CN117844767A - 神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 - Google Patents
神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117844767A CN117844767A CN202410073831.5A CN202410073831A CN117844767A CN 117844767 A CN117844767 A CN 117844767A CN 202410073831 A CN202410073831 A CN 202410073831A CN 117844767 A CN117844767 A CN 117844767A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- cells
- virus
- nervous necrosis
- necrosis virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001492212 Striped Jack nervous necrosis virus Species 0.000 title claims abstract description 53
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 title abstract description 11
- 101710132618 Protein B2 Proteins 0.000 title abstract description 3
- 101710201789 Ribonucleoside-diphosphate reductase 1 subunit beta Proteins 0.000 title abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 137
- 101710151325 B2 protein Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 68
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 74
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 5
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 abstract description 12
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 32
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 20
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 20
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 9
- 241000711973 Vesicular stomatitis Indiana virus Species 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 102100026359 Cyclic AMP-responsive element-binding protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 description 6
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 6
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 6
- -1 TRAF1D Proteins 0.000 description 6
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 101000855516 Homo sapiens Cyclic AMP-responsive element-binding protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100030090 Probable ATP-dependent RNA helicase DHX58 Human genes 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 206010001197 Adenocarcinoma of the cervix Diseases 0.000 description 4
- 208000034246 Adenocarcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 description 4
- 102100037435 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Human genes 0.000 description 4
- 101710127675 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 101000743795 Homo sapiens NFX1-type zinc finger-containing protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 4
- 102100040021 Interferon-induced transmembrane protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100039043 NFX1-type zinc finger-containing protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 201000006662 cervical adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 102100026085 RNA-binding region-containing protein 3 Human genes 0.000 description 3
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 101100302211 Arabidopsis thaliana RNR2A gene Proteins 0.000 description 2
