KR20190124723A - 조작된 글리코실트랜스퍼라제 및 스테비올 글리코시드 글루코실화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제(GT) 효소, GT 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 조작된 수크로스 신타제(SuS) 효소, SuS 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 GT 효소를 포함하는 조성물 및 조작된 GT 효소를 사용하여 β-글루코스 연결을 갖는 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 레바우디오시드(예를 들어, 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및 레바우디오시드 D)의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 SuS 효소를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. GT 및 SuS 효소를 생성하는 방법도 제공된다.
Description
본원은 2017년 2월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/454,417호 및 2017년 3월 30일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/479,262호에 기초한 우선권을 주장하고, 상기 두 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제(GT) 효소, GT 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 조작된 수크로스 신타제(SuS) 효소, SuS 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 GT 효소를 포함하는 조성물 및 조작된 GT 효소를 사용하여 β-글루코스 연결을 갖는 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 레바우디오시드(예를 들어, 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및 레바우디오시드 D)의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 SuS 효소를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. GT 및 SuS 효소를 생산하는 방법도 제공된다.
서열 목록, 표 또는 컴퓨터
프로그램에 대한 언급
서열 목록의 공식 사본은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식의 텍스트 파일로서 명세서와 동시에 제출되며, 파일 이름은 "CX8-162WO3_ST25.txt"이며, 생성 날짜는 2018년 1월 24일이고, 크기는 31,100 킬로바이트이다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
글리코실트랜스퍼라제(GT)는 번역 후에 글리코실 잔기를 활성화된 뉴클레오시드 당으로부터 단량체 및 중합체 수용체 분자(예를 들어, 다른 당, 단백질, 지질 및 다른 유기 물질)로 전달하는 효소이다. 따라서, 이들 효소는 치환된 포스페이트 이탈기를 함유하는 활성화된 공여체 당 기질을 이용한다. 공여체 당 기질(즉, "글리코실 공여체")은 일반적으로 뉴클레오시드 디포스페이트 당으로 활성화된다. 그러나, 뉴클레오시드 모노포스페이트 당, 지질 포스페이트 및 비치환된 포스페이트와 같은 다른 당도 사용된다(예를 들어, Lairson et al., Ann. Rev. Biochem, 77:25.1-25.35 [2008] 참조). GT는 기질 및 반응 생성물의 입체화학에 기초하여 유지형(retaining) 또는 전화(inverting) 효소로 분류된다. 공여체의 아노머 결합의 입체화학이 유지되는 반응(예를 들어, 알파에서 알파로)에서, GT는 유지형 효소이다. 입체화학이 전화되는 반응(예를 들어, 알파에서 베타로)에서, GT는 전화 효소이다. 이러한 글리코실화 생성물은 다양한 대사 경로 및 과정에 관여한다. 실제로, 많은 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드의 생합성은 다양한 글리코실트랜스퍼라제의 작용을 포함한다. 글루코실 모이어티의 전달은 세포 내에서 수용체의 생체 활성, 용해도 및 수송 특성을 변경할 수 있다. GT는 특이적 화합물(예를 들어, 당접합체 및 글리코시드)의 표적화된 합성뿐만 아니라, 차별적으로 글리코실화된 약물, 생물학적 프로브 또는 천연 생성물 라이브러리의 생산에 유용한 것으로 밝혀졌다. 일부 방법에서, 당접합체 합성을 위한 GT의 대규모 사용은 다량의 글리코실 공여체를 필요로 하고, 이것은 상기 방법의 비용을 증가시킨다. 뉴클레오티드 재순환 시스템은 방출된 뉴클레오티드로부터 글리코실 공여체의 재합성을 가능하게 하기 위해 개발되었다. 이들 재순환 시스템은 또한 반응 동안 형성된 뉴클레오티드 부산물의 양을 감소시켜 GT에 의해 야기되는 억제를 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, GT에 의한 당접합체의 대규모 생산에 적합한 개선된 방법이 여전히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제(GT) 효소, GT 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 조작된 수크로스 신타제(SuS) 효소, SuS 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 GT 효소를 포함하는 조성물 및 조작된 GT 효소를 사용하여 β-글루코스 연결을 갖는 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 레바우디오시드(예를 들어, 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및 레바우디오시드 D)의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 SuS 효소를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. GT 및 SuS 효소를 생성(생산)하는 방법도 제공된다.
본 발명은 서열 번호 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 91%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 93%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 94%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 베타-1,2-글리코실트랜스퍼라제 및 베타-1,3-글리코실트랜스퍼라제로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 우라실-디포스페이트 이외의 다른 당 공여체를 우선적으로 사용한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 표 2.1, 3.1, 5.1, 6.1, 6.3, 8.1, 9.1, 9.2, 9.4, 11.1, 12.1, 14.1, 15.1, 15.2, 15.3, 16.1, 17.1, 43.1, 43.2, 44.2, 45.1, 45.3, 46.1, 46.2, 46.3, 47.1, 47.2, 47.3, 48.1, 48.2, 49.1, 49.3, 50.1, 50.2, 50.3, 50.4, 51.1, 51.2, 52.1, 53.1, 53.3, 54.1, 54.2, 54.3, 55.1, 55.2, 55.3, 56.1, 56.2, 56.3, 57.1, 58.1, 58.2, 58.3, 59.1, 59.3, 59.3, 60.1, 60.2, 61.1, 61.2, 62.1, 62.2, 63.1, 63.2, 64.1, 64.2, 65.1, 65.2, 66.1, 66.2, 67.1, 67.2, 67.3, 68.1, 68.2, 69.1, 69.2, 70.1, 70.2, 71.1, 71.2, 71.3, 72.1, 72.2, 72.3, 73.1, 73.2, 74.1, 74.2, 74.3, 75.1, 75.2, 75.3, 77.1, 및/또는 77.2에 제시된 변이체 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 본 발명은 다음 서열 번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공한다: 서열 번호
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 10, 10/309, 262, 278/284/311/339/360, 283,307, 309, 339/361, 344/361, 및 361로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 여기서 상기 위치는 서열 번호 4를 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 10-/309R, 262K, 262L, 278L/284I/311G/339A/360G, 283T, 307V, 309L/N/R/S, 339A/361G, 344I/361G, 및 361G로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 여기서 상기 위치는 서열 번호 4를 기준으로 하여 넘버링된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 R10-/V309R, R262K, R262L, Y278L/T284I/R311G/V339A/N360G, S283T, L307V, V309L/N/R/S, V339A/S361G, V344I/S361G, 및 S361G로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 여기서 상기 위치는 서열 번호 4를 기준으로 하여 넘버링된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 및/또는 30 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 및/또는 30을 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 112/172/283/318, 112/261/318, 112/282/283/431, 137/283, 137/283/431, 163/318, 261/283/306/337, 261/283/337, 261/337, 269/318, 282/283, 282/283/431, 283, 283/306/308/360, 283/306/337/426, 283/318/337/360, 283/360, 318, 360, 및 431로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8을 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 112S/172S/283Q/318E, 112S/261S/318E, 112S/282T/283Q/431E, 137K/283Q, 137K/283Q/431E, 163K/318E, 261S/283Q/306V/337F, 261S/283Q/337F, 261S/337S, 269T/318E, 282T/283Q, 282T/283Q/431E, 283Q, 283Q/306V/308S/360G, 283Q/306V/337S/426V, 283Q/318E/337S/360G, 283Q/360G, 318E, 360G, 및 431E로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8을 기준으로 하여 넘버링된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 E112S/T172S/T283Q/T318E, E112S/R261S/T318E, E112S/S282T/T283Q/Q431E, N137K/T283Q, N137K/T283Q/Q431E, L163K/T318E, R261S/T283Q/L306V/W337F, R261S/T283Q/W337F, R261S/W337S, Q269T/T318E, S282T/T283Q, S282T/T283Q/Q431E, T283Q, T283Q/L306V/R308S/S360G, T283Q/L306V/W337S/A426V, T283Q/T318E/W337S/S360G, T283Q/S360G, T318E, S360G, 및 Q431E로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 여기서 위치는 서열 번호 8을 기준으로 하여 넘버링된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 및/또는 70 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 및/또는 70 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 및/또는 70을 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 4, 6, 22, 64, 74, 84, 87, 97, 106, 110, 112, 137, 139, 154, 159, 169, 179, 191, 195, 198, 199, 207, 233, 259, 261, 262, 306, 347, 356, 396, 417, 421, 427, 및 435로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 32 기준으로 하여 넘버링된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 4P, 6P, 22A/L/H/P, 64P, 74W, 84A/G, 87A/H, 97S, 106D/G/S/T, 110S, 112A/P, 137G, 139P, 154A/L/Q/V, 159M/R, 169T, 179V, 191R, 195G, 198M/S/V, 199A/D/G/K/Q/S, 207L, 233R, 259Q, 261A/H/P/W, 262G, 306V, 347D, 356G, 396R, 417A/R/P, 421V, 427A, 및 435Q/R로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 32 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 K4P, E6P, Q22A/L/H/P, F64P, R74W, L84A/G, M87A/H, A97S, L106D/G/S/T, A110S, E112A/P, N137G, R139P, H154A/L/Q/V, Q159M/R, D169T, S179V, S191R, N195G, I198M/S/V, L199A/D/G/K/Q/S, I207L, I233R, H259Q, R261A/H/P/W, T262G, L306V, G347D, S356G, Y396R, E417A/R/P, Y421V, R427A, 및 V435Q/R로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 32를 기준으로 하여 넘버링된다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 32 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 32 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 32 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 및 1290 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 및 1290 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 및 1290 중 어느 하나를 포함한다.
본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 232 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 232 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 232 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 및/또는 498 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 및/또는 498 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 및/또는 498 중 어느 하나를 포함한다.
본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 106/112/204/347/396/417, 106/112/204/347/396/417/427, 106/112/204/347/396/417/427/431, 112/204/347/396/417/427, 112/204/347/396/417/427/431, 및 204/347/396/417/431로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 348 기준으로 하여 넘버링된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 106S/112P/204D/347D/396Y/417R, 106S/112P/204D/347D/396Y/417R/427A, 106S/112P/204D/347D/396Y/417R/427A/431D, 112P/204D/347D/396Y/417R/427A, 112P/204D/347D/396Y/417R/427A/431D, 및 204D/347D/396Y/417R/431D로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 348 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R, L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A, L106S/E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R /R427A/Q431D, E112P/G204D/G347D/R396Y/E417R/R427A, E112P/G204D/G347D/ R396Y/E417R/R427A/Q431D, 및 G204D/G347D/R396Y/E417R/Q431D로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 348 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 500, 502, 504, 506, 508, 및/또는 510 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 500, 502, 504, 506, 508, 및/또는 510 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 500, 502, 504, 506, 508, 및/또는 510을 포함한다.
본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 14/100, 28/44/365/407, 38/118/290/351/375/401/422, 38/178/401, 38/290/351/401/422, 54/413, 74/102/137/161/259/289, 92/118, 98/233, 102/161/250/435, 110/222/250/259/435, 118/156/178/290/375/401/422, 137/161/435, 137/169, 159/169/173/300/424/438, 185/290/401/422, 290/351/401, 및 435/438로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 348 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 14V/100F, 28M/44V/365I/407E, 38R/118A/290E/351G/375P/401L/422M, 38R/178V/401L, 38R/290E/351G/401L/422M, 54P/413L, 74W/102K/137G/161L/259S/289S, 92L/118A, 98P/233W, 102K/161L/250A/435E, 110G/222R/250R/259P/435G, 118A/156A/178V/290E/375P/401L/422M, 137G/161L/435R, 137G/169G, 159M/169S/173G/300Q/424E/438A, 185R/290E/401L/422M, 290E/351G/401L, 및 435Q/438A로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 348 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 I14V/L100F, I28M/I44V/V365I/A407E, K38R/S118A/D290E/A351G/D375P/W401L/I422M, K38R/A178V/W401L, K38R/D290E/A351G/W401L/I422M, T54P/V413L, R74W/R102K/N137G/D161L/H259S/K289S, I92L/S118A, D98P/I233W, R102K/D161L/T250A/V435E, A110G/K222R/T250R/H259P/V435G, S118A/S156A/A178V/D290E/D375P/W401L/I422M, N137G/D161L/V435R, N137G/D169G, Q159M/D169S/R173G/D300Q/Q424E/M438A, K185R/D290E/W401L/I422M, D290E/A351G/W401L, 및 V435Q/M438A로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 348 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 222, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 및/또는 548 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 222, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 및/또는 548 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 222, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 및/또는 548 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 548 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 548 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 548 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 및 680 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 548 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 및 680 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 548 기준으로 하여 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 및 680 중 임의의 서열을 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 548 기준으로 하여 넘버링된다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 562 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 562 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 562 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 및/또는 754 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 및/또는 754 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 및/또는 754를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 22, 25, 51, 56, 71, 78, 80, 81, 88, 157, 185/208/230/252/255/290/365, 189/206/208/365, 200, 208/365/435, 243, 245, 249, 259, 262/401, 279, 282, 284, 304/322/365/401, 308, 338, 339, 352, 362, 364, 365/401/413/435, 366, 및 374로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 696 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 696 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 696 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4684, 4686, 4688, 4690, 4692, 4694, 4696, 4698, 4700, 4702, 4704, 4706, 4708, 4710, 4712, 4714, 4716, 4718, 4720, 4722, 4724, 4726, 4728, 4730, 4732, 4734, 4736, 4738, 4740, 4742, 4744, 4746, 4748, 4750, 4752, 4754, 4756, 4758, 4760, 4762, 4764, 4766, 4768, 4770, 4772, 4774, 4776, 4778, 4780, 4782, 4784, 4786, 4788, 4790, 4792, 4794, 4796, 4798, 4800, 4902, 4804, 4806, 4808, 4810, 및 4812 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4684, 4686, 4688, 4690, 4692, 4694, 4696, 4698, 4700, 4702, 4704, 4706, 4708, 4710, 4712, 4714, 4716, 4718, 4720, 4722, 4724, 4726, 4728, 4730, 4732, 4734, 4736, 4738, 4740, 4742, 4744, 4746, 4748, 4750, 4752, 4754, 4756, 4758, 4760, 4762, 4764, 4766, 4768, 4770, 4772, 4774, 4776, 4778, 4780, 4782, 4784, 4786, 4788, 4790, 4792, 4794, 4796, 4798, 4800, 4902, 4804, 4806, 4808, 4810, 및 4812 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4684, 4686, 4688, 4690, 4692, 4694, 4696, 4698, 4700, 4702, 4704, 4706, 4708, 4710, 4712, 4714, 4716, 4718, 4720, 4722, 4724, 4726, 4728, 4730, 4732, 4734, 4736, 4738, 4740, 4742, 4744, 4746, 4748, 4750, 4752, 4754, 4756, 4758, 4760, 4762, 4764, 4766, 4768, 4770, 4772, 4774, 4776, 4778, 4780, 4782, 4784, 4786, 4788, 4790, 4792, 4794, 4796, 4798, 4800, 4902, 4804, 4806, 4808, 4810, 및 4812 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4684 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4684 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4684 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4814, 4816, 4818, 4820, 4822, 4824, 4826, 4828, 4830, 4832, 4834, 4836, 4838, 4840, 4842, 4844, 4846, 4848, 4850, 4852, 4854, 4856, 4858, 4860, 4862, 4864, 4866, 4868, 4870, 4872, 및 4874 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4814, 4816, 4818, 4820, 4822, 4824, 4826, 4828, 4830, 4832, 4834, 4836, 4838, 4840, 4842, 4844, 4846, 4848, 4850, 4852, 4854, 4856, 4858, 4860, 4862, 4864, 4866, 4868, 4870, 4872, 및 4874 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4814, 4816, 4818, 4820, 4822, 4824, 4826, 4828, 4830, 4832, 4834, 4836, 4838, 4840, 4842, 4844, 4846, 4848, 4850, 4852, 4854, 4856, 4858, 4860, 4862, 4864, 4866, 4868, 4870, 4872, 및 4874 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4838기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4838 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4838 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4876, 4878, 4880, 4882, 4884, 4886, 4888, 4890, 4892, 4894, 4896, 4898, 4900, 4902, 4904, 4906, 4908, 4910, 4912, 4914, 4916, 4918, 4920, 4922, 4924, 4926, 4928, 4930, 4932, 4934, 4936, 4938, 4940, 4942, 4944, 4946, 4948, 4950, 4952, 4954, 4956, 4958, 4960, 4962, 4964, 4966, 4968, 4970, 4972, 4974, 4976, 4978, 4980, 4982, 4984, 4986, 4988, 4990, 4992, 4994, 4996, 4998, 5000, 5002, 5004, 5006, 5008, 5010, 5012, 5014, 및 5016 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4876, 4878, 4880, 4882, 4884, 4886, 4888, 4890, 4892, 4894, 4896, 4898, 4900, 4902, 4904, 4906, 4908, 4910, 4912, 4914, 4916, 4918, 4920, 4922, 4924, 4926, 4928, 4930, 4932, 4934, 4936, 4938, 4940, 4942, 4944, 4946, 4948, 4950, 4952, 4954, 4956, 4958, 4960, 4962, 4964, 4966, 4968, 4970, 4972, 4974, 4976, 4978, 4980, 4982, 4984, 4986, 4988, 4990, 4992, 4994, 4996, 4998, 5000, 5002, 5004, 5006, 5008, 5010, 5012, 5014, 및 5016 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4876, 4878, 4880, 4882, 4884, 4886, 4888, 4890, 4892, 4894, 4896, 4898, 4900, 4902, 4904, 4906, 4908, 4910, 4912, 4914, 4916, 4918, 4920, 4922, 4924, 4926, 4928, 4930, 4932, 4934, 4936, 4938, 4940, 4942, 4944, 4946, 4948, 4950, 4952, 4954, 4956, 4958, 4960, 4962, 4964, 4966, 4968, 4970, 4972, 4974, 4976, 4978, 4980, 4982, 4984, 4986, 4988, 4990, 4992, 4994, 4996, 4998, 5000, 5002, 5004, 5006, 5008, 5010, 5012, 5014, 및 5016 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4876 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4876 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4876 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5018, 5020, 5022, 5024, 5026, 5028, 5030, 5032, 5034, 5036, 5038, 5040, 5042, 5044, 5046, 5048, 5050, 5052, 5054, 5056, 5058, 5060, 5062, 5064, 5066, 5068, 5070, 5072, 5074, 5076, 5078, 5080, 5082, 5084, 5086, 5088, 5090, 5092, 5094, 5096, 5098, 5100, 5102, 5104, 5106, 5108, 5110, 5112, 5114, 5116, 5118, 5120, 5122, 5124, 5126, 5128, 5130, 5132, 5134, 5136, 5138, 5140, 5142, 5144, 5146, 5148, 5150, 5152, 5154, 5156, 5158, 5160, 5162, 5164, 5166, 5168, 5170, 5172, 5174, 5176, 5178, 5180, 5182, 5184, 5186, 5188, 5190, 5192, 5194, 5196, 5198, 5200, 5202, 5204, 5206, 5208, 5210, 5212, 5214, 5216, 5218, 5220, 5222, 5224, 5226, 5228, 5230, 5232, 5234, 5236, 5238, 5240, 5242, 5244, 5246, 5248, 5250, 5252, 5254, 5256, 5258, 및 5260 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5018, 5020, 5022, 5024, 5026, 5028, 5030, 5032, 5034, 5036, 5038, 5040, 5042, 5044, 5046, 5048, 5050, 5052, 5054, 5056, 5058, 5060, 5062, 5064, 5066, 5068, 5070, 5072, 5074, 5076, 5078, 5080, 5082, 5084, 5086, 5088, 5090, 5092, 5094, 5096, 5098, 5100, 5102, 5104, 5106, 5108, 5110, 5112, 5114, 5116, 5118, 5120, 5122, 5124, 5126, 5128, 5130, 5132, 5134, 5136, 5138, 5140, 5142, 5144, 5146, 5148, 5150, 5152, 5154, 5156, 5158, 5160, 5162, 5164, 5166, 5168, 5170, 5172, 5174, 5176, 5178, 5180, 5182, 5184, 5186, 5188, 5190, 5192, 5194, 5196, 5198, 5200, 5202, 5204, 5206, 5208, 5210, 5212, 5214, 5216, 5218, 5220, 5222, 5224, 5226, 5228, 5230, 5232, 5234, 5236, 5238, 5240, 5242, 5244, 5246, 5248, 5250, 5252, 5254, 5256, 5258, 및 5260 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5018, 5020, 5022, 5024, 5026, 5028, 5030, 5032, 5034, 5036, 5038, 5040, 5042, 5044, 5046, 5048, 5050, 5052, 5054, 5056, 5058, 5060, 5062, 5064, 5066, 5068, 5070, 5072, 5074, 5076, 5078, 5080, 5082, 5084, 5086, 5088, 5090, 5092, 5094, 5096, 5098, 5100, 5102, 5104, 5106, 5108, 5110, 5112, 5114, 5116, 5118, 5120, 5122, 5124, 5126, 5128, 5130, 5132, 5134, 5136, 5138, 5140, 5142, 5144, 5146, 5148, 5150, 5152, 5154, 5156, 5158, 5160, 5162, 5164, 5166, 5168, 5170, 5172, 5174, 5176, 5178, 5180, 5182, 5184, 5186, 5188, 5190, 5192, 5194, 5196, 5198, 5200, 5202, 5204, 5206, 5208, 5210, 5212, 5214, 5216, 5218, 5220, 5222, 5224, 5226, 5228, 5230, 5232, 5234, 5236, 5238, 5240, 5242, 5244, 5246, 5248, 5250, 5252, 5254, 5256, 5258, 및 5260 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5066 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5066 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5066 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5262, 5264, 5266, 5268, 5270, 5272, 5274, 5276, 5278, 5280, 5282, 5284, 5286, 5288, 5290, 5292, 5294, 5296, 5298, 5300, 5302, 5304, 5306, 5308, 5310, 5312, 5314, 5316, 5318, 5320, 5322, 5324, 5326, 5328, 5330, 5332, 5334, 5336, 5338, 5340, 및 5342 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5262, 5264, 5266, 5268, 5270, 5272, 5274, 5276, 5278, 5280, 5282, 5284, 5286, 5288, 5290, 5292, 5294, 5296, 5298, 5300, 5302, 5304, 5306, 5308, 5310, 5312, 5314, 5316, 5318, 5320, 5322, 5324, 5326, 5328, 5330, 5332, 5334, 5336, 5338, 5340, 및 5342 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5262, 5264, 5266, 5268, 5270, 5272, 5274, 5276, 5278, 5280, 5282, 5284, 5286, 5288, 5290, 5292, 5294, 5296, 5298, 5300, 5302, 5304, 5306, 5308, 5310, 5312, 5314, 5316, 5318, 5320, 5322, 5324, 5326, 5328, 5330, 5332, 5334, 5336, 5338, 5340, 및 5342 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5290 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5290 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5290 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5344, 5346, 5348, 5350, 5352, 5354, 5356, 5358, 5360, 5362, 5364, 5366, 5368, 5370, 5372, 5374, 5376, 5378, 5380, 5382, 5384, 5386, 5388, 5390, 5392, 5394, 5396, 5398, 5400, 5402, 5404, 5406, 5408, 5410, 5412, 5414, 5416, 5418, 5420, 5422, 5424, 5426, 5428, 5430, 5432, 5434, 5436, 5438, 5440, 5442, 5444, 5446, 5448, 5450, 5452, 5454, 5456, 5458, 5460, 5462, 5464, 5466, 5468, 5470, 5472, 5474, 5476, 5478, 5480, 5482, 5484, 5486, 5488, 5490, 5492, 5494, 5496, 5498, 5500, 5502, 5504, 5506, 5508, 5510, 5512, 5514, 5516, 5518, 5520, 5522, 5524, 5526, 5528, 5530, 5532, 5534, 5536, 5538, 5540, 및 5542 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5344, 5346, 5348, 5350, 5352, 5354, 5356, 5358, 5360, 5362, 5364, 5366, 5368, 5370, 5372, 5374, 5376, 5378, 5380, 5382, 5384, 5386, 5388, 5390, 5392, 5394, 5396, 5398, 5400, 5402, 5404, 5406, 5408, 5410, 5412, 5414, 5416, 5418, 5420, 5422, 5424, 5426, 5428, 5430, 5432, 5434, 5436, 5438, 5440, 5442, 5444, 5446, 5448, 5450, 5452, 5454, 5456, 5458, 5460, 5462, 5464, 5466, 5468, 5470, 5472, 5474, 5476, 5478, 5480, 5482, 5484, 5486, 5488, 5490, 5492, 5494, 5496, 5498, 5500, 5502, 5504, 5506, 5508, 5510, 5512, 5514, 5516, 5518, 5520, 5522, 5524, 5526, 5528, 5530, 5532, 5534, 5536, 5538, 5540, 및 5542 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5344, 5346, 5348, 5350, 5352, 5354, 5356, 5358, 5360, 5362, 5364, 5366, 5368, 5370, 5372, 5374, 5376, 5378, 5380, 5382, 5384, 5386, 5388, 5390, 5392, 5394, 5396, 5398, 5400, 5402, 5404, 5406, 5408, 5410, 5412, 5414, 5416, 5418, 5420, 5422, 5424, 5426, 5428, 5430, 5432, 5434, 5436, 5438, 5440, 5442, 5444, 5446, 5448, 5450, 5452, 5454, 5456, 5458, 5460, 5462, 5464, 5466, 5468, 5470, 5472, 5474, 5476, 5478, 5480, 5482, 5484, 5486, 5488, 5490, 5492, 5494, 5496, 5498, 5500, 5502, 5504, 5506, 5508, 5510, 5512, 5514, 5516, 5518, 5520, 5522, 5524, 5526, 5528, 5530, 5532, 5534, 5536, 5538, 5540, 및 5542 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5372 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5372 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5372 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5544, 5546, 5548, 5550, 5552, 5554, 5556, 5558, 5560, 5562, 5564, 5566, 5568, 5570, 5572, 5574, 5576, 5578, 5580, 5582, 5584, 5586, 5588, 5590, 5592, 5594, 5596, 5598, 5600, 5602, 5604, 5606, 5608, 5610, 5612, 5614, 5616, 5618, 5620, 5622, 5624, 5626, 5628, 5630, 5632, 5634, 5636, 5638, 5640, 5642, 5644, 5646, 5648, 5650, 5652, 5654, 5656, 5658, 5660, 5662, 5664, 5666, 5668, 5670, 5672, 5674, 5676, 5678, 5680, 5682, 5684, 5686, 5688, 및 5690 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5544, 5546, 5548, 5550, 5552, 5554, 5556, 5558, 5560, 5562, 5564, 5566, 5568, 5570, 5572, 5574, 5576, 5578, 5580, 5582, 5584, 5586, 5588, 5590, 5592, 5594, 5596, 5598, 5600, 5602, 5604, 5606, 5608, 5610, 5612, 5614, 5616, 5618, 5620, 5622, 5624, 5626, 5628, 5630, 5632, 5634, 5636, 5638, 5640, 5642, 5644, 5646, 5648, 5650, 5652, 5654, 5656, 5658, 5660, 5662, 5664, 5666, 5668, 5670, 5672, 5674, 5676, 5678, 5680, 5682, 5684, 5686, 5688, 및 5690 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5544, 5546, 5548, 5550, 5552, 5554, 5556, 5558, 5560, 5562, 5564, 5566, 5568, 5570, 5572, 5574, 5576, 5578, 5580, 5582, 5584, 5586, 5588, 5590, 5592, 5594, 5596, 5598, 5600, 5602, 5604, 5606, 5608, 5610, 5612, 5614, 5616, 5618, 5620, 5622, 5624, 5626, 5628, 5630, 5632, 5634, 5636, 5638, 5640, 5642, 5644, 5646, 5648, 5650, 5652, 5654, 5656, 5658, 5660, 5662, 5664, 5666, 5668, 5670, 5672, 5674, 5676, 5678, 5680, 5682, 5684, 5686, 5688, 및 5690 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5562 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5562 기준으로 하여 넘버링된다:
추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5562 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 14, 55, 56, 255, 282, 308, 336, 342, 364, 391, 407, 및 422로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5562 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 14I, 55V, 56A, 255L, 282S, 308L, 308Q, 336Q, 342W, 364A, 364S, 391C, 407C, 407V, 및 422Q로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5562 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 V14I, S55V, L56A, S255L, T282S, R308L, R308Q, K336Q, E342W, G364A, G364S, L391C, E407C, E407V, 및 M422Q로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5562 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5692, 5694, 5696, 5698, 5700, 5702, 5704, 5706, 5708, 5710, 5712, 5714, 5716, 5718, 5720, 5722, 5724, 5726, 5728, 5730, 5732, 5734, 5736, 5738, 5740, 5742, 5744, 5746, 5748, 5750, 5752, 5754, 5756, 5758, 5760, 5762, 5764, 5766, 5768, 5770, 5772, 5774, 5776, 5778, 5780, 5782, 5784, 5786, 5788, 5790, 5792, 5794, 5796, 5798, 5800, 5802, 5804, 5806, 5808, 5810, 5812, 및 5814 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5692, 5694, 5696, 5698, 5700, 5702, 5704, 5706, 5708, 5710, 5712, 5714, 5716, 5718, 5720, 5722, 5724, 5726, 5728, 5730, 5732, 5734, 5736, 5738, 5740, 5742, 5744, 5746, 5748, 5750, 5752, 5754, 5756, 5758, 5760, 5762, 5764, 5766, 5768, 5770, 5772, 5774, 5776, 5778, 5780, 5782, 5784, 5786, 5788, 5790, 5792, 5794, 5796, 5798, 5800, 5802, 5804, 5806, 5808, 5810, 5812, 및 5814 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5692, 5694, 5696, 5698, 5700, 5702, 5704, 5706, 5708, 5710, 5712, 5714, 5716, 5718, 5720, 5722, 5724, 5726, 5728, 5730, 5732, 5734, 5736, 5738, 5740, 5742, 5744, 5746, 5748, 5750, 5752, 5754, 5756, 5758, 5760, 5762, 5764, 5766, 5768, 5770, 5772, 5774, 5776, 5778, 5780, 5782, 5784, 5786, 5788, 5790, 5792, 5794, 5796, 5798, 5800, 5802, 5804, 5806, 5808, 5810, 5812, 및 5814 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5708 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5708 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5708 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5816, 5818, 5820, 5822, 5824, 5826, 5828, 5830, 5832, 5834, 5836, 5838, 5840, 5842, 5844, 5846, 5848, 5850, 5852, 5854, 5856, 5858, 5860, 5862, 5864, 5866, 5868, 5870, 5872, 5874, 5876, 5878, 5880, 5882, 5884, 5886, 5888, 5890, 5892, 5894, 5896, 5898, 5900, 5902, 5904, 5906, 5908, 5910, 5912, 5914, 5916, 5918, 5920, 5922, 5924, 5926, 5928, 5930, 5932, 5934, 5936, 5938, 5940, 5942, 5944, 5946, 5948, 5950, 5952, 5954, 5956, 5958, 5960, 5962, 5964, 5966, 5968, 5970, 5972, 5974, 5976, 5978, 5980, 5982, 5984, 5986, 5988, 5990, 5992, 5994, 5996, 5998, 6000, 6002, 6004, 6006, 6008, 6010, 6012, 및 6014 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5816, 5818, 5820, 5822, 5824, 5826, 5828, 5830, 5832, 5834, 5836, 5838, 5840, 5842, 5844, 5846, 5848, 5850, 5852, 5854, 5856, 5858, 5860, 5862, 5864, 5866, 5868, 5870, 5872, 5874, 5876, 5878, 5880, 5882, 5884, 5886, 5888, 5890, 5892, 5894, 5896, 5898, 5900, 5902, 5904, 5906, 5908, 5910, 5912, 5914, 5916, 5918, 5920, 5922, 5924, 5926, 5928, 5930, 5932, 5934, 5936, 5938, 5940, 5942, 5944, 5946, 5948, 5950, 5952, 5954, 5956, 5958, 5960, 5962, 5964, 5966, 5968, 5970, 5972, 5974, 5976, 5978, 5980, 5982, 5984, 5986, 5988, 5990, 5992, 5994, 5996, 5998, 6000, 6002, 6004, 6006, 6008, 6010, 6012, 및 6014 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5816, 5818, 5820, 5822, 5824, 5826, 5828, 5830, 5832, 5834, 5836, 5838, 5840, 5842, 5844, 5846, 5848, 5850, 5852, 5854, 5856, 5858, 5860, 5862, 5864, 5866, 5868, 5870, 5872, 5874, 5876, 5878, 5880, 5882, 5884, 5886, 5888, 5890, 5892, 5894, 5896, 5898, 5900, 5902, 5904, 5906, 5908, 5910, 5912, 5914, 5916, 5918, 5920, 5922, 5924, 5926, 5928, 5930, 5932, 5934, 5936, 5938, 5940, 5942, 5944, 5946, 5948, 5950, 5952, 5954, 5956, 5958, 5960, 5962, 5964, 5966, 5968, 5970, 5972, 5974, 5976, 5978, 5980, 5982, 5984, 5986, 5988, 5990, 5992, 5994, 5996, 5998, 6000, 6002, 6004, 6006, 6008, 6010, 6012, 및 6014 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5976 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5976 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5976 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6016, 6018, 6020, 6022, 6024, 6026, 6028, 6030, 6032, 6034, 6036, 6038, 6040, 6042, 6044, 6046, 6048, 6050, 6052, 6054, 6056, 6058, 6060, 6062, 6064, 6066, 6068, 6070, 6072, 6074, 6076, 6078, 6080, 6082, 6084, 6086, 6088, 6090, 6092, 6094, 6096, 6098, 6100, 6102, 6104, 6106, 6108, 6110, 6112, 6114, 6116, 6118, 6120, 6122, 6124, 6126, 6128, 6130, 6132, 6134, 6136, 6138, 6140, 6142, 6144, 6146, 6148, 6150, 6152, 6154, 6156, 6158, 6160, 6162, 6164, 6166, 6168, 6170, 6172, 6174, 6176, 6178, 6180, 6182, 6184, 6186, 6188, 6190, 6192, 6194, 6196, 6198, 6200, 6202, 6204, 6206, 6208, 6210, 6212, 6214, 6216, 6218, 6220, 6222, 6224, 6226, 6228, 6230, 6232, 6234, 6236, 6238, 6240, 6242, 6244, 6246, 6248, 6250, 6252, 6254, 6256, 6258, 및 6260 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6016, 6018, 6020, 6022, 6024, 6026, 6028, 6030, 6032, 6034, 6036, 6038, 6040, 6042, 6044, 6046, 6048, 6050, 6052, 6054, 6056, 6058, 6060, 6062, 6064, 6066, 6068, 6070, 6072, 6074, 6076, 6078, 6080, 6082, 6084, 6086, 6088, 6090, 6092, 6094, 6096, 6098, 6100, 6102, 6104, 6106, 6108, 6110, 6112, 6114, 6116, 6118, 6120, 6122, 6124, 6126, 6128, 6130, 6132, 6134, 6136, 6138, 6140, 6142, 6144, 6146, 6148, 6150, 6152, 6154, 6156, 6158, 6160, 6162, 6164, 6166, 6168, 6170, 6172, 6174, 6176, 6178, 6180, 6182, 6184, 6186, 6188, 6190, 6192, 6194, 6196, 6198, 6200, 6202, 6204, 6206, 6208, 6210, 6212, 6214, 6216, 6218, 6220, 6222, 6224, 6226, 6228, 6230, 6232, 6234, 6236, 6238, 6240, 6242, 6244, 6246, 6248, 6250, 6252, 6254, 6256, 6258, 및 6260 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6138 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6138 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6138 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6262, 6264, 6266, 6268, 6270, 6272, 6274, 6276, 6278, 6280, 6282, 6284, 6286, 6288, 6290, 6292, 6294, 6296, 6298, 6300, 6302, 6304, 6306, 6308, 6310, 6312, 6314, 6316, 6318, 6320, 6322, 6324, 6326, 6328, 6330, 6332, 6334, 6336, 6338, 6340, 6342, 6344, 6346, 6348, 6350, 6352, 6354, 6356, 6358, 6360, 6362, 6364, 6366, 6368, 6370, 6372, 6374, 6376, 6378, 6380, 6382, 6384, 6386, 6388, 6390, 6392, 6394, 6396, 6398, 6400, 6402, 6404, 6406, 6408, 6410, 6412, 6414, 6416, 6418, 6420, 6422, 6424, 6426, 6428, 6430, 6432, 6434, 6436, 6438, 6440, 6442, 6444, 6446, 6448, 6450, 6452, 6454, 6456, 6458, 및 6460 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6262, 6264, 6266, 6268, 6270, 6272, 6274, 6276, 6278, 6280, 6282, 6284, 6286, 6288, 6290, 6292, 6294, 6296, 6298, 6300, 6302, 6304, 6306, 6308, 6310, 6312, 6314, 6316, 6318, 6320, 6322, 6324, 6326, 6328, 6330, 6332, 6334, 6336, 6338, 6340, 6342, 6344, 6346, 6348, 6350, 6352, 6354, 6356, 6358, 6360, 6362, 6364, 6366, 6368, 6370, 6372, 6374, 6376, 6378, 6380, 6382, 6384, 6386, 6388, 6390, 6392, 6394, 6396, 6398, 6400, 6402, 6404, 6406, 6408, 6410, 6412, 6414, 6416, 6418, 6420, 6422, 6424, 6426, 6428, 6430, 6432, 6434, 6436, 6438, 6440, 6442, 6444, 6446, 6448, 6450, 6452, 6454, 6456, 6458, 및 6460 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6262, 6264, 6266, 6268, 6270, 6272, 6274, 6276, 6278, 6280, 6282, 6284, 6286, 6288, 6290, 6292, 6294, 6296, 6298, 6300, 6302, 6304, 6306, 6308, 6310, 6312, 6314, 6316, 6318, 6320, 6322, 6324, 6326, 6328, 6330, 6332, 6334, 6336, 6338, 6340, 6342, 6344, 6346, 6348, 6350, 6352, 6354, 6356, 6358, 6360, 6362, 6364, 6366, 6368, 6370, 6372, 6374, 6376, 6378, 6380, 6382, 6384, 6386, 6388, 6390, 6392, 6394, 6396, 6398, 6400, 6402, 6404, 6406, 6408, 6410, 6412, 6414, 6416, 6418, 6420, 6422, 6424, 6426, 6428, 6430, 6432, 6434, 6436, 6438, 6440, 6442, 6444, 6446, 6448, 6450, 6452, 6454, 6456, 6458, 및 6460 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6288 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6288 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6288 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 5/449, 6, 10, 25, 25/449, 69, 69/449, 87, 87/449, 91, 91/449, 144/449, 153, 153/449, 159, 159/449, 172, 172/449, 212/449, 233, 233/449, 288/449, 303, 317, 347/449, 361, 369, 및 421로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6288 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6288 기준으로 하여 넘버링된다: 5S/449R, 6P, 10K, 25I/449R, 25M/449R, 25Q/449R, 25S, 69A, 69M/449R, 87A/449R, 87E, 87K, 87Q, 87R, 91L, 91N/449R, 91Q, 91T/449R, 91V, 144Q/449R, 153T/449R, 153V, 159K, 159R/449R, 172S, 172T/449R, 212L/449R, 233A, 233C, 233G, 233L/449R, 233M/449R, 233Q/449R, 233R, 233S, 233V, 288P/449R, 303C, 303V, 317Y, 347P/449R, 361C, 369K, 및 421I. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6288 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6462, 6464, 6466, 6468, 6470, 6472, 6474, 6476, 6478, 6480, 6482, 6484, 6486, 6488, 6490, 6492, 6494, 6496, 6498, 6500, 6502, 6504, 6506, 6508, 6510, 6512, 6514, 6516, 6518, 6520, 6522, 6524, 6526, 6528, 6530, 6532, 6534, 6536, 6538, 6540, 6542, 6544, 6546, 6548, 6550, 6552, 6554, 6556, 6558, 6560, 6562, 6564, 6566, 6568, 6570, 6572, 6574, 6576, 6578, 6580, 6582, 6584, 6586, 6588, 6590, 6592, 6594, 6596, 6598, 6600, 6602, 6604, 6606, 6608, 6610, 6612, 6614, 6616, 6618, 6620, 6622, 6624, 6626, 6628, 6630, 6632, 6634, 6636, 6638, 6640, 6642, 6644, 6646, 6648, 6650, 6652, 6654, 6656, 6658, 6660, 6662, 6664, 6666, 6668, 6670, 6672, 6674, 및 6676 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6462, 6464, 6466, 6468, 6470, 6472, 6474, 6476, 6478, 6480, 6482, 6484, 6486, 6488, 6490, 6492, 6494, 6496, 6498, 6500, 6502, 6504, 6506, 6508, 6510, 6512, 6514, 6516, 6518, 6520, 6522, 6524, 6526, 6528, 6530, 6532, 6534, 6536, 6538, 6540, 6542, 6544, 6546, 6548, 6550, 6552, 6554, 6556, 6558, 6560, 6562, 6564, 6566, 6568, 6570, 6572, 6574, 6576, 6578, 6580, 6582, 6584, 6586, 6588, 6590, 6592, 6594, 6596, 6598, 6600, 6602, 6604, 6606, 6608, 6610, 6612, 6614, 6616, 6618, 6620, 6622, 6624, 6626, 6628, 6630, 6632, 6634, 6636, 6638, 6640, 6642, 6644, 6646, 6648, 6650, 6652, 6654, 6656, 6658, 6660, 6662, 6664, 6666, 6668, 6670, 6672, 6674, 및 6676 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6462, 6464, 6466, 6468, 6470, 6472, 6474, 6476, 6478, 6480, 6482, 6484, 6486, 6488, 6490, 6492, 6494, 6496, 6498, 6500, 6502, 6504, 6506, 6508, 6510, 6512, 6514, 6516, 6518, 6520, 6522, 6524, 6526, 6528, 6530, 6532, 6534, 6536, 6538, 6540, 6542, 6544, 6546, 6548, 6550, 6552, 6554, 6556, 6558, 6560, 6562, 6564, 6566, 6568, 6570, 6572, 6574, 6576, 6578, 6580, 6582, 6584, 6586, 6588, 6590, 6592, 6594, 6596, 6598, 6600, 6602, 6604, 6606, 6608, 6610, 6612, 6614, 6616, 6618, 6620, 6622, 6624, 6626, 6628, 6630, 6632, 6634, 6636, 6638, 6640, 6642, 6644, 6646, 6648, 6650, 6652, 6654, 6656, 6658, 6660, 6662, 6664, 6666, 6668, 6670, 6672, 6674, 및 6676 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6468 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6468 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6468 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 2, 3, 4, 9, 53/437, 61, 64, 72/170, 72/405, 94, 96, 98, 113, 118, 118/120, 120, 129, 134/158, 158, 165, 170, 171, 173, 183, 193, 214, 214/222, 222, 226, 229, 234, 253, 265, 269, 272, 289, 296, 300, 302, 304, 322, 322/407, 330, 390, 395/439, 396, 398, 399, 403, 405, 408, 411, 412, 423, 428, 434, 435, 438, 439, 442, 444, 448, 449, 452, 및 454로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6468 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6468 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6468 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6864 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6864 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6864 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 7362, 7364, 7366, 7368, 7370, 7372, 7374, 7376, 7378, 7380, 7382, 7384, 7386, 7388, 7390, 7392, 7394, 7396, 7398, 7400, 7402, 7404, 7406, 7408, 7410, 7412, 7414, 7416, 7418, 7420, 7422, 7424, 7426, 7428, 7430, 7432, 7434, 및 7436 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6864 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 7362, 7364, 7366, 7368, 7370, 7372, 7374, 7376, 7378, 7380, 7382, 7384, 7386, 7388, 7390, 7392, 7394, 7396, 7398, 7400, 7402, 7404, 7406, 7408, 7410, 7412, 7414, 7416, 7418, 7420, 7422, 7424, 7426, 7428, 7430, 7432, 7434, 및 7436 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 7362, 7364, 7366, 7368, 7370, 7372, 7374, 7376, 7378, 7380, 7382, 7384, 7386, 7388, 7390, 7392, 7394, 7396, 7398, 7400, 7402, 7404, 7406, 7408, 7410, 7412, 7414, 7416, 7418, 7420, 7422, 7424, 7426, 7428, 7430, 7432, 7434, 및 7436 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7388 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7388 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7388 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 41, 56, 61, 72, 76, 87, 88, 107, 139, 156, 338, 및 407로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7388 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 41E, 56D, 61D, 61E, 72P, 76S, 87E, 88L, 88M, 107L, 107V, 139N, 156S, 338V, 및 407T로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7388 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 A41E, L56D, S61D, S61E, T72P, R76S, M87E, R88L, R88M, A107L, A107V, K139N, C156S, C338V, 및 V407T로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7388 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8088 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8088 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8088 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 55, 111, 252, 255, 324, 328, 413, 및 451로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 80888 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 55G, 111T, 252P, 255T, 324D, 324G, 328T, 413L, 및 451Q로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 80888 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 S55G, S111T, S252P, S255T, P324D, P324G, L328T, V413L, 및 V451Q로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8088 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및/또는 108 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및/또는 108 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및/또는 108을 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 69/173/175/243/246/354/365/383/399, 69/173/243/383/399, 56/191/354/383/399, 70/225/246/409/413, 70/115/225/409, 70/225/413, 70/225/247, 74/310/396/424, 74/396, 및 173/175/191/365/383/399로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 758 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 69H/173N/175S/243A/246K/354I/365I/383V/399A, 69H/173N/243A/383V/399A, 56T/191D/354I/383V/399A, 70L/225G/246P/409K/413V, 70L/115S/225G/409K, 70L/225G/413V, 70L/225G/247G, 74T/310D/396E/424S, 74T/396E, 및 173H/175S/191D/365I/383V/399A로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 758 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 758 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 및/또는 788 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 및/또는 788 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 및/또는 788 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 1292, 및/또는 1294 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 1292, 및/또는 1294 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 1292, 및/또는 1294 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 24, 28, 32, 264, 269, 325, 341, 351, 및 366으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 24L/V, 28G/K/L, 32C/R/S, 264A/G, 269S/W, 325G/H, 341V, 351L, 및 366L/Q/T로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 Y24L/V, S28G/K/L, N32C/R/S, C264A/G, Y269S/W, K325G/H, F341V, M351L, 및 H366L/Q/T로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 및/또는 846 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 및/또는 846 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 및/또는 846 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 및/또는 952 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 및/또는 952 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 및/또는 952 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 792 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 792 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 792 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 994, 996, 998, 및/또는 1000 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 994, 996, 998, 및/또는 1000 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 994, 996, 998, 및/또는 1000 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 954 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 954 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 954 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 및/또는 1078 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 및/또는 1078 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 및/또는 1078 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1054 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1054 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1054 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2596, 2598, 2600, 2602, 2604, 2606, 2608, 2610, 2612, 2614, 2616, 2618, 2620, 2622, 2624, 2626, 2628, 2630, 2632, 2634, 2636, 2638, 2640, 2642, 2644, 및 2646 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2596, 2598, 2600, 2602, 2604, 2606, 2608, 2610, 2612, 2614, 2616, 2618, 2620, 2622, 2624, 2626, 2628, 2630, 2632, 2634, 2636, 2638, 2640, 2642, 2644, 및 2646 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2596, 2598, 2600, 2602, 2604, 2606, 2608, 2610, 2612, 2614, 2616, 2618, 2620, 2622, 2624, 2626, 2628, 2630, 2632, 2634, 2636, 2638, 2640, 2642, 2644, 및 2646 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1002 기준으로 하여 넘버링된다: 21/127/129/161, 21/127/129/161/162, 21/127/129/162/199/200, 127/129/161/162/199, 127/129/161/199/200, 127/129/162, 156, 156/161, 156/161/162, 156/162/199, 및 156/199/200.
