CN118165972A - 氧化鲨烯环化酶NiOSC4和其编码产物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了氧化鲨烯环化酶NiOSC4和其编码产物达玛烯二醇‑Ⅱ的应用，属于合成生物学和天然药物技术领域。本发明从葫芦科植物棒锤瓜（Neoalsomitra integrifoliola）出发，克隆并功能鉴定了一个合成达玛烯二醇‑Ⅱ的三萜合酶NiOSC4编码基因，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示，对其进行基因克隆后与表达载体pYES2连接，构建成为能够在大肠杆菌中表达的重组质粒，再将重组质粒转化至酿酒酵母中构建成为工程细胞，实现了酿酒酵母异源高效合成化合物达玛烯二醇‑Ⅱ，本发明构建的该基因工程细胞安全稳定，生产周期短，显示出其在应用开发中的重大价值。本发明提供的NiOSC4产物达玛烯二醇‑Ⅱ可用于制备抗心脑血管疾病、内分泌系统疾病、中枢神经系统疾病、抗癌、抗糖尿病的药物。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学和天然药物技术领域。具体涉及氧化鲨烯环化酶NiOSC4和其编码产物达玛烯二醇-Ⅱ，与其产物作为在制备治疗心脑血管疾病、内分泌系统疾病、中枢神经系统疾病、抗癌、抗糖尿病的药物中的应用。
背景技术
人参皂苷(ginsenosides)是人参属植物的主要活性成分,在心脑血管系统、内分泌系统、中枢神经系统及抗癌和抗糖尿病等方面具有广泛的药理学活性。达玛烯二醇II是人参皂苷生物合成的关键前体物质，因而寻找合成达玛烯二醇调控基因对异源合成人参皂苷起到了至关重要的作用。
尽管人参属植物中已发现和分离了多达289种人参皂苷，但是特定人参属植物只有少数几种高含量的人参皂苷，且达玛烷型人参皂苷在人参属植物中含量低、难以提取。另外，人参属植物生长周期长、病虫害难防控、栽培难度大，品质与产量容易受外界环境影响，很难保证高品质人参皂苷持续供应，利用植物提取生产人参皂苷面临诸多困难。
因此，异源合成人参属(Panax L.)特有的、具有抗癌等活性的达玛烷型人参皂苷成为合成生物学研究的热点之一。葫芦科植物棒锤瓜(Neoalsomitra integrifoliola(Cogn.)Hutch.)中含有丰富的达玛烷型皂苷，是葫芦科植物中又一高含人参皂苷的新资源植物，其根状茎中达玛烷型三萜含量高达4％以上，因此十分有必要对棒锤瓜中参与达玛烷型人参皂苷(ginsenosides)合成的关键氧化鲨烯环化酶基因进行研究。
发明内容
本发明提供了氧化鲨烯环化酶基因NiOSC4及其编码产物，该基因是参与棒锤瓜三萜皂苷元合成的关键酶基因，可作为达玛烯二醇-Ⅱ的生物合成调控基因以及应用于制备达玛烯二醇-Ⅱ。从而提供了一种新的生物合成达玛烯二醇-Ⅱ的方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：
氧化鲨烯环化酶NiOSC4，其为：
(1)Seq ID No.1所示氨基酸序列构成的蛋白；
(2)Seq ID No.1所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
所述氧化鲨烯环化酶NiOSC4的编码基因，其为：
(a)Seq ID No.2所示的核苷酸序列；
(b)Seq ID No.2所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
含有所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4编码基因的重组载体。
含有所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4编码基因的重组菌。
所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在制备含有达玛烯二醇-Ⅱ的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌中的应用。
所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在制备含有化合物达玛烯二醇-Ⅱ的发酵液中的应用，其特征在于所述的应用是采用：构建含有编码所述基因的表达载体，将所述重组载体转化至酿酒酵母细胞中，将获得的基因工程酵母菌进行发酵培养，得到含有达玛烯二醇-Ⅱ的发酵液。
氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在合成或制备达玛烯二醇-Ⅱ中的应用。
所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在制备抗心脑血管疾病、治疗内分泌系统疾病、治疗中枢神经系统疾病、抗癌、抗糖尿病的药物中的应用。
化合物达玛烯二醇-Ⅱ的制备方法，该方法包括下述步骤：
构建含有编码氧化鲨烯环化酶NiOSC4的编码基因的表达载体，将所述重组载体转化至酿酒酵母菌中，将获得的基因工程酵母菌进行发酵培养，得到含有达玛烯二醇-Ⅱ的发酵液，通过石油醚或乙酸乙酯或二氯甲烷或三氯甲烷萃取后获得含有达玛烯二醇-Ⅱ的浸膏，经硅胶柱层析方法分离纯化，最终得到如下结构式所示的化合物达玛烯二醇-Ⅱ，
