CN112094951B

CN112094951B - 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法

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Publication number: CN112094951B
Application number: CN202011147923.1A
Authority: CN
Inventors: 孔卫青; 杨金宏; 江微; 黎欢吉
Original assignee: Ankang University
Current assignee: Ankang University
Priority date: 2020-10-23
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2040-10-23
Also published as: CN112094951A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种桑树线虫传多面体病毒不同RNA链(poly1和poly2)的绝对定量检测方法。本发明通过合成多种聚合的体外转录载体，制备RNA标准品，避免了因为poly1和poly2不同基因反转录、扩增效率差异，可以分别定量多面体病毒poly1和poly2两条RNA，并进行不同poly的拷贝数比较。同时本发明对提出的感染桑树叶片样本总RNA进行反转录→PCR→体外转录→核酶切割→电泳检测排除假阳性。既能够对细胞内病毒poly1和poly2分别进行精准定量，又可有效降低单基因检测的假阳性，解决了单纯定量PCR检测方法容易出现假阳性的弊端。

Description

一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种桑树线虫传多面体病毒不同RNA链(poly1和poly2)的定量检测方法。

背景技术

病毒往往给人类带来灾难性、可怕的后果。其结构简单，基因组仅仅包含DNA或者RNA，也有仅仅包含蛋白质的朊病毒。在已经发现的病毒中，其中大部分为RNA病毒，但是不同RNA病毒含有的RNA基因组片段却不一样，例如甲型流感病毒基因组由8个线性的RNA基因组片段组成，编码11个已知的病毒蛋白质(一个基因组片段可以编码1-2个蛋白质)。冠状病毒只有1条基因片段，编码多个蛋白质。具有多个片段的病毒被称为多分体病毒。

桑树线虫传多面体病毒属于小RNA病毒目(Picornavirales)，该目含有4个科，海洋RNA病毒科(Marnaviridae)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，双顺反子病毒科(Dicistroviridae)，植物小RNA病毒科(Secoviridae)。

线虫传多面体病毒属Nepovirus病毒基因组为双分体基因，病毒粒子为等轴对称的20面体(多面体)，直径28nm，无包膜，外形常为六边形，由60个蛋白结构亚基。病毒纯化时分为顶部(T)、中部(M)和底部(B)三组分。两条核酸为线形单股正链RNA，poly1长6-9kb，poly2长3-7kb。

由于PCR的非特异扩增，目前对病毒的核酸检测多是采用双基因进行检测，大多不采用标准品进行定量，该方法无法准确定量。采用DNA质粒进行定量的方法容易检测不到逆转录过程的影响，仍然没有办法进行准确的定量。现有技术也有对HIV病毒检测中采用体外转录RNA定量的报道，但是对于多分体基因病毒，则未见综合考量正负链，不同链之间差异的定量(尤其是宿主中拷贝数的确定)的检测方法。

对于桑树线虫多面体病毒，其线虫传多面体病毒属病毒的2条RNA链在植物体内并不是均匀存在，其2条RNA链的比例对于确定侵染时期和危害程度预测具有重要意义，甚至有报道仅有poly1的低水平感染情况，而植物中也存在只有一条poly2链的死病毒颗粒的情况。而且2条链基因不同，对于反转录的转录效率也不一样，这都增加了准确定量的难度。同时由于PCR的非特异扩增，假阳性和假阴性现象的存在，造成了核酸检测的疑似情况屡见不鲜。如何在PCR的基础上进一步确定序列，并实现桑树线虫传多面体病毒的精准定量，已经是一个亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法。

本发明的目的是提供一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，包括：

步骤一、RNA标准品的制备

体外合成具有间隔的体外转录载体，核苷酸序列参见SEQ ID NO.1；

利用T7体外转录酶转录SEQ ID NO.1的序列，测定其浓度，得RNA预标准品一；

利用SP6体外转录酶转录SEQ ID NO.1的序列，测定其浓度，得RNA预标准品二；

将RNA预标准品一和RNA预标准品二混合，最终得到RNA标准品；

步骤二、提取健康和感染线虫传多面体病毒桑树叶片的总RNA；

步骤三、反转录

将步骤一的RNA标准品与步骤二的健康桑树总RNA按照1:101～106体积比例混合后作为模板，反转录，得到标准品反转录样品；

将感染线虫传多面体病毒桑树叶片的总RNA为模板进行反转录，得到检测样反转录样品；

步骤四、定量检测

分别对步骤三所得标准品反转录样品进行荧光定量PCR分析，制作浓度-Ct标准曲线；

利用荧光定量PCR对步骤三所得检测样反转录样品中的poly1和poly2保守区域和桑树内参基因组分别进行定量PCR分析，获得的Ct值对应到浓度-Ct标准曲线上，获得poly1和poly2浓度含量；

