CN113817698B

CN113817698B - 一种朝鲜淫羊藿来源的黄酮8-异戊烯基转移酶及其应用

Info

Publication number: CN113817698B
Application number: CN202111098375.2A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 余世琴; 陈坚; 曾伟主; 高松
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN113817698A

Abstract

本发明公开了一种朝鲜淫羊藿来源的黄酮8‑异戊烯基转移酶及其应用，属于基因和代谢工程领域。本发明筛选获得了朝鲜淫羊藿来源的EkF8DT3，并构建了表达该酶的重组酿酒酵母。该重组酿酒酵母具有催化山奈酚合成8‑异戊烯基山奈酚的能力，在250mL摇瓶进行发酵，外源添加200mg/L的山奈酚，可以获得118.3mg/L的8‑异戊烯基山奈酚，较已报道的EsPT2增产356.8％，对于推动高产淫羊藿素在工业中的应用具有重要意义。

Description

一种朝鲜淫羊藿来源的黄酮8-异戊烯基转移酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种朝鲜淫羊藿来源的黄酮8-异戊烯基转移酶及其应用，属于基因和代谢工程领域。

背景技术

淫羊藿素是中药淫羊藿的主要药用成分之一，属于高附加值黄酮类化合物。淫羊藿素的合成需要一个重要的基因：异戊烯基转移酶(prenyltransferase，PT)的催化才能合成。但是近十年来仅有9个异戊烯基转移酶被报道。2008年，Sasaki等克隆表达了第一个植物苦参(Sophora flavescens)来源的黄酮异戊烯基转移酶SfN8DT。此后，Akashi等克隆得到了催化大豆抗毒素4位异戊烯基化的GmG4DT26，Sasaki等得到的SfG6DT和Shen等得到的LaPT1分别作用于染料木素的6位和3′位，Karamat等获得的PcPT催化7-羟基香豆素发生6位和8位异戊烯基化。然而，除SfN8DT外，上述获得的异戊烯基转移酶，催化底物仅为异黄酮或者香豆素，无法特异性的催化黄酮母核柚皮素的异戊烯基化。最近报道了一个来源于箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)的异戊烯基转移酶EsPT2可以催化山奈酚获得8-异戊烯基山奈酚，但是产量仅25.9mg/L。因此。对新型、高效且特异性催化黄酮8位异戊烯化的异戊烯基转移酶对微生物法合成高附加值淫羊藿素具有重要意义。

异戊烯基转移酶广泛存在于生物界，参与6万种以上天然产物的合成。植物是巨大的异戊烯基转移酶基因库。其中朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)作为淫羊藿的道地药材，药用价值高，对其相关异戊烯基转移酶的研究具有重要的学术和经济意义。

发明内容

本发明提供了朝鲜淫羊藿来源的潜在黄酮8-异戊烯基转移酶(Flavonoid8-Dimethylallyltransferase,F8DT)，为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黄酮8-异戊烯基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了编码所述黄酮8-异戊烯基转移酶的基因。

在一种实施方式中，所述基因具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体携带SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明提供一种含有所述基因或表达所述8-异戊烯基转移酶的微生物细胞。

本发明还提供了含有所述基因或所述表达载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞的基因组上整合了SEQ ID NO.8所示的基因。

在一种实施方式中，所述微生物细胞中含有携带所述基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为酿酒酵母菌株C800(CEN.PK2-1D；MATα；ura3-52；leu2-3,112；trp1-289；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2；gal80::KanMX)(公开于论文Gao,S.；Zhou,H.；Zhou,J.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization forefficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomycescerevisiae[J].J Agric Food Chem 2020,68(25),6884-6891.)。

在一种实施方式中，所述重组质粒为pY26-PGAL7-EGFP(公开于论文Gao,S.；Xu,X.Y.；Zeng,W.Z.,et al.,Efficient biosynthesis of(2S)-eriodictyol from(2S)-naringenin in Saccharomyces cerevisiae through a combination of promoteradjustment and directed evolution[J].ACS Synth Biol 2020,9(12),3288-3297.)。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是以酿酒酵母菌株C800为宿主，表达SEQID NO.3所示的8-异戊烯基转移酶或含有连接了SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。

本发明提供了构建所述重组微生物细胞的方法，所述方法是将SEQ ID NO.3所示的基因连接至pY26-PGAL7-EGFP中EGFP基因所在位置，替换EGFP基因，再将重组质粒转入酿酒酵母C800中，构建得到重组酿酒酵母。

在一种实施方式中，所述表达载体是将SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列连接至常用质粒pET28a(+)中BamHI和HindIII之间的位置，再将重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到重组大肠杆菌。

本发明还提供了一种产EkF8DT3酶的方法，是将所述大肠杆菌接种至TB培养基中，于35～40℃培养至OD600为0.04～0.06，加入终浓度为0.01～1mM的IPTG，于28～30℃诱导表达至少8h。

本发明还提供一种生产8-异戊烯基山奈酚的方法，是将所述重组酿酒酵母接种至含山奈酚的培养基中，将山奈酚转化为8-异戊烯基山奈酚。

在一种实施方式中，所述方法是将所述重组酿酒酵母接种至培养基中培养，并在接种后每10～14h加入底物山奈酚，培养至少72h。

在一种实施方式中，所述方法是将每0.6mg的EkF8NDT3酶添加到含172.6μM山奈酚的反应体系中，30℃反应至少1h。

本发明还提供所述重组酿酒酵母在制备微生物细胞催化剂方面的应用。

本发明还提供所述重组酿酒酵母在生产含8-异戊烯基山奈酚的医用营养品或药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明筛选和验证的8-异戊烯基转移酶及EkF8DT3基因，较已报道的EsPT2，在酿酒酵母中表达，可以合成更多的8-异戊烯基山奈酚。在250mL摇瓶进行发酵，外源添加200mg/L的山奈酚，可以获得118.3mg/L的8-异戊烯基山奈酚，较已报道的在酿酒酵母中最高产量25.9mg/L，增产356.8％。高产8-异戊烯基山奈酚菌株的获得对于推动高产淫羊藿素在工业中的应用具有重要意义。