- 241001279887 Betanodavirus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101001034844 Homo sapiens Interferon-induced transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001138020 Homo sapiens La-related protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000961071 Homo sapiens NF-kappa-B inhibitor alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000692148 Homo sapiens RNA-binding region-containing protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000665442 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TBK1 Proteins 0.000 description 2
- 101000844518 Homo sapiens Transient receptor potential cation channel subfamily M member 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000743195 Homo sapiens WD repeat-containing protein 35 Proteins 0.000 description 2
- 101000818575 Homo sapiens Zinc finger and BTB domain-containing protein 21 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 101710087399 Interferon-induced transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100020861 La-related protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000025443 POZ domain binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091014659 POZ domain binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 101150084101 RNA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150002896 RNR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 101100353432 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100038192 Serine/threonine-protein kinase TBK1 Human genes 0.000 description 2
- 102000003611 TRPM7 Human genes 0.000 description 2
- 108010041385 Tumor Suppressor p53-Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000504 Tumor Suppressor p53-Binding Protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100038158 WD repeat-containing protein 35 Human genes 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101150005734 CREB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 102100023033 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710128014 Cyclic AMP-responsive element-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037062 Forkhead box protein D2 Human genes 0.000 description 1
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 description 1
- 102100030308 Homeobox protein Hox-A11 Human genes 0.000 description 1
- 101000974934 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001029314 Homo sapiens Forkhead box protein D2 Proteins 0.000 description 1
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101001083158 Homo sapiens Homeobox protein Hox-A11 Proteins 0.000 description 1
- 101100340594 Homo sapiens IFITM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001037247 Homo sapiens Interferon alpha-inducible protein 27-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001082073 Homo sapiens Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000735213 Homo sapiens Palladin Proteins 0.000 description 1
- 101001089243 Homo sapiens RILP-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001060852 Homo sapiens Ras-related protein Rab-34 Proteins 0.000 description 1
