CN101942420A

CN101942420A - 一种与黄酮类化合物合成相关的蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101942420A
Application number: CN 201010246241
Authority: CN
Inventors: 赵德修; 夏芳; 虞珍珍
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2011-01-12

Abstract

本发明公开了一种与黄酮类化合物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的一种蛋白质，是一种查耳酮合酶，命名为SmCHS，来源于水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)，该蛋白质为如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与黄酮类化合物合成相关或与双氢黄酮类化合物合成相关或与4’，5，7-三羟基黄烷酮合成相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明的黄酮醇合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要价值。

Description

一种与黄酮类化合物合成相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与黄酮类化合物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

雪莲花又名雪莲，菊科风毛菊属。是民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。一般分布于海拔4,000米以上的高山流石滩上。早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)(S.involucrata Kar.et Kir.)和水母雪莲(S.medusa Maxim)。而水母雪莲(Saussurea medusa Maxim.)是藏药“雪莲”药材的原植物，分布在我国青海、甘肃、西藏等地。水母雪莲是藏药中的名贵药材，具有散寒除湿、活血通络、抗癌、抗炎及抗疲劳等功效，可治疗风湿性关节炎、妇女月经不调、痈疮肿毒和高山不适应等多种疾病。

黄酮类化合物的药理作用包括：抗癌、抗肿瘤，抗心脑血管疾病，镇咳祛痰，抗炎、镇痛作用，免疫调节作用，雌性激素样作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗辐射。雪莲中含黄酮、生物碱、内酯、甾醇、挥发油、多糖等多种成分，其有效成分主要为黄酮类化合物。如用来治疗偏瘫的雪莲通脉丸、雪莲注射液和治疗脑动脉硬化与缺血性中风的雪莲通脉口服液，都是以黄酮类化合物含量为质量标准的。雪莲黄酮药理作用显著，如水母雪莲黄酮成分对中枢神经系统有抑制作用；以黄酮类化合物为有效成分的雪莲注射液治疗偏头痛效果显著。

发明内容

本发明的目的是提供一种与黄酮类化合物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，为查耳酮合酶，命名为SmCHS，来源于水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)，该酶为如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与黄酮类化合物合成相关或与双氢黄酮类化合物合成相关或与4’，5，7-三羟基黄烷酮合成相关的由1)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由389个氨基酸残基组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使1)中的SmCHS便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的SmCHS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的SmCHS的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-1170所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

SmCHS蛋白的编码基因SmCHS也属于本发明的保护范围。

所述的编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)的基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第1-1170位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列1自5’末端的第1-1203位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且与黄酮类化合物合成相关或与双氢黄酮类化合物合成相关或与4’，5，7-三羟基黄烷酮合成相关的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90％同源性且与黄酮类化合物合成相关或与双氢黄酮类化合物合成相关或与4’，5，7-三羟基黄烷酮合成相关的DNA分子。

所述5)中的基因，与1)或2)或3)的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中的序列1由1313个碱基组成，自5′末端第1-1170位为编码区，编码序列表中序列2的蛋白质。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述SmCHS基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为在载体pET28a的EcoR I和Sal I酶切识别位点间插入所述编码基因得到的重组载体。

所述重组菌为将所述的重组载体导入宿主菌得到的重组菌。

扩增上述SmCHS基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

可用现有的植物表达载体构建含有SmCHS基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的SmCHS基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

使用SmCHS基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的SmCHS基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

所述蛋白质在体外合成黄酮类化合物的应用也是本发明保护的范围，或所述编码基因在体外合成黄酮类化合物中的应用也是本发明保护的范围，所述重组载体在体外合成黄酮类化合物中的应用是本发明保护的范围，所述重组菌在体外合成黄酮类化合物中的应用是本发明保护的范围。

上述应用中，所述黄酮类化合物为双氢黄酮类化合物，所述双氢黄酮类化合物优选为4’，5，7-三羟基黄烷酮。

本发明的实验证明，从水母雪莲中获得SmCHS基因，经过表达和纯化，可以获得蛋白SmCHS，具有在体外合成黄酮类化合物的功能，尤其是合成柚皮素。本发明的黄酮醇合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要价值。