步骤五、假阳性排除

利用带有启动子的引物对步骤三所得检测样反转录样品进行PCR；电泳回收的PCR产物，体外转录，核酶体外切割并电泳检测；当步骤四和步骤五的检测结果吻合，则证明步骤四的poly1和poly2含量计算结果为精准定量。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，步骤一中T7或SP6体外转录酶转录产物分别保存在RNA保存液中，使用时，通过乙醇溶液沉淀、洗涤其中的RNA，ddH₂O重悬，得到相应的RNA预标准品；

RNA保存液配方2×：100mM TCEP-HCl，甘油10mL/100mL，1-巯基甘油0.2mL/100mL，Tris-HCl 30mM，EDTA 20mM，溶剂为ddH₂O，pH 5.0。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，RNA预标准品一和RNA预标准品二重悬后的摩尔浓度相同，且二者按照1:1的体积混合。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，步骤四中，

poly1的定量引物为：

RT-6309P1F：5’-CTTGCTGGTGCCTGGAT-3’

RT-6309P1R：5’-CCAACCAAGTTGCATCATGCG-3’

或者RT-6309P2F：5’-CTGGCACGCAAGTGGTA-3’

RT-6309P2R：5’-GTACACTATGGACCCTGGCAC-3’

Poly2的定量引物为：

RT-3279P1F：5’-GTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCT-3’

RT-3279P1R：5’-ACTTCCCCTCCAGTCACAAC-3’

或者

RT-3279P2F：5’-CTCTTCCCTTTGATGTTCCCTT-3’

RT-3279P2R：5’-AAACTCTCACCCTCAATACC-3’

内参引物为：

actin F：5’-AGCAACTGGGATGACATGGA-3’

actin R：5’-CCAACACAATACCAGTTGTAC-3’。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，荧光定量体系为：Power

Green PCR Master Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、内参引物F/R各1μL、模板2μL，蒸馏水补足25μL。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，步骤五中，假阳性排除所用PCR引物为

6309P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGCTTGCTGGTGCCTGGAT-3’

6309P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGCCAACCAAGTTGCATCATGCG

和3279P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGGTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCT-3’

3279P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGAAACTCTCACCCTCAATACC-3’。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，核酶的DNA序列如SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，体外切割体系：10×核酶切割缓冲液10μl，底物RNA的终浓度0.2～50pmol/μL，DTT终浓度1g/100mL，rnasin终浓度4U/μL，核酶RNA终浓度0.2～50pmol/μL，ddH₂O补足至100μL。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，底物RNA与核酶RNA的体积比例为1：1～10。

优选的，上述桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，具有间隔的体外转录载体和核酶RNA模板分别保存于经Nde I酶和Nco I酶线性化的载体PGEX-4T-2EASY上。

与现有技术相比，本发明提供的桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，具有以下有益效果：

1、RNA病毒是利用RNA聚合酶进行复制，该酶不具有修复功能，所以相较于DNA病毒，RNA病毒的突变率较高，检测更为困难。

本发明利用多样本多克隆策略，共做了55个克隆，筛选到了保守的检测位点，避免了检测结果的假阴性问题。本发明通过合成多种聚合的体外转录载体，避免了因为poly1和poly2不同基因反转录、扩增效率差异，可以分别定量多面体病毒poly1和poly2两条RNA，并进行不同poly的比较，确定复制特点，对于多分体病毒的检测具有重要意义。

本发明还利用总RNA提取→反转录→PCR→体外转录→核酶切割→电泳检测排的思路排除假阳性，能够对细胞内病毒poly1和poly2两条RNA链的量分别进行精准定量，并且可以有效降低单基因检测的假阳性，解决了单纯PCR容易出现假阳性的弊端。

2、现有技术除了测序，还有利用DNA限制性内切酶的办法，但是限制性内切酶的检测对象需要6个碱基的回文结构，这在RNA序列中存在的概率低，而且限制性内切酶如6个碱基中突变1个则不能被检测出。

