75、107/139、107/139/200/240/322/324/325/448、107/236/240/325/440、107/240/252/423/448、107/423、113、114、121/126/128/161/369、126/128/155/160/161、126/128/155/160/161/199、126/128/155/161/199、126/128/160/161/369、126/128/160/198/369、126/128/160/199/369、126/128/160/369、126/128/161/199/369、126/128/161/369、126/128/369、126/160/161/199/369、126/160/198/369、126/196/198/369、126/198/369、126/199/369、126/369、128/155/160/161、128/155/160/161/199、128/155/160/198、128/155/199、128/160/161/369、128/161/199/369、128/198/199/369、128/199/369、128/369、139、139/164/236/240、139/255/325/415/440、155/161/198/199、155/199、160/161/369、161/198/369、161/369、164/189、164/189/236/240、164/189/240/252/415/423、164/200/236、164/200/236/240/324/416/440、164/200/236/255/322/324/423/440、164/236、164/236/240/440、164/236/423、164/322/325、164/322/325/416/423、164/416/448、186、189、199/369、200/236/322/325/416、200/322/325/415/448、221、235、236/415/416、237、239、240、240/252/255/322/415/416、240/252/255/415/448、255/423、256、286、299、305、309、312、313、323、325、355、389、406、415/416/448、422、438および446から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号3082を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、14、35、42、46、49、105、106/164/172/200/409、106/164/172/210/240/415、106/164/172/242/409/416、106/164/200/210/242、106/164/200/210/415、106/164/200/240/408/409/416、106/164/210/240/408/409/416、106/164/210/408/409、106/164/240/415、106/164/409/415/423、106/172/200/210/240/242/408/415/416/423、106/172/200/210/242、106/172/240、106/172/240/242/409/415、106/172/242、106/172/242/416/423、106/172/408/409、106/172/409/423、106/200/210/409、106/210/240、106/210/240/408/415、106/240/242、106/240/242/409、106/242/408/409、134、143、164/172/200/210/242/409、164/172/240/242/415、164/172/242/408、164/200/408/415/416、164/240/242/408、164/240/242/415/423、164/423、172/200/210/240/408、172/200/240、172/200/408/416、172/210/415、172/240、172/240/242/415、172/240/409、179、181、200/210/240/242/409、200/240/242/407、200/242/415/416/423、200/408/409、210/240、232、240、240/242、240/242/408/416、240/242/415/423、240/408、240/415、278、290、336、373、381、401、409/415および441から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号3244を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、21、91、125、127、130/187、143、143/150、145、152、156、186、187、195、197、200、201、202、264、268、364、365、および415から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号3346を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2/5/113/186/237/406、2/73/186/237、2/189/286、2/286/355/416/422、5/34/73/113/406、5/73/186/406、5/113/237/406、5/186/237/245/256/406、5/186/237/406、5/256/406、34/113/186/237/406、72/73/172/235/240/242/438、72/172/239/240/242/408、72/172/240/242、73/172、73/172/235/239/240、73/172/235/239/242、73/172/239/240、73/172/239/240/242、73/172/240/242/408、73/172/240/408、73/186/237/406、73/235/240/323、73/235/240/408、73/237、73/239/242、96、113/186/406、127、132、144、153、155、156、172、172/188/323、172/235、172/235/239/240/242、172/235/239/408、172/235/240、172/235/240/242/438、172/239/240/242/323/408、172/240、172/240/299/323、186、186/237、186/237/286、186/406、187、189/333/355/421,196、199、200、235/239/240、235/240/242、237、239/240、239/240/242/256/323、239/240/242/323/408、239/240/408、239/242/408、240/242/256/438および242/408から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号3502を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2/5/35/105/143/237/373/416/422、2/5/35/143/232/237/416/422/441、2/5/35/232/278/373/416、2/5/105/143/232/373/416/422、2/5/278、2/105/143/232/237/278/373/441、2/143/232/373/441、2/143/373/441、3、5/35/232/373/416/422、5/105/232/237/373/416/441、5/105/237/278/422/441、5/105/237/416/422/441、5/143/189/232/237/441、5/143/232/237/278、5/143/232/237/416/422、5/143/232/373/422/441、5/143/237/278/373/416/422、5/143/373、5/189/237/278/373/416/422/441、5/232/416/422、5/237/373/422、5/373/416、8、26/42、26/42/46/49、26/42/46/49/134、26/42/46/49/134/186、26/42/46/134、26/42/49/134、26/42/49/134/186/355、26/42/49/134/401、26/42/134/401、26/49/134、26/134、26/134/186/355/401、26/134/355、26/134/401、26/355/401、35、35/105/189/232/373/416、42/46/49/97/134/401、42/46/49/134、42/46/49/134/186、42/46/49/134/186/355、42/46/49/134/235/355/401、42/46/49/134/401、42/46/49/186、42/49/134/186/355、42/49/134/186/401、42/49/134/355/401、42/134/186、42/186/355、46/49/134、49/134/355、50、61、62、101、105/143/232/237/373/416/422/441、105/143/278/373、105/189/237、105/237/278/373/416/422、105/237/373/422/441、105/373、105/373/441、134/401、137、143、143/189、143/189/232/422/441、143/189/237/373/416/422、143/232、143/237、143/237/422/441、158、161、164、176、186/355、189/232/373/416/422/441、189/237/278/416/441、193、223、223/243、232/237、237/373、235、237、 237/373/441および239、240、243、244、248、249、301、323、330、352、364、426および427から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号3696を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、5/73/113/186/187/373/423、5/73/143/144/179/186/187/422、5/73/144/179/186/373/423、5/73/144/187/373/422、5/143/144/179/181/186/187/373、5/144/179/181/373/422、5/144/373/422、11、12、41、44、44/187、45、49/96/127/132/156/196、49/96/127/153/278、49/96/132/153/155/156/237/278/406、49/96/132/153/199/200、49/96/132/155、49/96/132/155/237/278、49/96/155/199/200/406、49/153/155、55、56、57、65、66、70、72、73、73/113/143/179/181/422、73/113/179/181/186/187、73/143/144/179/186/187/373/423、73/179/181/186/187/373、73/179/181/186/373/422、73/181/186/187、74/238、82、83、85、 96/127/132/153/278、96/127/153/155、96/132/153/155、96/132/153/155/156、96/132/153/155/156/200、96/132/153/156、96/132/196/199、96/132/278、96/153/155/156、96/153/155/199/200/237、96/153/406、103、111、113、113/143/179/186/187、113/144/186/423、113/144/373、113/181/186/373/422、113/373/422、114、117、127/132、127/132/153/156、127/132/155/156/406、127/153/155/199/200/237、127/406、 