CN109207448A

CN109207448A - 新型黄酮异戊烯基转移酶及其应用

Info

Publication number: CN109207448A
Application number: CN201710521825.1A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 王瑛; 王平平; 严兴; 黄文俊
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS; South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS; Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2037-06-30
Also published as: CN109207448B

Abstract

本发明涉及一种新型黄酮异戊烯基转移酶及其应用。本发明揭示了一条新的异戊烯基转移酶的核苷酸候选序列，命名为ESNPT2。在提供异戊烯基供体的情况下以ESNPT2处理，可催化黄酮类化合物的C8位进行异戊烯基化修饰合成异戊烯基黄酮类化合物。

Description

新型黄酮异戊烯基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和天然产物药物等领域，更具体地，本发明涉及一种新型黄酮异戊烯基转移酶及其应用。

背景技术

淫羊藿(Herba epimedii)是我国使用最为悠久的中草药之一，最早记载于《神农本草经》，也是现在应用最为广泛的中草药之一(郭宝林，肖培根。中药淫羊藿主要种类评述。中国中药杂志，2003，8(4)：303-307)。淫羊藿药材主要来源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)中的几个物种的干燥叶片。淫羊藿属物种有50余种，绝大部分广泛分布于我国；其中被《中国药典》2010版收录的仅有5种，包含有淫羊藿(E.brevicornuMaxim)、朝鲜淫羊藿(E.koreanum Nakai)、箭叶淫羊藿(E.sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim)、柔毛淫羊藿(E.pubescens Maxim)、巫山淫羊藿(E.wushanense T.S.Ying)。淫羊藿不仅具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，而且还有抗衰老、抗肿瘤、改善免疫功能等功效(Ma H et al The genus Epimedium:An ethnopharmacological and phytochemicalreview.J Ethnopharmacol,2011,134(3):519-541)，因而也是最具开发潜力的中药材之一，受到国内外学者的高度重视。除此之外，淫羊藿植株的花和叶形态各异，颜色丰富多彩，具有较高的园林观赏价值(任璘，戴思兰，王瑛。淫羊藿属植物种质资源及其园林应用。武汉植物学研究，2008，26(6)：644-649)。

大量研究表明淫羊藿中主要活性成分为类黄酮化合物，特别是C8位置异戊烯修饰的黄酮醇苷类化合物即淫羊藿素及其糖基化修饰产物淫羊藿皂苷。淫羊藿属植物中分离鉴定了260余种化合物，其中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量占到总黄酮的一半左右。这四种主要活性成分与黄酮醇骨架在化学结构式上非常相似，它们的结构差异仅为糖基化修饰、甲基化修饰和异戊烯基修饰的不同。这些后修饰的不同极大的增加了淫羊藿黄酮的多样性，同时也使其生理活性和要用价值产生极大差异。

目前箭叶淫羊藿中淫羊藿苷的前体山奈酚的合成途径已经解析，但是其一系列下游的修饰酶还尚未进行分离及功能鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供异戊烯基转移酶及其应用。

在本发明的一个方面，提供分离的多肽，所述的多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的多肽序列有80％以上(较佳地85％以上，如90％，95％，98％，99％或更高)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

在一个优选例中，所述的序列(d)还包括：由(a)或(b)(c)中所述多肽序列添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自：

(A)编码所述多肽的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的同源性≥95％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌；较佳地，所述真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括酵母细胞和灵芝细胞；更佳地，所述的酵母包括：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在一个优选中，在表达后，破碎所述的宿主细胞，获得含有所述的多肽的微粒体；较佳地，所述的宿主细胞是灵芝、酵母酿酒、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

在本发明的另一方面，提供一种用于在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰的微粒体，所述的微粒体是所述的方法产生的微粒体。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰；或用于制备在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰的制剂；

在一个优选中，所述的异戊烯基通过碳碳单键连接到母核的C8位上。

在另一优选中，以含有异戊烯基的化合物作为异戊烯基供体；较佳地，所述的含有异戊烯基的化合物包括：二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)。

在另一优选例中，所述的式(I)母核结构的化合物上，还包括至少一个取代基，所述的取代基独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素；更佳地，所述的取代基独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基。