本发明利用核酶进行假阳性排除时，其结合位点只需要3个碱基，目标较多，检出率高。核酶的3个碱基(切割GUC，DNA对应的是gtc，反向互补就是gac)，只有C不能突变，其他2个突变后仅仅影响切割效率，但仍能被检出。相较于限制性内切酶，本发明对序列突变的容忍度更大。

附图说明

图1为Poly1的电泳结果；

图2为Poly2的电泳结果。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明的试剂说明：PCR采用Promega的taq酶(M7122)；RNA提取采用北京天根的植物RNA提取试剂盒(DP452)；反转录采用Promega的反转录试剂盒(Promega，A5001)；T7和sp6RNA聚合酶为NEB公司制备。

本发明中未特殊注明的试剂和方法均采用现有技术。

实施例1

一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，包括以下步骤：

步骤一、RNA标准品的制备

(1)体外转录载体的制备

利用多样本多克隆测序策略筛选病原的poly1和poly2保守区域和actin对照区域(桑树线虫传多面体病毒poly1：NC_038767.1；桑树线虫传多面体病毒poly2：KC904084.1)，体外合成具有间隔的复合序列SEQ ID NO.1，将该序列克隆至PGEX-4T-2EASY(Promega公司，A3610)上，得到体外转录载体PGEX-4T-2EASY-SEQ ID NO.1，其中克隆策略用的是5’EcoR I/Pst I 3’，获得体外转录载体。

体外转录载体的序列参见SEQ ID NO.1，如下：

CGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCCTTGCTGGTGCCTGG ATCGCGGCCATTTATTTTGCTGATAAAACCAATCGCTGTGATCTAGAAACTGGGAAGTTGCTGTGTGGTAACTTGGCTGGAAAGCAAGGTCATCAAATCTGCAAATGGTTTGATACCGAACTTCACGGTGACGTTACCTGGAAGGTTAGAGGTGATCCCCTCAAGTTTGGTAGAACCCGCATGATGCAACTTGGTTGGCGTTTTGTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCTCTTTTGTACAGCTAAGTTTATTTGTGTTTTGGTTTTTGGTTCTTTTGTTCCCAGCACTGCGCAGATGTGGAAAATGCATCATGTGGTTGTGACTGGAGGGGAAGCTGGCACGCAAGTGGTACTTGAATGATTATGAAAAGAATATCAACATGACCACGTGCGACATTTATGGAGTTACCGTTCGGAGGACTGGAAAGTCTTATGAAGAGCGGGAAATCCAATGGTGGAAGGTGCC AGGGTCCATAGTGTACCTCTTCCCTTTGATGTTCCCTTTGGGGCGGTTCCCAATGTCGGGCTTAAAGGAGCTCGTTTTATATGCCGCCCTATTGGAGGTGTTAAGGCACCCAAGGACTTTGCTGGGAAGTATGAATGTTTGATTCATCTTCTTG GTATTGAGGGTGAGAGTTTCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATT

波浪线下划线为EcoR I/Pst I切割位点GAATTC和CTGCAG；单下划线为定量引物位点；斜体(包括波浪线和单直线下划线部分)为反向互补引物位点；CGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGG和GTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATT为会在转录中出现的载体序列；双下划线为核酶切割位点，且GTC为T7正向切割。

(2)RNA标准品的制备

(2.1)T7体外转录酶

利用Nde I酶(NEB公司，R0111S)线性化重组载体PGEX-4T-2EASY-SEQ ID NO.1，并利用胶回收试剂盒纯化线性化的载体(TaKaRa胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0)，利用分光光度计进行定量(thermo，Multiskan Sky)，测定纯DNA浓度，Nco I酶切后回收的纯DNA浓度为96.85ng/μl。

利用T7 RNA聚合酶(NEB公司，M0251)对上述纯DNA转录，体外转录体系：5×buffer20μL，转录酶5μL，NTP(10mM)10μL，模板DNA 2μg，rnase抑制剂100U，水补齐至100μL。具体步骤参照转录试剂盒的操作要求执行，获得纯RNA。T7的转录长度为718nt，分子量为205G×345.2+156A×329.2+213U×306.2+144C×305.2+159(起点的三磷酸结构)＝231449.6g/mol。

将纯RNA与RNA保存液混合，得到RNA保存缓冲液，备用。

RNA保存液配方(2×)：100mM TCEP-HCl，甘油10mL/100mL，1-巯基甘油0.2mL/100mL，Tris-HCl 30mM，EDTA 20mM，溶剂为ddH₂O，pH 5.0。