132、132/153/155、132/153/237/406、132/155、132/237、135、138、140、143/144/179/181/186/187/422、143/179/181/186/187/422/423、144/179/181/186/187/373、144/179/186/187/373、153/155/156/237、153/155/196/199/237、153/199/406、153/237、155/199、159、160、162、167、179/181/186、179/181/186/187/423、179/186/187、179/187/373/422、181/186/187/422/423、182、214、220、222、223、226、236、238、256、286、299、309、373/423、387、388、389、391、393、406、408、412、418、422、429、430、449および450および373/423から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号3956を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、7、8/375、9、10、12、50/137/189/375、53、62/153/155/156/159、62/153/155/156/159/427、62/153/155/199/406、65、68、99、106、110、115、116、131、132、136、137/164/375、153、153/155/156、153/155/156/159/199/238/406、153/155/237/238/239/406、153/155/238/239、153/155/427、153/156/159、153/156/199/237/427、153/156/427、153/159/237/238/352、153/176/181/427、155/156、155/156/176/181/199、155/156/176/238/427、155/181/199/238/406、156/199、156/199/427、164/375/433、170、178、190、192、194、200、220、223/375、238、242、245、257、272、280、302、304、335、375、385、395、399、402、408、412、416、423、427、445、447および449から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号4256を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、11/41/44/127/132/406、11/41/44/127/278/406、11/41/45/73/127/278/406/408、11/41/45/127/278/406、11/41/132/278、11/44/45/127、11/44/73/127/132/135、11/44/73/127/132/135/406/408、11/44/127、11/44/132/278/406、11/45/73/127/135、11/45/127/132/135/138/182、11/45/406、11/73/127/132/135/182/278、11/73/127/132/278/406/408、11/73/127/132/406/408、11/73/132、11/73/132/135/408、11/127/132/135、11/127/132/135/182、11/127/132/135/406、11/127/132/138/182、11/127/132/182、11/132/135/406、11/182/406、41/44/45/73/127/132/278、41/45/127/132/135/278/406、41/73/132/135/406、44/45/73/132/135/406、44/45/127/132/135/138/182/406/408、44/45/127/132/278、44/73/127/135、44/73/127/135/182/278/406/408、44/73/132/135/406/408、45/73/127/132/135/406/408、45/73/132、45/73/132/135/182、45/73/278/406/408、45/127/132、45/127/132/135/182、45/127/132/135/182/406/408、45/127/135、45/132/408、45/406、56/309/449、57、65/114/422/427、65/114/427、65/143、65/143/235/427、73/127、73/127/132、127、127/132/135/182、127/132/135/182/406、132/135、132/135/182、132/135/406、132/406、164、164/220/309/449、164/220/449、164/449、182、220/449、309、309/449、406、418/427、427、427/429および449から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号4550を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2、4、7/10/73/127/132/385/423、10、10/53/73/99、10/53/272/423/427、10/53/423、10/73、10/73/127、10/127/132/385、10/132/302/385、11/44、11/71、11/287、11/441、37、40、42、42/138、42/141、43、46、47、48/398、49、49/406/408、51、53/73/200/423、53/127/132/385、53/127/136/385、53/132/136/302/423/427、53/132/302/385/423/427、64、65/106/445/447/449、65/143/220、65/220/309/445/447、65/220/445/449、65/399/406/447/449、65/402/406/445/449、65/445/447/449、65/447/449、71、73、73/127/427、73/132/136/385/427、73/385、73/385/427、76、97、100、106/220/399/402/406、108、108/172、109、112、115/116/278、115/170/190/238/412、115/190/194、115/245/278、116/170/190、116/190/406/408、116/238、116/238/245、116/416、117/157/301、118、118/406/408、119、119/172、127、130、132、133、134、141、143/220/445/447、143/309/402、143/309/445/447/449、157、169、170、170/190/192/194、170/192、170/192/194/278、170/192/194/335、170/194、170/194/335/416、170/238、170/335、170/335/416、172/420、172/437、179、181、190、190/192/194、190/194、190/194/238/245、190/194/335/416、190/194/412、190/245/412、192/194、192/194/242/406/408、194、200、200/385、220/399、220/445、220/445/447、257/385、259、272/302、272/385、274、275、278、287、288、302/385、309/399/449、309/445/447/449、333/398、333/406/408、338、356、357、376、381、385、394/420、396、397/406/408、398、401、385、385/427、399/406、399/406/449、402/445/449、406/408、406/445/447/449、406/445/449、410、417、420、423/427、434、437、441、445/447/449、445/449、447および449から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号7324を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、10、10/144、10/199、11、11/64/109、11/445、13、14、15、15/394、16、22、36、42/43、42/44/71/73/116、43/73/141、46/47/51、46/51、47/49、47/51、64、64/65/109、64/65/112、64/112、64/134、64/445、65/112、65/112/445、71、71/73、71/73/141、71/141、71/302、73、73/116/141、73/141、73/302、89、93、96、109、109/112、109/115/118、109/134、109/406、112、112/445、116、116/123、116/287、116/143、116/350、123、125、127、127/169/172、127/169/287、127/169/376/398/399、127/169/398/399、127/287、127/376、141、141/302、143、144、149、156、169/172/287、169/172/288、169/172/288/398/399/420/423/427、169/172/398/399、169/287、169/398、169/398/399、186、187、197、198、199、201、202、203、268、287、287/288、287/376、287/398、287/399、287/420/423/427、288、288/376/398、288/398、288/399、302、324、331、350、376、376/398、376/399、398、398/399、398/399/420、398/427、399および420から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号7784を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、22、25、51、56、71、78、80、81、88、157、185/208/230/252/255/290/365、189/206/208/365、200、208/365/435、243、245、249、259、262/401、279、282、284、304/322/365/401、308、338、339、352、362、364、365/401/413/435、366および374から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号696を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、51/56、51/56/243/249/282/353/362/366、51/56/243/249/308/362/364、51/56/249/353、51/56/249/362/364、51/56/249/362/366、51/243/249/308/353、51/243/249/348/362/366、51/249、51/249/282/284/364、51/249/282/353/366、51/249/284/308/362/366、51/249/353/362/364、51/353/362、56、56/243/249/282/364/366、56/243/364/366、56/249、56/249/284/353、56/249/353、56/284/366、243/249/282/284/362/364/366、243/249/308/353/366、243/249/353/362/366、243/282/353/362/364、243/282/362/364/366、243/308/353、249/353/362/366、282、308/366および362/366から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号4684を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、25、25/56/353、25/243/249/259/366、25/243/249/362、25/362/366、51、51/56/200/243/249/259/338、51/56/362、51/71/249/279/284/362/366、56/243/249、56/362/366、70/198/259/313、85、88、88/173、110、159、163、171、174、175、177、198、198/313、198/313/428、200/243/249/259、208、208/320、209、209/234、222、226、234、234/408、243/338/362/366、253、256、259、265、272、289、322、336、353/362、405、411、428および439から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号4838を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、8、9、25、25/198/209、25/200/209/338、25/200/243/249、25/209/243、25/209/243/249、25/209/243/259、25/209/249/259/366、25/209/259、25/209/279/366、25/209/289/366、25/249、25/259/279、25/259/279/289、25/279/284、25/279/284/289、25/289、34、53、54、55、61、69、70、73、79、87、91、107、108、111、141、153、158、174、190、194、198、198/200/209/243/249/289、198/249/338、200/209/366、201、205、209、209/249/259