KR20230117150A - 시토크롬 p450 돌연변이체 단백질 및 이의 응용 - Google Patents

시토크롬 p450 돌연변이체 단백질 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

시토크롬 P450(CYP716A53v2) 돌연변이체 단백질 및 이의 응용을 제공하며, 상기 돌연변이는 야생형 CYP716A53v2 단백질을 기반으로, F167V, T451A, I117S 및 L208C로 이루어진 군으로부터 선택된 부위 또는 이의 조합의 돌연변이를 수행한 것이며, 돌연변이 후 획득된 CYP716A53v2 돌연변이체의 효소 촉매 활성이 향상되고, 프로토파낙사트리올의 생산량이 향상될 수 있다.

Description

시토크롬 P450 돌연변이체 단백질 및 이의 응용
본 발명은 바이오 기술, 천연 생성물 약물 등 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 본 발명은 시토크롬 P450(CYP716A53v2)의 돌연변이체 단백질 및 이의 응용에 관한 것이다.
진세노사이드는 두릅나무과 인삼속 식물(예를 들어 인삼, 칠삼, 서양삼 등) 중에서 주요한 활성 물질이며, 최근 박과 식물 돌외(Gynostemma pentaphyllum)에서도 일부 진세노사이드가 발견되었다. 현재, 국내외 과학자들은 이미 인삼, 돌외 등의 식물에서 적어도 100여 종의 진세노사이드를 분리해냈는데, 인삼에서 이러한 사포닌의 함량 차이는 매우 크다. 그 중 일부 치료 효능이 현저한 트리테르페노이드 사포닌은 천연 총 사포닌에서 함량이 극히 적고(희귀 사포닌으로도 불림), 추출 비용이 매우 높아, 가격이 매우 비싸다. 현재 다양한 사포닌이 의약품 및 건강관리제품에 사용되고 있는데, 예를 들어 진세노사이드 Rg3 단량체를 주요 성분으로 하는 약물인 션이(參一) 캡슐은 종양 환자의 원기 결핍 증상을 개선하고, 신체의 면역 기능을 향상시킬 수 있다; 진세노사이드 Rh1 등 16종의 희귀 진세노사이드 혼합물을 주요 성분으로 하는 레드세놀(Redsenol) 캡슐은 종양 부위의 신생혈관 생성을 억제하고, 암세포의 세포사멸을 촉진하며, 화학요법 약물 내성을 낮출 수 있다.
희귀 진세노사이드는 종종 독특한 생물학적 활성 또는 보다 현저한 치료 효능을 갖기 때문에, 전통적으로 희귀 진세노사이드는 모두 인삼 또는 칠삼에서 대량의 사포닌을 추출하여 화학적 가수분해법, 효소 가수분해법 및 미생물 가수분해법을 통해 제조된다. 야생의 인삼 자원이 거의 고갈됨에 따라, 인삼 총 사포닌 자원은 현재 주로 인공재배에서 나오는데, 인삼 또는 칠삼은 인공재배 생육주기가 길고(일반적으로 5 내지 7년 이상 필요), 지리적 제한이 있으며, 자주 병충해에 시달려 다량의 농약을 사용해야 하고, 심각한 연작 장애가 있어(인삼 또는 칠삼 재배지는 연작 장애를 극복하려면 5 내지 15년 이상 휴경해야 함), 진세노사이드의 생산량, 품질 및 안정성은 모두 도전에 직면했다. 한편, 인삼 총 사포닌을 원료로 사용하여 단일 성분의 사포닌을 제조하는 경우, 총 사포닌에 더 있는 표적 진세노사이드 단량체(예를 들어 프로토파낙사트리올형 사포닌)로 전환할 수 없는 대량의 성분이 활용될 수 없어, 자원이 낭비될 뿐만 아니라, 추출 정제 비용도 증가된다.
합성 생물학의 발전은 식물 유래 천연물의 이종 합성을 위한 새로운 기회를 제공하였다. 효모를 섀시로 사용하여, 대사 경로의 조립 및 최적화를 통해, 저가의 단당류로 아르테미신산 또는 디히드로아르테미신산을 발효 및 합성한 다음 다시 1단계 화학 전환 방법을 통해 아르테미시닌을 생성하는 것을 이미 구현하였는데, 이는 합성 생물학이 천연 생성물의 약물 합성 측면에서 엄청난 잠재력을 갖고 있음을 나타낸다. 효모 섀시 세포를 이용하여 합성 생물학적 방법을 통해 희귀 진세노사이드 단량체를 이종 합성하며, 원료는 저가의 단당류이고, 제조 과정은 안전성 제어가 가능한 발효 과정이며, 임의 외부 오염(예를 들어, 원료 식물 인공재배 시 사용되는 농약)을 방지하였으므로, 합성 생물학 기술을 통해 희귀 진세노사이드 단량체를 제조함으로써, 원가 경쟁력을 갖출 뿐만 아니라, 완제품의 품질과 안전성을 보장할 수 있다. 합성 생물학 기술을 이용하여 충분한 양의 다양한 고순도 희귀 진세노사이드 단량체를 제조하여, 활성 측정 및 임상 실험에 사용함으로써, 희귀 진세노사이드의 혁신 약물 연구 및 개발을 촉진시킨다.