附图说明

图1为PCR扩增SmCHS上游片断

图2为PCR扩增SmCHS全长cDNA

图3为重组质粒pET28a-SmCHS酶切图

图4为纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析

图5为水母雪莲SmCHS体外酶促反应的HPLC-MS图谱

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、水母雪莲查耳酮合酶基因(SmCHS)的克隆

1、水母雪莲查耳酮合酶基因(SmCHS)的克隆

1)雪莲cDNA文库的建立

称取培养1-14天的水母雪莲红色系愈伤组织，每天50mg，共计700mg混合样品于研钵中，用TRIZOL Reagent(购自GIBCO公司)提取总RNA。取1-3μl总RNA样品，用SMART cDNA Library Construction Kit(Catlog#：K1051-1)(CLONTECH)自带的CDSIII酶切位点的PolyT引物合成第一链cDNA。采用LD PCR(long distance PCR)扩增用cDNA第一链以获得双链cDNA。

加入蛋白酶K消化去除cDNA中的Taq酶，再用Sfi I酶切cDNA，然后用CHROMA SPIN-400(Catlog#：636076，Clontech)对cDNA进行大小分离。收集大小＞500bp的cDNA，将收集到的cDNA与λTripIEx2 Vector(Promega)连接，连接好的DNA由包装蛋白Packagene Lambda DNA Packaging System(购自Promega公司)包装后，加入明胶使终浓度为0.01％，DMSO终浓度为7％，可以在-70℃下保存1年滴度不变。将文库分成20个亚文库，避免反复冻溶，每个亚文库来自于在原始文库扩增时不同培养皿的回收物，其组成可能不同，可保存，这样就完成了雪莲噬菌体文库构建。

2)从雪莲cDNA文库筛选雪莲查耳酮合酶基因(SmCHS)cDNA

根据GenBank中已发表的查耳酮合酶(CHS)保守的氨基酸序列用软件DNAMAN4.0(美国Lynnon Biosoft公司)设计合成上下游部分简并引物：

CP1：5′′-AAT GCG ATG AAT GAA TGG GG-3′

CP2：5′′-AAG CAA CCG TGT TAC ATC AT-3′

每个亚文库取1μL为模板，以CP₁、CP₂为引物，25μL反应体系，先于95℃加热10min裂解噬菌体，加入PCR扩增混合物，进行TD-PCR扩增。

程序：94℃变性5min，随之以94℃1min，65-50℃退火1min(每进行一个循环退火温度比上一循环下降0.5℃)，72℃延伸1min，进行30循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，15循环；72℃延伸5min，1循环。

1.6％琼脂糖电泳检测，确定阳性池。选取信号最强的阳性池，作10倍梯度稀释到106倍，每个梯度稀释物取1μL为模板，按同样程序进行PCR检测，确定在下一级筛选时本级阳性池的最大稀释倍数N(能够检测到阳性信号的极限稀释倍数)。将选中的初级阳性池按其最大稀释倍数N稀释，取1μL稀释物感染大肠杆菌并铺制10个9cm LB平板，培养并回收洗脱物。从平板上挑取生长并分离良好的单噬菌斑，置于缓冲液中，涡旋震荡，稍离心，于4℃冰箱过夜。取3μL洗脱物为模板，以CP₁、CP₂为引物，PCR程序扩增检测，大小为1232bp的条带对应的克隆为阳性单克隆。

选取阳性单克隆，送上海生物工程公司测序。测序结果在GenBank中比较分析以确认所克隆的片段为带有完整3′端Poly A尾巴的，大小为1232bp的片段，通过比较发现并不是完整的CHS全长cDNA，在5′端缺失了100bp左右片段。

3)PCR法克隆雪莲查耳酮合酶基因SmCHS全长cDNA

根据GenBank中已公布的CHS cDNA的序列，在开放阅读框上游，即5′端，根据保守性设计一段引物，再用软件DNAMAN4.0从测序序列的中部设计一段引物：

CP3：5′-ATG GTG ACC GTC GAG GAA GTC CG-3′

CP4：5′-CAA CGC CAC TAG TAG TGC-3′

取2μl上述提取的水母雪莲红色系愈伤组织的总RNA，在M-MLV反转录酶(购自Promega公司)作用下合成第一链cDNA，以此第一链cDNA为模板，以上述CP₃，CP₄为引物进行PCR扩增：94℃变性5min，随之以94℃1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行30循环；72℃延伸10min，1循环。得到的PCR产物经过电泳，结果见图1所示，可以看出扩出406bp左右的片段。再将PCR产物送上海生物工程公司测序。测序结果为406bp左右的片段，在GeneBank中比对为CHS基因的上游序列。

