CN105734055B - 一种用于桑树植原体基因组的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于桑树植原体基因组的纯化方法,利用植原体具有细胞膜且其基因组为半自主复制的特点,采用DNA甲基化结合蛋白,从纯化的感染植原体的桑树全基因组中去除桑树基因组,通过半定量和定量PCR均证实所获的DNA纯度较高,浓度较大的桑树植原体基因组DNA,解决了木本植物植原体含量低,脉冲电泳纯化困难的问题,并利用定量PCR对本发明效果进行了验证,所获得的植原体基因组浓度和比例较高,可以用于PCR实验和高通量测序。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于桑树植原体基因组的纯化方法,特别涉及一种用于直接测序等需要高纯度基因组的桑树植原体DNA的纯化方法。
背景技术
1967年土居等首次发现桑树黄化型萎缩病、泡桐丛枝病等多种植物的丛枝病均系植物类菌原体寄生所引起,1974年我国通过电子显微镜研究,在发生萎缩病的桑树韧皮部筛管内观察到类菌原体,1998年邱并生等分别扩增了桑黄化型萎缩病和萎缩型萎缩病16SRNA片段,按照植原体的分子分类系统,初步确定两种病害的植原体隶属于翠菊黄化组。1992年类菌原体被正式命名为植原体(Phytoplasma)。植原体归属于柔膜菌属,细胞通常呈圆形或椭圆形,没有细胞壁,在细胞质外具有单层膜,细胞质内有颗粒状的核糖体、可溶性蛋白质、RNA及代谢物等,基因组是双链闭合环状的DNA,目前已知植原体的种类有12个类群,25个亚群。桑树植原体属于翠菊黄化病组B亚组。由于植原体不能进行人工培养,所以植原体全基因组序列对于植原体研究的重要性,许多实验室用不同的方法对植原体进行全基因组测序。
在测序技术非常成熟的今天,分离技术是其基因组学研究的瓶颈,目前植原体基因组的纯化方法有先组织浸提液简单过滤法,差速离心法,密度梯度离心法,植株韧皮部汁液渗出发和植物组织冷冻法,这些方法的分离效果均不够理想。由于这些提取液的渗透压难以达到韧皮部的环境,而植原体有缺乏细胞壁,导致渗透压稍有变化就会引起植原体个体的崩解。PFGE是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中,大的DNA分子(>10kb)移动速度接近,很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中,电场不断在两种方向(有一定夹角,而不是相反的两个方向)变动。DNA分子带有负电荷,会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向,而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。但该方法对于植原体的基因组含量要求较高,而且对于木质化高的植物非常不适用,一般是利用菟丝子转到草本植物中再进行,这大大增加了纯化难度。而利用酶促反应从病株总基因组中直接纯化植原体的方法未见报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足,本发明的目的是提供一种用于桑树植原体基因组的纯化方法,加快桑树植原体的全基因组序列的解析,首先对桑树植原体的分子生物学地位和结构特点进行分析,桑树植原体虽然没有细胞壁,但是具有细胞膜,属于半自主复制,这样就可以避免被桑树的DNA甲基化酶进行甲基化修饰,同时植原体的GC含量在40%左右,偏低,也可以有效避免被甲基化的比例,同时,已有的植原体染色实验证实植原体主要存在于桑树的韧皮部,所以本发明利用从桑树韧皮部提取全基因组DNA,然后利用甲基化DNA结合蛋白,去除桑树的宿主DNA,就可以获得纯度较高的桑树植原体基因组。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种用于桑树植原体基因组的纯化方法,包括以下步骤:
步骤一、样品处理,利用解剖刀取桑树感染植原体的病株的枝条的韧皮部1g,放入干净的研钵中,加入液氮冷冻后研磨均匀;
步骤二、提取基因组DNA,采用1.5ml离心管收集步骤一粉末,并迅速加入500-700ul缓冲液SLX和5-10ul核糖核酸酶 A,利用涡旋器混合均匀,于70摄氏度孵育10分钟后经14000转离心5分钟,仔细吸取上清液到一个干净的1.5ml离心管中,加入30-50ul磁珠和300-500ul无水乙醇,混合均匀,利用磁力架吸附磁珠,丢弃上清,并用70-75%的乙醇洗涤,重复3次后,利用60-100ul缓冲液TE洗脱,完成基因组DNA的提取;