/279/338/366、209/249/259/289、209/249/279/284/289、209/249/338、209/279/289、209/366、234/297、238、247、249/259、252、253、254、256、259/366、279、279/338、289、297、308、321、322、327、336、338、341、342、364、366、388、392、411、412、414、426、430、432、446および449から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号4876を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、88、88/110、88/110/159/198/200、88/110/159/198/234/259/265、88/110/159/198/259、88/110/198、88/110/234、88/159/198、88/198、88/198/200/259、88/198/259、88/259、88/259/265、110/259/265/411、159/198/411、159/259/411、171/174/175/177/208/320/428/439、171/175/177/208/320/428、171/177、171/177/226/428/439、171/208/320、171/208/320/428、171/208/428、174/175/177/208/320/428、174/175/428、174/320、198、198/200、198/200/234、198/234、198/259、208、208/320/331/428、208/320/428、208/428、234、259、320/428および428から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号5066を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2、7、25/61/208/252/253、25/61/428、25/107/208/320/428、25/208/247/252/253/364/428、25/247/249/252/364/428、38、53/54/55/153/201、53/54/308/392、53/171/308/392、54、61/107/208/252/253/254/364/428、61/208/252/254/428、64、68、73/87/201、91/201/439/444、99、106、107、107/208/320/364/428、107/247/249/252/254/364、107/247/252、107/247/428、109、159、169、171、172、177、179、190、190/208/247/252/428、222、233、233/269、247/249/252/254/320/428、249/252/253/254、249/252/254/428、251、252/253/254、253/320、259、264、289、296、300、308、308/327/439、317、318、320、320/364/428、320/428、347、404、408、417、424、427、428、428/434、431、435および438から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号5290を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2、49、73、87、87/88、87/88/94/159/177/208、87/88/159/198、87/88/177/198/249、87/88/208、87/159/177、87/159/320、87/177/249、87/198、87/198/199、87/198/208/320、87/208、87/208/320、87/320、88、88/177、88/177/208、88/177/320、88/198、88/199、88/199/208、88/208、88/208/249/320、88/320、113、134、135、158、159/177/198、159/177/208、159/198/208/320、171、173、177/198、177/208、195、214、222、253、256、257、268、272、289、300、302、330、348、374、392、399、408、411、412、437、439、445および453から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号5372を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2/7/107/233/252/253/320、2/7/107/233/252/253/320/408/428、2/7/233/252/253/320/427/428、2/233/252/317/320、7/107/190/233/252/253/317/408/427、7/107/233/252/253、7/107/233/252/317/320、7/107/233/252/317/408、7/190/233/252/253/320/427、7/190/233/252/317/320/427/428、7/190/233/252/408/427、7/233/252/253/317/408/427、7/233/252/253/408、7/233/252/317/320/427、7/233/252/317/428、14、55、56、64/169/201/347/392、64/172/264/268/347/392/417、91/94/171/172/201/264/347、91/201/264/347/392、94/201/264/347/435、107/190/233/252、107/190/233/252/317/320、107/233/252/253、107/252/317、169/171/172/264/392/435、169/171/201/264/392/435、169/172/201/264/347、169/172/201/264/347/392/435、169/172/201/347/392、169/172/201/417/435、171/172/201/264/392/417/435、171/201/392/417、190/233/252、190/233/252/253/317/320/408/428、190/233/252/317/408、190/233/252/320/408、201/264/347/392/417/435、201/264/347/392/435、201/264/347/417/435、233/252/253/317/320/427/428、233/252/253/408/427、233/252/317/408、233/252/317/427、233/252/320、233/252/320/408/428、255、282、308、336、342、348/374/435、364、374、391、407および422から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号5562を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2/4/113/158/163/302/364/399/449、2/4/113/158/163/330/449、2/4/113/163/449、2/4/158/163/364/449、2/4/158/222/257/302/330、2/4/158/330、2/4/163/222/302/330/364/449、2/4/163/257、2/4/163/257/330/399/449、2/4/163/330/449、2/4/163/364、2/4/163/364/453、2/4/302、2/113、2/113/163、2/113/163/449、2/113/330/399、2/113/449、2/158/163、2/158/163/364/399、2/163/364/453、2/364/449、4/113/158/163/330/364/399、4/113/158/302/330/364、4/113/163/364/399、4/158/163/364/399、4/364/449、87、87/95/198、87/198、87/266、87/322、107/134/135/195/412/417、107/195/268/322/439、107/195/272、107/195/417/439、107/374/417/439、113/158/163/364/399、134、134/135/195/268/317、158/163/257/330/364/449、158/163/302/330/364/399、158/163/364、163/257/302/364、163/302/330/364/449、163/364、173、173/190/233/252/427/437、173/190/252/257/347/427/437、173/190/257/374/437、173/190/257/427/437、173/233/252/257/427、173/233/437、173/252、173/252/268/437、173/252/347/411、173/257/374/437、173/374/437、173/427/437、190/233/252/257/347/411/437、190/252、190/252/257/285/427、190/252/257/411/437、190/252/257/427、190/374/427/437、195/272/320/439、195/317/320、198、198/244、198/292、233/252、233/252/257、233/252/257/347、233/252/257/347/411/437、233/252/257/427/437、233/252/285、233/252/285/437、233/252/411/437、233/252/437、233/374、233/374/437、252/257、252/257/347/437、257/347/411/437、268/417、285/347/437、302/364、330/364、347/411/437、347/427/437、364/399、374、374/411/437、408/417、411/437および437から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号5708を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2/4/14/158/282/364/449、2/4/14/158/282/407、2/4/14/163/198、2/4/14/163/282/399、2/4/14/198/308/407、2/4/14/282/308/364、2/4/14/282/308/407、2/4/14/282/364、2/4/158/163/364/399/407、2/4/158/198/282/364/407、2/4/163/198/282/308/342、2/4/163/282/342/364、2/4/163/364/399/449、2/4/198/282/449、2/4/198/364/391/449、2/4/282/342/364/407、2/14/158/198/407/449、2/14/163/308/364、2/14/163/364/407、2/14/282、2/14/282/308、2/14/282/308/364、2/14/282/399、2/14/308、2/14/308/364、2/158/163/407/449、2/163/282、2/163/282/308/364、2/198/282/308/342、2/198/282/399、2/282、2/282/308/342/407、2/282/308/391/407、2/282/399、2/282/399/407、2/308、2/308/364/399、4/14/158/163/198/282/407、4/14/158/282/364/391/407、4/14/163/282、4/14/163/282/308/342/407/449、4/14/198/308/364、4/14/282、4/14/282/308/364/407/449、4/14/282/342/399/407、4/14/364/391、4/158/282/364/399、4/163/282/308/407、4/198/399/407、4/282/342/364/407、4/282/364/407、4/364、12、14/158/163/198/364、14/158/163/282/364、14/158/198/282/342/364/449、14/158/364、14/163/198/282/342/364/449、14/163/282/308、14/282、14/282/308、14/282/342/364/391、14/282/364、14/282/364/391/407/449、14/282/399/407/449、14/407、37、44、70、71/331、74、75、90、106、108、112、114、115、131、138、139、156、158/282/407、158/282/407/449、158/364/399/407/449、158/364/449、162、163/198/282/342、