在另一优选例中，所述的式(I)母核结构的化合物上，包括至少一个羟基取代基；较佳地为1～2个羟基取代基。

在另一优选中，所述的式(I)母核结构的化合物是黄酮类化合物。

在另一优选中，所述的黄酮类化合物是淫羊藿的次级代谢产物。

在另一优选中，所述的式(I)母核结构的化合物是柚皮素，所述的式(II)母核结构的化合物是8-异戊烯基柚皮素；或

所述的式(I)母核结构的化合物是山奈酚，所述的式(II)母核结构的化合物是8-异戊烯基山奈酚；或

所述的式(I)母核结构的化合物是山奈素，所述的式(II)母核结构的化合物是淫羊藿素。

在本发明的另一方面，提供一种在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰的方法，所述方法包括：以所述的多肽处理式(I)母核结构的化合物，从而形成如式(II)母核结构的化合物；

在一个优选中，以含有异戊烯基的化合物作为异戊烯基供体；较佳地，所述的含有异戊烯基的化合物包括：二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)。

在另一优选中，所述的式(I)母核结构的化合物是淫羊藿的次级代谢产物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为异戊烯基转移酶ESNPT2的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为异戊烯基转移酶ESNPT2催化柚皮素反应产物的HPLC检测图。

图3为异戊烯基转移酶ESNPT2催化山奈酚反应产物的HPLC检测图。

图4为异戊烯基转移酶ESNPT2催化山奈素反应产物的HPLC检测图。

具体实施方式

本发明人通过对植物转录组数据进行拼接和分析，获得一条新的异戊烯基转移酶的核苷酸候选序列，本发明人将之命名为ESNPT2。在提供异戊烯基供体的情况下，以ESNPT2处理，可催化具有式(I)母核结构的化合物的C8位进行异戊烯基化修饰合成异戊烯基化合物，这类产物具有多种重要生理活性。

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

活性多肽、其编码基因、载体及宿主

本发明揭示了一种新的，在异戊烯基转移中发挥催化作用的酶，本发明人将之命名为ESNPT2。优选地，所述的ESNPT2是具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:2所示的多肽，还包括具有与所示多肽具有相同功能的SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的ESNPT2多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述ESNPT2的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码ESNPT2的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的ESNPT2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ESNPT2多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的ESNPT2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码ESNPT2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码ESNPT2的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ESNPT2的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。作为本发明的优选方式，所述原核宿主细胞包括(但不限于)大肠杆菌、枯草杆菌；较佳地，所述真核宿主细胞包括(但不限于)真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括(但不限于)酵母细胞和灵芝细胞；更佳地，所述的酵母包括但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，所述的重组多肽在宿主细胞中表达，在表达后，破碎细胞，获得含有ESNPT2多肽的微粒体。将所述的微粒体应用于酶反应。微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。ESNPT2多肽可存在于微粒体上。

应用

本发明的ESNPT2多肽，可应用于催化具有式(I)母核结构的化合物进行异戊烯基化修饰。如本发明的实施例中所论证的，所述的ESNPT2能特异和高效地催化具有式(I)母核结构的化合物的C8位进行异戊烯基化修饰，获得的经修饰的化合物(式(II)母核结构的化合物)具有多种重要生理活性。

上述母核结构式中，各环上还可以含有一些取代基，包括但不限于：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。进行常规的取代基添加或替换是本领域技术人员易于实现的。

上述母核结构中，虚线标示处表示含有化学键或不含有化学键。这是本领域人员常用的表示方法。

术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。

作为本发明的优选方式，所述的具有式(I)母核结构的化合物是黄酮类化合物。所述的黄酮类化合物例如一些淫羊藿的次级代谢产物。更具体地，例如包括但不限于：柚皮素，山奈酚，山奈素，他们依次可被修饰为8-异戊烯基柚皮素，8-异戊烯基山奈酚，淫羊藿素。

本发明还提供了应用所述的ESNPT2多肽或其衍生多肽催化具有式(I)母核结构的化合物的方法。在获得了本发明的ESNPT2后，本领域人员可以方便地应用它们来发挥异戊烯基转移酶的作用。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的ESNPT2多肽或其衍生多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、异戊烯基转移酶ESNPT2的克隆及其在酿酒酵母中表达