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1002 기준으로 하여 넘버링된다:
21Y/127H/129A/161S, 21Y/127H/129A/161S/162G, 21Y/127H/129A/162T/199H/200A, 127H/129A/162T, 127Q/129A/161S/162G/199H, 127Q/129A/161S/199H/200A, 156R, 156R/161S, 156R/161S/162G, 156R/161S/162T, 156R/162G/199H, 및 156R/199H/200A.
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1002 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2648, 2650, 2652, 2654, 2656, 2658, 2660, 2662, 2664, 2666, 2668, 2670, 2672, 2674, 2676, 2678, 2680, 2682, 및 2684 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2648, 2650, 2652, 2654, 2656, 2658, 2660, 2662, 2664, 2666, 2668, 2670, 2672, 2674, 2676, 2678, 2680, 2682, 및 2684 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2648, 2650, 2652, 2654, 2656, 2658, 2660, 2662, 2664, 2666, 2668, 2670, 2672, 2674, 2676, 2678, 2680, 2682, 및 2684 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2600 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2600 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2600 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 32, 135, 148, 152, 186, 237, 239, 240, 323, 325, 326, 327, 330, 331, 및 356으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2600 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 32R, 135A, 148A, 152V, 186V, 237T, 239E, 239F, 239Y, 240A, 240P, 323L, 325G, 325R, 326M, 327V, 330A, 331C, 331H, 331S, 및 356G로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2600 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 N32R, V135A, S148A, L152V, F186V, D237T, I239E, I239F, I239Y, T240A, T240P, V323L, H325G, H325R, F326M, A327V, P330A, R331C, R331H, R331S, 및 F356G로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2600 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2686, 2688, 2690, 2692, 2694, 2696, 2698, 2700, 2702, 2704, 2706, 2708, 2710, 2712, 2714, 2716, 2718, 2720, 2722, 2724, 2726, 2728, 2730, 2732, 2734, 2736, 2738, 2740, 2742, 2744, 2746, 2748, 2750, 2752, 2754, 2756, 2758, 2760, 2762, 2764, 2766, 2768, 2770, 2772, 및 2774 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2686, 2688, 2690, 2692, 2694, 2696, 2698, 2700, 2702, 2704, 2706, 2708, 2710, 2712, 2714, 2716, 2718, 2720, 2722, 2724, 2726, 2728, 2730, 2732, 2734, 2736, 2738, 2740, 2742, 2744, 2746, 2748, 2750, 2752, 2754, 2756, 2758, 2760, 2762, 2764, 2766, 2768, 2770, 2772, 및 2774 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2686, 2688, 2690, 2692, 2694, 2696, 2698, 2700, 2702, 2704, 2706, 2708, 2710, 2712, 2714, 2716, 2718, 2720, 2722, 2724, 2726, 2728, 2730, 2732, 2734, 2736, 2738, 2740, 2742, 2744, 2746, 2748, 2750, 2752, 2754, 2756, 2758, 2760, 2762, 2764, 2766, 2768, 2770, 2772, 및 2774 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2718 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2718 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2718 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 11, 45, 55, 56, 58, 65, 104, 113, 114, 132, 135, 138, 165, 238, 256, 273, 286, 309, 391, 422, 430, 및 449로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2718 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 11G, 11Q, 45F, 45V, 55L, 56T, 58R, 65N, 65S, 104L, 113V, 114R, 132Q, 132S, 135L, 138G, 138K, 165P, 238G, 256P, 273R, 286R, 309E, 309H, 391R, 422R, 430L, 430V, 및 449F로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2718 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 S11G, S11Q, L45F, L45V, I55L, I56T, K58R, E65N, E65S, M104L, L113V, Q114R, H132Q, H132S, N135L, N138G, N138K, E165P, I238G, E256P, E273R, N286R, K309E, K309H, N391R, K422R, E430L, E430V, 및 Y449F로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2718 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2776, 2778, 2780, 2782, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, 2836, 2838, 2840, 2842, 2844, 2846, 2848, 2850, 2852, 2854, 2856, 2858, 2860, 2862, 2864, 2866, 2868, 2870, 2872, 2874, 2876, 2878, 2880, 및 2882 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2776, 2778, 2780, 2782, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, 2836, 2838, 2840, 2842, 2844, 2846, 2848, 2850, 2852, 2854, 2856, 2858, 2860, 2862, 2864, 2866, 2868, 2870, 2872, 2874, 2876, 2878, 2880, 및 2882 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2776, 2778, 2780, 2782, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, 2836, 2838, 2840, 2842, 2844, 2846, 2848, 2850, 2852, 2854, 2856, 2858, 2860, 2862, 2864, 2866, 2868, 2870, 2872, 2874, 2876, 2878, 2880, 및 2882 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2814 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2814 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2814 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 122, 164, 176, 177, 316, 325, 400, 425, 426, 427, 440, 및 446으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2814 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 122L, 164H, 164M, 164R, 176K, 176L, 176N, 176R, 177A, 316R, 325L, 400V, 425R, 426A, 426R, 427R, 440R, 및 446R로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2814 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 I122L, V164H, V164M, V164R, V176K, V176L, V176N, V176R, E177A, G316R, M325L, T400V, K425R, S426A, S426R, I427R, I440R, 및 S446R로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2814 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2884, 2886, 2888, 2890, 2892, 2894, 2896, 2898, 2900, 2902, 2904, 2906, 2908, 2910, 2912, 2914, 2916, 2918, 2920, 2922, 2924, 2926, 2928, 2830, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 및 2950 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2884, 2886, 2888, 2890, 2892, 2894, 2896, 2898, 2900, 2902, 2904, 2906, 2908, 2910, 2912, 2914, 2916, 2918, 2920, 2922, 2924, 2926, 2928, 2830, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 및 2950 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2884, 2886, 2888, 2890, 2892, 2894, 2896, 2898, 2900, 2902, 2904, 2906, 2908, 2910, 2912, 2914, 2916, 2918, 2920, 2922, 2924, 2926, 2928, 2830, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 및 2950 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2884 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2884 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2884 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 및 3016 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 및 3016 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 및 3016 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3016 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3016 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3016 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 9, 65, 106, 115, 116, 172, 178, 200, 210, 213, 240, 242, 245, 255, 324/423, 385, 408, 409, 411, 412, 415, 416, 423, 및 447로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3016 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3016 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3016 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2, 3, 8, 34, 72, 73, 75, 113, 114, 186, 189, 221, 235, 237, 239, 256, 286, 299, 305, 309, 312, 313, 323, 355, 389, 406, 422, 438, 및 446으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3244 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3244 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3244 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 14, 35, 42, 46, 49, 105, 134, 143, 179, 181, 232, 278, 290, 336, 373, 381, 401, 및 441로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3244 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 14K, 35D, 42F, 42I, 42V, 46T, 46V, 49A, 49M, 49P, 49Q, 49S, 105A, 134A, 134C, 134S, 143P, 179A, 179D, 179T, 181L, 232T, 278I, 278L, 290L, 336A, 373R, 381G, 401V, 441I, 및 441R로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3244 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 R14K, Q35D, L42F, L42I, L42V, C46T, C46V, L49A, L49M, L49P, L49Q, L49S, S105A, V134A, V134C, V134S, K143P, V179A, V179D, V179T, M181L, P232T, V278I, V278L, I290L, S336A, K373R, A381G, L401V, Q441I, 및 Q441R로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3244 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 21, 91, 125, 127, 130/187, 143, 143/150, 145, 152, 156, 186, 187, 195, 197, 200, 201, 202, 264, 268, 364, 365, 및 415로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3346 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3346 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3346 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 3760, 3762, 3764, 3766, 3768, 3770, 3772, 3774, 3776, 3778, 3780, 3782, 3784, 3786, 3788, 3790, 3792, 3794, 3796, 3798, 3800, 3802, 3804, 3806, 3808, 3810, 3812, 3814, 3816, 3818, 3820, 3822, 3824, 3826, 3828, 3830, 3832, 3834, 3836, 3838, 3840, 3842, 3844, 3846, 3848, 및 3850 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 3760, 3762, 3764, 3766, 3768, 3770, 3772, 3774, 3776, 3778, 3780, 3782, 3784, 3786, 3788, 3790, 3792, 3794, 3796, 3798, 3800, 3802, 3804, 3806, 3808, 3810, 3812, 3814, 3816, 3818, 3820, 3822, 3824, 3826, 3828, 3830, 3832, 3834, 3836, 3838, 3840, 3842, 3844, 3846, 3848, 및 3850 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 3760, 3762, 3764, 3766, 3768, 3770, 3772, 3774, 3776, 3778, 3780, 3782, 3784, 3786, 3788, 3790, 3792, 3794, 3796, 3798, 3800, 3802, 3804, 3806, 3808, 3810, 3812, 3814, 3816, 3818, 3820, 3822, 3824, 3826, 3828, 3830, 3832, 3834, 3836, 3838, 3840, 3842, 3844, 3846, 3848, 및 3850 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3502 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3502 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3502 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 96, 127, 132, 144, 153, 155, 156, 186, 187, 196, 199, 및 200으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3502 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 96A, 96P, 127I, 127L, 127V, 132H, 132K, 132T, 144V, 153A, 153G, 155M, 156W, 186A, 186G, 186R, 187A, 187R, 187T, 196S, 199A, 199S, 199Y, 및 200S로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3502 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 G96A, G96P, Q127I, Q127L, Q127V, Q132H, Q132K, Q132T, I144V, S153A, S153G, F155M, F156W, E186A, E186G, E186R, K187A, K187R, K187T, A196S, N199A, N199S, N199Y, 및 A200S로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3502 기준으로 하여 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3696 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3696 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3696 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 3, 8, 50, 61, 62, 101, 137, 158, 161, 164, 176, 193, 223, 223/243, 235, 237, 239, 240, 243, 244, 248, 249, 301, 323, 330, 352, 364, 426, 및 427로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3696 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3696 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3696 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3956 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3956 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3956 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 11, 12, 41, 44, 44/187, 45, 55, 56, 57, 65, 66, 70, 72, 73, 74/238, 82, 83, 85, 103, 111, 113, 114, 117, 132, 135, 138, 140, 159, 160, 162, 167, 182, 214, 220, 222, 223, 226, 236, 238, 256, 286, 299, 309, 387, 388, 389, 391, 393, 406, 408, 412, 418, 422, 429, 430, 449, 및 450으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3956 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3956 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3956 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4256 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4256 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4256 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 7, 9, 10, 12, 53, 65, 68, 99, 106, 110, 115, 116, 131, 132, 136, 170, 178, 190, 192, 194, 200, 220, 238, 242, 245, 257, 272, 280, 302, 304, 335, 385, 395, 399, 402, 408, 412, 416, 423, 445, 447, 및 449로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4256 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4256 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4256 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4550 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4550 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4550 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7324 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7324 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7324 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7324 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7324 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7324 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7784 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7784 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7784 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 10, 10/144, 10/199, 13, 14, 15, 15/394, 16, 22, 36, 89, 93, 96, 116, 116/123, 116/143, 116/350, 123, 125, 127, 143, 144, 149, 156, 186, 187, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 268, 287, 324, 331, 및 350으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7784 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7784 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7784 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 서열 번호 72에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 90% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 91% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 92% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 93% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 94% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 95% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 96% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 97% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 98% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420의 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 표 18.1, 19.1, 19.2, 20.1, 20.2, 20.3, 31.2, 31.3, 32.1, 32.2, 33.1, 33.2, 34.1, 34.2, 35.1, 35.2, 36.1, 36.2, 37.1, 37.2, 37.3, 38.1, 38.2, 38.3, 39.1, 39.2, 39.3, 40.1, 40.2, 40.3, 41.1, 41.2, 42.1, 및/또는 42.2에 제시된 수크로스 신타제를 제공한다. 또한, 본 발명은 다음 서열 번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다:
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 74 기준으로 하여 넘버링된다: 4/9/349/532, 4/13/113/343/532, 4/13/113/532, 4/33/47/52/343/532, 4/47/52/532, 4/113/532, 4/13/113, 4/13/532, 4/33/113, 4/343, 7, 8, 44, 95, 117/440, 136, 221, 343/532, 440, 444, 478, 532, 583, 611, 615, 615/789, 695, 722, 및 788. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 74 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 74 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092, 1094, 1096, 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126, 1128, 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142,1144, 1146, 1148, 1150, 및/또는 1152 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092, 1094, 1096, 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126, 1128, 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142,1144, 1146, 1148, 1150, 및/또는 1152 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092, 1094, 1096, 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126, 1128, 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142,1144, 1146, 1148, 1150, 및/또는 1152 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1080 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1080 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1080 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1192, 1194, 1196, 1198, 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216, 1218, 및/또는 1220 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1192, 1194, 1196, 1198, 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216, 1218, 및/또는 1220 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1192, 1194, 1196, 1198, 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216, 1218, 및/또는 1220 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1158 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1158 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1158 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, 1236, 1238, 1240, 1242, 1244, 1246, 1248, 1250, 1252, 1254, 1256, 1258, 1260, 1262, 1264, 1266, 1268, 1270, 1272, 1274, 1276, 1278, 1280, 1282, 1284, 1286, 및/또는 1288 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, 1236, 1238, 1240, 1242, 1244, 1246, 1248, 1250, 1252, 1254, 1256, 1258, 1260, 1262, 1264, 1266, 1268, 1270, 1272, 1274, 1276, 1278, 1280, 1282, 1284, 1286, 및/또는 1288 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, 1236, 1238, 1240, 1242, 1244, 1246, 1248, 1250, 1252, 1254, 1256, 1258, 1260, 1262, 1264, 1266, 1268, 1270, 1272, 1274, 1276, 1278, 1280, 1282, 1284, 1286, 및/또는 1288 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1222 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1222 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1222 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1296, 1298, 1300, 1302, 1304, 1306, 1308, 1310, 1312, 1314, 1316, 1318, 1320, 1322, 1324, 1326, 1328, 1330, 1332, 1334, 1336, 1338, 1340, 1342, 1344, 1346, 1348, 1350, 1352, 1354, 1356, 1358, 1360, 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374, 1376, 1378, 1380, 1382, 1384, 1386, 1388, 1390, 및 1392 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1296, 1298, 1300, 1302, 1304, 1306, 1308, 1310, 1312, 1314, 1316, 1318, 1320, 1322, 1324, 1326, 1328, 1330, 1332, 1334, 1336, 1338, 1340, 1342, 1344, 1346, 1348, 1350, 1352, 1354, 1356, 1358, 1360, 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374, 1376, 1378, 1380, 1382, 1384, 1386, 1388, 1390, 및 1392 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1296, 1298, 1300, 1302, 1304, 1306, 1308, 1310, 1312, 1314, 1316, 1318, 1320, 1322, 1324, 1326, 1328, 1330, 1332, 1334, 1336, 1338, 1340, 1342, 1344, 1346, 1348, 1350, 1352, 1354, 1356, 1358, 1360, 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374, 1376, 1378, 1380, 1382, 1384, 1386, 1388, 1390, 및 1392 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1392 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1392 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1392 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1456 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1456 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1456 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1568, 1570, 1572, 1574, 1576, 1578, 1580, 1582, 1584, 1586, 1588, 1590, 1592, 1594, 1596, 및 1598 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1568, 1570, 1572, 1574, 1576, 1578, 1580, 1582, 1584, 1586, 1588, 1590, 1592, 1594, 1596, 및 1598 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1568, 1570, 1572, 1574, 1576, 1578, 1580, 1582, 1584, 1586, 1588, 1590, 1592, 1594, 1596, 및 1598 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1582 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1582 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1582 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1764 기준으로 하여 넘버링된다: 63/536, 117/122/270/540/681, 181/536/548, 181/536/548/705, 181/548/705, 270/681, 347/532, 347/536/548/705, 407/570/681, 407/681, 536, 536/548, 536/548/699, 536/705, 548, 548/580, 548/705, 580, 681, 699, 및 705. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1764 기준으로 하여 넘버링된다: 63I/536L, 117E/122D/270L/540M/681A, 181N/536L/548P, 181N/536L/548P/705M, 181N/548P/705P, 270L/681A, 347R/532Y, 347R/536L/548P/705P, 407I/570H/681A, 407T/681A, 536L, 536L/548P, 536L/548P/699F, 536L/705M, 548P, 548P/580M, 548P/705P, 580M, 681A, 699F, 705M, 및 705P. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1764 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1774, 1776, 1778, 1780, 1782, 1784, 1786, 1788, 1790, 1792, 1794, 1796, 1798, 1800, 1802, 1804, 1806, 1808, 1810, 1812, 1814, 1816, 1818, 및 1820 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1774, 1776, 1778, 1780, 1782, 1784, 1786, 1788, 1790, 1792, 1794, 1796, 1798, 1800, 1802, 1804, 1806, 1808, 1810, 1812, 1814, 1816, 1818, 및 1820 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1774, 1776, 1778, 1780, 1782, 1784, 1786, 1788, 1790, 1792, 1794, 1796, 1798, 1800, 1802, 1804, 1806, 1808, 1810, 1812, 1814, 1816, 1818, 및 1820 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1804 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1804 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1804 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1840 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1840 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1840 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1840 기준으로 하여 넘버링된다: 14, 15, 18/362, 20, 24, 26, 33, 33/154, 46, 50, 54, 58, 59, 59/72, 79, 81, 92, 93, 97/154, 104, 105, 130, 134, 154, 165, 175, 185, 212, 213, 218, 241, 256, 263, 316, 319, 349, 360, 362, 364, 390, 393, 434, 480, 498, 530, 534, 534/739, 542, 603, 및 652. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1840 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1840 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2064 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2064 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2064 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 21, 25/112, 41, 89, 91, 112, 186, 200, 226, 259, 318, 330, 485, 487, 641, 674, 684, 688, 763, 및 764로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2064 기준으로 하여 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 21Q, 25T/112W, 41K, 89L, 89M, 91C, 91G, 112Q, 112R, 186V, 200A, 226V, 259G, 318A, 330A, 485A, 485S, 487I, 487K, 487R, 487T, 487V, 641L, 674A, 684G, 684H, 684M, 684T, 688A, 688F, 688G, 688H, 688Q, 763L, 및 764R로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2064 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2064 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2432 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2432 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2432 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 25, 42, 70, 75, 77, 106, 199, 265, 267, 380, 410, 561, 642, 및 758로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2432 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 25E, 25G, 25L, 42H, 42S, 42T, 70H, 70N, 70R, 70S, 70V, 75T, 75W, 77L, 77W, 106W, 199A, 265A, 265Q, 267I, 380T, 410S, 561I, 561V, 642V, 758Q, 및 758R로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2432 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 A25E, A25G, A25L, D42H, D42S, D42T, F70H, F70N, F70R, F70S, F70V, M75T, M75W, F77L, F77W, Y106W, T199A, S265A, S265Q, V267I, A380T, T410S, L561I, L561V, A642V, G758Q, 및 G758R로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2432 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2504, 2506, 2508, 2510, 2512, 2514, 2516, 2518, 2520, 2522, 2524, 2526, 2528, 2530, 2532, 2534, 2536, 2538, 2540, 2542, 2544, 2546, 2548, 2550, 2552, 2554, 2556, 2558, 2560, 2562, 2564, 2566, 2568, 2570, 2572, 2574, 2576, 2578, 2580, 2582, 2584, 2586, 2588, 2590, 2592, 및 2594 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2504, 2506, 2508, 2510, 2512, 2514, 2516, 2518, 2520, 2522, 2524, 2526, 2528, 2530, 2532, 2534, 2536, 2538, 2540, 2542, 2544, 2546, 2548, 2550, 2552, 2554, 2556, 2558, 2560, 2562, 2564, 2566, 2568, 2570, 2572, 2574, 2576, 2578, 2580, 2582, 2584, 2586, 2588, 2590, 2592, 및 2594 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2504, 2506, 2508, 2510, 2512, 2514, 2516, 2518, 2520, 2522, 2524, 2526, 2528, 2530, 2532, 2534, 2536, 2538, 2540, 2542, 2544, 2546, 2548, 2550, 2552, 2554, 2556, 2558, 2560, 2562, 2564, 2566, 2568, 2570, 2572, 2574, 2576, 2578, 2580, 2582, 2584, 2586, 2588, 2590, 2592, 및 2594 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2510 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2510 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2510 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 7/12, 12, 27, 29, 44, 45, 47, 48, 51, 55, 72, 95, 100, 116, 136, 139, 176, 178, 198, 201, 205, 205/485, 207, 208, 280, 303, 317, 343, 358, 361, 440, 478, 611, 615, 630, 675, 724, 756, 및 788로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2510 기준으로 하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2510 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2510 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7506 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7506 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7506 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 8370, 8372, 8374, 8376, 8378, 8380, 8382, 8384, 8386, 8388, 8390, 8392, 8394, 8396, 8398, 8400, 8402, 8404, 8406, 8408, 8410, 8412, 8414, 8416, 8418, 8420, 8422, 8424, 8426, 8428, 8430, 8432, 8434, 8436, 8438, 8440, 8442, 8444, 8446, 8448, 8450, 8452, 8454, 8456, 8458, 8460, 8462, 8464, 8466, 8468, 8470, 8472, 8474, 8476, 8478, 및 8480 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 8370, 8372, 8374, 8376, 8378, 8380, 8382, 8384, 8386, 8388, 8390, 8392, 8394, 8396, 8398, 8400, 8402, 8404, 8406, 8408, 8410, 8412, 8414, 8416, 8418, 8420, 8422, 8424, 8426, 8428, 8430, 8432, 8434, 8436, 8438, 8440, 8442, 8444, 8446, 8448, 8450, 8452, 8454, 8456, 8458, 8460, 8462, 8464, 8466, 8468, 8470, 8472, 8474, 8476, 8478, 및 8480 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 8370, 8372, 8374, 8376, 8378, 8380, 8382, 8384, 8386, 8388, 8390, 8392, 8394, 8396, 8398, 8400, 8402, 8404, 8406, 8408, 8410, 8412, 8414, 8416, 8418, 8420, 8422, 8424, 8426, 8428, 8430, 8432, 8434, 8436, 8438, 8440, 8442, 8444, 8446, 8448, 8450, 8452, 8454, 8456, 8458, 8460, 8462, 8464, 8466, 8468, 8470, 8472, 8474, 8476, 8478, 및 8480 중 어느 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 조작된 수크로스 신타제를 제공하고, 상기 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8420 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8420 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8420 기준으로 하여 넘버링된다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
일부 실시양태에서, 조작된 수크로스 신타제의 폴리펩티드 서열은 다음 서열 번호 중 어느 하나를 포함한다:
본 발명은 또한 NDP-글리코실트랜스퍼라제인 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하고, 상기 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(AGT), CDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(CGT), GDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(GGT), TDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(TGT) 및 IDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(IGT)로부터 선택되는 NDP-글리코실트랜스퍼라제이다. 일부 실시양태에서, 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제이다. 일부 실시양태에서, 조작된 NDP-글리코트랜스퍼라제는 UDP-글루코스-의존적 글리코실트랜스퍼라제가 아니다.
본 발명은 또한 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드는 다음 서열 번호에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함한다:
본 발명은 또한 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드는 다음 서열 번호에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함한다:
본 발명은 또한 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 제어 서열을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에서 제공되는 적어도 하나의 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 및 원핵 유기체로부터 선택된다. 일부 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)이다.
본 발명은 또한 조작된 글리코실트랜스퍼라제 변이체가 숙주 세포에 의해 생성되도록 하는 조건 하에 본원에서 제공되는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 변이체를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 글리코실트랜스퍼라제 변이체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 변이체 및/또는 수크로스 신타제 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 조작된 수크로스 신타제 변이체가 숙주 세포에 의해 생성되는 조건 하에서 본원에서 제공되는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제 변이체를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 수크로스 신타제 변이체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 기질, 본원에서 제공되는 짝수 번호의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계; 및 기질이 글리코실화되어 하나 이상의 글리코실화된 생성물을 생성하는 조건 하에 기질을 글리코실트랜스퍼라제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 기질을 글리코실화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 기질은 적어도 하나의 스테비올 글리코시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 글리코실화된 생성물은 적어도 하나의 모노글리코실화된 및/또는 폴리글리코실화된 생성물을 포함한다. 본 발명은 생성물의 글리코실화 정도에 관한 임의의 제한으로 한정되는 것으로 의도되지 않는다(예를 들어, 디글리코실화된, 트리글리코실화된 생성물, 및 보다 높은 글리코실화 수준을 갖는 생성물이 본 발명에 유용함).
본 발명은 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 및 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 레바우디오시드 D 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, NDP-글루코스는 ADP-글루코스, CDP-글루코스, TDP-글루코스, GDP-글루코스 및/또는 IDT-글루코스로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP-글루코스는 UDP-글루코스가 아니다.
본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A의 생성 방법을 제공한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, NDP-글루코스는 ADP-글루코스, CDP-글루코스, TDP-글루코스, GDP-글루코스 및/또는 IDT-글루코스로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP-글루코스는 UDP-글루코스가 아니다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, NDP-글루코스는 ADP-글루코스, CDP-글루코스, TDP-글루코스, GDP-글루코스 및/또는 IDT-글루코스로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP-글루코스는 UDP-글루코스가 아니다.
본 발명은 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 및 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 레바우디오시드 D 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다.
본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A의 생성 방법을 제공한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 ADP, CDP, TDP, GDP 및/또는 IDT로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 UDP가 아니다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A의 생성 방법을 제공한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 ADP, CDP, TDP, GDP 및/또는 IDT로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 UDP가 아니다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 ADP, CDP, TDP, GDP 및/또는 IDT로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 UDP가 아니다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 스테비오시드 및/또는 스테비오시드와 rebA의 혼합물을 포함하는 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 ADP, CDP, TDP, GDP 및/또는 IDT로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 UDP가 아니다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 적어도 하나의 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 및 글리코실트랜스퍼라제를, 레바우디오시드 A가 먼저 생성된 후, 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되고, 레바우디오시드 M이 마지막으로 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 본 실시양태의 일부에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 ADP, CDP, TDP, GDP 및/또는 IDT로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, NDP는 UDP가 아니다.
레바우디오시드(들)의 생성을 위한 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 원 포트(one-pot) 반응으로 수행된다. 추가의 일부 실시양태에서, 방법은 순차적으로 수행된다. 추가의 일부 실시양태에서, 방법은 방법의 단계들을 반복하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 수크로스는 반복 단계 동안 재순환된다. 추가의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 및/또는 다른 반응 성분이 재순환된다. 추가의 일부 실시양태에서, 스테비오시드 기질은 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 추출되는 반면, 일부 대안적인 실시양태에서, 스테비오시드 기질은 합성에 의해 생성되고, 추가의 일부 실시양태에서, 스테비오시드 기질은 자연적으로 및/또는 합성에 의해 생성되는 스테비오시드의 혼합물이다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 고정화된다. 본 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 고정화된다. 추가의 또 다른 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제 및/또는 수크로스 신타제가 고정화된다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 프럭토스를 포함하는 반응 생성물이 생성된다. 일부 실시양태에서, 프럭토스는 반응 생성물로부터 제거된다. 또 다른 추가의 일부 실시양태에서, 방법은 세척 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 단계는 방법에 의해 생성된 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및/또는 레바우디오시드 D를 용매에 노출시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용매는 물이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 컬럼 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 컬럼 크로마토그래피 단계는 방법에 의해 생성된 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및/또는 레바우디오시드 D에 대해 수행된다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 본원에서 제공되는 베타-1,2 글리코실트랜스퍼라제이다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 본원에서 제공되는 베타-1,3 글리코실트랜스퍼라제이다. 상기 방법의 또 다른 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 본원에서 제공되는 베타-1,2 글리코실트랜스퍼라제이고, 적어도 하나의 추가의 조작된 글리코실트랜스퍼라제는 본원에서 제공되는 베타-1,3 글리코실트랜스퍼라제이다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 적어도 하나의 수크로스 신타제가 유용하다.
본원에서 제공되는 방법에서, 다음 서열 번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 유용하다:
본원에서 제공되는 방법에서, 다음 서열 번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 유용하다:
본 발명은 또한 레바우디오시드 및 본원에서 제공되는 방법에 따라 생성된 레바우디오시드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 레바우디오시드는 레바우디오시드 M이고, 일부 대안적인 실시양태에서 레바우디오시드는 레바우디오시드 A이고, 또 다른 실시양태에서 레바우디오시드는 레바우디오시드 I이고, 추가의 일부 실시양태에서 레바우디오시드는 레바우디오시드 D이다. 추가의 일부 실시양태에서, 레바우디오시드는 레바우디오시드 D이다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 레바우디오시드의 농축물 및 관심 있는 다른 성분의 임의의 조합으로 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및/또는 레바우디오시드 D의 혼합물을 비롯하여 본원에서 제공되는 방법에 따라 생성된 레바우디오시드 혼합물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 레바우디오시드의 농축물 및 관심 있는 다른 성분의 임의의 조합으로 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및/또는 레바우디오시드 D의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 실제로, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생성된 레바우디오시드(들)의 임의의 특정 조합 또는 혼합물로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 및 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스 및 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 D 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, NDP-글루코스 및 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스 및 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스 및 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스 및 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스 및 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스 및 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 D 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, ADP-글루코스 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제, 및/또는 118을 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 I 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 레바우디오시드 I 및/또는 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 I의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 스테비오시드 및/또는 스테비오시드와 rebA의 혼합물을 포함하는 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 당은 적절한 신타제와 조합하여 사용된다.
또한, 본 발명은 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 적어도 하나의 수크로스 신타제, 및 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 스테비오시드 기질, NDP, 및 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A가 먼저 생성된 후, 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되고, 레바우디오시드 M이 마지막으로 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 수크로스 및 수크로스 신타제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 본원에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 원 포트 반응으로 수행되는 반면, 일부 대안적인 실시양태에서, 방법은 다중 반응 용기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 순차적인 방식으로 단일 및/또는 다중 반응 용기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법 단계들은 반복된다(즉, 방법의 단계들의 일부 또는 전부가 다수회 반복된다). 일부 실시양태에서, 수크로스는 반복 단계 동안 재순환된다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제 및/또는 다른 반응 성분(예를 들어, 보조 인자)이 재순환된다. 방법의 일부 실시양태에서, 스테비오시드 기질은 스테비아 레바우디아나로부터 추출되는 반면, 일부 대안적인 방법에서, 스테비오시드 기질은 합성에 의해 생성된다. 추가의 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제가 고정화된다. 추가의 일부 실시양태에서, 수크로스 신타제는 고정화된다. 추가의 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제 및/또는 수크로스 신타제가 고정화된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 프럭토스가 생성된다. 추가의 일부 실시양태에서, 프럭토스는 반응 생성물로부터 제거된다.
본 발명은 또한 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에서 제공되는 적어도 하나의 비자연 발생 글리코실트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 글리코실기 공여체, 적어도 하나의 글리코실기 수용체, 및 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제 효소를 제공하는 단계; 및 글리코실기 수용체가 글리코실화되어 베타-글루코스 연결을 갖는 적어도 하나의 생성물을 생성하는 조건 하에서 글리코실기 공여체 및 글리코실기 수용체를 글리코실트랜스퍼라제 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 베타-글루코실화 생성물을 생성하기 위한 기질의 글리코실화 방법을 제공한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 글리코실기 공여체는 뉴클레오티드 디포스페이트 당, 예를 들어 아데닌 디포스포글루코스(ADP-글루코스)이다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 글리코실기 수용체는 글리코실, 알콕시, 카르복시, 아미노카르보닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카르복시알킬, 아미노알킬, 할로알킬, 알킬티오알킬, 헤테로시클로알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬기로부터 선택된다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 베타-글루코스 연결을 갖는 생성물은 스테비올 글리코시드이다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 글리코실기 수용체는 레바우디오시드 D이고, 글리코실기 공여체는 ADP-글루코스이고, 베타-글루코스 연결을 갖는 생성물은 레바우디오시드 M이다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 글리코실기 수용체는 스테비오시드이고, 글리코실기 공여체는 ADP-글루코스이고, 베타-글루코스 연결을 갖는 생성물은 레바우디오시드 A 또는 레바우디오시드 I이다.
본 발명은 또한 뉴클레오시드 디포스포글루코스의 생성 방법을 제공하고, 이 방법은 뉴클레오시드 디포스페이트 의존적 신타제, 뉴클레오시드 디포스페이트, 및 신타제의 디사카라이드, 트리사카라이드, 또는 올리고사카라이드 기질을 제공하는 단계; 사카라이드가 절단되어 보다 저분자량의 사카라이드 및 뉴클레오시드 디포스포글루코스를 생성하는 조건 하에 신타제, 뉴클레오시드 디포스페이트 및 사카라이드를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이전에 설명된 방법과 조합된다. 상기 방법의 추가의 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 디포스페이트는 ADP이고, 뉴클레오시드 디포스포글루코스는 ADP-글루코스이고, 신타제 기질은 수크로스이다.
도 1은 글리코실트랜스퍼라제가 글리코실기를 뉴클레오시드 디포스포글루코스(NDP-글루코스), 예를 들어 ADP-글루코스로부터 수용체, 예를 들어 R-OH로 전달하는 것을 촉매하는 효소 반응식을 제공하고, 여기서 R은 임의의 글리코실, 알콕시, 카르복시, 아미노카르보닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카르복시알킬, 아미노알킬, 할로알킬, 알킬티오알킬, 헤테로시클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬기이다. 추가의 실시양태에서, R-OH는 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D이고, 생성물은 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 또는 레바우디오시드 M이다. 뉴클레오시드 디포스페이트 의존적 신타제는 글루코실기를 글루코스 공여체(예를 들어, 수크로스)로부터 뉴클레오시드 디포스페이트로 전달하는 것을 촉매하여 NDP-글루코스를 재생하고 부산물(예를 들어, 프럭토스)을 방출시킨다.
도 2는 탄소가 넘버링된 레바우디오시드 M의 구조를 제공한다.
도 3은 탄소가 넘버링된 레바우디오시드 I의 구조를 제공한다.
도 2는 탄소가 넘버링된 레바우디오시드 M의 구조를 제공한다.
도 3은 탄소가 넘버링된 레바우디오시드 I의 구조를 제공한다.
본 발명은 조작된 글리코실트랜스퍼라제(GT) 효소, GT 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 조작된 수크로스 신타제(SuS) 효소, SuS 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 GT 효소를 포함하는 조성물 및 β-글루코스 연결을 갖는 생성물을 제조하기 위해 조작된 GT 효소를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 레바우디오시드(예를 들어, 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I 및 레바우디오시드 D)의 생성을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 SuS 효소를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. GT 및 SuS 효소를 생성하는 방법도 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 아래에서 설명되는 세포 배양, 분자 유전학, 미생물학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학의 실험 절차는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 이러한 기술은 잘 알려져 있고, 많은 텍스트 및 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 참고 문헌에 기재되어 있다. 표준 기술 또는 이의 변형은 화학 합성 및 화학 분석에 사용된다. 앞에서 및 아래에서 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 간행물은 본원에 명백히 참고로 포함된다.
본원에서 설명되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 적합한 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 유용할 수 있지만, 일부 방법 및 재료가 본원에서 설명된다. 본 발명은 설명된 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않으며, 이는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 사용되는 상황에 따라 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어는 본 발명을 전체적으로 참조하여 보다 상세하게 설명된다.
상기한 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적인 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 섹션 제목은 단지 구성상의 목적을 위한 것이로서, 설명되는 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 따라서, 본원에서 개시되는 모든 수치 범위는 마치 보다 좁은 수치 범위가 모두 본원에서 분명하게 기재된 것처럼 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 보다 좁은 모든 수치 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서 개시되는 최대(또는 최소) 수치 제한은 마치 보다 낮은(또는 보다 높은) 수치 제한이 본원에서 분명하게 기재된 것처럼 모든 보다 낮은(또는 보다 높은) 수치 제한을 포함하는 것으로 의도된다.