附图说明

图1为山奈酚经过EkF8DT3催化产8-异戊烯基山奈酚示意图。

图2为验证EkF8DT3催化能力的高效液相结果；山奈酚标准品的出峰时间为16.376min，8-异戊烯基山奈酚标准品的出峰时间为22.544min。

图3为验证EkF8DT3催化能力的液相-质谱联用结果。A1：山奈酚标准品和8-异戊烯基山奈酚标准品在液质-质谱联用中液相结果；山奈酚标准品和8-异戊烯基山奈酚标准品的出峰时间分别为8.70min和10.03min；A2：山奈酚标准品的质谱结果，山奈酚在负离子模式下出现285.0336的离子峰；A3：8-异戊烯基山奈酚标准品的质谱结果，8-异戊烯基山奈酚在负离子模式下出现353.0894的离子峰；B1：实施例3表达EkF8DT3的酿酒酵母发酵液在液相-质谱联用中的液相结果，在对应时间有山奈酚和8-异戊烯基山奈酚目标峰；B2：实施例3表达EkF8DT3的酿酒酵母发酵液中的底物山奈酚在质谱的检测结果，可以看到对应离子峰出现，与标准品山奈酚一致；B3：实施例3表达EkF8DT3的酿酒酵母发酵液中8-异戊烯基山奈酚的质谱检测结果，可以看到对应离子峰出现，与标准品8-异戊烯基山奈酚一致。

图4为EkF8DT3的酶促反应动力学曲线。

具体实施方式

YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。

YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。

TB培养基：24g/L酵母粉、12g/L蛋白胨、4mL/L甘油。

固体培养基中添加20g/L的琼脂粉。

缓冲液A：20mM K₂HPO₄，20mM KH₂PO₄，50mM NaCl，pH 7.4。

缓冲液B：20mM K₂HPO₄，20mM KH₂PO₄，50mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4。

PBS缓冲液：160mL的20mM NaH₂PO4与840mL的20mM Na₂HPO₄混合(pH 7.5)。

山奈酚、8-异戊烯基山奈酚的检测方法：

样品使用岛津高效液相检测(Prominence LC-20A instrument)，C18反相色谱柱(4.6mm×250mm,Thermo)，柱温25℃。流动相为乙腈(A)：水(B)，并添加1‰的三氟乙酸。流速1mL/min，进样量10μL，检测波长为350nm。流动相条件为0-10min(B:10-40％)，10-30min(B:40-80％)，30-35min(B:80％)，35-37min(B:80-10％)，37-40min(B:10％)。山奈酚标样出峰时间为16.376min，8-异戊烯基山奈酚出峰时间为22.544min。

8-异戊烯基转移酶的酶活测定方法：

取600μL酶液于1.5mL离心管中，依次加入200μL溶于PBS中且浓度为5mM的二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)、200μL溶于PBS中且浓度为1mM的山奈酚(94.7U/g)。使用移液器充分混匀后置于30℃水浴锅孵育1h后取出。吸取500μL反应液与500μL的乙酸乙酯混合，充分震荡混匀后，14000rpm离心5min，取上层乙酸乙酯过0.22μm尼龙膜后使用高效液相色谱检测产物8-异戊烯基山奈酚的生成。

定义在pH7.5的PBS缓冲液，30℃条件下，每分钟催化1μmol的底物山奈酚转化为产物8-异戊烯基山奈酚所需的酶量为1个酶活单位(1U)。

实施例1：EkF8DT基因的筛选

以已知功能的SfN8DT(Sophora flavescens，NCBI蛋白质登录号GI(Geninfoidentifier)：GI:169658914)的氨基酸序列为模板，通过tBLASTn(Lv,Y.et al.,Spatialorganization of silybin biosynthesis in milk thistle[Silybum marianum(L.)Gaertn].2017,Plant J 92(6),995–1004)，从淫羊藿RNA-seq数据库中预测到5条潜在的同源基因，依次对应c213652、c203632、c218750、c198229和c203562，分别被命名为EkF8DT1、EkF8DT2、EkF8DT3、EkF8DT4和EkF8DT5，原始核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中所示，分别对序列进行优化后获得SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15中所示。

本发明中tBLASTn的预测序列及评分见表1，预测的序列在朝鲜淫羊藿不同组织中的分布见表2，菌株和质粒的基因型见表3。

表1tBLASTn预测序列及评分

*:SfN8DT作为tBLASTn的模板

表2预测的序列在朝鲜淫羊藿不同组织中的分布^*

*:其中的数字代表RNA-Seq结果中各个基因的FPKM值(Fragments Per Kilobaseof exon model per Million mapped fragments，即每千个碱基的转录在每百万映射读取的数值)，用于表征特定基因的丰度，数值越大，表示基因的丰度越高。

表3菌株和质粒的基因型

实施例2：表达朝鲜淫羊藿F8NDT的重组菌株的构建

(1)重组质粒的构建

将合成的如SEQ ID NO.6～10所示基因分别整合在pY26-PGAL7-EGFP中，将SEQ IDNO.6～10所示基因分别完全取代EGFP的DNA序列，并使用强启动子P_GAL7起始转录，依次获得重组质粒pY26-EkN8DT1、pY26-EkN8DT2、pY26-EkN8DT3、pY26-EkN8DT4和pY26-EkN8DT5。