采用常规的方法，从淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim.)中提取的RNA。

合成如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的两条引物，以从淫羊藿中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板。

正向引物：ATGGTTTCTAGATGTGCTTCTCCGTCTTTC(SEQ ID NO:3)；

反向引物：TTAACCAATGAGTGGAATGAGTAAGTAC(SEQ ID NO:4)。

利用如上引物进行PCR，DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶。

PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。

在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的异戊烯基转移酶基因的DNA片段。

利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMDT载体，所构建的载体命名为PMDT-ESNPT2。经测序获得ESNPT2的基因序列。

ESNPT2基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码一个氨基酸的蛋白质ESNPT2，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸残基序列。

合成如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的两条引物：

正向引物：AGCGGGATCCATGGTTTCTAGATGTGCTTCTC(SEQ ID NO:5)；

反向引物：GCGCTCGAGTTAACCAATGAGTGGAATGAGTAA(SEQ ID NO:6)。

合成的引物两端分别加BamH I和Xho I两个酶切位点，以质粒PMDT-ESNPT2为模板，进行PCR扩增。PCR扩增程序同上。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后经BamH I和Xho I双酶切，利用NEB公司的T4NDA连接酶连入同样经BamH I和Xho I双酶切的PESC-HIS载体(安捷伦公司AgilentTechnologies)中。所获得的重组质粒命名为PESC-ESNPT2。

将重组质粒PESC-ESNPT2及空载体PESC-HIS，利用ZYMO Research公司的Frozen-EZ Yeast Transformation II转化试剂盒转化酿酒酵母BY4742(购自ZYMO Research公司)中构建重组酿酒酵母，获得重组酿酒酵母BY-ESNPT2和BY-HIS。

配制固体培养基：0.67％酵母氮源(无氨基酸)，2％葡萄糖，2％琼脂糖，0.01％亮氨酸，0.01％赖氨酸，0.01％尿嘧啶。

配制液体种子培养基：0.67％酵母氮源(无氨基酸)，2％葡糖糖，0.01％亮氨酸，0.01％赖氨酸，0.01％尿嘧啶。

配制液体诱导培养基：0.67％酵母氮源(无氨基酸)，2％半乳糖，0.01％亮氨酸，0.01％赖氨酸，0.01％尿嘧啶。

诱导培养方法：分别挑取在固体培养基平板上划线的酵母：BY-ESNPT2和BY-HIS，于含有5mL液体种子培养基的试管震荡培养过夜(30℃，250rpm，16h)；离心收集菌体，转移至含有50mL诱导培养基的的250mL三角瓶中，调OD600至0.05，30℃，250rpm震荡培养48h得到诱导菌体。将BY-ESNPT2和BY-HIS各50mL的发酵液离心收集菌体，加入3mL酵母裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl、1mM EDTA、1mM PMSF、5％甘油，pH 9.0)重悬后，用液氮低温研磨破碎酵母，通过超高速(100,000g)离心1h收集微粒体，作为酶用于催化反应。

实施例2、异戊烯基转移酶ESNPT2催化柚皮素反应

配制如下反应体系(100μL)：

在25℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于10μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图2。

从图2结果可以看出，含有异戊烯基转移酶ESNPT2的酿酒酵母微粒体BY-ESNPT2柚皮素(naringenin，NAR)形成一种新的产物，其在HPLC的保留时间与8-异戊烯基柚皮素(8-prenylaringenin，8PNAR)标准品一致，而对照组含有空载体PESC-HIS的酿酒酵母微粒体BY-HIS催化柚皮素则没有该产物生成。

结果表明，异戊烯基转移酶ESNPT2能催化黄酮类化合物柚皮素的C8位发生异戊烯基修饰，合成8-异戊烯基柚皮素。也即发生了如下所示的化学反应：

实施例3、异戊烯基转移酶ESNPT2催化山奈酚反应

配制如下反应体系(100μL)：

在25℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于10μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图3。

从图3结果可以看出，含有异戊烯基转移酶ESNPT2的酿酒酵母微粒体BY-ESNPT2山奈酚(kaempferol，KAE)形成一种新的产物，其在HPLC的保留时间与8-异戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol，8P KAE)标准品一致。而对照组含有空载体PESC-HIS的酿酒酵母微粒体BY-HIS催化山奈酚则没有该产物生成。

结果表明，异戊烯基转移酶ESNPT2能催化黄酮类化合物山奈酚的C8位发生异戊烯基修饰，合成8-异戊烯基山奈酚。也即发生了如下所示的化学反应：

实施例4、异戊烯基转移酶ESNPT2催化山奈素反应

配制如下反应体系(100μL)：

在25℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于10μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图4。

从图4结果可以看出，含有异戊烯基转移酶ESNPT2的酿酒酵母微粒体BY-ESNPT2山奈素(kaempferide，KDE)形成一种新的产物，其在HPLC的保留时间与淫羊藿素(icaritin，ICAR)标准品一致，而对照组含有空载体PESC-HIS的酿酒酵母微粒体BY-HIS催化山奈素则没有该产物生成。

结果表明，异戊烯基转移酶ESNPT2能催化黄酮类化合物山奈素的C8位发生异戊烯基修饰合成淫羊藿素。也即发生了如下所示的化学反应：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院;中国科学院华南植物园

<120> 新型黄酮异戊烯基转移酶及其应用

<130> 174274

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> 淫羊藿 (Epimedium brevicornu Maxim.)

<400> 1

atggtttcta gatgtgcttc tccgtctttc tccatcacca aatacactcc tcatcaaggt 60

tcacttttaa caagtctaaa acctttcagt tcccaaaaac caggaaccag aataccatac 120

aaattgcagc aaaatcagat ctattgtgcc ctaagaaaac attcacatac acccttcaca 180

catactcatg aaaaggagct actcttcaaa gacaagaacc caaccagaga aaacccatgc 240

ccttctgcaa caagttctga aaatgcacct tcaagttttt ccactaaatt agatatgttt 300

atcaagtttg ttcgtcccta tgcaaccatc ggcattattg ggaatacaat atgcatgtgc 360

atacttccag tgcaaacaat ggctgatctg tctccaaggt tttttattgg tgtagctcag 420

gcaatagcaa gcatggtgct tatgaatcta tttactgttg ccgtgaatca agtatatgac 480

gttgagctcg ataaggtaaa caagccatat ttacctcttg cttctggagg agtctctatg 540

acgagtgcta ctctatttac aatcttgaca gccgctctga gcattgcatt gggatacttt 600

tcatctccag cactgtttta cggatctatt gctttctttc tctctgcctc cgcatactct 660

gtcaatttcc ccttattgag atggaaaaac aatgcactgg gtgccattat aagtctcatg 720

ctttggggga tttcactaca aactggtgtc ttttttcaca ttcagcaata cgtgcttgga 780

aagcccatgg ttttaaaaaa ttcgttcatc tatgcaataa ttttccagtc cctattcagc 840

attgtcgtcg caacactcaa ggatttacct gatgtcgaag gcgacaaagc taacggctct 900

accaacttga ctatactaat cggtaaagaa aaagtatttt ggggttgcac tagtctcatg 960

ttggcgatat atattggtac agcagccttt ggggctactt taccgatcct gaagaacaag 1020

ctcgtcacta tggtagcgca cagtgcactt gccgtcttcc tttggcttca ggctaaacag 1080

attgatcttg caggtgatgc ctctacacaa tcttattact tgcttatgtg gaagctttgc 1140

aatatcgagt acttactcat tccactcatt ggttaa 1176

<210> 2

<211> 391

<212> PRT

<213> 淫羊藿 (Epimedium brevicornu Maxim.)

<400> 2

Met Val Ser Arg Cys Ala Ser Pro Ser Phe Ser Ile Thr Lys Tyr Thr

1 5 10 15

Pro His Gln Gly Ser Leu Leu Thr Ser Leu Lys Pro Phe Ser Ser Gln

20 25 30

Lys Pro Gly Thr Arg Ile Pro Tyr Lys Leu Gln Gln Asn Gln Ile Tyr

35 40 45

Cys Ala Leu Arg Lys His Ser His Thr Pro Phe Thr His Thr His Glu

50 55 60

Lys Glu Leu Leu Phe Lys Asp Lys Asn Pro Thr Arg Glu Asn Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ser Ala Thr Ser Ser Glu Asn Ala Pro Ser Ser Phe Ser Thr Lys

85 90 95

Leu Asp Met Phe Ile Lys Phe Val Arg Pro Tyr Ala Thr Ile Gly Ile

100 105 110

Ile Gly Asn Thr Ile Cys Met Cys Ile Leu Pro Val Gln Thr Met Ala

115 120 125

Asp Leu Ser Pro Arg Phe Phe Ile Gly Val Ala Gln Ala Ile Ala Ser

130 135 140

Met Val Leu Met Asn Leu Phe Thr Val Ala Val Asn Gln Val Tyr Asp

145 150 155 160

Val Glu Leu Asp Lys Val Asn Lys Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Gly

165 170 175

Gly Val Ser Met Thr Ser Ala Thr Leu Phe Thr Ile Leu Thr Ala Ala

180 185 190

Leu Ser Ile Ala Leu Gly Tyr Phe Ser Ser Pro Ala Leu Phe Tyr Gly

195 200 205

Ser Ile Ala Phe Phe Leu Ser Ala Ser Ala Tyr Ser Val Asn Phe Pro

210 215 220

Leu Leu Arg Trp Lys Asn Asn Ala Leu Gly Ala Ile Ile Ser Leu Met

225 230 235 240

Leu Trp Gly Ile Ser Leu Gln Thr Gly Val Phe Phe His Ile Gln Gln

245 250 255

Tyr Val Leu Gly Lys Pro Met Val Leu Lys Asn Ser Phe Ile Tyr Ala

260 265 270

Ile Ile Phe Gln Ser Leu Phe Ser Ile Val Val Ala Thr Leu Lys Asp

275 280 285

Leu Pro Asp Val Glu Gly Asp Lys Ala Asn Gly Ser Thr Asn Leu Thr

290 295 300

Ile Leu Ile Gly Lys Glu Lys Val Phe Trp Gly Cys Thr Ser Leu Met

305 310 315 320

Leu Ala Ile Tyr Ile Gly Thr Ala Ala Phe Gly Ala Thr Leu Pro Ile

325 330 335

Leu Lys Asn Lys Leu Val Thr Met Val Ala His Ser Ala Leu Ala Val

340 345 350

Phe Leu Trp Leu Gln Ala Lys Gln Ile Asp Leu Ala Gly Asp Ala Ser

355 360 365

Thr Gln Ser Tyr Tyr Leu Leu Met Trp Lys Leu Cys Asn Ile Glu Tyr

370 375 380

Leu Leu Ile Pro Leu Ile Gly

385 390

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

atggtttcta gatgtgcttc tccgtctttc 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

ttaaccaatg agtggaatga gtaagtac 28

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

agcgggatcc atggtttcta gatgtgcttc tc 32

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

gcgctcgagt taaccaatga gtggaatgag taa 33

Claims

1.分离的多肽，所述的多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的多肽序列有80％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

2.分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自：

(A)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.一种载体，所述的载体含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，它含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌；较佳地，所述真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括酵母细胞和灵芝细胞；更佳地，所述的酵母包括：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

6.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在表达后，破碎所述的宿主细胞，获得含有权利要求1所述的多肽的微粒体；较佳地，所述的宿主细胞是灵芝、酵母酿酒、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

8.一种用于在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰的微粒体，其特征在于，所述的微粒体是权利要求7所述的方法产生的微粒体。

9.权利要求1所述的多肽的用途，用于在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰；或用于制备在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰的制剂；

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的异戊烯基通过碳碳单键连接到母核的C8位上。

11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，以含有异戊烯基的化合物作为异戊烯基供体。

12.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的式(I)母核结构的化合物是黄酮类化合物。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的黄酮类化合物是淫羊藿的次级代谢产物。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的式(I)母核结构的化合物是柚皮素，所述的式(II)母核结构的化合物是8-异戊烯基柚皮素；或

15.一种在具有式(I)母核结构的化合物的C8位上进行异戊烯基修饰的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1所述的多肽处理式(I)母核结构的化合物，从而形成如式(II)母核结构的化合物；

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，以含有异戊烯基的化合物作为异戊烯基供体。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的式(I)母核结构的化合物是黄酮类化合物。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的式(I)母核结构的化合物是柚皮素，所述的式(II)母核结构的化合物是8-异戊烯基柚皮素；或