약어
유전자에 의해 코딩되는 아미노산에 대해 사용된 약어는 통상적이며, 다음과 같다:
"L" 또는 "D"가 구체적으로 선행하거나 약어가 사용된 문맥으로부터 명확하지 않은 경우, 3문자 약어가 사용되는 경우, 아미노산은 α-탄소(Cα)에 대해 L- 또는 D-배열로 존재할 수 있다. 예를 들어, "Ala"는 α- 탄소에 관한 배열을 특정하지 않으면서 알라닌을 지칭하는 반면, "D-Ala" 및 "L-Ala"는 각각 D-알라닌 및 L-알라닌을 지칭한다. 1문자 약어를 사용할 때, 대문자는 α-탄소에 관한 L-배열의 아미노산을 나타내고, 소문자는 α-탄소에 대한 D-배열의 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, "A"는 L- 알라닌을 나타내며, "a"는 D-알라닌을 나타낸다. 폴리펩티드 서열이 1문자 또는 3문자 약어(또는 이들의 혼합)의 스트링으로 제시될 때, 서열은 통상적인 규약에 따라 아미노(N)에서 카르복시(C) 방향으로 제시된다.
유전자 코딩 뉴클레오시드에 사용되는 약어는 통상적인 것으로서, 다음과 같다: 아데노신(A); 구아노신(G); 시티딘(C); 티미딘(T); 및 우리딘(U). 구체적으로 설명되지 않는 한, 약어로 표시된 뉴클레오시드는 리보뉴클레오시드 또는 2'-데옥시리보뉴클레오시드일 수 있다. 뉴클레오시드는 개별적으로 또는 총체적으로 리보뉴클레오시드 또는 2'-데옥시리보뉴클레오시드로서 특정될 수 있다. 핵산 서열이 1문자 약어의 스트링으로 제시될 때, 서열은 통상적인 규약에 따라 5'에서 3' 방향으로 제시되며, 포스페이트는 표시되지 않는다.
정의
본 발명과 관련하여, 본원의 설명에 사용된 기술 및 과학 용어는 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 따라서, 다음 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 초과의 폴리펩티드를 포함한다.
유사하게, "포함하다", "포함한다", "포함하는" "포괄하다", "포괄한다" 및 "포괄하는"은 상호 교환 가능하며, 제한하려는 것이 아니다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 및 그의 어원이 같은 용어는 포괄적인 의미로 사용된다(즉, 용어 "포함하는" 및 그의 상응하는 어원이 같은 용어와 동등한 의미를 갖는다).
다양한 실시양태의 설명이 "포함하는"이라는 용어를 사용하는 경우, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일부 특정 예에서 "본질적으로 이루어는" 또는 "이루어지는"이라는 표현을 사용하여 대안적으로 설명될 수 있음을 또한 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차를 의미한다. 일부 경우에, "약"은 주어진 값의 범위의 0.05%, 0.5%, 1.0% 또는 2.0% 이내를 의미한다. 일부 경우에, "약"은 주어진 값의 1, 2, 3 또는 4의 표준 편차를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "EC" 번호는 국제 생화학 분자생물학 연합 학회의 명명 위원회(NC-IUBMB: Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)의 효소 명명법을 지칭한다. IUBMB 생화학 분류는 효소가 촉매 작용을 하는 화학 반응에 기초한 수치적 분류 체계이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ATCC"는 그의 생체 시료 저장 수집물이 유전자 및 균주를 포함하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NCBI"는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biological Information) 및 그 안에 제공된 서열 데이터베이스를 지칭한다.
"단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 길이 또는 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)에 관계 없이, 아미드 결합에 의해 공유 연결된 적어도 2개의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 이 정의에는 D- 및 L-아미노산, 및 D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물뿐만 아니라, D- 및 L-아미노산, 및 D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물을 포함하는 중합체가 포함된다.
"아미노산"은 이들의 통상적으로 공지된 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회에 의해 권고된 1문자 기호에 의해 본원에서 언급된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 이들의 일반적으로 허용되는 1문자 코드에 의해 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 서로 공유 연결된 2개 이상의 뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 전적으로 리보뉴클레오티드(즉, RNA)로 이루어지거나, 전적으로 2' 데옥시리보뉴클레오티드(즉, DNA)로 이루어지거나, 또는 리보뉴클레오티드와 2' 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물로 이루어질 수 있다. 뉴클레오사이드는 전형적으로 표준 포스포디에스테르 연결을 통해 서로 연결될 것이지만, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비표준 연결을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 단일 가닥 영역 및 이중 가닥 영역 모두를 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 자연 발생하는 코딩 핵염기(즉, 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민 및 시토신)로 이루어질 것이지만, 그것은 하나 이상의 변형된 핵염기 및/또는 합성 핵염기, 예를 들어, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 변형된 핵염기 또는 합성 핵염기는 아미노산 서열을 코딩하는 핵염기이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오시드"는 핵염기(즉, 질소 염기) 및 5탄당(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스)을 포함하는 글리코실아민을 지칭한다. 뉴클레오시드의 비제한적인 예는 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신, 티미딘 및 이노신을 포함한다. 대조적으로, 용어 "뉴클레오티드"는 핵염기, 5탄당 및 하나 이상의 포스페이트기를 포함하는 글리코실아민을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드는 키나제에 의해 인산화되어 뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오시드 디포스페이트"는 핵염기(즉, 질소 염기), 5탄당(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스), 및 디포스페이트(즉, 피로포스페이트) 모이어티를 포함하는 글리코실아민을 지칭한다. 본원의 일부 실시양태에서, "뉴클레오시드 디포스페이트"는 "NDP"로 약칭된다. 뉴클레오시드 디포스페이트의 비제한적 예는 시티딘 디포스페이트(CDP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 티미딘 디포스페이트(TDP) 및 이노신 디포스페이트를 포함한다. 용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는 일부 상황에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "코딩 서열"은 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(예를 들어, 유전자)의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체 촉매 작용", "생체 촉매", "생체 전환" 및 "생합성"은 유기 화합물에 대한 화학 반응을 수행하기 위한 효소의 사용을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글리코실트랜스퍼라제"(GT)는 글리코실 잔기를 활성화된 당 공여체로부터 단량체 및 중합체 수용체 분자로 전달하는 효소의 능력을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제는 "글리코실트랜스퍼라제 변이체" 또는 "글리코실트랜스퍼라제 조합 변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, "글리코실트랜스퍼라제"는 분류 EC 2.4.1.17의 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 효소를 지칭하며, 이것은 글루코스를 UDP-α-D-글루쿠로네이트(UDP-UDP-글루코스로도 알려짐)로부터 수용체로의 전달을 촉매하여 UDP를 방출시키고, 수용체 β-D-글루쿠로노사이드를 형성한다. 탄수화물-활성 효소 데이터베이스(CAZy)는 글리코실트랜스퍼라제 패밀리의 지속적으로 업데이트된 목록을 제공한다. 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제는 GT1 패밀리로 분류된 효소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제 변이체는 ADP-글루코스를 우선적으로 이용한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제 효소는 UDP-글루코스를 이용하지 않는다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제 변이체는 ADP-글루코스, CDP-글루코스, TDP-글루코스, GDP-글루코스 및/또는 IDT-글루코스를 이용하지만, UDP-글루코스는 이용하지 않는다. 따라서, 바람직한 일부 실시양태에서, 본 발명은 ADP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(ADP-글리코실트랜스퍼라제; AGT), CDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(CDP-글리코실트랜스퍼라제; CGT), GDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(GDP-글리코실트랜스퍼라제; GGT), TDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(TDP-글리코실트랜스퍼라제; TGT) 및/또는 IDT-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(IDP-글리코실트랜스퍼라제; IGT)를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NDP-글리코실트랜스퍼라제"(NDP-GT)는 글리코실 잔기를 NDP인 활성화된 당 공여체로부터 단량체 및 폴리머 수용체 분자로 전달하는 효소 능력을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, NDP-글리코실트랜스퍼라제는 일반적으로 "글리코실트랜스퍼라제"로 지칭된다. 실제로, 본원에 사용 되는 용어 "글리코실트랜스퍼라제"는 ADP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(ADP-글리코실트랜스퍼라제; AGT), CDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(CDP-글리코실트랜스퍼라제; CGT), GDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(GDP-글리코실트랜스퍼라제; GGT), TDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(TDP-글리코실트랜스퍼라제; TGT) 및 IDT-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(IDP-글리코실트랜스퍼라제; IGT)를 비롯하여 NDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제 효소는 ADP-글루코스, CDP-글루코스, TDP-글루코스, GDP-글루코스 및/또는 IDT-글루코스를 이용하지만, UDP-글루코스는 이용하지 않는다. 추가의 일부 실시양태에서, 효소는 "변이체" 또는 "조합 변이체"(예를 들어, ADP-글리코실트랜스퍼라제 변이체)로 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글리코실전이"는 글리코실 잔기가 디사카라이드, 트리사카라이드, 또는 올리고사카라이드 공여체로부터 아글리코실화된 또는 글리코실화된 수용체 분자로 전달되는 반응을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글루코실전이"는 전달되는 글리코실 잔기가 글루코스이고 디사카라이드, 트리사카라이드, 또는 올리고사카라이드 공여체가 글루코스를 함유하는 글리코실전이 반응을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글리코실화"는 글리코실 잔기와 수용체 분자 사이의 글리코시드 연결의 형성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글루코실화"는 글루코스 잔기와 수용체 분자 사이의 글리코시드 연결의 형성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글리코실"은 모노사카라이드, 저급 올리고사카라이드 또는 올리고사카라이드 유도체의 시클릭 형태로부터 헤미아세탈 히드록실 기를 제거함으로써 수득되는 1가 자유 라디칼 또는 치환체 구조인 유기 기를 지칭한다. 글리코실기는 무기 산(예를 들어, 인산)과 반응하여 에스테르(예를 들어, 글루코스 1-포스페이트)를 형성한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글리코시드"는 글리코시드 결합에 의해 탄수화물(예를 들어, 당)이 또 다른 관능기에 결합되는 분자를 지칭한다. 글리코시드는 당 및 비-당(즉, 아글리콘) 성분을 생성하기 위해 가수분해될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "스테비올 글리코시드"는 비제한적으로, 천연 발생 스테비올 글리코시드(예를 들어, 스테비오시드, 스테비올모노시드, 스테비올비오시드, 루부소시드, 둘코시드 B, 둘코시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 G, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 F, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 H, 레바우디오시드 L, 레바우디오시드 K, 레바우디오시드 J, 레바우디오시드 M(레바우디오시드 X로도 지칭됨), 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 N, 레바우디오시드 O), 및 합성 스테비올 글리코시드(예를 들어, 효소에 의해 글루코실화된 스테비올 글리코시드), 및 이들의 조합을 포함하는 스테비올의 글리코시드를 지칭한다. 스테비올 및 그의 글리코시드의 화학 구조가 아래에 제시된다(WO 2013/176738 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "스테비오시드 기질"은 적어도 하나의 스테비올 글리코시드를 포함하는 임의의 적합한 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "수크로스 신타제"는 NDP-글루코스 + D-프럭토스의 NDP 및 수크로스로의 화학 반응을 가역적으로 촉매할 수 있는 글리코실트랜스퍼라제 효소(EC 2.4.1.1.13)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 아시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus) 수크로스 신타제("AcSuS")의 변이체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이들 효소는 "수크로스 신타제 변이체", "SuS", "SUS", "SuS 변이체", "SUS 변이체", "수크로스 신타제 조합 변이체"또는 "SuS 조합 변이체" 또는 "SUS 조합 변이체"로 언급된다. 일부 실시양태에서, 이들 변이체는 우리딘 이외의 다른 NDP를 우선적으로 이용한다(즉, UDP-글루코스보다는 ADP-글루코스, CDP-글루코스, TDP-글루코스, GDP-글루코스 및/또는 IDP-글루코스가 이용됨). 일부 실시양태에서, 이들 변이체는 UDP-글루코스를 이용하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "원 포트 반응"은 하나의 반응 용기에서 관심 레바우디오시드의 생성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 다른 레바우디오시드(예를 들어, rebD 및/또는 rebI)의 중간체 생성과 함께 rebA 및/또는 스테비오시드를 포함하고 이로 제한되지 않는, 출발 물질로부터 rebM의 생성과 관련하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 스테비오시드의 RebA로의, RebA에서 RebD 및/또는 RebI로의 및 RebD 및/또는 RebI에서 RebM으로의 전환은 하나의 반응 용기에서 다중 효소 캐스케이드로서 수행된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "야생형" 및 "천연 발생"은 자연에서 발견되는 형태를 지칭한다. 예를 들면, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 인간 조작에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체에 존재하는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합", "조작된" 및 "비천연 발생"은 세포, 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 자연에 존재하지 않는 방식으로 변형된 물질 또는 물질의 자연 또는 천연 형태에 해당하는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포, 핵산 또는 폴리펩티드는 천연 발생 세포, 핵산 또는 폴리펩티드와 동일하지만, 합성 물질로부터 및/또는 재조합 기술을 사용하여 조작에 의해 생성되거나 유도된 것이다. 비제한적 예는 그 중에서도, 세포의 천연(비재조합) 형태에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 그렇지 않으면 상이한 수준으로 발현되는 천연 유전자를 발현하는 재조합 세포를 포함한다.
용어 "서열 동일성 백분율(%)"은 본원에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 간 비교를 지칭하기 위해 사용되며, 비교 창에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 참고 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 대응하는 위치의 수를 산출하고, 대응하는 위치의 수를 비교 창의 위치의 총수로 나누고, 서열 동일성의 백분율을 산출하기 위해 결과값에 100을 곱함으로써 계산될 수 있다. 대안적으로, 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하거나 또는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 갭과 정렬되는 위치의 수를 결정하여 대응하는 위치의 수를 산출하고, 대응하는 위치의 수를 비교 창의 위치의 총수로 나누고, 서열 동일성의 백분율을 산출하기 위해 결과값에 100을 곱함으로써 계산될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 2개의 서열을 정렬하는데 이용할 수 있는 많은 확립된 알고리즘이 존재함을 이해한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 비제한적으로 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman)의 국소 상동성 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]), 니들맨(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]), 피어슨(Pearson) 및 립맨(Lipman)(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988])의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행(예를 들어, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 관련 기술 분야에 공지된 육안 검사를 포함하는 임의의 적당한 방법에 의해 수행될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는 데 적당한 알고리즘의 예는 비제한적으로 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함하고, 이는 알츌(Altschul) 등에 의해 설명된 바 있다(각각 Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]; 및 Altschul et al., Nucl. Acids Res., 3389-3402 [1977] 참조). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터 웹사이트를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 이러한 알고리즘은 데이타베이스 서열에서 동일 길이의 단어와 정렬할 때, 일부 양수 값의 한계 점수 T와 대응하거나 이를 충족하는, 문의 서열 중 길이 W의 짧은 단어를 확인하여 높은 점수의 서열쌍(HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 한계치(Altschul et al., 상기 문헌 참조)로서 언급된다. 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위해 검색을 개시하기 위한 씨드(seed)로서 작용한다. 이어서, 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(대응하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(미대응 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 평가 매트릭스를 사용해서 누적 점수를 계산한다. 각 방향으로의 단어 히트의 확장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 획득값으로부터 X의 양만큼 감소할 때; 누적 점수가 1 이상의 음성 평가 잔기 정렬의 누적에 기인하여 0 이하가 될 때; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달할 때 중지한다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬 속도 및 민감도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), 및 BLOSUM62 평가 매트릭스를 사용한다(예를 들면, Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989] 참조). 서열 정렬 및 서열 동일성 %의 예시적인 결정은 제공된 디폴트 파라미터를 사용하는, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지(Accelrys, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 BESTFIT 또는 GAP 프로그램을 채택할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "참조 서열"은 서열 및/또는 활성 비교를 위한 기초로서 사용되는 규정된 서열을 지칭한다. 참조 서열은 더 큰 서열의 하위세트, 예를 들어 전장 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 절편일 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은 적어도 20개 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 길이, 적어도 25개 잔기 길이, 적어도 50개 잔기 길이, 적어도 100개 잔기 길이 또는 핵산 또는 폴리펩티드의 전체 길이이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 (1) 2개의 서열 사이의 유사한 서열(즉, 완전한 서열의 일부)을 포함할 수 있고, (2) 2개의 서열 사이에서 분지성인 서열을 추가로 포함할 수 있기 때문에, 2개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 비교는 통상 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위한 "비교 창"에 걸쳐 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 비교함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, "참조 서열"은 주요 아미노산 서열을 기초로 할 수 있고, 참조 서열은 주요 서열에서 하나 이상의 변화를 가질 수 있는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비교 창"은 적어도 약 20개의 인접하는 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 잔기의 개념적 절편을 지칭하고, 여기서 서열은 적어도 20개의 인접하는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 참조 서열과 비교될 수 있고, 비교 창 내의 서열의 일부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는)과 비교하여 20% 이하의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 창은 20개보다 긴 인접하는 잔기일 수 있고, 경우에 따라 30, 40, 50, 100개 또는 그보다 긴 창을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 제시된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링 측면에서 사용될 때 "~에 상응하는", "~를 참조하여" 및 "~에 대하여"는 제시된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 비교시에 구체화된 참조 서열의 잔기의 넘버링을 지칭한다. 달리 말하면, 제시된 중합체의 잔기 번호 또는 잔기 위치는 제시된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 잔기의 실제 수치 위치보다는 참조 서열과 관련하여 지정된다. 예를 들면, 제시된 아미노산 서열, 예컨대 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 2개의 서열 사이에 잔기 대응을 최적화하도록 갭을 도입함으로써 참조 서열에 정렬시킬 수 있다. 이러한 경우, 갭이 존재하더라도, 제시된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 잔기의 넘버링은 정렬되는 참조 서열과 관련하여 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적인 동일성"은 적어도 20개 잔기 위치의 비교 창, 빈번하게는 적어도 30-50개 잔기의 비교 창에 걸쳐 참조 서열과 비교함으로써 적어도 80%의 서열 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 89 내지 95%의 서열 동일성, 보다 일반적으로는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭하고, 여기서 서열 동일성 백분율은 비교 창에 걸쳐 참조 서열의 총 20% 이하인 결실 또는 부가를 포함하는 서열에 참조 서열을 비교함으로써 계산된다. 폴리펩티드에 적용되는 일부 특정 실시양태에서, 용어 "실질적인 동일성"은 2개의 폴리펩티드 서열이 예를 들어 디폴트 갭 가중치를 사용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 89%의 서열 동일성, 적어도 95%의 서열 동일성 또는 그 초과의 서열 동일성(예를 들어, 99%의 서열 동일성)을 공유한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 비교하고자 하는 서열에서 동일하지 않은 잔기의 위치는 보존적 아미노산 치환과 상이하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산 차이" 및 "잔기 차이"는 참조 서열 내의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 대한 폴리펩티드 서열의 위치에서의 아미노산 잔기의 차이를 지칭한다. 일부 경우에, 참조 서열은 히스티딘 태그를 갖지만, 넘버링은 히스티딘 태그가 없는 동등한 참조 서열에 대해 유지된다. 아미노산 차이의 위치는 일반적으로 본원에서 "Xn"으로 언급되고, 여기서 n은 잔기 차이가 기초로 하는 참조 서열 내의 상응하는 위치를 의미한다. 예를 들면, "서열 번호 4와 비교시 위치 X93에서의 잔기 차이"는 서열 번호 4의 위치 93에 상응하는 폴리펩티드 위치에서의 아미노산 잔기의 차이를 의미한다. 따라서, 서열 번호 4의 참조 폴리펩티드가 위치 93에 세린을 가지면, "서열 번호 4와 비교시 위치 X93에서의 잔기 차이"는 서열 번호 4의 위치 93에 상응하는 폴리펩티드의 위치에서 세린 이외의 다른 임의의 잔기의 아미노산 치환을 의미한다. 본원의 대부분의 예에서, 일정 위치에서의 특정 아미노산 잔기 차이는 "XnY"로 표시되고, 여기서 "Xn"은 상기 기술된 상응하는 위치를 특정하고, "Y"는 조작된 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산의 1문자 식별자(즉, 참조 폴리펩티드에서와는 상이한 잔기)이다. 일부 예에서(예를 들어, 실시예에서 제시되는 표에서), 본 발명은 또한 통상적인 표기법 "AnB"로 표시된 특정한 아미노산 차이를 제공하며, 여기서 A는 참조 서열 내의 잔기의 1문자 식별자이고, "n"은 참조 서열 내의 잔기 위치의 번호이며, B는 조작된 폴리펩티드의 서열 내의 잔기 치환의 1문자 식별자이다. 일부 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 잔기 차이가 참조 서열에 대해 존재하는 특정 위치의 목록으로 표시되는, 참조 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 아미노산이 폴리펩티드의 특정 잔기 위치에서 사용될 수 있는 경우, 사용될 수 있는 다양한 아미노산 잔기는 "/"에 의해 구분된다(예를 들어, X307H/X307P 또는 X307H/P). 슬래시는 또한 제시된 변이체 내의 다중 치환을 나타내기 위해 사용될 수도 있다(즉, 제시된 서열에, 예컨대 조합 변이체 내에 하나 초과의 치환이 존재함). 일부 실시양태에서, 본 발명은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산 차이를 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 보존적 및 비보존적 아미노산 치환을 둘 모두 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 상이한 잔기로 잔기를 치환하는 것을 의미하고, 따라서 통상 동일하거나 유사한 정의된 아미노산 클래스 내의 아미노산으로 폴리펩티드의 아미노산을 치환하는 것을 포함한다. 비제한적인 예를 들어, 일부 실시양태에서 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 다른 지방족 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신)으로 치환되고, 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산은 히드록실 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들어, 세린 및 트레오닌)으로 치환되며, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘)으로 치환되고, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 염기성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들어, 라이신 및 아르기닌)으로 치환되며, 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 산성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 치환되고/되거나, 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각 또 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 치환된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비보존적 치환"은 유의하게 상이한 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로 폴리펩티드 내의 아미노산을 치환하는 것을 의미한다. 비보존적 치환은 정의된 군에 속하는 것이 아니라 그들 사이의 아미노산을 사용할 수 있고, (a) 치환 영역 내의 펩티드 골격의 구조(예, 글리신 대신 프롤린); (b) 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미칠 수 있다. 비제한적인 예로서, 예시적인 비보존적 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 산성 아미노산; 소형 아미노산으로 치환된 방향족 아미노산; 및 소수성 아미노산으로 치환된 친수성 아미노산일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "결실"은 참조 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산의 제거에 의한 폴리펩티드의 변형을 의미한다. 결실은 조작된 글리코실트랜스퍼라제 효소의 개선된 특성을 유지하고/하거나 효소 활성을 보유하면서 참조 효소를 구성하는 아미노산 중 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산, 아미노산 총수의 최대 10%, 또는 아미노산 총수의 최대 20%의 제거를 포함할 수 있다. 결실은 폴리펩티드의 내부 영역 및/또는 말단 영역에 대한 것일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 연속되는 절편을 포함할 수 있거나 비연속적일 수 있다. 결실은 일반적으로 아미노산 서열에 "-"로 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "삽입"은 참조 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산의 부가에 의한 폴리펩티드의 변형을 의미한다. 삽입은 폴리펩티드의 내부 영역에 있거나, 또는 카르복시 또는 아미노 말단에 있을 수 있다. 본원에서 사용되는 삽입은 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다. 삽입은 아미노산의 인접하는 절편이거나 또는 천연 발생 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산에 의해 분리될 수 있다.
"기능적 단편" 및 "생물학적 활성 단편"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실(들) 및/또는 내부 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열이 비교되는 서열(즉, 본 발명의 조작된 전장 글리코실트랜스퍼라제)의 상응하는 위치와 동일하고 실질적으로 전장 폴리펩티드의 전체 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된 폴리펩티드"는 천연적으로 이와 수반되는 다른 오염물(예를 들어, 단백질, 지질 및 폴리뉴클레오티드)로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 이 용어는 그들의 천연 발생 환경 또는 발현계(예를 들어, 숙주 세포 또는 시험관 내 합성)로부터 분리되거나 정제된 폴리펩티드를 포함한다. 재조합 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 세포 내에 존재하거나, 세포 배지에 존재하거나, 또는 다양한 형태, 예컨대 용해물 또는 단리된 조제물로서 생성될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재조합 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한 폴리펩티드" 또는 "정제된 단백질"은 그 폴리펩티드 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰 또는 중량 기준으로 조성물 내의 임의의 다른 개별 거대분자 종보다 더 풍부함)인 조성물을 의미하고, 일반적으로 대상 종이 몰 또는 중량% 기준으로 존재하는 거대분자 종의 적어도 약 50%를 차지하는 경우 실질적으로 순수한 조성물이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 조성물은 50% 미만(예를 들어, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%)으로 순수한 글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 글리코실트랜스퍼라제 조성물은 몰 또는 중량% 기준으로 조성물에 존재하는 모든 존재하는 거대분자 종의 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상을 차지한다. 일부 실시양태에서, 대상 종은 본질적으로 균질하게 정제되고(즉, 오염 종이 기존의 검출 방법으로는 조성물에서 검출될 수 없음), 여기서 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다. 용매 종, 소분자(<500 달톤), 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로 고려하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 재조합 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "개선된 효소 특성"은 효소의 적어도 하나의 개선된 특성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 참조 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드 및/또는 야생형 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드, 및/또는 또 다른 조작된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드와 비교시에 임의의 효소 특성의 개선을 나타내는 조작된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, "개선" 수준은 야생형 및 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 포함한 다양한 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 결정하고 비교할 수 있다. 개선된 특성은 비제한적으로, 증가된 단백질 발현, 증가된 열활성, 증가된 열안정성, 증가된 pH 활성, 증가된 안정성, 증가된 효소 활성, 증가된 기질 특이성 또는 친화성, 증가된 비활성, 기질에 대한 증가된 내성 또는 최종 산물 억제, 증가된 화학적 안정성, 개선된 화학선택성, 개선된 용매 안정성, 산성 pH에 대한 증가된 내성, 단백질분해 활성에 대한 증가된 내성(즉, 단백질분해에 대한 감소된 감수성), 감소된 응집성, 증가된 용해도, 및 변경된 온도 프로파일 등과 같은 특성을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 용어는 수크로스 신타제 효소의 적어도 하나의 개선된 특성과 관련하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 참조 수크로스 신타제 폴리펩티드 및/또는 야생형 수크로스 신타제 폴리펩티드 및/또는 또 다른 조작된 수크로스 신타제 폴리펩티드와 비교시에 임의의 효소 특성의 개선을 나타내는 조작된 수크로스 신타제 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, "개선"의 수준을 결정하고, 야생형 및 조작된 수크로스 신타제를 포함한 다양한 수크로스 신타제 폴리펩티드를 결정하고 비교할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "증가된 효소 활성" 및 "향상된 촉매 활성"은 참조 효소와 비교시에 특정 활성(예를 들어, 생성된 산물/시간/단백질 중량)의 증가 또는 기질의 산물로의 전환율(예를 들어, 특정량의 효소를 사용하여 특정 기간에 기질의 출발량에서 산물로의 전환되는 비율)의 증가로 대표될 수 있는 조작된 폴리펩티드의 개선된 특성을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 참조 글리코실트랜스퍼라제 효소와 비교시에 특정 활성(예를 들어, 생성된 산물/시간/단백질 중량)의 증가 또는 기질의 산물로의 전환율(예를 들어, 특정량의 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 특정 기간에 기질의 출발량에서 산물로의 전환되는 비율)의 증가로 대표될 수 있는 본원에서 제공되는 조작된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드의 개선된 특성을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 본원에서 제공되는 개선된 수크로스 신타제 효소에 대해 사용된다. 본 발명의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 및 수크로스 신타제의 효소 활성을 측정하는 예시적인 방법은 실시예에서 제공된다. 그 변화가 증가된 효소 활성을 일으킬 수 있는 K m , V max 또는 k cat 의 고전적인 효소 특성을 비롯하여 효소 활성과 관련된 임의의 특성이 영향받을 수 있다. 예를 들어, 효소 활성의 개선은 상응하는 야생형 효소의 효소 활성의 약 1.1배로부터, 천연 발생 글리코실트랜스퍼라제 또는 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드가 그로부터 유도된 또 다른 조작된 글리코실트랜스퍼라제보다 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배, 150배, 200배 또는 그 초과의 효소 활성일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전환"은 기질(들)의 상응하는 산물(들)로의 효소에 의한 전환(또는 생물 전환)을 의미한다. "전환율"은 특정 조건 하에서 일정 기간 내에 산물로 전환되는 기질의 백분율을 의미한다. 따라서, 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드의 "효소 활성" 또는 "활성"은 특정 기간 내에 기질의 산물로의 "전환율"로서 표현될 수 있다.
"일반종 특성"을 가진 효소(또는 "일반종 효소")는 모 서열과 비교시에 광범위한 기질에 대해 개선된 활성을 나타내는 효소를 의미한다. 일반종 효소는 모든 가능한 기질에 대한 개선된 활성을 반드시 입증하는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 광범위한 입체적으로 및 전자적으로 다양한 기질에 대해 모 유전자와 관련하여 유사하거나 개선된 활성을 보여준다는 점에서 일반종 특성을 가진 글리코실트랜스퍼라제 변이체를 제공한다. 또한, 본원에서 제공되는 일반종 효소는 대사산물/산물의 생성을 증가시키기 위해 광범위한 다양한 분자에 걸쳐 개선되도록 조작되었다.
본원에서 사용되는 용어 "엄격한 혼성화 조건"은 핵산 혼성체가 안정한 조건을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 혼성체의 안정성은 혼성체의 용융 온도(Tm)에 반영된다. 일반적으로, 혼성체의 안정성은 이온 강도, 온도, G/C 함량 및 카오트로픽제의 존재의 함수이다. 폴리뉴클레오티드의 Tm 값은 용융 온도를 예측하기 위한 공지된 방법을 사용하여 계산될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Baldino et al., Meth. Enzymol., 168:761-777 [1989]; Bolton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390 [1962]; Bresslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8893-8897 [1986]; Freier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377 [1986]; Kierzek et al., Biochem., 25:7840-7846 [1986]; Rychlik et al., Nucl. Acids Res., 18:6409-6412 [1990] (erratum, Nucl. Acids Res., 19:698 [1991]); Sambrook et al., supra); Suggs et al., 1981, in Developmental Biology Using Purified Genes, Brown et al. [eds.], pp. 683-693, Academic Press, Cambridge, MA [1981]; 및 Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259 [1991] 참조). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에서 개시되는 폴리펩티드를 코딩하고, 규정된 조건, 예컨대 중등도로 엄격하거나 고도로 엄격한 조건 하에서, 본 발명의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 서열의 상보체와 혼성화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혼성화 엄격성"은 핵산의 혼성화 시의 세척 조건 등과 같은 혼성화 조건과 관련된다. 일반적으로, 혼성화 반응은 보다 낮은 엄격성 조건 하에서 수행된 후, 다양하지만 보다 높은 엄격성의 세척이 실시된다. 용어 "중등도로 엄격한 혼성화"는 표적 DNA에 대해 약 60% 동일성, 바람직하게는 약 75% 동일성, 약 85% 동일성을 갖고, 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 약 90% 초과의 동일성을 갖는, 상보성 핵산에 표적 DNA가 결합할 수 있게 하는 조건을 의미한다. 예시적인 중등도 엄격성 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액, 5x SSPE, 0.2% SDS에서의 혼성화, 이어서 42℃에서 02x SSPE, 0.2% SDS 중에서의 세척이 실시되는 것과 동등한 조건이다. "고엄격성 혼성화"는 일반적으로 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 용액 조건 하에서 결정된 열 용융 온도(Tm)로부터 약 10℃ 이하인 조건을 의미한다. 일부 실시양태에서, 고엄격성 조건은 65℃에 0.018 M NaCl에서 안정한 혼성체를 형성하는 핵산 서열의 혼성화만을 허용하는 조건을 의미한다(즉, 혼성체가 65℃에 0.018 M NaCl에서 안정하지 않으면, 본원에서 고려되는 고엄격성 조건 하에서 안정하지 않을 것이다). 고엄격성 조건은 예를 들면 42℃에 50% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액, 5x SSPE, 0.2% SDS와 동등한 조건에서의 혼성화, 이어서, 65℃에서 0.1x SSPE, 및 0.1% SDS 중에서의 세척이 실시되는 것에 의해 제공될 수 있다. 또 다른 고엄격성 조건은 65℃에서 0.1%(w:v) SDS를 포함하는 5X SSC에서의 혼성화 및 65℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.1x SSC로 세척하는 것과 동등한 조건에서의 혼성화이다. 중등도 엄격성 조건을 비롯한 다른 고엄격성 혼성화는 상기 인용된 참조문헌에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "코돈 최적화"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을, 코딩된 단백질이 관심 유기체에서 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서 유전자 코드는 축퇴성이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 사용은 무작위적이지 않고, 특정 코돈 삼중체에 편향적인 것으로 잘 공지되어 있다. 이러한 코돈 사용 편향성은 제시된 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 카피수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 선택된 숙주 유기체에서의 최적 생성을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "바람직한", "최적의" 및 "고 코돈 사용 편향성" 코돈은 단독으로 또는 조합하여 사용될 때, 단백질 코딩 영역에 있어서 동일 아미노산을 코딩하는 다른 코돈보다 더 높은 빈도로 사용되는 코돈을 상호 교환 가능하게 지칭한다. 바람직한 코돈은 단일 유전자에서의 코돈 사용, 공통적인 기능 또는 기원의 유전자 세트, 고도로 발현된 유전자, 전체 유기체의 집합적 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 관련 유기체의 집합적 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 또는 이들의 조합과 관련하여 결정될 수 있다. 유전자 발현 수준에 따라 그의 빈도가 증가하는 코돈은 일반적으로 발현을 위한 최적 코돈이다. 특정 유기체에서의 코돈 빈도(예를 들어, 코돈 사용, 관련 동의 코돈 사용) 및 코돈 선호도를 결정하기 위해, 예를 들어 클러스터 분석 또는 대응 분석 등을 사용하는 다변량 분석, 및 유전자에 사용된 코돈의 효과적인 수를 비롯한 다양한 방법이 공지되어 있다(예를 들어, GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, Peden, University of Nottingham; McInerney, Bioinform., 14:372-73 [1998]; Stenico et al., Nucl. Acids Res., 222437-46 [1994]; 및 Wright, Gene 87:23-29 [1990] 참조). 코돈 사용 표가 다수의 상이한 유기체에 대해 이용 가능하다(예를 들어, Wada et al., Nucl. Acids Res., 20:2111-2118 [1992]; Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 [2000]; Duret, et al., supra; Henaut and Danchin, in Escherichia coli and Salmonella , Neidhardt, et al. (eds.), ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066 [1996] 참조). 코돈 사용을 수득하기 위한 데이타 공급원은 단백질을 코딩할 수 있는 임의의 이용 가능한 뉴클레오티드 서열에 의존할 수 있다. 이러한 데이타 세트는 발현된 단백질을 코딩하는 것으로 실제 공지된 핵산 서열(예를 들어, 완전한 단백질 코딩 서열-CDS), 발현된 서열 태그(ESTS), 또는 게놈 서열의 예측된 코딩 영역(예를 들어, Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [2001]; Uberbacher, Meth. Enzymol., 266:259-281 [1996]; 및 Tiwari et al., Comput. Appl. Biosci., 13:263-270 [1997] 참조)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제어 서열"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현에 필수적이거나 또는 유리한 모든 성분을 포함한다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대해 천연 성분이거나 또는 외생적일 수 있다. 이러한 제어 서열은 비제한적으로, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터 서열, 신호 펩티드 서열, 개시 서열, 및 전사 종결인자를 포함한다. 최소한으로, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 영역과 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입하는 것을 목적으로 하는 링커가 제공될 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"은 제어 서열이 관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 유도하거나 또는 조절하도록, 관심 폴리뉴클레오티드에 대한 위치에 적절하게(즉, 기능적 관련성으로) 위치된 구성으로 본원에서 정의된다.
"프로모터 서열"은 관심 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 코딩 서열의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 핵산 서열을 의미한다. 프로모터 서열은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 말단절단된 및 혼성체 프로모터를 비롯하여 선택 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 상동성이거나 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다.
용어 "적합한 반응 조건"은 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드가 기질을 바람직한 생성 화합물로 전환할 수 있는 효소 전환 반응 용액의 조건(예를 들어, 효소 로딩, 기질 로딩, 온도, pH, 완충제, 공용매 등의 범위)을 의미한다. 일부 예시적인 "적합한 반응 조건"이 본원에서 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "로딩", 예컨대 "화합물 로딩 또는 "효소 로딩"은 반응의 출발시에 반응 혼합물 내의 성분의 농도 또는 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 효소 전환 반응 과정의 측면에서 "기질"은 본원에서 제공되는 조작된 효소(예를 들어, 조작된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드)이 그에 대해 작용하는 화합물 또는 분자를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이오매스", "바이오매스 기질", "셀룰로스 바이오매스", "셀룰로스 공급 원료" 및 "셀룰로스 기질"은 셀룰로스를 함유하는 임의의 물질을 지칭한다. 바이오매스는 식물, 동물, 또는 미생물로부터 유래될 수 있고, 비제한적으로 농업, 산업, 및 임업 잔류물, 산업 및 도시 폐기물, 및 에너지 목적으로 재배된 육상 및 수생 작물을 포함할 수 있다. 셀룰로스계 기질의 예는 비제한적으로, 목재, 목재 펄프, 종이 펄프, 옥수수 섬유, 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 예컨대 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 밀짚, 보리, 보리짚, 건초, 벼, 볏집, 스위치그라스, 폐지, 종이 및 펄프 가공 폐기물, 목본 식물 또는 초본 식물, 과일 또는 식물성 펄프, 옥수수 속대, 증류 곡물(distillers grain), 풀, 쌀겨, 목화, 대마, 아마, 사이잘(sisal), 사탕수수 버개스(bagasse), 수수, 대두, 스위치그라스, 곡물의 분쇄로부터 얻은 성분, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나무 조각, 톱밥, 관목 및 덤불, 채소, 과일, 및 꽃 및 이의 임의의 적합한 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 셀룰로스계 바이오매스는 비제한적으로 재배 작물(예를 들어, 스위치그라스, 코드 그라스(cord grass), 라이 그라스(rye grass), 억새, 리드 카나리 그라스(reed canary grass), 또는 이의 임의의 조합과 같은 C4 풀을 포함하는 풀), 당 가공 잔류물, 예를 들어 비제한적으로, 버개스(예를 들어, 사탕수수 버개스, 무 펄프[예를 들어, 사탕무], 또는 이의 조합), 농업 잔류물(예를 들어, 대두 줄기, 옥수수 대, 옥수수 섬유, 볏짚, 사탕수수 짚, 벼, 쌀겨, 보리짚, 옥수수 속대, 밀짚, 카놀라짚, 귀리짚, 귀리 껍질, 옥수수 섬유, 대마, 아마, 사이잘, 목화, 또는 이의 임의의 조합), 과일 펄프, 식물성 펄프, 증류 곡물, 임업 바이오매스(예를 들어, 목재, 목재 펄프, 종이 펄프, 재생 목재 펄프 섬유, 톱밥, 경목, 예를 들어 아스펜 목재, 연목, 또는 이의 조합)를 포함한다. 또한, 일부 실시양태에서, 셀룰로스계 바이오매스는 비제한적으로, 종이 및 펄프 가공 폐기물, 신문용지, 마분지 등을 포함하는 셀룰로스계 폐기물 및/또는 임업 폐기물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 셀룰로스계 바이오매스는 섬유의 하나의 종을 포함하는 반면, 일부 대안적인 실시양태에서, 셀룰로스계 바이오매스는 상이한 셀룰로스계 바이오매스로부터 유래된 섬유의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이오매스는 또한 리그니나제 및/또는 셀룰라제 효소를 발현하는 형질전환 식물을 포함할 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 US 2008/0104724 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "슬러리"는 셀룰로스계 기질과 같은 하나 이상의 고체 성분이 분산된 수용액을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 반응으로부터 생성물(예를 들어, 스테비올 글리코시드)의 수율을 "증가시키는 것"은 동일한 기질 및 다른 치환체를 갖지만 관심 성분이 존재하지 않는 동일한 조건하에 수행된 반응과 비교하여, 반응 동안 존재하는 특정 성분(예를 들어, GH 효소)이 더 많은 생성물이 생성되게 할 때 발생한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 셀룰로스 또는 다른 폴리사카라이드를 "가수분해하는 것"은 기질 내에 존재하는 2개의 모노사카라이드 사이의 글리코시드 결합 중 적어도 일부가 가수분해되어, 이전에 결합된 2개의 단량체를 서로 분리할 때 발생한다.
반응을 촉매하는데 관여하는 다른 효소와 비교하여 특정 효소의 양이 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.1%(wt/wt) 미만이면, 반응은 상기 특정 효소가 "실질적으로 없다"고 언급된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 액체(예를 들어, 배양 브로쓰)를 "분획화하는 것"은 분리 과정(예를 들어, 염 침전, 컬럼 크로마토그래피, 크기 배제, 및 여과) 또는 이러한 과정의 조합을 적용하여 원하는 단백질(예를 들어 레바우디오시드)이 초기 액체 생성물에서보다 용액에서 더 큰 백분율의 총 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "출발 조성물"은 적어도 하나의 기질을 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 임의의 셀룰로스계 기질을 포함한다.