(2.2)SP6体外转录酶

利用Nco I酶(NEB公司，R0193T)酶线性化重组载体PGEX-4T-2EASY-SEQ ID NO.1(Promega公司，A3610)，其余步骤同T7，测定纯DNA浓度，Nde I酶切后回收纯DNA浓度为97.65ng/μl。

利用SP6 RNA聚合酶(NEB公司，M0207)转录，具体步骤同T7，获得纯RNA。SP6的转录长度为723nt，分子量为137G×345.2+219A×329.2+161U×306.2+206C×305.2+159(起点的三磷酸结构)＝231715.6g/mol。

将纯RNA与RNA保存液混合，得到RNA保存缓冲液。

(2.3)将T7体外转录酶的RNA保存缓冲液中的RNA标准品利用无水乙醇沉淀后，75％无水乙醇洗涤3次，ddH₂O重悬，为RNA预标准品。利用分光光度计进行定量(thermo，Multiskan Sky)，测定RNA预标准品一浓度。

(2.4)参照上述步骤一(2.3)的方法对SP6体外转录酶的RNA保存缓冲液进行处理，得RNA预标准品二。

RNA预标准品一浓度为120.1ng/μl，RNA预标准品二浓度为111.2ng/μl。拷贝数(copies/μL)＝计算公式为：6×10²³(copies/μL)×RNA浓度(g/μL)/分子量MW(g/mol)。

所以，获得的RNA预标准品一拷贝数为3.11×10¹¹(copies/μL)，用ddH₂O稀释成1×10¹¹。RNA预标准品二拷贝数为2.88×10¹¹(copies/μL)，用ddH₂O稀释成1×10¹¹。使RNA预标准品一和RNA预标准品二重悬后的摩尔浓度相同，就是同样体积的拷贝一样。

然后将RNA预标准品一和RNA预标准品二1:1混合，因为在桑树中，也是以混合形式存在的，最终得到RNA标准品。

步骤二、提取健康和感染线虫传多面体病毒桑树叶片的总RNA。

健康桑树叶片是为了阴性对照和稀释标准RNA。感染桑树叶片是为了检验。由于是绝对定量，所以精准称取0.5g样本，并所有的试剂均严格按照说明书执行，所有步骤均平行3个重复，取平均值。

步骤三、反转录

(1)将RNA标准品与健康桑树总RNA(健康桑树叶片为沙2品种种子发芽后的试管苗叶片，种子不带病毒，用培养基培养获得)分别用无酶水调整为300ng/μl，然后调整后的分别按照1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷体积比例混合，混合物分别作为模板，利用反转录试剂盒进行反转录，反转录条件为：70℃，5min；然后冰浴，25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min；12℃保存。

得到7个标准反转录样品。其中RNA标准品作为定量内参标准品，用于分别检测桑树线虫传多面体病毒poly1和poly2的转录效率。

混合RNA利用随机引物逆转录，随机引物为Random6随机引物(试剂盒自带)序列为5’-NNNNNN-3’。

反转录体系按照说明书进行：RNA模板4μL；MgCl₂ 3μL；其它均为试剂盒说明书的固定添加量。

反转录后PCR条件为：94℃，3min；30个循环(94℃，30s；52℃，35s；72℃，1min)；72℃，5min；12℃保存。

(2)感染桑树线虫传多面体病毒桑树叶片的总RNA，作为模板，利用反转录试剂盒进行反转录，得到检测样反转录样品。反转录体系和条件参照步骤三(1)。

步骤四、定量检测

本研究中，健康桑树用了一个试管苗样本，步骤三到四提取了一次。感染桑树用了1个poly1和poly2感染样本，步骤三到四提取5次，5个重复，样品分别命名为V1-V5，为了检验引物那个好。健康桑树主要是为了阴性对照和稀释RNA标准品，相较于用水或者酵母的RNA来稀释，本研究用健康桑树更接近于真实的病毒环境；而感染桑树则是为了检测本发明的实用性，也是为了证明poly1和poly2的不同，证明了本发明的价值。

利用CFX Connect^TM荧光定量系统，使用Power

Green PCR Master Mix对步骤四(3)所得7个标准反转录样品(用于制作回归直线)和5个检测样反转录样品(V1-V5)中的poly1和poly2保守区域和桑树内参基因组进行定量PCR分析，其中步骤四(3)所得7个标准品反转录样品的定量结果用于制定标准品的标准曲线。标准曲线用于计算用于计算V1-V5，共5个样本的poly1和poly2含量。

定量引物为poly1的定量引物对为：

RT-6309P1F：5’-CTTGCTGGTGCCTGGAT-3’，SEQ ID NO.2；

RT-6309P1R：5’-CCAACCAAGTTGCATCATGCG-3’，SEQ ID NO.3；

或者RT-6309P2F：5’-CTGGCACGCAAGTGGTA-3’，SEQ ID NO.4；

RT-6309P2R：5’-GTACACTATGGACCCTGGCAC-3’，SEQ ID NO.5；

Poly2的定量引物对为：

RT-3279P1F：5’-GTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCT-3’，SEQ ID NO.6；

RT-3279P1R：5’-ACTTCCCCTCCAGTCACAAC-3’，SEQ ID NO.7；

或者RT-3279P2F：5’-CTCTTCCCTTTGATGTTCCCTT-3’，SEQ ID NO.8；

RT-3279P2R：5’-AAACTCTCACCCTCAATACC-3’，SEQ ID NO.9；

内参引物为：

actin F：5’-AGCAACTGGGATGACATGGA-3’，SEQ ID NO.10；

actin R：5’-CCAACACAATACCTGTTCAAAG-3’，SEQ ID NO.11。

需要说明的是，poly1与poly2的定量引物可以任意组合。内参基因、内参引物也可以替换为其他内参基因、其他内参引物，以能够定量poly1与poly2为准。

定量PCR反应体系如下：RT引物的浓度为10uM。

Power

定量PCR实验所使用的程序为：

1)95.0℃for 3min

2)95.0℃for 10s

3)55.0℃for 20s

4)72.0℃for 20s

5)75.0℃for 5s

+Plate Read

6)GOTO 2,40more times

7)Melt Curve 65.0to 95.0℃,increment 0.5℃,

0:05+Plate Read

8)结束

表1-2是不同引物的定量Ct结果。结果显示，actin的ct较为接近，极差小于1，符合实验要求。V1-V5的RNA起始浓度是300ng/μl，其Ct极差也是很小，小于1，证明重复性好。Ct值是平均数，这个都是每个样本3个重复，定量PCR都是这样做。本发明提供的引物定量Ct结果可以及用于计算poly1、poly2浓度。

表1标准反转录样品定量结果

表2检测反转录样品定量结果

表1证明了poly1和poly2在样本中的比例不一致，证明了该方案的重复性好，poly1的两个引物和poly2的两个引物均具有较好的扩增效果。根据表1-2的Ct值和标准曲线分别计算RNA浓度，再根据拷贝数计算公式6×10²³(copies/μL)×RNA浓度(g/μL)/分子量MW(g/mol)计算拷贝数，结果参见表3，说明本发明的方法可以分别精准的定量poly1、poly2的拷贝数。拷贝数之间的差异由大到小表现为：不同poly之间的差异>poly的不同引物对差异>同一引物对、同一poly在V1-V5之间的差异，说明了本专利的有益效果。

表3不同引物对检测到的拷贝数

步骤五、假阳性排除：

(1)利用PCR引物6309P1F/6309P1R和3279P1F/3279P2R分别对染病V1-V5的cDNA样品进行PCR。

假阳性排PCR除引物：F引物含有T7 RNA聚合酶切碱基，R引物含有sp6RNA聚合酶切碱基，酶切碱基参见单下划线部分，5’端ag为保护碱基。

6309P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGCTTGCTGGTGCCTGGAT-3’，SEQ ID NO.12；

6309P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGCCAACCAAGTTGCATCATGCG-3’，SEQ ID NO.13；

3279P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGCGTTTTGTTTTGGAGCCCACTTG-3’，SEQ ID NO.14；

3279P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGAAACTCTCACCCTCAATACC-3’，SEQ ID NO.15；

PCR体系：Power

Green PCR Master Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板2μL，蒸馏水补足25μL；