步骤三、利用甲基化结合蛋白去除桑树的基因组,首先在1.5ml的离心管中加入100-200 ul蛋白A磁珠,置于磁力架吸附5分钟后,去除上清,加入缓冲液C(稀释比例为1:10)和无核酸酶的水(根据要求补充至所需总体积),加入10-20ul链霉亲和素标记的甲基化结合蛋白MBD2,22-25摄氏度震荡孵育10-15分钟,置于磁力架吸附5-7分钟,去除上清,再加入10-20ul缓冲液C、15-30ul水和25-50ul与步骤二提取的基因组DNA,25摄氏度震荡孵育20分钟,置于磁力架吸附5分钟,仔细吸取上清到一个新的1.5ml离心管中,加入2-3倍体积的无水乙醇和10-20ul 5M氯化钠,冷冻2小时后4度14000转离心10分钟,沉淀用70-75%的乙醇洗涤2次后用80-100ul缓冲液TE溶解,电泳检测;
步骤四、去除碎片DNA段,步骤三产物利用琼脂糖电泳,在1.5%的胶浓度,电压5V/CM,由细菌噬菌体Bacteriophage λc I857 Sam7 DNA用EcoT14 I酶切反应后配制而成的λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker为指示,利用玻璃奶吸附的方法回收19329bp以上的DNA,用于下一步骤;
步骤五、基因定量PCR所使用的引物,在2只200ul薄壁管中分别加入双蒸水,计算后补充总体至100ul、100微摩3端双硫代修饰的6随机引物25-30ul、反应缓冲液10ul、步骤二和步骤四所得的产物分别10-15ul,于95摄氏度加热3分钟,置于冰上20分钟,然后加入脱氧核糖核苷三磷酸dNTP(10mM)4-5ul,2-3ul的10mg/ml牛血清白蛋白BSA,phi29聚合酶4-5ul,30摄氏度孵育12小时,65摄氏度10分钟灭活合成酶,处理后浓度为126ng/ul,可以满足测序或PCR要求,稀释至500ul分装冷冻保存备用;
其中所用的引物为:
所述的100微摩3端双硫代修饰的6随机引物为常用引物,硫代修饰为防止酶对引物的降解。
步骤六、利用CFX Connect™ 荧光定量系统,使用Power SYBR® Green PCRMaster Mix进行定量PCR对步骤五所得样品中的植原体基因组和桑树基因组进行定量分析。
所述的缓冲液SLX为1%的去氢胆酸钠Sodium deoxycholate, 0.5%的 亮抑蛋白酶肽Leupeptin,1%的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100混合溶液。
所述的缓冲液C为25mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,62.5mM氯化镁,5mM DTT,50%甘油,0.5M 氯化钾的混合溶液。
所述的反应缓冲液为为0.5M Tris,0.1M氯化镁,0.1M硫酸铵,0.1M二硫苏糖醇DTT的混合溶液。
所述的缓冲液TE为10mM的Tris-HCl缓冲液,1mM EDTA的混合溶液。
本发明的有益效果是:
首次利用酶促反应的办法,获得纯度较高,浓度较大的桑树植原体基因组DNA,解决了木本植物植原体含量低,脉冲电泳纯化困难的问题,并利用定量PCR对本发明效果进行了验证,所获得的植原体基因组可以用于PCR实验和高通量测序。
附图说明
图1为利用本发明纯化的植原体基因组结果,其中,M1为λ-Hind Ⅲ digest(Takara)分子标记,BR为基因组对照,1为桑树植原体基因组。
图2 为利用桑树基因和植原体16S RNA基因做的PCR验证,其中1、2、3为桑树的基因;4、5、6为植原体的基因;1、4为步骤2的产物;2、5为步骤3的产物;3、6为步骤4的产物;M为DL2000分子标记。
图3为利用定量PCR,对利用步骤5处理后和处理前的基因组DNA定量结果,其中横轴为不同的基因NCBI登录号,其后3位数为对应的引物。纵轴为相对荧光单位,灰色柱为处理前,黑色柱为处理后。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步叙述,但本发明不局限于以下实施例。
一种用于桑树植原体基因组的纯化方法,包括以下步骤:
步骤一、样品处理,因为植物的韧皮部筛管细胞不具有细胞核,桑树的基因组含量较低,而植原体的含量较高。利用解剖刀取桑树感染植原体的病株的枝条的韧皮部1g,放入干净的研钵中,加入液氮冷冻后研磨均匀;