化合物达玛烯二醇-Ⅱ在制备抗心脑血管疾病、治疗内分泌系统疾病、治疗中枢神经系统疾病、抗癌、抗糖尿病的药物中的应用。
本发明提供的氧化鲨烯环化酶基因NiOSC4编码基因的开放阅读框(ORF)为2283bp(Seq ID No.2)，编码760个氨基酸(Seq ID No.1)。
本发明提供的氧化鲨烯环化酶NiOSC4的编码基因是从棒锤瓜中(Neoalsomitraintegrifoliola)中克隆获得的基因，其能够环化2,3-氧化鲨烯形成化合物达玛烯二醇-Ⅱ，达玛烯二醇-Ⅱ是达玛烷型皂苷的关键前体物质。NiOSC4是首次从该植物中克隆得到，氧化鲨烯环化酶NiOSC4及其编码基因的发现丰富了三萜合酶的多样性。
本发明从葫芦科植物棒锤瓜中克隆并功能鉴定了氧化鲨烯环化酶NiOSC4，并利用酿酒酵母菌生成达玛烯二醇-Ⅱ的应用。
本发明从葫芦科植物棒锤瓜(Neoalsomitra integrifoliola)出发，克隆并功能鉴定了一个合成达玛烯二醇-Ⅱ的氧化鲨烯环化酶NiOSC4的编码基因，其核苷酸序列如SeqID No.2所示，对其进行基因克隆后与表达载体pYES2连接，构建成为能够在大肠杆菌中表达的重组质粒，再将重组质粒转化至酿酒酵母中构建成为工程细胞，实现了酿酒酵母异源高效合成化合物达玛烯二醇-Ⅱ，本发明构建的该基因工程细胞安全稳定，生产周期短，显示出其在应用开发中的重大价值。本发明提供的NiOSC4产物达玛烯二醇-Ⅱ在制备抗心脑血管疾病、治疗内分泌系统疾病、治疗中枢神经系统疾病、抗癌、抗糖尿病的药物中的应用。
附图说明
图1为实施例1中氧化鲨烯环化酶NiOSC4的三维结构预测图。
图2为实施例2中氧化鲨烯环化酶NiOSC4在根、茎、叶、花中的表达量分析。
图3为实施例2中表达氧化鲨烯环化酶NiOSC4的工程酵母菌提取物的GC-MS分析的总理子图。
图4为实施例2中氧化鲨烯环化酶NiOSC4催化产物达玛烯二醇-Ⅱ对应的质谱图。
图5为实施例2中达玛烯二醇-Ⅱ标准品色谱图。
图6为实施例2中达玛烯二醇-Ⅱ标准品质谱图。
图7为实施例2中为重组表达质粒pYES2-NiOSC4的构建示意图。
具体实施方法
下面结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行操作。
实施例1
棒锤瓜中氧化鲨烯环化酶基因NiOSC4的克隆。
1.根据已测序的棒锤瓜转录组数据，通过拼接、注释、筛选等操作，获得棒锤瓜皂苷合成途径中的候选氧化鲨烯环化酶基因cDNA序列。
2.设计该候选氧化鲨烯环化酶基因的引物，引物序列为：
正向引物(NiOSC4-F)：
gggaatattaagcttggtaccATGTGGCGGATTAAGATTGCTGATG，Seq ID NO.3；
反向引物(NiOSC4-R)：
ccctctagatgcatgctcgagTCAAGTAGAAGGGAATTTGAGGAGTCTAC，Seq ID NO.4；
引物由北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司合成。
3.取棒锤瓜植株的各个组织(根、茎、叶和花)，使用TRIzol试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取总RNA，利用PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara，中国)进行逆转录获得cDNA，以cDNA为模板扩增NiOSC4的基因序列。
4.扩增产物琼脂糖凝胶电泳在2.3kb左右出现特异性条带，对目标条带进行切胶回收，胶回收产物连接到载体pYES2，并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行测序(北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司)，选择和保存序列正确的NiOSC4基因克隆用于后续表达载体的构建。
测序获得的棒锤瓜三萜皂苷合成代谢途径氧化鲨烯环化酶基因NiOSC4全长开放读码框(ORF)的长度为2283bp，核苷酸序列如ID NO.2；编码760个氨基酸，氨基酸序列如IDNO.1。
通过NiOSC4与已鉴定的OSCs进行多序列比对和系统进化树分析,可知NiOSC4有OSCs基因家族高度保守的结构域QW和DCTAE。
实施例2
NiOSC4基因真核表达及功能分析。
1.NiOSC4功能初步分析。
分别提取棒锤瓜根、茎、叶、花RNA，参照PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara，中国)反转录成cDNA，使用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)在AppliedBiosystems QuantStudioTM5平台(Life Technologies)上进行实时荧光定量PCR扩增。