PCR条件：94℃，3min；30个循环(94℃，30s；55℃，45s；72℃，1min)；72℃，7min；12℃保存。

电泳回收的PCR产物，并利用体外转录试剂盒将PCR产物体外转录变成RNA。

(2)核酶体外切割并电泳检测。

核酶的DNA序列如SEQ ID NO.16或者SEQ ID NO.17所示：

SEQ ID NO.16：

5’-CAGATTTGATCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACCTTGCTTTtgtgttgCTTTAAGCCCCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACATTGGGAAtgtgttgACTTCACGGTCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACGTTACCTGtgtgttgGGCACCCAAGCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACTTTGCTGGCAGATTTGATCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACCTTGCTTTtgtgttgCTTTAAGCCCCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACATTGGGAAtgtgttgACTTCACGGTCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACGTTACCTGtgtgttgGGCACCCAAGCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACTTTGCTGG–CAGATTTGATCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACCTTGCTTTtgtgttgCTTTAAGCCCCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACATTGGGAAtgtgttgACTTCACGGTCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACGTTACCTGtgtgttgGGCACCCAAGCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACTTTGCTGG-3’。

SEQ ID NO.17(对应SEQ ID NO.16中部分序列)：

5’-CAGATTTGATCTGATGA

GaaA

GAAACCTTGCTTT

CTTTAAGCCCCTGATGA

GaaA

GAAACATTGGGAA

CAGATTTGATCTGATGA

GaaA

GAAACCTTGCTTT

CTTTAAGCCCCTGATGA

GaaA

GAAACATTGGGAA

CAGATTTGATCTGATGA

GaaA

GAAACCTTGCTTT

CTTTAAGCCCCTGATGA

GaaA

GAAACATTGGGAA

SEQ ID NO.16-17中：

5’-CAGATTTGATCTGATGA

GaaA

GAAACCTTGCTTT

3’用于切割SEQ ID NO.1中从左至右第一个双下划线GTC；5’-CTTTAAGCCCCTGATGA

GaaA

GAAACATTGGGAA

-3’用于切割SEQ ID NO.1中从左至右第二个双下划线GTC；

小写字母

是7nt的茎环结构，有利于核酶与靶序列的解离，双下划线的两部分序列反向互补，形成环；上述核酶DNA序列保存在被Nde I酶和Nco I酶线性化的载体PGEX-4T-2EASY中。核酶的切割位点为3个碱基，切割GUC(DNA对应的是gtc，反向DNA互补就是gac)，其中只有C不能突变，其他2个突变后仅仅影响切割效率，但仍能被检出。

上述DNA序列经体外转录成RNA，其中的T变为U，然后再用于酶切。体外转录体系：5×buffer 20μl、T7转录酶5μl、NTP(10mM)10μl、DNA 5μg，rnase抑制剂100U；水补齐至100μl。37℃反应2h。

体外切割体系：10×核酶切割缓冲液10μl，底物RNA的终浓度50pmol/μL(底物RNA浓度为500pmol/μL、加10μL)，DTT终浓度1g/100mL，rnasin(RNA酶抑制剂)终浓度4U/μL，终浓度10pmol/UL的核酶RNA(一般核酶RNA为500pmol/μL，所以加2μL)，ddH₂O补足至100μL。

10×核酶切割缓冲液的配方如下：Tris 400mM，Mgcl₂ 25mM，pH 7.2，溶剂为超纯水。

需要说明的是，本发明的假阳性排除体系中，底物RNA与核酶RNA的体积比例为1：1～10。底物RNA与核酶RNA的终浓度0.2～50pmol/μL均可以。

利用SEQ ID NO.16切割后产物的电泳结果参见图1-2，结果显示，除了核酶和扩增后体外转录的条带，还有比扩增小的，应该是两条，则证明发生了切割，排除假阳性。

实施例2

一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，与实施例1基本相同，区别在于，假阳性排除中，核酶的DNA序列如SEQ ID NO.16或者SEQ ID NO.18所示。

SEQ ID NO.18：

5’-ACTTCACGGTCTGATGA

GaaA

GAAACGTTACCTGtgtgttg

GGCACCCAAGCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACTTTGCTGG

ACTTCACGGTCTGATGA

GaaA

GAAACGTTACCTGtgtgttg

GGCACCCAAGCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACTTTGCTGG

ACTTCACGGTCTGATGA

GaaA

GAAACGTTACCTGtgtgttgGGCACCCAAGCTGATGA

GaaA

GAAACTTTGCTGG-3’

其中，

5’-ACTTCACGGTCTGATGA

GaaA

GAAACGTTACCTGtgtgttg-3’用于切割SEQ ID NO.1中从右至左第一个双下划线GAC(对应SP6部分转录产物)；

5’-GGCACCCAAGCTGATGAGTTCGaaAGAACGAAACTTTGCTGG-3’用于切割SEQ ID NO.1中从右至左第二个双下划线GAC(对应SP6部分转录产物)；