用DNAMAN4.0软件将此406bp片段与上述2获得的大小为1232bp片段拼接起来，得到一个长度为1313bp的cDNA序列。

根据这拼接后的碱基序列，在开放阅读框3′端后面，且PolyA尾巴前面设计一段引物：

CP₅：5′-GGC CAC ATC AAG AGA TAG AGT AGG-3′。

以上述获得的第一链cDNA为模板，CP₃，CP₅为引物进行PCR扩增：94℃变性5min热启动后，随之以94℃1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，进行35循环；72℃延伸10min，1循环。得到的PCR产物取3μl经凝胶电泳，结果见图2所示，从图中可以看出，得到约1200bp的片段。回收该PCR产物，再加1μl的连接缓冲液，1μl pMD19-T载体(购自TAKARA公司，)，4μl无菌双蒸水，1μl的T4DNA连接酶，总共反应体系10μl。4℃下连接过夜。CaCl₂法制备感受态大肠杆菌DH5α。取连接产物加入CaCl₂溶液制备的感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30min，再放入预加热到42℃的循环水浴中，静置90s，后快速转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。每管冷却的细胞加入400μl LB培养基，用水浴将培养基加热到37℃，然后将管转移到摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因。将适当体积转化细胞转移涂布到相应抗生素LB平板上。于37℃培养，筛选转化子。以转化子的菌液为模板，CP₃，CP₅为引物，进行菌液PCR，扩增出大小约为1200bp条带的菌液为阳性转化子，再将阳性转化子送去测序，测序结果为该阳性转化子中含有序列表中序列1自5’末端第1-1203位核苷酸，序列表中序列1的所示的基因命名为SmCHS，其开放阅读框为序列1自5’末端第1-1170位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为SmCHS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2所示，该阳性转化子命名为DH5α/pMD19-T-SmCHS，提取该阳性转化子获得的质粒命名为pMD 19-T-SmCHS。

采用BLAST同源性分析，通过比较得知，SmCHS全长cDNA序列和氨基酸序列与非洲菊(Gerbera hybrid AM906210)中的查耳酮酶CHS基因相似性最高，分别达到82％和92％。表明，从水母雪莲中克隆到的SmCHS为查耳酮酶的编码基因。

实施例2、SmCHS的表达和纯化

1、pET28a-SmCHS原核表达载体的构建

以人工合成的序列1所示DNA(SmCHS全长cDNA)作为模板，用引物SmCHS-Yf和SmCHS-Yr扩增SmCHS开放读码框(ORF)，引物SmCHS-Yf和SmCHS-Yr的两端分别引入EcoR I和Sal I的识别位点，引物的序列如下：

SmCHS-Yf：5′-GGAATTCATGGTGACCGTCGAGGAAGTCCG-3′(序列3)

SmCHS-Yr：5′-GCGTCGACGGCCACATCAAGAGATAGAGTAG-3′(序列4)

得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化1200bp的DNA片段，用EcoRI和Sal I酶切该片段，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的片段，插入pET28a(Novagen，69864-3)的EcoR I和Sal I酶切识别位点间，得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，经过卡那霉素抗性筛选，挑单菌落过夜培养，提取质粒进行EcoR I和Sal I双酶切检测，结果见图3所示，从图中可以看出，得到大小为1200bp的片段，该质粒为阳性质粒，命名为pET28a-SmCHS，将pET28a-SmCHS送去测序，结果进一步证明了该阳性质粒为将序列表中序列1自5’末端的第1-1203位核苷酸插入到载体pET28a的EcoR I和Sal I酶切识别位点间得到。含有该阳性质粒的菌命名为BL21/pET28a-SmCHS。

采用同样的方法将空载体pET28a转入获得大肠杆菌BL21，获得重组菌BL21/pET28a。

2)SmCHS诱导表达与纯化

将BL21/pET28a-SmCHS接种至含卡那霉素(终浓度为100mg/L)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％接种量转接，培养至DD值约0.6，加入1mmol/L的IPTG，28℃诱导表达5小时，得到培养液，离心收集菌体。

将收集菌体进行超声破碎，得到破碎液，再将破碎液经过离心后收集上清液和沉淀，将上清液经过His Gravitrap层析柱(GE公司)进行纯化，融合蛋白的纯化参照GE公司的His Gravitrap说明书进行。

收集洗脱液，得到纯化的SmCHS。

采用上述表达的方法将BL21/pET28a-SmCHS在不加IPTG诱导的条件下培养，经超声破碎后，收集破碎液、上清液和沉淀，将上清液经同样的方法进行纯化得到对照蛋白1。