将合成的基因SEQ ID NO.8所示基因分别整合在pET28a(+)的BamHI/HindIII位置处，获得质粒pET28-EkF8DT3。

(2)重组酿酒酵母和重组大肠杆菌的构建

通过酿酒酵母的高效转化方法，将步骤(1)构建的重组质粒pY26-EkN8DT1、pY26-EkN8DT2、pY26-EkN8DT3、pY26-EkN8DT4和pY26-EkN8DT5分别转化到酿酒酵母菌株C800中，将转化液涂布在YNB固体平板上，30℃培养3-5天直至长出单菌落，即为重组菌。依次将重组菌命名为C800FT1、C800FT2、C800FT3、C800FT4和C800FT5。

通过大肠杆菌的化学转化方法，将步骤(1)中构建的重组质粒pET28-EkF8DT3转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌EFT3。

实施例3：表达朝鲜淫羊藿F8NDT的重组酿酒酵母菌株生产淫羊藿素

将实施例2构建的重组酿酒酵母菌株用于发酵验证，以柚皮素、二氢山奈酚、芹菜素、山奈酚和山奈素等5种化合物为底物添加到发酵液中，检测有无底物消耗和新物质生成。

分别将菌株C800NT1、C800NT2、C800NT3、C800NT4和C800NT5在250mL摇瓶中发酵，具体步骤为：挑取至少10个单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基。将种子培养基以2％(V/V)转接到含有20mL新鲜YPD液体培养基的250mL摇瓶中，在第12、24、36和48h时，分别向培养基中添加50mg/L的山奈酚，累计共添加200mg/L的山奈酚，30℃，220rpm培养72小时后结束发酵。

取500μL的发酵液于2mL的破碎管中，13500rpm离心5min，去上清液。将菌体沉淀添加0.5mm玻璃珠和500μL的乙酸乙酯，使用MP震荡破碎仪破碎细胞，按照推荐程序震荡8-10个循环，每个循环40s。将破碎液13500rpm离心5min后，使用尼龙膜过滤后备用检测。结果显示，重组酿酒酵母菌株经过72h发酵后(此时菌体OD₆₀₀约为80)，可以催化200mg/L的山奈酚，获得118.3mg/L的8-异戊烯基山奈酚，转化率为47.8％。

实施例4：EkF8NDT酶学性质检测

将实施例2构建的重组大肠菌株EFT3单菌落接种在含有25mL LB培养基的250mL摇瓶中，培养基中添加终浓度为50g/mL的卡那霉素，37℃，220rpm培养10-12h后，按照起始OD₆₀₀＝0.01转接到含有50mL新鲜TB培养基的250mL摇瓶中，培养基中添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，37℃，220rpm培养3-4h后，待OD₆₀₀达到2-3之间时，添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，同时将温度降低为30℃。诱导表达8h后，将发酵液于4℃，5000rpm离心10min后去除上清液，沉淀使用50mL PBS缓冲液重悬2次后，4℃，5000rpm离心10min去除上清液。沉淀使用50mL的PBS重悬后加入已经预冷到4℃的高压均质机中。将高压均质机调节为850bar，开机并破碎2次后收集裂解液。裂解液4℃，14000rpm离心10min保留上清液。上清液过0.45μm的滤膜备用。过滤液即为粗酶液。

使用亲和层析法回收带有His标签的EkF8DT3蛋白质。使用缓冲液A平衡1mL镍柱，然后以1mL/min流速上粗酶液，以1mL/min流速冲洗10个镍柱体积的缓冲液A，随后以1mL/min流速使用缓冲液B冲洗镍柱，根据UV值收集洗脱峰。将收集到的洗脱峰使用脱盐柱(Hitrap Desalting,5mL)进行脱盐处理，用pH 7.5的PBS以5mL/min的流速洗脱回收目标蛋白。使用NanoDrop对回收的目标蛋白进行定量，并用pH 7.5的PBS稀释到1mg/mL置于4℃冰上备用。

经过检测600μL粗酶液的酶活约5.4U，8-异戊烯基山奈酚的浓度为61.2mg/L(172.6μM)，转化率为86.3％。体外催化酶促反应进一步验证了EkF8DT3的催化底物为山奈酚，产物为8-异戊烯基山奈酚。经检测，EkF8DT3的Vmax、Km、kcat和Kcat/Km依次为9.04μM/(min·mg)、177.09μmol/L、6.48/s和0.0366μmol/(L·s)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种朝鲜淫羊藿来源的黄酮8-异戊烯基转移酶及其应用

<130> BAA210494A

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 407

<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

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Met Asp Ser Leu Leu Leu Leu Gly Ser Val Ser Lys Pro Cys Trp Arg

1 5 10 15

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Ser Ile Leu Ser Val Ser Leu Leu Ala Ile Glu Arg Leu Ser Asp Leu

130 135 140

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145 150 155 160

Phe Met Asn Ile Tyr Ile Val Gly Leu Asn Gln Leu Phe Asp Val Glu

165 170 175

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Phe Trp Leu Gly Trp Phe Val Gly Ser Gly Pro Leu Leu Trp Ala Leu

210 215 220

Ser Ile Ser Phe Ile Leu Gly Thr Ala Tyr Ser Ile Asn Leu Pro Leu

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Leu Arg Trp Lys Arg Phe Ala Leu Val Ala Ala Met Cys Ile Leu Val

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 3

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<211> 394

<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 4

Met Asp Leu Arg Ser Leu Tyr Ser Pro Cys Ser Ala Thr Ser Val Leu

1 5 10 15

Thr Pro His His Gln Lys Ile Leu Thr Ala Lys Pro Thr Val Gln Ser

20 25 30

Ser Lys Ile Ser Phe Lys Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Thr Thr