其中，小写字母tgtgttg是7nt的茎环结构，有利于核酶与靶序列的解离，双下划线的两部分序列反向互补，形成环；上述核酶DNA序列保存在被Nde I酶和Nco I酶线性化的载体PGEX-4T-2EASY中。核酶的切割位点为3个碱基，切割GUC(DNA对应的是gtc，反向DNA互补就是gac)，其中只有G不能突变，其他2个突变后仅仅影响切割效率，但仍能被检出。

上述是DNA序列，经体外转录体系：5×buffer 20ul；SP6转录酶5ul；NTP(10mM)10μl、DNA 5μg，rnase抑制剂100U；水补齐至100μl。37℃反应2h变成RNA，其中的T变为U，然后再用于酶切。

需要说明的是，上述实施例1-2中，SEQ ID NO.16包含了切割T7和sp6的，SEQ IDNO.17只包含切割T7的，SEQ ID NO.18只包含切割sp6的。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 安康学院

<120> 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 761

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaattgggc ccgacgtcgc atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga attccttgct 60

ggtgcctgga tcgcggccat ttattttgct gataaaacca atcgctgtga tctagaaact 120

gggaagttgc tgtgtggtaa cttggctgga aagcaaggtc atcaaatctg caaatggttt 180

gataccgaac ttcacggtga cgttacctgg aaggttagag gtgatcccct caagtttggt 240

agaacccgca tgatgcaact tggttggcgt tttgttttgg agcccacttg ttccctcttt 300

tgtacagcta agtttatttg tgttttggtt tttggttctt ttgttcccag cactgcgcag 360

atgtggaaaa tgcatcatgt ggttgtgact ggaggggaag ctggcacgca agtggtactt 420

gaatgattat gaaaagaata tcaacatgac cacgtgcgac atttatggag ttaccgttcg 480

gaggactgga aagtcttatg aagagcggga aatccaatgg tggaaggtgc cagggtccat 540

agtgtacctc ttccctttga tgttcccttt ggggcggttc ccaatgtcgg gcttaaagga 600

gctcgtttta tatgccgccc tattggaggt gttaaggcac ccaaggactt tgctgggaag 660

tatgaatgtt tgattcatct tcttggtatt gagggtgaga gtttctgcag gtcgaccata 720

tgggagagct cccaacgcgt tggatgcata gcttgagtat t 761

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttgctggtg cctggat 17

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaaccaagt tgcatcatgc g 21

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggcacgca agtggta 17

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtacactatg gaccctggca c 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttttggagc ccacttgttc cct 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acttcccctc cagtcacaac 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctcttccctt tgatgttccc tt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaactctcac cctcaatacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcaactggg atgacatgga 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccaacacaat acctgttcaa ag 22

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agtaatacga ctcactatag ggcttgctgg tgcctggat 39

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agatttaggt gacactatag ccaaccaagt tgcatcatgc g 41

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agtaatacga ctcactatag ggcgttttgt tttggagccc acttg 45

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agatttaggt gacactatag aaactctcac cctcaatacc 40

<210> 16

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cagatttgat ctgatgagtt cgaaagaacg aaaccttgct tttgtgttgc tttaagcccc 60

tgatgagttc gaaagaacga aacattggga atgtgttgac ttcacggtct gatgagttcg 120

aaagaacgaa acgttacctg tgtgttgggc acccaagctg atgagttcga aagaacgaaa 180

ctttgctggc agatttgatc tgatgagttc gaaagaacga aaccttgctt ttgtgttgct 240

ttaagcccct gatgagttcg aaagaacgaa acattgggaa tgtgttgact tcacggtctg 300

atgagttcga aagaacgaaa cgttacctgt gtgttgggca cccaagctga tgagttcgaa 360

agaacgaaac tttgctggca gatttgatct gatgagttcg aaagaacgaa accttgcttt 420

tgtgttgctt taagcccctg atgagttcga aagaacgaaa cattgggaat gtgttgactt 480

cacggtctga tgagttcgaa agaacgaaac gttacctgtg tgttgggcac ccaagctgat 540

gagttcgaaa gaacgaaact ttgctgg 567

<210> 17

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagatttgat ctgatgagtt cgaaagaacg aaaccttgct tttgtgttgc tttaagcccc 60