- 101001128094 Homo sapiens Ras-related protein Rab-34, isoform NARR Proteins 0.000 description 1
- 101000783404 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 2A 65 kDa regulatory subunit A alpha isoform Proteins 0.000 description 1
- 101000596086 Homo sapiens TATA box-binding protein-associated factor RNA polymerase I subunit D Proteins 0.000 description 1
- 101000631616 Homo sapiens Translocation protein SEC62 Proteins 0.000 description 1
- 101000965719 Homo sapiens Volume-regulated anion channel subunit LRRC8C Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102100040063 Interferon alpha-inducible protein 27-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100027353 Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035031 Palladin Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102100033758 RILP-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 101710165423 RNA-binding region-containing protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100031921 Ras-related protein Rab-34, isoform NARR Human genes 0.000 description 1
- 102100021087 Regulator of nonsense transcripts 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 101150090346 Rnpc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100191561 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036122 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 65 kDa regulatory subunit A alpha isoform Human genes 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 102100035207 TATA box-binding protein-associated factor RNA polymerase I subunit D Human genes 0.000 description 1
- 102100033663 Transforming growth factor beta receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100029007 Translocation protein SEC62 Human genes 0.000 description 1
- 101710028540 UPF2 Proteins 0.000 description 1
- 102100040984 Volume-regulated anion channel subunit LRRC8C Human genes 0.000 description 1
- 101150067429 ZBTB21 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021130 Zinc finger and BTB domain-containing protein 21 Human genes 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010079292 betaglycan Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009124 positive feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了神经坏死病毒蛋白B2在促进病毒在细胞内增殖中的应用。本发明通过在哺乳动物细胞中过表达神经坏死病毒B2蛋白发现,B2蛋白能够抑制细胞的先天性免疫,协助病毒增殖。即可以利用神经坏死病毒B2蛋白,在多种病毒的培养过程中对宿主细胞进行预处理后再感染病毒,从而提高病毒产率。由此,本发明提供了神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用以及一种促进病毒在细胞内增殖的方法。本发明不仅有助于病毒的增殖,也有助于拓展病毒培养的宿主细胞系,使病毒的增殖不再受限于特定的高敏感细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地,涉及神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
背景技术
病毒是一种可以利用宿主细胞进行复制的微小、无完整细胞结构的亚显微粒子,主要由核酸和蛋白质外壳组成。因病毒感染引起的疾病种类繁多,而研究病毒的感染机理,揭示其与宿主免疫系统之间的相互作用情况,有利于病毒性疾病的防治。目前,实验室培养病毒的方法中,需先培养对所要培养的病毒敏感的细胞系,然后对培养好的细胞进行攻毒,培养至细胞出现明显病变并破碎后,裂解细胞收取上清液进行纯化。但此方法并不适用于一些尚未发现其高敏感细胞的病毒,需先耗费较多的人力和物力进行高敏感细胞的筛选。即使可以借助某些细胞进行增殖,病毒产率也不理想。因此,需要提供一种能够提高细胞对病毒的敏感度,拓展病毒培养的宿主细胞系,促进病毒增殖的方法。
