CN117844767A - 神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了神经坏死病毒蛋白B2在促进病毒在细胞内增殖中的应用。本发明通过在哺乳动物细胞中过表达神经坏死病毒B2蛋白发现,B2蛋白能够抑制细胞的先天性免疫,协助病毒增殖。即可以利用神经坏死病毒B2蛋白,在多种病毒的培养过程中对宿主细胞进行预处理后再感染病毒,从而提高病毒产率。由此,本发明提供了神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用以及一种促进病毒在细胞内增殖的方法。本发明不仅有助于病毒的增殖,也有助于拓展病毒培养的宿主细胞系,使病毒的增殖不再受限于特定的高敏感细胞。

Description

神经坏死病毒蛋白B2在促进病毒在细胞内增殖中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地,涉及神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
背景技术
病毒是一种可以利用宿主细胞进行复制的微小、无完整细胞结构的亚显微粒子,主要由核酸和蛋白质外壳组成。因病毒感染引起的疾病种类繁多,而研究病毒的感染机理,揭示其与宿主免疫系统之间的相互作用情况,有利于病毒性疾病的防治。目前,实验室培养病毒的方法中,需先培养对所要培养的病毒敏感的细胞系,然后对培养好的细胞进行攻毒,培养至细胞出现明显病变并破碎后,裂解细胞收取上清液进行纯化。但此方法并不适用于一些尚未发现其高敏感细胞的病毒,需先耗费较多的人力和物力进行高敏感细胞的筛选。即使可以借助某些细胞进行增殖,病毒产率也不理想。因此,需要提供一种能够提高细胞对病毒的敏感度,拓展病毒培养的宿主细胞系,促进病毒增殖的方法。
鱼类病毒性神经坏死病(Viral nervous necrosis,VNN)是一种危害性极高的鱼类疾病,病原为β野田村病毒(Betanodavirus),现称为神经坏死病毒(Nervous necrosisvirus,NNV)。野田村病毒是一类大小为25~30nm的RNA病毒,由衣壳蛋白包裹基因组构成,无囊膜。基因组由两条单链RNA(RNA1和RNA2)组成,RNA1的分子量为3.0~3.2kb,主要编码非结构蛋白,包括蛋白A(Protein A)。病毒入侵后的早期阶段,RNA1大量表达产生ProteinA,复制病毒的基因组。同时,RNA1复制过程中,在其3’末端会产生小分子的亚基因组RNA3,编码非结构蛋白,包括B1和B2。RNA2的分子量为1.3~1.4kb,编码病毒的衣壳蛋白(Capsidprotein,CP)。病毒入侵后的后期阶段,RNA2大量表达产生CP蛋白。
现有研究发现,神经坏死病毒B2蛋白作为病毒复制增殖过程中的早期表达蛋白,参与了NNV的早期感染,但B2蛋白的具体功能尚不清楚。此外,NNV感染的主要是鱼类细胞,对于其他类型的细胞以及病毒,B2蛋白会有怎样的效果也未可知。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的技术问题,提供了神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。通过在细胞中过表达所述神经坏死病毒B2蛋白,可以抑制细胞的免疫反应,从而促进病毒增殖。所述方法能够提高细胞对病毒的敏感度,拓展病毒培养的宿主细胞系,使病毒的增殖不再受限于特定的高敏感细胞。
本发明的第一个目的是提供神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
本发明的第二个目的是提供神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种促进病毒在细胞内增殖的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明发现,通过在哺乳动物细胞中过表达神经坏死病毒(NNV)的B2蛋白,能够抑制细胞(病毒宿主)的先天性免疫,协助病毒增殖。即可以利用神经坏死病毒B2蛋白,在多种病毒的培养过程中先对宿主细胞进行预处理再感染待培养的病毒,从而提高病毒产率。因此,本发明请求保护神经坏死病毒B2蛋白的以下应用。
本发明请求保护神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
具体地,所述应用为神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进除神经坏死病毒(Nervous necrosisvirus,NNV)外的其它病毒在细胞内增殖中的应用。
本发明还请求保护神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
具体地,所述应用为神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进除神经坏死病毒外的其它病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