163/282/308/364/399、163/282/399/407、163/282/407/449、174、198/282/308/342、198/282/407、198/308、247、248、254、258、282/308/342/364/449、282/308/449、365、389、401/402、416、427、429、432、433および456から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号5976を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、14/113/158、14/113/158/163、14/113/158/163/190/257/308/342、14/113/158/163/437、14/113/158/308/317/330/449、14/113/163/190/308/317、14/113/163/257/308/342/437/449、14/113/163/257/437、14/113/163/308/317/320/322/330/449、14/113/320/437/449、14/158、14/158/163/190/257/308/317/330/437、14/158/163/190/342/437、14/158/163/257、14/158/163/257/308/449、14/158/257/308/437/449、14/158/317/320/330/437、14/163/317/320、14/190、14/190/257/317/320/322、14/257/308/320/322/330、14/257/308/322/330/437、14/317、14/330、14/449、19、29/375、41、45、46、71、72、80、81、83、84、85、88、95、105、113/158/163/190/257/437、113/158/163/190/308/317/322、113/158/163/190/308/320、113/158/163/257/308/317/322/437/449、113/158/190/257/320、113/158/190/320/322/449、113/158/320/322/437、113/257/308、113/257/317/322/437、155、158/163、158/163/190/257/308/342/449、158/163/308、158/163/322/437、158/308/320/437、158/320/437/449、163/308/330/437/449、168、190/449、197、199、202、209、243、249、263、273、317/320/322/330、322/330、366、375および383から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号6138を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、5/449、6、10、25、25/449、37/71/125/174/247/248/427、37/71/247/331/365/389/401/429、37/139/329/365/427/433/449、37/139/427/432/433/449、37/139/429/432/433、37/174/401/402/433/449、37/248/331/389/427/433、37/248/389/401/429、37/331/432/433、69、69/449、71/139/389/427/429/432/433/449、71/174/329/427/429/432/433、71/174/365/427/432、71/248/365/389/401、71/248/449、71/254/433/449、71/427/432/433/449、71/432/433、87、87/449、91、91/449、139/156/174/389/401/427/433/449、139/156/247/365/401/433/449、139/156/247/389/401/427/433/449、139/156/248/389、139/156/248/389/401/416/427/429/433、139/156/365、139/174/248/331/389/401/449、139/174/254、139/174/365/401/402/427/433/449、139/247/248/331/401/417/432/449、139/248/254/449、139/248/402/416/427/433/449、139/248/432/433、139/254/401/416/427/433/449、139/401/449、144/449、153、153/449、156/248/256、156/254/331/365/427/432/449、156/389/401/402/416/432/433、159、159/449、172、172/449、174/247/248/389/401/432/433、174/329/432/449、174/365、174/389/429/432/433/449、212/449、233、233/449、247/248/401、247/248/449、247/331/401/427/432/449、247/401、247/427/432、248/331/427/429/433、248/365/389/427/429/432/449、248/401/429/432/433、248/416、248/416/449、248/449、254/365、254/427/433、288/449、303、317、331/365/429/432/433/449、347/449、361、365/401/402/429/432/433、369、389/401/416/432/449、389/401/427/432、401/427、416/427/433/449、416/432/433、416/432/433/449、421、427/432、427/432/449、432および433/449から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号6288を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2、3、4、9、37/41/45/72/81/83/84/88/155/163/168/190/331/375、37/41/45/72/81/83/84/88/155/263/273/331/375/432、37/41/45/72/81/83/84/88/155/331/366/375、37/41/45/72/81/83/84/88/155/331/375、37/41/45/72/81/83/84/88/248/375、37/41/45/72/81/83/84/88/331/366/432/433、37/41/45/72/88/155/168/190/331/366/375/432、37/41/45/72/88/155/168/190/331/375、37/41/45/72/88/190/263/273/331/366、37/41/45/72/155/163/168/190/243/263/273/331/366/432、37/41/45/72/155/163/168/243/248/273/331/366/432/433、37/41/45/72/155/163/168/263/366/432/433、37/41/45/72/155/163/331/366/375、37/41/45/72/155/190/243/248/273/331/432/433、37/41/45/72/155/190/248/263/331、37/41/45/72/155/190/263/331/366、37/41/45/72/155/190/273/331/366/375、37/41/45/72/155/190/273/366、37/41/45/72/155/190/273/366/375/432、37/41/45/72/155/248/263/273/366、37/41/45/72/155/263/331/375、37/41/45/72/155/263/375、37/41/45/72/155/273/366、37/41/45/72/155/331/366/375/432/433、37/41/45/72/190/263/273/331、37/41/45/72/190/331/366、37/41/45/72/190/366、37/41/45/72/263/331/366、37/41/45/72/263/366/432/433、37/41/45/72/331/366、37/41/45/81/83/84/88/155/168/190/243/331/366、37/41/45/81/83/84/88/155/168/331/375、37/41/45/81/83/84/88/155/263/273/331/366、37/41/45/81/83/84/88/163/168/263/273/331/366/375、37/41/45/155/163/168/263/331/375、37/41/45/155/168/248/273/331/375、37/41/45/155/190/331/366/375、37/41/45/155/366、37/41/45/155/366/432/433、37/41/45/155/375、37/41/45/243/248/273/331、37/41/45/263/331/375/432、37/41/45/331/366/432/433、37/72/81/83/88/155/190、37/72/197/273/331/375/432、37/83/263/365/366/375、37/190/202、41/45/72/155/263/331/366/375/432/433、41/45/163/168/243/248/273/366/432、45/72/84/88/197/375、45/72/88/366、45/72/163/202/365/366/375、45/72/168/243/331/365/366/429/432、45/84/168/190/199/254/273/365/366、45/163/168/190/199/366/429/432、45/163/168/197/263/331/365/366、53/437、61、64、72/81/83/84/88/155/163/168/190/366、72/81/83/84/88/155/190、72/81/83/84/88/155/190/273/331/366/432、72/81/83/84/88/155/273/331/375、72/81/83/84/88/155/366、72/81/83/84/88/163/168/190/243/263/331/366、72/81/83/84/88/163/168/263/331/375、72/81/84/190/248、72/83/84/88/202/254/273/366/375、72/83/84/197/202/243/263/365/366、72/83/88/243/263/331/365/366、72/155/163/168/190/366/432/433、72/155/190、72/155/190/263/331/366、72/155/190/366、72/155/273/331/375/432、72/243/248/263/366/432/433、72/243/248/273/366/432/433、72/243/248/366/432/433、72/248、72/170、72/405、81/83/84/88/155/163/168/273/331/375、81/83/84/88/155/190/263/331/366、81/83/84/88/155/263/366/375、81/83/84/88/155/366、81/83/84/88/190/263/375、81/83/84/88/263/273/331/366/432、81/83/169/190/263、81/83/190/263/365/366、81/83/202/365/366/402、81/88/375/402、83/88/155/273/366/375、84/155/168/197/199/331/366/375/383/402、84/168/197/202/263/366、84/197/366/402、94、96、98、113、118、118/120、120、129、134/158、155/168/190/197/199/366、155/168/375、155/263/366/432/433、158、165、170、171、173、183、190/199/202/331/366、193、197/199/202、197/202/248、197/248、199/263/331/365/366、214、214/222、222、226、229、234、248/375、253、265、269、272、289、296、300、302、304、322、322/407、330、365/366、365/375/402、390、395/439、396、398、399、403、405、408、411、412、423、428、434、435、438、439、442、444、448、449、452および454から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号6468を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、5/6/25/317、