鱼类病毒性神经坏死病(Viral nervous necrosis,VNN)是一种危害性极高的鱼类疾病,病原为β野田村病毒(Betanodavirus),现称为神经坏死病毒(Nervous necrosisvirus,NNV)。野田村病毒是一类大小为25~30nm的RNA病毒,由衣壳蛋白包裹基因组构成,无囊膜。基因组由两条单链RNA(RNA1和RNA2)组成,RNA1的分子量为3.0~3.2kb,主要编码非结构蛋白,包括蛋白A(Protein A)。病毒入侵后的早期阶段,RNA1大量表达产生ProteinA,复制病毒的基因组。同时,RNA1复制过程中,在其3’末端会产生小分子的亚基因组RNA3,编码非结构蛋白,包括B1和B2。RNA2的分子量为1.3~1.4kb,编码病毒的衣壳蛋白(Capsidprotein,CP)。病毒入侵后的后期阶段,RNA2大量表达产生CP蛋白。
现有研究发现,神经坏死病毒B2蛋白作为病毒复制增殖过程中的早期表达蛋白,参与了NNV的早期感染,但B2蛋白的具体功能尚不清楚。此外,NNV感染的主要是鱼类细胞,对于其他类型的细胞以及病毒,B2蛋白会有怎样的效果也未可知。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的技术问题,提供了神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。通过在细胞中过表达所述神经坏死病毒B2蛋白,可以抑制细胞的免疫反应,从而促进病毒增殖。所述方法能够提高细胞对病毒的敏感度,拓展病毒培养的宿主细胞系,使病毒的增殖不再受限于特定的高敏感细胞。
本发明的第一个目的是提供神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
本发明的第二个目的是提供神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种促进病毒在细胞内增殖的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明发现,通过在哺乳动物细胞中过表达神经坏死病毒(NNV)的B2蛋白,能够抑制细胞(病毒宿主)的先天性免疫,协助病毒增殖。即可以利用神经坏死病毒B2蛋白,在多种病毒的培养过程中先对宿主细胞进行预处理再感染待培养的病毒,从而提高病毒产率。因此,本发明请求保护神经坏死病毒B2蛋白的以下应用。
本发明请求保护神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
具体地,所述应用为神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进除神经坏死病毒(Nervous necrosisvirus,NNV)外的其它病毒在细胞内增殖中的应用。
本发明还请求保护神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
具体地,所述应用为神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进除神经坏死病毒外的其它病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
具体地,所述神经坏死病毒B2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体地,所述能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂包括能够表达所述神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒。
具体地,所述病毒为RNA病毒。更具体地,所述病毒为水疱性口炎印第安纳州病毒(Vesiculovirus,VSV)。
具体地,所述细胞为哺乳动物细胞。
更具体地,所述细胞为人胚胎肾上皮细胞或人宫颈腺癌细胞。
作为其中的一个实施例,本发明以人胚胎肾上皮细胞(HEK-293T)和人宫颈腺癌细胞(Hela)为宿主细胞,基于真核细胞密码子偏好性,针对编码神经坏死病毒B2蛋白的基因进行了密码子优化,通过克隆、酶切和连接,构建得到了含优化后的表达神经坏死病毒B2蛋白的基因序列的重组表达质粒,通过将所述重组表达载体转染至宿主细胞,促进了宿主细胞内水疱性口炎印第安纳州病毒的增殖。
具体地,构建重组表达质粒所用载体为pEGFP-N3或pN3-FLAG。所述pN3-FLAG是将pEGFP-N3载体的绿色荧光蛋白序列替换为FLAG标签序列得到。
具体地,基于真核细胞密码子偏好性进行密码子优化所得的编码神经坏死病毒B2蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种促进病毒在细胞内增殖的方法,所述方法为:在宿主细胞内过表达神经坏死病毒B2蛋白后再感染病毒。
具体地,所述过表达神经坏死病毒B2蛋白的方法为:构建神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒并转染至宿主细胞;或将神经坏死病毒B2蛋白与细胞穿膜肽进行融合表达所得的融合蛋白与宿主细胞共培养。将神经坏死病毒B2蛋白与细胞穿膜肽进行融合表达,可使所得融合蛋白具有穿过细胞膜的能力,从而将B2蛋白带入宿主细胞。
具体地,所述病毒为RNA病毒。
更具体地,所述病毒为水疱性口炎印第安纳州病毒(Vesiculovirus,VSV)。
具体地,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
更具体地,所述宿主细胞为人胚胎肾上皮细胞或人宫颈腺癌细胞。
具体地,构建重组表达质粒所用载体为pEGFP-N3或pN3-FLAG。
本发明具有以下有益效果:
本发明通过在哺乳动物细胞中过表达神经坏死病毒B2蛋白发现,B2蛋白能够抑制哺乳动物细胞的先天性免疫,协助病毒增殖。即可以利用神经坏死病毒B2蛋白,在多种病毒的培养过程中对宿主细胞进行预处理后再感染病毒,从而提高病毒产率。由此,本发明提供了神经坏死病毒B2蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用以及一种促进病毒在细胞内增殖的方法。本发明不仅有助于病毒的增殖,也有助于拓展病毒培养的宿主细胞系,使病毒的增殖不再受限于特定的高敏感细胞。
附图说明
图1为转录组差异基因的实时定量荧光PCR(RT-qPCR)验证结果;图中的A为转录组下调基因的RT-qPCR验证结果;图中的B为转录组上调基因的RT-qPCR验证结果。
图2为B2蛋白(B2O)抑制细胞基因mRNA表达水平的检测结果;图中的A为B2蛋白抑制HEK-293T的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图中的B为B2蛋白抑制Hela的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图中的C为B2蛋白抑制HEK-293T的IFITM1基因mRNA表达水平的检测结果;图中的D为B2蛋白抑制HEK-293T的RNPC3基因mRNA表达水平的检测结果;图中的E为B2蛋白抑制HEK-293T的CREB1基因mRNA表达水平的检测结果;图中的F为B2蛋白抑制HEK-293T的ZBTB21基因mRNA表达水平的检测结果。