일부 대안적인 실시양태에서, 용어 "출발 조성물"은 적어도 하나의 스테비올 글리코시드를 포함하는 임의의 조성물을 지칭하며, 스테비올 글리코시드 중 하나 이상은 생체 전환을 위한 기질(들)로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 수용액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 스테비오시드, 스테비올모노시드, 스테비올비오시드, 루부소시드, 둘코시드 B, 둘코시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 G, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 F, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 H, 레바우디오시드 L, 레바우디오시드 K, 레바우디오시드 J, 레바우디오시드 M(레바우디오시드 X로도 지칭됨), 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 N, 레바우디오시드 O, 및 합성 스테비올 글리코시드(예를 들어, 효소적으로 글루코실화된 스테비올 글리코시드)로부터 선택된 적어도 하나의 스테비올 글리코시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 2개 이상의 스테비올 글리코시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 스테비아 레바우디아나 식물 물질(예를 들어, 잎)의 정제로부터 수득된 추출물을 포함한다. 일부 대안적인 실시양태에서, 출발 조성물은 상업적으로 이용 가능한 스테비아 추출물(들)을 포함한다. 추가의 출발 조성물은 스테비올 글리코시드를 단리하고 정제하는데 사용되는 과정의 부산물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 정제되거나 부분적으로 정제된 스테비올 글리코시드 기질(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물은 약 99 중량% 초과의 특정 스테비올 글리코시드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 출발 조성물은 적어도 하나의 스테비올 글리코시드(예를 들어, 레바우디오시드 A, D 등)를 생성하기 위한 기질로서 적어도 하나의 글리코시드 및 셀룰로스계 성분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 효소에 의한 전환 과정의 측면에서 "생성물"은 기질에 대한 효소 폴리펩티드의 작용으로부터 비롯되는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 상기 용어는 기질에 대한 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드의 작용으로부터 비롯되는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 생성물은 스테비올 글리코시드이다. 일부 실시양태에서, 생성물은 스테비오시드, 스테비올모노시드, 스테비올비오시드, 루부소시드, 둘코시드 B, 둘코시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 G, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 F, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 I, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 H, 레바우디오시드 L, 레바우디오시드 K, 레바우디오시드 J, 레바우디오시드 M(레바우디오시드 X로도 지칭됨), 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 N, 레바우디오시드 O, 및 합성 스테비올 글리코시드(예를 들어, 효소에 의해 글루코실화된 스테비올 글리코시드)로부터 선택된 적어도 하나의 스테비올 글리코시드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배양"은 임의의 적합한 조건 하에(예를 들어, 액체, 겔 또는 고체 배지를 사용하여) 미생물 세포의 집단의 성장을 지칭한다.
재조합 폴리펩티드는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 관심 있는 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 플라스미드와 같은 벡터에 클로닝되어, 이. 콜라이 등과 같은 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 재조합 폴리펩티드의 변이체는 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 실제로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 매우 다양한 상이한 돌연변이 유발 기술이 존재한다. 또한, 돌연변이 유발 키트가 많은 상업적인 분자 생물학 공급업체로부터 이용가능하다. 정의된 아미노산에서의 특정 치환(부위 지정), 유전자의 국소 영역에서의 특이적 또는 무작위 돌연변이(영역 특이적), 또는 전체 유전자에 걸친 무작위 돌연변이 유발(예를 들어, 포화 돌연변이 유발)을 유도하는 방법이 이용 가능하다. 효소 변이체를 생성하기 위한 많은 적합한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 비제한적으로, PCR, 카세트 돌연변이 유발, 유전자 합성, 오류 빈발 PCR, 셔플링, 및 화학적 포화 돌연변이 유발, 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 사용한 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA의 부위 지정 돌연변이 유발을 포함한다. 돌연변이 유발 및 유도된 진화 방법은 효소 코딩 폴리뉴클레오티드에 용이하게 적용되어, 발현, 스크리닝 및 검정될 수 있는 변이체 라이브러리를 생성할 수 있다. 임의의 적합한 돌연변이 유발 및 유도된 진화 방법이 본 발명에서 사용될 수 있고, 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 5,837,458, 5,928,905, 6,096,548, 6,117,679, 6,132,970, 6,165,793, 6,180,406, 6,251,674, 6,265,201, 6,277,638, 6,287,861, 6,287,862, 6,291,242, 6,297,053, 6,303,344, 6,309,883, 6,319,713, 6,319,714, 6,323,030, 6,326,204, 6,335,160, 6,335,198, 6,344,356, 6,352,859, 6,355,484, 6,358,740, 6,358,742, 6,365,377, 6,365,408, 6,368,861, 6,372,497, 6,337,186, 6,376,246, 6,379,964, 6,387,702, 6,391,552, 6,391,640, 6,395,547, 6,406,855, 6,406,910, 6,413,745, 6,413,774, 6,420,175, 6,423,542, 6,426,224, 6,436,675, 6,444,468, 6,455,253, 6,479,652, 6,482,647, 6,483,011, 6,484,105, 6,489,146, 6,500,617, 6,500,639, 6,506,602, 6,506,603, 6,518,065, 6,519,065, 6,521,453, 6,528,311, 6,537,746, 6,573,098, 6,576,467, 6,579,678, 6,586,182, 6,602,986, 6,605,430, 6,613,514, 6,653,072, 6,686,515, 6,703,240, 6,716,631, 6,825,001, 6,902,922, 6,917,882, 6,946,296, 6,961,664, 6,995,017, 7,024,312, 7,058,515, 7,105,297, 7,148,054, 7,220,566, 7,288,375, 7,384,387, 7,421,347, 7,430,477, 7,462,469, 7,534,564, 7,620,500, 7,620,502, 7,629,170, 7,702,464, 7,747,391, 7,747,393, 7,751,986, 7,776,598, 7,783,428, 7,795,030, 7,853,410, 7,868,138, 7,783,428, 7,873,477, 7,873,499, 7,904,249, 7,957,912, 7,981,614, 8,014,961, 8,029,988, 8,048,674, 8,058,001, 8,076,138, 8,108,150, 8,170,806, 8,224,580, 8,377,681, 8,383,346, 8,457,903, 8,504,498, 8,589,085, 8,762,066, 8,768,871, 9,593,326, 및 관련 미국, 및 PCT 및 미국 이외의 대응 특허; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; 및 WO 2009/152336 참조).
일부 실시양태에서, 돌연변이 유발 처리 후 수득한 효소 클론은 효소 제제를 규정된 온도(또는 다른 검정 조건)에 적용하고 열처리 또는 다른 적합한 검정 조건 조건 후에 잔류하는 효소 활성의 양을 측정함으로써 스크리닝된다. 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 클론을 이어서 유전자로부터 단리하고, 시퀀싱하여 뉴클레오티드 서열 변화(존재할 경우)를 확인하고, 숙주 세포에서 효소를 발현시키기 위해 사용한다. 발현 라이브러리로부터 효소 활성을 측정하는 것은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법(예를 들어, 표준 생화학 기술, 예컨대 HPLC 분석)을 사용하여 수행할 수 있다.
변이체가 생성된 후, 이들은 임의의 원하는 특성(예를 들어, 높거나 증가된 활성, 또는 낮거나 감소된 활성, 증가된 열 활성, 증가된 열 안정성, 및/또는 산성 pH 안정성 등)에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, "재조합 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드"(본원에서 "조작된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드", "변이체 글리코실트랜스퍼라제 효소", "글리코실트랜스퍼라제 변이체" 및 "글리코실트랜스퍼라제 조합 변이체"로도 지칭됨)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "재조합 수크로스 신타제 폴리펩티드"(본원에서 "조작된 수크로스 신타제 폴리펩티드", "변이체 수크로스 신타제 효소", "수크로스 신타제 변이체" 및 "수크로스 신타제 조합 변이체"로도 지칭됨)가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 DNA 서열을 세포 내로 도입하기 위한 DNA 구축물이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 DNA 서열에서 코딩된 폴리펩티드의 적합한 숙주에서의 발현을 달성할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현을 유도하기 위해 DNA 서열(예를 들어, 도입 유전자)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 가지며, 일부 실시양태에서, 또한 전사 종결인자 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 비제한적으로, 전사, 전사후 변형, 번역, 및 번역후 변형을 포함하는, 폴리펩티드의 생성과 관련된 임의의 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생성하다"는 세포에 의한 단백질 및/또는 다른 화합물의 생성을 지칭한다. 이 용어는 비제한적으로, 전사, 전사후 변형, 번역, 및 번역후 변형을 포함하는 폴리펩티드의 생성과 관련된 임의의 단계를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 프로모터 서열, 신호 펩티드, 종결인자 서열 등)은 2개의 서열이 자연에서 회합되어 있지 않는 경우, 그것이 작동가능하게 연결된 또 다른 서열에 대해 "이종성"이다. 예를 들어, "이종성 폴리뉴클레오티드"는 실험 기술에 의해 숙주 세포 내로 도입되는 임의의 폴리뉴클레오티드이며, 이는 숙주 세포로부터 제거되고, 실험 조작을 거친 다음, 숙주 세포 내로 재도입되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포" 및 "숙주 균주"는 본원에서 제공되는 DNA(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 발현 벡터에 적합한 숙주를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축된 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 원핵 또는 진핵 세포이다.
용어 "유사체"는 참조 폴리펩티드와 70% 초과의 서열 동일성 내지 100% 미만의 서열 동일성(예를 들어, 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 유사체는 비제한적으로, 자연 발생 아미노산뿐만 아니라 호모아르기닌, 오르니틴 및 노르발린을 포함하는 하나 이상의 자연 발생하지 않는 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 유사체는 또한 하나 이상의 D-아미노산 잔기 및 2개 이상의 아미노산 잔기 사이에 비펩티드 연결을 포함한다.
용어 "유효량"은 원하는 결과를 생성하는데 충분한 양을 의미한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 통상적인 실험을 사용하여 유효량을 결정할 수 있다.
용어 "단리된" 및 "정제된"은 자연적으로 회합된 적어도 하나의 다른 성분으로부터 제거된 분자(예를 들어, 단리된 핵산, 폴리펩티드 등) 또는 다른 성분을 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "정제된"은 절대적인 순도를 요구하지 않으며, 오히려 상대적인 정의로서 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "입체선택성"은 하나의 입체이성질체가 또 다른 입체이성질체보다 화학적 또는 효소적 반응에서 우선적으로 형성되는 것을 지칭한다. 입체선택성은 하나의 입체이성질체의 형성이 다른 입체이성질체보다 선호되는 경우 부분적일 수 있거나, 또는 오직 하나의 입체이성질체만 형성되는 경우 완전할 수 있다. 입체이성질체가 거울상이성질체인 경우, 입체선택성은 두 거울상이성질체의 합에서 하나의 거울상이성질체의 분율(전형적으로 백분율로서 보고됨)인 거울상이성질체 선택성으로 불린다. 이것은 식 [주요 거울상이성질체 - 소수 거울상이성질체]/[주요 거울상이성질체 + 소수 거울상이성질체]에 따라 이로부터 계산된 거울상이성질체 과량("e.e.")으로서(전형적으로 백분율로서) 통상적으로 대안적으로 관련 기술 분야에 보고된다. 입체이성질체가 부분입체이성질체인 경우, 입체선택성은 통상적으로 대안적으로 부분입체이성질체 과량("d.e.")으로 보고되는, 2개의 부분입체이성질체의 혼합물에서 하나의 부분입체이성질체의 분율(전형적으로 백분율로서 보고됨)인 부분입체선택성으로 불린다. 거울상이성질체 과량 및 부분입체이성질체 과량은 입체이성질체 과량의 유형이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "위치선택성" 및 "위치선택적 반응"은 결합 형성 또는 절단의 하나의 방향이 다른 가능한 모든 방향보다 우선적으로 발생하는 반응을 지칭한다. 반응은 구별이 완전하면 완전히(100%) 위치선택적일 수 있고, 하나의 부위에서의 반응 생성물이 다른 부위에서의 반응 생성물보다 우세한 경우 실질적으로 위치선택적(적어도 75%)이거나, 또는 부분적으로 위치선택적(x%, 여기서 백분율은 관심 반응에 의존적으로 설정됨)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "열안정성"은 동일한 상승된 온도에 노출된 야생형 효소와 비교하여 일정 시간(예를 들어, 0.5-24시간) 동안 상승된 온도(예를 들어, 40-80℃)에 노출된 후 유사한 활성(예를 들어 60% 내지 80% 초과)을 유지하는 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "용매 안정성"은 동일한 농도의 동일한 용매에 노출된 야생형 효소와 비교하여 일정 시간(예컨대, 0.5-24시간) 동안 다양한 농도(예를 들어, 5-99%)의 용매(에탄올, 이소프로필 알콜, 디메틸술폭시드[DMSO], 테트라히드로푸란, 2-메틸테트라히드로푸란, 아세톤, 톨루엔, 부틸 아세테이트, 메틸 tert-부틸에테르 등)에 노출된 후 유사한 활성(예컨대, 60% 내지 80% 초과)을 유지하는 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "열 및 용매 안정성"은 열안정하고 용매 안정한 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "환원제"는 Fe+3을 Fe+2로 전환할 수 있는 화합물 또는 작용제를 지칭한다. 예시적인 환원제는 아스코르브산이며, 이는 일반적으로 L-아스코르브산의 형태이다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택적" 및 "선택적으로"는 추후 설명되는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있다는 것과, 상기 설명이 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 하나 이상의 선택적인 치환체를 함유하는 것으로 설명된 임의의 분자와 관련하여, 입체적으로 실제적인 및/또는 합성적으로 실현가능한 화합물만이 포함된다는 것을 의미함을 이해할 것이다. "선택적으로 치환된"은 용어 또는 일련의 화학적 기에 있는 모든 후속 개질체를 지칭한다.
글리코실화
글리코실화는 안정성, 약력학, 용해성, 및 막 수송을 포함하는 천연 및 합성 생성물의 많은 특성을 변경할 수 있다. 본 발명은 다양한 아글리콘(aglycone) 및 글리코실화된 기질로부터 새로운 글리코실화된 화합물을 생성하기에 적합한 조성물, 방법 및 효소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 용이하게 수득된 전구체로부터 공지된 글리코실화된 화합물을 효율적으로 생성하는 수단을 제공한다. 일부 경우, 글리코실화는 화학적 합성 방법을 통해 달성된다. 그러나, 이들 방법은 전형적으로 바람직하지 않은 화학물질 및 과정을 필요로 하며, 혼합된 생성물(예를 들어, 부정확한 위치에서 연결을 갖고/갖거나 원하지 않는 아노머 배열을 갖는)을 야기할 수 있다. 또한, 탄수화물 화학은 다수의 보호 및 탈보호 단계를 필요로 한다.
이와 대조적으로, 글리코실화 효소는 온화한 조건 하에서 활성일 수 있으며, 단일 단계에서 높은 위치 선택성 및 입체특이성을 부여할 수 있다. 많은 천연 발생하는 글리코실화된 대사산물은 다양한 당 뉴클레오시드로부터 당 모이어티를 전달하는 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 생체 내에서 생성된다. 항균, 항종양, 천연 감미 특성 등을 가진 많은 2차 대사산물을 비롯한 많은 분자는 β-글리코시드 연결로 변형된 비-리보솜 펩티드, 폴리케티드 또는 테르페노이드 골격을 포함한다. 식물로부터 추출된 다수의 디테르펜 글리코시드, 즉 스테비아 레바우디아나 베르토니(Bertoni)는 β-연결된 글루코스 분자를 함유한다. 당연히, 이러한 분자는 UDP-글루코스 의존적 글리코실 트랜스퍼라제 효소를 사용하여 생체 내에서 글리코실화된다. 본 발명은 새로운 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 뉴클레오시드 디포스포글루코스로부터 기질(예를 들어, 레바우디오시드 D 또는 스테비오시드)로 글루코스 모이어티를 전달하고, 하나 이상의 β-글루코스 연결된 생성물(예를 들어, 레바우디오시드 M, 레바우디오시드 A 또는 레바우디오시드)을 생성하기 위해 사용되는 방법을 제공한다(도 1 참조). 그러나, 시험관 내에서 사용될 때, UDP-글루코스는 엄청나게 비싸고/비싸거나 이용할 수 없을 수 있다. 추가의 일부 실시양태에서, 신타제(예를 들어, 수크로스 신타제 또는 트레할로스 신타제)는 반대 방향으로 작용하여, 뉴클레오시드 디포스페이트 및 글루코스 공여체(예를 들어, 수크로스, 트레할로스 또는 전분)로부터 뉴클레오시드 디포스포글루코스 화합물을 형성한다.
따라서, 글리코실화는 천연 감미제, 예컨대 달콤한 허브인 스테비아 레바우디아나 베르토니로부터 유도된 것의 생성에 사용된다. 상기 제시된 바와 같이, 이러한 식물은 많은 다른 고효능 감미제의 것보다 더 우수한 고강도 감미제 및 감각 특성을 특징으로 하는 다수의 디테르펜 글리코시드를 생성한다. 상기 언급된 달콤한 글리코시드는 공통적인 아글리콘(즉, 스테비올)을 갖고, C13 및 C19 위치에서 탄수화물 잔기의 숫자 및 유형이 상이하다. 스테비올 글리코시드는 분자 구조뿐만 아니라, 그의 맛 특성도 서로 상이하다. 대체로, 스테비오시드는 수크로스보다 89-143배 더 달콤한 것으로 보고되었지만, 레바우디오시드 A는 수크로스보다 85-242배 더 달콤한 것으로 보고되어 있다(예를 들어, Kasai et al., Nippon Kagaku Kaishi, 1981:726-735 [1981] 참조). 이러한 공통적인 화합물 중에서, 레바우디오시드 A는 최소의 톡쏘는 맛, 최소의 쓴맛 그리고 최소의 지속되는 뒷맛을 갖는다. 따라서, 이는 주요 스테비올 글리코시드 중 가장 유리한 감각 속성을 갖는다. 그러나, 레바우디오시드 A는 스테비아 레바우디아나 베르토니로부터 단리된 전체 글리코시드 중 소량(약 20%)만을 구성하며, 스테비오시드(약 70%) 및 소량의 스테비올 글리코시드가 나머지를 구성한다(예를 들어, FAO, Chemical and Technical Assessment, 63rd JECFA, Steviol Glycosides [2004] 참조). 레바우디오시드 X로도 알려진, 자연적으로 발생하지만 덜 풍부한 화합물인 레바우디오시드 M은 수크로스보다 200-350배 더 달콤하고, 레바우디오시드 A에 비해 뒷맛이 감소한다(예를 들어, Prakash et al., Food, 3:162-175 [2014] 참조). 따라서, 예를 들어 레바우디오시드 M의 천연 감미료로서의 상업화에 관심이 있지만, 현재 이 화합물을 합성하기 위한 유효한 상업적 경로는 없다.
조작된
글리코실트랜스퍼라제
폴리펩티드
본 발명은 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드의 제조 방법 및 폴리펩티드의 사용 방법을 제공한다. 설명이 폴리펩티드와 관련되는 경우, 이것은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 설명한다는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 야생형 GT 효소와 비교하여 개선된 특성을 갖는 조작된 비천연 발생 GT 효소를 제공한다. 임의의 적합한 반응 조건이 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 트랜스퍼라제 반응을 수행하기 위해 조작된 폴리펩티드의 개선된 특성을 분석하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 반응 조건은 아래에서 및 실시예에서 추가로 설명되는 바와 같이 폴리펩티드의 농도 또는 양, 기질, 보조 기질, 완충제, 공용매, pH, 온도 및 반응 시간을 포함하는 조건, 및/또는 고체 지지체 상에 고정화된 폴리펩티드 사용 조건에 대해 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조작된 GT 폴리펩티드는 스테비올 글리코시드를 추가로 글리코실화된 스테비올 글리코시드로의 전환(예를 들어, 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A로의 또는 레바우디오시드 D에서 레바우디오시드 M으로의 전환) 및 아데닌 디포스포글루코스 또는 기타 뉴클레오시드 디포스페이트의 사용에서 야생형 GT 효소와 비교하여 개선된 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 GT 효소는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 4256, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 684, 7388 및/또는 8088과 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 GT 효소는 서열 번호 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 7324, 및/또는 7784와 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 베타-1,2 글리코실트랜스퍼라제 변이체이다. 일부 실시양태에서, 조작된 GT 효소는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088과 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 베타-1,3 글리코실트랜스퍼라제 변이체이다. 추가의 일부 실시양태에서, 조작된 GT 폴리펩티드는 N-말단과 C-말단 사이에 유전자 수준에서 펩티드 링커가 혼입되고 새로운 아미노산 위치가 새로운 N-말단 및 C-말단의 위치로서 선택되는 원형의 치환된(circular permuted) 단백질이다. 일부 실시양태에서, 원형의 치환된 GT 효소는 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088과 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 원형의 치환된 GT 효소는 서열 번호 32와 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, GT 효소는 본원에서 제시되는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 다음 서열 번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공한다:
추가의 일부 실시양태에서, 본 발명은 다음 서열 번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제를 제공한다:
일부 실시양태에서, 반응 조건을 보충하기 위해 추가의 반응 성분 또는 추가의 기술이 이용된다. 일부 실시양태에서, 이들은 효소를 안정화하거나 불활성화를 억제하고, 생성물 억제를 감소시키고, 반응 평형을 글루코실화 생성물 형성으로 이동시키는 조치를 취하는 것을 포함한다.
추가의 일부 실시양태에서, 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환시키기 위한 상기 설명된 임의의 방법은 생성물 화합물의 추출; 단리; 정제; 및 결정화, 여과 또는 동결건조로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 개시된 방법에 의해 생성된 생체 촉매 반응 혼합물로부터 글루코실화된 생성물을 추출, 단리, 정제 및/또는 결정화하기 위한 방법, 기술 및 프로토콜은 통상의 기술자에게 공지되어 있고/있거나, 통상적인 실험을 통해 이용 가능하다. 추가로, 예시적인 방법이 하기 실시예에서 제시된다.
조작된
수크로스
신타제
폴리펩티드
본 발명은 조작된 수크로스 신타제(SuS) 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드의 제조 방법 및 폴리펩티드의 사용 방법을 제공한다. 설명이 폴리펩티드와 관련되는 경우, 이것은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 설명한다는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 야생형 SuS 효소와 비교하여 개선된 특성을 갖는 조작된 비천연 발생 SuS 효소를 제공한다. 임의의 적합한 반응 조건이 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 신타제 반응을 수행하기 위해 조작된 폴리펩티드의 개선된 특성을 분석하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 반응 조건은 아래에서 및 실시예에서 추가로 설명되는 바와 같이 조작된 SuS의 농도 또는 양, 기질(들), 완충제(들), 용매(들), pH, 온도 및 반응 시간을 포함하는 조건, 및/또는 고체 지지체 상에 고정화된 조작된 SuS 폴리펩티드 사용 조건에 대해 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조작된 SuS 폴리펩티드는 본원에서 설명되는 반응에서와 같이 야생형 SuS 효소와 비교하여 개선된 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 SuS 효소는 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420과 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 조작된 SuS 효소를 제공하고, 여기서 SuS 효소의 폴리펩티드는 다음 서열 번호에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함한다:
일부 실시양태에서, 반응 조건을 보충하기 위해 추가의 반응 성분 또는 추가의 기술이 이용된다. 일부 실시양태에서, 이들은 효소를 안정화하거나 불활성화를 억제하고, 생성물 억제를 감소시키고, 반응 평형을 글루코실화 생성물 형성으로 이동시키는 조치를 취하는 것을 포함한다.
추가의 일부 실시양태에서, 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환시키기 위한 상기 설명된 임의의 방법은 생성물 화합물(들)의 추출, 단리, 정제, 결정화, 여과 및/또는 동결건조로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에 의해 생성된 생체 촉매 반응 혼합물로부터 생성물(예를 들어, 레바우디오시드)을 추출, 단리, 정제 및/또는 결정화하기 위한 방법, 기술 및 프로토콜은 통상의 기술자에게 공지되어 있고/있거나, 통상적인 실험을 통해 이용 가능하다. 추가로, 예시적인 방법이 하기 실시예에서 제시된다.
조작된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 본원에서 설명되는 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현을 제어하여 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 하나 이상의 이종성 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 조작된 효소 폴리펩티드(들)를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 구축물은 상응하는 효소 폴리펩티드(들)를 발현시키기 위해 적절한 숙주 세포 내로 도입된다.
통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 단백질 서열의 이용 가능성 및 다양한 아미노산에 상응하는 코돈의 지식은 대상 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드의 설명을 제공한다. 동일한 아미노산이 대체 또는 동의 코돈에 의해 코딩되는 유전적 코드의 축퇴성은 극히 많은 수의 핵산이 제조될 수 있도록 하며, 이들은 모두 조작된 효소(예를 들어, GT 또는 SuS)를 코딩한다. 따라서, 본 발명은 가능한 코돈 선택에 기초하여 조합을 선택함으로써 본원에서 설명되는 효소 폴리펩티드를 코딩하는 효소 폴리뉴클레오티드의 각각의 및 모든 가능한 변이를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 제공하고, 이러한 모든 변이는 실시예에서(예를 들어, 다양한 표에서) 제시되는 아미노산 서열을 비롯하여 본원에서 설명되는 임의의 폴리펩티드에 대해 구체적으로 개시되어 있는 것으로 고려되어야 한다.
일부 실시양태에서, 코돈은 바람직하게는 단백질 생성을 위해 선택된 숙주 세포에 의한 이용을 위해 최적화된다. 예를 들어, 박테리아에서 사용되는 바람직한 코돈은 전형적으로 박테리아에서의 발현에 사용된다. 결과적으로, 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드는 전장 코딩 영역 내의 코돈 위치의 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과로 바람직한 코돈을 함유한다.
일부 실시양태에서, 효소 폴리뉴클레오티드는 본원에서 개시되는 특성을 갖는 효소 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 폴리펩티드는 본원에서 제시되는 서열 번호로부터 선택되는 참조 서열에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 임의의 변이체(예를 들어, 실시예에서 제공되는 것)의 아미노산 서열, 및 참조 폴리뉴클레오티드(들)와 비교될 때 하나 이상의 잔기 차이, 또는 실시예에서 개시되는 임의의 변이체의 아미노산 서열(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기 위치)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4, 8, 32, 232, 348, 548, 562, 696, 758, 770, 792, 954, 1002, 1054, 2600, 2718, 2814, 2884, 3016, 3082, 3244, 3346, 3502, 3696, 3956, 4256, 4550, 4684, 4838, 4876, 5066, 5290, 5372, 5562, 5708, 5976, 6138, 6288, 6468, 6864, 7324, 7388, 7784, 및/또는 8088로부터 선택된다. 대안적인 일부 실시양태에서, 참조 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 참조 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 7, 31, 231, 347, 547, 561, 695, 757, 769, 791, 953, 1001, 1053, 2599, 2717, 2813, 2883, 3015, 3081, 3243, 3345, 3501, 3695, 3955, 4255, 4549, 4683, 4837, 4875, 5065, 5289, 5371, 5561, 5707, 5975, 6137, 6287, 6467, 6863, 7323, 7387, 7783, 및/또는 8087로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 757, 769, 791, 953, 1001, 1053, 2599, 2717, 2813, 2883, 3015, 3081, 3243, 3345, 3501, 3695, 3955, 4255, 4549, 7323, 및/또는 7783으로부터 선택되고, 대안적인 일부 실시양태에서, 참조 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 7, 31, 231, 347, 547, 561, 695, 4683, 4837, 4875, 5065, 5289, 5371, 5561, 5707, 5975, 6137, 6287, 6467, 6863, 7387, 및/또는 8087로부터 선택된다. 추가의 일부 실시양태에서, 참조 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 73, 1079, 1157, 1221, 1391, 1455, 1581, 1763, 1803, 1839, 2063, 2431, 2509, 7505, 및/또는 8419로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드는 다음 서열 번호에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함한다:
추가의 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드는 다음 서열 번호에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함한다:
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 매우 엄격한 조건 하에서 본원에서 제공되는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 선택된 참조 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보체, 또는 본원에서 제공되는 임의의 변이체 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 참조 서열과 비교하여 하나 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 임의의 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 효소 폴리펩티드의 발현을 촉진하기 위해 다양한 방식으로 조작된다. 일부 실시양태에서, 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제어 서열이 효소 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위해 존재하는 발현 벡터에 포함된다. 이를 벡터 내로 삽입하기 전에 단리된 폴리뉴클레오티드의 조작이 이용되는 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변형하기 위한 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 제어 서열은 다른 서열 중에서, 프로모터, 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 프로모터는 숙주 세포의 선택에 기초하여 선택될 수 있다. 박테리아 숙주 세포의 경우, 본 개시내용의 핵산 구축물의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터는 이. 콜라이 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자(dagA), 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자(sacB), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자(amyM), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 바실루스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(penP), 바실루스 섭틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵 베타-락타마제 유전자(예를 들어, Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci.USA 75: 3727-3731 [1978] 참조)로부터 수득된 프로모터뿐만 아니라, tac 프로모터(예를 들어, DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983] 참조)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사상 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 프로모터는 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르틱 프로테이나제, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니거 산 안정성 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니거 또는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제(glaA), 리조무코르 미에헤이 리파제, 아스페르길루스 오리재 알칼리성 프로테아제, 아스페르길루스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라제, 아스페르길루스 니둘란스 아세트아미다제, 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신 유사 프로테아제(예를 들어, WO 96/00787 참조)에 대한 유전자로부터 수득된 프로모터뿐만 아니라, NA2-tpi 프로모터(아스페르길루스 니거 중성 알파-아밀라제 및 아스페르길루스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로부터의 프로모터의 혼성체), 및 이의 돌연변이체 프로모터, 말단절단된 프로모터, 및 혼성체 프로모터를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 효모 세포 프로모터는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지애 알콜데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(ADH2/GAP), 및 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터 유래될 수 있다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 프로모터는 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992] 참고).
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 적합한 전사 종결인자 서열(즉, 전사를 종결시키기 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 서열)이다. 일부 실시양태에서, 종결인자 서열은 효소 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택되는 숙주 세포에서 기능을 보이는 임의의 적합한 종결인자가 본 발명에서 사용된다. 사상 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 전사 종결인자는 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제, 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스페르길루스 니거 알파-글루코시다아제, 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신 유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다. 효모 숙주 세포를 위한 예시적인 종결인자는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라제, 사카로마이세스 세레비지애 시토크롬 C(CYC1), 및 사카로마이세스 세레비지애 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 종결인자는 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예컨대, Romanos et al., 상기 문헌 참고)
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 적합한 리더 서열(즉, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역)이다. 일부 실시양태에서, 리더 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능을 보이는 임의의 적합한 리더 서열이 사용될 수 있다. 사상 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 리더는 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제 및 아스페르길루스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포를 위한 적합한 리더는 비제한적으로, 사카로마이세스 세레비지애 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비지애 알콜 데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 폴리아데닐화 서열(즉, 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결되고 전사될 때 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하기 위한 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되는 서열)이다. 선택된 숙주 세포에서 기능을 보이는 임의의 적합한 폴리아데닐화 서열이 본 발명에 사용될 수 있다. 사상 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 폴리아데닐화 서열은 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제, 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 푸사리움 옥시스포룸 트립신 유사 프로테아제, 및 아스페르길루스 니거 알파-글루코시다제에 대한 유전자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포를 위한 유용한 폴리아데닐화 서열이 또한 공지되어 있다(예를 들어, Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995] 참고).
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 신호 펩티드(즉, 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하고 코딩되는 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 유도하는 코딩 영역)이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 분절과 번역 리딩 프레임으로 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 본질적으로 함유한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 코딩 서열의 5' 말단은 코딩 서열에 대해 외인성인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유한다. 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 유도하는 임의의 신호 펩티드 코딩 영역이 조작된 폴리펩티드(들)의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아 숙주 세포를 위한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 바실루스 NClB 11837 말토제닉 아밀라제, 바실루스 스테아로써모필루스 알파-아밀라제, 바실루스 리케니포르미스 섭틸리신, 바실루스 리케니포르미스 베타-락타마제, 바실루스 스테아로써모필루스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM), 및 바실루스 섭틸리스 prsA에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 추가의 신호 펩티드가 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Simonen and Palva, Microbiol Rev, 57:109-137 [1993] 참고). 일부 실시양태에서, 사상 진균 숙주 세포를 위한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 니거 중성 아밀라제, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제, 리조무코르 미에헤이 아스파르틱 프로테이나제, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라제, 및 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파제에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포를 위한 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지애 인버타제에 대한 유전자로부터의 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 제어 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역이다. 생성된 폴리펩티드는 "프로효소", "프로폴리펩티드", 또는 "자이모겐"으로 언급된다. 프로폴리펩티드는 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매분해 또는 자가 촉매분해 절단에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실루스 섭틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE), 바실루스 섭틸리스 중성 프로테아제(nprT), 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자, 리조무코르 미에헤이 아스파르틱 프로테이나제, 및 미셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 락타제에 대한 유전자를 포함하고, 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다(예를 들어, WO 95/33836 참고). 신호 펩티드와 프로펩티드 영역 둘 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 다음에 위치하고, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 다음에 위치한다.
일부 실시양태에서, 조절 서열이 또한 이용된다. 이들 서열은 숙주 세포의 성장과 관련하여 폴리펩티드의 발현의 조절을 용이하게 한다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현이 켜지거나 꺼지게 하는 것이다. 원핵 숙주 세포에서, 적합한 조절 서열은 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포에서, 적합한 조절 시스템은 ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사상 진균에서, 적합한 조절 서열은 TAKA 알파-아밀라아제 프로모터, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제 프로모터, 및 아스페르길루스 오리재 글루코아밀라제 프로모터를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들이 도입되는 숙주의 유형에 따라 하나 이상의 발현 조절 영역, 예컨대 프로모터 및 종결인자, 복제 기점 등을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 설명한 다양한 핵산 및 제어 서열은 함께 연결되어, 하나 이상의 편리한 제한 부위에 효소 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 삽입 또는 치환을 허용하는 상기 제한 부위를 포함하는 재조합 발현 벡터를 생성한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 핵산 서열 또는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구축물을 발현을 위한 적절한 벡터 내로 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터의 생성을 수반하는 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 발현을 위한 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터에 위치한다.
재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차를 편리하게 적용할 수 있고 효소 폴리뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있는 임의의 적합한 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 상용성에 의존할 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 자율 복제 벡터(즉, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체와 같이 그의 복제가 염색체 복제에 독립적인 염색체외 실체로서 존재하는 벡터)이다. 벡터는 자가 복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적인 일부 실시양태에서, 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 게놈 내로 통합되고 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 벡터이다. 또한, 일부 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈 내로 도입되는 총 DNA를 함께 함유하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존이 사용된다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선택 가능 마커를 함유한다. "선택 가능 마커"는 그의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구체(auxotroph)에 대한 자가영양성(prototrophy) 등을 제공하는 유전자이다. 박테리아 선택 가능 마커의 예는 바실루스 섭틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 효모 숙주 세포를 위한 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사상 진균 숙주 세포에서 사용하기 위한 선택 가능 마커는 amdS(예를 들어, 에이. 니쿨란스 또는 에이. 오리재로부터의 아세트아미다제), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제), bar(예를 들어, 에스. 히그로스코피쿠스(S. hygroscopicus)로부터의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), hph(히그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD(니트레이트 리덕타제), pyrG(예를 들어, 에이. 니쿨란스 또는 에이. 오리재로부터의 오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제), sC(술페이트 아데닐트랜스퍼라제), 및 trpC(안트라닐레이트 신타제)뿐만 아니라 이들의 동등물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 숙주 세포에서 조작된 효소(들)의 발현을 위해 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는데 사용하기 위한 숙주 세포는 관련 기술 분야에 널리 알려져 있으며, 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(ATCC 등록 번호 201178); 곤충 세포, 예컨대 초파리(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS, BHK, 293, 및 보우스 흑색종(Bowes melanoma) 세포; 및 식물 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 숙주 세포는 에셔리키가 콜라이 균주(예를 들어, W3110(△fhuA) 및 BL21)이다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 조작된 효소 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조작된 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 설명된 바와 같이 효소 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 성장 조건은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 효소 폴리펩티드의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 임의의 적합한 방법이 본 발명에서 사용될 수 있음이 고려된다. 적합한 기술은 전기천공, 유전자총(biolistic) 입자 충격, 리포솜 매개 형질감염, 염화칼슘 형질감염, 및 원형질체 융합을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 다양한 특징 및 실시양태가 하기 대표적인 실시예에서 예시되며, 이는 예시적인 것으로서 본 발명을 제한하지 않는 것으로 의도된다.
실험
실험 및 달성된 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제공되며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 실제로, 아래에서 설명되는 많은 시약 및 장비에 대한 다양한 적합한 공급원이 있다. 본 발명이 임의의 시약 또는 장비 품목에 대한 임의의 특정 공급원으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
하기 실험 개시내용에서, 하기 약어가 적용된다: M(몰); mM(밀리몰), uM 및 μM(마이크로몰); nM(나노몰); mol(몰); gm 및 g(그램); mg(밀리그램); ug 및 μg(마이크로그램); L 및 l(리터); ml 및 mL(밀리리터); cm(센티미터); mm(밀리미터); um 및 μm(마이크로미터); sec(초); min(s)(분(들)); h(s) 및 hr(s)(시간(들)); U(단위); MW(분자량); rpm(분당 회전); psi 및 PSI(제곱인치당 파운드); ℃(섭씨 도); RT 및 rt(실온); CV(변동 계수); CAM 및 cam(클로람페니콜); PMBS(폴리믹신 B 술페이트); IPTG(이소프로필 β-D-l-티오갈락토피라노사이드); LB(루리아 브로쓰); TB(테리픽 브로쓰); SFP(진탕 플라스크 분말); CDS(코딩 서열); DNA(데옥시리보핵산); RNA(리보핵산); 이. 콜라이 W3110(일반적으로 사용되는 실험실 이. 콜라이 균주, Coli Genetic Stock Center[CGSC](미국 켄터키주 뉴헤이븐 소재)로부터 이용가능함); AcSus(아시디티오바실루스 칼두스 수크로스 신타제); SUS, SuS 및 SuSy(수크로스 신타제로도 알려진 수크로스 신타제); NDP(뉴클레오시드 디포스페이트); 아데노신 디포스페이트(ADP); 시티딘 디포스페이트(CDP); 구아노신 디포스페이트(GDP); 티미딘 디포스페이트(TDP); 우리딘 디포스페이트(UDP); 이노신 디포스페이트(IDP); GT(글리코실트랜스퍼라제); UGT(UDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제); NGT(NDP-뉴클레오시드 디포스페이트 의존적 글리코실트랜스퍼라제); AGT(ADP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제); CGT(CDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제); GGT(GDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제); TGT (TDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제); IGT(IDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제); UGT(UDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제); reb(레바우디오시드); rebA(레바우디오시드 A); rebD(레바우디오시드 D); rebI(레바우디오시드 I); rebM(레바우디오시드 M); "Reb A 60": 각각 스테비오시드와 레바우디오시드 A의 ~1:2 혼합물; HTP(고처리량); HPLC(고압 액체 크로마토그래피); HPLC-UV(HPLC-자외선 가시광 검출기); 1H NMR (양성자 핵 자기 공명 분광법); HSQC NMR(이핵성 단일 양자 간섭 분광법 NMR); COZY NMR(단일핵 상관성 분광법 NMR); Acorn(Acorn NMR, 미국 캘리포니아주 리버모어 소재); FIOPC(양성 대조군 대비 개선 배수); 시그마(Sigma) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세이트 루이스 소재; Difco(Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, 미국 미시건주 디트로이트 소재); 마이크로플루이딕스(Microfluidics)(Microfluidics, 미국 매사추세츠주 웨스트우드 소재); 크로마덱스(ChromaDex)(ChromaDex, Inc, 미국 캘리포니아주 어빈 소재); 에펜도르프(Eppendorf)(Eppendorf, Inc, 미국 코네티컷주 엔필드 소재); 및 써모트론(Thermotron)(Thermotron, 미국 미시건주 홀랜드 소재).
실시예
1
글루코실화
활성을 갖는
UGT
효소의 합성, 최적화 및 검정
본 실시예에서, 글루코실화 활성을 갖는 UGT 효소의 합성, 최적화 및 검정에 사용되는 방법이 설명된다.
유전자 합성 및 최적화:
스테비올비오시드를 레바우디오시드 B로 글루코실화하고 스테비오시드를 레바우디오시드 A로 글루코실화하는 것으로 보고된 야생형 스테비아 레바우디아나 폴리펩티드(서열 번호 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)(예를 들어, Richman et al., Plant J., 41:56-67 [2005] 참조)을 코돈-최적화하고, 서열 번호 3의 유전자로서 합성하였다. 이 합성 유전자(서열 번호 3)를 pCK110900 벡터 시스템 내에 클로닝하고(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 공개 특허 출원 공개 2006/0195947 참조), 이어서 이. 콜라이 W3110(△fhuA)에서 발현시켰다. 이. 콜라이 균주 W3110은 lac 프로모터의 제어 하에 UGT 효소를 발현시켰다.
진탕 플라스크 분말(
SFP
)의 생성:
본원에서 설명되는 생체 촉매 과정에 사용되는 특성 결정 검정을 위한 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드 진탕 플라스크 분말(SFP)을 생성하기 위해 진탕 플라스크 절차를 사용하였다. 효소의 진탕 플라스크 분말(SFP) 제제는 HTP 검정에서 사용된 세포 용해물과 비교하여 보다 정제된 효소 제제(예를 들어, 총 단백질의 30% 초과까지의)를 제공하고, 또한 보다 농축된 효소 용액의 사용을 허용한다. 관심 있는 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이의 단일 콜로니를 30 μg/ml 클로람페니콜 및 1% 글루코스를 함유하는 5 mL 루리아 베르타니(Luria Bertani) 브로쓰에 접종하였다. 세포를 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 인큐베이터에서 밤새(적어도 16시간) 성장시켰다. 배양액을 1 L 플라스크에서 30 μg/ml CAM을 함유하는 250 mL 테리픽 브로쓰(Terrific Broth; 12 g/L 박토-트립톤, 24 g/L 효모 추출물, 4 mL/L 글리세롤, 65 mM 인산칼륨, pH 7.0, 1 mM MgS04) 내로 0.2의 600 nm의 광학 밀도(OD600)까지 희석하고, 30℃에서 성장시켰다.