합성 생물학적 방법을 이용하여 약용 활성을 갖는 프로토파낙사트리올형 진세노사이드를 인공합성하려면, 먼저 프로토파낙사트리올 PPT의 합성 대사 경로를 해석하고 재구성해야 한다. 진세노사이드는 트리테르펜 화합물에 속하기 때문에, 식물 중 MVA 및 MEP 대사 경로는 테르페노이드 화합물의 공통 전구체 IPP 및 DMAPP를 제공하며, 이는 트리테르펜 화합물 전구체 스쿠알렌 및 2,3-에폭시스쿠알렌의 합성을 위한 토대를 마련한다. 2006년 한국과 일본 과학자들은 각각 인삼으로부터 에폭시스쿠알렌을 다마렌디올로 전환시키는 합성효소 DS를 클로닝 및 감정하였는데(Han, J.Y., et al., Plant Cell Physiol, 2006. 47(12): p. 1653-62.; Tansakul, P., et al., FEBS Lett, 2006. 580(22): p. 5143-9), 한국 연구원 Han JY는 각각 2011년(Han, J.Y., et al., Plant Cell Physiol, 2011. 52(12): p. 2062-73)과 2012년(Han, J.Y., et al., Plant Cell Physiol, 2012. 53(9): p. 1535-45)에 인삼의 cDNA 라이브러리로부터 프로토파낙사디올과 프로토파낙사트리올을 합성하는 핵심 시토크롬 P450인, CYP716A47 및 CYP716A53v2를 클로닝 및 감정하였다. CYP716A47은 다마렌디올 C12 부위 히드록실화를 촉매하여 프로토파낙사디올 PPD를 생성할 수 있고, CYP716A53v2는 프로토파낙사디올 C6 부위 히드록실화를 촉매하여 프로토파낙사트리올 PPT를 생성할 수 있다. DS와 위 2개의 시토크롬 P450 및 애기장대 유래의 P450 환원효소 ATR2-1을 WAT21 효모에 공동발현시켜, 프로토파낙사디올과 프로토파낙사트리올을 생산할 수 있는 재조합 균주를 획득하였다. 추가 연구에서는, CYP716A53v2가 프로토파낙사디올이 프로토파낙사트리올로 전환되도록 촉매하는 것은 전체 합성 경로에서 하나의 핵심 속도 제한 단계인 것으로 나타났다.
따라서, 당업계에서는 보다 높은 효율의 시토크롬 P450 단백질 성분을 획득하여 진세노사이드 세포 공장 합성 효율을 촉진시키기 위하여, 시토크롬 P450 CYP716A53v2에 대한 더 많은 연구와 변형을 수행할 필요가 있다.
본 발명은 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 단백질 암호화 서열에 대해 돌연변이 및 최적화를 수행하여 새로운 돌연변이 서열을 획득하였으며, 프로토파낙사디올 생산 세포 내에서 해당 돌연변이 서열의 발현은 프로토파낙사트리올 생산량을 크게 증가시킬 수 있다.
본 발명의 제1 양상에서, 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 촉매 활성을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기에는 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 아미노산 서열을 돌연변이시키는 단계가 포함되고, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2에 대응하여, 돌연변이는 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째로 이루어진 군의 부위 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 아미노산 위치 넘버링은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열에 기초한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 167번째 부위는 Val(V)로 돌연변이되고, 451번째 부위는 Asn(A)로 돌연변이되고, 117번째는 Ser(S)로 돌연변이되고, 208번째 부위는 Cys(C)로 돌연변이된다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체가 제공되며, 이는 (a) 아미노산 서열이 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2에 대응하여, 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위 또는 부위 조합에 돌연변이가 발생한 단백질(비교적 바람직하게는, 이들은 핵심 아미노산 돌연변이임); (b) (a) 단백질의 아미노산 서열이 하나 이상(예를 들어 1 내지 20개; 비교적 바람직하게는 1 내지 15개; 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 예를 들어 5개, 3개)의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가에 의해 형성된 것이며, (a) 단백질 기능을 갖는 (a)로부터 유래된 단백질 ― 단, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째에 대응하는 아미노산은 (a) 단백질의 해당 위치에서 돌연변이된 아미노산과 동일함 ― ; (c) (a) 단백질의 아미노산 서열과 80% 이상(비교적 바람직하게는 85% 이상; 보다 바람직하게는 90% 이상; 더욱 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어 98%, 99%)의 상동성을 가지며 (a) 단백질의 기능을 갖는 (a)로부터 유래된 단백질 ― 단, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째에 대응하는 아미노산은 (a) 단백질의 해당 위치에서 돌연변이된 아미노산과 동일함 ― ; 또는, (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드의 N 또는 C 말단에 태그 서열이 부가되거나, 이의 N 말단에 신호 펩티드 서열 또는 분비 신호 서열이 부가되어 형성된 폴리펩티드이다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는 야생형보다 현저하게 높은 촉매 활성을 갖는다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체에서, 167번째 부위는 Val(V)로 돌연변이된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체에서, 451번째 부위는 Asn(A)로 돌연변이된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체에서, 117번째 부위는 Ser(S)로 돌연변이된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체에서, 208번째 부위는 Cys(C)로 돌연변이된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2에 대응하여,
(1) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
(2) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되고, 167번째 부위가 Val로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
(3) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되고;
(4) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
(5) 167번째 부위가 Val로 돌연변이되고;
(6) 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
(7) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고;
(8) 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 핵산은 전술한 어느 하나에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체를 암호화한 것이다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터는 발현 벡터, 셔틀 벡터 및 통합 벡터를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 유전자 조작된 숙주 세포가 제공되며, 여기에는 전술한 어느 하나에 따른 벡터가 포함되거나, 전술한 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드가 게놈에 통합된다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이고; 비교적 바람직하게는, 상기 진핵 세포는 효모 세포, 식물 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 곰팡이 세포, 포유동물 세포를 포함하고(단, 이에 한정되지 않음); 보다 바람직하게는, 상기 효모 세포는 사카로미세스 세레비시아 세포 또는 피키아 파스토리스 세포(보다 바람직하게는 사카로미세스 세레비시아 세포임)를 포함하고(단, 이에 한정되지 않음); 보다 바람직하게는, 상기 식물 세포는 인삼 세포를 포함하고(단, 이에 한정되지 않음); 비교적 바람직하게는, 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균 세포를 포함한다(단, 이에 한정되지 않음).
본 발명의 다른 일 양상에서, 전술한 어느 하나에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체의 제조 방법이 제공되며, 여기에는:
(i) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계;
(ii) 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체를 포함하는 배양물을 수집하는 단계; 및
(iii) 배양물로부터 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체를 분리하는 단계가 포함된다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 데 사용되는 조성물이 제공되며, 여기에는 전술한 어느 하나에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체; 또는, 상기 숙주 세포 또는 이의 배양물 또는 용해물; 및 식품학 또는 산업적으로 허용 가능한 담체가 유효량으로 함유된다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 촉매는 고효율 촉매이며, 이의 촉매 효율은 야생형보다 적어도 10% 이상 높고, 비교적 바람직하게는 적어도 20% 이상 높고, 보다 바람직하게는 적어도 30% 이상 높으며, 예를 들어 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상 높다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 전술한 어느 하나에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체의 용도가 제공되며, 이는 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 데 사용되고; 비교적 바람직하게는, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는 프로토파낙사디올의 C6 부위에 하나의 히드록시기를 부가하여, 프로토파낙사트리올을 생성한다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 상기 조성물의 용도가 제공되며, 이는 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 데 사용되고; 비교적 바람직하게는, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는 프로토파낙사디올의 C6 부위에 하나의 히드록시기를 부가하여, 프로토파낙사트리올을 생성한다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 전술한 어느 하나에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체 또는 상기 조성물을 이용하여 프로토파낙사디올을 처리하는 단계를 포함하고; 비교적 바람직하게는, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는 프로토파낙사디올의 C6 부위에 하나의 히드록시기를 부가하여, 프로토파낙사트리올을 생성한다.
본 발명의 다른 일 양상에서, 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 데 사용되는 키트가 제공되며, 여기에는 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체 또는 돌연변이체의 조합; 상기 숙주 세포; 또는 상기 조성물이 포함된다.
본 발명의 다른 양상은 본원에 공개된 내용에 의해 당업자가 용이하게 알 수 있다.
도 1은 사카로미세스 세레비시아 섀시 세포에서 통합 돌연변이의 CYP716A53v2의 PPT 생산량을 도시한 것이다.
본 발명자는 심도 있는 연구를 거쳐, 대량의 CYP716A53v2 돌연변이체를 구축하여, 돌연변이체에 대한 기능적 연구를 수행함으로써, 효소 촉매 활성과 관련된 아미노산 부위를 확정하였고, 부위 특이적 변형을 통해, 효소 촉매 활성이 현저히 향상된 돌연변이체를 획득하였다.
본 발명의 돌연변이체 및 이의 암호화 핵산
본 발명자는 프로토파낙사디올 PPD를 합성하는 사카로미세스 세레비시아 섀시 세포 ZW를 이용하여, 시토크롬 P450(CYP716A53v2)의 돌연변이 라이브러리를 구축하였다: 무작위 돌연변이된 CYP716A53v2 유전자를 사카로미세스 세레비시아 섀시 세포 ZW로 형질전환하여 효모 게놈에 단일 복사 삽입되고 프로토파낙사디올 PPT를 합성하는 CYP716A53v2 효모 돌연변이 라이브러리를 구축하였다. 균주 PPT 생산량을 기반으로, 본 발명자는 CYP716A53v2 활성을 향상시키는 핵심 아미노산 부위를 확정하였다. 본 발명에서는, 시토크롬 P450(CYP716A53v2)의 핵심 부위를 변형하여 획득한 일부 돌연변이체가, PPT 생산량을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이체(단백질)", "CYP716A53v2 돌연변이체", "돌연변이형 CYP716A53v2"는 호환 사용될 수 있으며, 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올로 생성하는 비천연 발생 단백질을 모두 지칭하고, 상기 돌연변이 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 단백질이거나, SEQ ID NO: 1로 표시되는 단백질을 기반으로 인공 변형된 단백질이며(그 불활성 부위가 변화된 변이체, 유도체 등을 포함함), 여기에서 상기 돌연변이 단백질은 효소 촉매와 관련된 핵심 아미노산을 함유하고, 상기 핵심 아미노산 중 적어도 하나는 인공 변형된 것이며; 본 발명의 돌연변이 단백질은 프로토파낙사디올(PPD)의 C6 히드록실화를 촉매하여 프로토파낙사트리올(PPT)을 형성하는 효소 활성을 갖는다.
용어 "핵심 아미노산"은 SEQ ID NO: 1을 기반으로, SEQ ID NO: 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 것을 지칭하는데, 예를 들어 84%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%의 서열에서, 상응하는 부위는 본원에 따른 특정 아미노산이며, 예를 들어 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열을 기반으로, 핵심 아미노산은: 167번째 아미노산이 V이며; 451번째 아미노산이 A이며; 117번째 아미노산이 S이며; 208번째 아미노산이 C이며; 117번째 아미노산이 S이고, 208번째 아미노산이 C이며; 117번째 아미노산이 S이고, 451번째 아미노산이 A이며; 117번째 아미노산이 S이고, 208번째 아미노산이 C이고, 451번째 아미노산이 A이며; 117번째 아미노산이 S이고, 167번째 아미노산이 V이고, 208번째 아미노산이 C이고, 451번째 아미노산이 A이다.
본 발명의 돌연변이 단백질에서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1을 기준으로 한 것으로 이해되어야 하며, 구체적으로 특정 돌연변이 단백질과 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열의 상동성이 80% 이상에 달하면, 돌연변이 단백질의 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 넘버링에 상대적으로 오정렬될 수 있고, 예를 들어 아미노산의 N 말단 또는 C 말단에 1 내지 5 부위가 오정렬되면, 당업계의 일반적인 서열 정렬 기술이 채택되므로, 당업자는 통상적으로 이러한 오정렬이 합리적인 범위 내에 있음을 이해할 수 있으며, 상동성이 80%(예를 들어 90%, 95%, 98%)에 도달하고 동일하거나 유사한 효소 활성을 갖는 돌연변이 단백질을 아미노산 넘버링의 오정렬 때문에 본 발명의 돌연변이 단백질의 범위에서 제외해서는 안 된다.
본 발명의 돌연변이체(돌연변이 단백질)는 합성 단백질 또는 재조합 단백질이며, 즉 화학적 합성의 생성물이거나, 재조합 기술을 사용하여 원핵 또는 진핵 숙주(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물)로부터 생성되는 것일 수 있다. 재조합 생산 방식에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 돌연변이 단백질은 글리코실화되거나, 글리코실화되지 않은 것일 수 있다. 본 발명의 돌연변이 단백질은 초기의 메티오닌 잔기를 더 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 상기 돌연변이 단백질의 단편, 유도체 및 유사체를 더 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 상기 돌연변이 단백질과 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 기본적으로 보유하는 단백질을 의미한다.