图3为B2蛋白对哺乳动物细胞内源蛋白表达的影响结果。
图4为B2蛋白对外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果;图中的A为B2蛋白对HEK-293T中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果;图中的B为B2蛋白对Hela中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果。
图5为B2蛋白对HEK-293T细胞免疫的影响结果;图中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后IFN-β基因mRNA表达水平;图中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP基因mRNA表达水平;图中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP蛋白表达水平;图中的D为VSV-GFP感染HEK-293T后的镜检情况;图中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染HEK-293T后荧光标记细胞数量;图中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
图6为B2蛋白对Hela细胞免疫的影响结果;图中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后IFN-β基因mRNA表达水平;图中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP基因mRNA表达水平;图中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP蛋白表达水平;图中的D为VSV-GFP感染Hela后的镜检情况;图中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染Hela后荧光标记细胞数量;图中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
图中EV指空质粒;图中**,p<0.01;*,p<0.05;T检验。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1在细胞中转染B2蛋白对细胞RNA表达水平的影响
本发明以水疱性口炎印第安纳州病毒(Vesiculovirus,VSV)的增殖为例进行说明。为便于观察,本发明所用VSV为重组病毒(VSV-GFP),即在VSV的G基因下游插入了GFP基因,使其在细胞内的基因表达阶段能产生绿色荧光蛋白,GFP蛋白可作为感染标志物。
本发明所用细胞为人胚胎肾上皮细胞(HEK-293T细胞系)和人宫颈腺癌细胞(Hela细胞系)。培养细胞所用培养基为DEME培养基。
试验过程如下:
1、细胞的复苏、传代和冻存
细胞复苏:将冻存的细胞从液氮罐中取出后,迅速置于37℃水浴条件搅拌解冻,加入含20%胎牛血清(FBS)的培养基混匀,离心后吸弃上清,用新鲜的含20% FBS的培养基重悬细胞,加入培养瓶培养。
细胞传代:吸弃原培养基,加少量无血清培养基润洗细胞30s后吸弃,加含0.02%EDTA的0.25%胰酶(赛默飞,货号25200056)消化2~5分钟至细胞脱落,加入等体积的含10% FBS的培养基终止消化;离心后吸弃上清,用含10%FBS的培养基重悬细胞,加入培养瓶培养。
细胞冻存:按DMSO:血清:DEME培养基的体积比为1:2:7的比例提前配制冻存液;吸弃原培养基,加少量无血清培养基润洗细胞30s后吸弃,加入胰酶消化2~5分钟至细胞脱落,加入等体积含10% FBS培养基终止消化;离心后吸弃上清,加入冻存液重悬细胞后,吸入细胞螺纹冻存管,放置在梯度将温盒中,放在-80℃冰箱梯度降温,24h后转移至液氮罐长期保存。
2、真核表达载体的构建
为提高B2蛋白在真核细胞中的表达量,本发明以OGNNV b2原始序列(Genbank IDMG874757)为模板进行了优化,此过程委托通用生物(安徽)股份有限公司完成,优化后的基因命名为b2o,对应的蛋白命名为B2O。基因b2o的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
以合成所得b2o基因为模板,经PCR克隆、酶切后连接至pEGFP-N3或pN3-FLAG真核表达载体中,构建得到重组表达质粒B2O-EGFP/B2O-FLAG。所述pN3-FLAG真核表达载体是将pEGFP-N3(Invitrogen)载体的绿色荧光蛋白序列替换为FLAG标签序列得到,由此可在目的蛋白C端添加FLAG标签。PCR克隆所用引物如下所示:
B2O-Hind III-F:CTCAAGCTTGCCACCATGGAGCAGATCCAGCAGGC
B2O-Kpn I-R:CGCGGTACCATCTGTCTCCATAGGCTCCTCGATC
根据TOYOBO公司的KOD FX说明书配制PCR反应体系,扩增获得目的基因片段后,按照OMEGA公司胶回收试剂盒说明书纯化回收DNA。按照引物设计的酶切位点(Hind III和KpnI)使用相应限制性内切酶,根据Thermo Fisher公司的FastDigest快速内切酶说明书,配制对应的酶切体系,分别对回收的DNA(PCR扩增产物)和pN3-FLAG真核表达载体进行双酶切。将反应体系涡旋混匀后,37℃孵育1h,按照OMEGA公司的胶回收试剂盒说明书纯化回收DNA。根据Thermo Fisher公司的T4 DNA Ligase说明书,酶切产物回收纯化后,配制连接体系,将反应体系涡旋混匀,22℃孵育4h。连接反应结束后,将连接产物(重组表达质粒B2O-FLAG)转化感受态细菌,筛选阳性转化子进行PCR验证和测序,保存测序正确的阳性转化子和质粒进行后续实验。
本发明同时构建了b2o的RNA结合位点缺失突变体b2o-R53&60A,所述缺失突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。与B2O的氨基酸序相比,所述突变体b2o-R53&60A的第53和60位的氨基酸R变为了A。用于表达所述突变体b2o-R53&60A的重组表达质粒为B2O-R53&60A-FLAG。
3、细胞转染质粒
(1)提前18~24h铺板细胞,待密度达到60%~90%时转染;
(2)按照1μg质粒:3μL转染试剂,无血清培养基稀释质粒至10ng/μL的原则配制转染体系,轻轻混匀;