35 40 45

Ile Gly Ile Ser His Ser His Asn Ile Lys Ser Ala Pro Val Lys His

50 55 60

Thr Lys Arg Leu Ser Ile Leu Ala Cys Ser Pro Ile Asp Tyr Ala Ala

65 70 75 80

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Pro Leu Leu Val Lys Leu Ser

85 90 95

Glu Phe Arg Asp Ala Ser Trp Arg Phe Leu Arg Pro His Thr Ile Arg

100 105 110

Gly Thr Ala Leu Gly Ser Cys Ala Leu Val Ala Arg Ala Leu Val Glu

115 120 125

Asn Thr His Leu Ile Arg Trp Ser Leu Leu Leu Lys Ala Leu Ser Gly

130 135 140

Val Phe Ala Leu Ile Cys Gly Asn Gly Tyr Ile Val Gly Ile Asn Gln

145 150 155 160

Ile Tyr Asp Ile Gly Ile Asp Lys Val Asn Lys Pro Tyr Leu Pro Ile

165 170 175

Ala Ala Gly Asp Leu Ser Val Gln Ser Ala Trp Tyr Leu Val Val Phe

180 185 190

Phe Ala Val Ala Gly Leu Leu Ile Val Ser Phe Asn Phe Gly Thr Phe

195 200 205

Ile Thr Ser Leu Tyr Cys Leu Gly Leu Phe Leu Gly Thr Val Tyr Ser

210 215 220

Val Pro Pro Phe Arg Met Lys Lys Tyr Pro Val Ala Ala Phe Leu Ile

225 230 235 240

Ile Ala Thr Val Arg Gly Phe Leu Leu Asn Phe Gly Val Tyr His Ala

245 250 255

Thr Arg Ala Ala Leu Gly Leu Thr Phe Glu Trp Ser Ser Pro Val Ala

260 265 270

Phe Ile Thr Thr Phe Val Thr Met Phe Ala Leu Val Ile Ala Ile Thr

275 280 285

Lys Asp Leu Pro Asp Val Glu Gly Asp Arg Lys Phe Gln Ile Ser Thr

290 295 300

Leu Ala Thr Thr Leu Gly Val Arg Asn Ile Ala Leu Leu Gly Ser Gly

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ala Asn Tyr Leu Gly Ala Ile Phe Ala Ala Val Tyr Met

325 330 335

Pro Gln Ala Phe Arg Ser Ser Leu Met Ile Pro Val His Ala Ile Leu

340 345 350

Leu Leu Ser Leu Ile Phe Gln Ala Trp Ile Leu Glu Arg Ala Asn Tyr

355 360 365

Thr Lys Glu Ala Ile Leu Ala Phe Tyr Arg Phe Ile Trp Asn Leu Phe

370 375 380

Tyr Ala Glu Tyr Ile Val Phe Pro Phe Ile

385 390

<210> 5

<211> 369

<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 5

Met Ala Thr Leu Leu Asn Thr Leu Ser Leu Ser Ser Ala Lys Leu Thr

1 5 10 15

Asn Arg Arg Thr Gln Ser His Gln Pro Ser Ser Phe Phe Phe Leu Pro

20 25 30

Val Ser Thr Pro Ser Phe Thr Arg Arg Ile Leu Val Val Arg Ala Ala

35 40 45

Glu Thr Asp Thr Asn Glu Val Lys Pro Ser Ser Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Gln Leu Leu Gly Ile Lys Gly Ala Ser Gln Glu Thr Asn Lys Trp Lys

65 70 75 80

Ile Arg Leu Gln Leu Met Lys Pro Val Thr Trp Pro Pro Leu Val Trp

85 90 95

Gly Val Val Cys Gly Ala Ala Ala Ser Gly Asn Phe His Trp Asn Val

100 105 110

Glu Asp Val Gly Lys Ser Ile Leu Cys Met Ile Met Ser Gly Pro Cys

115 120 125

Leu Thr Gly Tyr Thr Gln Thr Leu Asn Asp Trp Tyr Asp Arg Glu Ile

130 135 140

Asp Ala Ile Asn Glu Pro Tyr Arg Pro Ile Pro Ser Gly Ala Val Ser

145 150 155 160

Glu Asn Glu Val Thr Thr Gln Ile Trp Val Leu Leu Leu Gly Gly Leu

165 170 175

Gly Leu Ala Gly Leu Leu Asp Val Leu Ala Gly His Asn Phe Pro Ile

180 185 190

Val Phe Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Ser Leu Leu Ser Tyr Ile Tyr Ser

195 200 205

Ala Pro Pro Leu Lys Leu Lys Gln Phe Gly Trp Val Gly Asn Phe Ala

210 215 220

Leu Gly Ala Ser Tyr Ile Ser Leu Pro Trp Trp Ala Gly Gln Ala Leu

225 230 235 240

Phe Gly Thr Leu Thr Pro Asp Val Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Ser

245 250 255

Ile Ala Gly Leu Gly Ile Ala Ile Ile Asn Asp Phe Lys Ser Ile Glu

260 265 270

Gly Asp Arg Ala Leu Gly Leu Gln Ser Leu Pro Val Ala Phe Gly Val

275 280 285

Asp Thr Ala Lys Trp Ile Cys Val Gly Ala Ile Asp Ile Thr Gln Leu

290 295 300

Ser Ile Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Val Gly Lys Gln Tyr Tyr Gly Leu

305 310 315 320

Ala Leu Leu Gly Leu Ile Ile Pro Gln Val Ile Phe Gln Phe Gln Tyr

325 330 335

Phe Leu Lys Asp Pro Ile Lys Tyr Asp Val Lys Tyr Gln Ala Ser Ala

340 345 350

Gln Pro Phe Leu Val Leu Gly Ile Leu Val Thr Ala Leu Ala Thr Ser

355 360 365

His

<210> 6

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggattcct tgttgttgtt gggttctgtt tctaagccat gttggagatt gtctttctct 60

gcttctgcta aattgtctac tgctactaga ggttaccatg ttcctattag attcgctaac 120

tcttccgctt ggtccactca agaaagaaga tacttcggtc aattgcaagg tcatttgatt 180

aatcatcata tcaccattga tgctgaaaaa tcttcttttt acagaagggc tgataagaag 240

ggtttagtta acgctacttc tgaacctcca tttgcttctg aaccagaatc atataaccca 300

aataactttt ggagatctat gcaatcagct actgatgcct tctatagatt ttctagacca 360

cacactgtta ttggtactgc tttgtctatt ttgtctgtct ctttattagc aattgaaaga 420

ttatctgatc tatcaccatt gttcttcact ggtttgctag aagctatcgt cgctgccttg 480

tttatgaata tctacatcgt tggtttgaac caattattcg acgttgaaat cgataaagtt 540

aataagccat acttgccatt agctagtggt gaatattcca ttggtactgg tattttgatc 600

gttgctgctt ttgctgttat gagtttctgg ttgggttggt ttgttggttc aggtccttta 660

ctttgggctt tatccatctc ttttatcttg ggtactgctt attctattaa tttgccattg 720

ttaagatgga aaagatttgc cttagttgct gctatgtgta tcttagttgt tagagctgtt 780

attgttcaat tagctttctt tttgcatatt caaactttcg tttaccgtag accagctatt 840

ttaactagac cattaatttt cgctactgcc ttcatgtcat tcttctctgt cgttattgct 900

ttgtttaaag atattccaga tattgaaggt gacgctattt tcgggattag atctttcact 960

gttagattgg gtcaaaagag agttttctgg atctgtgtct acctattgga aatggcttac 1020

ggtgttgctg ttttagtcgg tgcagcttct ccatctccat ggtctaagtt ggttaccgtt 1080

ttaggtcatg ttgttttggc ttccatttta tggttgaatg ctaagtccgt tgatttgact 1140

aacaaaactg ctattacttc tttctacatg ttcatttgga agttgttcta cgctgaatat 1200

ttgttgattc cattggttag ataa 1224

<210> 7

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggtatcat ccttcagctt tccttctttt gcagttacca agtacacccc tcaacaaggt 60

tttttactac gtaaattgag accattcagt agtcaacgta gagatgctga tattgctttg 120

ttgtttaaag ttcaaaccga aaataagatt ttcagtgcgc taaaaagttc agatccacaa 180

agtagttaca atttggataa gccattgtta aggcatactt ctagtatcag aaagctgtct 240

ccacctgcag ccactacgtc tgaacatgaa aatgtacctt tgagtagctt gtctaaagcc 300

attgacattt tttttagatt tataagaccc tatgcgatag tatgcacaat gtttggaata 360

atgagcgtta gcttattacc agttgaaacc ctggctgact taacaccgaa attttttctt 420

ggattaggta aggccatgat tgcagtggtc tcaatgaact tattctctgt cagtgttaac 480

caattttatg acgttgaatt agataaagta aacaaacctt atttgccctt agcatccggt 540

gagttgtcaa tggaagcggg tgctgcattt gttatcttgg cttcttcaat gggtatcagc 600

tttggtttga tgctacaatc accaccttta ttgtgtacga ttttaacatt ctttctattc 660

ggaggagctt atagtattga tttaccgttc ttgagatgga aaaaacatcc tgttttggcc 720

gtagtatgca ttactgcgat gagaggttta gctctgcagc tgggggtctt cttccatatc 780

caaaaatatg tattaggaaa gcctatggct ctaactcgta gtgtggtgtt cgtcaccatt 840

ttcatgtgtg tcttcaacat cgctatttca ttaattaaag atttaccgga tgttgatggt 900

gacaaggcac acggcttcca gaatatgacc attagattcg gaaaagaaaa agtgttttgg 960

gggtgcacct ctttaatgtt agccacatat ggtgctgcag tggcaatggg tttctcctct 1020

ccttttcttg ctactaaact tataactgtg atagcccata gcgcactagg gctatttgtg 1080

ttacttagag cgagaagcat aaaactagac gacgacgaat caacacaatc ttactactta 1140

cttttgtggg atctgtgcaa gattgaatac ttgttagcac catttgttag ataa 1194

<210> 8

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggttagta gatgtgcttc tccatctttt tctattacta aatatactcc acatcaaggt 60