tgatgagttc gaaagaacga aacattggga atgtgttgca gatttgatct gatgagttcg 120

aaagaacgaa accttgcttt tgtgttgctt taagcccctg atgagttcga aagaacgaaa 180

cattgggaat gtgttgcaga tttgatctga tgagttcgaa agaacgaaac cttgcttttg 240

tgttgcttta agcccctgat gagttcgaaa gaacgaaaca ttgggaatgt gttg 294

<210> 18

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acttcacggt ctgatgagtt cgaaagaacg aaacgttacc tgtgtgttgg gcacccaagc 60

tgatgagttc gaaagaacga aactttgctg gacttcacgg tctgatgagt tcgaaagaac 120

gaaacgttac ctgtgtgttg ggcacccaag ctgatgagtt cgaaagaacg aaactttgct 180

ggacttcacg gtctgatgag ttcgaaagaa cgaaacgtta cctgtgtgtt gggcacccaa 240

gctgatgagt tcgaaagaac gaaactttgc tgg 273

Claims

1.一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，其特征在于，包括：

步骤一、RNA标准品的制备

体外合成具有间隔的体外转录载体，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；

利用T7体外转录酶转录SEQ ID NO. 1的序列，测定其浓度，得RNA预标准品一；

利用SP6体外转录酶转录SEQ ID NO. 1的序列，测定其浓度，得RNA预标准品二；

将RNA预标准品一和RNA预标准品二混合，最终得到RNA标准品；

步骤三、反转录

将步骤一的RNA标准品与步骤二的健康桑树总RNA按照1 : 10¹ ~ 10⁶体积比例混合后作为模板，反转录，得到标准品反转录样品；

步骤四、定量检测

poly1的定量引物为：

RT-6309P1F：5’-CTTGCTGGTGCCTGGAT-3’

RT-6309P1R：5’-CCAACCAAGTTGCATCATGCG-3’

或者RT-6309P2F：5’-CTGGCACGCAAGTGGTA-3’

RT-6309P2R：5’-GTACACTATGGACCCTGGCAC-3’

Poly2的定量引物为：

RT-3279P1F：5’-GTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCT-3’

RT-3279P1R：5’-ACTTCCCCTCCAGTCACAAC-3’

或者

RT-3279P2F：5’-CTCTTCCCTTTGATGTTCCCTT-3’

RT-3279 P2R：5’-AAACTCTCACCCTCAATACC-3’

内参引物为：

actin F：5’-AGCAACTGGGATGACATGGA-3’

actin R：5’ -CCAACACAATACCAGTTGTAC-3’；

步骤五、假阳性排除

利用带有启动子的引物对步骤三所得检测样反转录样品进行PCR；电泳回收PCR产物，体外转录，核酶体外切割并电泳检测；当步骤四和步骤五的检测结果吻合，则证明步骤四的poly1和poly2含量计算结果为精准定量；

假阳性排除所用PCR引物为

6309P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGCTTGCTGGTGCCTGGAT-3’

6309P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGCCAACCAAGTTGCATCATGCG-3’

和3279P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGGTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCT-3’

3279P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGAAACTCTCACCCTCAATACC-3’；

核酶的DNA序列如SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17或SEQ ID NO. 18所示。

2.根据权利要求1所述的桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，其特征在于，步骤一中T7或SP6体外转录酶转录产物分别保存在RNA保存液中，使用时，通过乙醇溶液沉淀、洗涤其中的RNA，ddH₂O重悬，得到相应的RNA预标准品；

RNA保存液配方2×：100mM TCEP-HCl，甘油10mL/100mL，1-巯基甘油0.2 mL/100mL，Tris-HCl 30mM，EDTA 20mM，溶剂为ddH₂O，pH 5.0。

3.根据权利要求2所述的桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，其特征在于，RNA预标准品一和RNA预标准品二重悬后的摩尔浓度相同，且二者按照1:1的体积混合。

4.根据权利要求1所述的桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，其特征在于，荧光定量体系为：Power SYBR® Green PCR Master Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、内参引物F /R各1μL、模板2μL，蒸馏水补足25μL。

5.根据权利要求4所述的桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，其特征在于，体外切割体系：10×核酶切割缓冲液 10μl，底物RNA的终浓度0.2 ~ 50 pmol/μL，DTT终浓度1g/100mL，rnasin终浓度4U/μL，核酶RNA终浓度0.2 ~ 50 pmol/μL，ddH₂O补足至100μL。

6.根据权利要求5所述的桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法，其特征在于，底物RNA与核酶RNA的体积比例为1：1 ~ 10。