(3)室温孵育20min,加入细胞孵育,3~4h后换含10% FBS培养基继续培养。
4、病毒感染
(1)提前18~24h铺板细胞,待密度达到60%~90%时攻毒;
(2)从-80℃冰箱取出病毒液置于冰上融化,吸弃原培养基,用含5% FBS培养基按照比例稀释病毒液,加入细胞培养瓶孵育2h后吸走病毒液,换含5%FBS培养基继续培养。
5、实时定量荧光PCR(RT-qPCR)验证转录组分析结果
此前,本发明对转染了B2基因的HEK-293T细胞进行了转录组学分析,从中筛选出89个显著差异基因,根据GO分析结果,从中挑选出与细胞免疫、凋亡、表达功能相关基因28个。为验证转录组分析结果,本发明在HEK-293T中转染了重组表达质粒B2O-FLAG,转染空质粒(pN3-FLAG)作为对照组,转染后24h收细胞提取RNA,反转录后通过RT-qPCR实验测定上述28个候选基因的mRNA表达水平,对应的RT-qPCR引物序列如表1所示。
表1实时定量荧光PCR引物序列
RT-qPCR实验过程如下:
(1)按照Promega公司的RNA提取试剂盒提取细胞RNA;按照艾科瑞生物工程有限公司Evo M-MLV RT Premix for qPCR试剂盒说明书将提取得到的RNA逆转录成cDNA,稀释5倍后,保存于-20℃备用;
(2)用Primer-BLAST软件设计引物,扩增长度为80~150bp,Tm值为60℃,并检验物种特异性;设计并检验所得的引物如表1所示;
(3)根据Green Pro Taq HS qPCR试剂盒说明书配制RT-qPCR反应体系;
(4)将体系混匀后加入384孔定量板,每个样本3个重复孔,以β-actin基因为内参,离心后上机;
(5)根据Green Pro Taq HS qPCR试剂盒说明书在Roche Light Cycler480Ⅱ按照以下程序进行PCR反应;
(6)定量仪通过检测荧光变化得到ct值,按以下方式计算目标基因相对表达量:
ΔCt(目标基因-β-actin)=Ct(目标基因)-Ct(β-actin);
ΔCt(Vec-β-actin)=Ct(Vec)-Ct(β-actin);
-ΔΔCt(目标基因-β-actin)=ΔCt(Vec-β-actin)-ΔCt(目标基因-β-actin);
目标基因相对表达量=2-ΔΔCt(目标基因-β-actin)。
转录组差异基因的实时定量荧光PCR验证结果如图1所示;图1中的A为转录组下调基因的RT-qPCR验证结果;图1中的B为转录组上调基因的RT-qPCR验证结果。由图1中的A可知,在挑选的10个在转录组中显著下调的基因(RNPC3、CREB1、JUN、HOXA11、TRAF1D、FOXD2、LARP4、RNR2、SNORD30、ZBTB21)中,有7个基因在RT-qPCR实验结果中显示为mRNA表达显著受抑制(RNPC3、CREB1、JUN、TAF1D、LARP4、RNR2、ZBTB21)。然而,挑选出的18个在转录组中显著上调的基因(ECT2、TP53BP1、TRPM7、LRRC8C、NFKBIA、TGFBR3、UPF2、WDR35、ATF2、PPP2R1A、IFI27L1、IFI27L2、SEC62、RAB34、RILPL2、ZDHHC20、PALLD、H2BC12)中,在RT-qPCR实验中则显示出与转录组数据不相符的结果。18个在转录组中上调的基因中,只有NFKBIA(编码IκB蛋白)这1个基因在RT-qPCR实验中mRNA表达显著上调,有4个基因的表达显著下调(TP53BP1、TRPM7、WDR35、SEC62),其余13个基因表达量无显著变化(图1中的B)。由此可见,B2蛋白普遍抑制了HEK-293T细胞中基因的表达。
此外,本发明在转录组学分析的下调基因中,筛选出IFN-β、干扰素诱导跨膜蛋白1(Interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)、含RNA结合区蛋白3(RNA-binding region-containing protein 3,RNPC3)、cAMP响应元件结合蛋白1(Cyclic AMP-responsive element-binding protein 1,CREB1)、含锌指和BTB结构域蛋白21(Zincfinger and BTB domain containing protein 21,ZBTB21),这5个稳定下调基因,作为B2抑制基因表达的检测目标,从RNA水平检测B2蛋白的抑制效应。
同时,为检测哺乳动物细胞激活免疫反应状态时,B2蛋白抑制细胞RNA表达水平的能力,使用dsRNA类似物Poly(I:C)模拟细胞检测到的病毒dsRNA,在HEK-293T、Hela细胞中同时转染dsRNA类似物Poly(I:C)和重组表达质粒B2O-FLAG,设置单一转染组和空质粒对照组,转染后24h收细胞并提取细胞RNA,反转录后通过RT-qPCR检测上述5个基因的mRNA表达水平,RT-qPCR检测所用引物如表1所示。
B2蛋白抑制细胞基因mRNA表达水平的检测结果如图2所示;图2中的A为B2蛋白抑制HEK-293T的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图2中的B为B2蛋白抑制Hela的IFN-β基因mRNA表达水平的检测结果;图2中的C~F依次为B2蛋白抑制HEK-293T的IFITM1、RNPC3、CREB1和ZBTB21基因mRNA表达水平的检测结果。由图2可知,Poly(I:C)成功激活了HEK-293T和Hela细胞的RLR通路(是抗病毒天然免疫反应中机体抵抗RNA病毒感染的重要途径),刺激IFN-β表达上调,但会被B2蛋白显著抑制。HEK-293T和Hela细胞相比,HEK-293T对Poly(I:C)刺激更敏感。在HEK-293T细胞中,IFITM1受Poly(I:C)刺激后表达上调但会被B2蛋白抑制。其余基因,RNPC3、CREB1、ZBTB21的表达量不受Poly(I:C)影响但也会被B2蛋白显著抑制。
实施例2在细胞中转染B2蛋白对细胞内源蛋白表达水平的影响
为检测B2蛋白抑制哺乳动物细胞内源蛋白表达的能力,在HEK-293T细胞中同时转染Poly(I:C)和B2O-EGFP真核表达质粒,设置单一Poly(I:C)转染组和空质粒(pEGFP-N3)对照组,转染后24h收细胞,使用带蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞,利用WB实验检测内源RLR通路蛋白ZNFX1、RIG-I、MDA5、IRF3及磷酸化TBK1、磷酸化IRF3的蛋白量水平。
B2蛋白(B2O)对哺乳动物细胞内源蛋白表达的影响结果如图3所示。由图3可知,在Poly(I:C)刺激下,HEK-293T细胞RLR通路蛋白ZNFX1、RIG-I和MDA5的表达量以及TBK1、IRF3的磷酸化显著上调。若在此基础上转染B2蛋白,被Poly(I:C)上调的ZNFX1、RIG-I蛋白表达量、磷酸化IRF3蛋白量会被抑制(图中被标记为红色)。IRF3蛋白表达量不受Poly(I:C)和B2蛋白的影响。