5/6/69/288/303、5/6/91/288/317、5/25/91/212/303/317、5/25/91/263、5/25/288、5/69/91/212/288、5/69/91/212/303、5/91/288/303、5/91/303、5/91/317/421、5/288、6/91/212/288/303/369/421、6/212/288/303、6/288、25/91/212/288、25/91/263/288/303、25/91/303/317/369、25/91/317/369、25/263/317、87/144、87/144/159/361、87/144/159/361/433、87/433、88/144、88/144/159、91/263/317/369、91/288/303/317/369、91/288/317/369/421、91/303、91/317、91/317/369、109/144/153/155/159/433、144、212/288、263/288/303/317および288から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号6864を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、2/3/433/435/442、2/81、9/37/113/396、9/87、9/144/331、37/113/144/396、37/233、41、53/144/233/269/331/428、53/233/269/390/395/396、53/234、61、56、61/120/156/163/165/197/303/308、61/120/159/300/308/407、61/120/300/303/407、61/156/159/163/165/243/248/253/300/303/308、61/156/163/243/248/300/303/308/407、61/156/163/300/365/411、61/156/197/253、61/163/300/303/308/405/407/411、61/165/248/253/407/411、61/214、61/214/300/308、61/243/300/308/407/411、61/300/303/308、61/300/303/405、61/365/405、69、69/81、69/134、69/263、69/263/434/438/439、69/439、72、76、 81、81/134、81/222、81/222/263/322/435/442、81/433/435/438/442、85/156/159/243/248/253/308/405/407/411、87、87/144、87/144/396、88、107、113/233/234、120/156/159/169/197/214/303/308/365/405/407、120/156/159/248/300/308、120/156/248/303/308/411、120/159、120/159/165/197、120/159/197/308/407/411、120/159/197/365/411、120/197/253/300/308、120/253/300/303/308/407、120/308/407/411、134/222/263、139、144/234/269、156、156/165/248/300/303/308、156/197/248/300/411、156/214/308/411、156/248/253/308、159/163/165/197/214/243/300/303/308/407、163/197/253/300/303/308/365、171/263、183/233/234/331/428、197/253/308/407、197/300/303/308/365、197/300/308/411、222、222/263/435/442、233/396/399、263、269、269/428/437、300/303/308、300/308/405/411、308、322、338および407から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号7388を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、37/72/76/81、37/72/76/107/156/331、37/72/195/331、53/81/195/197、55、69/72/76/107、72/76/107/156、72/76/107/195/197、72/269、81/107/195、87、87/91、87/91/94、87/91/94/120、87/91/94/233、87/91/94/233/259、87/91/94/263/389、87/91/120/233、87/91/120/233/411/431/435/437、87/91/144/259、87/91/163、87/91/163/233、87/91/163/233/263、87/91/163/389、87/91/233、87/91/233/389、87/91/259/263/389/428/431/435/437、87/91/263/389、87/91/322、87/91/389、87/94、87/94/144/263/428/435、87/94/263、87/163/233、87/233、87/233/259、87/233/322/389/411、87/233/389、87/259、87/263、87/428/431/435、87/435、91、91/94、91/94/120/233、91/94/120/233/389/431/438、91/94/233/259、91/120、91/120/233、91/233、91/233/259/389、91/233/389、94/233/411、111、144/389、163/233、195/197、197、233、233/259/263、233/259/389、233/438、252、255、259、263、263/389、322、324、328、389、413、428/431/435および451から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号8088を参照して番号付けられている、請求項2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- ベータ−1,2−グリコシルトランスフェラーゼおよびベータ−1,3−グリコシルトランスフェラーゼから選択される、請求項2〜47のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- ADP−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(AGT)、CDP−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(CGT)、GDP−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(GGT)、TDP−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(TGT)、およびIDP−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(IGT)から選択されるNDP−グリコシルトランスフェラーゼである、請求項1〜48のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- ADP−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼである、請求項48に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
- 請求項1〜50のいずれかに提供される少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする、操作されたポリヌクレオチド。
- 請求項51に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 少なくとも1つの制御配列をさらに含む、請求項52に記載のベクター。
- 請求項51に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項52および/または53に記載の少なくとも1つのベクターを含む宿主細胞。
- 真核生物および原核生物から選択される、請求項54または55に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜50のいずれかに提供される少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを産生するための方法であって、請求項54〜56のいずれかに記載の宿主細胞を、前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼが前記宿主細胞において産生される条件下で培養するステップを含む、方法。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼを回収するステップをさらに含む、請求項57に記載の方法。
- 請求項1〜50のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを含む組成物。
- 配列番号72に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼ。
- 配列番号74、1080、1158、1222、1392、1456、1582、1764、1804、1840、2064、2432、2510、7506、および/または8420に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、4/9/349/532、4/13/113/343/532、4/13/113/532、4/33/47/52/343/532、4/47/52/532、4/113/532、4/13/113、4/13/532、4/33/113、4/343、7、8、44、95、117/440、136、221、343/532、440、444、478、532、583、611、615、615/789、695、722および788から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号74を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、8/221、47/221、68/129/248、68/129/248/595/600/756、68/146/248/387/506/550、68/189/272/316/477/719/756、75/105/154/215/264/345、75/105/345/410/769、75/105/530、75/345/530、85/170/225/266/534、87/125/230/267/375/464/708、93/129/506/550/595/719/756、93/477/635、95/136/788、95/201/478/583/724/788、95/385/478/583/788、95/440/478/724/788/792、95/444/478/603/792、95/444/478/724/788、95/478/724、98/250、113/225/266/415、126/314/499/549/589/755、136/440/444/478/603、136/440/444/478/583/788、136/444/478/583/788/792、225/372/534、266、306/358/703/776、358/636/737、440/444/583/724/788、440/478および466から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1080を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、8/68/95/98/358/478/595/724/792、8/68/98/221/248/250/440/477/534/595/724、8/68/788、8/93/95/98/136/221/595/600/788、8/93/95/113/250/440/595/600/724/788、8/95/98/440/478/534/600/788、8/136/248/478/788、47/75/85/105/125/129/170/635、47/75/85/105/375/756/776、47/75/85/264/267/372/415/635、47/75/85/87/129/375/776、47/75/85/87/170/372/756、47/85/105/129/201/230/267/583、47/85/125/372/583/635/756、47/85/170/756、47/85/87/105/125/635、47/85/87/154/756、47/125/129/375/756/776、47/129/170/635、47/154/372/375/583/635/708/756、68/93/95/358/440/444/478/534/595/603、68/93/95/444/788、68/93/98/136/248/250/358/440/534/724、75/85/87/105/264/267/583/708、75/85/129/154/264/375、85/125/215/375/415/635/776、85/87/105/215/267/756、85/87/129/375/756/776、87/125/129/170/230/756、87/154/306/375/756、93/95/98/534/792、95/440/444/724/788、129/215/372/756および170/264/267から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1158を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、47/68/93/98/358/440、47/68/154/372/375、47/93/98/136/154/772/776、47/93/98/154/372/375/776、47/93/98/358/583/635、47/93/129/136/154/250/372/534/635/724、47/93/129/136/375/534/583、47/93/358/372/375/440/724、47/93/358/372/375/776、47/98/129/358/372/375/438/534、47/98/129/375/534/635/724/776、47/98/372/375、47/125/154、47/129/136/372/375/534、47/129/248/250/372/375/534/724、47/136/583/776、47/358/440/724、47/358/635/776、47/372/635/776、68/93/98/129/358/375/724、68/93/154/358/372/440/776、68/129/440、68/129/583/724、68/136/724、68/154/358/375、68/154/534/635、68/375/440/534/724/776、93/98/125/154/248、93/98/125/154/250/440、93/98/129/154/248、93/98/154/250/358/375/534、93/98/154/635/776、93/98/534、93/125/154/440/534、93/129/250/358/372/375/583、93/154/248/724、93/358/534/635、98/129/375/583、98/534/583/635、129/136/154/248/250/372/375/534、129/136/375、129/154/248/250/358/375/534/635、129/358/372/635、154/250/358/375/583、154/358/375/534/776、154/534/635/724、372/375/776、375/635および534/583から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1222を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、17/357/364/434/519/684、17/357/434/519/684、17/434/684、17/684、54/97/118/307/694/727/738、68/98/129/136、68/98/129/136/154、68/98/129/136/154/534、68/98/129/154/534、68/98/129/154/635、68/98/136/154/534/635、68/98/136/154/635、68/98/154、68/98/154/534、68/98/154/534/635、68/129/136、68/129/136/154、68/129/136/154/464/635、68/129/136/534/635、68/129/154、68/129/154/765、68/136/154/534/635、68/136/534/635、68/136/635、68/154、68/154/534/635、68/154/635、97/118/442/694/727/738、98/129/136/154、98/129/136/154/635、98/129/136/534、98/129/136/635、98/129/154、98/129/154/534/635、98/129/534/635、98/136/154/635、98/136/534/635、98/136/635、98/154、98/154/534、122、129/136、129/136/154/635、129/136/534、129/136/635、129/154/534、129/154/635、129/635、132/136/154/534/635、136/154/635、136/534/635、136/603、136/635、154、154/635、157、160、161、167、253、285、381、519、550、563、564、635および785から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1392を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、17/54/97/136/329/550/684/738、17/54/97/329/524/684、17/54/161/519/727/738、17/54/524/550/727、17/161/434/524/766、17/434/524/684、17/434/738、17/442/524/550/684/721、17/727、17/738、54/97/161/434/442、54/97/434/524/550/684/727、54/136/442/550、54/434/524/738、97/136/519/550/727/738および329/550/684/727/738から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1456を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、14/137/356/745、14/570、14/570/745、26/117/365、26/164/165/213/586、71/158/222/356、71/222/236、71/319/356/606、117/158/213/332/608、117/164/707、117/213/365/517、117/311/332、117/608、122、122/160/161/167/550、122/160/161/282/381/550、122/160/161/282/381/550/636、122/160/161/282/550、122/160/161/550/636、122/160/167/282/381/550/636、122/160/282/381、122/160/282/381/550、122/160/282/550、122/160/381/550、122/160/381/550/636、122/160/550、122/160/550/636、122/161/550、122/167、122/167/550、122/282/381/550、122/282/550、122/282/550/636、122/381/706、122/550、137/319/570、157/253/519、160/161、160/161/282/381/550、160/161/282/550、160/161/550/636/735、160/167/282/381/636、160/282、160/282/381/550、160/282/550/636、160/381/550/636/681、161/282/550/636、161/381/550、165/311、167/282/636、167/550、213/365/517/707、236、253/519、253/519/563、253/519/635、253/563/635、270/322/517、270/367/452/517/613/700/750、270/452/517/700/750、270/570、282/381/550、282/550、356/570、381/550、517、517/562/750、517/640、519/563、550、550/636および562から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1582を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、63/536、117/122/270/540/681、181/536/548、181/536/548/705、181/548/705、270/681、347/532、347/536/548/705、407/570/681、407/681、536、536/548、536/548/699、536/705、548、548/580、548/705、580、681、699および705から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1764を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、13、17、18、30、37、52、57、60、71、85、87、90、98、99、118、129、164、180、183、347/434/517/562/640/681、347/434/532/562/640/681、347/434/550/562/681、347/434/681、347/517/532/681、347/532/550/640/681/699、347/536/562/681、347/550/580/681、347/550/681、347/681、365、388、389、415、433、434/517/532/681、517/681、531、532/681、535、536/580/681、539、562/681、589、606、608、707、711、727、738、748、765、769および789から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1804を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、14、15、17/52/87/118/129/388/589/738/765、17/52/87/118/129/589/738、17/52/87/118/129/589/738/765、17/52/87/118/129/589/765、17/52/87/129/388/589、17/52/87/129/388/589/738、17/52/87/129/738、17/52/87/388/589/765、17/52/87/589/738/765、17/52/118/129/265/589/765、17/52/118/129/388/589/738/765、17/52/118/129/589/738/765、17/52/118/129/738/765、17/52/118/388/589/738、17/52/118/388/589/738/765、17/52/118/388/738/765、17/52/129/388/589/738、17/52/129/388/589/738/765、17/52/129/589、17/52/129/589/738、17/52/129/589/765、17/52/129/653/738/765、17/52/129/738、17/52/129/738/765、17/52/388/589/738、17/52/388/589/738/765、17/52/589/738/765、17/52/589/765、17/87/118/388/738、17/87/129/388/738、17/118/129/388/738/765、17/129/589、17/129/589/738、17/129/589/738/765、17/129/738/765、17/388/589/738、17/589/738、17/589/765、17/738/765、18/362、20、24、26、33、33/154、46、50、52/84/129/388/738/765、52/87/118/129/388/765、52/87/118/388/589/738、52/87/118/589/738/765、52/87/129/388/738/765、52/87/129/765、52/87/589/738、52/87/738、52/118/129/589/738、52/118/129/765、52/118/388/589/738、52/118/388/738/765、52/129/589/738/765、52/129/589/765、52/129/738、52/388/738/765、52/589/738、52/589/738/765、52/738/765、54、58、59、59/72、79、81、84/129/589/738/765、87/118/129/765、87/129/388/589、92、93、97/154、104、105、130、134、154、165、175、185、212、213、218、241、256、263、316、319、349、360、362、364、390、393、434、480、498、530、534、534/739、542、589/738/765、603および652から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号1840を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