步骤二、提取基因组DNA,比较离心柱、磁珠、乙醇沉淀三种基因组的提取方法,磁珠法提取的片段最长,可以达到50k bp以上,为了提高下一步宿主蛋白的去除效率,所以利用磁珠法进行样品的基因组抽提,采用1.5ml离心管收集步骤一粉末,并迅速加入500ul缓冲液SLX和5ul核糖核酸酶 A,利用涡旋器混合均匀,于70摄氏度孵育10分钟后经14000转离心5分钟,仔细吸取上清液到一个干净的1.5ml离心管中,加入50ul磁珠和300ul无水乙醇,混合均匀,利用磁力架吸附磁珠,丢弃上清,并用70%的乙醇洗涤,重复3次后,利用100ul缓冲液TE洗脱,完成基因组DNA的提取;
步骤三、利用甲基化结合蛋白去除桑树的基因组,首先在1.5ml的离心管中加入200 ul蛋白A磁珠,置于磁力架吸附5分钟后,去除上清,加入40ul缓冲液C(25mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,62.5mM氯化镁,5mM DTT,50%甘油,0.5M 氯化钾,pH 7.4)和160ul无核酸酶的水,加入20ul链霉亲和素标记的甲基化结合蛋白MBD2,25摄氏度震荡孵育10分钟,置于磁力架吸附5分钟,去除上清,再加入20ul缓冲液C、30ul水和50ul与步骤二提取的基因组DNA,25摄氏度震荡孵育20分钟,置于磁力架吸附5分钟,仔细吸取上清到一个新的1.5ml离心管中,加入2倍体积的无水乙醇和10ul 5M氯化钠,冷冻2小时后4度14000转离心10分钟,沉淀用70%的乙醇洗涤2次后用100ul缓冲液TE溶解,电泳检测,如图1所示;
步骤四、去除碎片DNA段,由于利用任何一种植物基因组提取试剂盒,都会产生碎片DNA,这些DNA的存在会严重影响植原体基因组的纯度步骤三产物利用琼脂糖电泳,在1.5%的胶浓度,电压5V/CM,由细菌噬菌体Bacteriophage λc I857 Sam7 DNA用EcoT14 I酶切反应后配制而成的 λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker为指示,利用玻璃奶回收19329bp以上的DNA,用于下一步骤;
步骤五、基因定量PCR所使用的引物,在2只200ul薄壁管中分别加入双蒸水43ul、100微摩3端双硫代修饰的6随机引物25ul、反应缓冲液10ul(0.5M Tris,0.1M氯化镁,0.1M硫酸铵,0.1M DTT,pH 7.5)、步骤二和步骤四所得的产物分别10ul,于95摄氏度加热3分钟,置于冰上20分钟,然后加入脱氧核糖核苷三磷酸dNTP(10mM)5ul,2ul的10mg/ml牛血清白蛋白BSA,phi29聚合酶5ul,30摄氏度孵育12小时,65摄氏度10分钟灭活合成酶,处理后浓度为126ng/ul,可以满足测序或PCR要求,稀释至500ul分装冷冻保存备用,如图2所示,
其中所用的引物为:
植原体16S RNA(27F:5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1429R:5 GGTTACCTTGTTACGACT);桑树PP2基因(登录号exc24759)F:TTGACAAGATGGGCAAGAATTG;R:ACTCAACATGTTGTTTTTGGTTG;
步骤六、利用CFX Connect™ 荧光定量系统,使用Power SYBR® Green PCRMaster Mix进行定量PCR对步骤五所得样品中的植原体基因组和桑树基因组进行定量分析。
引物序列为,317F:ctgctcaaatggatgctgct; 317R:ggaatgtcgtctcctgggaa;608F:agcgaaaacaaaccaaatcagt;608R:agcaaatgaacctatcgcaaaa;866F:agcaactgggatgacatgga;866R:gtaaagggagagaacggcct;050F:ggtgcaggtgagtgtaaagc; 050R:acttccccttccacttaccg,分别通过上述步骤处理后,定量PCR的程序为95度3分钟预变性;95度10秒;55度20秒;72度20秒;75度5秒;40个循环。Melt Curve 为65到95摄氏度,增量为0.5度。发现引物序列为317和608的样品在纯化前后变化不大,而引物序列为866和050的样品则显著降低,如图3所示。