正向引物(NiOSC4-qRT-F)：GCTGCTGATATGGCTGATGA，Seq ID NO.5；
反向引物(NiOSC4-qRT-R)：CATTTTCTCGCCCACAATCT，Seq ID NO.6。
根据实时荧光定量PCR分析结果(图2)可知，NiOSC4在根中表达量最高，推测NiOSC4可能参与棒锤瓜地下部分三萜皂苷的合成。
2.酵母表达载体的构建。
缺乏羊毛甾醇合酶基因的ERG7缺陷型酿酒酵母突变体GIL77能内源积累2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯可以作为底物进行NiOSC4的功能验证。
通过对基因NiOSC4的编码序列及酶切位点进行分析，设计如下带有KpnI和XhoI酶切位点的引物，进行NiOSC4全长ORF扩增。
扩增产物进行测序验证后通过同源重组的方法将目的基因NiOSC4连接到酵母表达载体pYES2上，利用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体平板筛选转化菌落，挑取单克隆进行验证，测序验证正确性，获得pYES2-NiOSC4载体，将验证正确的单克隆接种到5ml相同抗性的LB液体培养中，发酵培养，提取pYES2-NiOSC4质粒。
3.酵母转化。
利用醋酸锂转化法将pYES2-NiOSC4质粒转入酿酒酵母菌株GIL77中，并设置空载pYES2转化对照组。通过菌落PCR法挑选阳性克隆GIL77-pYES2-NiOSC4和GIL77-pYES2。
4.诱导表达与孵育。
分别挑取阳性的酵母单克隆GIL77-pYES2-NiOSC4和GIL77-pYES2接种于50ml不含尿嘧啶的合成完全培养基[SC-U；含麦角甾醇(20μg/ml)、吐温80(5mg/ml)和氯化血红素(13μg/ml)]中，然后并在30℃下以200rpm振荡培养2天。
收获酵母细胞，重悬于50mL含2％半乳糖的SC-U培养基中，在30℃下以200rpm振荡诱导2天。
诱导2天后，收获细胞并重悬于相同体积的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0；加入2％葡萄糖和氯化血红素(13μg/ml)中，并在30℃下以200rpm振荡孵育12小时。
5.催化产物的提取与鉴定。
孵育12小时后，将细胞用相同体积的皂化试剂(20％KOH/50％EtOH)在92℃回流10分钟，然后用相同体积的石油醚萃取两次，合并萃取液，将萃取液减压浓缩至干，残渣用200μl氰基三甲基硅烷于65℃下衍生30分钟。
将衍生后的产物进行GC-MS分析，含有NiOSC4基因重组表达载体pYES2-NiOSC4的催化组与含空载pYES2对照组相比出现特异峰，即有新物质产生，经鉴定特异性产物为达玛烯二醇-Ⅱ。
上述实验证明NiOSC4基因参与棒锤瓜三萜皂苷的生物合成，可利用NiOSC4基因进行棒锤瓜中达玛烯二醇-Ⅱ生物合成的调节，实现达玛烯二醇-Ⅱ的异源合成。
实施例3
化合物达玛烯二醇-Ⅱ的制备。
提取棒锤瓜的RNA，参照PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara，中国)反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增NiOSC4的基因序列，扩增产物琼脂糖凝胶电泳在2.3kb左右出现特异性条带，对目标条带进行切胶回收，胶回收产物连接到载体pYES2，并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行测序(北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司)，选择测序正确的NiOSC4基因，采用同源重组的方法将目的基因NiOSC4连接到酵母表达载体pYES2上，获得pYES2-NiOSC4载体，测序验证正确性。提取pYES2-NiOSC4质粒，采用醋酸锂方法将pYES2-NiOSC4质粒导入酿酒酵母GIL77菌株中，通过菌落PCR法挑选阳性克隆GIL77-pYES2-NiOSC4和GIL77-pYES2，将阳性的酵母单克隆GIL77-pYES2-NiOSC4接种于50ml不含尿嘧啶的合成完全培养基[SC-U；含麦角甾醇(20μg/ml)、吐温80(5mg/ml)和氯化血红素(13μg/ml)]中，然后在30℃下孵育2天。将50ml菌液接种至10L不含尿嘧啶的合成完全培养基[SC-U；含麦角甾醇(20μg/ml)、吐温80(5mg/ml)和氯化血红素(13μg/ml)]中，然后在30℃下以200rpm振荡培养2天，收获酵母细胞，将酵母细胞重悬于10L含2％半乳糖的SC-U培养基中，在30℃下以200rpm振荡诱导蛋白表达2天。诱导2天后，收获酵母细胞并重悬于相同体积的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0；加入2％葡萄糖和氯化血红素(13μg/ml)中，并在30℃下以200rpm振荡孵育12小时。孵育12小时后，将细胞用相同体积的皂化试剂(20％KOH/50％EtOH)在92℃回流10分钟，然后用相同体积的石油醚萃取3次，合并萃取液，将萃取液减压浓缩至干得到含达玛烯二醇-Ⅱ的提取物，称定重量，用1.5倍量的硅胶拌样，15倍量的硅胶进行柱层析，用石油醚：乙酸乙酯(10:1，v/v——5:1，v/v)梯度洗脱，每个梯度用6倍柱体积的洗脱液洗脱，收集馏分，薄层色谱检测，收集含达玛烯二醇-Ⅱ的馏分，减压浓缩至干，98再采用制备型高效液相色谱法进行分离，安捷伦Zorbax SB-C18色谱柱(9.4×250mm,5μm)，以乙腈(A)-水(B)为流动相，0-25min，85％A-85％A，运行25min，流速为8ml/min，检测波长203nm。通过制备液相制备得到达玛烯二醇-Ⅱ，核磁共振鉴定其结构。药物制剂实施例1-8：
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物达玛烯二醇-Ⅱ能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将化合物达玛烯二醇-Ⅱ，用无水乙醇溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5-5mg/mL。
2.将化合物达玛烯二醇-Ⅱ，用二甲基亚砜溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将化合物达玛烯二醇-Ⅱ，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将化合物达玛烯二醇-Ⅱ，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将化合物达玛烯二醇-Ⅱ，按常规口服液制备方法制成口服液。
6.将化合物达玛烯二醇-Ⅱ，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将化合物达玛烯二醇-Ⅱ，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
8.胶囊剂：化合物达玛烯二醇-Ⅱ20mg，乳糖180mg，硬脂酸镁5mg。
制备方法：将化合物与助溶剂混和均匀，过筛，把得到的混合物装入明胶胶囊,每个胶囊重205mg,活性成分含量为20mg。
本发明中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.氧化鲨烯环化酶NiOSC4，其特征在于其为：
(1)Seq ID No.1所示氨基酸序列构成的蛋白；
(2)Seq ID No.1所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
2.权利要求1所述氧化鲨烯环化酶NiOSC4的编码基因，其特征在于其为：
(a)Seq ID No.2所示的核苷酸序列；
(b)Seq ID No.2所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4编码基因的重组载体。
4.含有权利要求2所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4编码基因的重组菌。
5.权利要求1或2所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在制备含有达玛烯二醇-Ⅱ的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌中的应用。
6.权利要求1或2所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在制备含有化合物达玛烯二醇-Ⅱ的发酵液中的应用，其特征在于所述的应用是采用：构建含有编码所述基因的表达载体，将所述重组载体转化至酿酒酵母细胞中，将获得的基因工程酵母菌进行发酵培养，得到含有达玛烯二醇-Ⅱ的发酵液。
7.权利要求1或2所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在制备治疗心脑血管疾病、内分泌系统疾病、中枢神经系统疾病、抗癌、抗糖尿病的药物中的应用。
8.权利要求1或2所述的氧化鲨烯环化酶NiOSC4或其编码基因在合成或制备达玛烯二醇-Ⅱ中的应用。
9.化合物达玛烯二醇-Ⅱ的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
构建含有编码氧化鲨烯环化酶NiOSC4的编码基因的表达载体，将所述重组载体转化至酿酒酵母菌中，将获得的基因工程酵母菌进行发酵培养，得到含有达玛烯二醇-Ⅱ的发酵液，通过石油醚或乙酸乙酯或二氯甲烷或三氯甲烷萃取后获得含有达玛烯二醇-Ⅱ的浸膏，经硅胶柱层析方法分离纯化，最终得到如下结构式所示的化合物达玛烯二醇-Ⅱ，
10.权利要求9所述制备方法得到的化合物达玛烯二醇-Ⅱ在制备治疗心脑血管疾病、内分泌系统疾病、中枢神经系统疾病、抗癌、抗糖尿病的药物中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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