、21、25/112、41、57/71/87/347/434/562/606、57/71/129/180/434/536/562、57/71/129/434/531/536/562、57/71/129/531/532/536/539/606、57/71/562/606/711/789、57/71/789、57/87/180/531/532/562/606/612/711、57/87/347/562、57/90/129/562、57/90/129/562/711、57/96/129/180/531/532/550/562、57/129/347/531/532/539/562/711/747、57/129/347/536/550/562/711/789、57/129/347/550/711、57/129/531/539/562/789、57/129/536/606/789、57/129/606、57/180/562、57/180/562/606/612、57/347/434/531/532/539/789、57/434/550/562/606/612/789、57/531/532/536/562、57/562/606/711、57/562/711、71/129/180/347/531/539/550、71/129/180/434/532/536/539/711/789、71/129/531、71/129/606、71/347/532/550/562/711、71/347/536/562/612/789、71/536/539/562、87/189/532/536/562/711/789、87/347/531/606/789、87/347/536/539/550、89、90/129/539/550/606、91、112、129/180/434/562/711/789、129/180/606/711/789、129/347/562、129/536/539/562、129/539/562/789、129/550、129/550/562、129/562/606/711、180/532、180/550/606、186、200、226、259、318、330、347/531/550/711、347/536/539/550/711/789、347/536/562/606/612、347/550/562/606、434/531/539/550/562/711、434/550、485、487、531/532/536/539/562/711/789、531/532/536/550/562/606/789、531/532/562/606/711、532/539/550、562/711、641、674、684、688、763および764から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号2064を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、25、33/47/59/81/175/530/534/550/606、33/58/59/81/130/480/530/534/550/652、33/58/59/480/530/534/550、33/58/154/480/534/550/603/606、33/59/480/530/534/550/606、33/79/81/175/530/534、33/79/81/175/530/534/603、33/79/154/480/530/534/550、33/81/130/480/530/534/550、33/81/175/530/534/542/550/652、33/130/530/534/550、33/154/480/530/534/603/606、33/154/534、33/530/534/550、42、58/59/79/175/480/534/550/652、59/154/530/534/550、70、75、77、79/81/480/530/534/550/603/606/652、81/480/530/534/550、106、130/480/530/534/550/603/606、199、265、267、380、410、561、642および758から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号2432を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、7/12、12、27、29、41、41/71、41/71/112、41/71/112/259/485/487/684/688、41/71/112/259/485/688、41/71/259/485/532、41/71/485、41/71/485/532/684、41/71/487、41/71/487/532/684、41/71/532、41/71/532/684、41/71/684、41/84/259/485/487、41/91/112/485、41/91/112/485/487/532/684、41/91/112/485/532/684、41/91/485、41/112、41/112/259/485/487、41/112/259/487/532/684、41/112/485/684、41/112/487/684、41/112/532、41/112/684/688、41/259/485、41/259/485/487、41/259/485/487/532/684、41/259/485/487/684/688、41/259/532、41/485、41/485/487、41/485/487/684/688、41/485/532、41/485/532/688、41/485/684/688、41/487/684、41/532、41/684、41/684/688、44、44/112/684/688、45、47、48、51、55、71/112/259/485/487/684、71/112/485/688、71/485/684/688、71/532、71/684/688、72、95、100、112、112/259、112/259/532/684/688、112/259/684/688、112/485/684、112/485/684/688、116、136、139、176、178、198、201、205、205/485、207、208、226/487/684/688、259/485/487/684、259/485/532、259/487/684/688、259/532、280、303、317、343、358、361、440、478、485、485/487、485/487/532、485/487/532/684、485/487/684、485/487/684/688、485/532、485/684、485/684/688、532、532/684/688、611、615、630、675、684、684/688、724、756および788から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号2510を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、8/25/55/95/208/358/440/517/788、12/45/47、12/45/47/48/51/136/142/630、12/45/47/51/136/139/630/758、12/45/47/136/139/142/675/758、12/45/51/136/139/630/675/756/758、12/45/51/630/756、12/48/51/136/139/758、12/136/139/142/756/758、12/136/142、12/630/756、25/29/208/440、25/100/154/208/440/517/705/788、25/517、29/208/361/517/788、42/198/199/480/532/539/561、42/198/532/561、42/198/532/561/724、42/199/480/532/561、42/259/480/561、42/259/480/652、42/480/561、42/480/561/724、42/561、47/51/136/756/758、55、55/410/440/603/788、55/517、55/517/788、70、70/642、77/176/487/615/642、95/603、106/199/539/561/652、116、136/139/142、154/361/440/517/603/788、176、198/199/480/561、198/199/480/561/724、198/199/561/724、198/480/561、198/480/724、199/532/539/561/652/724、259/480、267/611/642、280/440/517、380、480/561/652、480/561/652/724/764、480/724、517、532/539/561、532/561/724、603および642から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号7506を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、12/45/95/136/139/199/517/630/756、12/45/95/136/756、12/45/136/139/199/517/603、12/45/136/139/208/603/630/756、12/45/136/139/517/603/756、12/45/136/139/517/630/642/756、12/45/136/139/517/756、12/45/136/139/603/756、12/45/136/139/642/756、12/45/136/176/517/603/630/642、12/45/136/208/517/630/756、12/45/136/517/603/642/756/789、12/45/136/517/630/642/756、12/45/136/603/756、12/45/136/630/642、12/45/139/176/208/517/603/630、12/45/139/199/208/603、12/45/139/517/756、12/45/139/756、12/45/176/603/630/642/756、12/45/199/208/517/603/630/756、12/45/208/517/603/642/756、12/95/136/139/517/603/756、12/95/139/517/630/756、12/95/139/517/642、12/95/139/630/642、12/95/199/517/642、12/95/517/630/756、12/95/630/756、12/136、12/136/139/176/517/603/630、12/136/139/176/517/603/756、12/136/139/176/630/756、12/136/139/176/642、12/136/139/176/756、12/136/139/199/208/517/603/756、12/136/139/199/208/517/630/642/756、12/136/139/208/517、12/136/139/517、12/136/139/517/603/630/642/756、12/136/139/517/603/630/756、12/136/139/517/603/756、12/136/139/517/630、12/136/139/517/630/642、12/136/139/517/630/642/756、12/136/139/517/756、12/136/139/603/630、12/136/139/603/630/642、12/136/139/603/630/756、12/136/139/603/642/756、12/136/139/630、12/136/139/630/642/756、12/136/139/630/756、12/136/139/642/756、12/136/176/208/517/603/630/756、12/136/176/517/642、12/136/176/603/756、12/136/199/208/517/603/642/756、12/136/199/208/630/642、12/136/199/517/756、12/136/208、12/136/208/603/642、12/136/517/603/630/642、12/136/517/603/630/756、12/136/517/630、12/136/517/630/642、12/136/517/642、12/136/517/642/756、12/136/517/756、12/136/603/630/642/756、12/136/603/630/756、12/136/603/642、12/136/603/642/756、12/136/603/756、12/136/630、12/136/630/756、12/139/176/517/603/630/756、12/139/176/630/756、12/139/199/208/642、12/139/199/517/630/756、12/139/208/517、12/139/208/642、12/139/517/603/642/756、12/139/517/630/642/756、12/139/517/642、12/139/603/642/756、12/139/603/756、12/139/630/642、12/139/630/642/756、12/139/630/756、12/176/517/603/630、12/176/517/630/642/756、12/176/