结论:从该实施可以看出,利用该方法可以从提取的桑树基因组中纯化桑树植原体基因组,从图1亮度可以看出,植原体的比例非常低,而图2显示进一步利用植原体16SRNA和桑树PP2基因的半定量PCR检测发现步骤一产物中植原体基因组和桑树基因组的含量都非常高,而步骤二产物中桑树的基因组含量开始下降,植原体基因组的含量维持不变,图3和表1显示步骤四后桑树基因组的比例进一步下降,普通电泳已经难以观察,而植原体基因组的含量继续维持不变,说明该方法切实可行。而进一步利用定量PCR对桑树基因组和植原体基因组进行定量分析,为提高数据的代表性,我们选择了和半定量PCR不同的2对引物,结果也证明在经过该方法纯化后,桑树基因组的比例已经很低,而植原体的基因组变化很小。
。
Claims (1)
1.一种用于桑树植原体基因组的纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、样品处理,利用解剖刀取桑树感染植原体的病株的枝条的韧皮部1g,放入干净的研钵中,加入液氮冷冻后研磨均匀;
步骤二、提取基因组DNA,采用1.5ml离心管收集步骤一粉末,并迅速加入500-700ul缓冲液SLX和5-10ul核糖核酸酶A,利用涡旋器混合均匀,于70摄氏度孵育10分钟后经14000转离心5分钟,仔细吸取上清液到一个干净的1.5ml离心管中,加入30-50ul磁珠和300-500ul无水乙醇,混合均匀,利用磁力架吸附磁珠,丢弃上清,并用70-75%的乙醇洗涤,重复3次后,利用60-100ul缓冲液TE洗脱,完成基因组DNA的提取;
步骤三、利用甲基化结合蛋白去除桑树的基因组,首先在1.5ml的离心管中加入100-200ul蛋白A磁珠,置于磁力架吸附5分钟后,去除上清,加入缓冲液C和无核酸酶的水,无核酸酶的水根据要求补充至所需总体积,所述的缓冲液C稀释比例为1:10,加入10-20ul链霉亲和素标记的甲基化结合蛋白MBD2,22-25摄氏度震荡孵育10-15分钟,置于磁力架吸附5-7分钟,去除上清,再加入10-20ul缓冲液C、15-30ul水和25-50ul与步骤二提取的基因组DNA,25摄氏度震荡孵育20分钟,置于磁力架吸附5分钟,仔细吸取上清到一个新的1.5ml离心管中,加入2-3倍体积的无水乙醇和10-20ul5M氯化钠,冷冻2小时后4度14000转离心10分钟,沉淀用70-75%的乙醇洗涤2次后用80-100ul缓冲液TE溶解,电泳检测;
步骤四、去除碎片DNA段,步骤三产物利用琼脂糖电泳,在1.5%的胶浓度,电压5V/CM,由细菌噬菌体Bacteriophageλc1857 Sam7 DNA用EcoT14I酶切反应后配制而成的λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker为指示,利用玻璃奶吸附的方法回收19329bp以上的DNA,用于下一步骤;
步骤五、基因定量PCR所使用的引物,在2只200ul薄壁管中分别加入双蒸水,计算后补充总体至100ul、100微摩3端双硫代修饰的6随机引物25-30ul、反应缓冲液10ul、步骤二和步骤四所得的产物分别10-15ul,于95摄氏度加热3分钟,置于冰上20分钟,然后加入脱氧核糖核苷三磷酸dNTP,10mM,4-5ul,2-3ul的10mg/ml牛血清白蛋白BSA,phi29聚合酶4-5ul,30摄氏度孵育12小时,65摄氏度10分钟灭活合成酶,处理后浓度为126ng/ul,可以满足测序或PCR要求,稀释至500ul分装冷冻保存备用;
其中所用的引物为:
所述的100微摩3端双硫代修饰的6随机引物为常用引物,硫代修饰为防止酶对引物的降解;
步骤六、利用CFX Connect TM荧光定量系统,使用Power SYBR® Green PCR MasterMix进行定量PCR对步骤五所得样品中的植原体基因组和桑树基因组进行定量分析;
所述的缓冲液SLX为1%的去氢胆酸钠Sodium deoxycholate,0.5%的亮抑蛋白酶肽Leupeptin,1%的聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100混合溶液;
所述的缓冲液C为25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸,62.5mM氯化镁,5mMDTT,50%甘油,0.5M氯化钾的混合溶液;
所述的反应缓冲液为0.5MTris,0.1M氯化镁,0.1M硫酸铵,0.1M二硫苏糖醇DTT的混合溶液;
所述的缓冲液TE为10mM的Tris-HCl缓冲液,1mMEDTA的混合溶液。
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