TW202338087A

TW202338087A - 合成rna片段及其用於rna依賴擴增之用途

Info

Publication number: TW202338087A
Application number: TW112102802A
Authority: TW
Inventors: 希龍林; 山姆林; 吳堂熙
Original assignee: 美洛生物科技股份有限公司
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2023-01-19
Publication date: 2023-10-01

Abstract

本揭示內容關於一種合成核糖核酸(RNA)片段，其包含兩側夾有至少5'端RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)結合位及3'端RdRp結合位的一RNA模版，如此所述合成RNA片段可在生體外透過RNA依賴RNA循環反應(RCR)被擴增。本揭示內容還關於一種使用本揭示內容合成RNA片段來產生擴增RNA產物的方法。

Description

合成RNA片段及其用於RNA依賴擴增之用途

相關申請案之交互參照

本發明主張2022年1月24日申請之第63/302,163號及2022年5月5日申請之第63/338,881號的美國臨時申請案優先權，該申請案之完整內容納入本發明專利說明書的一部分以供參照。

本揭示內容關於一種核酸擴增技術領域。更具體地，本揭示內容關於一種新穎的合成核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)片段以及其用於RNA依賴RNA循環反應(RNA-dependent RNA cycling reaction，RCR)的用途。

自最初衍生自α病毒屬基因體，自我擴增核糖核酸(self-amplifying ribonucleic acid，又稱saRNA或samRNA，本節統稱saRNA)被研究並用於抗癌與傳染性疾病之疫苗開發已有數十年。早期是基於病毒複製子來設計saRNA，病毒複製子是使用部分病毒基因體作為骨幹來重建用於基因表現的重組、可自我複製的mRNA平台。因此，saRNA構建體不僅包含傳訊RNA(mRNA)的基本元素，像是一端帽、5'端非轉譯區(5'-untranslated region，UTR)、一段可編碼胜肽或蛋白的序列、3'端非翻譯區(3'-UTR)和多種長度的多聚腺苷酸尾(poly(A) tail)之外，還包含一段病毒19-核苷酸(nt)保守序列單元(conserved sequence element)(3’CSE)及編碼RNA依賴RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，本章節簡稱RdRp)複合體的α病毒屬複製酶基因，該RdRp複合體可藉著辨識3'CSE序列實現RNA轉錄本的原位自我轉譯及擴增。作為結果，saRNA因為其自我複製的活性，可以低濃度遞送以達成可觀的抗原表現。因此，saRNA正在成為重要的RNA疫苗候選物。

目前在生體外生產所需RNA序列的擴增RNA產物之主要方法是仰賴聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction，PCR)以及生體外(試管內)轉錄( in vitrotranscription，IVT)這兩種流程的結合。具體來說，前述方法主要包含以下步驟：從所需的RNA序列製備反轉錄雙股cDNA模版；透過試管外轉錄從前述反轉錄雙股cDNA模版合成一RNA模版；反轉錄該合成RNA模版以形成RNA-cDNA雜合體；藉由重複PCR流程將RNA-cDNA雜合體擴增至啟動子連接的雙股cDNA；從該啟動子連接的雙股cDNA透過試管內轉錄合成RNA；以及以核酸內切酶消化擴增的雜合RNA-cDNA產物之去氧核糖核苷酸，從而製作經擴增的RNA產物。

然而，以前述方法進行生體外擴增saRNA有許多限制。雖然前述的RdRp酵素可開發並涉及RNA-介導的擴增流程以省略產生RNA-cDNA雜合體的步驟，然而作為一種RdRp的結合位，3'CSE太長而難以做為通用PCR或反轉錄PCR的潛在引子。再者，3'-CSE是高度結構化的序列，容易形成主幹-環圈(stem-loop)，此結構會阻礙使用常規的原核生物RNA聚合酶所主導的RNA轉錄作用，導致無法執行常規生體外(試管內)轉錄(IVT)方法。

鑑於上述，相關領域亟需開發能夠與RNA模版結合並可作為PCR啟動子的RdRp結合位，從而達成生體外的saRNA擴增。

為了給讀者提供基本的理解，以下提供本揭示內容的簡要發明內容。此發明內容不是本揭示內容的廣泛概述，同時非用來識別本發明的關鍵/必需元件或勾勒本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。

如本文廣泛描述及具體實施，本揭示內容的一個態樣是關於一種合成核糖核酸(ribonucleic acid，以下簡稱RNA)片段，其包含兩側夾有5'端RNA依賴RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，以下簡稱RdRp)結合位、3'端RdRp結合位或是其組合的一RNA模版，其中，5'端RdRp結合位與3'端RdRp結合位各自分別包含選自由5'-USUSCYW-3'及5'-UAGSRVR-3'所組成之群組的一多核糖核苷酸序列。

根據本揭示內容某些實施方式，所述5'端RdRp結合位具有5'-UCUCCUA-3'、5'-UGUGCUA-3'或5'-UCUCCCU-3'的多核糖核苷酸序列。

根據本揭示內容某些實施方式，所述3'端RdRp結合位具有5'-UAGGAGA-3'、5'-UAGCACA-3'或5'-UAGGGAGA-3'的多核糖核苷酸序列。

根據本揭示內容某些實施方式，該RNA模版包含一多核糖核苷酸序列或是一多核糖核苷酸與多去氧核糖核苷酸序列的雜合體，其中該多核糖核苷酸序列是一編碼RNA或一非編碼RNA。

根據本揭示內容一實施方式，編碼RNA可以是編碼抗原的一傳訊RNA(或簡稱mRNA)。抗原具體可以是癌症抗原、腫瘤抗原、細菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生蟲抗原或是其組合。

腫瘤抗原的實例包含但不限於，新生抗原(neoantigen)、腫瘤衍生溶胞產物(tumor-derived lysate)、甲型胎兒蛋白 (alpha-fetoprotein，AFP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、黏蛋白、上皮腫瘤抗原(epithelial tumor antigen，ETA)、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、RAS蛋白以及抑瘤蛋白。

例示性細菌抗原可衍生自一細菌物種，所述細菌物種包含放線菌屬( Actinomyces)、產氣單孢菌屬( Aeromonas)、關節桿菌屬( Arthrobacter)、有芽胞桿菌屬( Bacillus)、類桿菌屬( Bacteroides)、博德氏桿菌屬( Bordetella)、疏螺旋體屬( Borrelia)、布氏桿菌屬( Brucella)、彎曲桿菌屬( Campylobacter)、披衣菌屬( Chlamydia)、檸檬酸桿菌屬( Citrobacter)、芽胞梭菌屬( Clostridium)、棒狀桿菌屬( Corynebacterium)、大腸菌屬( Escherichia)、腸桿菌屬( Enterobacter)、加德納氏菌屬( Gardnerella)、螺旋桿菌( Helicobacter)、嗜血桿菌屬( Haemophilus)、克留氏菌屬( Klebsiella)、退伍軍人症桿菌屬( Legionella)、李氏菌屬( Listeria)、分枝桿菌屬( Mycobacterium)、奈瑟菌屬 ( Neisseria)、奴卡菌屬( Nocardia)、巴斯德桿菌屬( Pasteurella)、變形桿菌屬( Proteus)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、脲原體屬( Ureaplasma)、沙門氏桿菌屬( Salmonella)、志賀桿菌屬( Shigella)、螺菌屬( Spirillum)、螺旋體屬( Spirochaeta)、葡萄球菌屬( Staphylococcus)、鏈桿菌屬( Streptobacillus)、鏈球菌( Streptococcus)、鏈黴菌屬( Streptomyces)、密螺旋體屬( Treponema)以及耶氏桿菌屬( Yersinia)之物種；然不限於此。

例示性病毒抗原可衍生自一病毒物種，該病毒物種包含但不限於：腺病毒( Adenovirus)、甲型冠狀病毒( Alphacoronavirus)、乙型冠狀病毒( Betacoronavirus)、巨細胞病毒( Cytomegalovirus)、丁型流感病毒( Deltainfluenzavirus)、丁型冠狀病毒( Deltacoronavirus)、丙型冠狀病毒( Gammacoronavirus)、肝炎病毒( Hepacivirus) 、肝病毒 (Hepatovirus)、A型流感病毒( Influenza A virus)、B型流感病毒( Influenza B virus)、C型流感病毒( Influenza C virus)、D型流感病毒( Influenza D virus)、慢病毒( Lentivirus) 、勒托病毒 (Letovirus)、淋巴潛隱病毒屬( Lymphocryptovirus)、正肺病毒屬( Orthopneumovirus)、正痘病毒屬( Orthopoxvirus)、乳突病毒( Papillomavirus)、夸蘭菲爾病毒( Quaranjavirus)、輪狀病毒, ( Rotavirus)、單純皰疹病毒( Simplexvirus)以及水痘皰疹病毒( Varicellovirus)。

根據本揭示內容一優選實施方式，病毒抗原係衍生自乙型冠狀病毒的棘蛋白。

例示性真菌抗原可衍生自造成真菌感染(fungal infection)的一任意真菌物種，所述真菌感染包含麴菌病(aspergillosis)、芽生菌病(blastomycosis)、念珠菌病(candidiasis)、產色黴菌病 (chromoblastomycosis)、隱球菌病 (cryptococcosis)、組織漿菌症(histoplasmosis)、足菌腫(mycetoma)、副球黴菌病(paracoccidioidomycosis)、癬(ringworm)及變色糠疹(tinea versicolor)；然而不限於此。

例示性寄生蟲抗原可衍生自導致一寄生蟲感染的寄生蟲物種，所述寄生蟲感染包含，但不限於，非洲人類錐蟲病(African trypanosomiasis)、變形蟲症(amebiasis)、Chagas氏病(南美錐蟲病) (Chagas disease)、胞蟲病(echinococcosis)、片吸蟲症(fascioliasis)、鉤蟲病(hookworm disease)、包膜絛蟲病(hymenolepis)、利什曼原蟲病(leishmaniasis)、神經性豬囊尾蚴病(neurocysticercosis)、蟠尾絲蟲病(onchocerciasis)、瘧原蟲感染( Plasmodiuminfection)、肺吸蟲病(paragonimiasis)、肺胞囊蟲肺炎( Pneumocystispneumonia (PCP))、血吸蟲病(schistosomiasis)、滴蟲病(trichomoniasis)、絛蟲病(taeniasis)以及鞭蟲病(trichuriasis)。

根據本揭示內容某些實施方式，非編碼RNA是一短小干擾RNA (small interfering，簡稱siRNA)、一核醣體RNA (簡稱rRNA)、一轉送RNA (簡稱tRNA)、一微小RNA (簡稱miRNA)或一適體。

前述miRNA在本揭示內容的某些實施方式中是前驅miRNA (precursor miRNA)；在另一個實施方式中，miRNA則是成熟miRNA(mature miRNA)。

根據本揭示內容一具體實施例，非編碼RNA是衍生自前驅miRNA-302。

根據本揭示內容某些實施方式，所述RNA模版包含可編碼一非結構蛋白轉錄本的一多核糖核苷酸序列；在優選實施方式中，該非結構蛋白是RNA依賴RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。

本揭示內容另一個態樣是關於一種用於在生體外(或試管內)產生經擴增的RNA產物，其包含透過RNA循環反應(RNA cycling reaction，RCR)對前述合成RNA片段進行擴增，從而產生轉錄自所述合成RNA片段之RNA模版的擴增RNA產物。

根據本揭示內容某些實施方式，合成RNA片段的RNA模版包含多核糖核苷酸序列或是多核糖核苷酸序列與多去氧核糖核苷酸序列的雜合體，且該多核糖核苷酸序列編碼非結構蛋白的轉錄本。根據本揭示內容一優選實施方式，非結構蛋白是RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)。

根據本揭示內容某些實施方式，本揭示內容方法更包含對該擴增RNA產物添加一5'端帽 (5’cap)及一多聚腺苷酸尾(poly-A tail)。

在某些優選實施方式中，擴增RNA產物是一自我擴增RNA (self-amplifying RNA，saRNA)。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 定義

為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本文另有定義，本文所有的技術及科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者習知的術語的意思相同。

除非上下文另有明確說明，本文所使用的單數形式「一 (a, an)」以及「該 (the)」均包含複數形式。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。

本文使用的術語「RNA模版」(RNA template)旨在涵蓋一所需多核糖核苷酸序列，在RNA-介導的RNA循環反應 (或稱RCR)中作為合成複本(copy)的模版，藉此所需的多核糖核苷酸序列可被擴增或放大。據此，取決於實際需求，所述RNA模版可包含編碼RNA或非編碼RNA之多核糖核苷酸序列，或是衍生自一編碼 RNA或一非編碼RNA之多核糖核苷酸序列。舉例來說，RNA模版可包含編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)棘蛋白的多核糖核苷酸序列。抑或是，若在模版中同時存在多核糖核苷酸及多去氧核糖核苷酸，RNA模版也可包含多核糖核苷酸序列及多去氧核糖核苷酸序列的雜合體。

「所需(的)RNA」(desired RNA) 或「所需(的)多核糖核苷酸序列」(desired polyribonucleotide sequence) 之詞語在本文可互換地使用，皆用來指稱被視為標的物並出於某些目的而預期將被擴增的那些RNA片段或是多核糖核苷酸序列。在本揭示內容中，所需RNA可以是前驅miRNA (precursor miRNA)的片段或是病毒非結構蛋白的轉錄本。

本文使用的「RNA依賴RNA聚合酶結合位」(RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) binding site)一詞是指稱可被RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)酵素辨識並結合的一條短RNA序列(例如，小於10 nt)。通常，所述RdRp結合位可位於DNA或RNA多核苷酸的兩個末端，以形成可用於擴增方法(舉例來說，RNA循環反應(RCR))的DNA或RNA模版。根據本揭示內容，RdRp結合位包含5'-USUSCYW-3'或5'-UAGSRVR-3'的多核糖核苷酸序列。

本文使用的「RNA依賴」(RNA-dependent)或「RNA介導」(RNA-mediated)RNA循環反應(RNA cycling reaction，簡稱RCR)之詞語可互換地使用，以指稱一重複循環的反應，使用多核糖核苷酸序列作為模版，並借助於RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)及核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate，rNTP)作為反應材料，從而產生擴增的RNA。

本文使用的「非結構蛋白」一詞是指由病毒編碼但非該病毒顆粒一部分的一種蛋白。非結構蛋白(一般簡稱為nsP或NSP)通常包含各種病毒用來自我複製的酵素及轉錄因子，例如病毒蛋白酶、RNA複製酶及/或RNA模版導向的聚合酶。

本文使用的「微小RNA」(microRNA)或「miRNA」之詞是指非編碼RNA的一種類型，可於調節基因表現發揮作用。大多的miRNA是從DNA序列轉錄成初級miRNA (pri-miRNA)並接著加工成前驅 (precursor) miRNA (pre-miRNA)，最後形成成熟 miRNA。據此，本文使用的miRNA一詞則用來指稱所有涉及miRNA加工與成熟過程中的所有非編碼RNA，優選地包含前驅miRNA及成熟miRNA。

本文使用的「傳染病」(infectious disease)詞語是指因病原體，例如細菌、病毒、真菌或寄生蟲，所導致的疾病，通常會造成急性症狀，像是發燒、發言、上呼吸道症狀、下痢等。

2. 具體實施方式

本揭示內容至少部分基於短核糖核苷酸(小於10 nt)的發展，這些短核糖核苷酸可位於核糖核酸(RNA)模版的兩末端(亦即短核糖核苷酸可將RNA模版夾住)，並可被RNA依賴RNA 聚合酶(RdRp)辨識以啟動原位轉錄作用。據此，本揭示內容提供一種合成RNA片段，包含夾有可供RdRp辨識的新穎短核糖核苷酸的一RNA模版，如此該合成RNA片段可在生體外透過RNA依賴RNA循環反應(RNA cycling reaction，RCR)來擴增。本揭示內容還關於一種使用本揭示內容合成RNA片段來產生擴增RNA產物的方法。

2.1 本揭示內容的合成 RNA 片段

本揭示內容的一個態樣是關於適合用在RNA依賴RNA擴增流程的合成核糖核酸(RNA)片段。合成RNA片段包含夾有5'端RNA依賴RNA聚合酶(以下簡稱RdRp)結合位、3'端RdRp結合位，或是其組合的RNA模版，其中5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位各自包含一多核糖核苷酸序列，係選自由5'-USUSCYW-3'及5'-UAGSRVR-3'所組成之群組。

更具體地，請參考第1圖，其根據本揭示內容一實施方式繪示本發明合成RNA片段1的例示性結構。應當理解的是RNA模版15可以夾有任一5'端RdRp結合位11或是3'端RdRp結合位12，或是兼具兩者。優選地，RNA模版15是同時夾有5'端及3'端RdRp結合位 (11、12)如同第1圖所描繪的示意結構。

本揭示內容的合成RNA片段可以透過本領域習知的方法及/或工具來生產製作，前述方法及/或工具包含在生體外(試管內)從DNA或cDNA模版(無論是單股或雙股)直接轉錄。根據本揭示內容某些實施方式，可藉由結合反轉錄PCR (RT-PCR)或一般性PCR流程以及生體外(試管內)轉錄( in vitrotranscription，IVT)流程的一種方法來產生本揭示內容合成RNA片段，此方法具體描述於已公開的專利公開文件例如US 2022/0396798和WO 2022/260718 A1，以及由Li & Ji發表的學術文獻(Methods in Molecular Biology, vol. 221, 2003)中。具體而言，可透過常規RT-PCR並添加引子對(包含用於PCR的正向引子與反向引子)，從分離的單股DNA或RNA、RNA-DNA雜合體或一雙股DNA製備目標基因或序列片段的雙股cDNA模版(以下稱：cDNA模版)。根據本揭示內容，設計並合成引子對以與RdRp結合位的序列互補；如此，本發明RdRp結合位的互補DNA序列則可嵌入並併入cDNA模版的5'端與3'端。注意本發明RdRp結合位可作為用來啟動RdRp活性的類啟動子(promoter-like)模體。所產生的cDNA模版接著進入生體外轉錄(IVT)流程以產生合成RNA片段。根據本揭示內容，為執行IVT流程，可透過本領域習知的方法及/工具將所產生的cDNA模版選殖進一質體或是病毒載體內，從而生產本揭示內容的合成RNA片段，其包含兩端夾有5'端及3'端RdRp結合位的RNA模版之RNA序列。在替選實施方式，前述方式產生的cDNA模版已經併有RdRp結合位引子對，並作為RNA依賴RNA循環反應(RNA cycling reaction，RCR)的起始材料，從而直接製作產生本發明合成RNA片段。

根據本揭示內容某些優選實施方式，5'端RdRp結合位具有5'-UCUCCUA-3'、5'-UGUGCUA-3'或5'-UCUCCCU-3'的一多核糖核苷酸序列。根據本揭示內容某些優選實施方式，3'端RdRp結合位具有 5'-UAGGAGA-3'、5'-UAGCACA-3'或5'-UAGGGAGA-3'的一多核糖核苷酸。於一具體實施例中，RNA模版兩端夾有5'-UCUCCUA-3'及5'-UAGGAGA-3'。在其他具體實施例中，RNA模版兩端夾有5’-UGUGCUA-3’ 及5’-UAGCACA-3’。在又其他具體實施例中，RNA模版兩端夾有5’-UCUCCCU-3’及5’-UAGGGAGA-3’。

非必要地或選擇性地，本揭示內容的每一個5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位各自包含選自由5'-UAGSRVRA-3'及5'-UYBYHCUA-3'所組成之群組的一多核糖核苷酸序列。

如前述，本揭示內容RNA模版可以是，或含有，任意所需的編碼RNA或非編碼RNA的多核糖核苷酸序列，只要該所需序列兩端夾有兩RdRp結合位，從而形成對生產RNA複本有用的合成RNA片段。

根據本揭示內容某些實施方式，編碼RNA包含編碼一抗原的傳訊RNA(簡稱mRNA)。具體而言，所述編碼RNA可為編碼一癌症抗原、一腫瘤抗原、一真菌抗原、一寄生蟲抗原、一細菌抗原、一病毒抗原、或其組合的mRNA。

前述腫瘤抗原的實例包含但不限於，新生抗原(neoantigen)、腫瘤衍生溶胞產物(tumor-derived lysate)、甲型胎兒蛋白 (alpha-fetoprotein，AFP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、黏蛋白、上皮腫瘤抗原(epithelial tumor antigen，ETA)、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、RAS蛋白、抑瘤蛋白以及上述組合。

前述細菌抗原的實例包含衍生自一細菌物種的抗原，所述細菌物種包含放線菌屬( Actinomyces)、產氣單孢菌屬( Aeromonas)、關節桿菌屬( Arthrobacter)、有芽胞桿菌屬( Bacillus)、類桿菌屬( Bacteroides)、博德氏桿菌屬( Bordetella)、疏螺旋體屬( Borrelia)、布氏桿菌屬( Brucella)、彎曲桿菌屬( Campylobacter)、披衣菌屬( Chlamydia)、檸檬酸桿菌屬( Citrobacter)、芽胞梭菌屬( Clostridium)、棒狀桿菌屬( Corynebacterium)、大腸菌屬( Escherichia)、腸桿菌屬( Enterobacter)、加德納氏菌屬( Gardnerella)、螺旋桿菌( Helicobacter)、嗜血桿菌屬( Haemophilus)、克留氏菌屬( Klebsiella)、退伍軍人症桿菌屬( Legionella)、李氏菌屬( Listeria)、分枝桿菌屬( Mycobacterium)、奈瑟菌屬 ( Neisseria)、奴卡菌屬( Nocardia)、巴斯德桿菌屬( Pasteurella)、變形桿菌屬( Proteus)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、脲原體屬( Ureaplasma)、沙門氏桿菌屬( Salmonella)、志賀桿菌屬( Shigella)、螺菌屬( Spirillum)、螺旋體屬( Spirochaeta)、葡萄球菌屬( Staphylococcus)、鏈桿菌屬( Streptobacillus)、鏈球菌( Streptococcus)、鏈黴菌屬( Streptomyces)、密螺旋體屬( Treponema)以及耶氏桿菌屬( Yersinia)之物種；然不限於此。

前述病毒抗原的實例包含衍生自病毒物種的抗原，前述病毒物種包含但不限於，腺病毒( Adenovirus)、甲型冠狀病毒( Alphacoronavirus)、乙型冠狀病毒( Betacoronavirus)、巨細胞病毒( Cytomegalovirus)、丁型流感病毒( Deltainfluenzavirus)、丁型冠狀病毒( Deltacoronavirus)、丙型冠狀病毒( Gammacoronavirus)、肝炎病毒( Hepacivirus) 、肝病毒 (Hepatovirus)、A型流感病毒( Influenza A virus)、B型流感病毒( Influenza B virus)、C型流感病毒( Influenza C virus)、D型流感病毒( Influenza D virus)、慢病毒( Lentivirus) 、勒托病毒 (Letovirus)、淋巴潛隱病毒屬( Lymphocryptovirus)、正肺病毒屬( Orthopneumovirus)、正痘病毒屬( Orthopoxvirus)、乳突病毒( Papillomavirus)、夸蘭菲爾病毒( Quaranjavirus)、輪狀病毒, ( Rotavirus)、單純皰疹病毒( Simplexvirus)以及水痘皰疹病毒( Varicellovirus)。在一些實施方式中，病毒抗原是衍生自一乙型冠狀病毒屬；優選是嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV-2)的棘(S)蛋白或核殼蛋白(nucleocapsid，N)。在替選實施方式中，病毒抗原是衍生自一肝炎病毒屬；優選是C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的核心抗原(core antigen)。

真菌抗原的實例包含衍生自造成真菌感染的真菌物種的抗原，所述真菌感染包含但不限於，麴菌病(aspergillosis)、芽生菌病(blastomycosis)、念珠菌病(candidiasis)、產色黴菌病 (chromoblastomycosis)、隱球菌病 (cryptococcosis)、組織漿菌症(histoplasmosis)、足菌腫(mycetoma)、副球黴菌病(paracoccidioidomycosis)、癬(ringworm)、變色糠疹(tinea versicolor)以及其組合。

前述寄生蟲抗原實例包含衍生自導致一寄生蟲感染的寄生蟲物種的抗原，所述寄生蟲感染包含但不限於，非洲人類錐蟲病(African trypanosomiasis)、變形蟲症(amebiasis)、Chagas氏病(南美錐蟲病) (Chagas disease)、胞蟲病(echinococcosis)、片吸蟲症(fascioliasis)、鉤蟲病(hookworm disease)、包膜絛蟲病(hymenolepis)、利什曼原蟲病(leishmaniasis)、神經性豬囊尾蚴病(neurocysticercosis)、蟠尾絲蟲病(onchocerciasis)、瘧原蟲感染( Plasmodiuminfection)、肺吸蟲病(paragonimiasis)、肺胞囊蟲肺炎( Pneumocystispneumonia (PCP))、血吸蟲病(schistosomiasis)、滴蟲病(trichomoniasis)、絛蟲病(taeniasis)、鞭蟲病(trichuriasis)以及其組合。

根據本揭示內容替選實施方式，RNA模版含有非編碼RNA的多核糖核苷酸序列，所述非編碼RNA像是短小干擾RNA RNA (siRNA)、核醣體RNA (rRNA)、轉送RNA (tRNA)、微小RNA (miRNA)或適體。miRNA的實例通常包含但不限於前驅miRNA或成熟miRNA。根據本揭示內容一具體實施例，本揭示內容RNA模版含有衍生自人類前驅miRNA-302簇(cluster)的多核糖核苷酸序列。

在一些替選實施方式中，除了編碼或非編碼RNA序列之外，合成RNA片段更包含編碼衍生自病毒的非結構蛋白(nsPs)之多核糖核苷酸序列。多核糖核苷酸序列的轉錄本通常轉譯成功能性蛋白，像是RNA複製酶及/或RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)以起始RNA-介導複製。可用於本發明合成RNA片段的非結構蛋白的實例可為衍生自病毒物種或屬的非結構蛋白，前述種或屬包含但不限於輪狀病毒( Rotavirus)、乙型冠狀病毒( Betacoronavirus)、流感病毒(Influenza viruses)、肝炎病毒( Hepacivirus)、正肝病毒屬( Orthohepadnavirus)、沙蠅病毒屬( Phlebovirus)等。在本揭示內容的具體實施方式中，轉錄本可衍生自α病毒屬(alphavirus)且具有轉譯後預期形成完整RdRp蛋白的非結構蛋白(nsP1–4)。在本揭示內容其他具體實施方式中，非結構蛋白是衍生自嚴重急性呼吸道症候群相關的冠狀病毒(例如SARS-CoV-1 及SARS-CoV-2)。在本揭示內容又其他具體實施方式中，非結構蛋白是衍生自C型肝炎病毒(HCV)的RdRp，亦稱為NS5B。

2.2 透過使用本發明合成 RNA 片段進行擴增

本揭示內容另一態樣關於生體外(試管內)製造生產經擴增RNA產物的方法。所述方法至少包含透過一RNA循環反應(RNA cycling reaction，以下簡稱 “RCR”)擴增本發明合成RNA片段，從而產生轉錄自本發明合成RNA片段的RNA模版的經擴增RNA產物。

根據本揭示內容，合成RNA片段涵蓋至少一RdRp結合位，可被RNA複製酶(即，RdRp酵素)辨識，從而可用於RNA依賴(或RNA-介導)RCR。RNA依賴RCR的流程已公開揭示於美國專利申請案第17/648,336號以及美國臨時申請案第63/302,163及63/338,881號中。簡言之，可以緩衝液的形式提供合成RNA片段及RNA複製酶(即RdRp酵素)，該緩衝液還含有用於RNA合成不可或缺的核苷三磷酸分子(ribonucleoside triphosphate，rNTPs)。當擴增開始，合成RNA片段(大部分情況下是單股)可作為一模版，使RdRp酵素結合至RdRp結合位並執行複製以產生一互補的、反義股RNA序列。反義股RNA序列也囊括RNA模版與所述RdRp結合位；如此，反義股RNA序列可作為擴增有義股RNA序列的另一模版，而有義股RNA序列則又可作為再次擴增反義股RNA序列的模版。換句話說，有義股與反義股RNA兩者皆可作為彼此的模版，以透過RNA依賴RCR執行所需的RNA擴增。據此，可在預定條件(包含根據實際需求的溫度與時間)下執行多次擴增循環，最後有所需序列的合成RNA片段被擴增數次，例如擴增10倍至1000倍，舉例來說，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000倍的擴增，從而獲得所需的、經擴增的RNA產物。在一具體實施例中，所產生的擴增RNA產物比初始合成RNA片段增加10倍。在另一具體實施例中，所產生的擴增RNA產物比初始合成RNA片段增加100倍。在又另一具體實施例中，產生的擴增RNA產物增加1000倍。

根據一些實施方式，是在6.0至8.0之間的pH值、20°C至45°C之溫度下，執行擴增20分鐘至6小時。

根據本揭示內容，所獲得的經擴增RNA產物可以是一級、二級或三級結構，取決於反應條件。在一些實施方式中，本揭示內容經擴增RNA產物的結構是呈現單股二級結構構型。在其他實施方式中，本揭示內容經擴增RNA產物主要由雙股RNA產物構成。

如前述，用於RNA依賴RCR的合成RNA片段更包含編碼源自病毒的非結構蛋白(nsPs)之一多核糖核苷酸序列。在合成RNA片段的RNA模版，所述多核糖核苷酸序列優選地是設置在所需RNA的上游。在本揭示內容一些實施方式中，轉錄本是衍生自α病毒屬，並且具有預期在轉譯後要形成全長RdRp蛋白的四個非結構蛋白(nsP1–4)。在本揭示內容其他實施方式中，非結構蛋白是衍生自嚴重急性呼吸道症候群相關的冠狀病毒(例如，SARS-CoV-1及SARS-CoV-2)。在本揭示內容又其他具體實施方式中，非結構蛋白是衍生自C型肝炎病毒(HCV)的RdRp，亦稱為NS5B。

據此，基於合成RNA片段全長的經擴增RNA產物也囊括可編碼非結構蛋白轉錄本的多核糖核苷酸序列。本揭示內容經擴增RNA產物更可藉由本領域習知的手段與工具(例如透過rRNAs、snRNAs、tRNAs、核仁小RNA(small nucleolar (sno) RNA))、甚至是mRNA，所進行的RNA引導的RNA修飾)進一進行RNA加工。所述RNA加工包含但不限於：RNA剪接、無意義介導降解(nonsense-mediated decay，NMD)、RNA編輯、5'端加帽、3'端多聚腺苷酸(poly-(A))拖尾及其組合。在優選實施方式中，將5'端帽 (5’cap)及一多聚腺苷酸尾(poly(A) tail)加到經擴增的RNA產物上，從而形成一成熟傳訊RNA。所產生的經擴增RNA產物在結構上至少含有5'端帽、5'UTR、至少一非結構蛋白(nsP)、轉譯起始位(TIS)、所需感興趣的序列(無論編碼或非編碼序列)、3' UTR及3'多聚腺苷酸尾(poly(A) tail)。據此，所獲得的經擴增RNA產物擁有一自我擴增的能力，從而可作為具有廣用性質的自我擴增RNA(self-amplifying RNA，或簡稱saRNA)。

總結前述，本發明合成RNA片段結構上含有RCR-介導RNA擴增所需的5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位，以及自我擴增所需的非結構蛋白(即RdRp聚合酶)的多核糖核苷酸序列，作為結果，藉由根據前述本發明RCR方法擴增所述合成RNA片段而產生的經擴增RNA產物仍保留saRNA的全長構型，這對mRNA疫苗的開發具有相當益處。

藉上述技術特徵，本揭示內容提供合成RNA片段包含可被聚合酶辨識並結合的新穎的5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位，從而在體外環境實現RNA依賴擴增及複製。本揭示內容的5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位更形成一互補對以穩定RdRp在RNA模版上的結合，以啟動RNA合成，不受主幹-環圈(stem-loop)結構阻礙。總結來說，saRNA可在RNA依賴RCR過程中高效快速地合成，由此產生的saRNA保留高產率、高結構完整性及高純度的優點，且可廣泛應用。

實施例

材料與方法

引子對

表1：本揭示內容使用的引子對

引子	DNA 序列 (5'→3')	序列編號
病毒RdRp，正義	GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG GTATGGTACT TGGTAGTT	1
病毒RdRp，反義	GACAACAGGT GCGCTCAGGT CCT	2
pre-miR-302，正義	GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAT CTGTGGGAAC TAGTTCAGGA AGGTAA	3
pre-miR-302，反義	GTTCTCCTAA GCCTGTAGCC AAGAACTGCA CA	4

序列設計

藉由電腦篩選，從SARS-CoV-2或HCV病毒設計並衍生本揭示內容5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位的RNA序列。

試管內 RNA 轉染作用

將分離的病毒RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)之傳訊RNA以及前驅miRNA-302或是SARS-CoV-2的S蛋白以20：1至1：20之區間的比例混合，溶於0.5 mL的細胞培養基中，並添加1至50 µL的轉染作用試劑(in vivo-jetPEI, Westburg, NL)以形成一混合物。經培養10–30分鐘之後，將混合物加至含有50%–60%匯合度(confluency)培養細胞的另一細胞培養基中。根據細胞類型，每12至48小時更換一次培養基。

製備 cDNA 模版

分離所需的RNAs (0.01 ng–10 μg)、反轉錄(RT)引子對(0.01–20 nmole)、dNTPs及反轉錄酶一同與反轉錄反應套組(SuperScript III cDNA RT kit, ThermoFisher Scientific, USA)的試劑(20–50 μL)混合，並遵照供應商的指示製備反應混合物。取決於所需RNA的長度與複雜度，將所述反應混合物於37–65ºC培養1–3小時，從而產生其互補DNA(cDNA)模版。RT-衍生的cDNA模版(0.01 pg–10 μg)接著與20–50 µL的PCR緩衝液(High-Fidelity PCR master kit, ThermoFisher Scientific, USA)混合，以產生PCR混合物。將PCR混合物進行反應循環，該反應循環係由變性(以94ºC進行1分鐘)、退火(30–58ºC進行30秒至1分鐘)以及延長(72ºC進行1–3分鐘)組成，共進行五至四十個循環，從而產生經擴增cDNA。此cDNA作為包含生體外(試管內)轉錄作用(IVT)後續研究的模版。IVT流程具體描述於公開文件Li & Ji, Methods in Molecular Biology, vol221, 2003以及美國專利申請第17/648,336號、美國專利臨時申請案第63/302,163及63/338,881號中。

用於製作病毒RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)的cDNA序列的RT引子對的序列是表1所列的SEQ ID NO: 1。

生體外 ( 試管內 ) 轉錄

合成及擴增cDNA模版透過PCR專一性引子對(以下將簡稱為『PCR-用引子對』(PCR-ready primer))合併本發明5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位，「PCR-用引子對」包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 4。具體而言，SEQ ID NO: 1及2是用於含有RdRp基因的cDNA模版；而SEQ ID NO: 3及4是用於含有人類pre-miR-302基因簇(pre-miR-302)的cDNA模版。擴增的cDNA模版(0.01 ng–10 μg)、0.1–50 U的病毒RdRp及解旋酶(Abcam, MA, USA/Creative Enzymes, NY)、rNTP以及RNA聚合酶(包含T7、T3、M13及/或SP6)混合於1× 轉錄緩衝液(含有以MgCl ₂、NaCl、精三胺補充的Tris-HCl緩衝液，非必要還可添加三甲甘胺酸(trimethylglycine，TMG)、二甲基亞碸(dimethylsulfoxide，DMSO)及/或3[N-𠰌啉基]丙烷磺酸(3[N-morpholino]propane sulfonic acid，MOPS)，前述每種試劑濃度分別為0.001–10)中，以形成一混合物。30–40°C下反應混合物1至6小時，從而產生用於RNA依賴擴增的本揭示內容合成RNA片段。

RNA 依賴 RNA 循環反應 (RCR)

在1× 轉錄緩衝液(含有以MgCl ₂、NaCl、精三胺、TMG、DMSO及/或MOPS (0.001–10 mM)補充的Tris-HCl緩衝液)中混合分離的合成RNA片段(0.01 ng–10 μg)、病毒RdRp及解旋酶(0.1–50 U)的混合物，以及rNTP，從而形成一反應混合物。藉由在20–45ºC下反應1–6小時，對反應混合物進行RNA依賴RCR，從而製備擴增的RNA產物。

統計

所有結果以平均值及標準差(SD)的方式呈現。分別以微軟Excel軟體的各受試組的AVERAGE及STDEV功能計算各受測組的平均值及其SD。使用單向ANOVA分析數據。藉由執行統計軟體(SPSS v12.0)，以Tukey及Dunnett的t事後比較檢驗來識別各組的數據差異顯著性。 p＜0.05則為顯著。

實施例 1 ：含有 5' 端 RdRp 結合位及 3' 端 RdRp 結合位的本發明合成 RNA 片段之製備

以前述「材料與方法」一節描述的方法設計合成本揭示內容5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位。表2列出所述方法產生的5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位及其RNA序列。

表2：本發明5'端及3'端RdRp結合位

	序列 (5'→3')
5'端RdRp結合位	UCUCCUA
UGUGCUA
UCUCCCUA
3'端RdRp結合位	UAGGAGA
UAGCACA
UAGGGAGA

接著，依照「材料與方法」一節描述之流程，合成兩端各自夾有5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位的SARS-CoV-2的病毒RdRp及棘蛋白或是前驅miRNA-302的cDNA模版，接著執行生體外(試管內)轉錄，從而產生本揭示合成RNA片段。

實施例 2 ：使用合成 RNA 片段產生自我擴增 RNA

本實施例測試本揭示內容的合成RNA片段是否可增進RNA依賴RCR的效率。為此，根據「材料與方法」段落描述的流程，所述合成RNA片段作為RNA依賴RCR(擴增)的模版，從而產生自我擴增 RNA (saRNA)，並計算saRNA的產率。

結果發現本發明合成RNA片段成功地啟動RNA依賴RCR，且saRNA產物具有高純度比(14/15至999/1000)。更甚者，saRNA產物保有結構完整性，因此在隨後遞送至細胞的時候將繼承原有的自我擴增能力。

總觀之，本發明5'端RdRp結合位及3'端RdRp結合位與病毒RdRp是高度互補，從而可自動地啟動直接的生體外(試管內)RNA-介導擴增反應。

應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

1:合成RNA片段 11:5'端RdRp結合位 12:3'端RdRp結合位 15:RNA模版

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖是根據本揭示內容一實施方式的例示性合成RNA片段1示意圖。

根據慣常的作業方式，圖中各種元件與特徵並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同的圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。

TW202338087A_112102802_SEQL.xml

1:合成RNA片段

11:5'端RdRp結合位

12:3'端RdRp結合位

15:RNA模版

Claims

一種合成核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)片段，其包含：一RNA模版，其兩側夾有一5'端RNA依賴RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)結合位以及一3'端RNA依賴RNA聚合酶結合位，其中該5'端RNA依賴RNA聚合酶結合位及該3'端RNA依賴RNA聚合酶結合位個別包含一多核糖核苷酸(polyribonucleotide)序列，係選自由5'-USUSCYW-3'及5'-UAGSRVR-3'所組成之群組。
如請求項1所述之合成RNA片段，其中該5'端RNA依賴RNA聚合酶結合位具有一5'-UCUCCUA-3'、5'-UGUGCUA-3'或5'-UCUCCCU-3'的多核糖核苷酸序列。
如請求項1所述之合成RNA片段，其中該3'端RNA依賴RNA聚合酶結合位具有一5'-UAGGAGA-3'、5'-UAGCACA-3'或5'-UAGGGAGA-3'的多核糖核苷酸序列。
如請求項1所述之合成RNA片段，其中該RNA模版包含一多核糖核苷酸序列或一多核糖核苷酸與多去氧核糖核苷酸序列的雜合體，其中該多核糖核苷酸序列為一編碼RNA或一非編碼RNA。
如請求項4所述之合成RNA片段，其中該編碼RNA為編碼一抗原的一傳訊RNA (mRNA)。
如請求項5所述之合成RNA片段，其中該抗原為一癌症抗原、一腫瘤抗原、一細菌抗原、一病毒抗原、一真菌抗原、一寄生蟲抗原或一其組合。
如請求項6所述之合成RNA片段，其中該腫瘤抗原係選自由一新生抗原、一腫瘤衍生溶胞產物、一甲型胎兒蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、一癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、一黏蛋白、一上皮腫瘤抗原(epithelial tumor antigen，ETA)、一酪胺酸酶、一黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、一RAS蛋白以及一抑瘤蛋白所組成之群組。
如請求項6所述之合成RNA片段，其中該細菌抗原係衍生自一細菌物種，該細菌物種係選自由放線菌屬( Actinomyces)、產氣單孢菌屬( Aeromonas)、關節桿菌屬( Arthrobacter)、有芽胞桿菌屬( Bacillus)、類桿菌屬( Bacteroides)、博德氏桿菌屬( Bordetella)、疏螺旋體屬( Borrelia)、布氏桿菌屬( Brucella)、彎曲桿菌屬( Campylobacter)、披衣菌屬( Chlamydia)、檸檬酸桿菌屬( Citrobacter)、芽胞梭菌屬( Clostridium)、棒狀桿菌屬( Corynebacterium)、大腸菌屬( Escherichia)、腸桿菌屬( Enterobacter)、加德納氏菌屬( Gardnerella)、螺旋桿菌( Helicobacter)、嗜血桿菌屬( Haemophilus)、克留氏菌屬( Klebsiella)、退伍軍人症桿菌屬( Legionella)、李氏菌屬( Listeria)、分枝桿菌屬( Mycobacterium)、奈瑟菌屬 ( Neisseria)、奴卡菌屬( Nocardia)、巴斯德桿菌屬( Pasteurella)、變形桿菌屬( Proteus)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、脲原體屬( Ureaplasma)、沙門氏桿菌屬( Salmonella)、志賀桿菌屬( Shigella)、螺菌屬( Spirillum)、螺旋體屬( Spirochaeta)、葡萄球菌屬( Staphylococcus)、鏈桿菌屬( Streptobacillus)、鏈球菌( Streptococcus)、鏈黴菌屬( Streptomyces)、密螺旋體屬( Treponema)以及耶氏桿菌屬( Yersinia)所組成之群組。
如請求項6所述之合成RNA片段，其中該病毒抗原係衍生自一病毒物種，該病毒物種係選自由腺病毒( Adenovirus)、甲型冠狀病毒( Alphacoronavirus)、乙型冠狀病毒( Betacoronavirus)、巨細胞病毒( Cytomegalovirus)、丁型流感病毒( Deltainfluenzavirus)、丁型冠狀病毒( Deltacoronavirus)、丙型冠狀病毒( Gammacoronavirus)、肝炎病毒( Hepacivirus) 、肝病毒 (Hepatovirus)、A型流感病毒( Influenza A virus)、B型流感病毒( Influenza B virus)、C型流感病毒( Influenza C virus)、D型流感病毒( Influenza D virus)、慢病毒( Lentivirus) 、勒托病毒 (Letovirus)、淋巴潛隱病毒屬( Lymphocryptovirus)、正肺病毒屬( Orthopneumovirus)、正痘病毒屬( Orthopoxvirus)、乳突病毒( Papillomavirus)、夸蘭菲爾病毒( Quaranjavirus)、輪狀病毒, ( Rotavirus)、單純皰疹病毒( Simplexvirus)以及水痘皰疹病毒( Varicellovirus)所組成之群組。
如請求項9所述之合成RNA片段，其中該病毒抗原係源自於一乙型冠狀病毒的棘蛋白。
如請求項6所述之合成RNA片段，其中該真菌抗原係衍生自導致一真菌感染的一真菌物種，該真菌感染係選自由麴菌病(aspergillosis)、芽生菌病(blastomycosis)、念珠菌病(candidiasis)、產色黴菌病 (chromoblastomycosis)、隱球菌病 (cryptococcosis)、組織漿菌症(histoplasmosis)、足菌腫(mycetoma)、副球黴菌病(paracoccidioidomycosis)、癬(ringworm)及變色糠疹(tinea versicolor)所組成之群組。
如請求項6所述之合成RNA片段，其中該寄生蟲抗原係衍生自導致一寄生蟲感染的一寄生蟲物種，該寄生蟲感染係選自由非洲人類錐蟲病(African trypanosomiasis)、變形蟲症(amebiasis)、Chagas氏病(南美錐蟲病) (Chagas disease)、胞蟲病(echinococcosis)、片吸蟲症(fascioliasis)、鉤蟲病(hookworm disease)、包膜絛蟲病(hymenolepis)、利什曼原蟲病(leishmaniasis)、神經性豬囊尾蚴病(neurocysticercosis)、蟠尾絲蟲病(onchocerciasis)、瘧原蟲感染( Plasmodiuminfection)、肺吸蟲病(paragonimiasis)、肺胞囊蟲肺炎( Pneumocystispneumonia (PCP))、血吸蟲病(schistosomiasis)、滴蟲病(trichomoniasis)、絛蟲病(taeniasis)以及鞭蟲病(trichuriasis)所組成之群組。
如請求項4所述之合成RNA片段，其中該非編碼RNA是一短小干擾RNA (small interfering RNA (siRNA))、一核醣體RNA (ribosomal RNA (rRNA))、一轉送RNA (transfer RNA(tRNA))、一微小RNA (microRNA (miRNA))或一適體。
如請求項13所述之合成RNA片段，其中該miRNA為一前驅miRNA或一成熟miRNA。
如請求項14所述之合成RNA片段，其中該非編碼RNA係衍生自前驅miRNA-302。
如請求項1所述之合成RNA片段，其中該RNA模版包含編碼一非結構蛋白之轉錄本的一多核糖核苷酸序列。
如請求項16所述之合成RNA片段，其中該非結構蛋白為一RNA依賴RNA聚合酶。
一種生體外製作一擴增RNA產物的方法，包含透過一RNA循環反應(RCR)擴增如請求項1所述的合成RNA片段，從而產生轉錄自如請求項1所述之合成RNA片段的RNA模板的該擴增RNA產物。
如請求項18所述之方法，其中該合成RNA片段的RNA模版包含一多核糖核苷酸序列或一多核糖核苷酸及多去氧核糖核苷酸序列的雜合體，且該多核糖核苷酸序列編碼一非結構蛋白的轉錄本。
如請求項18所述之方法，更包含對該擴增RNA產物添加一5'端帽(5’cap)及一多聚腺苷酸尾(poly-A tail)。
如請求項18所述之方法，其中該擴增RNA產物為一自我擴增RNA(saRNA)。