517/756、12/176/603/630/756、12/176/603/756、12/199/208/517/642、12/199/630/642/756、12/199/642/756、12/199/756、12/208/517/603/623/630/642、12/208/603/630/756、12/208/630/756、12/517/603/630/642/756、12/517/603/630/756、12/517/603/756、12/517/630/642/756、12/517/642/756、12/603/630/756、12/603/642/756、12/603/756、12/630/642/756、12/630/756、25/176/198/532/539、116/142/198/434/440、136/139/176/199/208/517/630/642、136/139/176/517/630/642/756、136/139/199/517/603/756、136/139/208/517/630/756、136/139/208/603/630/756、136/139/517/603/630/642/756、136/139/517/603/642/756、136/139/517/603/756、136/139/517/756、136/139/603、136/139/630/642/756、136/517/756、136/603/756、136/630/642、136/630/756、136/642、136/642/756、136/756、139/199/208/517/630/756、139/199/517/642、139/208/517/630/642/756、139/517/603/756、139/517/630/756、139/642/756、154/532/652/788、199/517/603/630/756、208/517/630/642/756、517/603/630/642/756、517/630/756、603/630/756および603/756から選択される1つまたは複数の位置で少なくとも1つの変異または変異の組を含み、前記位置が、配列番号8420を参照して番号付けられている、請求項61に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 請求項60〜76のいずれかに提供される少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼポリペプチドをコードする、操作されたポリヌクレオチド。
- 請求項77に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 少なくとも1つの制御配列をさらに含む、請求項78に記載のベクター。
- 請求項78に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項78または請求項79に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 真核生物および原核生物から選択される、請求項80および/または81に記載の宿主細胞。
- 請求項60〜76に提供される少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を産生するための方法であって、請求項80〜82のいずれかに記載の宿主細胞を、前記操作されたスクロースシンターゼ改変体が前記宿主細胞によって産生される条件下で培養するステップを含む、方法。
- 前記操作されたスクロースシンターゼ改変体を回収するステップをさらに含む、請求項83に記載の方法。
- 請求項60〜75のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を含む組成物。
- 基質をグリコシル化するための方法であって、少なくとも1つの基質、請求項1〜50のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、および前記基質がグリコシル化されて少なくとも1つのグリコシル化産物を産生する条件下で、前記基質に前記グリコシルトランスフェラーゼを接触させるステップを含む、方法。
- 前記基質が、少なくとも1つのステビオール配糖体を含む、請求項86に記載の方法。
- 前記グリコシル化産物が、少なくとも1つのモノグリコシル化および/またはポリグリコシル化産物を含む、請求項86に記載の方法。
- レバウジオシドMを産生するための方法であって、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、NDP−グルコース、ならびに請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドDおよびレバウジオシドI基質、NDP−グルコース、ならびに前記グリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP−グルコース、および請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドDを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP−グルコース、および請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドDが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- 前記NDP−グルコースが、ADP−グルコース、CDP−グルコース、TDP−グルコース、GDP−グルコース、および/またはIDT−グルコースから選択される、請求項86〜91のいずれかに記載の方法。
- 前記NDP−グルコースがUDP−グルコースではない、請求項86〜92のいずれかに記載の方法。
- 前記グリコシルトランスフェラーゼが、請求項48〜50のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項86〜93のいずれかに記載の方法。
- レバウジオシドMを産生するための方法であって、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、ADP−グルコース、ならびに請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、ADP−グルコース、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ADP−グルコース、および請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたADP−グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ADP−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドDを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ADP−グルコース、および請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ADP−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼをレバウジオシドDが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドMを産生するための方法であって、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドD基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドDを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、および請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドDが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドMを産生するための方法であって、少なくとも1つのステビオシドおよび/またはステビオシドとrebAの混合物を含むステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- レバウジオシドMを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、少なくとも1つのスクロースシンターゼ、および請求項1〜50に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAが最初に産生され、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドIが次に産生され、レバウジオシドMが最終的に産生される条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
- 前記スクロースシンターゼが、請求項60〜76のいずれかに提供される操作されたスクロースシンターゼである、請求項98〜102のいずれかに記載の方法。
- ワンポット反応として実施される、請求項86〜103のいずれかに記載の方法。
- 逐次的に実施される、請求項86〜104のいずれかに記載の方法。
- 前記方法のステップを繰り返すステップをさらに含む、請求項86〜104のいずれかに記載の方法。
- 前記スクロースが繰り返されるステップの間に再利用される、請求項106に記載の方法。
- 前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよび/または他の反応構成要素が再利用される、請求項106および/または101に記載の方法。
- 前記ステビオシド基質が、Stevia rebaudianaから抽出される、請求項86〜108のいずれかに記載の方法。
- 前記ステビオシド基質が合成により産生される、請求項86〜108のいずれかに記載の方法。
- 前記グリコシルトランスフェラーゼおよび/または前記スクロースシンターゼが固定される、請求項86〜110のいずれかに記載の方法。
- フルクトースを含む反応産物を産生する、請求項86〜110のいずれかに記載の方法。
- 前記フルクトースが、前記反応産物から除去される、請求項112に記載の方法。
- 洗浄ステップをさらに含む、請求項86〜113のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つのカラムクロマトグラフィーステップをさらに含む、請求項86〜114のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、請求項11〜31のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−1,2グリコシルトランスフェラーゼである、請求項86〜115のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、請求項4〜10および32〜47のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−1,3グリコシルトランスフェラーゼである、請求項86〜116のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、請求項11〜31のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−1,2グリコシルトランスフェラーゼであり、請求項4〜10および31〜47のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−1,3グリコシルトランスフェラーゼである少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項86〜117のいずれかに記載の方法。
- 請求項60〜76のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼをさらに含む、請求項86〜118に記載の方法。
- 請求項86〜119のいずれかに記載の方法に従って産生された少なくとも1つのレバウジオシド。
- 請求項120に記載のレバウジオシドを含む組成物。
- 請求項86〜89、92〜95、98、および/または101〜121のいずれかに記載の方法に従って産生されたレバウジオシドM。
- 請求項122に記載のレバウジオシドMを含む組成物。
- 請求項86〜94、96、99、および/または101〜121のいずれかに記載の方法に従って産生されたレバウジオシドA。
- 請求項124に記載のレバウジオシドAを含む組成物。
- 請求項86〜94、96、99、および/または101〜121のいずれかに記載の方法に従って産生されたレバウジオシドI。
- 請求項126に記載のレバウジオシドIを含む組成物。
- 請求項86〜94、97、および/または100〜121のいずれかに記載の方法に従って産生されたレバウジオシドD。
- 請求項128に記載のレバウジオシドDを含む組成物。
- 請求項122、124、126、および/または128に提供される少なくとも2つのレバウジオシドを含む組成物。
- 請求項123、125、127、および/または129に提供される少なくとも2つの組成物の混合物を含む組成物。
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