采用同样的方法将BL21/pET28a在加IPTG诱导的条件下培养，经超声破碎后，收集破碎液、上清液和沉淀，再将上清液经同样的方法进行纯化得到对照蛋白2。

将经过IPTG诱导的BL21/pET28a-SmCHS的破碎液、上清液和沉淀以及纯化的SmCHS与未经过IPTG诱导的BL21/pET28a-SmCHS的破碎液、上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，以经过IPTG诱导的BL21/pET28a破碎液、上清液和沉淀作为对照。检测结果如图4所示，M为蛋白分子量标准，1、2、3依次为经过IPTG诱导的BL21/pET28a-SmCHS的破碎液(总蛋白)、上清液和沉淀，4为纯化的SmCHS，5、6、7依次为未经过IPTG诱导的BL21/pET28a-SmCHS的破碎液(总蛋白)、上清液和沉淀。从图中看出经过IPTG诱导的BL21/pET28a-SmCHS的破碎液、上清液和沉淀以及纯化的SmCHS均有43KD的条带，与预期的SmCHS的大小一致。BL21/pET28a的电泳结果与未经过IPTG诱导的BL21/pET28a-SmCHS的结果无显著差异。

用考马斯亮蓝法测定纯化的SmCHS的蛋白浓度，标准品为牛血清白蛋白，购自北京索莱宝科技有限公司，产品目录号为A8010-5，得到纯化的SmCHS的浓度为0.636mg/L培养液(即为摇瓶中的所有产物)。

实施例3、SmCHS的体外酶促反应产物HPLC-MS鉴定

体外酶促反应体系总体积250μl，其中含有3.75μmol的4-香豆酰辅酶A(Beuerle T，Pichersky E.2002.Enzymatic Synthesis and Purification of Aromatic Coenzyme A Esters.Analytical Biochemistry，302(2)：305-312，公众可从中国科学院植物研究所获得)、14μmol的丙二酰辅酶A(购自Sigma，产品目录号M4263)、0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)以及2.0μg由实施例2获得的纯化的SmCHS。上述反应体系置于30℃下60分钟后，加入12.5μl乙酸，获得酶促反应产物。向酶促反应产物中加入250μl乙酸乙酯萃取，吸取有机相，12000rpm离心20分钟。取上清液干燥后，加入70ul 50％(体积百分含量)的甲醇水溶液获得酶促反应产物提取物。

用Agilent 1100HPLC/MSD Trap VL鉴定上述获得的酶促反应产物。

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm(Agilent Co，USA)，柱温30℃，进样量20μl。流动相为水(A)和甲醇(B)，流速为1.0ml min^-1，洗脱程序：80％B10min。检测波长289nm。

质谱条件：电喷雾(ESI)离子阱，干燥气温度350℃，雾化气压力35psi，干燥气流速8.00l min^-1，毛细管电压3500V，锥孔电压-30.9V，负离子模式下扫描质量范围m/z 100-400。

以实施例2获得的对照蛋白1和对照蛋白2分别进行上述的酶促反应分别获得的酶促反应产物和反应产物提取物，作为阴性对照。实验重复三次，实验结果取平均值。

柚皮素标准品为4’，5，7-三羟基黄烷酮，购自Sigma，产品目录号为N5893。柚皮素属于黄酮类化合物中的双氢黄酮类。

HPLC和质谱的结果如图5所示，A为柚皮素标准品HPLC图谱；B为柚皮素标准品质谱图谱([M-H]270.8)；C为纯化的SmCHS酶促反应产物提取物图谱；D为纯化的SmCHS酶促反应产物提取物质谱图谱；E为阴性对照酶促反应产物提取物图谱；F为阴性对照酶促反应产物提取物质谱图谱；

从图中看出，柚皮素标准品保留时间为1.8min(A)，负离子模式下柚皮素标准品的m/z为270.8(B)，纯化的SmCHS酶促反应产物提取物的保留时间为1.8min(C)；纯化的SmCHS酶促反应产物提取物的m/z为270.8(D)；阴性对照酶促反应产物提取物(对照蛋白1)图谱保留时间为1.8min时没有洗脱峰(E)；阴性对照酶促反应产物提取物(对照蛋白1)质谱保留时间为1.8min时也没有m/z为270.8的离子出现(F)。对照蛋白2的反应产物提取物与对照蛋白1的结果无显著差别。从产物的出峰时间和质谱图显示4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA在体外被SmCHS催化生成了柚皮素，表明克隆到的水母雪莲SmCHS基因是一个与柚皮素合成相关的酶。阴性对照没有活性。