以上结果表明,在病毒感染过程中,B2蛋白能抑制被dsRNA激活的RLR通路,通过抑制IRF3的磷酸化水平而不是其蛋白表达水平来抑制I型IFN的表达,并抑制IFN对ZNFX1、RIG-I等ISGs的正反馈调节,进一步抑制RLR通路。
实施例3在细胞中转染B2蛋白对细胞外源蛋白表达水平的影响
为检测B2蛋白抑制哺乳动物细胞外源蛋白表达的能力,在HEK-293T细胞中同时转染pRL-CMV(pRL-CMV是一个使用来源于人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)的CMV强启动子起始转录报告基因海参荧光素酶(Luciferase from Renilla reniformis,Rluc)的真核表达质粒,常用于在双荧光素酶报告基因实验中作为内参报告基因表达质粒,质粒购买于Promega公司)和B2O-FLAG,设置空质粒对照组,转染后24h和48h收细胞,使用PromegaDual-Reporter Assay System试剂盒中的细胞裂解液裂解细胞,用酶标仪检测外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平。另在Hela细胞中同时转染pRL-CMV和B2O-FLAG或B2O-R53&60A-FLAG,设置空质粒对照组,转染后24h收细胞,用酶标仪检测外源CMV启动子起始转录的Rluc表达水平。
B2蛋白对外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果如图4所示;图4中的A为B2蛋白对HEK-293T中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果;图4中的B为B2蛋白对Hela中外源CMV启动子起始转录Rluc表达水平的影响结果。由图4可知,在时序转染实验中,B2蛋白显著抑制HEK-293T细胞中CMV启动子起始转录的Rluc表达,48h时的抑制能力相比于24h显著减弱。在突变体转染实验中,B2蛋白同样显著抑制Hela细胞中CMV启动子起始转录的Rluc表达,B2蛋白的RNA结合位点缺失突变体的抑制能力显著减弱。
实施例4活病毒水平检测B2蛋白对细胞免疫的影响
在HEK-293T细胞中同时转染Poly(I:C)和B2O-FLAG,设置单一转染组和空质粒对照组,转染后6h加入MOI=2.25×10-2的VSV-GFP,18h后收细胞。细胞样分成3组分别用于以下实验:提取RNA,反转录后通过RT-qPCR实验测定IFN-β、EGFP的mRNA表达水平;使用WB实验检测EGFP蛋白表达量;使用细胞流式术分析细胞荧光比例,依此推算感染率。
B2蛋白对HEK-293T细胞免疫的影响结果如图5所示;图5中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后IFN-β基因mRNA表达水平;图5中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP基因mRNA表达水平;图5中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染HEK-293T后EGFP蛋白表达水平;图5中的D为VSV-GFP感染HEK-293T后的镜检情况;图5中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染HEK-293T后荧光标记细胞数量;图5中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
由图5可知,在无Poly(I:C)刺激的实验组中,过表达B2蛋白显著抑制IFN-β、EGFP两个基因mRNA表达,但并不影响EGFP蛋白的表达量,最终显著提高HEK-293T细胞的VSV-GFP感染率。HEK-293T细胞经Poly(I:C)刺激后,IFN-β的表达显著上调,表明HEK-293T细胞的先天性免疫系统被激活,EGFP的mRNA、蛋白水平以及VSV-GFP感染率显著降低。当HEK-293T细胞同时转染Poly(I:C)和过表达B2O,在IFN-β表达相比转染Poly(I:C)对照组没有明显变化的情况下,EGFP的mRNA水平和VSV-GFP感染率恢复空白对照组水平,但是EGFP的蛋白水平仍受抑制。上述结果表明,在哺乳动物细胞过表达B2蛋白能协助VSV-GFP增殖。
为探究在不同哺乳动物细胞中的适用性,本发明在Hela细胞中重复VSV-GFP攻毒实验。同时,为验证B2蛋白的RNA结合位点对B2蛋白抑制细胞免疫功能的关键作用,引入B2蛋白的RNA结合位点突变体B2O-R53&60A进行平行实验。
在Hela细胞中同时转染Poly(I:C)和B2O-FLAG或B2O-R53&60A-FLAG质粒,设置单一转染组和空质粒对照组,转染后6h加入MOI=2.25×10-2的VSV-GFP,18h后收细胞。细胞样分成3组分别用于以下实验:提取RNA,反转录后通过RT-qPCR实验测定IFN-β、EGFP的mRNA表达水平;使用WB实验检测EGFP蛋白表达量;使用细胞流式术分析细胞荧光比例,依此推算感染率。
B2蛋白对Hela细胞免疫的影响结果如图6所示;图6中的A为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后IFN-β基因mRNA表达水平;图6中的B为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP基因mRNA表达水平;图6中的C为B2蛋白影响VSV-GFP感染Hela后EGFP蛋白表达水平;图6中的D为VSV-GFP感染Hela后的镜检情况;图6中的E为流式细胞术检测VSV-GFP感染Hela后荧光标记细胞数量;图6中的F为根据荧光标记细胞数量计算的VSV-GFP感染率。
由图6可知,过表达B2蛋白显著提高了Hela细胞的VSV-GFP感染率。当Hela细胞经过Poly(I:C)刺激后,EGFP的mRNA、蛋白水平以及VSV-GFP感染率显著降低。当Hela细胞同时转染Poly(I:C)和过表达B2蛋白,相比仅转染Poly(I:C)的对照组,EGFP的mRNA、蛋白水平以及VSV-GFP感染率显著提高。此外,B2O-R53&60A处理组的结果介于B2蛋白处理和对照组之间,这说明B2蛋白的RNA结合位点对B2蛋白抑制细胞免疫功能起重要作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在促进病毒在细胞内增殖中的应用。
2.神经坏死病毒B2蛋白、能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂或含有神经坏死病毒B2蛋白的融合蛋白在制备促进病毒在细胞内增殖的产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述神经坏死病毒B2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述能够表达神经坏死病毒B2蛋白的试剂包括能够表达所述神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒。