본 발명의 돌연변이 단백질 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 돌연변이 단백질일 수 있으며, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화된 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에 치환기를 갖는 돌연변이 단백질, 또는 (iii) 성숙한 돌연변이 단백질과 다른 화합물(예를 들어 돌연변이 단백질 반감기를 연장하는 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜)이 융합되어 형성된 돌연변이 단백질, 또는 (iv) 부가된 아미노산 서열이 이 돌연변이 단백질 서열에 융합되어 형성된 돌연변이 단백질(예를 들어 리더 서열 또는 분비 서열 또는 이 돌연변이 단백질을 정제하기 위한 서열 또는 전구단백질 서열, 또는 항원 IgG 단편과 형성된 융합 단백질)일 수도 있고, 아닐 수도 있다. 본원에 교시된 바를 기반으로, 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에게 공지된 범위에 속한다. 본 발명에서, 보존적으로 치환된 아미노산은 가장 바람직하게는 표 1에 따른 아미노산 치환에 의해 생성된다.
또한, 본 발명의 돌연변이 단백질은 변형될 수도 있다. 변형(통상적으로 1차 구조는 변경하지 않음) 형태에는, 생체내 또는 생체외 돌연변이 단백질의 아세틸화 또는 카르복실화와 같은 화학적 유도 형태가 포함된다. 변형에는 글리코실화, 예를 들어 돌연변이 단백질의 합성 및 가공 과정 또는 추가적 가공 과정에서 수행하는 글리코실화 변형에 의해 생성된 돌연변이 단백질이 더 포함된다. 이러한 변형은 돌연변이 단백질을 글리코실화된 효소(예를 들어 포유동물의 글리코실화 효소 또는 탈글리코실화 효소)에 노출시킴으로써 완료할 수 있다. 변형 형태는 인산화 아미노산 잔기(예를 들어 포스포티로신, 포스포세린, 포스포트레오닌)를 갖는 서열을 더 포함하며, 변형되어 그 단백질 가수분해 저항성이 향상되거나 용해성이 최적화된 돌연변이 단백질을 더 포함한다.
용어 "돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 서열을 추가로 암호화하고/하거나 암호화하지 않는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드의 돌연변이체에 관한 것이기도 하며, 이는 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 돌연변이 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 암호화한다. 이러한 뉴클레오티드 돌연변이체는 치환 돌연변이체, 결실 돌연변이체 및 삽입 돌연변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립형질 변이체는 하나의 폴리뉴클레오티드의 치환 형태이며, 이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있으나, 그 암호화된 돌연변이 단백질의 기능을 실질적으로 변경할 수 없다.
본 발명의 돌연변이 단백질 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 분리된 형태로, 보다 바람직하게는 균질하게 정제된 형태로 제공된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전장 서열은 통상적으로 PCR 증폭법, 재조합법 또는 인공 합성의 방법에 의해 획득될 수 있다. PCR 증폭법의 경우, 본 발명에 공개된 관련 뉴클레오티드 서열, 특히 오픈 리딩 프레임 서열을 기반으로 프라이머를 설계할 수 있으며, 시판되는 cDNA 라이브러리 또는 당업자에게 공지된 일반적인 방법에 따라 제조된 cDNA 라이브러리를 템플릿으로 사용하여, 증폭시켜 관련 서열을 획득할 수 있다. 서열이 비교적 긴 경우, 종종 2회 이상의 PCR 증폭을 수행한 후, 다시 각각의 회차에 증폭된 단편을 올바른 순서로 함께 스플라이싱해야 한다.
일단 관련 서열이 획득되면, 재조합법으로 관련 서열을 대량으로 획득할 수 있다. 통상적으로 이를 벡터에 클로닝한 다음, 세포에 옮긴 후, 일반적인 방법을 통해 증식된 숙주 세포로부터 관련 서열을 분리한다.
또한, 인공 합성 방법으로 관련 서열을 합성할 수도 있으며, 특히 단편 길이가 비교적 짧은 경우에 할 수 있다. 통상적으로, 먼저 복수의 작은 단편을 합성한 후, 다시 연결하여 서열이 매우 긴 단편을 획득할 수 있다.
현재, 화학적 합성을 통해 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 암호화하는 DNA 서열을 완전히 획득할 수 있다. 그 후 해당 DNA 서열을 당업계에 공지된 다양한 기존 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터) 및 세포에 도입할 수 있다. 또한, 화학적 합성을 통해 돌연변이체를 본 발명의 단백질 서열에 도입할 수도 있다.
PCR 기술을 사용하여 DNA/RNA를 증폭하는 방법은 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 획득하는 데 사용된다. 특히 라이브러리로부터 전장의 cDNA를 획득하기 어려운 경우, 바람직하게는 RACE법(RACE-cDNA 말단 급속 증폭법)을 사용할 수 있으며, PCR에 사용되는 프라이머는 본원에 공개된 본 발명의 서열 정보에 따라 적절하게 선택할 수 있고, 일반적인 방법으로 합성할 수 있다. 증폭된 DNA/RNA 단편은 겔 전기영동과 같은 일반적인 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.
발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 돌연변이 단백질 암호화 서열을 사용하여 유전 공학에 의해 생산된 숙주 세포, 및 재조합 기술로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이기도 하다.
일반적인 재조합 DNA 기술을 통해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합 돌연변이 단백질을 발현하거나 생산하는데 사용할 수 있다. 일반적으로 다음과 같은 단계가 있다:
(1) 본 발명의 돌연변이 단백질을 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(또는 돌연변이체)를 사용하거나, 해당 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 발현 벡터를 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질전환 또는 형질도입한다.
(2) 적합한 배지에서 숙주 세포를 배양한다.
(3) 배지 또는 세포로부터 단백질을 분리 및 정제한다.
본 발명에서, 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 당업계에 공지된 박테리아 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스와 같은 포유동물 세포 바이러스 또는 기타 벡터를 의미한다. 숙주 체내에서 복제되고 안정화될 수 있는 한, 임의 플라스미드와 벡터는 모두 사용될 수 있다. 발현 벡터의 중요한 특징은 통상적으로 복제 기점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 제어 요소를 포함한다는 것이다.
당업자에게 잘 알려진 방법은 본 발명의 돌연변이 단백질 암호화 DNA 서열 및 적절한 전사/번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 체외 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 체내 재조합 기술 등이 포함된다. 상기 DNA 서열은 발현 벡터의 적절한 프로모터 상에 유효하게 연결되어, mRNA 합성을 지시할 수 있다. 이러한 프로모터의 대표적인 예시에는, 대장균의 lac 또는 trp 프로모터; λ파지 PL 프로모터가 있으며; 진핵 프로모터에는 CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스의 LTRs 및 기타 일부 공지된 제어 가능한 유전자가 원핵 또는 진핵 세포 또는 이의 바이러스에서 발현하는 프로모터가 포함된다. 발현 벡터는 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 더 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택적 마커 유전자를 포함하여, 진핵 세포 배양에 사용되는 디히드로폴레이트 환원효소, 네오마이신 내성 및 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 대장균에 사용되는 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포를 선택하기 위한 표현형 특성을 제공한다.
상술한 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터는, 적절한 숙주 세포를 형질전환하여, 그것이 단백질을 발현할 수 있도록 하는 데 사용될 수 있다.
숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예시로는, 대장균, 스트렙토마이세스; 쥐장티푸스균의 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포, 식물 세포(예를 들어 인삼 세포)가 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드가 고등 진핵 세포에서 발현될 때, 인핸서 서열이 벡터에 삽입되면 전사가 강화될 것이다. 인핸서는 DNA의 시스 작용 요소로, 통상적으로 대략 10 내지 300개 염기쌍이 있으며, 프로모터에 작용하여 유전자 전사를 강화한다. 예를 들면 복제 기점의 후기 일측의 100 내지 270개 염기쌍의 SV40 인핸서, 복제 기점 후기 일측의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서 등이 포함된다.
당업자는 적절한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 숙주 세포를 어떻게 선택하는지 모두 명확하게 알고 있다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 일반적인 기술로 수행할 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 수용성 세포는 대수증식기 후 수확하고, CaCl2법으로 처리할 수 있으며, 사용되는 단계는 당업계에 공지된 것이다. 또 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요할 경우, 형질전환은 전기천공 방법으로도 수행할 수 있다. 숙주가 진핵 생물인 경우, 인산칼슘 공침법, 및 미세주입, 전기천공, 리포솜 패키징 등과 같은 일반적인 기계적 방법과 같은 DNA 형질감염 방법을 선택하여 사용할 수 있다.
획득된 형질전환체는 일반적인 방법으로 배양하여, 본 발명의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 사용된 숙주 세포에 따라, 배양에 사용되는 배지는 다양한 일반 배지에서 선택할 수 있다. 배양은 숙주 세포 성장에 적합한 조건에서 수행된다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적합한 방법(예를 들어 온도 전환 또는 화학적 유도)으로 선택된 프로모터를 유도하고, 세포를 일정 시간 동안 더 배양한다.
상기 방법에서 재조합 폴리펩티드는 세포 내, 또는 세포막 상에서 발현되거나, 세포외로 분비될 수 있다. 필요한 경우, 그 물리적, 화학적 및 기타 특성을 이용하여 다양한 분리 방법으로 재조합된 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예시에는, 일반적인 재생 처리, 단백질 침전제를 사용한 처리(염석법), 원심분리, 균 삼투 파괴, 초처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 기타 다양한 액체 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 결합이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
응용
본 발명의 CYP716A53v2 돌연변이체는 프로토파낙사디올에 특이적으로 작용할 수 있고, 그 C6 부위에 히드록시기를 부가하여, 프로토파낙사트리올을 생성할 수 있으며, 이의 촉매 활성은 야생형 CYP716A53v2보다 높다. 상기 촉매는 고효율 촉매이며, 이의 촉매 효율은 야생형보다 적어도 10% 이상 높고, 비교적 바람직하게는 적어도 20% 이상 높고, 보다 바람직하게는 적어도 30% 이상 높으며, 예를 들어 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상 높다.
프로토파낙사디올 프로토파낙사트리올
본 발명의 CYP716A53v2 돌연변이체를 획득한 후, 본 발명에서 제안한 바에 따라, 당업자는 본 발명의 돌연변이체를 용이하게 응용하여 기질인 프로토파낙사디올에 대한 촉매 작용을 발휘할 수 있으며, 야생형 CYP716A53v2로 인한 현저한 기술적 효과를 획득할 수 있다.
적용 시, 특히 산업적 생산에서, 본 발명의 CYP716A53v2 돌연변이체 또는 이의 유래 폴리펩티드는 고체상 담체 상에 고정되어, 고정화된 효소를 획득할 수 있으며, 이는 기질과 체외 반응하는데 사용될 수 있다. 상기 고체상 담체는 예를 들어 일부 무기물로 이루어진 마이크로스피어, 관상체 등이다. 고정화 효소의 제조 방법은 물리적 방법과 화학적 방법의 두 가지 범주로 나눌 수 있다. 물리적 방법에는 물리적 흡착법, 포매법 등이 포함된다. 화학적 방법에는 결합법, 가교법이 포함된다. 결합법은 다시 이온 결합법과 공유 결합법으로 나뉜다. 상기 고정화 효소의 방법은 모두 본 발명에 적용될 수 있다.
선택 가능한 방식으로서, 본 발명의 CYP716A53v2 돌연변이체를 이용하여 체외 생산을 수행할 수 있으며, 본 발명의 CYP716A53v2 돌연변이체(이의 추출물(조추출물 포함) 또는 발효액일 수 있고, 이의 분리 정제된 생성물일 수도 있음)의 대량 생산을 통해, 프로토파낙사디올의 존재 하에서(기질로서) 반응하여, 프로토파낙사트리올 생성물을 획득할 수도 있다.
본 발명의 다른 바람직한 방식으로서, 생합성 방법을 이용하여 생산할 수 있다. 이는 통상적으로, (1) 조작된 세포를 제공하는 단계 ― 해당 세포는 프로토파낙사트리올(PPT)을 포함하는 합성 대사 경로 또는 생산 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 일 측면의 특징을 가짐 ― ; (2) (1) 상기 조작된 세포에 본 발명에 따른 CYP716A53v2 돌연변이체를 발현하거나, 본 발명의 CYP716A53v2 돌연변이체로 해당 대사 경로의 야생형 CYP716A53v2를 치환하는 단계; 및 (3) (2)의 조작된 세포를 배양하여, 프로토파낙사트리올 생성물을 생산하는 단계를 포함한다. 보다 바람직한 방식에서, 상기 방법은, 조작된 세포의 배양물로부터, 상기 생성물을 분리 정제하는 단계를 더 포함한다.
생합성 방법으로 생산하는 경우, 본 발명의 바람직한 방식으로서, 세포에서 프로토파낙사트리올(PPT) 합성 대사 경로 중 기타 화합물 대사 경로/생산 경로를 강화하는 단계를 더 포함한다. 그 합성 대사 경로의 상류 경로에서 화합물의 생산을 강화함으로써, 더 많은 상류 기질을 제공하여, 본 발명의 촉매 반응 전구체로 사용할 수도 있다. 프로토파낙사트리올(PPT) 합성 대사 경로를 강화하는 기타 일부 방법도 본 발명에 포함될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 CYP716A53v2 돌연변이체는 촉매 작용을 갖는 조성물의 제조에 적용될 수도 있다. 당업자는 조성물의 실제 용도에 따라 조성물 중 CYP716A53v2 돌연변이의 유효량을 확정할 수 있다.
본 발명에 따른 CYP716A53v2 돌연변이체, 이를 포함하는 조성물, 이를 발현하는 세포 등을, 키트에 포함시켜, 응용의 확대 또는 상업적 응용이 용이하도록 할 수 있다. 비교적 바람직하게는, 상기 키트는 상기 유전자 조작된 세포를 배양하기에 적합한 배지 또는 배양 성분을 더 포함할 수 있다. 비교적 바람직하게는, 상기 키트에는 당업자가 적절한 방법으로 생산하도록 안내하기 위해, 생합성 방법을 설명하는 사용 설명서가 더 포함된다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 이하 실시예에서 구체적인 조건이 명시되지 않은 실험 방법은, 통상적으로 분자 클로닝 실험 매뉴얼(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J. Sambrook 등 집필, 제3판, 과학출판사, 2002)에 설명된 일반적인 조건을 따르거나, 제조업체가 권장하는 조건에 따른다.
야생형 CYP716A53v2 단백질 서열(SEQ ID NO: 1):
MDLFISSQLLLLLVFCLFLFWNFKPSSQNKLPPGKTGWPIIGETLEFISCGQKGNPEKFVTQRMNKYSPDVFTTSLAGEKMVVFCGASGNKFIFSNENKLVVSWWPPAISKILTAT I PSVEKSKALRSLIVEFLKPEALHKFISVMDRTTRQHFEDKWNGSTEVKA F AMSESLTFELACWLLFSINDPVQVQKLSHLFEKVKAGLLS L PLNFPGTAFNRGIKAANLIRKELSVVIKQRRSDKLQTRKDLLSHVMLSNGEGEKFFSEMDIADVVLNLLIASHDTTSSAMGSVVYFLADHPHIYAKVLTEQMEIAKSKGAGELLSWEDIKRMKYSRNVINEAMRLVPPSQGGFKVVTSKFSYANFIIPKGWKIFWSVYSTHKDPKYFKNPEEFDPSRFEGDGPMPFTFIPFGGGPRMCPGSEFARLEVLIFMHHLVTNFKWEKVFPNEKIIY T PFPFPENGLPIRLSPCTL
상기 서열에서, 돌연변이 부위는 굵은 밑줄로 표시하였다.
실시예 1. 무작위 돌연변이를 통한 고효율의 시토크롬 P450 돌연변이 단백질 획득
(1) pUC57-synPPTS(CYP716A53v2 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드)를 템플릿으로 하여, 프라이머 SJ-F(SEQ ID NO: 2) 및 SJ-R(SEQ ID NO: 3)을 사용하여 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) PCR을 수행하였다. 상기 오류가 발생하기 쉬운 PCR은 Stratagene사의 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit 무작위 돌연변이 키트를 선택하였다. PCR 프로그램은, 95℃ 2분; 95℃ 10초, 55℃ 15초, 72℃ 1분 30초, 총 24회 순환; 72℃에서 10분 동안 10℃까지 강하, pUC57-synPPTS 템플릿 사용량 900ng로 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 회수하여 CYP716A53v2의 오류가 발생하기 쉬운 PCR 생성물을 획득하였다.
SJ-F: atggatttgtttatttcttc(SEQ ID NO: 2);
SJ-R: ttacaatgtacatggagaca(SEQ ID NO: 3).
(2) 표 2에 따른 프라이머와 템플릿으로 PCR 반응을 수행하여, 표적 DNA 단편을 증폭하였으며, 균주 구축에 사용하였다. 상기 PCR 시스템은 Tsingke사의 고충실도 PCR 효소 I-5TM 2ХHigh-Fidelity Master Mix 표준 시스템이다. PCR 프로그램은, 98℃ 2분; 98℃ 10초, 55℃ 15초, 72℃ 1분, 총 30회 순환; 72℃에서 10분 동안 10℃까지 강하를 수행하였다. 아가로스 겔 전기영동으로 회수한 후 각각의 PCR 생성물을 수득하였다. 상기 PCR 생성물 단편 양단은 PCR 프라이머를 이용하여 그 전후로 인접한 양단 단편과 상동성인 약 70bp의 서열을 각각 가지며, 이는 사카로미세스 세레비시아에서 상동성 재조합에 사용된다.
PPT-UP-F: cccaaagctaagagtcccat(SEQ ID NO: 4);
PPT-UP-R: gtagaaacattttgaagctatggtgtgtgggggatcactctgctcttgaatggcgacag(SEQ ID NO: 5);
PPT-TEF1-F: aacactggggcaataggctgtcgccattcaagagcagagtgatcccccacacaccatag(SEQ ID NO: 6);
PPT-TEF1-R: aacaataacaattgtgaagaaataaacaaatccattttgtaattaaaacttagattaga(SEQ ID NO: 7);
PPT-PPTS-F: gaaagcatagcaatctaatctaagttttaattacaaaatggatttgtttatttcttcac(SEQ ID NO: 8);
PPT-PPTS-R: agtgtctcccgtcttctgtctaatgatgatgatgatgatgcaatgtacatggagacaat(SEQ ID NO: 9);
PPT-PRM9-F: attgtctccatgtacattgcatcatcatcatcatcattagacagaagacgggagacact(SEQ ID NO: 10);
PPT-PRM9-R: ctgtcgattcgatactaacgccgccatccagtgtcgaattttcaacatcgtattttccg(SEQ ID NO: 11);
PPT-KAN-F: cattatgcaacgcttcggaaaatacgatgttgaaaattcgacactggatggcggcgtta(SEQ ID NO: 12);
PPT-KAN-R: aattcaaaaaaaaaagcgaatcttcccatgcctgttcagcgacatggaggcccagaat(SEQ ID NO: 13);
PPT-DN-F: agactgtcaaggagggtattctgggcctccatgtcgctgaacaggcatgggaagattcg(SEQ ID NO: 14);
PPT-DN-R: tctggtgaggatttacggtatg(SEQ ID NO: 15).
(3) 상기 모든 생성물 DNA 단편을 100ng씩 균일하게 혼합한 후 사카로미세스 세레비시아 균주 ZW(Wang, P. P., et al., Cell Discovery, 2019. 5(5)) 수용성을 형질전환하였다. 형질전환 완료 후 균주는 YPD+200mg/L G418 항생제 스크리닝 플레이트에 균일하게 도말하고, 30℃에서 48시간 동안 정치하여 배양하였다. 모든 클론을 이쑤시개로 골라 96-웰 플레이트에 옮기고, 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였으며, 1:100의 비율로 하나의 새로운 96-웰 플레이트로 옮겨 96시간 동안 발효시켰다.
화합물 추출: 발효액에 동일 부피의 n-부탄올 용매를 첨가하여 24시간 동안 추출하고, 상층 유기상을 흡취하고 HPLC을 진행하여 각각의 형질전환체 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올 생산량 및 그 비율을 검출하였다.
(4) 대량의 스크리닝 작업을 거쳐, 본 발명자는 프로토파낙사트리올 생산량 PPT가 20% 향상되고 프로토파낙사트리올/프로토파낙사디올의 비율(PPT/PPD)이 20% 이상 증가한 총 4개의 클론을 획득하였으며, 넘버링은 각각 SJ-1, SJ-2, SJ-3 및 SJ-4였다. 각각 상기 4개 클론의 게놈을 템플릿으로 하고, 프라이머 SJ-F 및 SJ-R을 이용해 PCR을 수행하여 각각의 클론의 시토크롬 P450 단편을 획득하였으며, 시퀀싱을 수행하여 각각의 돌연변이체 단백질 서열을 검출 및 획득하였다.
상기에서 획득한 각각의 야생형 및 돌연변이체 단백질 서열 정보 및 PPT 생산량은 표 3 및 도 1에 도시된 바와 같다.
실시예 2. 돌연변이체 부위를 통합하여, 보다 고효율의 CYP716A53v2 돌연변이체 획득
실시예 1에서 무작위 돌연변이 방법을 통해 F167V, T451A, I117S 및 L208C로 총 4개의 활성 향상 부위를 획득하였다.
야생형 CYP716A53v2 유전자를 기반으로, 상기 4개의 돌연변이 부위를 다양하게 조합하여, 일련의 CYP716A53v2 돌연변이 유전자를 획득하였다. 실시예 1의 (2) 및 (3)에 설명된 방법으로, 상기 CYP716A53v2의 조합 돌연변이 유전자를 ZW 효모 수용성에 각각 옮기고, 일련의 상응하는 균주를 구축하여 발효를 수행하였다.
발효 방법: 각각의 돌연변이는 단일 클론 6개를 골라 96-웰 플레이트에 넣고, 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였으며, 1:100의 비율로 새로운 96-웰 플레이트로 옮겨 96시간 동안 발효시켰다(효모 자체는 히드록시기 공여체를 생성할 수 있음).
화합물 추출: 발효액에 동일 부피의 n-부탄올 용매를 첨가하여 화합물을 균으로부터 추출하고, 24시간 추출하여, 상층 유기상을 흡취하고 HPLC를 진행하여 각각의 형질전환체 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올 생산량 및 그 비율을 검출하였다.
실시예 3. 상기 시토크롬 P450 돌연변이체 단백질을 이용한 프로토파낙사트리올의 고효율 이종 합성
본 실시예에서. 상기 시토크롬 P450 돌연변이체 단백질을 이용하여 프로토파낙사트리올의 고효율 이종 합성을 수행하였으며, 구체적인 방법은 다음과 같다:
(1) 표 2에 따른 프라이머와 템플릿으로 PCR 반응을 수행하여, 표적 DNA 단편을 증폭하였으며, 균주 구축에 사용하였다. 상기 PCR 시스템은 Tsingke사의 고충실도 PCR 효소 I-5TM 2ХHigh-Fidelity Master Mix 표준 시스템이다. PCR 프로그램은, 98℃ 2분; 98℃ 10초, 55℃ 15초, 72℃ 1분, 총 30회 순환; 72℃에서 10분 동안 10℃까지 강하를 수행하였다. PCR 생성물은 아가로스 겔 전기영동으로 회수한 후 각각의 PCR 생성물을 수득하였다. 상기 PCR 생성물 단편 양단은 그 전후로 인접한 양단 단편과 상동성인 약 70bp의 서열을 각각 가지며, 이는 사카로미세스 세레비시아에서 상동성 재조합에 사용된다.
상기 모든 유전자, 상동 아암 및 스크리닝 마커 유전자 PCR 단편을 100ng씩 균일하게 혼합한 후 사카로미세스 세레비시아 균주 수용성 ZW를 형질전환하여, 프로토파낙사트리올을 생성하는 재조합 사카로미세스 세레비시아 균주 PPT-WT 균주를 획득하였다.
(2) 유사하게 돌연변이 유전자 ZH-1, ZH-2, ZH-3 및 ZH-4로 야생형 CYP716A53v2 유전자를 대체하여 템플릿으로 각각 사용하였다. 상기 PCR을 수행하여 각각의 PCR 단편을 획득하였으며, 사카로미세스 세레비시아 수용성 ZW를 각각 형질전환하여, 각각의 돌연변이체 단백질을 포함한 프로토파낙사트리올을 생성하는 재조합 사카로미세스 세레비시아 균주 PPT-ZH-1 균주, PPT-ZH-2 균주, PPT-ZH-3 균주, PPT-ZH-4 균주를 획득하였다.
(3) 고체 배지 배합 제조: 배지의 배합 제조: 1% 효모 추출물, 2% Bacto 펩톤, 2% D-글루코스, 2% 한천 분말. 액체 배지 배합 제조: 배지 배합 제조: 배지 배합 제조: 1% 효모 추출물, 2% Bacto 펩톤, 2% D-글루코스.
(4) 고체 배지 플레이트 상에 스트리킹한 재조합 사카로미세스 세레비시아 PPT-ZH-1 균주, PPT-ZH-2 균주, PPT-ZH-3 균주 및 PPT-ZH-4 균주를 골라, 5mL 액체 배지가 함유된 시험관에서 각각 밤새 진탕 배양하였으며(30℃, 250rpm, 16시간); 원심분리하여 균체를 수집하여, 10mL 액체 배지의 50mL 삼각 플라스크로 옮겼으며, OD600을 0.05로 조정하고, 30℃, 250rpm으로 4일간 진탕 배양하여 발효 생성물을 획득하였다. 본 방법에서는 각각의 균주의 재조합 효모에 대해 하나의 병렬 실험을 동시에 설정하였다.
(5) 프로토파낙사트리올 추출 및 검출: 10mL 발효액으로부터 100μL 발효액을 흡취하고, Fastprep으로 효모를 진탕 용해하고, 동일 부피의 n-부탄올을 첨가하여 추출한 다음, 진공 조건 하에서 n-부탄올을 증발 건조시켰다. 100μL 메탄올로 용해시킨 후 HPLC로 목적 생성물의 생산량을 검출하였다.
상기 획득된 각각의 재조합 사카로미세스 세레비시아 균주 프로토파낙사트리올은 표 5 및 도 1에 도시된 바와 같다.
본 발명에 언급된 모든 문헌은 모두 본 출원에 참조로 인용되었으며, 이는 각각의 문헌이 개별적으로 참조로 인용된 것과 같다. 또한, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있으며, 이러한 균등한 형태도 본 출원에 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 범위에 속함을 이해해야 한다.

Claims (14)

  1. 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 촉매 활성을 향상시키는 방법으로서,
    시토크롬 P450 CYP716A53v2의 아미노산 서열을 돌연변이시키는 단계를 포함하며, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2에 대응하여, 돌연변이는 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째로 이루어진 군의 부위 또는 이의 조합으로부터 선택되는, 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 촉매 활성을 향상시키는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    167번째 부위가 Val로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Asn으로 돌연변이되고, 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체로서,
    (a) 아미노산 서열이 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2에 대응하여, 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위 또는 부위 조합에 돌연변이가 발생한 단백질;
    (b) (a) 단백질의 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가에 의해 형성된 것이며, (a) 단백질 기능을 갖는 (a)로부터 유래된 단백질 ― 단, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째에 대응하는 아미노산은 (a) 단백질의 해당 위치에서 돌연변이된 아미노산과 동일함 ― ;
    (c) (a) 단백질의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지며 (a) 단백질의 기능을 갖는 (a)로부터 유래된 단백질 ― 단, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2의 167번째, 451번째, 117번째 및 208번째에 대응하는 아미노산은 (a) 단백질의 해당 위치에서 돌연변이된 아미노산과 동일함 ― ;
    (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드의 N 또는 C 말단에 태그 서열이 부가되거나, 이의 N 말단에 신호 펩티드 서열 또는 분비 신호 서열이 부가되어 형성된 폴리펩티드인, 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체.
  4. 제3항에 있어서,
    167번째 부위가 Val로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Asn으로 돌연변이되고, 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는, 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는, 야생형 시토크롬 P450 CYP716A53v2에 대응하여,
    (1) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
    (2) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되고, 167번째 부위가 Val로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
    (3) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되고;
    (4) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고, 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되고, 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
    (5) 167번째 부위가 Val로 돌연변이되고;
    (6) 451번째 부위가 Ala로 돌연변이되고;
    (7) 117번째 부위가 Ser로 돌연변이되고;
    (8) 208번째 부위가 Cys로 돌연변이되는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체.
  6. 분리된 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 핵산은 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체를 암호화한 것인 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 벡터로서,
    제6항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  8. 유전자 조작된 숙주 세포로서,
    제7항에 따른 벡터를 포함하거나, 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드가 게놈에 통합된 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이고; 비교적 바람직하게는, 상기 진핵 세포는 효모 세포, 식물 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 곰팡이 세포, 포유동물 세포를 포함하고; 보다 바람직하게는, 상기 효모 세포는 사카로미세스 세레비시아 세포 또는 피키아 파스토리스 세포를 포함하고; 보다 바람직하게는, 상기 식물 세포는 인삼 세포를 포함하고; 비교적 바람직하게는, 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
  10. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체의 제조 방법으로서,
    (i) 제8항의 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (ii) 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체를 포함하는 배양물을 수집하는 단계; 및
    (iii) 배양물로부터 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체를 분리하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  11. 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 데 사용되는 조성물로서,
    제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체; 또는, 제8항에 따른 숙주 세포 또는 이의 배양물 또는 용해물; 및
    식품학 또는 산업적으로 허용 가능한 담체를 유효량으로 함유하는, 조성물.
  12. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체 또는 제11항에 따른 조성물의 용도로서,
    프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 데 사용되고; 비교적 바람직하게는, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는 프로토파낙사디올의 C6 부위에 하나의 히드록시기를 부가하여, 프로토파낙사트리올을 생성하는, 용도.
  13. 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 방법으로서,
    상기 방법은, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체 또는 제11항에 따른 조성물을 이용하여 프로토파낙사디올을 처리하는 단계를 포함하고; 비교적 바람직하게는, 상기 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체는 프로토파낙사디올의 C6 부위에 하나의 히드록시기를 부가하여, 프로토파낙사트리올을 생성하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 프로토파낙사디올을 촉매하여 프로토파낙사트리올을 생성하는 데 사용되는 키트로서,
    제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 CYP716A53v2 돌연변이체 또는 돌연변이체의 조합;
    제8항에 따른 숙주 세포; 또는
    제11항에 따른 조성물을 포함하는, 키트.
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