agtttattaa cttctttaaa accttttagt tctcaaaaac caggtgctag aattgaatat 120

aaattacaac aaaatcatat attttgtgct ttaagaaaag attctcatgc ttctttgact 180

catacacatg aaaatgaatt gttgtttaaa gataaatctc caactagaga aaaaggtaga 240

ttgtcagcta ctagttctga aaatgctcca tcatcttttt ctactaaatt agatatgttt 300

attaagtttg ttagaccata tgctactatt ggaattattg gtaatactat ttgtatgtgt 360

attttaccag ttcaaactat ggctgatttg tctcctagat tctttattgg tgttgctcaa 420

gctattgcat ctatggtttt gatgaatttg tttaatgttg ctgttaatca agtttatgat 480

gttgaattag ataaagtaaa caaaccatat ttgcctttag cttcaggtgg tgtttctatg 540

acttctgcta ctttgtttac aattttaaca gctgctttat caattgcttt aggttatttt 600

tcttctccag cattatttta tggtagtata gctttctttt tatctgcttc agcttacagt 660

gttaattttc cattgttgag atggaaacat aatgctttag gtgcaattat ttctttaatg 720

ttatggggta tttcattgca aactggtgtt ttctttcata ttcaacaata tgttttaggt 780

aaaccaatgg ttttaaaaaa ttctttcata tatgcaatta tttttcaatc attgttttct 840

attgttgttg ctactttaaa ggatttgcca gatgttgaag gagatcaagc taatggttct 900

acaaacttaa caattttgat tggtaaagaa aaagttttct ggggttgtac ttcattgatg 960

ttggctacat atattggtac tgctgctttt ggtgctactt tacctatttt gaaaaataag 1020

ttggttacaa tggttgcaca ttctgcattg gcagtatttt tgtggttaca agctaaacaa 1080

atagatttgg ctgatgatgc ttctactcaa tcttattact tgttgatgtg gaaattgtgt 1140

aatattgaat atttgttgat tccattcgtt ggttaa 1176

<210> 9

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggatttga gatccttgta ctctccatgt tctgctacat ctgttttgac tccacatcat 60

caaaaaattt tgactgctaa gccaactgtt caatcttcta aaatttcttt caagttctct 120

tcatcttctt cttccttaac tactattggt atttcccatt ctcataacat taagtctgcc 180

ccagtcaagc acactaagag attgtcaatt ttggcttgtt ctccaattga ctatgctgct 240

ggttctggtt ccggatctgg ttctgatcca ttattagtta aattgtcaga attccgtgac 300

gcttcctgga gattcttgag accacatact atcagaggta cagctttggg ttcttgtgct 360

ttggtggcta gggccttggt tgaaaacact cacttaatca gatggtcttt gttgttgaag 420

gctttgtctg gtgtttttgc tttaatttgt ggtaacggct acattgttgg tattaaccaa 480

atctatgaca ttggtattga taaggttaat aagccttatt tgccaattgc tgctggcgat 540

ttgtctgttc aatccgcttg gtacttggtc gttttcttcg ctgttgctgg tttgttgatt 600

gttagtttta actttggtac ttttattact tctttgtact gtttgggttt gtttttaggt 660

actgtttact ctgttcctcc attcagaatg aaaaagtatc cagttgctgc cttcttgatt 720

attgctaccg ttagaggttt cttgttgaac tttggtgttt accacgccac tagagctgct 780

ttgggtttga ctttcgaatg gtctagccct gttgctttca ttactacttt tgttactatg 840

ttcgctttgg ttatcgctat tactaaggac ttaccagatg ttgaaggaga tagaaagttt 900

caaatctcta ctttggctac caccttgggt gttagaaata ttgctttatt aggttcaggt 960

ttattattag ctaattactt gggtgctatt tttgctgctg tttacatgcc acaagctttt 1020

agatcttcat tgatgattcc agttcatgct attttattat tatctttgat ttttcaagcc 1080

tggatcttag aaagagctaa ttacactaaa gaagctattt tggctttcta tagattcatt 1140

tggaacttgt tctatgctga atacattgtt tttccattca tctaa 1185

<210> 10

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggcaacat tgttgaatac attatcatta agttccgcta aattaactaa tagaagaaca 60