具体地,所述神经坏死病毒B2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体地,所述能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂包括能够表达所述神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒。
具体地,所述病毒为RNA病毒。更具体地,所述病毒为水疱性口炎印第安纳州病毒(Vesiculovirus,VSV)。
具体地,所述细胞为哺乳动物细胞。
更具体地,所述细胞为人胚胎肾上皮细胞或人宫颈腺癌细胞。
作为其中的一个实施例,本发明以人胚胎肾上皮细胞(HEK-293T)和人宫颈腺癌细胞(Hela)为宿主细胞,基于真核细胞密码子偏好性,针对编码神经坏死病毒B2蛋白的基因进行了密码子优化,通过克隆、酶切和连接,构建得到了含优化后的表达神经坏死病毒B2蛋白的基因序列的重组表达质粒,通过将所述重组表达载体转染至宿主细胞,促进了宿主细胞内水疱性口炎印第安纳州病毒的增殖。
具体地,构建重组表达质粒所用载体为pEGFP-N3或pN3-FLAG。所述pN3-FLAG是将pEGFP-N3载体的绿色荧光蛋白序列替换为FLAG标签序列得到。
具体地,基于真核细胞密码子偏好性进行密码子优化所得的编码神经坏死病毒B2蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种促进病毒在细胞内增殖的方法,所述方法为:在宿主细胞内过表达神经坏死病毒B2蛋白后再感染病毒。
具体地,所述过表达神经坏死病毒B2蛋白的方法为:构建神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒并转染至宿主细胞;或将神经坏死病毒B2蛋白与细胞穿膜肽进行融合表达所得的融合蛋白与宿主细胞共培养。将神经坏死病毒B2蛋白与细胞穿膜肽进行融合表达,可使所得融合蛋白具有穿过细胞膜的能力,从而将B2蛋白带入宿主细胞。
具体地,所述病毒为RNA病毒。
更具体地,所述病毒为水疱性口炎印第安纳州病毒(Vesiculovirus,VSV)。
具体地,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
更具体地,所述宿主细胞为人胚胎肾上皮细胞或人宫颈腺癌细胞。
具体地,构建重组表达质粒所用载体为pEGFP-N3或pN3-FLAG。
本发明具有以下有益效果:
本发明通过在哺乳动物细胞中过表达神经坏死病毒B2蛋白发现,B2蛋白能够抑制哺乳动物细胞的先天性免疫,协助病毒增殖。即可以利用神经坏死病毒B2蛋白,在多种病毒的培养过程中对宿主细胞进行预处理后再感染病毒,从而提高病毒产率。由此,本发明提供了神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用以及一种促进病毒在细胞内增殖的方法。本发明不仅有助于病毒的增殖,也有助于拓展病毒培养的宿主细胞系,使病毒的增殖不再受限于特定的高敏感细胞。
附图说明
图1为转录组差异基因的实时定量荧光PCR(RT-qPCR)验证结果;图中的A为转录组下调基因的RT-qPCR验证结果;图中的B为转录组上调基因的RT-qPCR验证结果。
图2为B2蛋白(B2O)抑制细胞基因mRNA表达水平的检测结果;图中的A为B2蛋白抑制HEK-293T的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图中的B为B2蛋白抑制Hela的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图中的C为B2蛋白抑制HEK-293T的IFITM1基因mRNA表达水平的检测结果;图中的D为B2蛋白抑制HEK-293T的RNPC3基因mRNA表达水平的检测结果;图中的E为B2蛋白抑制HEK-293T的CREB1基因mRNA表达水平的检测结果;图中的F为B2蛋白抑制HEK-293T的ZBTB21基因mRNA表达水平的检测结果。
图3为B2蛋白对哺乳动物细胞内源蛋白表达的影响结果。
图4为B2蛋白对外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果;图中的A为B2蛋白对HEK-293T中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果;图中的B为B2蛋白对Hela中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果。
图5为B2蛋白对HEK-293T细胞免疫的影响结果;图中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后IFN-β基因mRNA表达水平;图中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP基因mRNA表达水平;图中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP蛋白表达水平;图中的D为VSV-GFP感染HEK-293T后的镜检情况;图中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染HEK-293T后荧光标记细胞数量;图中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
图6为B2蛋白对Hela细胞免疫的影响结果;图中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后IFN-β基因mRNA表达水平;图中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP基因mRNA表达水平;图中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP蛋白表达水平;图中的D为VSV-GFP感染Hela后的镜检情况;图中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染Hela后荧光标记细胞数量;图中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
图中EV指空质粒;图中**,p<0.01;*,p<0.05;T检验。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1在细胞中转染B2蛋白对细胞RNA表达水平的影响
本发明以水疱性口炎印第安纳州病毒(Vesiculovirus,VSV)的增殖为例进行说明。为便于观察,本发明所用VSV为重组病毒(VSV-GFP),即在VSV的G基因下游插入了GFP基因,使其在细胞内的基因表达阶段能产生绿色荧光蛋白,GFP蛋白可作为感染标志物。
本发明所用细胞为人胚胎肾上皮细胞(HEK-293T细胞系)和人宫颈腺癌细胞(Hela细胞系)。培养细胞所用培养基为DEME培养基。
试验过程如下:
1、细胞的复苏、传代和冻存
细胞复苏:将冻存的细胞从液氮罐中取出后,迅速置于37℃水浴条件搅拌解冻,加入含20%胎牛血清(FBS)的培养基混匀,离心后吸弃上清,用新鲜的含20% FBS的培养基重悬细胞,加入培养瓶培养。
细胞传代:吸弃原培养基,加少量无血清培养基润洗细胞30s后吸弃,加含0.02%EDTA的0.25%胰酶(赛默飞,货号25200056)消化2~5分钟至细胞脱落,加入等体积的含10% FBS的培养基终止消化;离心后吸弃上清,用含10%FBS的培养基重悬细胞,加入培养瓶培养。
细胞冻存:按DMSO:血清:DEME培养基的体积比为1:2:7的比例提前配制冻存液;吸弃原培养基,加少量无血清培养基润洗细胞30s后吸弃,加入胰酶消化2~5分钟至细胞脱落,加入等体积含10% FBS培养基终止消化;离心后吸弃上清,加入冻存液重悬细胞后,吸入细胞螺纹冻存管,放置在梯度将温盒中,放在-80℃冰箱梯度降温,24h后转移至液氮罐长期保存。
2、真核表达载体的构建
为提高B2蛋白在真核细胞中的表达量,本发明以OGNNV b2原始序列(Genbank IDMG874757)为模板进行了优化,此过程委托通用生物(安徽)股份有限公司完成,优化后的基因命名为b2o,对应的蛋白命名为B2O。基因b2o的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
以合成所得b2o基因为模板,经PCR克隆、酶切后连接至pEGFP-N3或pN3-FLAG真核表达载体中,构建得到重组表达质粒B2O-EGFP/B2O-FLAG。所述pN3-FLAG真核表达载体是将pEGFP-N3(Invitrogen)载体的绿色荧光蛋白序列替换为FLAG标签序列得到,由此可在目的蛋白C端添加FLAG标签。PCR克隆所用引物如下所示:
B2O-Hind III-F:CTCAAGCTTGCCACCATGGAGCAGATCCAGCAGGC
B2O-Kpn I-R:CGCGGTACCATCTGTCTCCATAGGCTCCTCGATC
根据TOYOBO公司的KOD FX说明书配制PCR反应体系,扩增获得目的基因片段后,按照OMEGA公司胶回收试剂盒说明书纯化回收DNA。按照引物设计的酶切位点(Hind III和KpnI)使用相应限制性内切酶,根据Thermo Fisher公司的FastDigest快速内切酶说明书,配制对应的酶切体系,分别对回收的DNA(PCR扩增产物)和pN3-FLAG真核表达载体进行双酶切。将反应体系涡旋混匀后,37℃孵育1h,按照OMEGA公司的胶回收试剂盒说明书纯化回收DNA。根据Thermo Fisher公司的T4 DNA Ligase说明书,酶切产物回收纯化后,配制连接体系,将反应体系涡旋混匀,22℃孵育4h。连接反应结束后,将连接产物(重组表达质粒B2O-FLAG)转化感受态细菌,筛选阳性转化子进行PCR验证和测序,保存测序正确的阳性转化子和质粒进行后续实验。
本发明同时构建了b2o的RNA结合位点缺失突变体b2o-R53&60A,所述缺失突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。与B2O的氨基酸序相比,所述突变体b2o-R53&60A的第53和60位的氨基酸R变为了A。用于表达所述突变体b2o-R53&60A的重组表达质粒为B2O-R53&60A-FLAG。
3、细胞转染质粒
(1)提前18~24h铺板细胞,待密度达到60%~90%时转染;
(2)按照1μg质粒:3μL转染试剂,无血清培养基稀释质粒至10ng/μL的原则配制转染体系,轻轻混匀;
(3)室温孵育20min,加入细胞孵育,3~4h后换含10% FBS培养基继续培养。
4、病毒感染
(1)提前18~24h铺板细胞,待密度达到60%~90%时攻毒;
(2)从-80℃冰箱取出病毒液置于冰上融化,吸弃原培养基,用含5% FBS培养基按照比例稀释病毒液,加入细胞培养瓶孵育2h后吸走病毒液,换含5%FBS培养基继续培养。
5、实时定量荧光PCR(RT-qPCR)验证转录组分析结果
此前,本发明对转染了B2基因的HEK-293T细胞进行了转录组学分析,从中筛选出89个显著差异基因,根据GO分析结果,从中挑选出与细胞免疫、凋亡、表达功能相关基因28个。为验证转录组分析结果,本发明在HEK-293T中转染了重组表达质粒B2O-FLAG,转染空质粒(pN3-FLAG)作为对照组,转染后24h收细胞提取RNA,反转录后通过RT-qPCR实验测定上述28个候选基因的mRNA表达水平,对应的RT-qPCR引物序列如表1所示。
表1实时定量荧光PCR引物序列
RT-qPCR实验过程如下:
(1)按照Promega公司的RNA提取试剂盒提取细胞RNA;按照艾科瑞生物工程有限公司Evo M-MLV RT Premix for qPCR试剂盒说明书将提取得到的RNA逆转录成cDNA,稀释5倍后,保存于-20℃备用;
(2)用Primer-BLAST软件设计引物,扩增长度为80~150bp,Tm值为60℃,并检验物种特异性;设计并检验所得的引物如表1所示;
(3)根据Green Pro Taq HS qPCR试剂盒说明书配制RT-qPCR反应体系;
(4)将体系混匀后加入384孔定量板,每个样本3个重复孔,以β-actin基因为内参,离心后上机;
(5)根据Green Pro Taq HS qPCR试剂盒说明书在Roche Light Cycler480Ⅱ按照以下程序进行PCR反应;
(6)定量仪通过检测荧光变化得到ct值,按以下方式计算目标基因相对表达量:
ΔCt(目标基因-β-actin)=Ct(目标基因)-Ct(β-actin)
ΔCt(Vec-β-actin)=Ct(Vec)-Ct(β-actin)
-ΔΔCt(目标基因-β-actin)=ΔCt(Vec-β-actin)-ΔCt(目标基因-β-actin)
目标基因相对表达量=2-ΔΔCt(目标基因-β-actin)
转录组差异基因的实时定量荧光PCR验证结果如图1所示;图1中的A为转录组下调基因的RT-qPCR验证结果;图1中的B为转录组上调基因的RT-qPCR验证结果。由图1中的A可知,在挑选的10个在转录组中显著下调的基因(RNPC3、CREB1、JUN、HOXA11、TRAF1D、FOXD2、LARP4、RNR2、SNORD30、ZBTB21)中,有7个基因在RT-qPCR实验结果中显示为mRNA表达显著受抑制(RNPC3、CREB1、JUN、TAF1D、LARP4、RNR2、ZBTB21)。然而,挑选出的18个在转录组中显著上调的基因(ECT2、TP53BP1、TRPM7、LRRC8C、NFKBIA、TGFBR3、UPF2、WDR35、ATF2、PPP2R1A、IFI27L1、IFI27L2、SEC62、RAB34、RILPL2、ZDHHC20、PALLD、H2BC12)中,在RT-qPCR实验中则显示出与转录组数据不相符的结果。18个在转录组中上调的基因中,只有NFKBIA(编码IκB蛋白)这1个基因在RT-qPCR实验中mRNA表达显著上调,有4个基因的表达显著下调(TP53BP1、TRPM7、WDR35、SEC62),其余13个基因表达量无显著变化(图1中的B)。由此可见,B2蛋白普遍抑制了HEK-293T细胞中基因的表达。
此外,本发明在转录组学分析的下调基因中,筛选出IFN-β、干扰素诱导跨膜蛋白1(Interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)、含RNA结合区蛋白3(RNA-binding region-containing protein 3,RNPC3)、cAMP响应元件结合蛋白1(Cyclic AMP-responsive element-binding protein 1,CREB1)、含锌指和BTB结构域蛋白21(Zincfinger and BTB domain containing protein 21,ZBTB21),这5个稳定下调基因,作为B2抑制基因表达的检测目标,从RNA水平检测B2蛋白的抑制效应。
同时,为检测哺乳动物细胞激活免疫反应状态时,B2蛋白抑制细胞RNA表达水平的能力,使用dsRNA类似物Poly(I:C)模拟细胞检测到的病毒dsRNA,在HEK-293T、Hela细胞中同时转染dsRNA类似物Poly(I:C)和重组表达质粒B2O-FLAG,设置单一转染组和空质粒对照组,转染后24h收细胞并提取细胞RNA,反转录后通过RT-qPCR检测上述5个基因的mRNA表达水平,RT-qPCR检测所用引物如表1所示。
B2蛋白抑制细胞基因mRNA表达水平的检测结果如图2所示;图2中的A为B2蛋白抑制HEK-293T的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图2中的B为B2蛋白抑制Hela的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图2中的C~F依次为B2蛋白抑制HEK-293T的IFITM1、RNPC3、CREB1和ZBTB21基因mRNA表达水平的检测结果。由图2可知,Poly(I:C)成功激活了HEK-293T和Hela细胞的RLR通路(是抗病毒天然免疫反应中机体抵抗RNA病毒感染的重要途径),刺激IFN-β表达上调,但会被B2蛋白显著抑制。HEK-293T和Hela细胞相比,HEK-293T对Poly(I:C)刺激更敏感。在HEK-293T细胞中,IFITM1受Poly(I:C)刺激后表达上调但会被B2蛋白抑制。其余基因,RNPC3、CREB1、ZBTB21的表达量不受Poly(I:C)影响但也会被B2蛋白显著抑制。
实施例2在细胞中转染B2蛋白对细胞内源蛋白表达水平的影响
为检测B2蛋白抑制哺乳动物细胞内源蛋白表达的能力,在HEK-293T细胞中同时转染Poly(I:C)和B2O-EGFP真核表达质粒,设置单一Poly(I:C)转染组和空质粒(pEGFP-N3)对照组,转染后24h收细胞,使用带蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞,利用WB实验检测内源RLR通路蛋白ZNFX1、RIG-I、MDA5、IRF3及磷酸化TBK1、磷酸化IRF3的蛋白量水平。
B2蛋白(B2O)对哺乳动物细胞内源蛋白表达的影响结果如图3所示。由图3可知,在Poly(I:C)刺激下,HEK-293T细胞RLR通路蛋白ZNFX1、RIG-I和MDA5的表达量以及TBK1、IRF3的磷酸化显著上调。若在此基础上转染B2蛋白,被Poly(I:C)上调的ZNFX1、RIG-I蛋白表达量、磷酸化IRF3蛋白量会被抑制(图中被标记为红色)。IRF3蛋白表达量不受Poly(I:C)和B2蛋白的影响。
以上结果表明,在病毒感染过程中,B2蛋白能抑制被dsRNA激活的RLR通路,通过抑制IRF3的磷酸化水平而不是其蛋白表达水平来抑制I型IFN的表达,并抑制IFN对ZNFX1、RIG-I等ISGs的正反馈调节,进一步抑制RLR通路。
实施例3在细胞中转染B2蛋白对细胞外源蛋白表达水平的影响
为检测B2蛋白抑制哺乳动物细胞外源蛋白表达的能力,在HEK-293T细胞中同时转染pRL-CMV(pRL-CMV是一个使用来源于人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)的CMV强启动子起始转录报告基因海参荧光素酶(Luciferase from Renilla reniformis,Rluc)的真核表达质粒,常用于在双荧光素酶报告基因实验中作为内参报告基因表达质粒,质粒购买于Promega公司)和B2O-FLAG,设置空质粒对照组,转染后24h和48h收细胞,使用PromegaDual-Reporter Assay System试剂盒中的细胞裂解液裂解细胞,用酶标仪检测外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平。另在Hela细胞中同时转染pRL-CMV和B2O-FLAG或B2O-R53&60A-FLAG,设置空质粒对照组,转染后24h收细胞,用酶标仪检测外源CMV启动子起始转录的Rluc表达水平。
B2蛋白对外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果如图4所示;图4中的A为B2蛋白对HEK-293T中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果;图4中的B为B2蛋白对Hela中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果。由图4可知,在时序转染实验中,B2蛋白显著抑制HEK-293T细胞中CMV启动子起始转录的Rluc表达,48h时的抑制能力相比于24h显著减弱。在突变体转染实验中,B2蛋白同样显著抑制Hela细胞中CMV启动子起始转录的Rluc表达,B2蛋白的RNA结合位点缺失突变体的抑制能力显著减弱。
实施例4活病毒水平检测B2蛋白对细胞免疫的影响
在HEK-293T细胞中同时转染Poly(I:C)和B2O-FLAG,设置单一转染组和空质粒对照组,转染后6h加入MOI=2.25×10-2的VSV-GFP,18h后收细胞。细胞样分成3组分别用于以下实验:提取RNA,反转录后通过RT-qPCR实验测定IFN-β、EGFP的mRNA表达水平;使用WB实验检测EGFP蛋白表达量;使用细胞流式术分析细胞荧光比例,依此推算感染率。
B2蛋白对HEK-293T细胞免疫的影响结果如图5所示;图5中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后IFN-β基因mRNA表达水平;图5中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP基因mRNA表达水平;图5中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP蛋白表达水平;图5中的D为VSV-GFP感染HEK-293T后的镜检情况;图5中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染HEK-293T后荧光标记细胞数量;图5中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
由图5可知,在无Poly(I:C)刺激的实验组中,过表达B2蛋白显著抑制IFN-β、EGFP两个基因mRNA表达,但并不影响EGFP蛋白的表达量,最终显著提高HEK-293T细胞的VSV-GFP感染率。HEK-293T细胞经Poly(I:C)刺激后,IFN-β的表达显著上调,表明HEK-293T细胞的先天性免疫系统被激活,EGFP的mRNA、蛋白水平以及VSV-GFP感染率显著降低。当HEK-293T细胞同时转染Poly(I:C)和过表达B2O,在IFN-β表达相比转染Poly(I:C)对照组没有明显变化的情况下,EGFP的mRNA水平和VSV-GFP感染率恢复空白对照组水平,但是EGFP的蛋白水平仍受抑制。上述结果表明,在哺乳动物细胞过表达B2蛋白能协助VSV-GFP增殖。
为探究在不同哺乳动物细胞中的适用性,本发明在Hela细胞中重复VSV-GFP攻毒实验。同时,为验证B2蛋白的RNA结合位点对B2蛋白抑制细胞免疫功能的关键作用,引入B2蛋白的RNA结合位点突变体B2O-R53&60A进行平行实验。
在Hela细胞中同时转染Poly(I:C)和B2O-FLAG或B2O-R53&60A-FLAG质粒,设置单一转染组和空质粒对照组,转染后6h加入MOI=2.25×10-2的VSV-GFP,18h后收细胞。细胞样分成3组分别用于以下实验:提取RNA,反转录后通过RT-qPCR实验测定IFN-β、EGFP的mRNA表达水平;使用WB实验检测EGFP蛋白表达量;使用细胞流式术分析细胞荧光比例,依此推算感染率。
B2蛋白对Hela细胞免疫的影响结果如图6所示;图6中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后IFN-β基因mRNA表达水平;图6中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP基因mRNA表达水平;图6中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP蛋白表达水平;图6中的D为VSV-GFP感染Hela后的镜检情况;图6中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染Hela后荧光标记细胞数量;图6中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
由图6可知,过表达B2蛋白显著提高了Hela细胞的VSV-GFP感染率。当Hela细胞经过Poly(I:C)刺激后,EGFP的mRNA、蛋白水平以及VSV-GFP感染率显著降低。当Hela细胞同时转染Poly(I:C)和过表达B2蛋白,相比仅转染Poly(I:C)的对照组,EGFP的mRNA、蛋白水平以及VSV-GFP感染率显著提高。此外,B2O-R53&60A处理组的结果介于B2蛋白处理和对照组之间,这说明B2蛋白的RNA结合位点对B2蛋白抑制细胞免疫功能起重要作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
2.神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述神经坏死病毒B2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂包括能够表达所述神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒。
5.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述病毒为RNA病毒。
6.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述细胞为哺乳动物细胞。
7.一种促进病毒在细胞内增殖的方法,其特征在于,所述方法为:在宿主细胞内过表达神经坏死病毒B2蛋白后再感染病毒。
8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述过表达神经坏死病毒B2蛋白的方法为:构建神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒并转染至宿主细胞;或将神经坏死病毒B2蛋白与细胞穿膜肽进行融合表达所得的融合蛋白与宿主细胞共培养。
9.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述病毒为RNA病毒。
10.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
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