배양액의 OD600이 0.6 내지 0.8일 때, IPTG를 1 mM의 최종 농도까지 첨가하여 글리코실트랜스퍼라제 유전자의 발현을 유도하였다. 이어서, 인큐베이션을 밤새(적어도 16시간) 계속하였다. 세포를 원심분리(5000 rpm, 15분, 4℃)에 의해 수집하고, 상청액을 버렸다. 세포 펠렛을 표준 이. 콜라이 용해 설정으로, 2 부피의 25 mM 트리에탄올아민 완충제, pH 7.5에 재현탁시키고, MICROFLUIDIZER® 고압 균질화기(Microfluidics)를 통과시키고, 4℃에 유지시켰다. 세포 잔해를 원심분리(10,000 rpm, 45분, 4℃)에 의해 제거하였다. 맑아진 용해물 상청액을 수집하고, -80℃에서 동결시킨 다음, His-친화도 정제 및 투석을 실시하여 정제된 단백질을 생성하거나 또는 동결건조하여 조질 폴리펩티드의 건조한 진탕 플라스크 분말을 생성하였다.
스테비오시드
글루코실화에
대한
SFP의
검정:
SFP를 재구성하여 20 g/L의 분말을 제공하였다. 이어서, 이들 원액 50 μL를 2 mM 우리딘 디포스포글루코스 및 3 mM MgSO4 및 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도)와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5의 200 μL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다.
HPLC
-MS/MS 분석:
상기 설명된 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5 부피/부피의 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 글리코실화된 스테비오시드 생성물은 다음 기기 및 파라미터를 사용하여 LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출되었다:
서열 번호 4에 대한 활성이 검출되었다. 스테비오시드에서 레바우디오시드 A로의 높은 전환율(즉, >95%)이 상기 설명된 검정 샘플의 LC-MS/MS 분석에서 관찰되었다.
실시예
2
서열 번호 4의
GT
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 4로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝이 설명된다. 효소의 특정 구조적 특징과 관련된 위치가 돌연변이 유발된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 3에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 4)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 12개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제1 라운드("라운드 1")를 제공하였다.
HTP
성장, 발현 및
용해물
제조
세포를 96웰 플레이트에 집어넣고, 1% 글루코스 및 30 μg/mL CAM, 30℃, 200 rpm, 85% 습도를 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 20 μL의 하룻밤 동안의 성장물을 30 μg/mL CAM을 함유하는 380 μL TB 성장 배지를 함유하는 딥 웰 플레이트로 옮기고, 1 mM IPTG로 유도하고, 30℃, 200 rpm, 85% 습도에서 18시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포 배양물을 4000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 배지를 버렸다. 이렇게 수득된 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시키고, 실온에서 적정 플레이트 진탕기 상에서 2시간 동안 저속 진탕시키면서 250 μL 용해 완충제(0.5 g/L 리소자임 및 20 mM 트리스-HCl 완충제 중 0.5 g/L PMBS, pH 7.5)에서 용해시켰다. 이어서, 플레이트를 4000 rpm 및 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 맑아진 용해물 상청액을 아래에서 설명되는 HTP 검정 반응에 사용하였다.
ADP-
글루코스로부터
스테비오시드로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정:
200 μL 반응에서 50 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도)의 기질 로딩 및 0.5 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 3 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양액 용해물의 96웰 플레이트 상에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Tris-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 30℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 100 μL/웰 아세토니트릴로 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 HPLC-MS/MS에 의해 분석하였다.
ADP-글루코스와 함께 야생형 UGT76G1(서열 번호 4)의 존재 하에 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A의 형성은 효소 조절이 없는 것과 구별할 수 없었다. 서열 번호 4의 야생형 효소와 대조적으로, ADP-글루코스와 함께 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 2.1에 열거되어 있다. 모체 및 변이체 구축물은 친화도 정제를 위해 N-말단 히스티딘 태그를 함유하지만, 돌연변이를 명확성을 위해 태그가 부착되지 않은 참조 서열에 대해 넘버링하였다. 진탕 플라스크 규모 배양물을 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 정제를 위해 성장시켰다. 서열 번호 4와 비교하여 하기 표 2.1에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체를 분석하였다.
정제된 단백질 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
먼저, 250 mL의 진탕 플라스크 배양물을 실시예 1에서 설명된 바와 같이 성장시키고, 유도하고, 용해시키고, 히스티딘-친화도 정제하고, 투석하고, 글리세롤로 1:1로 희석하여 정제된 단백질을 제조하였다. 이어서, 이들 단백질 50 μL를 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도) 또는 레바우디오시드 D(Sigma, >93% 순도) 및 0.5 mM ADP-글루코스와 함께 200 μL의 총 반응 부피의 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2로 희석하였다. 반응은 16시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5% 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다.
돌연변이 R10- 및 V309R, S361G, V309S, L307V 및 S283T를 갖는 변이체(서열 번호 8, 10, 12, 14 및 16)는 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 상기 음성 대조군 및 ADP-글루코스를 사용한 서열 번호 2 수준보다 높은 수준으로 생성하였다. 돌연변이 R10- 및 V309R을 갖는 변이체(서열 번호 8) 및 돌연변이 V309S를 갖는 변이체(서열 번호 12)는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 상기 음성 대조군 및 ADP-글루코스를 사용한 서열 번호 2 수준보다 높은 수준으로 생성하였다. 따라서, 이들 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제 효소는 스테비오시드의 레바우디오시드 A로의, 레바우디오시드 D의 레바우디오시드 M으로의 β-글루코실화를 위한 새로운 방법에 사용하기 위한 새로운 생체 촉매 시약을 제공한다. 돌연변이 R10- 및 V309R을 갖는 변이체(서열 번호 8)는 보조 기질로서 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드 및 레바우디오시드 D 둘 모두에 대한 가장 높은 활성을 가졌다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 7)를 추가의 유도 진화를 위해 선택하였다.
실시예
3
서열 번호 8의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 8로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험을 설명한다. 서열 번호 7에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 8)의 유도 진화를, 라운드 1에서의 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 실시예 2에서 설명된 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 20개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제2 라운드("라운드 2")를 제공하였다. 조작된 폴리펩티드는 표 3.1에 열거되어 있다. 모체 및 변이체 구축물은 친화도 정제를 위해 N-말단 히스티딘 태그를 함유하지만, 돌연변이를 명확성을 위해 태그가 부착되지 않은 참조 서열에 대해 넘버링하였다. 진탕 플라스크 규모 배양물을 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 정제를 위해 성장시켰다. 아래에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 8에 대해 표 3.1에 제시된 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체를 분석하였다.
정제된 단백질 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
단백질을 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제, 검정 및 분석하였다.
표 3.2의 모든 변이체(서열 번호 32, 34, 36 및 38)는 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 8보다 더 많은 양으로 생성하였다. 돌연변이 T283Q, T318E, W337S, 및 S360G를 갖는 변이체(서열 번호 32)는 보조 기질로서 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드 및 레바우디오시드 D 둘 모두에 대한 가장 높은 활성을 가졌다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 31)를 추가의 유도 진화를 위해 선택하였다.
정제된 단백질 특성 결정 검정 및
NDP
-
글루코스로부터
스테비오시드로의
글루코실
전달에 대한 분석
서열 번호 32와 비교하여 서열 번호 4의 뉴클레오티드 디포스페이트 특이성을 프로파일링하기 위해, 다음 실험을 수행하였다. 먼저, 정제된 단백질 50 μL을 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도) 및 0.5 mM ADP-글루코스, UDP-글루코스 또는 TDP-글루코스와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2의 200 μL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 16시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 글리코실화된 생성물은 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 물에서 1:10으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출되었다. 서열 번호 32는 ADP-글루코스의 경우 서열 번호 4보다 13배 더 많은 레바우디오시드 A를 생성하였고, UDP-글루코스의 경우에는 90%, TDP-글루코스의 경우에는 22%를 생성하였다. 서열 번호 31에 의해 코딩되는 글리코실트랜스퍼라제(즉, 서열 번호 32)는 서열 번호 3에 의해 코딩되는 글리코실트랜스퍼라제(즉, 서열 번호 4)와 비교하여 실질적으로 변형된 NDP-글루코스 특이성을 가졌다.
레바우디오시드
D 및
NDP
-
글루코스에
대한 서열 번호 31에 의해 코딩되는
GT
의 특이적 활성의 결정
서열 번호 32의 뉴클레오티드 디포스페이트 특이성을 프로파일링하기 위해, 다음 실험을 수행하였다. 먼저, 정제된 단백질 50 μL을 1 mM 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 2 mM ADP-글루코스, UDP-글루코스, TDP-글루코스 또는 GDP-글루코스와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2의 100 μL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 1-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 글리코실화된 생성물은 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 물에서 1:10 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출되었다. 서열 번호 31에 의해 코딩되는 글리코실트랜스퍼라제(즉, 서열 번호 32)는 레바우디오시드 M을 ADP-글루코스에 비해 GDP-글루코스를 사용할 때 50%, UDP-글루코스를 사용할 때 70%, TDP-글루코스를 사용할 때 검출 한계 미만의 양으로 생성하였다. 레바우디오시드 D 및 ADP-글루코스를 사용할 때 서열 번호 32의 GT의 특이적 활성(분당 정제된 단백질 mg당 μmol RebM)은 UDP-글루코스를 사용할 때의 특이적 활성보다 1.4배 더 높았다. 따라서, 서열 번호 31에 의해 코딩된 글리코실트랜스퍼라제(즉, 서열 번호 32)는 새로은 아데닌 디포스포글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제 또는 "AGT"이다.
실시예
4
서열 번호 32의 조작된
AGT를
사용한
스테비오시드의
레바우디오시드
A로의 전환 및 ADP-글루코스의 인 시츄(in situ) 형성
본 실시예에서, 스테비올 글리코시드의 글루코실화에 대한 ADP-글루코스의 인 시츄 형성을 평가하는 실험(도 1 참조)이 설명된다.
유전자 합성 및 최적화
야생형 아시디티오바실루스 칼두스 수크로스 신타제 및 써모시네코코쿠스 에롱가투스(Thermosynechococcus elongatus) 수크로스 신타제 폴리펩티드(각각 서열 번호 72 및 74)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 글루코스를 프럭토스에 공여하여 수크로스를 가역적인 전환으로 형성하기 위해 ADP-글루코스를 우선적으로 이용하는 것으로 보고되었고(예를 들어, Diricks et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 99:8465-74 [2015] 및 Figueroa et al., FEBS Lett., 587: 165-9 [2013] 참조), 코돈 최적화되고 서열 번호 71 및 73의 유전자로서 합성되었다. 이들 합성 유전자(서열 번호 71 및 73)를 개별적으로 pCK110900 벡터 시스템에 클로닝하였고(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 서열 번호 71 및 73 참조), 이. 콜라이 W3110(△fhuA)에서 후속적으로 발현되었다. 이. 콜라이 균주 W3110은 lac 프로모터의 제어 하에 효소를 발현하였다. 균주를 진탕 플라스크 규모로 성장시키고, His-친화도 단백질 정제를 위해 용해시켰으며, 이를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
정제된
AGT
및
수크로스
신타제를
이용한 커플링 분석
수크로스 신타제(SuS)를 서열 번호 31에 의해 코딩되는 AGT(즉, 서열 번호 32)와 커플링함으로써 NDP 재순환 가능성을 조사하기 위해, 다음 실험을 수행하였다. 먼저, 20 μL의 정제된 수크로스 신타제 폴리펩티드(서열 번호 72 또는 74) 및 30 μL의 정제된 AGT 폴리펩티드(서열 번호 32)를 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도), 200 mM 수크로스 및 5 mM 아데노신 디포스페이트(ADP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 티미딘 디포스페이트(TDP) 또는 우리딘 디포스페이트(UDP)(Sigma, 5개 모두 >93% 순도)와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 5 mM MgCl2의 200 μL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 16시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다.
글리코실화된 생성물은 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 물에서 1:10 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출되었다.
서열 번호 32 및 SuS(서열 번호 74)에 대해, ADP, UDP 및 GDP를 사용할 때 동등한 양의 레바우디오시드 A가 형성되었고, CDP 및 TDP를 사용할 때에는 레바우디오시드 A가 거의 형성되지 않았다. 서열 번호 32 및 SuS(서열 번호 72)에 대해, ADP를 사용하여 형성된 레바우디오시드 A의 수준은 ADP를 사용하여 SuS(서열 번호 74)로 형성된 것과 대등하였다. UDP를 사용하여 형성된 레바우디오시드 A의 양은 ADP를 사용하여 형성된 양의 20% 미만이었고, GT(서열 번호 32) 및 SuS(서열 번호 72) 및 CDP, GDP, 또는 TDP를 사용할 때에는 레바우디오시드 A가 거의 형성되지 않았다. 이러한 결과는 서열 번호 72 및 74 둘 모두가 수크로스로부터 ADP-글루코스를 인 시츄로 생성할 수 있고, 더 비싼 기질인 ADP-글루코스 대신에 보조 기질로서 수크로스 및 ADP를 사용하여 스테비올 글리코시드를 글루코실화하기 위해 AGT(서열 번호 32)를 사용할 수 있음을 입증한다. 또한, 서열 번호 72는 GDP 및 UDP와 함께 사용할 수도 있다. ADP-선택적 커플링 시스템을 포함하는 일부 실시양태에서, 서열 번호 74가 사용될 수 있다.
실시예
5
서열 번호 32의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제의
원형의 치환된
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용하여 스테비올 글리코시드를 글루코실화하기 위한 서열 번호 32로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 설계, 구축 및 평가를 위한 실험이 설명된다. 서열 번호 31에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 N- 및 C-말단이 코딩 서열에서 연결되고 효소의 특정 구조적 특징과 관련된 위치가 단백질의 새로운 N- 말단으로서 선택된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행되었다. 이어서, 상기 원형의 치환된 변이체의 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 17개의 조작된 GT의 원형의 치환된 변이체 폴리펩티드의 "라운드 3.2"를 제공하기 위해 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하였다. 어떤 변이체도 치환되지 않은 서열 번호 32보다 더 높은 활성을 나타내지 않았지만, 표 5.1에 제시된 17개의 조작된 폴리펩티드는 무효소 음성 대조군보다 더 높은 활성을 나타내었다.
ADP-
글루코스로부터
스테비오시드로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정:
200 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도)의 기질 로딩 및 0.5 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 31 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양액 용해물의 96웰 플레이트 상에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Tris-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 30℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 100 μL/웰 아세토니트릴로 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 HPLC-MS/MS에 의해 분석하였다.
분석된 조작된 폴리펩티드는 표 5.1에 열거되어 있다. 모체 및 변이체 구축물은 친화도 정제를 위해 N-말단 히스티딘 태그를 함유하지만, 아미노산을 명확성을 위해 태그가 부착되지 않은 참조 서열에 대해 넘버링하였다. 서열 번호 32, 71, 170, 259 및 401과 비교하여 하기 표에 나타낸 바와 같은 제1 아미노산을 갖는 변이체에 대해, 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 정제를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다. 이들 변이체는 단백질의 가장 뚜렷한 영역으로부터의 원형 치환체를 나타내었다.
레바우디오시드
D 및 ADP-
글루코스에
대한 정제된 원형의 치환된
GT의
특이적 활성의 측정
먼저, 10 μL의 정제된 단백질을 1 mM 스테비오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 2 mM ADP-글루코스와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2의 100 μL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 1-4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다.
실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 4개의 원형 치환체 중, 서열 번호 106은 가장 높은 특이적 활성(분당 정제된 단백질 mg당 μmol RebM)을 보였고, 이어서 서열 번호 100 및 서열 번호 90 순으로 활성을 보였다. 서열 번호 78은 검출 가능한 활성이 거의 없었다. 따라서, 서열 번호 105에 의해 코딩된 글리코실트랜스퍼라제(즉, 서열 번호 106)는 이러한 실험에서 추가의 유도 진화를 위한 최고의 후보 원형 치환된 AGT로서 확인되었다.
실시예
6
서열 번호 32의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 32로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝이 설명된다. 효소의 특정 구조적 특징과 관련된 위치가 돌연변이 유발된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 31에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 32)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 60개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제3 라운드("라운드 3.1")를 제공하였다.
ADP-
글루코스로부터
스테비오시드로
또는
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정:
200 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 0.5 mM 레바우디오시드 D 또는 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도)의 기질 로딩 및 0.5 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 32 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양액 용해물의 96웰 플레이트 상에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Tris-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 30℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 100 μL/웰 아세토니트릴로 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 HPLC-MS/MS에 의해 분석하였다.
조작된 폴리펩티드는 표 6.1에 열거되어 있다. 모체 및 변이체 구축물은 친화도 정제를 위해 N-말단 히스티딘 태그를 함유하지만, 돌연변이를 명확성을 위해 태그가 부착되지 않은 참조 서열에 대해 넘버링하였다. 서열 번호 32와 비교하여 하기 표 6.1에 나타낸 바와 같은 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해, 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 정제를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
정제된 단백질 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
먼저, 1 μL의 정제된 단백질을 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도) 또는 레바우디오시드 D(Sigma, >93% 순도) 및 2 mM ADP-글루코스와 함께 100 μL의 총 반응 부피의 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2로 희석하였다. 반응은 1-30시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5% 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 스테비오시드 및 레바우디오시드 D에 대한 표 6.2에서 설명되는 특이적 활성은 반응 진행 곡선의 선형 부분으로부터 정제된 단백질 mg당 분당 형성되는 μmol 생성물로서 결정되었다.
상기 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 31에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 32)의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 레바우디오시드 D를 사용하여 상기 설명된 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 59개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 라운드 3.3을 제공하였다. 조작된 폴리펩티드는 표 6.3에 열거되어 있다. 서열 번호 32와 관련하여 표 6.3에 나타낸 바와 같은 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 정제를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
정제된 단백질 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
먼저, 2 μL의 정제된 단백질을 1 mM 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 2 mM ADP-글루코스와 함께 100 μL의 총 반응 부피의 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2로 희석하였다. 반응은 1-18시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5% 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다.
실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 스테비오시드에 대해 표 6.4에서 설명되는 특이적 활성은 반응 진행 곡선의 선형 부분으로부터 정제된 단백질 mg당 분당 형성되는 μmol 레바우디오시드 M 생성물로서 결정되었다. 표 6.4에서 열거되는 효소는 0.8 g/L의 스테비오시드 또는 1.3 g/L rebD, 2몰 과량의 ADP-글루코스 및 35-77 mg/L의 정제된 단백질을 사용하여 18시간 이내에 RebD를 RebM으로 >99%의 수준으로 전환하는 것을 촉매하고, 스테비오시드를 RebA와 RebI의 혼합물로 >85%의 수준으로 전환하는 것을 촉매하였다.
실시예
7
AGT(서열 번호 232)를
사용한
레바우디오시드
D에서
레바우디오시드
M으로의 전환
실시예 1에서 설명된 바와 같이 폴리펩티드 서열 번호 232의 단백질 정제를 위해 250 mL 진탕 플라스크 배양물을 성장시켰다. 이어서, 2.4 mL의 50% 글리세롤 원액을 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 2 mM ADP-글루코스 및 1 mL 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도)로 250 mL 배플 플라스크에서 60 mL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 2시간 동안 250 RPM 진탕 하에 이노바(Innova)® 진탕 인큐베이터에서 30℃에서 수행하고, 0.12 mL 포름산으로 pH<4로 켄칭하였다. 반응물을 10,000 RPM에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 6 g의 XAD-4 수지(Sigma)를 상청액에 첨가하고, 진탕 플라스크에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 수지를 여과하고, 4시간 동안 인큐베이팅하고 재여과함으로써 16.3 mL의 50:24:26의 물:ACN:EtOH로 용리시켰다. 10 mL의 50:50의 물:EtOH로 제2 용리를 수행하고, 이를 여과하고, 제1 용리액과 합하였다. 용리액을 회전 증발에 의해 약 6 mL로 농축하고, WHATMAN® UNIPREP® 시린지리스(syringeless) 필터를 통해 여과하고, 표 7.1에 설명된 기기 및 파라미터를 사용하여 HPLC에 의해 분획화하였다. C18 컬럼으로부터, 분획을 체류 시간 5.8-6.2 m에서 수동으로 수집하였다. 분획을 모으고, 회전 증발에 의해 농축하고, 동결건조시켰다. 그 후, 샘플을 1.5 mL 에탄올에 재현탁하고 80℃에서 2시간 동안 교반 플레이트에서 인큐베이팅하고, 회전 증발에 의해 농축한 다음, 40℃에서 14시간 동안 진공 하에 건조시켰다. 샘플을 피리딘-d5에 재현탁하고, Acorn NMR에 의해 수행된 1H, COSY 및 HSQC NMR 스펙트럼 획득을 위해 사용하였다.
단리된 생성물 M은 기준이 되는 레바우디오시드 M 표준물질(Chromadex, HPLC에 의한 순도 95.6%)의 스펙트럼에 대한 스펙트럼의 종류에 기초하여 레바우디오시드 M으로 결정되었다. 1H NMR에 의해, 샘플에서 교환 가능 양성자는 표준물질의 것보다 더 넓었고, 샘플은 미미한 메틸 오염물질을 함유하였다. 그 외에는, 샘플과 표준물질의 스펙트럼은 동일하였다. 미미한 불순물을 제외하고, 샘플 및 표준물질의 COSY 및 HSQC 스펙트럼은 동일하였다. 1H 및 1H-13C HSQC 스펙트럼으로부터 분명한 6개의 아노머성 양성자[δH 6.44, δH 5.85, δH 5.524, δH 5.518, δH 5.49, δH 5.34]의 존재는 구조에서 6개의 당 단위의 존재를 확인해주었고, 이것은 표준물질과 일치하여 β-아노머 입체형태를 나타내었다. C2' 및 C3' 히드록실 위치에서 당의 부착은 당 I에서 H-2'(δH 4.54) 및 H-3'(δH 5.15)의 비교적 낮은 장(downfield)의 화학적 이동에 의해 뒷받침되며, 이것은 C-19에서의 2,3-분지-D-글루코트리오실 치환체를 시사한다(탄소 넘버링에 대해서는 도 2 참조). 피크 할당은 표 7.2에 열거되어 있고, 1H, COSY, 및 HSQC 스펙트럼으로부터 결정되었고, 문헌과 비교되었다(예를 들어, Prakash et al., Nat. Prod. Comm., 11:1523-6 [2013] 참조).
실시예
8
서열 번호 232의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 232로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 라운드 3에서 개선된 활성과 관련된 표면 잔기 돌연변이가 재조합되는 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 231에 의해 코딩되는 GT(즉, 서열 번호 232)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 상기 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 76개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제4 라운드("라운드 4")를 제공하였다.
ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정:
100 μL 반응에서 2.5 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 0.5 mM 레바우디오시드 D(ChromaDex, >94% 순도)의 기질 로딩 및 0.5 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 232 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양액 용해물의 96웰 플레이트 상에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Tris-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 30℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 50 μL/웰 아세토니트릴로 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 HPLC-MS/MS에 의해 분석하였다.
조작된 폴리펩티드는 표 8.1에 열거되어 있다. 모체 및 변이체 구축물은 친화도 정제를 위해 N-말단 히스티딘 태그를 함유하지만, 돌연변이를 명확성을 위해 태그가 부착되지 않은 참조 서열에 대해 넘버링하였다. 서열 번호 348, 350, 352, 354, 356, 364, 408, 및 428을 갖는 변이체에 대해, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 동결건조하였다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
스테비오시드 및 레바우디오시드 D에 대한 조작된 라운드 4 변이체의 활성을 특성화하기 위해 시간 경과 실험을 수행하였다. 1 g/L의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도) 또는 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 1 mM ADP-글루코스와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 2.5% v/v 에탄올을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 0.5-2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 반응을 0.2% 포름산을 갖는 50 μL 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에서 1:50으로 희석한 후, 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 8개의 모든 변이체는 스테비오시드 및 레바우디오시드 D 둘 모두에 대해 서열 번호 232보다 더 높은 활성을 보였다. 1시간 시점에서 서열 번호 232에 비해 변이체에 의해 스테비오시드로부터 생성된 레바우디오시드 A의 수준을 표 8.2에 나타내었다.
8개의 조작된 변이체의 활성은 레바우디오시드 D에 대해 서열 번호 232의 활성보다 명백히 더 높았지만, 이들은 시간 과정에서 서로 잘 구별되지 않았다. 따라서, 후속 실험을 다음과 같이 수행하였다: 0.03-1 g/L 진탕 플라스크 분말(SFP)의 용량 반응 곡선을 1 mM 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 1 mM ADP-글루코스와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 2.5% v/v 에탄올을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 0.5시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 반응을 0.2% 포름산을 갖는 50 μL 아세토니트릴을 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에서 1:67로 희석한 후, 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 0.0625 g/L SFP 로딩에서 레바우디오시드 D에 대한 라운드 4 변이체의 활성이 표 8.3에 열거되어 있다.
실시예
9
서열 번호 348의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 348부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 공적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 상동체로부터 확인된 돌연변이가 재조합된 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 347에 의해 코딩되는 GT(즉, 서열 번호 348)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 상기 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는, 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제5 라운드("라운드 5"), 즉 라이브러리 5.01로부터의 6개(표 9.1) 및 라운드에 남아있는 라이브러리로부터의 18개(표 9.2)를 제공하였다.
ADP-
글루코스로부터
스테비올 글리코시드로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 348 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 이전 라운드에서 사용된 250 uL로부터 400 uL로 증가되었고, 용해물은 10배 희석되었다. 라운드 5.01에 대해, 검정은 100 μL 반응에서 10 μL 용해물을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Tris-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 40℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 10 μL 검정물을 첨가함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 물에 1:10으로 희석하고, 표 9.3에서 설명한 바와 같이 RapidFire SPE-MS/MS(Agilent)에 의해 분석하였다. 나머지 라운드 5 라이브러리의 경우에는, 용해물을 10배 대신에 4배 희석하고, Tris-HCl 대신에 50 mM 인산칼륨 완충제(pH 7)을 사용하고, 온도는 50℃이었고, 반응 시간은 2시간이었고, 검정은 스테비오시드와 레바우디오시드 D(Chromadex, > 93%) 둘 모두를 사용하여 수행하였다.
조작된 폴리펩티드는 표 9.1 및 표 9.2에 열거되어 있다. 모체 및 변이체 구축물은 친화도 정제를 위해 N-말단 히스티딘 태그를 함유하지만, 돌연변이를 명확성을 위해 태그가 부착되지 않은 참조 서열에 대해 넘버링하였다. 서열 번호 500에 대해 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
스테비오시드 및 레바우디오시드 D에 대한 조작된 라운드 5 변이체 서열 번호 500의 활성을 서열 번호 348과 비교하여 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.03-1 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도) 또는 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 1 mM ADP-글루코스와 함께 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 2.5% v/v 에탄올을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 0.5시간 동안 열순환기에서 40℃에서 수행하고, 반응을 0.2% 포름산을 갖는 50 μL 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에서 1:67로 희석한 후, 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 1 g L 로딩에서, 서열 번호 500은 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 서열 번호 348보다 1.2배 초과로 더 많이 생성하였고, 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 1.07배 초과로 더 많이 생성하였다. 이어서, 서열 번호 499(즉, 500)를 다시 클로닝하여 N-말단 히스티딘 태그를 제거하고, 고처리량으로 발현시키고, 플레이트를 400 μL에서 용해시켰다. 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도) 또는 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 1 mM ADP-글루코스와 함께 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.3, 3 mM MgCl2, 2.5% v/v 에탄올을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 2.5 μL 용해물에 첨가하여 변이체 서열 번호 548을 함유하는 생성된 분말을 변이체 서열 번호 500 변이체에 대해 검정하였다. 반응은 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 진탕 인큐베이터에서 50℃에서 수행하고, 반응을 10 μL 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에서 1:10으로 희석한 후, 표 9.3에서 설명한 바와 같이 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석하였다. 상기 조건 하에서, 서열 번호 548 변이체는 서열 번호 500 변이체보다 거의 1.5배 더 많은 레바우디오시드 A를 스테비오시드로부터 생성하고, 레바우디오시드 D로부터 1.6배를 초과하는 수준보다 더 많은 레바우디오시드 M을 생성하였다.
이어서, 서열 번호 548의 변이체를 함유하는 진탕 플라스크 분말을 제조하고, 이를 서열 번호 348 변이체와 비교하여 검정하였다. 0.25-10 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.3, 3 mM MgCl2, 2 mM ADP-글루코스 및 1 g/L 레바우디오시드 A 60(60% 레바우디오시드 A, >35% 스테비오시드) 또는 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도)를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 열순환기에서 40℃에서 수행하고, 반응은 10 μL 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에서 1:10으로 희석한 후, 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 서열 번호 548 변이체는 레바우디오시드 A 60을 레바우디오시드 A와 레바우디오시드 I의 혼합물로 65% 초과의 비율로 전환시키고, 레바우디오시드 D를 레바우디오시드 M으로 거의 완전하게 전환하였다. 0.25 g/L 진탕 플라스크 분말 로딩에서, 서열 번호 548 변이체는 서열 번호 348 변이체보다 1.4배 더 높은 레바우디오시드 D 전환율에 도달하였고, 레바우디오시드 A 60의 전환율은 2.2배 더 높았다.
AGT
효소의 발현 분석
스테비올 글리코시드의 β-1,3-글루코실화를 위한 조작된 AGT 폴리펩티드의 6 라운드를 폴리아크릴아미드 겔-전기영동에 의해 분석하여 상대적인 단백질 발현 수준을 결정하였다. 샘플을 1x LDS 로딩 완충제 및 1x 환원제(Life Technologies)를 사용하여 제조하였다. 4-12% 비스-트리스 아크릴아미드 겔(Life Technologies)에 진탕 플라스크 규모 배양물로부터 동결건조된 가용성 조질 용해물을 레인당 5 μg 로딩하고, 200 V에서 25분 동안 MES 이동 완충제로 이동시키고, 밴드를 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 정량하였다. 상대적인 발현 수준은 표 9.4에 열거되어 있다. 서열 번호 547/548, 499/500 및 347/348은 유의하게 더 잘 발현된 유전자 및/또는 유의하게 더 잘 폴딩된/보다 안정한 단백질이다. 따라서, 이들 유전자는 야생형 유전자보다 더 많은 단백질을 생성하였다.
실시예
10
AGT(서열 번호 500)를
사용한
레바우디오시드
A의
레바우디오시드
I로의 전환
본 실시예에서, 서열 번호 500 변이체를 사용하여 레바우디오시드 A를 레바우디오시드 I로 전환하는 반응의 규모 확대, 및 레바우디오시드 I의 단리 및 특성화가 설명된다. 5 g/L의 서열 번호 500 변이체 동결건조 진탕 플라스크 분말, 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 7, 10.3 mM 염화마그네슘, 10 g/L 레바우디오시드 A(>97% 순도) 및 10.3 mM ADP-글루코스(Sigma)를 함유하는 총 부피 10 mL의 반응물을 교반 플레이트에서 300 RPM 및 35℃에서 89시간 동안 교반하였다. 반응이 시작될 때 반응물은 투명하고, 반응이 끝날 때 백색 에멀젼이었다. 검정물을 물에서 1:10으로 희석하고, 10 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석하였다. 이 분석은 높은 전환율로 레바우디오시드 I이 생성됨을 확인해주었다. 그의 낮은 용해도 때문에, 레바우디오시드 I는 침강되었다. 따라서, 상청액을 제거하고, 최소 부피의 물로 침강물을 재현탁시키고, 원심분리하여 단리를 수행하였다. 이 세척 단계를 2회 반복하고, 백색 침강물의 표면에서 갈색 침강물을 긁어내었다. 물질을 동결건조시키고, Acorn NMR에 의해 분석하였다. 물질을 피리딘-d5에 용해시키고, 1H 1-D, 13C DEPT-135, 1H-13C HSQC NMR 실험을 배리안 이노바(Varian Inova) 500 NMR 분광계로 수행하였다. NMR 스펙트럼은 레바우디오시드 I에 대한 문헌 보고서와 완전히 일치하였다(표 10.1 참조). 탄소가 넘버링된 레바우디오시드 I의 구조는 도 3을 참조한다.
실시예
11
서열 번호 548의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 548로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 547에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 548)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 66개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제6 라운드("라운드 6")를 제공하였다 (표 11.1).
ADP-
글루코스로부터
스테비올 글리코시드로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 548 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양액 용해물의 96웰 플레이트 상에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 4배 희석되었다. 100 μL 반응에서 10 μL 용해물을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 50℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 10 μL 검정물을 첨가함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 물에 1:10으로 희석하고, 표 9.3에 기재된 바와 같이 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 분석하였다. 상위 84개 변이체를 1 mM 스테비오시드(Chromadex, >94% 순도), 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도) 또는 레바우디오시드 D(Chromadex, >93% 순도)를 사용하여 동일한 조건으로 재시험하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 11.1에 열거되어 있다. 서열 번호 554, 562, 568 및 576을 갖는 변이체에 대해, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의 글루코실 전달에 대한 분석
스테비오시드 및 레바우디오시드 D에 대한 조작된 라운드 6 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.03-1 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도) 또는 레바우디오시드 D(ChromaDex, >93% 순도) 및 1 mM ADP-글루코스와 함께 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.3, 3 mM MgCl2, 2.5% v/v 에탄올을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 써모트론 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하고, 12.5 μL를 0.2% 포름산을 갖는 87.5 μL 아세토니트릴 내에 전달하여 반응을 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에서 1:20으로 희석한 후, 실시예 9, 표 9.3에 기재된 바와 같이 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 효소의 상대적인 생산성은 표 11.2에 열거되어 있다.
실시예
12
서열 번호 562의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 562로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 561에 의해 코딩되는 GT(즉, 서열 번호 562)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 상기 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는, 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제7 라운드("라운드 7")를 제공하였다(표 12.1).
ADP-
글루코스로부터
스테비올 글리코시드로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 562 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 uL이었고, 용해물은 4배 희석되었다. 검정은 100 μL 반응에서 10 μL 용해물을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 1 mM 스테비오시드(ChromaDex, >94% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 50℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 10 μL 검정물을 첨가함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 물에 1:10으로 희석하고, 표 9.3에서 설명한 바와 같이 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 분석하였다. 상위 84개 변이체를 1 mM 스테비오시드(Chromadex, >94% 순도), 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도) 또는 레바우디오시드 D(Chromadex, >93% 순도)를 사용하여 동일한 조건으로 재시험하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 12.1에 열거되어 있다.
실시예
13
글루코실화
활성을 갖는
글리코실트랜스퍼라제
효소의 합성, 최적화 및 검정
본 실시예에서, 글루코실화 활성을 갖는 UGT 효소의 합성, 최적화 및 검정에 사용되는 방법이 설명된다.
유전자 합성 및 최적화:
오리자 사티바 자포니카(Oryza sativa Japonica), 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum), 리시움 바르바룸(Lycium barbarum) 및 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)으로부터의 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 코돈 최적화하고, 서열 번호 755, 757, 759, 761, 763, 765 및 767의 유전자로서 합성하였다. 이들 합성 유전자를 pCK110900 벡터 시스템에 클로닝하고(예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 2006/0195947 참조), 이어서 이. 콜라이 W3110(△fhuA)에서 발현시켰다. 이. 콜라이 균주 W3110은 lac 프로모터의 제어 하에 UGT 효소를 발현시켰다.
진탕 플라스크 분말(
SFP
)의 생성
본원에서 설명되는 생체 촉매 과정에 사용되는 특성 결정 검정을 위한 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드 진탕 플라스크 분말(SFP)을 생성하기 위해 진탕 플라스크 절차를 사용하였다. 효소의 진탕 플라스크 분말(SFP) 제제는 HTP 검정에서 사용된 세포 용해물과 비교하여 보다 정제된 효소 제제(예를 들어, 총 단백질의 30% 초과까지의)를 제공하고, 또한 보다 농축된 효소 용액의 사용을 허용한다. 관심 있는 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이의 단일 콜로니를 30 μg/ml 클로람페니콜 및 1% 글루코스를 함유하는 5 mL 루리아 베르타니 브로쓰에 접종하였다. 세포를 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 인큐베이터에서 밤새(적어도 16시간) 성장시켰다. 배양액을 1 L 플라스크에서 30 μg/ml CAM을 함유하는 250 mL 테리픽 브로쓰(12 g/L 박토-트립톤, 24 g/L 효모 추출물, 4 mL/L 글리세롤, 65 mM 인산칼륨, pH 7.0, 1 mM MgS04) 내로 0.2의 600 nm의 광학 밀도(OD600)까지 희석하고, 30℃에서 성장시켰다.
배양액의 OD600이 0.6 내지 0.8일 때, IPTG를 1 mM의 최종 농도까지 첨가하여 글리코실트랜스퍼라제 유전자의 발현을 유도하였다. 이어서, 인큐베이션을 밤새(적어도 16시간) 계속하였다. 세포를 원심분리(5000 rpm, 15분, 4℃)에 의해 수집하고, 상청액을 버렸다. 세포 펠렛을 표준 이. 콜라이 용해 설정으로, 2 부피의 25 mM 트리에탄올아민 완충제, pH 7.5에 재현탁시키고, MICROFLUIDIZER® 고압 균질화기(Microfluidics)를 통과시키고, 4℃에 유지시켰다. 세포 잔해를 원심분리(10,000 rpm, 45분, 4℃)에 의해 제거하였다. 맑아진 용해물 상청액을 수집하고, -80℃에서 동결시킨 다음, His-친화도 정제 및 투석을 실시하여 정제된 단백질을 생성하거나 또는 동결건조하여 조질 폴리펩티드의 건조한 진탕 플라스크 분말을 생성하였다.
정제된 단백질을 사용한
레바우디오시드
A
글루코실화에
대한 검정
먼저, 정제된 단백질 50 μL를 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM 염화마그네슘, 1 mM 레바우디오시드 A 및 0.5 mM 우리딘 디포스페이트로 이루어진 200 μL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 18시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 끓인 효소 반응물을 음성 대조군으로 사용하였다.10 μL의 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 글리코실화된 레바우디오시드 A 생성물은 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 검출되었다.
레바우디오시드 A로부터의 레바우디오시드 D의 생성은 서열 번호 756, 758, 762 및 768에 대해 검출되었다. 일부 효소는 또한 레바우디오시드 D의 위치이성질체, 가능하게는 6-연결합된 분자 레바우디오시드 D2를 생성하였다. 불량한 가용성 발현에도 불구하고, 서열 번호 758은 스테비올 글리코시드 기질에서 β-1,2-글루코스 연결 생성에 대한 높은 특이적 활성 및 우수한 선택성을 나타내었다.
진탕 플라스크 분말을 사용한
레바우디오시드
A
글루코실화에
대한 검정
동결건조된 진탕 플라스크 분말을 20 mg/mL로 재구성하였다. 이어서, 이들 원액 10 μL를 3 mM 염화마그네슘, 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도) 및 2 mM 우리딘 디포스페이트(UDP-글루코스)와 함께 50 mM 인산칼륨(KPhos) 완충제, pH 7의 100 μL의 총 반응 부피로 희석하였다. 반응은 16-18시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 40℃에서 수행하였다. 활성은 음성 대조군보다는 서열 번호 758에 대해 검출되었다. LC-MS/MS 분석에서 레바우디오시드 A의 레바우디오시드 D로의 낮은 전환율(즉, <10%)이 관찰되었다.
실시예
14
서열 번호 758의
GT
변이체
본 실시예에서, 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 758로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 효소의 표면 잔기와 관련된 위치가 돌연변이 유발된 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 757에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 758)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, 스테비올 글리코시드에 대해 β-1,2-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 10개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제1 라운드("라운드 1")를 제공하였다.
HTP 성장, 발현 및 용해물 제조
세포를 96웰 플레이트에 집어넣고, 1% 글루코스 및 30 μg/mL CAM, 30℃, 200 rpm, 85% 습도를 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 20 μL의 하룻밤 동안의 성장물을 30 μg/mL CAM을 함유하는 380 μL TB 성장 배지를 함유하는 딥 웰 플레이트로 옮기고, 1 mM IPTG로 유도하고, 30℃, 200 rpm, 85% 습도에서 18시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포 배양물을 4000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 배지를 버렸다. 이렇게 수득된 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시키고, 실온에서 적정 플레이트 진탕기 상에서 2시간 동안 저속 진탕시키면서 250 μL 용해 완충제(0.5 g/L 리소자임 및 20 mM 트리스-HCl 완충제 중 0.5 g/L PMBS, pH 7.5)에서 용해시켰다. 이어서, 플레이트를 4000 rpm 및 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 맑아진 용해물 상청액을 아래에서 설명되는 HTP 검정 반응에 사용하였다.
레바우디오시드
A
글루코실화에
대한
HTP
검정
100 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 50% 에탄올 중의 20 mM 원액 용액으로부터 1 mM 스테비오시드 A(Sigma, >96% 순도)의 기질 로딩 및 0.5 mM UDP-글루코스(Sigma, >98% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 757 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양액 용해물의 96웰 플레이트 상에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Tris-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 30℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 0.5 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:20으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 서열 번호 758보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 14.1에 열거되어 있다. 서열 번호 758과 비교하여 하기 표 14.1에 나타낸 바와 같은 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체의 분석을 위해, 실시예 1에서 설명된 바와 같은 동결건조된 분말 생성을 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크
용해물
특성 결정 검정 및
레바우디오시드
A
글루코실화에
대한 분석
먼저, 250 mL의 진탕 플라스크 배양물을 성장시키고, 유도하고, 용해시켰다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하고, 맑아진 용해물 상청액을 수집하였다. 이어서, 용해물 10 μL를 100 μL의 총 반응 부피의 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 1 mM 레바우디오시드 A(Sigma, >96% 순도) 및 2 mM UDP-글루코스(Sigma, >98% 순도) 내에서 희석하였다. 반응은 0-18시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5% 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:20으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다.
서열 번호 770 및 772에 상응하는 변이체는 서열 번호 758의 변이체보다 더 많은 양으로 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 생성하였다. 서열 번호 770의 변이체는 RebA에 대해 가장 높은 활성을 나타냈다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 769)는 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
15
서열 번호 770의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 770으로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 769에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 770)의 유도 진화를 수행하였다. 라이브러리는 실시예 14(라운드 1)에서 확인된 유익한 돌연변이를 재조합하거나, 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 상동체로부터의 다양성을 조합 방식으로 혼입하거나 또는 포화 돌연변이 유발을 거친 효소의 특정한 구조적 특징을 나타냈다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제2 라운드("라운드 2")를 제공하였다. 10개의 조작된 변이체가 재조합된 유익한 돌연변이로부터(표 15.1), 19개의 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터(표 15.2), 53개의 변이체가 표면 잔기 및 상동체 다양성으로부터(표 15.3) 확인되었다.
ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
100 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 1 mM 레바우디오시드 A(Sigma, >96% 순도)의 기질 로딩 및 4 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 770 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Tris-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 30℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 0.5% 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 서열 번호 770보다 더 많은 양으로 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 재조합된 유용한 돌연변이로부터의 조작된 폴리펩티드는 표 15.1에 열거되어 있다. 포화 돌연변이 유발 라이브러리로부터의 조작된 폴리펩티드는 표 15.2에 열거되어 있다.
레바우디오시드
A의
글루코실화에
대한
HTP
검정
나머지 조합 라운드 2 라이브러리는 다음과 같이 스크리닝되었다: 1 mM 레바우디오시드 A(Sigma, >96% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM UDP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하면서 100 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하거나 또는 100 μL 반응에서 10 μL의 4배 희석된 용해물을 사용하여 서열 번호 769 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1-2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 40℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 0.5% 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하거나 또는 0.2% 포름산을 갖는 90 μL의 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:100 또는 1:10으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 서열 번호 770보다 더 많은 양으로 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 15.3에 열거되어 있다.
레바우디오시드
I의
글루코실화에
대한
HTP
검정
라운드 2 포화 돌연변이 유발 라이브러리로부터의 88개의 변이체를 다음과 같이 스크리닝하였다: 100 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 1 mM 스테비오시드 I(실시예 10에서 설명된 바와 같이 레바우디오시드 A로부터 제조됨)의 기질 로딩 및 1 mM UDP-글루코스(Sigma, >98% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 769 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양액 용해물의 96웰 플레이트 상에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 66시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.3, 3 mM MgCl2, 40℃. 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 10 μL의 반응물을 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 표 15.5에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 서열 번호 770보다 더 많은 양으로 레바우디오시드 I로부터 레바우디오시드 M을 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 상위 2개의 조작된 폴리펩티드는 서열 번호 1292 및 1294이며, 이들은 각각 서열 번호 770과 비교하여 돌연변이 F156R 및 G199H를 갖는다.
표 15.4에 나타낸 아미노산 돌연변이(서열 번호 770에 비해)를 갖는 변이체의 분석을 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 SFP 생성을 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말을 재구성하여 20 g/L의 분말을 제공하였다. 이어서, 10 μL의 상기 원액을 3 mM MgCl2, 1 mM 레바우디오시드 A(Sigma, >96% 순도) 및 4 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)와 함께 100 μL의 총 반응 부피의 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5 내에서 희석하였다. 반응은 0-19시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 30℃에서 수행하였다. 반응을 실시예 14에서 설명한 바와 같이 켄칭하고, 침전시켰다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:100으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다.
표 15.4의 모든 변이체(즉, 서열 번호 790, 792, 794 및 796의 변이체)는 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 서열 번호 770보다 더 많은 양으로 생성하였다. 따라서, 상기 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제 효소는 레바우디오시드 A의 레바우디오시드 D로의 β-글루코실화를 위한 새로운 생체 촉매 시약을 제공한다. 이 실험에서, 서열 번호 792의 변이체는 ADP-글루코스를 보조 기질로서 사용하여 레바우디오시드 A에 대한 가장 높은 초기 활성을 나타내었다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 791)는 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
16
서열 번호 792의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 792부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 791에 의해 코딩되는 GT(즉, 서열 번호 792)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 상기 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는, 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제3 라운드("라운드 3")를 제공하였다.
ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로의 글루코스 전달에 대한 HTP 검정
100 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 792 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 5-6시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM KPhos 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 40℃. 이어서, 10 μL의 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴로 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 실시예 9, 표 9.3에서 설명한 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A를 서열 번호 792보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 16.1에 열거되어 있다. 서열 번호 792와 비교하여 하기 표 16.1에 나타낸 변이체의 분석을 위해, 실시예 1에서 설명된 바와 같은 SFP 생성을 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말을 재구성하여 20 g/L의 분말을 제공하였다. 이어서, 10 μL의 상기 원액을 3 mM MgCl2, 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도) 및 2 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)와 함께 100 μL의 총 반응 부피의 50 mM KPhos 완충제, pH 7 내에서 희석하였다.
반응은 0-21시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 40℃에서 수행하였다. 반응을 상기 설명한 바와 같이 켄칭하고, 침전시켰다. 실시예 1, 표 1.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다.
이들 실험에서, 표 16.2의 모든 변이체(즉, 서열 번호 954, 956 및 990)는 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 서열 번호 792보다 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 954의 변이체는 이들 실험에서 보조 기질로서 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A에 대해 가장 높은 활성을 나타냈다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 953)는 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
17
레바우디오시드
I의
레바우디오시드
M으로의
글루코실화를
포함하는 스테비올 글리코시드
글루코실화를
위한 서열 번호 954의 ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화에 대한 서열 번호 954로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 953에 의해 코딩되는 GT(즉, 서열 번호 954)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 상기 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는, 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제4 라운드("라운드 4")를 제공하였다.
ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
세포를 실시예 13에서 설명된 바와 같이 400 μL의 용해 완충제로 용해시켰다. 100 μL 반응에서 20 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 954 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM KPhos 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 40℃. 반응물을 실시예 16에서 설명된 바와 같이 켄칭하고, 상청액을 실시예 9, 표 9.3에서 설명한 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A를 서열 번호 954보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 17.1에 열거되어 있다. 하기 표 17.1에 나타낸 변이체의 분석을 위해(서열 번호 150과 비교하여), 실시예 1에서 설명된 바와 같은 SFP 생성을 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말을 재구성하여 50 g/L의 분말을 제공하였다. 이어서, 1 μL의 상기 원액을 3 mM MgCl2, 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도) 및 2 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)와 함께 100 μL의 총 반응 부피의 50 mM KPhos 완충제, pH 7 내에서 희석하였다. 반응은 2시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 40℃에서 수행하였다. 이어서, 반응물을 물에 1:5으로 희석하고, 25 μL의 희석된 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 75 μL 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 9, 표 9.3에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10 희석한 후, RapidFire-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다.
서열 번호 1030을 제외하고, 표 17.2의 다른 모든 변이체(서열 번호 1054, 1032, 1028, 1052, 1058, 1014 및 1002)는 이들 실험에서 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 서열 번호 954보다 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 954에 비해 돌연변이 H97G, Q202G 및 N367W를 갖는 변이체(서열 번호 1054)는 이들 실험에서 보조 기질로서 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A에 대한 가장 높은 활성을 나타냈다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1053)는 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
SFP
특성 결정 검정 및
UDP
-
글루코스로부터
레바우디오시드
I로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말을 재구성하여 50 g/L의 분말을 제공하였다. 이어서, 2 μL의 상기 원액을 3 mM MgCl2, 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도) 및 2 mM UDP-글루코스(Sigma, >98% 순도)와 함께 100 μL의 총 반응 부피의 50 mM KPhos 완충제, pH 7 내에서 희석하였다. 반응은 20시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 40℃에서 수행하였다. 이어서, 반응을 0.2% 포름산을 갖는 0.5 부피/부피 아세토니트릴로 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 15, 표 15.5에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:20으로 희석한 후, LC-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다.
서열 번호 954 및 표 17.3의 모든 변이체(서열 번호 1054, 1032, 1028, 1052, 1014, 1002 및 1030)는 UDP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 I로부터 레바우디오시드 M을 음성 대조군보다 높은 수준으로 생성하였다. 서열 번호 1002, 1032 및 1058은 UDP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 I로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 954와 동등하거나 이보다 높은 수준으로 생성하였다. 서열 번호 954에 비해 돌연변이 P175S, T211E, S264A, V279L, I316V, 및 L323V를 갖는 변이체(서열 번호 1002)는 보조 기질로서 UDP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 I에 대한 가장 높은 활성을 나타냈다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1001)는 레바우디오시드 I의 레바우디오시드 M으로의 전환을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
18
서열 번호 74의
수크로스
신타제
변이체
본 실시예에서, 수크로스 및 ADP로부터 ADP-글루코스의 개선된 생성에 대한 서열 번호 73으로부터 유래된 수크로스 신타제(SuS) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝을 위한 실험이 설명된다. 효소의 특정 구조적 특징과 관련된 위치가 포화 돌연변이 유발 또는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서의 상동체로부터의 다양성을 거친 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 73에 의해 코딩된 SuS(즉, 서열 번호 74)의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스의 합성에 대한 개선된 활성을 갖는 37개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제1 라운드("라운드 1")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
100 μL 반응에서 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 물 내의 60% 원액 용액으로부터 30% w/v 수크로스(Sigma)의 기질 로딩 및 2 mM ADP(Sigma, >95%)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 73 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 열순환기에서 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 30℃. 반응물을 95℃에서 10분 동안 열 켄칭한 후, 문헌에 기재된 검정을 적용한 D-프럭토스 데히드로게나제 비색 검정에 의해 분석하였다(예를 들어, Ameyama et al., J. Bacteriol., 145:814-823 [1981]; 및 Ameyama, Meth. Enzymol., 89:20-29 [1982] 참조). 간단히 설명하면, 하룻밤 효소-결합 검정은 프럭토스 농도가 <1 g/L가 되도록 희석된 20 μL 샘플, 20 μL 100 mM 페리시안화칼륨(Sigma P-8131), 및 0.1 % Triton X-100을 갖는 pH 4.6 매킬베인(McIlvaine) 완충제에 용해된 160 μL 0.8 단위/mL 프럭토스 데히드로게나제(Sigma F4892)를 사용하여 96웰 플레이트에서 수행하였다. 이 반응은 프럭토스를 K4Fe(CN)6으로 정량적으로 전환하고, 60 μL의 밤새 반응액을 33 μL의 정지 용액(0.3% w/v 도데실황산나트륨, Sigma L-4509, 8.1% v/v 인산, Sigma P-6560 및 0.5% w/v 황산제이철, Sigma F-1135)에 첨가하고 20분 동안 진탕하여 K4Fe(CN)6이 프러시안 블루로 완전히 전환되도록 허용하고, 그 흡광도를 플레이트 판독기에서 690 nm의 파장에서 판독함으로써 비색 방식으로 정량하였다.
1차 검정 후, 서열 번호 74보다 더 높은 프럭토스 및 따라서 더 높은 화학양론적 ADP-글루코스 형성 활성을 갖는 84개의 조작된 수크로스 신타제(SuS) 변이체 폴리펩티드를 2% w/v 수크로스(Sigma)의 더 낮은 로드 및 1 mM ADP(Sigma, >95%)의 보조 기질 로드에서 삼중으로 스크리닝하였다. 조작된 폴리펩티드는 표 18.1에 열거되어 있다.
실시예
19
서열 번호 1080의
수크로스
신타제
변이체
상기 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리 및 추가의 상동성 다양성이 재조합된 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1079에 의해 코딩된 SuS(즉, 서열 번호 1080)의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 보다 낮은 기질 로드를 사용하여 실시예 18에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 활성을 갖는 34개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제2 라운드("라운드 2")를 제공하였다.
1차 스크리닝 후, 42개의 변이체를 이중으로 재시험하고, 56개의 변이체를 다음과 같은 변형된 동일한 조건 하에서 삼중으로 재시험하였다: 50 mM Tris-HCl pH 7.5를 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7로 변경하고, 온도를 50℃로 올렸다. 실시예 18에 기재된 프럭토스 데히드로게나제 검정을 사용하여 화학양론적 ADP-글루코스에 대한 대리물로서 프럭토스 생성을 정량하였다. 생성되는 조작된 폴리펩티드는 표 19.1에 열거되어 있다. 진탕 플라스크 규모 배양물을 표 19.1에 나타낸 아미노산 돌연변이(서열 번호 1080에 비해)를 갖는 변이체에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같이 단백질 특성화를 위해 성장시켰다.
수크로스
및 ADP로부터
SuS에
의해 생성된 ADP-
글루코스를
사용한
레바우디오시드
A의 글루코실화에 대한 결합 검정을 사용한 SuS 진탕 플라스크 분말의 특성 결정
먼저, SuS 동결건조된 진탕 플라스크 분말을 물에 재구성하고, 총 반응 부피에서 단백질의 0.025-1 g/L의 최종 농도로 첨가하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 10 mM 수크로스(Sigma) 및 1 mM ADP(Sigma)와 함께 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2. ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로의 글루코실 전달을 촉매하기 위해 첨가된 GT는 총 반응 부피 100 μL에서 2 g/L의 최종 농도의 서열 번호 548이었다. 반응은 1시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응은 10 μL 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 9, 표 9.3에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10 희석한 후, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 결합된 진탕 플라스크 분말 검정에서 레바우디오시드 A로부터 생성된 레바우디오시드 I의 상대적인 수준이 표 19.2에 열거되어 있다.
실시예
20
서열 번호 1158의
수크로스
신타제
변이체
상기 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1157에 의해 코딩된 SuS(즉, 서열 번호 1158)의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 활성을 갖는 34개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제3 라운드("라운드 3")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로,
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
다음과 같은 고처리량(HTP) 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다: 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP(Sigma, >95%)의 보조 기질 로딩과 함께 100 μL 반응 부피에서 10 μL SuS 용해물 및 2 g/L GT 서열 번호 548. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 50℃. 상기 설명한 반응물은 10 μL 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:10 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 실시예 9, 표 9.3에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 결합된 활성을 나타내는 56개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드를 동일한 조건 및 2.5배의 감소된 용해물 로드를 사용하여 삼중으로 재시험하였다. 생성된 조작된 폴리펩티드는 표 20.1에 열거되어 있다.
표 20.1에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체(서열 번호 1158에 비해)에 대해 실시예 1에 기술된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
수크로스
및 ADP로부터
SuS에
의해 생성된 ADP-
글루코스를
사용한
레바우디오시드
A의
글루코실화에
대한 결합 검정을 사용한
SuS
진탕 플라스크 분말의 특성 결정
먼저, SuS 동결건조된 진탕 플라스크 분말을 물에 재구성하고, 총 반응 부피에서 단백질의 0.025-5 g/L의 최종 농도로 첨가하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 1 g/L 레바우디오시드 D, 10 mM 수크로스(Sigma) 및 1 mM ADP(Sigma)와 함께 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2. ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로의 글루코실 전달을 촉매하기 위해 첨가된 GT는 총 반응 부피 100 μL에서 1 g/L의 최종 농도의 서열 번호 561/562이었다. 반응은 1시간 동안 300 RPM으로 진탕하면서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 상기 설명한 반응은 10 μL 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 실시예 9, 표 9.3에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 글리코실화된 생성물을 물에 1:10 희석한 후, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 상청액에서 검출하였다. 결합된 진탕 플라스크 분말 검정에서 레바우디오시드 D로부터 생성된 레바우디오시드 M의 상대적인 수준이 표 20.2에 열거되어 있다.
SuS
효소의 발현 분석
수크로스를 이용한 ADP 재순환을 위한 3라운드의 조작된 SuS 폴리펩티드를 폴리아크릴아미드 겔-전기영동에 의해 분석하여 상대적인 단백질 발현 수준을 결정하였다. 샘플을 1x LDS 로딩 완충제 및 1x 환원제(Life Technologies)를 사용하여 제조하였다. 4-12% 비스-트리스 아크릴아미드 겔(Life Technologies)에 진탕 플라스크 규모 배양물로부터의 동결건조된 가용성 조질 용해물을 레인당 5 μg 로딩하고, 200 V에서 25분 동안 MES 이동 완충제를 사용하여 이동시키고, ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 밴드를 정량하였다. 상대적인 발현 수준은 표 20.3에 열거되어 있다. 서열 번호 1079/1080, 1157/1158 및 1221/1222는 현저히 우수한 발현 유전자 및/또는 현저히 우수한 폴딩된/보다 안정한 단백질이다. 이들은 야생형 유전자보다 더 많은 단백질을 생성한다.
실시예
21
AGT
및
ACSuS를
사용한
스테비오시드의
레바우디오시드
A로의 전환
본 실시예에서, AGT 및 ACSuS를 사용하여 레바우디오시드 A를 생성하기 위해 수행된 실험이 설명된다. 사용된 완충제는 3 mM MgSO4와 함께 50 mM pH 7.0 인산칼륨이었다. 효소 및 수크로스 원액 용액(400 g/L)을 완충제에서 제조하였다. "Reb A 60"은 스테비오시드와 레바우디오시드 A의 ~1:2 혼합물이었다. 공기 하의 바이알에 250 μL의 8 g/L β-1,3-GT 서열 번호 1290 원액 용액, 250 μL의 2 g/L SuS 서열 번호 1158 원액 용액 및 500 μL의 50 g/L Reb A 60 및 400 g/L 수크로스 중의 2.6 g/L ADP 원액 용액을 첨가하였다. 최종 조성은 25 g/L Reb A 60, 200 g/L 수크로스, 2 g/L 서열 번호 1290, 0.5 g/L 서열 번호 1158, 및 1.3 g/L(3 mM)의 ADP이었다. 생성된 투명한 균질한 용액을 공기 하에서 교반하였다(반응물은 침전물 형성에 따라 점차 흐려졌다). 반응 진행 후에, 분취하여 1:1의 아세토니트릴/물로 켄칭하였다. 4000 rpm/r.t./5분에서 원심분리한 후, 투명한 균질한 상청액을 표 21.1 및 표 21.2에 열거된 기기 및 파라미터를 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 48시간 후, 반응 혼합물은 >90% Reb A로 구성되었다(표 21.3).
실시예
22
AGT
및
ACSuS를
사용한
스테비오시드의
레바우디오시드
A로의 전환 및
레바우디오시드
A의
레바우디오시드
D로의 전환
본 실시예에서, 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 D를 생성하기 위해 수행된 실험이 설명된다. 공기 하의 바이알에 250 μL의 20 g/L β-1,3-GT 서열 번호 1290 원액 용액, 250 μL의 40 g/L β-1,2-GT 서열 번호 954 원액 용액 및 500 μL의 20 g/L Reb A 60, 400 g/L 수크로스 중의 2.6 g/L ADP 및 1 g/L SuS 서열 번호 1158 원액 용액을 첨가하였다. 사용된 완충제는 3 mM MgSO4를 함유하는 50 mM pH 7.0 인산칼륨이었다. 효소 및 수크로스 원액 용액(400 g/L)을 완충제 중에서 제조하였다. 최종 조성은 10 g/L Reb A 60, 200 g/L 수크로스, 5 g/L 서열 번호 1290, 10 g/L 서열 번호 954, 0.5 g/L 서열 번호 1158, 및 1.3 g/L(3 mM)의 ADP이었다. 생성된 투명한 균질한 용액을 공기 하에서 교반하였다(반응물은 침전물 형성에 따라 점차 흐려졌다). 반응 진행 후에, 분취하여 1:1의 아세토니트릴/물로 켄칭하였다. 4000 rpm/r.t./5분에서 원심분리한 후, 투명한 균질한 상청액을 표 21.1 및 표 21.2에 열거된 기기 및 파라미터를 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 24시간 후, 스테비오시드는 존재하지않았고, 16%의 Reb D의 형성이 관찰되었다(표 22.1).
실시예
23
AGT
및
ACSuS를
사용한
레바우디오시드
D의
레바우디오시드
M으로의 전환
본 실시예에서, AGT 및 ACSuS 변이체를 사용하여 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 생성하기 위해 수행된 실험이 설명된다. 공기 하의 바이알에 250 μL의 80 g/L β-1,3-GT 서열 번호 548 원액 용액, 250 μL의 10 g/L SuS 서열 번호 1158 원액 용액 및 400 g/L 수크로스 중의 500 μL의 2.6 g/L ADP 원액 용액을 첨가하였다. 사용된 완충제는 3 mM MgSO4를 함유하는 50 mM pH 7.0 인산칼륨이었다. 효소 및 수크로스 원액 용액(400 g/L)을 완충제 중에서 제조하였다. 최종 조성은 100 g/L Reb D, 200 g/L 수크로스, 20 g/L 서열 번호 548, 2.5 g/L 서열 번호 1158, 및 1.3 g/L(3 mM)의 ADP이었다. 생성된 두꺼운 슬러리를 공기 하에서 교반하였다. 반응 진행 후에, 분취하여 1:1의 아세토니트릴/물로 켄칭하였다. 4000 rpm/r.t./5분에서 원심분리한 후, 투명한 균질한 상청액을 표 21.1 및 표 21.2에 열거된 기기 및 파라미터를 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 48시간 후, 반응 혼합물은 >90% Reb M으로 구성되었다(표 23.1).
실시예
24
AGT
및
ACSuS를
사용한
스테비오시드의
레바우디오시드
A로의,
레바우디오시드
A의 레바우디오시드 D로의, 및 레바우디오시드 D의 레바우디오시드 M으로의 전환
본 실시예에서, 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를, 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 생성하기 위해 수행된 실험이 설명된다. 공기 하의 바이알에 250 μL의 20 g/L β-1,3-GT 서열 번호 1290 원액 용액, 250 μL의 40 g/L β-1,2-GT 서열 번호 954 원액 용액 및 500 μL의 50 g/L Reb A 60, 400 g/L 수크로스 중의 2.6 g/L ADP, 5 g/L β-1,3-GT 서열 번호 548 및 1 g/L SuS 서열 번호 1158 원액 용액을 첨가하였다. 사용된 완충제는 3 mM MgSO4를 함유하는 50 mM pH 7.0 인산칼륨이었다. 효소 및 수크로스 원액 용액(400 g/L)을 완충제 중에서 제조하였다. 최종 조성은 25 g/L Reb A 60, 200 g/L 수크로스, 5 g/L 서열 번호 1290, 10 g/L 서열 번호 954, 2.5 g/L 서열 번호 548, 0.5 g/L 서열 번호 1158, 및 1.3 g/L(3 mM)의 ADP이었다. 생성된 투명한 균질한 용액을 공기 하에서 교반하였다(반응물은 침전물 형성에 따라 점차 흐려졌다). 반응 진행 후에, 분취하여 1:1의 아세토니트릴/물로 켄칭하였다. 4000 rpm/r.t./5분에서 원심분리한 후, 투명한 균질한 상청액을 표 21.1 및 표 21.2에 열거된 기기 및 파라미터를 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 24시간 후, 5% 미만의 스테비오시드가 잔류하였고, 9%의 Reb M의 형성이 관찰되었다(표 24.1).
실시예
25
AGT
및/또는
ACSuS의
고정화
본 실시예에서, AGT(예를 들어, 서열 번호 1290, 954 및/또는 548의 변이체) 및/또는 ACSuS 변이체(예를 들어, 서열 번호 1158)를 고정화하기 위해 수행된 실험이 설명된다. 용기에 효소 용액을 단독으로 또는 효소의 조합물로서(즉, AGT 및/또는 ACSuS 효소) 고체 지지체와 함께 첨가한다. 고체 지지체는 티올, 알콜, 아민, 올레핀, 알킬 할라이드 및/또는 에폭시드와 같은 공유 결합 형성 관능기가 존재하거나 존재하지 않는 양이온성, 음이온성, 소수성, 또는 친수성이다. 고체 지지체는 별개의 중합체 수지 또는 비정질(나노) 점토 또는 활성탄이다. 자성 입자는 생성물 단리/효소 재순환에 적합할 때 사용된다. 반응은 글루타르알데히드의 존재 또는 부재 하에 수행된다. 고체 지지체에 의한 효소 흡수의 진행에 이어서, 브래드포드(Bradford) 검정이 수행된다. 대안적으로, 고체 지지체를 컬럼에 충전하고, 원하는 정도의 효소가 포획될 때까지 필요하다면 재순환시키면서 효소 용액을 컬럼을 통해 흐르게 한다. 일부 실시양태에서, 관심 있는 모든 효소는 동일한 반응 용기에서 동일한 고체 지지체 상에 고정화되는 반면, 일부 대안적인 실시양태에서, 효소는 개별 용기 또는 용기의 조합물에 개별적으로 고정화된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 효소는 여과를 통해 단리되거나 또는 완충제, 수크로스, ADP 및 기질을 고정화 반응 혼합물에 첨가함으로써 즉시 사용된다.
실시예
26
고정화된
AGT
및/또는
ACSuS를
사용한
스테비오시드의
레바우디오시드
A로의 전환 및 당 용액의 재순환
본 실시예에서, 고정화된 AGT(예를 들어, 서열 번호 1290) 및 ACSuS(예를 들어, 서열 번호 1158)를 사용한 스테비오시드의 레바우디오시드 A로의 전환, 및 당 용액 재순환이 설명된다. 용기에 고정화된 β-1,3-GT(예를 들어, 서열 번호 1290) 및 고정화된 SuS(예를 들어, 서열 번호 1158)를 첨가한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 효소 중 하나는 고정화된 형태로 사용되고, 다른 하나는 용액 형태로 사용된다. 완충제, 수크로스, ADP 및 기질(즉, 스테비오시드 또는 Reb A 60)을 첨가한 후, 원하는 전환율에 도달할 때까지 반응을 모니터링한다. 일부 실시양태에서, 생성물 및 고정화된 효소는 여과에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 효소는 원심분리, 입자 크기 여과 또는 자기 회수를 통해 생성물로부터 추가로 분리되어 재사용된다. 당 여액은 다시 반복을 위해 용기로 반송된다.
실시예
27
고정화된
AGT
및/또는
ACSuS를
사용한
레바우디오시드
A의
레바우디오시드
D로의
전환 및 당 용액의 재순환
본 실시예에서, 고정화된 AGT 및 ACSuS를 사용한 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 D를 생성하기 위해 수행된 실험, 및 당 용액 재순환이 설명된다. 용기에 고정화된 β-1,2-GT(예를 들어, 서열 번호 954) 및 고정화된 SuS(예를 들어, 서열 번호 1158)를 첨가한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 효소 중 하나는 고정화된 형태로 사용되고, 다른 하나는 용액 형태로 사용된다. 완충제, 수크로스, ADP 및 기질(즉, 스테비오시드 또는 Reb A 60)을 첨가한 후, 원하는 전환율에 도달할 때까지 반응을 모니터링한다. 일부 실시양태에서, 생성물 및 고정화된 효소는 여과에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 효소는 원심분리, 입자 크기 여과 또는 자기 회수를 통해 생성물로부터 추가로 분리되어 재사용된다. 당 여액은 다시 반복을 위해 용기로 반송된다.
실시예
28
고정화된
AGT
및/또는
ACSuS를
사용한
레바우디오시드
D의
레바우디오시드
M으로의
전환 및 당 용액의 재순환
본 실시예에서, 고정화된 AGT 및 ACSuS를 사용한 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 생성하기 위해 수행된 실험, 및 당 용액 재순환이 설명된다. 용기에 고정화된 β-1,3-GT(예를 들어, 서열 번호 548) 및 고정화된 SuS(예를 들어, 서열 번호 1158)를 첨가한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 효소 중 하나는 고정화된 형태로 사용되고, 다른 하나는 용액 형태로 사용된다. 완충제, 수크로스, ADP 및 RebD를 첨가한 후, 원하는 전환율에 도달할 때까지 반응을 모니터링한다. 일부 실시양태에서, 생성물 및 고정화된 효소는 여과에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 효소는 원심분리, 입자 크기 여과 또는 자기 회수를 통해 생성물로부터 추가로 분리되어 재사용된다. 당 여액은 다시 반복을 위해 용기로 반송된다.
실시예
29
고정화된
AGT
및
ACSuS를
사용한
스테비오시드의
레바우디오시드
A로의 및
레
바우디오시드 A의 레바우디오시드 D로의 전환 및 당 용액의 재순환
본 실시예에서, 고정화된 AGT 및 ACSuS를 사용한 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A의 및 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 생성하기 위해 수행된 실험, 및 당 용액 재순환이 설명된다. 용기에 고정화된 β-1,3-GT(예를 들어, 서열 번호 1290) 및 β-1,2-GT(예를 들어, 서열 번호 954) 및 고정화된 SuS(예를 들어, 서열 번호 1158)를 첨가한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 효소 중 하나 또는 2개는 고정화된 형태로 사용되고, 다른 효소는 용액 형태로 사용된다. 완충제, 수크로스, ADP 및 기질(스테비오시드 또는 Reb A 60)을 첨가한 후, 원하는 전환율에 도달할 때까지 반응을 모니터링한다. 일부 실시양태에서, 생성물 및 고정화된 효소는 여과에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 효소는 원심분리, 입자 크기 여과 또는 자기 회수를 통해 생성물로부터 추가로 분리되어 재사용된다. 당 여액은 다시 반복을 위해 용기로 반송된다.
실시예
30
고정화된
AGT
및
ACSuS를
사용한
스테비오시드의
레바우디오시드
A로의,
레바
우디오시드 A의
레바우디오시드
D로의, 및
레바우디오시드
D의
레바우디오시드
M으로의 전환 및 당 용액의 재순환
용기에 고정화된 β-1,3-GT(예를 들어, 서열 번호 1290), β-1,2-GT(예를 들어, 서열 번호 954), β-1,3-GT(예를 들어, 서열 번호 548), 및 고정화된 SuS(예를 들어, 서열 번호 1158)를 첨가한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이들 효소 중 1, 2 또는 3개는 고정화된 형태로 사용되고, 다른 효소는 용액 형태로 사용된다. 완충제, 수크로스, ADP 및 기질(스테비오시드 또는 Reb A 60)을 첨가한 후, 원하는 전환율에 도달할 때까지 반응을 모니터링한다. 일부 실시양태에서, 생성물 및 고정화된 효소는 여과에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 효소는 원심분리, 입자 크기 여과 또는 자기 회수를 통해 생성물로부터 추가로 분리되어 재사용된다. 당 여액은 다시 반복을 위해 용기로 반송된다.
실시예
31
서열 번호 1222의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1222에 의해 코딩된 SuS의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 활성을 갖는 49개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제4 라운드("라운드 4")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다: 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 250 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 트리스-HCl, pH 7.5로 20배 희석하였다. 이어서, 10 μL의 희석된 SuS 용해물 및 2 g/L GT 서열 번호 696(Rd8BB)을 ~1 mM 레바우디오시드 D의 기질 로딩 및 1 mM ADP(Sigma, >95%) 및 10 mM 수크로스(Sigma)의 보조 기질 로딩과 함께 100 μL 반응 부피에서 조합하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 50℃. 상기 설명한 반응물은 10 μL 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 10배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다.
분석 후에, 레바우디오시드 D에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 49개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 생성된 조작된 폴리펩티드는 표 31.2에 열거되어 있다. 표 31.3에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 아래에서 설명되는 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말(
SFP
)의 생성
본원에서 설명되는 생체 촉매 과정에 사용되는 특성 결정 검정을 위한 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드 진탕 플라스크 분말(SFP)을 생성하기 위해 진탕 플라스크 절차를 사용하였다. 효소의 진탕 플라스크 분말(SFP) 제제는 HTP 검정에서 사용된 세포 용해물과 비교하여 보다 정제된 제제(예를 들어, 총 단백질의 30% 초과까지의)를 제공하고, 또한 보다 농축된 효소 용액의 사용을 허용한다. 관심 있는 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이의 단일 콜로니를 30 μg/ml 클로람페니콜 및 1% 글루코스를 함유하는 5 mL 루리아 베르타니 브로쓰에 접종하였다. 세포를 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 인큐베이터에서 밤새(적어도 16시간) 성장시켰다. 배양액을 1 L 플라스크에서 30 μg/ml CAM을 함유하는 250 mL 테리픽 브로쓰(12 g/L 박토-트립톤, 24 g/L 효모 추출물, 4 mL/L 글리세롤, 65 mM 인산칼륨, pH 7.0, 1 mM MgS04) 내로 0.2의 600 nm의 광학 밀도(OD600)까지 희석하고, 30℃에서 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 4 SuS 변이체의 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.3, 3 mM 염화마그네슘, 1 g/L 레바우디오시드 D, 10 mM 수크로스, 1 mM ADP, 및 2 g/L 서열 번호 734를 함유하는 0.125 g/L 농도의 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 10 μL의 반응 혼합물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가하여 반응을 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 10배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 변이체 중 적어도 3개가 서열 번호 1222보다 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 1222에 비해 변이체에 의해 레바우디오시드 D로부터 생성된 레바우디오시드 M의 수준이 표 31.3에 열거되어 있다. 서열 번호 1222와 비교하여 돌연변이 H47L, R93V, P358E, I372V, W375Y, R440P 및 K724H(서열 번호 1392)를 갖는 변이체가 가장 높은 활성을 가졌다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1391)은 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
32
서열 번호 1392의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1391에 의해 코딩된 SuS의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 활성을 갖는 86개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제5 라운드("라운드 5")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다: 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 트리스-HCl, pH 7.5로 25-60배 희석하였다. 10 μL의 희석된 SuS 용해물 및 2 g/L GT 서열 번호 4684(Rd9BB)을 ~1 mM 레바우디오시드 D의 기질 로딩 및 1 mM ADP(Sigma, >95%) 및 10 mM 수크로스(Sigma)의 보조 기질 로딩과 함께 100 μL 반응 부피에서 조합하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 50℃. 상기 설명한 반응물은 10 μL 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 10배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다.
분석 후에, 레바우디오시드 D에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 86개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 생성된 조작된 폴리펩티드는 표 32.1에 열거되어 있다. 표 32.2에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 아래에서 설명되는 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 4 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.3, 3 mM 염화마그네슘, 1 g/L 레바우디오시드 D, 10 mM 수크로스, 1 mM ADP, 및 2 g/L GT 서열 번호 4684를 함유하는 0.05 g/L 농도의 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1-2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 반응물을 물에 2.5배 희석함으로써 가용화하고, 10 μL의 희석된 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가하여 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 3.33배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 표 32.2의 모든 변이체가 서열 번호 1392보다 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 1392에 비해 변이체에 의해 레바우디오시드 D로부터 생성된 레바우디오시드 M의 수준이 표 32.2에 열거되어 있다. 서열 번호 1392와 비교하여 돌연변이 V68A, L98V, R129E, R154H, 및 A635S(서열 번호 1455)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
33
서열 번호 1456의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1455에 의해 코딩된 SuS의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 활성을 갖는 16개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제6 라운드("라운드 6")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다: 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 트리스-HCl, pH 7.5로 30배 희석하였다. 10 μL의 희석된 SuS 용해물 및 1 g/L GT 서열 번호 2814(Rd8BB)을 4.5 mM 레바우디오시드 A 97의 기질 로딩 및 0.25 mM ADP(Sigma, >95%) 및 10 mM 수크로스(Sigma)의 보조 기질 로딩과 함께 100 μL 반응 부피에서 조합하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 50℃. 상기 설명한 반응물은 10 μL 검정 혼합물을 90 μL의 물에 첨가하여 가용화하고, 10 μL의 가용화된 검정 혼합물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 7.3배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다.
분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 16개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 생성된 조작된 폴리펩티드는 표 33.1에 열거되어 있다. 표 33.2에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 아래에서 설명되는 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 6 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 4.5 mM 레바우디오시드 A 97, 30 mM 수크로스, 0.25 mM ADP, 및 1 g/L GT 서열 번호 2814를 함유하는 0.01 g/L 농도의 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1-2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 반응물을 물에 10배 희석함으로써 가용화하고, 10 μL의 희석된 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가하여 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 4.4배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 적어도 4개의 변이체가 서열 번호 1456보다 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 1456에 비해 변이체에 의해 레바우디오시드 A로부터 생성된 레바우디오시드 D의 수준이 표 32.2에 열거되어 있다. 서열 번호 1456과 비교하여 돌연변이 Y17D, G54D, S161T, F519T, L727E, 및 A738E(서열 번호 1582)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
34
서열 번호 1582의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1581에 의해 코딩된 SuS의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 활성을 갖는 87개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제7 라운드("라운드 7")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 조합 라이브러리를 스크리닝하였다: 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 트리스-HCl, pH 7.5로 ~90배 희석하였다. 이어서, 10 μL의 희석된 SuS 용해물 및 1 g/L GT 서열 번호 2884(Rd9BB)을 4.5-7.5 mM 레바우디오시드 A 97의 기질 로딩 및 0.2-0.25 mM ADP(Sigma, >95%) 및 30 mM 수크로스(Sigma)의 보조 기질 로딩과 함께 100 μL 반응 부피에서 조합하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 55℃. 상기 설명한 반응물은 10 μL 검정 혼합물을 90-190 μL의 물에 첨가하여 가용화하고, 10 μL의 가용화된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 4.4-6.7배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다.
분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 87개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 생성된 조작된 폴리펩티드는 표 34.1에 열거되어 있다. 표 34.2에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 31에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 7 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 7.5 mM 레바우디오시드 A 97, 30 mM 수크로스, 0.2 mM ADP, 및 1 g/L GT 서열 번호 2884를 함유하는 0.02 g/L 농도의 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 반응물을 물에 20배 희석함으로써 가용화하고, 10 μL의 희석된 반응물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가하여 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 4.4배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 적어도 3개의 변이체가 서열 번호 1582보다 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 1582에 비해 변이체에 의해 레바우디오시드 A로부터 생성된 레바우디오시드 D의 수준이 표 34.2에 열거되어 있다. 서열 번호 1582와 비교하여 돌연변이 F160W, Q381S, R550Q, L636Q, 및 A681V(서열 번호 1764)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
35
서열 번호 1764의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1763에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 활성을 갖는 24개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제8 및 9 라운드("라운드 7" 및 "라운드 9")를 제공하였다.
라운드 8에 대해
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 조합 라이브러리를 스크리닝하였다: 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 트리스-HCl, pH 7.5로 15배 희석하였다. 이어서, 10 μL의 희석된 SuS 용해물 및 1 g/L GT 서열 번호 2884(Rd9BB)을 15 mM 레바우디오시드 A 97의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >93%) 및 45 mM 수크로스(자당)의 보조 기질 로딩과 함께 100 μL 반응 부피에서 조합하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 55℃. 상기 설명한 반응물은 10 μL 검정을 390 μL의 물에 첨가하여 가용화하고, 20 μL의 가용화된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 180 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 3.3배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 서열 번호 1764에 비해 실질적으로 개선된 조합 변이체 폴리펩티드가 확인되지 않았고, 따라서 동일한 설정을 사용하여 또 다른 세트의 조합 및 포화 돌연변이 유발 라이브러리를 생성하였으며, 이 세트는 "라운드 9"로 명명되었다.
라운드 9에 대해
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 조합 라이브러리를 스크리닝하였다: 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 희석되지 않은 용해물(포화 돌연변이 유발 라이브러리) 또는 32x 희석된 용해물(라운드 9 조합 라이브러리)를 트리스-HCl, pH 7.5에 첨가하였다. 효소를 열로 자극하기 위해 라운드 9 라이브러리 용해물을 62℃에서 1시간(조합 라이브러리) 또는 3.75시간(포화 돌연변이 유발 라이브러리) 동안 사전 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된 SuS 용해물 및 1 g/L GT 서열 번호 3244(Rd12B)를 15 mM 레바우디오시드 A 97의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%), 45 mM 수크로스(자당) 및 9 mM 프럭토스(Sigma)의 보조 기질 로딩과 함께 100 μL 반응 부피에서 조합하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2-3시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 10 μL 검정물을 390 μL의 물에 첨가하여 가용화하고, 20 μL의 가용화된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 180 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 3.3배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 결합된 개선된 활성을 나타내는 24개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 생성된 조작된 폴리펩티드는 표 35.1에 열거되어 있다. 표 35.2에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 31에 기재된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 9 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 45 mM 수크로스, 9 mM 프럭토스, 0.2 mM ADP, 및 1 g/L GT 서열 번호 3244를 함유하는 0.006-0.02 g/L 농도의 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 예비 인큐베이팅을 수행하지 않고 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하거나, 또는 SFP는 62℃에서 1시간 동안 pH 6 인산칼륨 완충제에서 10배 최종 농도에서 예비 인큐베이팅한 후 60℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응물을 물에 40배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 10배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 3.3배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 표 35.2에 열거된 8개의 모든 변이체가 서열 번호 1764보다 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 1764와 비교하여 돌연변이 G181N, A548P, H705P(서열 번호 1804)를 갖는 변이체가 글루코실을 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
36
서열 번호 1804의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1804에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 증가된 활성을 갖는 82개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제10 라운드("라운드 10")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 인산칼륨-HCl, pH 6.0으로 20배 희석하고, 64℃(조합 라이브러리) 또는 65℃(포화 돌연변이 유발 라이브러리)에서 15분 동안 미리 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된 SuS 용해물 및 0.5-1 g/L GT(각각 서열 번호 3696 또는 3502)를 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 0.2 mM ADP(Sigma, >93%), 45 mM 수크로스(자당) 및 9 mM 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 3시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 40배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 10배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 3.3배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 표 36.1에 열거되어 있다. 표 36.2에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 31에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 10 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 인산칼륨 완충제, pH 6에 0.06-2 g/L로 만들고, 분취액을 15분 동안 열순환기에서 64℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 예비 인큐베이팅되거나 되지 않은 10 μL의 상기 SFP 희석액을 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 6, 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 45 mM 수크로스, 9 mM 프럭토스, 0.2 mM ADP, 및 1 g/L GT 서열 번호 3696을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 예비 인큐베이팅되지 않은 SFP 샘플에 대해서는 55℃에서, 예비 인큐베이팅된 SFP에 대해서는 60℃에서 3시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 수행하였다. 반응물을 물에 40배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 10배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 3.3배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 표 36.2에 나열된 7개의 모든 변이체는 예비 인큐베이팅된 조건 하에서 서열 번호 1804보다 더 높은 활성을 가졌고, 1개를 제외한 모든 변이체가 또한 55℃ 조건 하에서 더 높은 활성을 가졌다. 돌연변이 P517A 및 V681A(서열 번호 1804)를 갖는 변이체는 서열 번호 1804와 비교하여 두 조건 모두 하에서 가장 개선된 것이었고, 따라서 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
37
서열 번호 1840의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1839에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 증가된 활성을 갖는 167개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제11 라운드("라운드 11")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 인산칼륨 완충제, pH 6.0으로 10-20배 희석하고, 66℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물 및 0.5 g/L GT 서열 번호 3696 또는 3956을 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 0.2 mM ADP(Amresco, >93%), 45 mM 수크로스(자당), 및 9 mM 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 40배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5-10배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 ~10 μM 스테비올 글리코시드까지 물에 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 표 37.1 및 37.2에 열거되어 있다. 표 37.3에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 31에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 11 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 인산칼륨 완충제, pH 6에 0.03-1 g/L로 만들고, 분취액을 15분 동안 열순환기에서 66℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 예비 인큐베이팅되거나 되지 않은 10 μL의 상기 SFP 희석액을 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 6, 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 45 mM 수크로스, 9 mM 프럭토스, 0.2 mM ADP, 및 0.5 g/L GT 서열 번호 3956을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 예비 인큐베이팅되지 않은 SFP 샘플에 대해서는 55℃에서, 예비 인큐베이팅된 SFP에 대해서는 60℃에서 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 수행하였다. 반응물을 물에 40배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 10배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 3.3배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 표 37.3에 나열된 8개의 모든 변이체는 예비 인큐베이팅된 조건 하에서 서열 번호 1840보다 더 높은 활성을 가졌고, 3개를 제외한 모든 변이체가 또한 55℃ 조건 하에서 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 1840과 비교하여 두 조건 모두 하에서 개선된 돌연변이 D17R, D52P, L388K, G589S, E738S, 및 D765S(서열 번호 2064)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
38
서열 번호 2064의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 2063에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 증가된 활성을 갖는 92개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제12 라운드("라운드 12")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 인산칼륨 완충제, pH 6.0으로 10배 희석하고, 68℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물 및 0.5 g/L GT 서열 번호 3956 또는 4256을 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 0.2 mM ADP(Amresco, >93%), 37.5 mM 수크로스(자당), 및 9 mM 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 40배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 7.5배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 표 38.1 및 38.2에 열거되어 있다. 표 38.3에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 31에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 12 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 인산칼륨 완충제, pH 6에 0.03-1 g/L로 만들고, 분취액을 15분 동안 열순환기에서 68℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 예비 인큐베이팅되거나 되지 않은 10 μL의 상기 SFP 희석액을 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 6, 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 37.5 mM 수크로스, 9 mM 프럭토스, 0.2 mM ADP, 및 0.5 g/L GT 서열 번호 4256을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 예비 인큐베이팅되지 않은 SFP 샘플에 대해서는 55℃에서, 예비 인큐베이팅된 SFP에 대해서는 60℃에서 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 수행하였다. 반응물을 물에 40배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 10배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 3.3배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 동결건조 전에 맑아진 진탕 플라스크 용해물을 사용하여 추가의 열안정성 특성 결정을 다음과 같이 수행하였다: 용해물을 완충제로 400배 희석하고, 16-18시간 동안 55-70℃의 구배로 열 순환기에서 인큐베이팅하였다. 남아있는 % 활성을 결정하기 위해, 예비 인큐베이팅된 용해물을 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D 및 55℃에서의 4시간 인큐베이션을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 검정하였다. 남아있는 % 활성은 고온에서의 활성을 예비 인큐베이팅된 최저 온도에서의 활성으로 나눈 값으로 나타냈다. 표 38.3에 나열된 7개의 모든 변이체는 예비 인큐베이팅된 조건 하에서 서열 번호 2064보다 더 높은 활성을 가졌고, 2개의 변이체는 또한 55℃ 조건 하에서 덜 유해하였다. 서열 번호 2064와 비교하여 모든 조건 하에서 개선된 돌연변이 P57W, L562I, 및 R711K(서열 번호 2432)를 갖고 라운드 10 포화 돌연변이 유발 스크린으로부터의 상위 돌연변이를 함유하는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
39
서열 번호 2432의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 2431에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 증가된 활성을 갖는 46개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제13 라운드("라운드 13")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 조합 라이브러리의 경우, 용해물을 인산칼륨 완충제, pH 6.0으로 10배 희석하고, 73℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅하였다. 포화 돌연변이 유발의 경우, 용해물을 인산칼륨 완충제, pH 6.0으로 20배 희석하고, 62℃에서 17.5분 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물 및 0.5 g/L GT 서열 번호 4256 또는 4550을 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 0.2 mM ADP(Amresco, >93%), 37.5 mM 수크로스(자당), 및 9 mM 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 3-4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 40배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 7.5배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 표 39.1 및 39.2에 열거되어 있다. 표 39.3에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 31에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 13 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 인산칼륨 완충제, pH 6에 0.03-1 g/L로 만들고, 분취액을 15분 동안 열순환기에서 73℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 예비 인큐베이팅되거나 되지 않은 10 μL의 상기 SFP 희석액을 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 6, 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 37.5 mM 수크로스, 9 mM 프럭토스, 0.2 mM ADP, 및 0.5 g/L GT 서열 번호 4550을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 예비 인큐베이팅되지 않은 SFP 샘플에 대해서는 55℃에서, 예비 인큐베이팅된 SFP에 대해서는 60℃에서 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 수행하였다. 반응물을 물에 40배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액은 물에 3.3배 희석한 후, 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석되었다. 동결건조 전에 맑아진 진탕 플라스크 용해물을 사용하여 추가의 열안정성 특성 결정을 다음과 같이 수행하였다: 용해물을 완충제로 400배 희석하고, 16.7시간 동안 62-78℃의 구배로 열 순환기에서 인큐베이팅하였다. 남아있는 % 활성을 결정하기 위해, 예비 인큐베이팅된 용해물을 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D 및 60℃에서의 4시간 인큐베이션을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 검정하였다. 남아있는 % 활성은 고온에서의 활성을 예비 인큐베이팅된 최저 온도에서의 활성으로 나눈 값으로 나타냈다. 표 39.3에 나열된 8개의 모든 변이체는 적어도 하나의 조건 하에서 서열 번호 2432보다 더 높은 활성을 가졌고, 5개의 변이체는 모든 조건 하에서 개선되었다. 서열 번호 2432와 비교하여 모든 조건 하에서 개선된 돌연변이 Q33H, L47P, E59A, P81L, S175G, P530F, E534W, Q550I, 및 R606M(서열 번호 2510)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
40
서열 번호 2510의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 2509에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 증가된 활성을 갖는 164개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제14 라운드("라운드 14")를 제공하였다.
레바우디오시드
M을 형성하기 위한
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 14.5 g/L RebA60과 함께 인산칼륨 완충제, pH 6.0으로 35배 희석하고, 73℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물, 0.08 g/L β1,2 GT SFP 서열 번호 4550, 및 0.2 g/L β1,3 GT SFP 서열 번호 6864를 20 g/L RebA60, 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급), 40 g/L 수크로스(자당), 및 9.6 g/L 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 40배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 15배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 표 40.1 및 40.2에 열거되어 있다. 표 40.3에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
레바우디오시드
M을 형성하기 위한
수크로
스로부터 레바우디오시드 A 60으로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 14 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 인산칼륨 완충제, pH 6에 14.5 g/L RebA60 내의 0.03-1 g/L로 만들고, 분취액을 15분 동안 열순환기에서 73℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물, 0.08 g/L β1,2 GT SFP 서열 번호 4550, 및 0.2 g/L β1,3 GT SFP 서열 번호 6864를 20 g/L RebA60, 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급), 40 g/L 수크로스(자당), 및 9.6 g/L 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 40배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 15배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 표 40.3에 나열된 8개의 모든 변이체는 서열 번호 2510보다 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 2510과 비교하여 가장 개선된 돌연변이 A41K, G112Q, G485S, 및 F684H(서열 번호 7506)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
41
서열 번호 7506의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 7505에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 증가된 활성을 갖는 56개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제15 라운드("라운드 15")를 제공하였다.
레바우디오시드
M을 형성하기 위한
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 14.5 g/L RebA60과 함께 인산칼륨 완충제, pH 6.0으로 50배 희석하고, 73℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물, 0.08 g/L β1,2 GT SFP 서열 번호 4550, 및 0.2 g/L β1,3 GT SFP 서열 번호 6864를 20 g/L RebA60, 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급), 40 g/L 수크로스(자당), 및 9.6 g/L 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 20배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 표 41.1에 열거되어 있다. 표 41.2에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
레바우디오시드
M을 형성하기 위한
수크로스로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 15 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 인산칼륨 완충제, pH 6에 14.5 g/L RebA60 내의 0.03-1 g/L로 만들고, 분취액을 15분 동안 열순환기에서 73℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물, 0.08 g/L β1,2 GT SFP 서열 번호 4550, 및 0.2 g/L β1,3 GT SFP 서열 번호 6864를 20 g/L RebA60, 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급), 40 g/L 수크로스(자당), 및 9.6 g/L 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 20배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 표 41.2에 나열된 8개의 모든 변이체는 서열 번호 7506보다 더 높은 활성을 가졌다. 서열 번호 7506과 비교하여 가장 개선된 돌연변이 D42T, I480V, L561I, 및 H724K(서열 번호 8420)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
42
서열 번호 8420의
수크로스
신타제
변이체
초기 라운드의 진화에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 8419에 의해 코딩된 수크로스 신타제의 유도 진화를 계속하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스의 생성에 대한 증가된 활성을 갖는 155개의 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드의 제16 라운드("라운드 16")를 제공하였다.
레바우디오시드
M을 형성하기 위한
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
다음과 같은 HTP 효소 결합 검정을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 펠렛화된 이. 콜라이 배양물을 1 mM 황산마그네슘 및 0.5 mg/mL 리소자임 및 폴리믹신 B 술페이트(PMBS)와 함께 400 μL의 트리스-HCl, pH 7.5로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 용해물을 14.5 g/L RebA60과 함께 인산칼륨 완충제, pH 6.0으로 30배 희석하고, 75℃에서 1시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 SuS 용해물, 0.08 g/L β1,2 GT SFP 서열 번호 7784, 및 0.2 g/L β1,3 GT SFP 서열 번호 8088을 20 g/L RebA60, 0.025 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급), 40 g/L 수크로스(자당), 및 9.6 g/L 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 20배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 분석 후에, 레바우디오시드 A에 대해 GT와 연결된 개선된 활성을 보인 조작된 SuS 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 표 42.1에 열거되어 있다. 표 42.2에 나타낸 아미노산 돌연변이를 갖는 변이체에 대해 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단백질 특성화를 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
레바우디오시드
M을 형성하기 위한
수크로
스로부터 레바우디오시드 A 60으로의 글루코실 전달에 대한 분석
레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 M의 형성을 용이하게 하기 위한 조작된 라운드 16 SuS 변이체의 수크로스 및 ADP에 대한 활성을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 진탕 플라스크 분말(SFP)을 인산칼륨 완충제, pH 6에 14.5 g/L RebA60 내의 0.03-1 g/L로 만들고, 분취액을 1시간 동안 열순환기에서 75℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 10 μL의 희석된, 예비 인큐베이팅된 또는 예비 인큐베이팅되지 않은 SuS 용해물, 0.08 g/L β1,2 GT SFP 서열 번호 7784, 및 0.2 g/L β1,3 GT SFP 서열 번호 8088을 20 g/L RebA60, 0.025 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급), 40 g/L 수크로스(자당), 및 9.6 g/L 프럭토스와 함께 100 μL 반응 부피에서 사용하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 상기 설명한 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 20배 희석한 후, 스테비올 글리코시드 생성물을 표 31.1에 기재된 기기 및 파라미터를 사용하여 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 검출하였다. 표 42.2에 나열된 8개의 모든 변이체는 예비 인큐베이팅 후에 서열 번호 8420보다 더 많은 생성을 보였다. 서열 번호 8420과 비교하여 가장 개선된 돌연변이 D12S, R136Q, R139K, A517P, G603Q, L630M, A642V, 및 V756C(서열 번호 8910)를 갖는 변이체가 글루코스를 수크로스로부터 ADP로 전달하는 재순환 반응의 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
43
서열 번호 1054의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 1054로부터 유래된 GT 폴리펩티드(β1, 2GT)의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1053에 의해 코딩된 GT의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 26개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제5 라운드("라운드 5")를 제공하였다.
ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 1053 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 4배 희석되었다. 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물을 사용하고 1 mM 스테비오시드 A(>97% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 50℃. 반응물은 25 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 75 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성 혼합물을 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:5로 희석하고, 표 31.1에서 설명한 바와 같이 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 분석하였다. ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었고, 조작된 폴리펩티드는 표 43.1에 열거되어 있다. 표 43.2에 열거된 변이체에 대해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 5 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.006-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 1 mM 레바우디오시드 A 및 1 mM ADP-글루코스를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 반응물은 물에 1:5로 희석하고, 25 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 75 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 상청액을 물에 1:5로 희석한 후, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석하였다. 0.05 g/L SFP 로딩시에 레바우디오시드 A에 대한 라운드 5 변이체의 활성은 표 43.2에 열거되어 있다. 표 43.2에 열거된 6개의 모든 변이체가 서열 번호 1054보다 더 높은 활성을 가졌다. 돌연변이 E24L, N162R, E198P, M201G, T211E, W226V, L323V, 및 L351M(서열 번호 2600) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 2599)를 갖는 변이체가 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
44
레바우디오시드
I의
레바우디오시드
M으로의
글루코실화를
위한
서열 번호 1002의
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 1002로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 레바우디오시드 I에 대한 개선된 글리코실트랜스퍼라제 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 1001에 의해 코딩된 GT의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정에 의해 스크리닝함으로써, UDP-글루코스 및 레바우디오시드 I에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 라운드("라운드 5 RebI")를 제공하였다.
UDP
-
글루코스로부터
레바우디오시드
I로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
세포를 250 μL 용해 완충제로 용해시켰다. 100 μL 반응물 내의 25 μL 용해물의 용해물 로딩을 사용하고 1 mM UDP-글루코스(Sigma, >98% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 서열 번호 1002 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM KPhos 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 40℃. 반응물은 10 μL의 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성 혼합물을 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:5로 희석하고, 표 44.1에서 설명한 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. UDP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 I로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 1002보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 44.2에 열거되어 있다.
실시예
45
서열 번호 2600의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 2600으로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 2599에 의해 코딩된 GT의 유도 진화를 수행하였다. 라이브러리는 효소의 표면 잔기와 관련된 돌연변이 또는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 유익한 돌연변이를 재조합하거나, 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 상동체로부터의 다양성을 조합 방식으로 혼입하거나, 또는 포화 돌연변이 유발을 거친 효소의 특정한 구조적 특징을 나타냈다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제6 라운드("라운드 6")를 제공하였다. 24개의 조작된 변이체가 재조합된 유익한 돌연변이 및 상동체 다양성으로부터 확인되었고(표 45.1), 21개의 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 45.2).
ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로의 글루코스 전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 2600 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 40배 희석되었다. 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물을 사용하고 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도)의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 45℃. 반응물은 25 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 75 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성 혼합물을 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:5로 희석하고, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 분석하였다. ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 D를 생성하고 조합 라이브러리로부터 확인된 조작된 변이체가 표 45.1에 열거되어 있다. 포화 돌연변이 유발 라이브러리로부터의 상위 84개의 변이체는 50℃에서 상기 설명한 바와 같이 삼중으로 재시험하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 45.2에 열거되어 있다. 표 45.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의 글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 6 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.003-0.1 g/L 수준의 SFP를 사용하여 실시예 40에서 설명한 바와 같은 실험을 수행하였다. 0.025 g/L SFP 로딩시에 레바우디오시드 A에 대한 라운드 6 변이체의 전환은 표 45.3에 열거되어 있다. 표 45.3에 열거된 5개의 모든 변이체가 서열 번호 2600보다 더 높은 활성을 가졌다. 돌연변이 H2-, H7E, A12S, R15K, P175S, T260V, 및 E318D(서열 번호 2718) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 2717)를 갖는 변이체가 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
46
서열 번호 2718의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 2718로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성 또는 발현과 관련된 유익한 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 2717에 의해 코딩된 GT의 유도 진화를 수행하였다. 또 다른 라이브러리는 포화 돌연변이 유발을 거친 효소의 특정한 구조적 특징을 나타냈다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제7 라운드("라운드 7")를 제공하였다. 25개의 조작된 변이체가 재조합된 유익한 돌연변이로부터 확인되었고(표 46.1), 29개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 46.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 2717 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 10배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물을 사용하고 7.5 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 1 mM ADP(Sigma, >95%) 및 15 mM 수크로스(Sigma)의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 50℃. 반응물은 물에 1:10으로 희석한 후, 10 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 90 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성 혼합물을 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:10으로 희석하고, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire SPE-MS/MS에 의해 분석하였다. 남은 2개의 라운드 7 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 0.2 g/L SUS SFP 서열 번호 1456 SFP 및 30 mM 수크로스를 사용하였다. 재조합된 유익한 돌연변이에 의해 레바우디오시드 A에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 변이체가 표 46.1에 열거되어 있다. 포화 돌연변이 유발 라이브러리로부터의 상위 변이체는 상기 설명한 바와 같은 절차를 사용하여 삼중으로 재시험하되, 0.8 mM ADP를 사용하고, 반응물은 물에 1:20으로 희석한 후, 20 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 80 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 46.2에 열거되어 있다. 표 46.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A로의 글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 7 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.002-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 2 mM 레바우디오시드 A, 및 2 mM ADP-글루코스를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 반응물은 물에 1:5로 희석한 후, 25 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 75 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:10으로 희석한 후, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석하였다. 0.025 g/L SFP 로딩에서 레바우디오시드 A에 대한 라운드 7 변이체의 전환은 표 46.3에 제시되어 있다. 표 46.3에 나열된 7개의 모든 변이체는 서열 번호 2718보다 더 높은 활성을 보였다. 돌연변이 K14R, I56K, R194P, I238M, I315V, F325M, A326V, P329A, R330H, 및 E399Q(서열 번호 2814) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 2813)를 갖는 변이체가 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
47
서열 번호 2814의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 2814로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성 또는 발현과 관련된 유익한 돌연변이가 재조합되고 효소의 특정한 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발을 거친 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 2813에 의해 코딩된 GT의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제8 라운드("라운드 8")를 제공하였다. 16개의 조작된 변이체가 재조합된 유익한 돌연변이로부터 확인되었고(표 47.1), 18개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 47.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 2813 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 20배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.4 g/L SUS SFP 서열 번호 1456을 사용하고 7.5 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.4 mM ADP(Sigma, >95%) 및 30 mM 수크로스(Sigma)의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 50℃. 반응물은 물에 1:20으로 희석한 후, 20 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 80 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성 혼합물을 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:10으로 희석하고, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 47.1에 열거되어 있다. 라운드 8 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 0.2 g/L SUS SFP 서열 번호 1582, 0.2 mM ADP를 사용하고, 다음과 같은 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 55℃. 상기 라이브러리로부터의 상위 56개의 변이체는 동일한 검정 조건을 사용하여 삼중으로 재시험하되, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1582를 사용하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 47.2에 열거되어 있다. 표 47.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 8 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.002-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 8 mM 레바우디오시드 A, 0.4 mM ADP, 30 mM 수크로스, 및 0.2 g/L SUS SFP 서열 번호 1456을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 반응물은 물에 1:20으로 희석한 후, 20 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 80 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:10으로 희석한 후, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석하였다. 0.1 g/L SFP 로딩에서 레바우디오시드 A에 대한 라운드 8 변이체의 전환은 표 47.3에 제시되어 있다. 표 47.3에 나열된 8개의 모든 변이체는 서열 번호 2814보다 더 높은 활성을 보였다. 돌연변이 N31R 및 D388E(서열 번호 2884) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 2883)를 갖는 변이체가 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
48
서열 번호 2884의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 2884로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 유익한 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 서열 번호 2883에 의해 코딩된 GT의 유도 진화를 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 33개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제9 라운드("라운드 9")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 2883 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 20배 희석되었다. 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1582를 사용하고 7.5 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 24 mM 수크로스(Sigma)의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 55℃. 반응물은 상기 설명한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 48.1에 열거되어 있다. 표 48.2에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 9 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.002-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 8 mM 레바우디오시드 A, 0.4 mM ADP, 24 mM 수크로스, 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1582를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 55℃에서 수행하였다. 반응물은 상기 설명한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.05 g/L SFP 로딩에서 레바우디오시드 A에 대한 라운드 9 변이체의 전환은 표 48.2에 제시되어 있다. 표 48.2에 나열된 6개의 모든 변이체는 서열 번호 2884보다 더 높은 활성을 보였다. 돌연변이 S11Q, E65N, H132Q, N135L, N138G, S223T, 및 N391R(서열 번호 3016) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3015)를 갖는 변이체가 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
49
서열 번호 3016의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 3016으로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 3015에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제10 라운드("라운드 10")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 40개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 49.1), 40개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 49.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 3015 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 20배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764를 사용하고 8 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 24 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 55℃. 반응물은 물에 1:20으로 희석한 후, 20 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 80 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성 혼합물을 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:10으로 희석하고, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 49.1에 열거되어 있다. 라운드 10 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 용해물을 10배 희석하고, 다음과 같은 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 49.2에 열거되어 있다. 표 49.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 10 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.002-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 8 mM 레바우디오시드 A, 0.4 mM ADP, 24 mM 수크로스, 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 1시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 수행하였다. 반응물은 물에 1:20으로 희석한 후, 20 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 80 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 상청액을 물에 1:10으로 희석한 후, RapidFire SPE-MS/MS에 의해 스테비올 글리코시드에 대해 분석하였다. 0.25 g/L SFP 로딩시에 레바우디오시드 A에 대한 라운드 10 변이체의 활성은 표 49.3에 열거되어 있다. 표 49.3에 열거된 5개의 모든 변이체가 서열 번호 3016보다 더 높은 활성을 가졌다. 돌연변이 K58R, I122L, V176R, T400V, K425R, S426A, I427R, 및 S446R(서열 번호 3082) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3081)를 갖는 변이체가 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
50
서열 번호 3082의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 3082로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 3081에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제11 라운드("라운드 11")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 50개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 50.1), 53개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 50.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 3081 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 20배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764를 사용하고 8 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 24 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 50.1에 열거되어 있다. 라운드 11 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 10 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩을 사용하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 50.2에 열거되어 있다. 여러 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 11 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.006-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 10 mM 레바우디오시드 A, 0.2 mM ADP, 24 mM 수크로스, 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 2시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 수행하였다. 반응은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.025 g/L SFP 로딩시에 레바우디오시드 A에 대해 가장 개선된 라운드 11 변이체는 서열 번호 1764에 비해 돌연변이 G8S, G252D, D255P, V322L, M325L, 및 K448A를 갖는 서열 번호 3244이었다. 서열 번호 3244의 상기 변이체가 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
I로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 3081에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 이전 라운드에서 레바우디오시드 I에 대한 개선된 글리코실트랜스퍼라제 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 레바우디오시드 I에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 라운드("라운드 11.04")를 제공하였다. 세포를 400 μL 용해 완충제로 용해시켰다. 100 μL 반응 부피에서 25 μL의 용해물의 용해물 로딩을 사용하여 1 mM 레바우디오시드 I의 기질 로딩 및 1 mM ADP-글루코스의 보조 기질 로딩을 사용하여, 서열 번호 3081 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM KPhos 완충제, pH 6, 40℃. 반응물은 물에 1:4로 희석한 후, 25 μL의 희석된 검정물을 0.2% 포름산을 갖는 75 μL 아세토니트릴에 첨가함으로써 켄칭하였다. 생성 혼합물을 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 물에 1:5로 희석하고, 표 44.1에서 설명한 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 레바우디오시드 I에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성되는 52개의 조작된 변이체가 표 50.3에 열거되어 있다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우
디오시드 I로의 글루코실 전달에 대한 분석
레바우디오시드 I에 대한 조작된 라운드 11.04 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.16-5 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 1 mM 레바우디오시드 I, 및 1 mM ADP-글루코스를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 4시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 수행하였다. 반응은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.3 g/L SFP 로딩시에 라운드 11.04 변이체에 의한 레바우디오시드 M의 생산 수준을 표 50.4에 제시한다. 표 50.4에 열거된 5개의 모든 변이체는 서열 번호 3082보다 RebI에 대한 더 높은 활성을 보였다. 돌연변이 L126Q, P128A, F155R, K160S, R161T, 및 N199A(서열 번호 3346) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3345)를 갖는 변이체가 가장 개선되었고, 레바우디오시드 I의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
51
서열 번호 3244의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 3244로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 3243에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제12 라운드("라운드 12")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 50개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 51.1), 31개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 51.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 3243 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 40배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 희석된 용해물을 에펜도르프(Eppendorf) 열순환기에서 62℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764를 사용하고 15 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 37.5 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4.5시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SUS 서열 번호 1764와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 51.1에 열거되어 있다. 라운드 12 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 희석된 용해물을 65℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 51.2에 열거되어 있다. 표 51.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 12 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.006-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 62℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅한 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 레바우디오시드 A, 0.2 mM ADP, 37.5 mM 수크로스, 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 4.5시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃ 및 60℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.025 g/L SFP 로딩시에 레바우디오시드 A에 대한 라운드 12 변이체의 전환은 표 51.3에 열거되어 있다. 표 51.3에 열거된 7개의 모든 변이체는 60℃에서 서열 번호 3244보다 더 높은 활성을 가졌고, 4개는 50℃에서 유의한 활성을 상실하지 않았다. 돌연변이 K106A, V164H, G200A, E210V, 및 G415A(서열 번호 3502) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3501)를 갖는 변이체가 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
52
레바우디오시드
I로부터
레바우디오시드
M의 생성을 위한
서열 번호 3346의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 3346으로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 3345에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용한 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 레바우디오시드 I에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 라운드("라운드 12 RebI")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
M으로의
글루코스
전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 3345 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 이어서 검정은 100 μL 반응 부피에서 25 μL의 용해물 및 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1804를 사용하고 1 mM 레바우디오시드 I의 기질 로딩 및 1 mM ADP(Sigma, >95%) 및 15 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 50℃. 반응물은 실시예 50에서 설명한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 I에 대한 SUS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 52.1에 제시된다.
실시예
53
서열 번호 3502의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 3502로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 3501에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제13 라운드("라운드 13")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 53개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 53.1), 24개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 53.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 3501 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 40배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 희석된 용해물을 에펜도르프 열순환기에서 69℃에서 0.8시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764를 사용하고 15 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 37.5 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SUS 서열 번호 1764와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 53.1에 열거되어 있다. 라운드 13 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 희석된 용해물을 68℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅하고, 0.1 g/L SUS 서열 번호 1804를 사용하고, 0.1 또는 0.2 mM ADP를 사용하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 53.2에 열거되어 있다. 표 53.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 13 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.006-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 69℃에서 50분 동안 예비 인큐베이팅한 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 레바우디오시드 A, 0.2 mM ADP, 37.5 mM 수크로스, 및 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1804를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 4시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.025 g/L SFP 로딩시에 레바우디오시드 A에 대한 라운드 13 변이체의 전환은 표 53.3에 열거되어 있다. 표 53.3에 열거된 10개의 모든 변이체는 서열 번호 3502보다 더 높은 활성을 가졌다. 돌연변이 H73P, N172R, N240E, A242I, 및 E408P(서열 번호 3696) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3695)를 갖는 변이체가 가장 개선되었고, 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
54
서열 번호 3696의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 3696로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 3695에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제14 라운드("라운드 14")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 75개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 54.1), 49개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 54.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 3695 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 40배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 희석된 용해물을 에펜도르프 열순환기에서 72℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.1 g/L 수크로스 신타제(SUS) SFP 서열 번호 1804를 사용하고 20 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 50 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 54.1에 열거되어 있다. 라운드 14 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 용해물을 80배 희석하고, 70℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 54.2에 열거되어 있다. 표 54.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 14 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.006-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 72℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅한 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 20 mM 레바우디오시드 A, 0.2 mM ADP, 50 mM 수크로스, 및 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1804를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 4시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 예비 인큐베이팅된 SFP와 함께 60℃에서 또는 예비 인큐베이팅을 거치지 않은 SFP와 함께 55℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.05 g/L SFP 로딩시에 라운드 14 변이체에 의한 레바우디오시드 D의 생성 수준은 표 54.3에 제시된다. 표 54.3에 열거된 8개의 변이체 중 3개는 두 조건 모두 하에서 서열 번호 3696보다 더 높은 활성을 가졌다. 돌연변이 I26V, L42V, C46V, L49A, 및 V134A(서열 번호 3956) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 3955)를 갖는 변이체가 두 조건 모두에서 가장 개선되었고, 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
55
서열 번호 3956의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 3956으로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 3955에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제15 라운드("라운드 15")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 62개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 55.1), 113개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 55.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 3956 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 40배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 희석된 용해물을 에펜도르프 열순환기에서 76℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1840을 사용하고 20 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 50 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SUS 서열 번호 1840과 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 55.1에 열거되어 있다. 라운드 15 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 희석된 용해물을 65℃에서 16시간 동안 예비 인큐베이팅하고, 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 2064를 사용하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 55.2에 열거되어 있다. 표 55.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 15 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.006-0.2 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 76℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅한 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 20 mM 레바우디오시드 A, 0.2 mM ADP, 50 mM 수크로스, 및 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 2064를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 4시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 예비 인큐베이팅된 SFP와 함께 60℃에서 또는 예비 인큐베이팅을 거치지 않은 SFP와 함께 55℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.025 g/L SFP 로딩시에 라운드 15 변이체에 의한 레바우디오시드 D의 생성 수준은 표 55.3에 제시된다. 표 55.3에 열거된 9개의 변이체 중 5개는 두 조건 모두 하에서 서열 번호 3956보다 더 높은 활성을 가졌다. 돌연변이 P73A, K143P, I144V, V179D, E186G, K187T, K373R, 및 N423R(서열 번호 4256) 및 그의 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 4255)를 갖는 변이체가 두 조건 모두에서 가장 개선되었고, 레바우디오시드 A의 글루코실화를 위한 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
56
서열 번호 4256의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 4256으로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 4255에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제16 라운드("라운드 16")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 27개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 56.1), 66개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 56.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코스
전달에 대한 HTP 결합 검정
서열 번호 4255 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 40배 희석되었다. 이전 라운드로부터의 유익한 돌연변이가 재조합된 라이브러리의 스크리닝을 위해, 희석된 용해물을 에펜도르프 열순환기에서 79℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물 및 0.05 g/L 수크로스 신타제(SUS) SFP 서열 번호 2064를 사용하고 20 mM 레바우디오시드 A의 기질 로딩 및 0.2 mM ADP(Sigma, >95%) 및 50 mM 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SUS 서열 번호 2064와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 56.1에 열거되어 있다. 라운드 16 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 0.05 g/L 수크로스 신타제 SFP 서열 번호 2510을 사용하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 56.2에 열거되어 있다. 표 56.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A에 대한 조작된 라운드 16 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.003-0.1 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 79℃에서 0.5시간 동안 예비 인큐베이팅한 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 20 mM 레바우디오시드 A, 0.2 mM ADP, 50 mM 수크로스, 및 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2432를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에 첨가하였다. 반응은 4시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.0125 g/L SFP 로딩시에 라운드 16 변이체에 의한 레바우디오시드 D의 생성 수준은 표 56.3에 제시된다. 서열 번호 4550이 가장 개선되었고, 레바우디오시드 D를 형성하기 위해 ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로 글리코실을 전달하는 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
57
서열 번호 4550의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 4550으로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 4549에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 HTP 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제17 라운드("라운드 17")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 73개의 조작된 변이체가 확인되었다(표 57.1).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
서열 번호 4549 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 20 g/L 레바우디오시드 A 60% 내에 50 또는 100배 희석하고, 75℃에서 2시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물, 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 2510을 사용하고 20 g/L 레바우디오시드 A 60%(RebA60)의 기질 로딩 및 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 및 40 g/L 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 40배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석하여 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시키고, 상기한 바와 같이 분석을 위해 물에 10배 희석하였다. 레바우디오시드 A에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 57.1에 열거되어 있다. 표 57.2에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의 글루코실 전달에 대한 분석
레바우디오시드 A 60%에 대한 조작된 라운드 17 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.0003-0.04 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 20 g/L RebA60, 0.1 g/L ADP, 40 g/L 수크로스, 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 2510 및 0.2 g/L β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) SFP 서열 번호 6864를 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에서 검정하였다. 반응은 16-18시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.005 g/L SFP 로딩시에 라운드 17 변이체에 의한 원 포트 반응에서 레바우디오시드 M의 생성에 대한 결과가 표 57.2에 제시된다. 서열 번호 7324가 가장 개선된 것으로 확인되었고, 레바우디오시드 D를 형성하기 위해 ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로 글리코실을 전달하는 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
58
서열 번호 7324의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 7324로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 7323에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 조합 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 HTP 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제18 라운드("라운드 18")를 제공하였다. 재조합된 유익한 돌연변이로부터 90개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 58.1), 124개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 58.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
서열 번호 7323 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 20 g/L 레바우디오시드 A 60% 내에 80 또는 100배 희석하고, 75℃에서 1.5시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 7506 및 0.1 g/L β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) SFP 서열 번호 7388을 사용하고 20 g/L 레바우디오시드 A 60%(RebA60)의 기질 로딩 및 0.05 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 및 40 g/L 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 40배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석하여 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시키고, 상기한 바와 같이 분석을 위해 물에 10배 희석하였다. RebA60에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 58.1에 열거되어 있다. 라운드 18 포화 돌연변이 유발 라이브러리의 경우, 스크리닝은 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 용해물을 50 mM Kphos pH6으로 100배 희석하고, 75℃에서 1시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 생성된 조작된 GT 변이체 폴리펩티드는 표 58.2에 열거되어 있다. 표 58.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A 60%에 대한 조작된 라운드 18 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.0013-0.04 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 20 g/L RebA60, 0.05 g/L ADP, 40 g/L 수크로스, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 7506 및 0.15 g/L β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) SFP 서열 번호 7388을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에서 검정하였다. 반응은 16-18시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 0.005 g/L SFP 로딩시에 라운드 18 변이체에 의한 원 포트 반응에서 레바우디오시드 M의 생성에 대한 결과가 표 58.3에 제시된다. 서열 번호 7784의 변이체가 가장 개선된 변이체이었다. 따라서, 이 변이체를 레바우디오시드 D를 형성하기 위해 ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로 글리코실을 전달하는 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
59
서열 번호 7784의 베타-1,2-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 7784로부터 유래된 GT 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 7783에 의해 코딩된 GT의 유도 진화는 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 라이브러리는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 활성과 관련된 돌연변이를 재조합하고, 효소의 특정 구조적 특징을 포화 돌연변이 유발에 적용하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 HTP 검정을 사용하여 스크리닝하여 ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대한 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제19 라운드("라운드 19")를 제공하였다. 조합 라이브러리로부터 87개의 조작된 변이체가 확인되었고(표 59.1), 58개의 조작된 변이체가 포화 돌연변이 유발로부터 확인되었다(표 59.2).
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
결합 검정
서열 번호 7783 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 용해 완충제 부피는 400 μL이었고, 용해물은 50 mM 인산칼륨, pH 6.0 내에 100배 희석하고, 75℃에서 1시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, 검정은 100 μL 반응 부피에서 10 μL의 희석된 용해물, 0.04 g/L SUS SFP 서열 번호 8402 및 0.1 g/L β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) SFP 서열 번호 8088을 사용하고 20 g/L 레바우디오시드 A 60%(RebA60)의 기질 로딩 및 0.025 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 및 40 g/L 수크로스의 보조 기질 로딩을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16-18시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석함으로써 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석하여 켄칭하고, 원심분리에 의해 침전시키고, 상기한 바와 같이 분석을 위해 물에 20배 희석하였다. RebA60에 대한 SuS와 연결된 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 생성된 조작된 변이체가 표 59.1 및 59.2에 열거되어 있다. 표 59.3에 열거된 변이체에 대해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 분말로 동결건조시켰다.
진탕 플라스크 분말 특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, ADP로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코실
전달에 대한 분석
레바우디오시드 A 60%에 대한 조작된 라운드 19 변이체의 활성을 특성화하기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험을 수행하였다. 0.0013-0.04 g/L 수준의 진탕 플라스크 분말(SFP)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 20 g/L RebA60 또는 RebA97, 0.05 g/L ADP, 20(단일 기질) 또는 40 g/L(원 포트) 수크로스, 0.04 g/L SUS SFP 서열 번호 8420, 및 원 포트 반응만을 위해 0.15 g/L β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) SFP 서열 번호 8088을 함유하는 100 μL의 총 반응 부피에서 검정하였다. 반응은 16-18시간 동안 300 RPM에서 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 수행하였다. 반응물을 상기한 바와 같이 희석하고, 켄칭하고, 분석하였다. 각각 0.0025 및 0.005 g/L SFP 로딩시에 라운드 19 변이체에 의한 단일 기질에서 레바우디오시드 D 및 원 포트 반응에서 레바우디오시드 M의 생성 수준이 표 59.3에 제시된다. 서열 번호 9180의 변이체가 가장 개선된 변이체이었다. 따라서, 이 변이체를 레바우디오시드 D를 형성하기 위해 ADP-글루코스로부터 레바우디오시드 A로 글리코실을 전달하는 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
60
서열 번호 696의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 696으로부터 유래된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 6953에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 696)의 유도 진화는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 65개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제8 라운드("라운드 8")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 695 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 1.5시간 동안 25 mM 트리스-HCl, pH 7.5 내의 0.5 mg/mL 리소자임 및 0.5 mg/mL PMBS와 함께 400 μL의 용해 완충제로 용해시키고, 원심분리에 의해 맑게 하였다. 검정은 5 mM 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.1 g/L SuS SFP 서열 번호 1222, 및 15 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4-5시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Kphos 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 50℃. 이어서, 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 분석을 위해 물에 5배 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 696보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 그 대부분을 스테비오시드(95% 순도)에 대해 삼중으로 재시험하였다. 조작된 폴리펩티드는 표 60.1에 열거되어 있다. 서열 번호 696과 비교하여 표 60.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같은 SFP 생성을 위해 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 3 mM MgCl2, 1 mM 스테비오시드(95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)와 함께 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7의 100 μL의 총 반응 부피에 0.002-5 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 5배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 4배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 60.2의 모든 변이체(즉, 서열 번호 4684, 4686 및 4694)는 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 696보다 더 많은 양으로 생성하였다. 변이체 서열 번호 4684가 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
61
서열 번호 4684의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 4684로부터 유래된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 4684에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 4683)의 유도 진화는 이전 라운드에서 개선된 활성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 31개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제9 라운드("라운드 9")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 4684 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 하였다. 검정은 5 mM 스테비오시드(>95% 순도), 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.1 g/L SuS SFP 서열 번호 1222, 및 15 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4-5시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM Kphos 완충제, pH 7, 3 mM MgCl2, 50℃. 반응물은 실시예 60에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 서열 번호 4684보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 61.1에 열거되어 있다. 서열 번호 4684와 비교하여 표 61.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 3 mM MgCl2, 1 mM 스테비오시드(95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)와 함께 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7의 100 μL의 총 반응 부피에 0.002-5 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 5배 희석하여 가용화하고, 아세토니트릴 및 0.2% 포름산으로 4배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 61.2의 모든 변이체(즉, 서열 번호 4822, 4824, 4826, 4834 및 4838)는 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 4684보다 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 4838의 변이체는 이들 실험에서 보조 기질로서 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드 및 레바우디오시드 D 둘 모두에 대한 가장 높은 활성을 가졌다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 4837)를 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
62
서열 번호 4838의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 4838로부터 유래된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 4837에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 4838)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 123개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제10 라운드("라운드 10")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
D로의
글루코
스 전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 4838 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 인산칼륨 완충제, pH 6.5 내에서 4배 희석하였다. 검정은 5 mM 스테비오시드(>95% 순도) 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.2 g/L SUS SFP 서열 번호 1222, 및 15 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 50℃. 반응물은 실시예 60에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, 희석하였다. 샘플을 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 선택된 변이체를 10x 용해물 희석액, 4 mM 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D, 0.375 mM ADP, 0.5 g/L 수크로스 신타제 서열 번호 1392, 30 mM 수크로스 및 2시간 인큐베이팅을 사용하여 유사한 검정에서 재시험하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 4838보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 62.1에 열거되어 있다. 서열 번호 4838과 비교하여 표 62.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
또는
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 1 mM 스테비오시드(95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 및 1 mM ADP-글루코스(Sigma, >93% 순도)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 5배 희석하여 가용화하고, 아세토니트릴 및 0.2% 포름산으로 4배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 62.2의 하나의 변이체(즉, 서열 번호 4876)는 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 4838보다 더 많은 양으로 생성하였다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 4875)를 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
63
서열 번호 4876의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 4876으로부터 유래된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 4875에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 4876)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 122개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제11 라운드("라운드 11")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 4875 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 인산칼륨 완충제, pH 6.5 내에서 10배 희석하였다. 조합 라이브러리의 검정은 4 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.2 g/L SUS SFP 서열 번호 1456, 및 24 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 50℃. 반응물은 실시예 60에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, 희석하였다. 샘플을 실시예 1, 표 1.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 포화 돌연변이 유발 라이브러리에 대해, 동일한 검정을 수행하되, 5x 희석된 용해물, pH 6 인산칼륨 완충제, 및 50℃에서 1-2 인큐베이팅. 선택된 변이체를 또한 상기 조건 하에서 삼중으로 재시험하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 4876보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 63.1에 열거되어 있다. 서열 번호 4876과 비교하여 표 63.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비
오시드 및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 4 mM 스테비오시드(95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.2 g/L SUS SFP 서열 번호 1456, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 63.2의 6개의 변이체(즉, 서열 번호 5076, 5042, 5026, 5066, 5074, 및 5044)는 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 4876보다 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 5066은 1차 스크리닝에서 가장 좋은 활성을 나타냈고(표 63.1), 가장 유익한 돌연변이를 가졌다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 5065)는 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다. 서열 번호 5076을 갖는 변이체는 그의 높은 RebD로부터 RebM으로의 전환 활성으로 인해 공정 개발을 위해 사용되었다.
실시예
64
서열 번호 5066의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 5066으로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 5065에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 5066)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 40개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제12 라운드("라운드 12")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 5066 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 10배 희석하였다. 조합 라이브러리의 검정은 4 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1582, 및 24 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 55℃. 반응물은 실시예 63에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 5066보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 64.1에 열거되어 있다. 서열 번호 5066과 비교하여 표 64.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 4 mM 스테비오시드(95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.4 mM ADP (Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1582, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 55℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 64.2의 6개의 변이체(즉, 서열 번호 5280, 5290, 5302, 5314, 5324)는 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 5066보다 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 5290은 레바우디오시드 D에 대해 가장 좋은 활성을 나타냈고, 가장 유익한 돌연변이를 가졌다. 따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드(서열 번호 5289)는 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
65
서열 번호 5290의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 5290으로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 5289에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 5290)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 100개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제13 라운드("라운드 13")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 5289 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 5배 희석하였다. 검정은 4 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 24 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 55℃. 반응물은 실시예 33에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 5290보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 65.1에 열거되어 있다. 서열 번호 5290과 비교하여 표 65.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 4 mM 스테비오시드(95% 순도), 레바우디오시드 D, 또는 레바우디오시드 A(97% 순도), 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 55℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 65.2의 5개의 변이체(즉, 서열 번호 5348, 5356, 5364, 5372, 및 5386)는 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 5290보다 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 5372가 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
66
서열 번호 5372의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 5372로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 5371에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 5372)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 74개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제14 라운드("라운드 14")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의 글루코스 전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 5371 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 10배 희석하였다. 검정은 10 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 40 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 실시예 60에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, ~10 μM 스테비올 글리코시드로 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 5372보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 66.1에 열거되어 있다. 서열 번호 5372와 비교하여 표 66.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 4 mM 스테비오시드(95% 순도), 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E 또는 레바우디오시드 A(97% 순도), 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 55 및 60℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 66.2의 6개의 변이체(즉, 서열 번호 5552, 5562, 6675, 5578, 5582, 및 5590)는 ADP-글루코스를 사용하여 서열 번호 5290보다 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 더 많은 양으로, 레바우디오시드 A로부터 레바우디오시드 I를 더 적은 양으로, 레바우디오시드 E로부터 레바우디오시드 M을 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 5562가 4개의 모든 반응에서 가장 개선되었고, 따라서 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
67
서열 번호 5562의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 5562로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 5561에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 5562)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 62개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제15 라운드("라운드 15")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시
드 D로의 글루코스 전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 5562 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 5배 희석하였다. 검정은 10 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.1-0.2 mM ADP (Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 24-40 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 50 또는 60℃. 반응물은 실시예 60에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, ~10 μM 스테비올 글리코시드로 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 5562보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 67.1에 열거되어 있고, 포화 돌연변이 유발로부터의 폴리펩티드는 표 67.2에 열거되어 있다. 서열 번호 5562와 비교하여 표 67.3에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 10 mM 스테비오시드(95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP(Sigma, > 93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 2시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃ 및 60℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 5배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 67.3의 8개의 변이체는 서열 번호 5562보다 50℃ 및 60℃에서 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를, 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 5708은 두 온도 모두에서 스테비오시드를 레바우디오시드 A로 전환하는 활성이 가장 개선되었고, 또한 60℃에서 레바우디오시드 D를 레바우디오시드 M으로 전환하는 활성도 개선되었고, 따라서 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
68
서열 번호 5708의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 5708로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 5707에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 5708)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 100개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제16 라운드("라운드 16")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의 글루코스 전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 5708 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 20배 희석하였다. 검정은 10 mM 스테비오시드(>95% 순도), 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 A(>97% 순도) 또는 레바우디오시드 E 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 24 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 3시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 실시예 60에 기재된 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, ~10 μM 스테비올 글리코시드로 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 5708보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 68.1에 열거되어 있다. 서열 번호 5708과 비교하여 표 68.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 10 mM 스테비오시드(>95% 순도), 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 또는 레바우디오시드 A(>97% 순도), 0.2 mM ADP(Sigma, > 93% 순도) 보조 기질, 0.15 g/L SUS SFP 서열 번호 1764, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 3시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50℃ 및 60℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 10배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 68.2의 13개의 변이체는 서열 번호 5708보다 50℃ 및/또는 60℃에서 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 5976은 두 온도 모두에서 레바우디오시드 D의 레바우디오시드 M으로의 전환 활성을 상실하지 않으면서 스테비오시드를 레바우디오시드 A로 전환하는 활성이 가장 개선되었고, 따라서 이 변이체가 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
69
서열 번호 5976의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 5976으로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 5975에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 5976)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 123개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제17 라운드("라운드 17")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의 글루코스 전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 5976 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 완충제 내에서 20배 희석하였다. 용해물을 열에 의해 처리하기 위해, 65.5℃에서 15분 동안 열순환기에서 예비 인큐베이팅하였다. 검정은 10 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1804, 및 24 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 예비 인큐베이팅된 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물로 10배 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 5976보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 69.1에 열거되어 있다. 서열 번호 5976과 비교하여 표 69.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 10 mM 스테비오시드(>95% 순도), 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP (Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1804, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 예비 인큐베이팅 없이 55℃에서 인큐베이팅하거나 또는 65.5℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅한 후 60℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 10배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 69.2의 8개의 변이체는 서열 번호 5976보다 55℃ 및/또는 60℃에서 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및/또는 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 6138은 예비 인큐베이팅 후에 60℃에서 인큐베이팅하는 검정 조건 하에서 스테비오시드를 레바우디오시드 A로 전환하는 활성이 가장 개선되었으며, 다른 조건 하에서도 역시 개선되었고, 따라서 이 변이체가 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
70
서열 번호 6138의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 6138로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 6137에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 6138)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 100개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제18 라운드("라운드 18")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의 글루코스 전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 6138 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 20-40배 희석하였다. 용해물을 열에 의해 처리하기 위해, 68.6℃에서 15분 동안 열순환기에서 예비 인큐베이팅하였다. 검정은 10 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1840, 및 24 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 예비 인큐베이팅된 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물로 10배 희석하였다.
샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 6138보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 70.1에 열거되어 있다. 서열 번호 6138과 비교하여 표 70.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 10 mM 스테비오시드(>95% 순도), 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP (Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.1 g/L SUS SFP 서열 번호 1804, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 예비 인큐베이팅 없이 55℃에서 인큐베이팅하거나 또는 68.6℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅한 후 60℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 10배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다.
이들 실험에서, 표 70.2의 5개의 변이체(서열 번호 6262, 6268, 6288, 6300, 및 6334)는 예비 인큐베이팅 후에 60℃에서 서열 번호 6138보다 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 6288은 예비 인큐베이팅 후에 60℃에서 인큐베이팅하는 검정 조건 하에서 스테비오시드를 레바우디오시드 A로 전환하는 활성이 가장 개선되었으며, 레바우디오시드 D의 M으로의 전환에 대해서는 2번째로 크게 개선되었고, 따라서 이 변이체가 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
71
서열 번호 6288의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 6288로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 6287에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 6288)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 108개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제19 라운드("라운드 19")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 6288 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 40배 희석하였다. 용해물을 열에 의해 처리하기 위해, 16시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 73.5℃ 또는 65℃에서 15분 동안 열순환기에서 예비 인큐베이팅하였다. 검정은 10 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.2 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2064, 및 24 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 예비 인큐베이팅된 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물로 10배 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 6288보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 15분 예비 인큐베이팅으로 스크리닝된 조합 라이브러리로부터의 조작된 폴리펩티드는 표 71.1에 열거되어 있고, 16시간 예비 인큐베이팅으로 스크리닝된 포화 돌연변이 유발 라이브러리로부터의 폴리펩티드는 표 71.2에 열거되어 있다. 서열 번호 6288과 비교하여 표 71.3에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 10 mM 스테비오시드(> 95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP (Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2064, 및 24 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 예비 인큐베이팅 없이 55℃에서 인큐베이팅하거나 또는 73.5℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅한 후 60℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 10배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다. 동결건조 전에 맑아진 진탕 플라스크 용해물을 사용하여 추가의 열안정성 특성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 용해물을 완충제로 400배 희석하고, 55-70℃의 구배로 16시간 동안 열순환기에서 인큐베이팅하였다. 남아있는 활성의 비율을 결정하기 위해, 예비 인큐베이팅된 용해물을 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D 및 60℃에서의 4시간 인큐베이션을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 검정하였다. 남아있는 % 활성은 고온에서의 생성을 예비 인큐베이팅된 최저 온도에서의 생성으로 나눈 값으로 나타냈다.
이들 실험에서, 표 71.3의 8개의 변이체는 예비 인큐베이팅 후에 60℃에서 서열 번호 6288보다 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 6468은 예비 인큐베이팅 후에 60℃에서 인큐베이팅하는 검정 조건 하에서 레바우디오시드 D의 레바우디오시드 M으로의 전환에 대해서 가장 크게 개선되었으며, 16시간 열처리 후에 가장 큰 남아있는 % 활성을 가졌고, 따라서 이 변이체가 추가의 유도 진화를 위해 선택되었다.
실시예
72
서열 번호 6468의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 6468로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 6467에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 6468)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 269개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제20 라운드("라운드 20")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 6467 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 40배 희석하였다. 용해물을 열에 의해 처리하기 위해, 16시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 79℃ 또는 65℃에서 15분 동안 열순환기에서 예비 인큐베이팅하였다. 검정은 15 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D 기질, 0.1 mM ADP(Sigma, >93% 순도) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2432, 및 37.5 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 예비 인큐베이팅된 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물로 15배 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 6468보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 15분 예비 인큐베이팅으로 스크리닝된 조합 라이브러리로부터의 조작된 폴리펩티드는 표 72.1에 열거되어 있고, 16시간 예비 인큐베이팅으로 스크리닝된 포화 돌연변이 유발 라이브러리로부터의 폴리펩티드는 표 72.2에 열거되어 있다. 서열 번호 6468과 비교하여 표 72.3에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2432, 및 37.5 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.006-0.2 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 예비 인큐베이팅 없이 55℃에서 인큐베이팅하거나 또는 79℃에서 15분 동안 예비 인큐베이팅한 후 60℃에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 15배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다. 동결건조 전에 맑아진 진탕 플라스크 용해물을 사용하여 추가의 열안정성 특성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 용해물을 완충제로 400배 희석하고, 60-75℃의 구배로 16시간 동안 열순환기에서 인큐베이팅하였다. 남아있는 활성의 비율을 결정하기 위해, 예비 인큐베이팅된 용해물을 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D 및 60℃에서의 4시간 인큐베이션을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 검정하였다. 남아있는 % 활성은 고온에서의 생성을 예비 인큐베이팅된 최저 온도에서의 생성으로 나눈 값으로 나타냈다.
이들 실험에서, 표 72.3의 14개의 변이체는 예비 인큐베이팅 후에 60℃에서 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 6468보다 더 많은 양으로 생성하였고, 4개를 제외한 모든 변이체는 또한 예비 인큐베이팅을 수행하지 않은 상태에서 55℃에서 우수한 활성을 보였다. 서열 번호 6864가 각각 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 M의 형성을 위해 ADP-글루코스로부터 스테비오시드 및 레바우디오시드 D로 글리코실을 전달하기 위한 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
73
서열 번호 6864의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 6864로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 6863에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 6864)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 37개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제21 라운드("라운드 21")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 6863 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 34에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 40배 희석하였다. 용해물을 열에 의해 처리하기 위해, 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 75℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 검정은 20 g/L 레바우디오시드 A 60% 기질, 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2510, 0.1 g/L β-1,2-글리코실트랜스퍼라제(β12GT) 서열 번호 4550 및 37.5 mM 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 예비 인큐베이팅된 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물로 15배 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 스테비오시드/레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 A/레바우디오시드 M을 서열 번호 6864보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 73.1에 열거되어 있다. 서열 번호 6864와 비교하여 표 73.2에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2510, 및 37.5 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.003-0.1 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 60℃에서 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 15배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다. 동결건조 전에 맑아진 진탕 플라스크 용해물을 사용하여 추가의 열안정성 특성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 용해물을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6에 400배 희석하고, 60-75℃의 구배로 16시간 동안 열순환기에서 인큐베이팅하였다. 남아있는 활성의 비율을 결정하기 위해, 예비 인큐베이팅된 용해물을 스테비오시드 또는 레바우디오시드 D 및 60℃에서의 4시간 인큐베이션을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 검정하였다. 남아있는 % 활성은 고온에서의 생성을 예비 인큐베이팅된 최저 온도에서의 생성으로 나눈 값으로 나타냈다.
이들 실험에서, 표 73.2의 5개의 변이체는 60℃에서 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 6864보다 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 7388이 각각 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 M의 형성을 위해 ADP-글루코스로부터 스테비오시드 및 레바우디오시드 D로 글리코실을 전달하기 위한 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
74
서열 번호 7388의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 7388로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 7387에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 7388)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 88개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제22 라운드("라운드 22")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한 HTP 검정
서열 번호 7387 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 60에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 20배 희석하였다. 용해물을 열에 의해 처리하기 위해, 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 75℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 검정은 20 g/L 레바우디오시드 A 60% 기질, 0.05 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2510, 0.08 g/L β-1,2-글리코실트랜스퍼라제(β12GT) 서열 번호 7324, 및 40 g/L 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 예비 인큐베이팅된 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물로 20배 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A 60으로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 7388보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 74.1 및 표 74.2에 열거되어 있다. 서열 번호 7388과 비교하여 표 74.3에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 31에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및
레바우디오시드
D로의
글루코실
전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2510, 및 37.5 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.005-0.15 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 60℃에서 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 15배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다. 동결건조 전에 맑아진 진탕 플라스크 용해물을 사용하여 추가의 열안정성 특성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 용해물을 인산칼륨 완충제에 20배 희석하고, 60-75℃의 구배로 24시간 동안 열순환기에서 인큐베이팅하였다. 남아있는 활성의 비율을 결정하기 위해, 예비 인큐베이팅된 용해물은 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내의 20 g/L 레바우디오시드 A 60, 0.05 g/L ADP, 40 g/L 수크로스, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2510, 및 0.08 g/L β1,2GT SFP 서열 번호 7324를 사용하고 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 16시간 인큐베이팅하여 검정하였다. 반응물은 고처리량 검정에 대해 상기 설명한 바와 같이 가용화하고, 켄칭하고, 희석하였다. 남아있는 % 활성은 고온에서의 생성을 예비 인큐베이팅된 최저 온도에서의 생성으로 나눈 값으로 나타냈다.
이들 실험에서, 표 74.3의 11개의 모든 변이체는 레바우디오시드 A 60으로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 7388보다 더 많은 양으로 생성하였고, 8개의 변이체는 또한 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 서열 번호 8034 및 8088이 가장 우수한 활성을 나타내었다. 원 포트 검정에서 그의 우수한 활성 때문에, 서열 번호 8088이 각각 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 M의 형성을 위해 ADP-글루코스로부터 스테비오시드 및 레바우디오시드 D로 글리코실을 전달하기 위한 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
75
서열 번호 8088의 베타-1,3-ADP-
글리코실트랜스퍼라제
변이체
본 실시예에서, 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용한 스테비올 글리코시드의 개선된 글루코실화를 위한, 서열 번호 8088로부터 유래된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT) 폴리펩티드의 진화 및 스크리닝에 대한 실험이 설명된다. 서열 번호 8087에 의해 코딩된 GT(즉, 서열 번호 8088)의 유도 진화는 본 발명의 개발 동안 확인된 개선된 생성과 관련된 돌연변이가 재조합되고 특정 구조적 특징이 포화 돌연변이 유발에 적용된 변이체 유전자의 라이브러리를 구축함으로써 수행하였다. 이어서, 이들 라이브러리를 도말하고, 성장시키고, 아래에서 설명되는 고처리량(HTP) 검정을 사용하여 스크리닝하여, ADP-글루코스 및 스테비올 글리코시드에 대해 글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 80개의 조작된 GT 변이체 폴리펩티드의 제23 라운드("라운드 23")를 제공하였다.
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
레바우디오시드
A 60으로의
글루코스
전달에 대한
HTP
검정
서열 번호 8087 변이체를 발현하는 맑아진 이. 콜라이 배양 용해물의 96웰 플레이트에서 검정을 수행하였다. 펠렛을 실시예 34에 기재된 바와 같이 용해시키고, 용해물을 맑게 만든 후, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 내에서 10배 희석하였다. 용해물을 열에 의해 처리하기 위해, 1시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 75℃에서 예비 인큐베이팅하였다. 검정은 20 g/L 레바우디오시드 A 60% 기질, 0.025 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 8420, 0.08 g/L β-1,2-글리코실트랜스퍼라제(β12GT) 서열 번호 7784, 및 40 g/L 수크로스(자당)와 함께 100 μL 반응물 내의 10 μL 예비 인큐베이팅된 용해물을 사용하여 수행하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 16시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 60℃. 반응물은 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물로 20배 희석하였다. 샘플을 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 RapidFire-MS/MS에 의해 분석하였다. 인 시츄 합성된 ADP-글루코스를 사용하여 레바우디오시드 A 60으로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 8088보다 더 많은 양으로 생성한 글리코실트랜스퍼라제 변이체 폴리펩티드가 확인되었다. 조작된 폴리펩티드는 표 75.1 및 표 75.2에 열거되어 있다. 서열 번호 8088과 비교하여 표 75.3에 제시된 변이체의 분석을 위해 실시예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 규모 배양물을 성장시키고, 용해시키고, 맑게 하고, 분말로 동결건조시켰다.
SFP
특성 결정 검정 및
수크로스로부터
ADP로, 이어서 ADP-
글루코스로부터
스테비오시드
및 레바우디오시드 D로의 글루코실 전달에 대한 분석
진탕 플라스크 분말(SFP)을 20 g/L의 농도로 재구성하고, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.1 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 8420, 및 37.5 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.005-0.15 g/L SFP로 희석하였다. 반응물은 60℃에서 4시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 15배 희석하였다. 글리코실화된 생성물은 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의해 검출되었다. 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 20 g/L RebA60, 0.025 g/L ADP(Amresco, 초순수 등급) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 8420, 0.12 g/L β1,2GT SFP 서열 번호 7784 및 40 g/L 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에 0.01-0.3 g/L SFP를 사용하여 원 포트 반응을 수행하였다. 반응물을 60℃에서 16시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 반응물을 물로 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분석을 위해 물로 20배 희석하였다.
이들 실험에서, 표 75.3의 11개의 모든 변이체는 레바우디오시드 A 60으로부터 레바우디오시드 M을 서열 번호 8088보다 더 많은 양으로 생성하였고, 8개의 변이체는 또한 스테비오시드로부터 레바우디오시드 A를 및 레바우디오시드 D로부터 레바우디오시드 M을 더 많은 양으로 생성하였다. 원 포트 검정에서 그의 우수한 활성 때문에, 서열 번호 8598이 각각 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 M의 형성을 위해 ADP-글루코스로부터 스테비오시드 및 레바우디오시드 D로 글리코실을 전달하기 위한 촉매 작용을 위한 최상의 효소로서 선택되었다.
실시예
76
조작된
글리코실화
효소 및 재순환 효소의 열 내성
진탕 플라스크 분말(SFP)을 사용하여 조작된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT, 서열 번호 6864), β-1,2-글리코실트랜스퍼라제(β1,2GT, 서열 번호 4550), 및 수크로스 신타제 재순환 효소(SUS, 서열 번호 2510)의 열 내성을 결저하기 위해 3개의 검정을 수행하였다.
먼저, 각각의 효소 SFP를 50 mM 인산칼륨 pH 6(β1,3GT, 0.5 g/L; β1,2GT, 0.25 g/L; SUS, 0.1 g/L)에 희석하고 검정 전에 0-48시간의 상이한 시간 동안 인큐베이팅함으로써 60℃에서 수일 동안의 안정성에 대한 검정을 수행하였다. 남아있는 활성의 양은 본 실시예에서 설명되는 조건 하에서 검정함으로써 결정하였다. β1,3GT에 대해, 10 μL의 0-48시간 예비 인큐베이팅된 진탕 플라스크 분말을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6, 15 mM 스테비오시드(>95% 순도) 또는 레바우디오시드 D, 0.2 mM ADP(Amresco, 초순수) 보조 기질, 0.05 g/L SUS SFP 서열 번호 2432, 및 37.5 mM 수크로스(자당)의 100 μL의 총 반응 부피에서 사용하였다. 반응물은 5시간 동안 300 RPM 진탕 하에 써모트론® 적정 플레이트 진탕기에서 60℃에서 인큐베이팅한 후, 물에 20배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴로 5배 희석함으로써 켄칭하고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 실시예 31, 표 31.1에 기재된 바와 같이 SPE-QQQ에 의한 분석을 위해 물로 15배 희석하였다. 28시간에, 레바우디오시드 D를 레바우디오시드 M으로 전환하기 위한 비예비 인큐베이팅된 활성의 60%가 남아 있었고, 48시간에는 39%의 활성이 남았고; 스테비오시드를 레바우디오시드 A로 전환하기 위해, 28시간 후에 34%가 남아 있었고, 48시간 후에는 19%가 남았다. 따라서, β1,3GT 서열 번호 6864의 60℃에서의 반감기는 20-40시간이다. β1,2GT의 경우, 검정은 20 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도) 및 50 mM 수크로스와 유사하게 수행되었다. 24시간에, 비예비 인큐베이팅된 활성의 50-74%가 남아 있었고, 46시간에 활성의 33%가 남아 있었다. 따라서, β1,2GT 서열 번호 4550의 60℃에서의 반감기는 29-58시간이다. SUS의 경우, 15 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도), 37.5 mM 수크로스, 9 mM 프럭토스 및 연결된 효소로서 0.5 g/L의 β1,2GT 서열 번호 4550을 사용하여 유사하게 분석하였다. 24시간에, 비예비 인큐베이팅된 활성의 89%가 남아 있었고, 48시간에 활성의 86%가 남아 있었다. 따라서, SUS 서열 번호 2510의 60℃에서의 반감기는 100시간 초과이다. 60℃에서의 이들 세 가지 반감기는 모두 주변 온도 초과의 온도에서 유의한 안정성을 갖지 않는 야생형 효소와 큰 차이를 나타낸다.
둘째, 세 효소 각각의 동일한 원액을 열순환기에서 60-69.1℃(SUS), 59.9-79.9℃(β1,2GT) 또는 59.7-75.1℃의 온도 구배에 걸쳐 24시간 동안 예비 인큐베이팅하고, 가장 낮은 예비 인큐베이팅 온도(3개 모두 ~60℃)와 비교하여 남아있는 활성을 결정하기 위해 효소를 위에서 설명한 바와 같이 검정하였다. β1,3GT에 대해, 59.7℃에서의 예비 인큐베이팅에 비해 73.5℃에서의 예비 인큐베이팅 후에 20%의 활성이 남아있었다. β1,2GT의 경우, 73.6℃에서의 예비 인큐베이팅 후에 17%의 활성이 남아있었다. SUS의 경우, 69.1℃에서의 예비 인큐베이팅 후에 85%의 활성이 남아있었다. 70℃ 초과의 온도에서 24시간의 안정성은 발효 과정의 하류 처리의 매우 다양한 온도 및 광범위한 스테비올 글리코시드 전환 온도를 허용한다. 스테비올 글리코시드 전환 반응을 가열함으로써, 미생물 오염의 위험이 감소되고, 스테비올 글리코시드 기질 및 생성물 용해도가 향상되어 전환율을 증가시킨다. 또한, 고유 반응 속도는 온도가 증가함에 따라 약간 증가한다.
셋째, β1,3GT, 0.1 g/L; β1,2GT, 0.025 g/L; 및 SUS, 0.01 g/L을 효소가 시험 온도 범위에서 견고한지 결정하기 위해, 예비 인큐베이팅 없이 55-65℃에서 인큐베이팅하여 상기 설명한 단일 기질 전환 검정에서 검정하였다. 세 효소 모두에 대해, 55℃에 비해 65℃에서 4시간 후에 측정된 전환율에서 <36% 증가 또는 감소가 있었다.
실시예
77
추가의
NDP
및
NDP
-
글루코스를
사용한
조작된
글리코실트랜스퍼라제
및 재순환 효소의 검정
다수의 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 및 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코스(NDP-글루코스)를 조작된 글리코실트랜스퍼라제 및 재순환 시스템과 함께 사용할 수 있다.
대안적인 NDP 공여체에 대한 조작된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT, 서열 번호 6864) 및 β1,2-글리코실트랜스퍼라제(β1,2GT, 서열 번호 4550)의 무차별성(promiscuity)을 결정하기 위해, 다음과 같은 시판되는 3개의 NDP-글루코스를 효소 진탕 플라스크 분말(SFP)을 사용하여 시험하였다: ADP-글루코스(Amresco, 초고 등급), GDP-글루코스(Sigma, >97% 순도) 및 TDP-글루코스(Carbosynth, >95% 순도). β1,3GT의 경우, 1 mM 스테비오시드(>95% 순도), 1 mM NDP-글루코스, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 중의 0.025 g/L SFP를 사용하여 반응을 수행하였다. 1, 2 및 3시간에, 반응물을 물에 4배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물에서 5배 희석하였다. β1,2GT의 경우, 반응은 1 mM 레바우디오시드 A(>97% 순도)에서 0.0025 g/L SFP로 수행되었지만, 그 밖의 방식은 위에서 설명한 방법과 동일하였다. 그 결과는 처음 1시간에 스테비올 글리코시드의 전환율(%)로서 표 68.1에 요약하였다.
대안적인 NDP 보조 인자에 대한 조작된 β-1,2-글리코실트랜스퍼라제(β1,2GT, 서열 번호 4550) 및 수크로스 신타제 재순환 효소(SUS, 서열 번호 2510)의 무차별성을 결정하기 위해, 다음과 같은 시판되는 4개의 NDP를 시험하였다: ADP(Sigma, >95%), CDP(Sigma, >95%), GDP(Sigma, >96%), IDP(Sigma, >96%). 10 mM 스테비오시드 A(>97% 순도), 0.2 mM NDP, 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 6 중의 0.001 g/L SUS SFP 및 0.1 g/L β1,2GT SFP를 사용하여 반응을 수행하였다. 1, 2 및 3시간에, 반응물을 물에 4배 희석하여 가용화하고, 0.2% 포름산을 갖는 아세토니트릴에 5배 희석함으로써 켄칭하고, 분석을 위해 물에서 5배 희석하였다. 또한, 제2 수크로스 신타제(서열 번호 72)를 100 μL 반응물 내의 10 μL의 정제된 단백질 글리세롤 원액을 사용하여 시험하였다. 그 결과는 처음 1시간에 NDP 전환율(레바우디오시드 D mmol/보조 인자 mmol)로서 표 77.2에 요약하였다. 이들 데이터는 ADP/ADP-글루코스의 사용이 유용한 반응 조건을 제공함을 나타낸다. 또한, 이들 화합물은 다른 옵션(예를 들어, UDP/UDP-글루코스)과 비교하여 경제적 관점에서 유리하다.
실시예
78
레바우디오시드
A
60%를
레바우디오시드
M으로 전환하는 공정
Reb A 60(스테비오시드와 레바우디오시드 A[Reb A]의 질량 기준 ~1:2 혼합물)은 물 및 수크로스 용액에서 예상치 않게 높은 용해도를 갖는다. 스테비오시드 및 Reb A의 개별적인 수용해도는 3-5 g/L의 범위로 보고되었다. 놀랍게도, Reb A 60의 100-200 g/L 용액을 물 또는 200 g/L의 수크로스에서 제조하였고, 1주일 동안 실온에서 정치시에 상기 용액에서 침전물이 발생하지 않았다. 놀랍게도, 반응 과정 동안, Reb D 중간체와 Reb M 생성물 둘 모두가 이들의 보고된 용해도 한계(각각 ~0.3-0.5 및 3-5 g/L)를 훨씬 초과하는 수준(약 30-50 g/L)에서 가용성으로 유지되었다(균일한 반응 혼합물에 의해 분명한 바와 같이). 공정의 효율은 Reb A 60 출발 물질 및 Reb D 중간체의 예기치 않게 높은 용해도에 의해 크게 향상되었다.
Reb A 60을 레바우디오시드 M으로 전환하는 방법은 조작된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT, 서열 번호 6138), β-1,2-글리코실트랜스퍼라제(β1,2GT, 서열 번호 3696), 및 수크로스 신타제(SUS, 서열 번호 1846)을 사용하여 개발하였다. 50 mM의 pH 6의 인산칼륨 완충제 중의 0.2 g/L SUS, 0.1 g/L ADP 및 200 g/L 수크로스로 이루어진 재순환 원액 용액을 제조하였다. β1,2GT를 이 용액에 1.6 g/L로 용해시키고, β1,3GT의 별개의 원액을 재순환 원액 용액에 2.0 g/L로 용해시켰다. 이어서, 100 mg의 Reb A 60을 1드램 바이알에 넣고, 각각 1.6 g/L β1,2GT 원액 및 2.0 g/L β1,3GT 원액의 0.5 mL를 첨가하였다. 생성된 균질 용액을 55℃에서 교반하였다. 침전물이 서서히 발생하였고, 24시간에 반응 혼합물은 두꺼운 백색 슬러리이었다. HPLC 분석은 90-94% Reb M(~120-130 g/L Reb M)의 존재는 보여주었다.
또 다른 실험에서, 상기 반응은 0.5 g/L의 ADP 및 10 mM의 EDTA의 존재 하에 수행되었다. 이러한 조건 하에서, β1,2GT 및 β1,3GT 로딩은 둘 모두 0.4 g/L로 감소하였지만, 여전히 90% 초과의 Reb M 전환율에 도달하였다. 동결건조된 효소 분말이 10-15 L 규모 발효에서 생성되고 하류에서 60℃ 열처리 및 한외여과를 사용하여 처리될 때, Reb A 60 내의 스테비오시드 및 레바우디오시드 A의 95%가 β1,2GT 원액 대 β1,3GT 원액의 특정 비율 하에서 레바우디오시드 M으로 전환되었다.
Reb A 60을 레바우디오시드 M으로 전환하는 과정은 또 다른 세트의 조작된 β-1,3-글리코실트랜스퍼라제(β1,3GT, 서열 번호 6864), β-1,2-글리코실트랜스퍼라제(β1,2GT, 서열 번호 4550), 및 수크로스 신타제(SUS, 서열 번호 2510) 효소를 사용하여 개발하였다. 50 mM의 pH 6의 인산칼륨 완충제 중의 0.2 g/L SUS, 0.5 g/L의 ADP 및 200 g/L 수크로스로 이루어진 재순환 원액 용액을 제조하였다. β1,2GT를 이 용액에 0.6 g/L로 용해시키고, β1,3GT의 별개의 원액을 재순환 원액 용액에 1.2 g/L로 용해시켰다. 이어서, 100 mg의 Reb A 60을 1드램 바이알에 넣고, 각각 0.6 g/L β1,2GT 원액 및 1.2 g/L β1,3GT 원액의 0.5 mL를 첨가하였다. 생성된 균질 용액을 60℃에서 교반하였다. 침전물이 서서히 발생하였고, 24시간에 반응 혼합물은 두꺼운 백색 슬러리이었다. HPLC 분석은 90-92% Reb M(~120-130 g/L Reb M)의 존재는 보여주었다. 이 반응을 60℃에서 0.5 g/L ADP 및 10 mM EDTA와 함께 0.6 g/L β1,2GT, 0.2 g/L SUS 및 1.2 g/L β1,2GT가 존재하는 20 mL 내의 2 g의 Reb A로 규모를 변경하였고, JECFA 방법을 사용하여 곡선 하 면적에 의해 87.1% RebM이 수득된 것으로 결정되었다. 정제를 위해, 반응 혼합물을 40℃에서 원심분리하고, 상청액을 경사 분리하고, 펠렛을 1부피의 탈이온수로 재현탁하고, 20℃에서 원심분리하고, 상청액을 경사 분리하였다. 이 세척을 총 4개의 세척액에 대해 반복하고, 펠렛을 동결건조시켜 JECFA 방법을 사용하여 곡선 하 면적에 의해 결정시에 94.3% RebM을 수득하였다.
본 원에서 언급되는 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문헌은 마치 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 모든 목적을 위해 포함된다고 개별적으로 나타낸 바와 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전차게 본원에 참고로 포함된다.
다양한 특정 실시양태가 제시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
Claims (131)
- 서열 번호 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성인 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 글리코실트랜스퍼라제.
- 제1항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 서열 번호
에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성인 폴리펩티드를 포함하는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 우라실-디포스페이트 이외의 당 공여체를 우선적으로 사용하는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제.
- 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이 10, 262, 10/262, 278/284/311/339/360, 283, 307, 309, 339/361, 344/361, 및 361로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제.
- 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 32를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 232를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 348을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 548을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 562를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 758을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 770을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 NDP-글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 792를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 954를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1054를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1002를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2600을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2718을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2814를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2884를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3016을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3082를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3244를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3346을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3502를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3696을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 3956을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4256을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4550을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7324를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7784를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 696을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4684를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4838을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 4876을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5066을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5290을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5372를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5562를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5708을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 5976을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6138을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6288을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6468을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 6864를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7388을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8088을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제. - 제2항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 베타-1,2-글리코실트랜스퍼라제 및 베타-1,3-글리코실트랜스퍼라제로부터 선택되는 것인 조작된 글리코실트랜스퍼라제.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 ADP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(AGT), CDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(CGT), GDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(GGT), TDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(TGT) 및 IDP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제(IGT)로부터 선택되는 NDP-글리코실트랜스퍼라제인 조작된 글리코실트랜스퍼라제.
- 제48항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 ADP-글루코스 의존적 글리코실트랜스퍼라제인 조작된 글리코실트랜스퍼라제.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드.
- 제51항의 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제52항에 있어서, 상기 벡터가 적어도 하나의 제어 서열을 추가로 포함하는 것인 벡터.
- 제51항의 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
- 제52항 및/또는 제53항의 적어도 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 유기체 및 원핵 유기체로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 생성하는 방법으로서, 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 상기 숙주 세포에 의해 생성되도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 생성하는 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 조성물.
- 서열 번호 72에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성인 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제.
- 서열 번호 74, 1080, 1158, 1222, 1392, 1456, 1582, 1764, 1804, 1840, 2064, 2432, 2510, 7506, 및/또는 8420에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성인 폴리펩티드 서열을 포함하는 조작된 수크로스 신타제.
- 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 74를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1080을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1158을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1222를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1392를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1456을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1582를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1764를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1804를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 1840을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2064를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2432를 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 2510을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 7506을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제61항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제의 상기 폴리펩티드 서열이
으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 포함하고, 상기 위치는 서열 번호 8420을 기준으로 하여 넘버링되는 것인 조작된 수크로스 신타제. - 제60항 내지 제76항 중 어느 한 항에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제 폴리펩티드를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드.
- 제77항의 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제78항에 있어서, 적어도 하나의 제어 서열을 추가로 포함하는 벡터.
- 제78항의 적어도 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
- 제78항 또는 제79항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제80항 및/또는 제81항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 유기체 및 원핵 유기체로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
- 제60항 내지 제76항 중 어느 한 항에서 제공되는 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제 변이체를 생성하는 방법으로서, 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 상기 조작된 수크로스 신타제 변이체가 상기 숙주 세포에 의해 생성되도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 조작된 수크로스 신타제 변이체를 생성하는 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 조작된 수크로스 신타제 변이체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제60항 내지 제75항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제 변이체를 포함하는 조성물.
- 적어도 하나의 기질, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계; 및 상기 기질이 글리코실화되어 적어도 하나의 글리코실화된 생성물을 생성하는 조건 하에 상기 기질을 상기 글리코실트랜스퍼라제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 기질을 글리코실화하는 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 기질이 적어도 하나의 스테비올 글리코시드를 포함하는 것인 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 글리코실화된 생성물이 적어도 하나의 모노글리코실화된 및/또는 폴리글리코실화된 생성물을 포함하는 것인 방법.
- 레바우디오시드 M의 생성 방법으로서, 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 레바우디오시드 D 및 레바우디오시드 I 기질, NDP-글루코스, 및 상기 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법.
- 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법으로서, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법.
- 레바우디오시드 D의 생성 방법으로서, 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, NDP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법.
- 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NDP-글루코스가 ADP-글루코스, CDP-글루코스, TDP-글루코스, GDP-글루코스 및/또는 IDT-글루코스로부터 선택되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NDP-글루코스가 UDP-글루코스가 아닌 것인 방법.
- 제86항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코실트랜스퍼라제가 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 것인 방법.
- 레바우디오시드 M의 생성 방법으로서, 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 레바우디오시드 D 및 레바우디오시드 I 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법.
- 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법으로서, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 ADP-글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법.
- 레바우디오시드 D의 생성 방법으로서, 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, ADP-글루코스, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법.
- 레바우디오시드 M의 생성 방법으로서, 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 레바우디오시드 D 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법.
- 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법으로서, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 A 및/또는 레바우디오시드 I의 생성 방법.
- 레바우디오시드 D의 생성 방법으로서, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 D가 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 D의 생성 방법.
- 레바우디오시드 M의 생성 방법으로서, 적어도 하나의 스테비오시드 및/또는 스테비오시드와 rebA의 혼합물을 포함하는 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 수크로스 신타제, 및 글리코실트랜스퍼라제를 레바우디오시드 M이 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법.
- 레바우디오시드 M의 생성 방법으로서, 스테비오시드 기질, NDP, 수크로스, 적어도 하나의 수크로스 신타제, 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 제공하는 단계, 상기 스테비오시드 기질, NDP, 및 글리코실트랜스퍼라제를, 레바우디오시드 A가 먼저 생성된 후, 레바우디오시드 D 및/또는 레바우디오시드 I가 생성되고, 레바우디오시드 M이 마지막으로 생성되는 조건 하에서 조합하는 단계를 포함하는, 레바우디오시드 M의 생성 방법.
- 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스 신타제가 제60항 내지 제76항 중 어느 한 항에서 제공되는 조작된 수크로스 신타제인 방법.
- 제86항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 원 포트 반응으로서 수행되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 순차적으로 수행되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제106항에 있어서, 상기 수크로스가 반복되는 단계 동안 재순환되는 것인 방법.
- 제106항 및/또는 제101항에 있어서, 조작된 글리코실트랜스퍼라제 및/또는 다른 반응 성분이 재순환되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테비오시드 기질이 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 추출되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테비오시드 기질이 합성에 의해 생성되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코실트랜스퍼라제 및/또는 상기 수크로스 신타제가 고정화되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 프럭토스를 포함하는 반응 생성물을 생성하는 것인 방법.
- 제112항에 있어서, 상기 프럭토스가 상기 반응 생성물로부터 제거되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 세척 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제86항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 컬럼 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제86항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 글리코실트랜스퍼라제로부터 선택되는 베타-1,2 글리코실트랜스퍼라제인 방법.
- 제86항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 제4항 내지 제10항 및 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항의 글리코실트랜스퍼라제로부터 선택되는 베타-1,3 글리코실트랜스퍼라제인 방법.
- 제86항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제가 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 글리코실트랜스퍼라제로부터 선택되는 베타-1,2 글리코실트랜스퍼라제이고, 제4항 내지 제10항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항의 글리코실트랜스퍼라제로부터 선택되는 베타-1,3 글리코실트랜스퍼라제인 적어도 하나의 조작된 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제86항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 제60항 내지 제76항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 조작된 수크로스 신타제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제86항 내지 제119항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성되는 적어도 하나의 레바우디오시드.
- 제120항의 레바우디오시드를 포함하는 조성물.
- 제86항 내지 제89항, 제92항 내지 제95항, 제98항 및/또는 제101항 내지 제121항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성되는 레바우디오시드 M.
- 제122항의 레바우디오시드 M을 포함하는 조성물.
- 제86항 내지 제94항, 제96항, 제99항 및/또는 제101항 내지 제121항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성되는 레바우디오시드 A.
- 제124항의 레바우디오시드 A를 포함하는 조성물.
- 제86항 내지 제94항, 제96항, 제99항 및/또는 제101항 내지 제121항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성되는 레바우디오시드 I.
- 제126항의 레바우디오시드 I를 포함하는 조성물.
- 제86항 내지 제94항, 제97항 및/또는 제100항 내지 제121항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성되는 레바우디오시드 D.
- 제128항의 레바우디오시드 D를 포함하는 조성물.
- 제122항, 제124항, 제126항 및/또는 제128항에서 제공되는 적어도 2개의 레바우디오시드를 포함하는 조성물.
- 제123항, 제125항, 제127항 및/또는 제129항에서 제공되는 적어도 2개의 조성물의 혼합물을 포함하는 조성물.
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