caatctcatc aaccatcttc atttttcttt ttaccagttt ctactccttc ttttactaga 120

agaattttag ttgttagagc tgctgaaact gatactaatg aagtaaaacc atcttctggt 180

tcatctatta atcaattgtt aggtattaag ggtgcttcac aagaaactaa taagtggaaa 240

attagattgc aattgatgaa accagttact tggccaccat tagtttgggg tgttgtttgt 300

ggtgctgctg catctggtaa ttttcattgg aatgttgaag atgtaggtaa atctattttg 360

tgtatgataa tgtctggtcc atgtttaact ggttatactc aaactttgaa tgattggtat 420

gatagagaaa ttgatgctat taatgaacca tatagaccaa ttccatcagg agctgtttct 480

gaaaatgaag tgactactca aatttgggtt ttgttgttag gtggtttagg tttagcaggt 540

ttattagatg ttttagctgg tcataatttt cctattgtat tttatctagc tttaggtggt 600

tctttattat catatatata ttctgctcct ccattgaaat tgaaacaatt tggttgggtt 660

ggtaattttg cattgggtgc ttcttatatt tctttaccat ggtgggctgg tcaagcttta 720

tttggtacat taactcctga tgttattgtt ttgactttat tatattctat tgcaggttta 780

ggtattgcta ttattaatga ttttaaatct attgaaggcg atagagcttt gggtttgcaa 840

tctttaccag ttgcatttgg tgttgataca gctaagtgga tttgtgtagg tgctattgat 900

atcactcaat tgtctattgc tggttatcta ttaggtgttg gtaaacaata ttatggtttg 960

gcattgttag gtttgattat tccacaagtg atttttcaat ttcaatattt cttaaaagat 1020

ccaattaagt atgatgttaa atatcaagct tctgctcaac catttttagt tttaggtatt 1080

ttagttacag ctttagctac ttctcattaa 1110

<210> 11

<211> 1224

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 11

atggattctc tactccttct tgggtctgta tcgaaacctt gttggcgtct ttcgttttca 60

gcttctgcca agctatcaac tgctacaagg ggttatcatg taccaattag atttgcaaac 120

tcatcagcat ggtctactca agaaagacgc tactttggac agttacaggg acatcttatt 180

aatcatcaca tcacaattga tgcagaaaaa tcttcatttt ataggagggc cgacaagaag 240

gggttagtga atgctacttc agaaccacct tttgcatcgg agcctgaatc ttataatcca 300

aacaactttt ggagatctat gcaaagcgcc acagatgcct tttatcggtt ttcacggccc 360

catactgtca taggcacagc attaagtata ctctcagtat cattacttgc tattgagagg 420

ttatcagatc tttctccatt gttcttcact gggttgctgg aggcaattgt tgcggctctg 480

ttcatgaata tttacatagt cgggttaaat caactctttg acgtagaaat agataaggtt 540

aacaagccct atcttcctct tgcatctgga gaatactcca ttggaacggg catcctgatc 600

gttgcagctt ttgccgtgat gagcttttgg ctaggatggt ttgttggttc tgggccatta 660

ttatgggcac tttccattag ctttattctt gggactgcat attcaattaa tttaccatta 720

ttgagatgga agcgatttgc tttagttgct gcaatgtgta tcctggttgt ccgagcggtg 780

attgttcaac ttgcgttttt tctgcacata cagacatttg tttatagaag accagccatc 840

ttgacgaggc cattgatatt tgcaactgca ttcatgagct tcttctcagt tgttatagct 900

ctattcaagg atatacctga tattgaggga gacgcgattt ttggcatccg ttcttttact 960

gtccgccttg ggcaaaagcg ggtattctgg atttgtgtat accttcttga aatggcttat 1020

ggtgtcgccg tattggttgg agctgcttct ccctcccctt ggagcaaact tgttacggtt 1080

ttaggtcatg tagtcttggc ttcaatcctg tggctcaatg ctaaatccgt ggacctgaca 1140

aacaaaactg caataacatc cttttatatg tttatttgga agctctttta tgcagagtat 1200

ttgctcatcc cattggtcag atga 1224

<210> 12

<211> 1194

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 12

atggtttcaa gcttttcttt tccatctttt gcagtcacca aatacactcc tcaacaaggt 60

tttcttttga gaaagctgag accttttagt tcccaaagga gagatgcaga tattgctcta 120

ctgttcaagg tccaaacaga gaataaaatc ttcagtgctt tgaagagtag tgatccacaa 180

agctcttata atcttgataa accactcttg aggcacacaa gttcaattag gaaactctct 240

ccaccagctg ctactacatc agagcatgaa aatgtaccat taagtagtct ttccaaggca 300

atagatatat ttttcaggtt tattcgcccg tatgcaattg tttgcacgat gttcggcata 360

atgtctgttt cccttcttcc agtagaaaca ttggctgatc taactccaaa atttttcctc 420

ggtctaggga aggcaatgat agcagtggtg tctatgaatc tctttagtgt gtccgtaaat 480

caattttacg atgttgagct tgataaggtt aacaagccat atctccccct tgcttcagga 540

gaactttcta tggaggctgg ggcagccttt gttatcttgg caagttccat gggaatttct 600

tttgggttga tgcttcagtc tccaccgttg ttatgtacaa ttctgacatt cttcctcttt 660

ggtggtgctt attcaattga tcttcccttc ctgagatgga agaaacatcc agtcctagct 720

gtggtatgta tcactgccat gagagggctt gctttacaac taggtgtatt ttttcacatt 780

cagaaatatg tgcttgggaa gcctatggcc ttgacaagat cagtagtctt tgtaacgatt 840

ttcatgtgtg tcttcaacat tgccatttca ttaatcaagg atttacctga tgtggatgga 900

gacaaagctc atggcttcca aaacatgact atacgcttcg gtaaagaaaa ggtattttgg 960

ggttgcactt ccctcatgtt ggcaacttat ggcgctgcag tggcaatggg gttctcttcg 1020

ccattcctgg caactaagct aatcactgta attgcacata gtgcacttgg tttgtttgtc 1080

ttgcttcgtg ctcgatcaat taaacttgat gatgatgaat caacacagtc atattaccta 1140

cttctatggg atctttgtaa aattgagtac ttgcttgccc cattcgttcg ttga 1194

<210> 13

<211> 1176

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 13

atggtttcta gatgtgcttc tccgtctttc tccatcacca aatacactcc tcatcaaggt 60

tcacttttaa caagtctaaa acccttcagt tcccaaaaac caggagctag aatagaatat 120

aaattgcaac aaaatcatat attttgtgct ctgagaaaag attcacatgc atccctcaca 180

catactcatg aaaatgagct gctcttcaaa gacaagagcc caaccagaga aaaaggacgc 240

ctttctgcaa caagttctga aaacgcaccc tcaagttttt ccactaaatt agatatgttt 300