5.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述病毒为RNA病毒。
6.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述细胞为哺乳动物细胞。
7.一种促进病毒在细胞内增殖的方法,其特征在于,所述方法为:在宿主细胞内过表达神经坏死病毒B2蛋白后再感染病毒。
8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述过表达神经坏死病毒B2蛋白的方法为:构建神经坏死病毒B2蛋白的重组表达质粒并转染至宿主细胞;或将神经坏死病毒B2蛋白与细胞穿膜肽进行融合表达所得的融合蛋白与宿主细胞共培养。
9.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述病毒为RNA病毒。
10.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410073831.5A CN117844767A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410073831.5A CN117844767A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117844767A true CN117844767A (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=90534444
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410073831.5A Pending CN117844767A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117844767A (zh) |
-
2024
- 2024-01-17 CN CN202410073831.5A patent/CN117844767A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107502608B (zh) | 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用 | |
Parks et al. | Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock | |
Merrill et al. | Cell-type-specific repression of internal ribosome entry site activity by double-stranded RNA-binding protein 76 | |
CN105925728B (zh) | 一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒 | |
Hausmann et al. | RIG-I and dsRNA-induced IFNβ activation | |
WO2019149107A1 (zh) | 一种实时荧光定量pcr检测rcl的试剂和方法 | |
Nakagawa et al. | Molecular function analysis of rabies virus RNA polymerase L protein by using an L gene-deficient virus | |
CN109402179B (zh) | 一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法 | |
CN117987599A (zh) | 一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途 | |
von Brandenstein et al. | Beyond the 3′ UTR binding–microRNA-induced protein truncation via DNA binding | |
CN111154923A (zh) | 一种扩增新型冠状病毒(SARS-CoV-2)基因核苷酸片段的引物及其应用 | |
CN113166808A (zh) | 鉴定rna分子中2,-o-甲基化修饰的方法及其应用 | |
Mota et al. | Changes in the proteome of Huh7 cells induced by transient expression of hepatitis D virus RNA and antigens | |
CN111808858A (zh) | 一种siRNA序列及其靶标在提高PEDV毒价中的应用 | |
CN117844767A (zh) | 神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 | |
CN109402269B (zh) | 一种检测miRNA-217-5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途 | |
An et al. | Coronavirus transcription early in infection | |
CN110893240B (zh) | Nme2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用 | |
CN115873991B (zh) | 嵌段crRNA、使crRNA能够开关控制与Cas12a结合的功能及其功能验证方法 | |
CN110066799A (zh) | 靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA及应用 | |
CN113817724B (zh) | 一种FII-RNA pulldown试剂盒和方法及其应用 | |
CN114874993B (zh) | 一种调控猪卵巢颗粒细胞mmp2基因表达的方法 | |
JP2015527887A (ja) | 真核細胞に対するウイルスベクター組成物の作用を検出又は測定する方法並びにそれに使用されるバイオマーカー | |
CN110616216B (zh) | 一种稳定表达丝氨酸蛋白酶的单克隆细胞株及其制备方法及含该细胞株的试剂盒和应用 | |
CN111206034B (zh) | 猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |