KR20240004662A - 폴리 a 테일 길이를 측정하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 무엇보다도 mRNA를 포함한 핵산에서 단일중합체 뉴클레오티드 길이를 측정하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, mRNA와 작은 홈 결합 염료의 결합에 이은, 리보뉴클레아제 소화 및 모세관 전기영동을 포함하는 mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법이 본원에 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 4월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/181,488에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
2022년 4월 15일에 생성되었으며 크기가 688바이트인 "MRT-2220WOl_ST25.txt"라는 텍스트 파일의 내용 전체가 참조로 본원에 포함된다.
전령 RNA 요법(MRT)은 다양한 질환을 치료하는 유망한 접근법이다. MRT는 치료를 필요로 하는 환자에게 전령 RNA(mRNA)를 투여하는 것을 포함한다. 투여된 mRNA는 환자의 신체 내에서 mRNA에 의해 암호화된 단백질이나 펩티드를 생성한다. mRNA는 일반적으로 RNA 중합효소에 의한 효소 반응을 포함하는 시험관 내 전사 시스템(IVT)을 사용하여 합성된다. IVT 합성 공정에는 일반적으로 5'-캡(캡핑 반응) 및 3'-폴리 A 테일(폴리아데닐화)을 추가하는 반응이 이어진다.
효과적인 mRNA 치료법은 환자에게 mRNA를 전달하고 환자의 신체 내에서 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 효율적으로 생산할 것을 요구한다. 5' 캡과 3' 폴리 A 테일은 mRNA 전달과 생체 내에서 단백질 생산을 최적화하는 역할을 한다. 5' 말단의 캡은 분해를 방지하고 번역을 개선한다. 3' 말단의 폴리 A 테일은 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하고 mRNA 치료제에 대한 mRNA의 무결성과 안정성을 개선한다.
폴리 A 테일 길이의 평가는 mRNA 치료제에 대한 품질 관리 측정으로 수행된다. 정확한 폴리 A 테일 길이 측정은 온전하고 전체 길이이며 전달 시 기능적 단백질로 번역되는 안정한 mRNA 치료제를 정확하게 정량화하여 용량을 확립하는 데에도 사용된다. 폴리 A 테일 길이를 결정하는 현재 이용 가능한 방법은 특히 낮은 정확도를 비롯한 특정 단점을 가지고 있다.
폴리 A 테일 길이를 결정하기 위한 현재 방법은 예를 들어 폴리 A 결합 단백질 분석을 사용한 측정을 포함하며, 이는 폴리 A 결합 단백질의 적어도 4개의 단량체에 결합할 만큼 충분히 긴 폴리 A 테일을 필요로 하며, 여기서 각 단량체는 대략 38개 뉴클레오티드의 스트레치에 결합한다. 다른 방법에는 역전사 단계와 올리고 dT 프라이머로부터의 cDNA 합성을 요구하는 PCR 분석을 기반으로 하는 결찰 매개 폴리 A 측정을 사용하는 것이 포함되며, 이는 더 긴 폴리 A 테일에 대해 부정확할 수 있다. 또 다른 방법인 RNase H 기반 방법은 관심 mRNA에서 폴리 A 테일을 제거하는 것을 포함하며, 이는 온전한 폴리 A 테일을 요구하는 mRNA 치료제에는 적합하지 않다.
mRNA 치료제를 위한 mRNA 테일 길이를 측정하는 방법에는 예를 들어 모세관 전기영동(CE) 방법 및 RNase A 방법이 포함된다.
CE 방법은 효소 분해가 필요하지 않으며 약 1시간의 짧은 전개 시간에 완료된다. 이는 최대 48개의 샘플을 동시에 처리할 수 있는 고속 처리 방식으로 사용될 수 있다. 그러나 테일 길이가 증가함에 따라 측정된 테일 길이는 모세관 전기영동의 머무름 시간이 이동하기 때문에 부정확해지는 경우가 많다. CE 방법은 일반적으로 Agilent™ 삽입 염료와 같은 삽입 염료를 사용하는데, 이는 폴리 A 테일을 포함한 단일중합체 스트레치에서 약한 신호를 초래한다.
RNase A 겔 방법은 C와 U 다음에서 특정 분해를 허용하여 측정할 폴리 A 테일을 남기는 효소 분해가 필요하다. 이는 테일 길이에 대한 재현 가능하고 일관된 측정값을 제공한다. 그러나 이를 위해서는 30분의 효소 분해 단계와 2시간 30분의 겔 전개 시간이 필요하다. 이 방법은 약 10개의 샘플/겔의 저속 처리 방식으로 수행된다.
본 발명은 무엇보다도 신속한 고속 처리 방식으로 mRNA 샘플의 폴리 A 테일 길이를 정확하게 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로는 작은 홈 결합 염료와 mRNA의 결합에 이은, 리보뉴클레아제(RNase) 소화 및 모세관 전기영동(CE)이 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하는 정확한 방법을 제공한다는 놀랍고도 예상치 못한 발견에 기초한다. 일부 구현예에서, 방법의 하나 이상의 단계는 자동화된다. 일부 구현예에서, 방법은 고속 처리 방법이다.
현재 방법으로는 50개 내지 200개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 긴 폴리 A 테일 길이를 정확하게 측정하는 것은 어렵다. 효율적인 고속 처리 방식으로 50개 이상, 100개 이상, 150개 이상 또는 200개 이상의 뉴클레오티드의 긴 폴리 A 테일 길이를 신뢰성 있고 정확하게 측정할 수 있는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이 방법을 사용하여 측정된 폴리 A 테일 길이는 이론적인 테일 길이와 동일하다. 일부 구현예에서, 측정된 테일 길이는 100% 정확하다. 일부 구현예에서, 이 방법을 사용하여 측정된 폴리 A 테일 길이는 이론적인 테일 길이에 접근한다. 일부 구현예에서, 측정된 폴리 A 테일 길이는 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과의 정확도를 갖는다. 일부 구현예에서, 측정된 폴리 A 테일 길이는 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과의 정확도를 갖는다.
모세관 전기영동(CE)은 일반적으로 삽입 염료를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 삽입 염료는 Agilent™ 삽입 염료이다. 본 발명은 부분적으로는 모세관 전기영동에서 작은 홈 결합 염료를 사용하여 얻은 예상치 못한 결과에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 염료는 작은 홈 결합 염료이다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™이다.
폴리 A 테일은 나선형이며 평면 적층형 염기로 구성된다. 작은 홈 결합 염료는 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 선택적으로 RNA에 비공유 결합한다. 임의의 특정 이론에 구애됨을 바라지 않고, Sybr gold™를 포함한 작은 홈 결합 염료는 염기 적층에 의존하지 않는 상호작용으로 인해 폴리 A 테일에 의해 형성된 평면 구조에 결합할 수 있는 것으로 고려된다. Agilent™ 삽입 염료와 같은 삽입 염료는 폴리 A 테일에 의해 생성된 평면 구조에 삽입 염료가 적절하게 파이 적층할 수 없어서 폴리 A 테일 길이 측정이 부정확해지기 때문에 약화된 폴리 A 신호를 생성한다. 이에 반해, Sybr gold™는 단일 가닥의 2차 구조에 의해 형성된 작은 홈에 결합함으로써 폴리 A 테일의 나선형 구조에 비공유적으로 결합하여, 폴리 A 테일 길이를 정확하게 측정하는 방법을 제공한다(도 1b).
일부 양태에서, mRNA 샘플에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) mRNA 샘플을 작은 홈 결합 염료와 접촉시키는 단계; (b) (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (c) (b)의 샘플을 모세관 전기영동(CE)으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료가 Sybr gold™, Hoechst 염료 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)인 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™이다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Hoechst 염료이다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이다.
일부 구현예에서, mRNA 샘플을 RNase A 및 RNase T1로부터 선택된 하나 이상의 RNase와 함께 인큐베이션하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNase는 RNase A이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNase는 RNase T1이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNase는 RNase A1 및 RNase T1을 포함한다. RNase A는 C 및 U 잔기 다음에서 RNA를 분해하는 반면, RNase T1은 G 잔기 다음에서 분해한다. RNase A 및 RNase T1을 사용한 소화는 폴리 A 테일만 남도록 보장한다.
일부 구현예에서, 모세관 전기영동(CE)이 형광 기반 검출과 결합되는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 모세관 전기영동(CE)이 UV 흡수 분광법 검출과 결합되는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 약 15분, 30분, 45분 또는 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 약 15분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 약 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 약 45분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 약 60분 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 25개의 뉴클레오티드 이상이다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 50개의 뉴클레오티드 내지 5,000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 150개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 250개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 350개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 450개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 550개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 650개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 750개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 850개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 950개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 1000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 1200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 1400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 1600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 1800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 2000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 2200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 2400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 2600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 2800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 3000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 3200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 3400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 3600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 3800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 4000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 4200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 4400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 4600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 4800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 5000개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 50개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 100개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 150개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 200개 이상의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 100개의 뉴클레오티드 내지 1,500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 1000개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 250개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 250개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 260개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 270개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 280개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 290개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 310개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 320개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 330개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 340개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 350개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 360개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 370개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 380개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 390개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 410개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 420개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 430개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 440개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 450개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 460개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 470개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 480개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 490개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 약 500개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 방법의 하나 이상의 단계는 자동화된다.
일부 구현예에서, mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계는 자동화된다.
일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 단일 가닥 RNA(ssRNA)에 비공유적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 삽입 염료가 아니다.
일부 양태에서, mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) mRNA 샘플을 Sybr gold™ 작은 홈 결합 염료와 접촉시키는 단계; (b) (a)의 mRNA 샘플을 RNaseA 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (c) (b)의 샘플을 모세관 전기영동(CE)으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 형광 기반 검출과 결합된 모세관 전기영동(CE)을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 UV 흡수 분광법 검출과 결합된 모세관 전기영동(CE)을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 mRNA 샘플을 RNaseA 및 RNase T1과 함께 약 15분, 30분, 45분 또는 60분 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플을 RNase A 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계는 약 15분 동안이다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플을 RNase A 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계는 약 30분 동안이다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플을 RNase A 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계는 약 45분 동안이다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플을 RNase A 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계는 약 60분 동안이다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 25개 이상의 뉴클레오티드, 50개 이상의 뉴클레오티드, 100개 이상의 뉴클레오티드, 150개 이상의 뉴클레오티드, 또는 200개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 25개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 50개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 100개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이는 150개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A는 200개 이상의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 방법의 하나 이상의 단계는 자동화된다.
일부 구현예에서, 방법은 고속 처리 방법이다.
일부 양태에서, mRNA 샘플에서 단일중합체 뉴클레오티드 길이를 측정하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은
(a) mRNA 샘플을 작은 홈 결합 염료와 접촉시키는 단계; (b) (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (c) (b)의 샘플을 모세관 전기영동(CE)으로 분석하여 mRNA의 단일중합체 뉴클레오티드 길이를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 25개의 뉴클레오티드 이상이다.
일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개의 뉴클레오티드 내지 5,000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 150개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 250개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 350개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 450개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 550개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 650개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 750개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 850개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 950개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1000개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 2900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 3900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 4900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 5000개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개 이상의 뉴클레오티드, 100개 이상의 뉴클레오티드, 150개 이상의 뉴클레오티드, 또는 200개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 100개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 150개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 200개 이상의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 트랙트(tract)를 구성하는 뉴클레오티드는 A, U, G, 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 아데닌이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 우라실이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 구아닌이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 시토신이다.
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 본 개시내용에 사용되는 바와 같이, "포함하다"라는 용어 및 "포함하는" 및 "포함한다"와 같은 용어의 변형은 다른 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하려는 의도가 아니다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 동등한 의미로 사용된다. 두 용어 모두 당업자가 이해하는 임의의 정상적인 변동을 포괄하는 의미이다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이어지는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위에서 명백하다. 그러나 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위는 본 발명의 구현예를 나타내지만 제한을 위한 것이 아니라 단지 예시로서 제공된 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변경 및 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
도면은 제한을 위한 것이 아니라 단지 설명의 목적을 위한 것이다.
도 1a는 다양한 기전에 의한 염료 및 기타 리간드의 핵산에 대한 결합을 도시한 개략도이다. 이 개략도에서, 예시적인 이중 가닥 DNA 분자는 예를 들어 삽입 염료, 큰 홈 결합제, 작은 홈 결합제 또는 비스-인터칼레이터(bis-intercalator)에 의한 염료 결합 위치를 보여주기 위해 사용된다. 도 1b는 도 1a에 도시된 바와 같이 염료가 결합할 수 있는 형성된 RNA 2차 구조를 보여주는 개략도이다.
도 2a는 Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플 및 전통적인 RNase A 소화 샘플에 대해 25 nt, 50 nt 및 114 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 동시전사적으로 추가된 폴리 A 테일을 포함하는 EPO mRNA의 RNase A 분석을 보여주는 겔을 도시한다. 도 2b는 폴리 A 테일 길이가 25 nt, 50 nt 및 114 nt인 EPO mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 3a는 Sybr gold™ 결합에 이은 RNase A 소화 후 100 내지 600개의 뉴클레오티드의 폴리 A 테일 길이를 갖는 예시적인 EPO mRNA를 보여주는 모세관 전기영동 겔을 도시한다. 도 3b는 Agilent™ 삽입 염료 결합에 이은 RNase A 소화 후 100 내지 600개의 뉴클레오티드의 폴리 A 테일 길이를 갖는 예시적인 EPO mRNA를 보여주는 모세관 전기영동 겔을 도시한다.
도 4a는 100 내지 600개의 뉴클레오티드의 폴리 A 테일 길이를 갖는 EPO mRNA의 전통적인 RNase A 분석을 보여주는 겔을 도시한다. 도 4b는 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 EPO mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 5a는 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 5b는 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플과 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 간의 신호 강도 비교를 도시한다. 도 6a는 폴리 A 테일 길이가 200 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 6b는 폴리 A 테일 길이가 200 nt인 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 7은 RNaseA와 RNase A/T1 소화 생성물을 비교하는, 폴리 A 테일 길이가 100 내지 1800개 뉴클레오티드인 EPO mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다.
도 8a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 CFTR mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다. 도 8b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 CFTR mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다.
도 9a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 CFTR mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 9b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 CFTR mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 10은 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 CFTR mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 11a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 OTC mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다. 도 11b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 OTC mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다.
도 12a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 OTC mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 12b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 OTC mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 13은 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 OTC mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 14a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 MMA mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다. 도 14b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 MMA mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다.
도 15a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 MMA mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 15b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 MMA mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 16은 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 MMA mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 1a는 다양한 기전에 의한 염료 및 기타 리간드의 핵산에 대한 결합을 도시한 개략도이다. 이 개략도에서, 예시적인 이중 가닥 DNA 분자는 예를 들어 삽입 염료, 큰 홈 결합제, 작은 홈 결합제 또는 비스-인터칼레이터(bis-intercalator)에 의한 염료 결합 위치를 보여주기 위해 사용된다. 도 1b는 도 1a에 도시된 바와 같이 염료가 결합할 수 있는 형성된 RNA 2차 구조를 보여주는 개략도이다.
도 2a는 Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플 및 전통적인 RNase A 소화 샘플에 대해 25 nt, 50 nt 및 114 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 동시전사적으로 추가된 폴리 A 테일을 포함하는 EPO mRNA의 RNase A 분석을 보여주는 겔을 도시한다. 도 2b는 폴리 A 테일 길이가 25 nt, 50 nt 및 114 nt인 EPO mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 3a는 Sybr gold™ 결합에 이은 RNase A 소화 후 100 내지 600개의 뉴클레오티드의 폴리 A 테일 길이를 갖는 예시적인 EPO mRNA를 보여주는 모세관 전기영동 겔을 도시한다. 도 3b는 Agilent™ 삽입 염료 결합에 이은 RNase A 소화 후 100 내지 600개의 뉴클레오티드의 폴리 A 테일 길이를 갖는 예시적인 EPO mRNA를 보여주는 모세관 전기영동 겔을 도시한다.
도 4a는 100 내지 600개의 뉴클레오티드의 폴리 A 테일 길이를 갖는 EPO mRNA의 전통적인 RNase A 분석을 보여주는 겔을 도시한다. 도 4b는 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 EPO mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 5a는 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 5b는 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플과 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 간의 신호 강도 비교를 도시한다. 도 6a는 폴리 A 테일 길이가 200 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 6b는 폴리 A 테일 길이가 200 nt인 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 7은 RNaseA와 RNase A/T1 소화 생성물을 비교하는, 폴리 A 테일 길이가 100 내지 1800개 뉴클레오티드인 EPO mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다.
도 8a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 CFTR mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다. 도 8b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 CFTR mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다.
도 9a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 CFTR mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 9b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 CFTR mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 10은 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 CFTR mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 11a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 OTC mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다. 도 11b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 OTC mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다.
도 12a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 OTC mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 12b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 OTC mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 13은 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 OTC mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 14a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 MMA mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다. 도 14b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 MMA mRNA의 RNase A 소화 후 겔을 도시한다.
도 15a는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 MMA mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다. 도 15b는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 MMA mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도를 도시한다.
도 16은 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 MMA mRNA에 대한 y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적 테일 길이 사이의 그래프를 도시한다. Agilent™ 염료 처리된 CE 샘플, Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 소정의 용어가 먼저 아래에 정의된다. 다음 용어 및 기타 용어에 대한 추가적인 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 기재되어 있다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가 세부 사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 간행물 및 기타 참고 자료는 본 명세서에 참고로 포함된다.
대략 또는 약: 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 “대략” 또는 “약”은 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않은 한 언급된 참조 값의 (초과 또는 미만의) 어느 한 방향으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 이내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
배치: 본원에서 사용되는 용어 "배치"는 한 번에 합성된, 예를 들어 동일한 제조 주기 동안 단일 제조 주문에 따라 생산된 mRNA의 양 또는 분량을 지칭한다. 배치는 한 세트의 조건 하에서 연속 합성을 위한 단일 분취량의 효소 및/또는 단일 분취량의 DNA 주형을 통해 발생하는 하나의 반응에서 합성된 mRNA의 양을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 배치에는 반응이 진행됨에 따라 모든 시약 및/또는 성분이 추가 및/또는 보충되지는 않는 반응으로부터 생산된 mRNA가 포함된다. "배치"라는 용어는 원하는 양을 달성하기 위해 조합되는 서로 다른 시간에 합성된 mRNA를 의미하지 않는다.
생물학적 활성: 본원에서 사용되는 용어 "생물학적 활성"은 생물학적 시스템, 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 작용제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에 투여될 경우 해당 유기체에 생물학적 효과를 갖는 작용제는 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주된다.
전달: 본원에서 사용되는 용어 "전달"은 국소 전달과 전신 전달을 모두 포함한다. 예를 들어, mRNA의 전달은 mRNA가 표적 조직에 전달되고 암호화된 단백질이 표적 조직 내에서 발현되고 유지되는 상황("국소 분포" 또는 "국소 전달"이라고도 함) 및 mRNA가 표적 조직에 전달되고 암호화된 단백질이 발현되어 환자의 순환계(예: 혈청)로 분비되고 전신 분포되어 다른 조직에 의해 흡수되는 상황("전신 분포" 또는 "전신 전달"이라고도 함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달은 예를 들어 분무를 포함하는 폐 전달이다.
발현: 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 mRNA의 폴리펩티드로의 번역, 다중 폴리펩티드(예: 항체의 중쇄 또는 경쇄)의 온전한 단백질(예: 항체)로의 조립 및/또는 폴리펩티드 또는 완전히 조립된 단백질(예: 항체)의 번역 후 변형을 지칭한다. 본 출원에서, "발현" 및 "생산"이라는 용어 및 이들의 문법적 균등물은 상호교환적으로 사용된다.
전장 mRNA: 본원에서 사용되는 "전장 mRNA"는 특정 분석, 예를 들어 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동에 의한 분리와 함께 UV 및 UV 흡수 분광법을 사용한 검출을 사용할 경우 특성화된다. 전장 폴리펩티드를 암호화하고 본원에 기재된 임의의 정제 방법에 따라 얻은 mRNA 분자의 길이는 표적 DNA로부터 전사되는 전장 mRNA 분자 길이의 적어도 50%, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 정제 전의 표적 DNA로부터 전사되는 전장 mRNA 분자 길이의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.01%, 99.05%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%이다.
기능적: 본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적" 생물학적 분자는 특징으로 하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다.
단일중합체 또는 단일중합체 뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 "단일중합체" 또는 단일중합체 뉴클레오티드" 및 이의 문법적 균등물은 연속된 동일한 염기의 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 A, U, G, 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 용어 "단일중합체" 또는 "단일중합체 뉴클레오티드"는 실질적으로 동일한 염기의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이 용어는 하나 이상의 동일하지 않은 뉴클레오티드를 갖는 연속적인 일련의 뉴클레오티드를 포함한다.
삽입 염료: 본원에서 사용되는 바와 같이, 삽입 염료 또는 리간드 또는 작용제는 DNA 이중 나선의 염기쌍 사이에 결합한다. 삽입 염료는 염기쌍의 고리 구조와 유사한 소수성 복소환 고리 분자, 예를 들어 에티듐 브로마이드, 아크리딘 오렌지 및 악티노마이신 D이다. 일부 구현예에서, 삽입 염료는 Agilent™ 삽입 염료이다.
개선하다, 증가하다 또는 감소하다: 본원에서 사용되는 바와 같이, "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다"라는 용어 또는 문법적 균등물은 본원에 기재된 치료 개시 전 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기재된 치료 부재 하의 대조군 대상체(또는 다중 대조군 대상체)에서의 측정치와 같은 기준선 측정치에 대한 값을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료받는 대상체와 동일한 형태의 질환을 앓고 있는 대상체이며, 치료받는 대상체와 거의 동일한 나이이다.
시험관 내: 본원에서 사용되는 바와 같이, "시험관 내"라는 용어는 다세포 유기체 내부가 아닌 인공 환경, 예를 들어 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양물 등에서 발생하는 사건을 지칭한다.
생체 내: 본원에서 사용되는 바와 같이, "생체 내"라는 용어는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 지칭한다. 세포 기반 시스템의 맥락에서, 이 용어는 살아있는 세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하는 데 사용될 수 있다(예를 들어 시험관 내 시스템과 반대임).
분리된: 본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된"이라는 용어는 (1) (자연에서 및/또는 실험 환경에서) 처음 생산되었을 때 연관되었던 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되었고/되었거나, (2) 사람의 손으로 생산, 준비 및/또는 제조된 물질 및/또는 실재물을 지칭한다. 분리된 물질 및/또는 실재물은 처음 연관되었던 다른 성분들의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 넘게 순수하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없는 경우 "순수"하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 분리된 물질 및/또는 실재물의 순도 백분율 계산에는 부형제(예: 완충액, 용매, 물 등)가 포함되어서는 안 된다.
전령 RNA(mRNA): 본원에서 사용되는 바와 같이, "전령 RNA(mRNA)"라는 용어는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 mRNA는 변형된 RNA와 변형되지 않은 RNA를 모두 포함한다.
mRNA는 하나 이상의 암호화 및 비암호화 영역을 포함할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있고, 선택적으로 정제, 화학적으로 합성 등이 될 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 백본 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다.달리 명시하지 않는 한 mRNA 서열은 5'에서 3' 방향으로 표시된다.
작은 홈 또는 작은 홈 결합 염료: 본원에서 사용되는 "작은 홈"은 작은 홈 결합 염료가 수소 결합 또는 소수성 상호작용에 의해 결합하는 DNA 이중 나선의 두 홈 중 더 좁은 것을 지칭한다. RNA 분자에서, 작은 홈 결합 염료는 단일 가닥 핵산에 의해 형성된 2차 구조에 비공유적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™, Hoechst 염료 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이다.
mRNA 무결성: 본원에서 사용되는 바와 같이, "mRNA 무결성"이라는 용어는 일반적으로 mRNA의 품질을 지칭한다. 일부 구현예에서, mRNA 무결성은 정제 과정(예를 들어, 본원에 기재된 방법) 후에 분해되지 않는 mRNA의 백분율을 지칭한다. mRNA 무결성은 TAE 아가로스 겔 전기영동과 같은 본원에 특별히 기재된 방법을 사용하거나 은 염색을 이용한 SDS-PAGE에 의해, 또는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 RNA 아가로스 겔 전기영동(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology])에 의해 결정할 수 있다.
핵산: 본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"이라는 용어는 가장 넓은 의미에서 폴리뉴클레오티드 사슬에 포함되거나 포함될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬에 포함되거나 포함될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 포함한다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA" 및/또는 유사한 용어에는 핵산 유사체, 즉 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체가 포함된다. 예를 들어, 당업계에 공지되어 있고 골격에 포스포디에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 갖는 소위 "펩티드 핵산"은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 서로의 축퇴 버전이고/거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및/또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 인트랜스(intrans)가 포함될 수 있다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있고, 선택적으로 정제, 화학적으로 합성 등이 될 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 백본 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 달리 명시하지 않는 한 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 표시된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드(예: 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체(예: 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예: 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예: 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기(예: 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 구체적으로 전달을 용이하게 하거나 달성하기 위해 화학적으로 변형되지 않은 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드를 포함한 잔기)을 의미하는 "변형되지 않은 핵산"에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 T 및 U는 서열 설명에서 상호교환적으로 사용된다.
파이 적층: 본원에서 사용되는 바와 같이, 파이 적층은 파이 결합을 포함하기 때문에 방향족 고리 사이의 유인성 비공유 상호작용을 지칭한다. 이러한 상호작용은 DNA와 RNA 분자 내의 핵염기 적층에 중요하다.
실질적으로: 본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로"라는 용어는 관심 특성이나 성질의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 질적 조건을 지칭한다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 완성에 이르고/거나 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 경우는 거의 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서, "실질적으로"라는 용어는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적인 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명은 무엇보다도 신속한 고속 처리 방식으로 mRNA 샘플의 폴리 A 테일 길이를 정확하게 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로는 작은 홈 결합 염료와 mRNA의 결합에 이은, 리보뉴클레아제(RNase) 소화 및 모세관 전기영동(CE)이 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하는 정확한 방법을 제공한다는 놀랍고도 예상치 못한 발견에 기초한다. 모세관 전기영동(CE)은 일반적으로 삽입 염료를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 삽입 염료는 Agilent™ 삽입 염료이다. 본 발명은 부분적으로는 모세관 전기영동에서 작은 홈 결합 염료를 사용하는 것에 기초한다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™이다.
폴리 A 테일은 나선형이지만, 평면 적층형 염기로 구성된다. 임의의 특정 이론에 구애됨을 바라지 않고, Sybr gold™를 포함한 작은 홈 결합 염료는 염기 적층에 의존하지 않는 상호작용으로 인해 폴리 A 테일에 의해 형성된 평면 구조에 결합할 수 있는 것으로 고려된다. Agilent™ 삽입 염료와 같은 삽입 염료는 폴리 A 테일에 의해 생성된 평면 구조에 삽입 염료가 적절하게 파이 적층할 수 없어서 약화된 폴리 A 신호를 생성한다. 대조적으로, Sybr gold™는 단일 가닥의 2차 구조에 의해 형성된 작은 홈에 결합함으로써 폴리 A 테일의 나선형 구조에 수소 결합 및 소수성 신호를 통해 비공유적으로 결합한다(도 1b).
본 발명의 다양한 양태는 아래에 추가로 기재된다.
mRNA 폴리 A 테일 길이 측정
아래 명세서에 더 자세히 기재된 바와 같이, mRNA는 시험관 내 전사(IVT)를 포함한 임의의 다양한 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡핑되고 폴리 A 테일이 추가된다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일은 전사 후 또는 동시전사적으로 추가된다. 폴리 A 테일은 mRNA 치료제에 안정성을 부여한다.
일부 양태에서, mRNA 샘플에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) mRNA 샘플을 작은 홈 결합 염료와 접촉시키는 단계; (b) (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (c) (b)의 샘플을 모세관 전기영동(CE)으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법의 하나 이상의 단계는 자동화된다.
일부 구현예에서, 방법은 고속 처리 방법이다.
작은 홈 결합 염료
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 부분적으로는 mRNA를 비롯한 핵산과 작은 홈 결합 염료의 결합에 기초한다(도 1a 및 도 1b). 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™, Hoechst 염료, 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™이다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 Hoechst 염료이다. 일부 구현예에서, 작은 홈 결합 염료는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이다.
리보뉴클레아제
일부 구현예에서, mRNA 샘플을 RNase A 및 RNase T1로부터 선택된 하나 이상의 RNase와 함께 인큐베이션하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNase는 RNase A이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNase는 RNase T1이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNase는 RNase A1 및 RNase T1을 포함한다. RNase A는 C 및 U 잔기 다음에서 RNA를 분해하는 반면, RNase T1은 G 잔기 다음에서 분해한다. RNase A 및 RNase T1을 사용한 소화는 폴리 A 테일만 남도록 보장한다.
일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 RNase와 함께 약 15분, 30분, 45분 또는 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 RNase와 함께 약 15분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 RNase와 함께 약 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 RNase와 함께 약 45분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA 샘플은 하나 이상의 RNase와 함께 약 60분 동안 인큐베이션된다.
모세관 겔 전기영동
본 발명의 방법은 mRNA의 동일한 질량 대 전하 비율에 기초하여 mRNA를 분리하기 위한 검출 시스템과 결합된 모세관 전기영동을 사용한다. 모세관 겔 전기영동 방법은 25 nt 내지 약 5000개 초과의 뉴클레오티드의 다양한 길이의 소화 생성물을 분리한다. 길이는 표준 크기 마커를 기준으로 정확하게 정량화된다.
일부 구현예에서, 모세관 전기영동은 형광 기반 검출과 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 형광 기반 검출 방법은 레이저 유도된 형광 검출을 포함한다.
일부 구현예에서, 모세관 전기영동은 UV 흡수 분광법 검출과 결합된다.
mRNA의 합성
mRNA는 다양한 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 시험관 내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 간단히 말해서, IVT는 전형적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 삼인산염의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충 시스템 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7, 또는 SP6 RNA 중합효소), DNase I, 피로포스파타제 및/또는 RNase 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 용도에 따라 달라진다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 mRNA의 제조를 위해, DNA 주형은 시험관 내에서 전사된다. 적합한 DNA 주형에는 일반적으로 시험관 내 전사를 위한 프로모터, 예를 들어 T3, T7 또는 SP6 프로모터에 이어, 원하는 mRNA에 대한 원하는 뉴클레오티드 서열과 종결 신호가 있다.
T3 RNA 중합효소를 이용한 mRNA의 합성
일부 구현예에서, mRNA는 T3 RNA 중합효소를 사용하여 생산된다. T3 RNA 중합효소는 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA에서 5'→ 3' 방향으로 DNA로부터 RNA 형성을 촉매하고 변형된 뉴클레오티드를 통합할 수 있는 T3 박테리오파지의 DNA 의존적 RNA 중합효소이다. T3 중합효소는 매우 프로모터 특이적이며, T3 프로모터의 하류에 있는 DNA만 전사한다. T3은 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'(서열번호 1)의 공통 프로모터 서열에 결합한다.
T7 RNA 중합효소를 이용한 mRNA의 합성
일부 구현예에서, mRNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 생산된다. T7 RNA 중합효소는 5'→ 3' 방향으로 DNA로부터 RNA의 형성을 촉매하는 T7 박테리오파지의 DNA 의존적 RNA 중합효소이다. T7 중합효소는 매우 프로모터 특이적이며, T7 프로모터의 하류에 있는 DNA만 전사한다. T7은 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'(서열번호 2)의 공통 프로모터 서열에 결합한다. T7 중합효소는 또한 이중 가닥 DNA 주형과 RNA 합성을 위한 보조인자로서 Mg2+ 이온을 필요로 한다. 이는 매우 낮은 오류율을 갖는다.
SP6 RNA 중합효소를 이용한 mRNA의 합성
일부 구현예에서, mRNA는 SP6 RNA 중합효소를 사용하여 생산된다. SP6 RNA 중합효소는 SP6 프로모터 서열에 대해 높은 서열 특이성을 갖는 DNA 의존적 RNA 중합효소이다. SP6 중합효소는 프로모터의 하류에 있는 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA에서 RNA의 5'→3' 시험관 내 합성을 촉매한다. 이는 천연 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드 및/또는 표지된 리보뉴클레오티드를 중합된 전사체에 통합한다. SP6은 5'-ATTTACGACACACTATAGAAGAA-3'(서열번호 3)의 공통 프로모터 서열에 결합한다. 이러한 표지된 리보뉴클레오티드의 예에는 비오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌, 아미노알릴 및 동위원소 표지된 뉴클레오티드가 포함된다.
DNA 주형
일반적으로, DNA 주형은 적합한 프로모터 서열(예: T3, T7 또는 SP6 프로모터)이 있으며, 완전히 이중 가닥이거나 대부분 단일 가닥이다.
전사될 DNA 서열의 상류에(그리고 올바른 방향으로) 이중 가닥 프로모터를 포함할 경우, 선형화된 플라스미드 DNA(하나 이상의 제한 효소를 통해 선형화됨), 선형화된 게놈 DNA 단편(제한 효소 및/또는 물리적 수단을 통해), PCR 산물 및/또는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드를 시험관 내 전사를 위한 주형으로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 선형화된 DNA 주형은 평활 말단을 갖는다.
일부 구현예에서, 전사될 DNA 서열은 보다 효율적인 전사 및/또는 번역을 촉진하기 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, DNA 서열은 cis-조절 요소(예: TATA 박스, 종결 신호 및 단백질 결합 부위), 인공 재조합 부위, chi 부위, CpG 디뉴클레오티드 함량, 음성 CpG 섬, GC 함량, 중합효소 미끄러짐 부위 및/또는 전사와 관련된 기타 요소에 관해 최적화될 수 있고/있거나; DNA 서열은 잠재 스플라이스 부위(cryptic splice site), mRNA 2차 구조, mRNA의 안정적인 자유 에너지, 반복 서열, RNA 불안정성 모티프 및/또는 mRNA 처리 및 안정성과 관련된 기타 요소에 관해 최적화될 수 있고/있거나; DNA 서열은 코돈 사용 편향, 코돈 적응성, 내부 chi 부위, 리보솜 결합 부위(예: IRES), 조기 폴리 A 부위, Shine-Dalgarno(SD) 서열 및/또는 번역과 관련된 기타 요소에 관해 최적화될 수 있고/있거나; DNA 서열은 코돈 맥락, 코돈-안티코돈 상호작용, 번역 정지 부위 및/또는 단백질 접힘과 관련된 기타 요소에 관해 최적화될 수 있다. 당업계에 공지된 최적화 방법, 예를 들어 ThermoFisher의 GeneOptimizer 및 Optimum Gene™이 본 발명에 사용될 수 있으며, 이는 US 20110081708에 기재되어 있고, 이의 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, DNA 주형은 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역의 길이는 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 신호, mRNA의 세포 내 위치 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역의 길이는 50 내지 500개의 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.
예시적인 3' 및/또는 5' UTR 서열은 안정한 mRNA 분자(예: 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤 또는 시트르산 사이클 효소)로부터 유래되어 센스 mRNA 분자의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 5’ UTR 서열은 CMV 극초기 1(IE1) 유전자의 부분 서열, 또는 이의 단편을 포함하여, 뉴클레아제 저항성을 개선하고/하거나 폴리뉴클레오티드의 반감기를 개선할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 추가로 안정화시키기 위해 인간 성장 호르몬(hGH) 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 폴리뉴클레오티드(예를 들어 mRNA)의 3' 말단 또는 비번역 영역에 포함시키는 것도 고려된다. 일반적으로, 이러한 변형은 비변형 대응물에 비해 폴리뉴클레오티드의 안정성 및/또는 약동학적 특성(예를 들어, 반감기)을 개선하고, 예를 들어 생체 내 뉴클레아제 소화에 대한 이러한 폴리뉴클레오티드의 저항성을 개선하기 위해 이루어진 변형을 포함한다.
대규모 mRNA 합성
일부 구현예에서, 폴리 A 테일을 갖는 mRNA는 대규모로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 단일 배치에서 적어도 100 mg, 150 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 5 g, 10 g, 25 g, 50 g, 75 g, 100 g, 250 g, 500 g, 750 g, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 100 kg, 1000 kg, 또는 그 이상으로 합성된다. 본원에서 사용되는 용어 "배치"는 한 번에 합성된, 예를 들어 단일 제조 설정에 따라 생산된 mRNA의 양 또는 분량을 지칭한다. 배치는 한 세트의 조건 하에서 연속 합성을 위한 단일 분취량의 효소 및/또는 단일 분취량의 DNA 주형을 통해 발생하는 하나의 반응에서 합성된 mRNA의 양을 지칭할 수 있다. 단일 배치에서 합성된 mRNA는 원하는 양을 달성하기 위해 조합되는 서로 다른 시간에 합성된 mRNA를 포함하지 않는다.
본 발명에 따르면, 일반적으로 생산된 mRNA 1 그램(g)당 1 내지 100 mg의 RNA 중합효소가 사용된다. 일부 구현예에서, 생산된 mRNA 1 그램당 약 1~90 mg, 1~80 mg, 1~60 mg, 1~50 mg, 1~40 mg, 10~100 mg, 10~80 mg, 10~60 mg, 10~50 mg의 RNA 중합효소가 사용된다. 일부 구현예에서, 약 5 내지 20 mg의 RNA 중합효소가 약 1 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 약 0.5 내지 2 g의 RNA 중합효소가 약 100 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 약 5 내지 20 g의 RNA 중합효소가 약 1 kg의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 5 mg의 RNA 중합효소가 적어도 1 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 500 mg의 RNA 중합효소가 적어도 100 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 5 g의 RNA 중합효소가 적어도 1 kg의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 생산된 mRNA 1 그램당 약 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg 또는 100 mg의 플라스미드 DNA가 사용된다. 일부 구현예에서, 약 10 내지 30 mg의 플라스미드 DNA가 약 1 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 약 1 내지 3 g의 플라스미드 DNA가 약 100 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 약 10 내지 30 g의 플라스미드 DNA가 약 1 kg의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 10 mg의 플라스미드 DNA가 적어도 1 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 1 g의 플라스미드 DNA가 적어도 100 g의 mRNA를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 10 g의 플라스미드 DNA가 적어도 1 kg의 mRNA를 생산하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 반응 혼합물 중 RNA 중합효소의 농도는 약 1 내지 100 nM, 1 내지 90 nM, 1 내지 80 nM, 1 내지 70 nM, 1 내지 60 nM, 1 내지 50 nM, 1 내지 40 nM, 1 내지 30 nM, 1 내지 20 nM, 또는 약 1 내지 10 nM일 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 중합효소의 농도는 약 10 내지 50 nM, 20 내지 50 nM, 또는 30 내지 50 nM이다. 100 내지 10000 단위/ml의 농도의 RNA 중합효소가 사용될 수 있으며, 예를 들어 100 내지 9000 단위/ml, 100 내지 8000 단위/ml, 100 내지 7000 단위/ml, 100 내지 6000 단위/ml, 100 내지 5000 단위/ml, 100 내지 1000 단위/ml, 200 내지 2000 단위/ml, 500 내지 1000 단위/ml, 500 내지 2000 단위/ml, 500 내지 3000 단위/ml, 500 내지 4000 단위/ml, 500 내지 5000 단위/ml, 500 내지 6000 단위/ml, 1000 내지 7500 단위/ml 및 2500 내지 5000 단위/ml의 농도가 사용될 수 있다.
반응 혼합물 중 각 리보뉴클레오티드(예: ATP, UTP, GTP 및 CTP)의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 예를 들어 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 8 mM, 약 1 mM 내지 약 6 mM, 약 3 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 8 mM, 약 3 mM 내지 약 6 mM, 약 4 mM 내지 약 5 mM이다. 일부 구현예에서, 각 리보뉴클레오티드는 반응 혼합물 중 약 5 mM이다. 일부 구현예에서, 반응물에 사용되는 rNTP의 총 농도(예를 들어 ATP, GTP, CTP 및 UTP를 합한)는 1 mM 내지 40 mM의 범위이다. 일부 구현예에서, 반응물에 사용되는 rNTP의 총 농도(예를 들어 ATP, GTP, CTP 및 UTP를 합한)는 1 mM 내지 30 mM, 또는 1 mM 내지 28 mM, 또는 1 mM 내지 25 mM, 또는 1 mM 내지 20 mM의 범위이다. 일부 구현예에서, 총 rNTP 농도는 30 mM 미만이다. 일부 구현예에서, 총 rNTP 농도는 25 mM 미만이다. 일부 구현예에서, 총 rNTP 농도는 20 mM 미만이다. 일부 구현예에서, 총 rNTP 농도는 15 mM 미만이다. 일부 구현예에서, 총 rNTP 농도는 10 mM 미만이다.
RNA 중합효소 반응 완충액은 일반적으로 염/완충제, 예를 들어 Tris, HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 인산나트륨, 염화나트륨 및 염화마그네슘을 포함한다.
반응 혼합물의 pH는 약 6 내지 8.5, 6.5 내지 8.0, 7.0 내지 7.5일 수 있고, 일부 구현예에서 pH는 7.5이다.
(예를 들어 위에 기재한 바와 같은, 그리고 원하는 양의 RNA를 제공하기에 충분한 양/농도의) 선형 또는 선형화된 DNA 주형, RNA 중합효소 반응 완충액 및 RNA 중합효소를 조합하여 반응 혼합물을 형성한다. 반응 혼합물은 약 37℃ 내지 약 42℃에서 30분 내지 6시간, 예를 들어 약 60분 내지 약 90분 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 적합한 RNA 중합효소 반응 완충액(최종 반응 혼합물 pH 약 7.5) 중 약 5 mM의 NTP, 약 0.05 mg/mL의 RNA 중합효소 및 약 0.1 mg/ml의 DNA 주형을 약 37℃ 내지 약 42℃에서 60 내지 90분 동안 인큐베이션한다.
일부 구현예에서, 반응 혼합물은 RNA 중합효소 특이적 프로모터가 있는 선형화된 이중 가닥 DNA 주형, RNA 중합효소, RNase 억제제, 피로포스파타제, 29 mM의 NTP, 10 mM의 DTT 및 반응 완충액(10x에서 800 mM의 HEPES, 20 mM의 스페르미딘, 250 mM의 MgCh, pH 7.7인 경우) 및 원하는 반응 부피까지의 충분한 양(QS)의 RNase 불포함 물을 포함하며, 이어서 이 반응 혼합물을 37°C에서 60분 동안 인큐베이션한다. 이어서 중합효소 반응을 DNase I과 DNase I 완충액(10x에서 100 mM의 Tris-HCl, 5 mM의 MgCh 및 25 mM의 CaCh, pH 7.6인 경우)을 첨가하여 ??칭하여 정제를 위한 제제 중 이중 가닥 DNA 주형의 소화를 촉진한다. 이 구현예는 100 g의 mRNA를 생산하는 데 충분한 것으로 나타났다.
일부 구현예에서, 반응 혼합물은 1~10 mM 범위의 농도의 NTP, 0.01~0.5 mg/ml 범위의 농도의 DNA 주형 및 0.01~0.1 mg/ml 범위의 농도의 RNA 중합효소를 포함한다. 예를 들어, 반응 혼합물은 5 mM 농도의 NTP, 0.1 mg/ml 농도의 DNA 주형 및 0.05 mg/ml 농도의 RNA 중합효소를 포함한다.
뉴클레오티드
다양한 자연 발생적 또는 변형된 뉴클레오시드를 사용하여 본 발명에 따른 mRNA을 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예: 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예: 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 슈도우리딘(예: N-1-메틸-슈도우리딘), 2-티오우리딘 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예: 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예: 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기(예: 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 비표준 뉴클레오티드 잔기는 예를 들어 5-메틸-시티딘("5mC"), 슈도우리딘("ψU") 및/또는 2-티오-우리딘("2sU")을 포함할 수 있다. 이러한 잔기 및 이들의 mRNA로의 통합에 대한 논의는 예를 들어 미국 특허 번호 8,278,036 또는 WO 2011012316 참조. mRNA는 RNA일 수 있는데, 이는 U 잔기의 25%가 2-티오-우리딘이고 C 잔기의 25%가 5-메틸시티딘인 RNA로 정의된다. RNA의 사용에 대한 교시는 미국 특허 공개 US20120195936 및 국제 공개 WO 2011012316에 개시되어 있으며, 이들 둘 모두는 전체가 참조로 본원에 포함된다. 비표준 뉴클레오티드 잔기의 존재는 동일한 서열을 갖지만 표준 잔기만을 함유하는 대조군 mRNA보다 mRNA를 더 안정하게 하고/하거나 덜 면역원성을 갖게 할 수 있다. 추가 구현예에서, mRNA는 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린 시토신으로부터 선택된 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기뿐만 아니라 이러한 변형과 다른 핵염기 변형의 조합도 포함할 수 있다. 일부 구현예는 푸라노스 고리 또는 핵염기에 대한 추가 변형을 추가로 포함할 수 있다. 추가 변형에는 예를 들어 당 변형 또는 치환(예: 2'-O-알킬 변형, 잠금 핵산(LNA) 중 하나 이상)이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 추가적인 폴리뉴클레오티드 및/또는 펩티드 폴리뉴클레오티드(PNA)와 복합체화되거나 혼성화될 수 있다. 당 변형이 2'-O-알킬 변형인 일부 구현예에서, 이러한 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 2'-O-메틸 변형, 2'-O-메톡시에틸 변형 및 2'-데옥시 변형을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 변형 중 임의의 것은 뉴클레오티드의 0 내지 100%, 예를 들어 개별적으로 또는 조합하여 구성 뉴클레오티드의 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% 초과 또는 100%로 존재할 수 있다.
합성 후 처리
일반적으로 5' 캡 및/또는 3' 테일은 합성 후에 추가될 수 있다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 저항성을 제공하는 데 중요하다. "테일"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
5' 캡
5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 첫째, RNA 말단 포스파타제는 5' 뉴클레오티드로부터 말단 포스페이트 기로부터 말단 인산염 기들 중 하나를 제거하여, 2개의 말단 인산염을 남기고; 구아노신 삼인산염(GTP)은 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 인산염에 추가되어, 5'5'5 삼인산 연결을 생성하고; 그런 다음, 구아닌의 7-질소는 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예에는 m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 캡 구조는 공개된 미국 출원 번호 US 2016/0032356 및 2017년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 62/464,327에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
3'-폴리 A 테일
3' 말단에서 "테일"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 3' 테일은 5' 캡 추가 전에, 후에 또는 동시에 추가될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일은 동시전사적으로 추가된다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일은 전사 후에 추가된다. 일부 구현예에서, 폴리 C 테일은 동시전사적으로 추가된다. 일부 구현예에서, 폴리 C 테일은 전사 후에 추가된다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 25 내지 5,000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 75개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 150개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 250개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 350개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 450개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 550개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 650개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 750개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 850개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 950개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 1000개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 1500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 2000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 2500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 3000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 3500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 4000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 4500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일의 길이는 5000개의 뉴클레오티드이다.
일반적으로 테일 구조에는 폴리 A 및/또는 폴리 C 테일이 포함된다(A, 아데노신; C, 시토신). 일부 구현예에서, mRNA의 3' 말단의 폴리 A 또는 폴리 C 테일은 각각 적어도 25개의 아데닌 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 50개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 150개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 200개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 250개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 300개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 350개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 400개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 450개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 500개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 550개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 650개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 700개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 750개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 800개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 850개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 900개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 950개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 적어도 1 kb의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 2 kb의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 3 kb의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 4 kb의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 5 kb의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리 A 또는 폴리 C 테일은 각각 약 10 내지 800개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드(예를 들어, 약 10 내지 200개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 300개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 400개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 500개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 550개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 50 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 100 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 150 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 200 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 250 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 300 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 350 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 400 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 450 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 500 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 150개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 60개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드)일 수 있다. 일부 구현예에서, 테일 구조에는 본원에 기재된 다양한 길이의 폴리 A 및 폴리 C 테일의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 구조는 적어도 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리 A 테일 구조는 적어도 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 캡핑 및/또는 테일링이 없으면 조기 불발 mRNA 전사체의 크기가 검출하기에는 너무 작을 수 있기 때문에 5' 캡 및/또는 3' 테일의 추가는 시험관 내 합성 중에 생성되는 불발 전사체(abortive transcipt)의 검출을 용이하게 한다. 따라서, 일부 구현예에서, mRNA의 순도(예를 들어, mRNA에 존재하는 불발 전사체의 수준)를 테스트하기 전에 5' 캡 및/또는 3' 테일이 합성된 mRNA에 추가된다. 일부 구현예에서, 5' 캡 및/또는 3' 테일은 mRNA가 정제되기 전에 합성된 mRNA에 추가된다. 다른 구현예에서, 5' 캡 및/또는 3' 테일은 mRNA가 정제된 후 합성된 mRNA에 추가된다.
mRNA의 정제
본 발명에 따라 합성된 mRNA는 쇼트머(shortmer)를 제거하는 단계 없이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 합성된 mRNA는 추가로 정제될 수 있다. 본 발명에 따라 합성된 mRNA를 정제하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA의 정제는 원심분리, 여과 및/또는 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성된 mRNA는 에탄올 침전 또는 여과 또는 크로마토그래피, 또는 겔 정제 또는 임의의 다른 적합한 수단에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPLC에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 당업자에게 잘 알려진 표준 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 용액에서 추출된다. 일부 구현예에서, mRNA는 접선 유동 여과를 사용하여 정제된다. 적합한 정제 방법에는 US 2016/0040154, US 2015/0376220, 2018년 2월 27일에 출원된 "전령 RNA의 정제 방법"이라는 제목의 PCT 출원 PCT/US18/19954, 및 2018년 2월 27일에 출원된 "전령 RNA의 정제 방법"이라는 제목의 PCT 출원 PCT/US18/19978에 기재된 방법이 포함되며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함되며 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 후에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전과 후에 정제된다.
일부 구현예에서, mRNA는 원심분리에 의해 캡핑 및 테일링의 전이나 후에 또는 캡핑 및 테일링의 전과 후에 정제된다.
일부 구현예에서, mRNA는 여과에 의해 캡핑 및 테일링의 전이나 후에 또는 캡핑 및 테일링의 전과 후에 정제된다.
일부 구현예에서, mRNA는 접선 유동 여과(TFF)에 의해 캡핑 및 테일링의 전이나 후에 또는 캡핑 및 테일링의 전과 후에 정제된다.
일부 구현예에서, mRNA는 크로마토그래피에 의해 캡핑 및 테일링의 전이나 후에 또는 캡핑 및 테일링의 전과 후에 정제된다.
mRNA의 특성화
mRNA의 전장 또는 불발 전사체는 당업계에서 이용 가능한 임의의 방법을 사용하여 검출하고 정량화할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성된 mRNA 분자는 블롯팅, 모세관 전기영동, 크로마토그래피, 형광, 겔 전기영동, HPLC, 은 염색, 분광법, 자외선(UV), 또는 UPLC, 또는 이들의 조합을 사용하여 검출된다. 당업계에 공지된 다른 검출 방법이 본 발명에 포함된다. 일부 구현예에서, 합성된 mRNA 분자는 모세관 전기영동에 의한 분리와 함께 UV 흡수 분광법을 사용하여 검출된다. 일부 구현예에서, mRNA는 겔 전기영동 전에 먼저 글리옥살 염료에 의해 변성된다("글리옥살 겔 전기영동"). 일부 구현예에서, 합성된 mRNA는 캡핑 또는 테일링 전에 특성화된다. 일부 구현예에서, 합성된 mRNA는 캡핑 및 테일링 후에 특성화된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 mRNA는 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만의 전장 mRNA 이외의 불순물을 포함한다. 불순물에는 IVT 오염물질, 예를 들어 단백질, 효소, 유리 뉴클레오티드 및/또는 쇼트머가 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 mRNA에는 쇼트머 또는 불발 전사체가 실질적으로 없다. 특히, 본 발명에 따라 생산된 mRNA는 모세관 전기영동 또는 글리옥살 겔 전기영동에 의해 검출할 수 없는 수준의 쇼트머 또는 불발 전사체를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "쇼트머" 또는 "불발 전사체"라는 용어는 전장 미만의 임의의 전사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "쇼트머" 또는 "불발 전사체"는 길이가 100개 미만의 뉴클레오티드, 90개 미만, 80개 미만, 70개 미만, 60개 미만, 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만, 또는 10개 미만의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 쇼트머는 5'-캡 및/또는 3'-폴리 A 테일을 추가한 후에 검출되거나 정량화된다.
단일중합체 핵산 트랙트
일부 양태에서, 본 발명은 mRNA를 작은 홈 결합 염료와 접촉시킨 후, mRNA를 하나 이상의 리보뉴클레아제로 처리하고, 모세관 전기영동을 수행하여 단일중합체 뉴클레오티드 길이를 결정하는 단계를 포함하는, mRNA를 포함하는 핵산에서 단일중합체 뉴클레오티드 길이를 측정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법의 하나 이상의 단계는 자동화된다. 일부 구현예에서, 방법은 고속 처리 방법이다.
일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 A, U, G, 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 아데닌이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 우라실이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 구아닌이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 시토신이다.
본 발명의 방법에 따라 측정된 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 약 25개의 뉴클레오티드 내지 약 5000개 초과의 뉴클레오티드 범위이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 약 25개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 약 150개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 또는 약 200개 초과의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 약 25개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 약 150개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드 또는 약 200개 초과의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개의 뉴클레오티드 내지 5,000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 100개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 150개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 250개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 300개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 350개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 400개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 450개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 500개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 550개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 600개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 650개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 700개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 750개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 800개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 850개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 900개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 950개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 1000개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 약 1100 내지 5000개의 뉴클레오티드이다.
단일중합체 뉴클레오티드는 예를 들어, 단백질 결합 영역, 상류에서 프로모터 요소 및 뉴클레오솜 구조에서 DNA 위치 결정의 여러 기능을 수행한다. 본 발명의 방법은 무엇보다도 DNA 및 RNA를 비롯한 핵산에서 단일중합체 서열의 길이를 측정하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 반복 단위(SSR), 미세부수체, 미소부수체 및 거대부수체를 함유하는 단일중합체의 길이를 측정하는 방법을 추가로 제공한다. SSR은 1~5 bp의 직렬 반복 단위로 구성된다. 예를 들어, 가장 풍부한 SSR은 폴리 dA-폴리 dT 및 폴리 dG-폴리 dC이며 일반적으로 비암호화 영역에서 발견되며 길이가 9 bp보다 큰 경우가 많다. 폴리 dA-폴리 dT 트랙트는 AT가 풍부한 서열에서 일반적이다. SSR은 서열 특이적 DNA 결합에서 역할을 한다.
미세부수체는 약 10 bp의 반복부로 구성되며 6~8 bp의 반복부를 포함하는, 텔로미어를 포함한 영역에서 종종 발견된다. 암호화 영역에서 단일중합체로 인한 프레임 이동 오류는 암을 유발한다. 몇몇 암에서, 종양 샘플에서 DNA 미세부수체의 길이를 측정하면 미세부수체의 불안정성의 척도(더 짧아졌는지 또는 길어졌는지)를 알 수 있어, 암의 진행을 알 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 10~100 bp 반복 단위로 구성된 미소부수체의 길이를 측정하는 데 사용된다. 미소부수체는 동원체와 이질염색질 영역에서 종종 발견된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 100 bp 초과의 반복 단위를 포함하는 거대부수체의 길이를 측정하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 바이러스 유사 입자를 만드는 데 사용되는 폴리 A 및 폴리 U와 같은 RNA 단일중합체의 길이를 측정하는 데 사용되는데, 이들은 염기 혼합물을 포함하는 일반 조성을 갖는 RNA에 비해 이점을 제공하기 때문이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 단일중합체 뉴클레오티드를 포함하는 차세대 시퀀싱 리드에서 품질 관리로서 단일중합체의 길이를 측정하는 데 사용된다. 짧은 리드로부터의 반복적인 DNA 서열 조립은 미세부수체와 같은 반복 서열의 길이를 결정할 수 없으며, 이들은 종종 보고된 서열에서 생략된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 직렬 반복부, 산재된 반복부, 전이성 요소, DNA 트랜스포존, 레트로트랜스포존, SINE(Short Interspersed Nuclear Elements), LINE(Long Interspersed Nuclear Elements), 및 CRISPR 서열에서 단일중합체 뉴클레오티드의 길이를 측정하는 데 사용된다.
실시예
본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예에 따라 구체적으로 기재되었지만, 다음의 실시예는 본 발명의 화합물을 설명하기 위한 것일 뿐이며 이를 제한하려는 의도는 아니다.
mRNA의 합성
아래의 각 예에서 mRNA 합성은 완전한 RNase가 없는 조건에서 수행되었다. 다음 실시예에서, mRNA는 선형화된 DNA 주형으로부터 시험관 내 전사를 통해 합성되었다. 원하는 mRNA 전구체(IVT) 구축물을 생산하기 위해 약 8 mg의 선형화된 DNA, rNTP(7.25 mM), DTT(10 mM), T7 RNA 중합효소, RNase 억제제, 피로포스파타제 및 반응 완충액(10x, 800 mM HEPES)(pH 8.0), 20 mM의 스페르미딘, 250 mM의 MgCh, pH 7.7)의 혼합물을 RNase 불포함 물로 최종 부피 180 mL로 제조했다. 반응 혼합물을 37℃에서 20분 내지 60분의 시간 범위 동안 인큐베이션한다. 완료되면 혼합물을 추가 15분 동안 DNase I으로 처리하고 이에 따라 ??칭한다.
5' 캡과 3' 테일 추가
전술한 IVT 단계로부터 정제된 mRNA 생성물을 65℃에서 10분 동안 변성시켰다. 별도로, GTP(1.0 mM), S-아데노실 메티오닌, RNase 억제제, 2'-O-메틸트랜스퍼라제 및 구아닐릴 트랜스퍼라제의 일부를 반응 완충액(10x, 500 mM Tris-HCl(pH 8.0), 60 mM KCl, 12.5 mM MgCh)과 함께 혼합하여 최종 농도 1.6 L로 만든다. 변성 시, mRNA를 얼음 위에서 냉각시킨 후 반응 혼합물에 첨가하였다. 합한 용액을 37℃에서 25~90분 동안 일정 시간 동안 인큐베이션하였다. 완료 시, ATP(2.0 mM), 폴리 A 중합효소 및 테일링 반응 완충액(10x, 500 mM Tris-HCl(pH 8.0), 2.5 M NaCl, 100 mM MgCh)의 분취량을 첨가하고 전체 반응 혼합물을 37℃에서 20~45분 범위의 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 완료 시, 최종 반응 혼합물을 ??칭하고 이에 따라 정제하였다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 폴리 A 테일 길이를 측정하였다.
실시예 1.
150개 미만의 뉴클레오티드의 짧은 테일 길이를 갖는 EPO mRNA의 폴리 A 테일 길이 측정
본 실시예는 예시적인 테일 길이가 약 25 nt, 50 nt 및 114 nt인 예시적인 EPO mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법을 예시한다.
간략하게, 예시적인 EPO mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)로 소화시켰다. 이 실시예에서는, 일부 구현예에서, RNase A를 사용하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 모세관 전기영동으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하였다.
mRNA 샘플을 유기 용매인 메탄아미드(포름아미드)와 함께 75°C에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 단편 분석기 기계를 사용하여 전개하여 CE를 수행하였다. 이 과정에서 샘플을 추가하고 전개를 시작하기 전에 Sybr Gold 염료를 스톡의 1:10,000 희석도로 RNA 분리 겔에 첨가하였다. 이어서 염료는 실온에서 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 비공유적으로 mRNA 샘플에 결합되었다.
Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플 및 전통적인 RNase A 소화 샘플에 대한 폴리 A 테일 길이가 25 nt, 50 nt 및 114 nt인 동시전사적으로 추가된 폴리 A 테일을 포함하는 EPO mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 2a에 도시되어 있다. 분석 결과는 폴리 A 테일 길이가 25 nt, 50 nt 및 114 nt인 EPO mRNA에 대해 관찰된 테일 길이를 y축에, 이론적 테일 길이를 x축에 그래프로 도시한 것이다(도 2b). Agilent™ 염료 처리된 샘플(매우 낮은 원시 신호에서 플롯팅됨), Sybr gold™ 염료 처리된 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 2b에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 관찰된 테일 길이는 분석된 세 가지 테일 길이, 즉 25 nt, 50 nt 및 114 nt 모두에서 Agilent™ 염료 처리된 샘플에서 과대평가되었고 매우 부정확하다. Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플과 RNase A 소화 샘플에 이은 Biorad MW 분석은 관찰된 테일 길이와 이론적인 테일 길이 사이에 좋은 상관관계를 보여주었다.
종합적으로, 본 실시예의 결과는 mRNA를 작은 홈 결합 염료로 결합시킨 후 RNase 소화 및 모세관 전기영동을 수행하는 방법으로 폴리 A 테일 길이가 정확하게 측정되었음을 보여주었다. 이 방법은 매우 정확했고 관찰된 폴리 A 테일 길이는 이론적인 테일 길이와 유사했다. 이 방법은 정확도 면에서 전통적인 RNase A 소화에 이어 Biorad MW 분석을 수행하는 것과 비슷했다.
실시예 2.
100개 초과의 뉴클레오티드의 긴 테일 길이를 갖는 EPO mRNA의 폴리 A 테일 길이 측정
본 실시예는 예시적인 테일 길이가 약 100 nt, 200 nt, 300 nt, 4000 nt, 500 nt 및 600 nt인 예시적인 EPO mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법을 예시한다.
간략하게, 예시적인 EPO mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)로 소화시켰다. 이 실시예에서는, 일부 구현예에서, RNase A를 사용하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 모세관 전기영동으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하였다.
mRNA 샘플을 유기 용매인 메탄아미드(포름아미드)와 함께 75°C에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 단편 분석기 기계를 사용하여 전개하여 CE를 수행하였다. 이 과정에서 샘플을 추가하고 전개를 시작하기 전에 Sybr Gold 염료를 스톡의 1:10,000 희석도로 RNA 분리 겔에 첨가하였다. 이어서 염료는 실온에서 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 비공유적으로 mRNA 샘플에 결합되었다.
Sybr gold™ 염료 처리된 CE에 대한 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 EPO mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 3a에 도시되어 있다. Agilent™ 삽입 염료 처리된 CE에 대한 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 EPO mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 3b에 도시되어 있다.
일부 구현예에서, 폴리 A 테일 길이를 또한 전통적인 RNase A 방법에 의해 평가하였다. 간략하게, mRNA 샘플을 RNase A를 사용하여 30분 동안 소화시키고 2% 아가로스 겔에서 2시간 30분 동안 전개시켰다. 생성물은 도 4a에 도시되어 있다. 그런 다음 폴리 A 테일 길이를 Biorad MW 분석으로 분석하였다.
분석 결과는 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 EPO mRNA에 대해 관찰된 테일 길이를 y축에, 이론적 테일 길이를 x축에 그래프로 도시한 것이다(도 4b). Agilent™ 염료 처리된 샘플(매우 낮은 원시 신호에서 플롯팅됨), Sybr gold™ 염료 처리된 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 4b에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 관찰된 테일 길이는 분석된 여섯 가지 테일 길이, 즉 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt 모두에서 Agilent™ 염료 처리된 샘플에서 매우 부정확하다. 관찰된 테일 길이는 100 nt에 대해 매우 과소평가되고 200~600 nt의 테일 길이에 대해 과대평가된다. Sybr gold™ 염료 처리된 CE 샘플은 관찰된 테일 길이와 이론적인 테일 길이 사이에 좋은 상관관계를 보여주었다. Sybr gold™ 처리된 CE 샘플은 전통적인 RNase A 방법에 이어 Biorad MW 분석을 수행한 것보다 관찰된 테일 길이와 이론적인 테일 길이 사이의 향상된 상관관계를 보여주었다.
폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후의 모세관 전기영동도가 도 5a에 도시되어 있다. 폴리 A 테일 길이가 100, 200, 300, 400, 500 및 600 nt인 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 1.2 μg의 RNase A 소화 후의 모세관 전기영동도가 도 5b에 도시되어 있다.
Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플과 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 샘플 사이의 신호 강도 비교가 도 6a 및 6b에 도시되어 있다. 폴리 A 테일 길이가 200 nt인 Sybr gold™ 염료 처리된 EPO mRNA 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도가 도 6a에 도시되어 있다. 폴리 A 테일 길이가 200 nt인 Agilent™ 염료 처리된 EPO mRNA 1.2 μg의 RNase A 소화 후 모세관 전기영동도가 도 6b에 도시되어 있다.
종합적으로, 본 실시예의 결과는 mRNA를 작은 홈 결합 염료로 결합시킨 후 RNase 소화 및 모세관 전기영동을 수행하는 방법으로 폴리 A 테일 길이가 정확하게 측정되었음을 보여주었다. 이 방법은 매우 정확했고 관찰된 폴리 A 테일 길이는 이론적인 테일 길이와 유사했다. 이 방법은 정확도 면에서 전통적인 RNase A 소화에 이어 Biorad MW 분석을 수행하는 것과 비슷했다.
실시예 3.
RNase A 단독 또는 RNase A와 RNase T1 효소를 모두 사용한 mRNA 소화를 포함하는 방법에 의한 폴리 A 테일 길이 측정의 정확도 비교
본 실시예는 RNase A 단독 또는 RNase A와 RNase T1 효소 둘 다를 이용한 mRNA 소화를 포함하는 방법을 사용하여 폴리 A 테일 길이 측정의 정확도를 비교한 것을 예시한다.
RNase A는 C 및 U 잔기 다음에서 RNA를 분해하는 반면, RNase T1은 G 잔기 다음에서 분해한다. RNase A 및 RNase T1을 사용한 소화는 폴리 A 테일만 남도록 보장한다. 본 실시예에서는, RNase A 또는 RNase A 및 RNase T1로 소화시킨 50 내지 1800개 뉴클레오티드 길이 범위의 폴리 A 테일 길이를 갖는 예시적인 EPO mRNA 샘플에 대해 폴리 A 테일 길이 측정의 정확도를 비교했다.
이 실시예에서, 50 내지 1800개의 뉴클레오티드(예를 들어, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 1000 nt, 1500 nt 및 1800 nt)의 이론적 폴리 A 테일 길이를 갖는 EPO mRNA의 샘플을 RNase A로 30분 동안 소화시켰다. 소화 생성물을 2% 아가로스 겔에서 전개하고, BIORAD에서 분자량을 평가하여 폴리 A 테일 길이를 결정하였다. y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적인 테일 길이 사이의 그래프를 플롯팅하였다.
병렬적으로, 50 내지 1800개의 뉴클레오티드(예를 들어, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 1000 nt, 1500 nt 및 1800 nt)의 폴리 A 테일 길이를 갖는 EPO mRNA의 샘플을 RNase A 및 RNase T1로 30분 동안 소화시켰다. 소화 생성물을 2% 아가로스 겔에서 전개하고, BIORAD에서 분자량을 평가하여 폴리 A 테일 길이를 결정하였다. y축의 관찰된 테일 길이와 x축의 이론적인 테일 길이 사이의 그래프를 플롯팅하였다.
결과는 도 7 및 표 1에 제시되어 있다. 그래프는 관찰된 테일 길이와 이론적인 테일 길이 사이의 상관관계를 보여주었다. 관찰된 테일 길이는 이론적인 테일 길이에 접근하였다.
| 이론적인 테일 길이 | Sybr Gold RNAseA(관찰된 테일 길이) | 관찰된 테일 길이:이론적인 테일 길이의 비율 | Sybr Gold RNAse A/T1(관찰된 테일 길이) | 관찰된 테일 길이:이론적인 테일 길이의 비율 |
| 50 | 178.5 | 3.57 | 244 | 4.88 |
| 100 | 232 | 2.32 | 278.5 | 2.78 |
| 200 | 379.5 | 1.89 | 401 | 2.00 |
| 500 | 1386.5 | 2.77 | 1315 | 2.63 |
| 1000 | 2608.5 | 2.60 | 2237 | 2.24 |
| 1500 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1800 | 7697 | 4.27 | 0 | 0 |
본 실시예는 또한 관찰된 테일 길이가 50 내지 1800개의 뉴클레오티드의 테일 길이를 갖는 RNase A 및 RNase A/T1 소화된 EPO mRNA 샘플에서 유사하다는 것을 입증했다.
실시예 4.
100개 초과의 뉴클레오티드의 긴 테일 길이를 갖는 CFTR mRNA의 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법
본 실시예는 예시적인 테일 길이가 약 100 nt, 200 nt, 300 nt, 4000 nt, 500 nt 및 600 nt인 예시적인 CFTR mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법을 예시한다.
간략하게, 예시적인 CFTR mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)로 소화시켰다. 이 실시예에서는, 일부 구현예에서, RNase A를 사용하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 모세관 전기영동으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하였다.
mRNA 샘플을 유기 용매인 메탄아미드(포름아미드)와 함께 75°C에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 단편 분석기 기계를 사용하여 전개하여 CE를 수행하였다. 이 과정에서 샘플을 추가하고 전개를 시작하기 전에 Sybr Gold 염료를 스톡의 1:10,000 희석도로 RNA 분리 겔에 첨가하였다. 이어서 염료는 실온에서 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 비공유적으로 mRNA 샘플에 결합되었다. 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 Sybr gold™ 염료 처리 샘플에 대해 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 CFTR mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 8a에 도시되어 있다. 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 Agilent™ 삽입 염료 처리된 CE에 대해 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 CFTR mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 8b에 도시되어 있다.
400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 포함하는 Sybr gold™ 염료 처리된 CFTR mRNA 샘플에 대한 피크를 도시하는 모세관 전기 영동도가 도 9a에 도시되어 있다. 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 포함하는 Agilent™ 삽입 염료 처리된 CFTR mRNA 샘플에 대한 피크를 도시하는 모세관 전기 영동도가 도 9b에 도시되어 있다. 결과는 Sybr gold™ 처리된 샘플(도 9a)에 비해 Agilent™ 염료 처리된 샘플(도 9b)에서 신호 강도가 훨씬 낮다는 것을 보여준다.
분석 결과는 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 CFTR mRNA에 대해 관찰된 테일 길이를 y축에, 이론적 테일 길이를 x축에 그래프로 도시한 것이다(도 10). Agilent™ 염료 처리된 샘플(매우 낮은 원시 신호에서 플롯팅됨), Sybr gold™ 염료 처리된 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, 관찰된 테일 길이는 Agilent™ 염료 처리된 샘플에서 100 nt 및 200 nt 길이에서 과소평가되지만 300~600 nt의 테일 길이에서는 과대평가되어 전체적으로 부정확한 폴리 A 테일 길이 측정을 초래한다.
RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석을 수행한 결과 100 nt와 같은 짧은 테일 길이에 대한 이론적인 테일 길이에 필적하는 정확한 테일 길이 측정값이 나타났다. 그러나 200~600 nt 길이에서, 관찰된 테일 길이는 이론적인 테일 길이에 비해 과소평가되었다.
Sybr gold™ 처리된 샘플은 100 nt에서 정확한 짧은 테일 길이 측정값을 보여주었다. 더 긴 테일 길이는 200~600 nt의 테일 길이에 대한 RNase A 방법에 이어진 Biorad MW 측정으로 관찰한 것보다 더 정확하게 측정되었다.
실시예 5.
100개 초과의 뉴클레오티드의 긴 테일 길이를 갖는 OTC mRNA의 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법
본 실시예는 예시적인 테일 길이가 약 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 예시적인 OTC mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법을 예시한다.
간략하게, 예시적인 OTC mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)로 소화시켰다. 이 실시예에서는, 일부에서, RNase A를 사용하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 모세관 전기영동으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하였다.
mRNA 샘플을 유기 용매인 메탄아미드(포름아미드)와 함께 75°C에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 단편 분석기 기계를 사용하여 전개하여 CE를 수행하였다. 이 과정에서 샘플을 추가하고 전개를 시작하기 전에 Sybr Gold 염료를 스톡의 1:10,000 희석도로 RNA 분리 겔에 첨가하였다. 이어서 염료는 실온에서 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 비공유적으로 mRNA 샘플에 결합되었다.
400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 Sybr gold™ 염료 처리 샘플에 대해 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 OTC mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 11a에 도시되어 있다. 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 Agilent™ 삽입 염료 처리된 CE에 대해 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 OTC mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 11b에 도시되어 있다.
400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 포함하는 Sybr gold™ 염료 처리된 OTC mRNA 샘플에 대한 피크를 도시하는 모세관 전기 영동도가 도 12a에 도시되어 있다. 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 포함하는 Agilent™ 삽입 염료 처리된 OTC mRNA 샘플에 대한 피크를 도시하는 모세관 전기 영동도가 도 12b에 도시되어 있다. 결과는 Sybr gold™ 처리된 샘플(도 12a)에 비해 Agilent™ 염료 처리된 샘플(도 12b)에서 신호 강도가 훨씬 낮다는 것을 보여준다.
분석 결과는 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 OTC mRNA에 대해 관찰된 테일 길이를 y축에, 이론적 테일 길이를 x축에 그래프로 도시한 것이다(도 13). Agilent™ 염료 처리된 샘플(매우 낮은 원시 신호에서 플롯팅됨), Sybr gold™ 염료 처리된 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 13에 도시된 바와 같이, 관찰된 테일 길이는 Agilent™ 염료 처리된 샘플에서 100 nt 길이에서 과소평가되지만 200~600 nt의 테일 길이에서는 과대평가되어 전체적으로 부정확한 폴리 A 테일 길이 측정을 초래한다.
RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석을 수행한 결과 100 nt와 같은 짧은 테일 길이에 대한 이론적인 테일 길이에 필적하는 정확한 테일 길이 측정값이 나타났다. 그러나 200~600 nt 테일 길이에서, 관찰된 테일 길이는 이론적인 테일 길이에 비해 과소평가되었다.
Sybr gold™ 처리된 샘플은 100 nt~400 nt의 정확한 테일 길이 측정값을 보여주었다. 500 nt 및 600 nt와 같은 긴 테일 길이는 100 nt~600 nt의 테일 길이에 대한 RNase A 방법에 이어진 Biorad MW 측정으로 관찰한 것보다 이론적인 테일 길이에 더 밀접하게 상응하였다.
실시예 6. 100개 초과의 뉴클레오티드의 긴 테일 길이를 갖는 MMA mRNA의 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법
본 실시예는 예시적인 테일 길이가 약 100 nt, 200 nt, 300 nt, 4000 nt, 500 nt 및 600 nt인 예시적인 MMA mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법을 예시한다.
간략하게, 예시적인 MMA mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)로 소화시켰다. 이 실시예에서는, 일부 구현예에서, RNase A를 사용하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 모세관 전기영동으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하였다.
mRNA 샘플을 유기 용매인 메탄아미드(포름아미드)와 함께 75°C에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 mRNA 샘플을 단편 분석기 기계를 사용하여 전개하여 CE를 수행하였다. 이 과정에서 샘플을 추가하고 전개를 시작하기 전에 Sybr Gold 염료를 스톡의 1:10,000 희석도로 RNA 분리 겔에 첨가하였다. 이어서 염료는 실온에서 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 비공유적으로 mRNA 샘플에 결합되었다.
400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 Sybr gold™ 염료 처리 샘플에 대해 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 MMA mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 14a에 도시되어 있다. 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 Agilent™ 삽입 염료 처리된 CE에 대해 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 폴리 A 테일을 포함하는 MMA mRNA의 RNase A 겔 분석이 도 14b에 도시되어 있다.
400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 포함하는 Sybr gold™ 염료 처리된 MMA mRNA 샘플에 대한 피크를 도시하는 모세관 전기 영동도가 도 15a에 도시되어 있다. 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 갖는 소화되지 않은 대조군과 비교하여 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt의 폴리 A 테일 길이를 포함하는 Agilent™ 삽입 염료 처리된 MMA mRNA 샘플에 대한 피크를 도시하는 모세관 전기 영동도가 도 15b에 도시되어 있다. 결과는 Sybr gold™ 처리된 샘플(도 15a)에 비해 Agilent™ 염료 처리된 샘플(도 15b)에서 신호 강도가 훨씬 낮다는 것을 보여준다.
분석 결과는 폴리 A 테일 길이가 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt 및 600 nt인 MMA mRNA에 대해 관찰된 테일 길이를 y축에, 이론적 테일 길이를 x축에 그래프로 도시한 것이다(도 16). Agilent™ 염료 처리된 샘플(매우 낮은 원시 신호에서 플롯팅됨), Sybr gold™ 염료 처리된 샘플, RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석 및 이론적 테일 길이에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 16에 도시된 바와 같이, 관찰된 테일 길이는 Agilent™ 염료 처리된 샘플에서 100 nt 길이에서 과소평가되지만 200~600 nt의 테일 길이에서는 과대평가되어 전체적으로 부정확한 폴리 A 테일 길이 측정을 초래한다.
RNase A 소화 샘플에 이어 Biorad MW 분석을 수행한 결과 100 nt와 같은 짧은 테일 길이에 대한 이론적인 테일 길이에 필적하는 정확한 테일 길이 측정값이 나타났다. 그러나 200~600 nt 테일 길이에서, 관찰된 테일 길이는 이론적인 테일 길이에 비해 과소평가되었다.
Sybr gold™ 처리된 샘플은 100 nt~300 nt의 정확한 테일 길이 측정값을 보여주었다. 400 nt~600 nt와 같은 긴 테일 길이는 400 nt~600 nt의 테일 길이에 대한 RNase A 방법에 이어진 Biorad MW 측정으로 관찰한 것보다 이론적인 테일 길이에 더 밀접하게 상응하였다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시이며, 이로 제한하고자 하는 것이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본원에 기재되어 있다.
균등물
당업자는 단지 통상적인 실험을 이용하여 본원에서 기술된 발명의 구체적인 구현예에 대한 여러 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명으로 제한됨을 의도하는 것이 아니며, 다음의 청구범위에 기재된 바와 같다.
SEQUENCE LISTING
<110> TRANSLATE BIO, INC.
<120> METHODS FOR MEASURING POLY A TAIL LENGTH
<130> MRT-2220WO1
<150> 63/181,488
<151> 2019-04-29
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> T3 bacteriophage
<400> 1
aattaaccct cactaaaggg aga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> T7 bacteriophage
<400> 2
taatacgact cactataggg aga 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> SP6 bacteriophage
<400> 3
atttacgaca cactatagaa gaa 23
Claims (31)
- mRNA 샘플에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법으로서,
(a) mRNA 샘플을 작은 홈 결합 염료와 접촉시키는 단계;
(b) (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
(c) (b)의 샘플을 모세관 전기영동(CE)으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™, Hoechst 염료 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)인 방법.
- 제2항에 있어서, 작은 홈 결합 염료는 Sybr gold™인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 RNase는 RNase A 및 RNase T1로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 RNase는 RNase A 및 RNase T1을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, CE는 형광 기반 검출과 결합되는 방법.
- 제1항에 있어서, CE는 UV 흡수 분광법 검출과 결합되는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계는 약 15분, 30분, 45분 또는 60분 동안인 방법.
- 제8항에 있어서, (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계는 약 30분 동안인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리 A 테일 길이는 25개의 뉴클레오티드 이상인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리 A 테일 길이는 50개의 뉴클레오티드 내지 5,000개의 뉴클레오티드인 방법.
- 제11항에 있어서, 폴리 A 테일 길이는 50개 이상의 뉴클레오티드, 100개 이상의 뉴클레오티드, 150개 이상의 뉴클레오티드, 또는 200개 이상의 뉴클레오티드인 방법.
- 제11항에 있어서, 폴리 A 테일 길이는 100개의 뉴클레오티드 내지 1,500개의 뉴클레오티드인 방법.
- 제13항에 있어서, 폴리 A 테일 길이는 250개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 하나 이상의 단계는 자동화되는 방법.
- 제14항에 있어서, (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계는 자동화되는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 작은 홈 결합 염료는 단일가닥 RNA(ssRNA)에 비공유적으로 결합하는 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 작은 홈 결합 염료는 삽입 염료가 아닌 방법.
- mRNA에서 폴리 A 테일 길이를 측정하는 방법으로서,
(a) mRNA 샘플을 Sybr gold™ 작은 홈 결합 염료와 접촉시키는 단계;
(b) (a)의 mRNA 샘플을 RNaseA 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계; 및
(c) (b)의 샘플을 모세관 전기영동(CE)으로 분석하여 mRNA의 폴리 A 테일 길이를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 제19항에 있어서, CE는 형광 기반 검출과 결합되는 방법.
- 제19항에 있어서, CE는 UV 흡수 분광법 검출과 결합되는 방법.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 mRNA 샘플을 RNaseA 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계는 약 15분, 30분, 45분 또는 60분 동안인 방법.
- 제22항에 있어서, (a)의 mRNA 샘플을 RNaseA 및 RNase T1과 함께 인큐베이션하는 단계는 약 30분 동안인 방법.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리 A 테일 길이는 25개 이상의 뉴클레오티드, 50개 이상의 뉴클레오티드, 100개 이상의 뉴클레오티드, 150개 이상의 뉴클레오티드, 또는 200개 이상의 뉴클레오티드인 방법.
- 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 하나 이상의 단계는 자동화되는 방법.
- 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 고속 처리식인 방법.
- mRNA 샘플에서 단일중합체 뉴클레오티드 길이를 측정하는 방법으로서,
(a) mRNA 샘플을 작은 홈 결합 염료와 접촉시키는 단계;
(b) (a)의 mRNA 샘플을 하나 이상의 리보뉴클레아제(RNase)와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
(c) (b)의 샘플을 모세관 전기영동(CE)으로 분석하여 mRNA의 단일중합체 뉴클레오티드 길이를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 제27항에 있어서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 25개의 뉴클레오티드 이상인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개의 뉴클레오티드 내지 5,000개의 뉴클레오티드인 방법.
- 제29항에 있어서, 단일중합체 뉴클레오티드 길이는 50개 이상의 뉴클레오티드, 100개 이상의 뉴클레오티드, 150개 이상의 뉴클레오티드, 또는 200개 이상의 뉴클레오티드인 방법.
- 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단일중합체 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 A, U, G 또는 C로부터 선택되는 방법.
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