atcaagtttg ttcgtcccta tgcaaccatc ggcattattg ggaatacaat atgcatgtgc 360

atacttccag tgcaaacaat ggctgatctg tctccaaggt tttttattgg tgtagctcag 420

gcaatagcaa gcatggtgct tatgaatcta tttaatgttg ccgtgaatca agtatatgac 480

gttgagctcg ataaggtaaa caagccatat ttacctcttg cttctggagg agtctctatg 540

acaagtgcta ctctatttac aatcttgaca gccgctctga gcattgcatt gggatacttt 600

tcatctccag cactgtttta cggatctatt gctttctttc tctctgcctc cgcatactct 660

gtcaatttcc ccttattgag atggaaacac aatgcactgg gtgccattat aagtctcatg 720

ctttggggga tttcactaca aactggtgtc ttcttccaca ttcagcaata cgtgcttgga 780

aagcccatgg ttttaaaaaa ttcgttcatc tatgcaataa ttttccagtc cctattcagc 840

attgtcgtcg caacactcaa ggatttacct gatgtcgaag gcgaccaagc taacggctct 900

accaacttga ctatactaat cggtaaagaa aaagtatttt ggggttgcac tagtctcatg 960

ttggcaacat atattggtac agcagccttt ggggcaactt taccgatcct gaagaacaag 1020

ctcgtcacta tggtagcgca cagtgcactt gctgtcttcc tttggcttca ggctaaacag 1080

attgatcttg cagatgatgc ctctacacaa tcttattact tgcttatgtg gaagctttgc 1140

aatatcgagt acttactcat tccattcgtt ggttaa 1176

<210> 14

<211> 1185

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 14

atggatctcc gctccttgta ttctccttgt tctgcaactt cagttcttac ccctcatcac 60

cagaagatac tcactgcaaa acccactgtc caatcctcca aaatttcctt taaattctcc 120

agcagttcct catcactgac caccattggc atttctcaca gccacaacat caaatccgcg 180

ccggtcaagc acacaaagcg tttatctatc ttggcttgta gtccaattga ctatgcggct 240

gggtctgggt ccgggtctgg gtctgacccg ttgttggtaa aattgtcaga attcagagat 300

gcatcctgga gatttctaag gcctcacacc attcgtggga cggcgttggg atcctgtgct 360

ttggtagcaa gagccttagt tgaaaacacg catctgataa gatggtcgtt gctgttgaag 420

gcattatccg gagtttttgc ccttatatgt ggcaatgggt atatagtggg gattaaccag 480

atctatgaca ttggaattga caaagtaaat aagccttatt tacctatagc tgcaggggat 540

ctttcagttc agtcagcatg gtatttggtg gtgttttttg cagttgctgg actattaatt 600

gtcagtttta actttggtac attcattaca tccctctact gtctcggtct cttcctcggc 660

accgtctatt ctgttcctcc attcaggatg aagaaatatc ctgttgcagc gtttctcatc 720

attgccactg ttcgtggatt tcttctaaat tttggagtct atcatgctac aagagctgca 780

ttaggactta catttgaatg gagttcacct gtggctttta tcacaacctt tgtgacaatg 840

tttgcactcg ttatagcaat aacaaaagac ctcccagatg tagagggaga ccgcaagttt 900

caaatatcga ccttggccac aacgcttggt gttagaaata ttgcattact tggttcaggg 960

cttctgctgg ctaattatct tggcgctata tttgcagcag tttacatgcc tcaggctttt 1020

agaagcagct tgatgatacc agttcatgca atcctactgt tgagtttgat attccaggca 1080

tggatattag aacgggccaa ttacaccaag gaagccatct tagcgttcta tcggtttatc 1140

tggaatctct tctatgcaga atatattgta ttccccttta tttaa 1185

<210> 15

<211> 1110

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 15

atggcaacct tgctaaacac tctctccttg tcttccgcaa aattaacaaa cagaagaacc 60

caatctcatc aaccttcttc tttctttttc ctaccggttt ccacaccatc cttcacccgg 120

agaatacttg tagtcagagc agctgaaact gatacaaatg aagttaaacc ctcaagtggt 180

tcgagcatca atcaacttct tggcattaaa ggagcttccc aagagacaaa caaatggaag 240

attcgtctcc aacttatgaa gcctgtgaca tggcctcctt tggtctgggg agtagtctgt 300

ggagctgctg cttctgggaa cttccactgg aatgtggaag atgttggaaa atcaattctc 360

tgtatgataa tgtctggacc atgtctcact ggctatacac aaacccttaa tgattggtat 420

gatcgagaaa ttgatgcaat aaatgagccc tatcgtccaa ttccttctgg ggcagtatct 480

gagaatgagg tgactacaca gatatgggtg ctgcttttag gtggccttgg cttggctggg 540

ttattagatg tattggcagg acataacttt cctatagttt tttaccttgc acttggtgga 600

tccttgcttt catacatata ttctgctccg ccattaaagc tcaaacagtt tggatgggtt 660

ggaaactttg ctcttggagc aagctacatt agcttgccat ggtgggctgg ccaagcttta 720

tttggaactc ttacacctga cgtaattgta cttacacttc tatatagcat agctgggctt 780

ggtatcgcca tcattaatga cttcaaaagt atcgaaggag atagggcact tggactgcag 840

tctcttccgg tggcttttgg cgttgatact gctaaatgga tatgcgttgg cgcaatagac 900

ataactcagc tttctattgc tggttatctt cttggggtgg gtaaacaata ttatggcttg 960

gccctattag gtttgataat tccgcaagtc atttttcagt ttcagtattt cctgaaggac 1020

ccaatcaagt atgatgtcaa atatcaggct agtgcacaac catttcttgt gcttggaata 1080

ttggtaacag ctctagcaac gagccactga 1110

Claims

1.朝鲜淫羊藿来源的黄酮8-异戊烯基转移酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述黄酮8-异戊烯基转移酶的基因。

3.携带权利要求2所述的基因的表达载体。

4.表达权利要求1所述8-异戊烯基转移酶的微生物细胞。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，在基因组上整合了SEQ ID NO.8所示的基因，或含有携带SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。

6.一种生产黄酮8-异戊烯基转移酶的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的微生物细胞接种至培养基中，于28~40℃培养至少12 h，收集黄酮8-异戊烯基转移酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将表达权利要求1所述黄酮8-异戊烯基转移酶的大肠杆菌在培养基中，于35~40℃培养至OD₆₀₀为0.04~0.06，加入终浓度为0.01~1 mM的IPTG，于28~30℃诱导表达至少8 h。

8.权利要求1所述的黄酮8-异戊烯基转移酶在催化山奈酚生产8-异戊烯基山奈酚，或在催化山奈酚生产含8-异戊烯基山奈酚的医用营养品或药物中的应用。

9.一种生产8-异戊烯基山奈酚的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的微生物细胞或其代谢产物接种至含山奈酚的培养基中，将山奈酚转化为8-异戊烯基山奈酚；所述代谢产物含黄酮8-异戊烯基转移酶。

10.权利要求1所述的黄酮8-异戊烯基转移酶，或权利要求4或5所述的微生物细胞在制备微生物细胞催化剂方面的应用。