KR20230034208A - Rna 합성을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
RNA 생성물을 합성하기 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 본 개시내용은 시험관내 전사 혼합물을 인큐베이션하고 이에 의해 복수의 단일-가닥 RNA 분자를 포함하는 RNA 생성물을 생성하는 것을 포함하는 RNA 생성물을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물은 표적 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 DNA 주형; RNA 중합효소 프로모터 서열을 인식하는 적어도 하나의 RNA 중합효소; 각각의 유형이 상이한 뉴클레오시드를 포함하는 적어도 2개의 상이한 유형의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 리보뉴클레오티드; 및 삼투물질을 포함하는 전사 완충액을 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2020년 5월 1일자로 출원된 미국 가출원 번호 63/019,158의 이익을 주장하며, 그의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
mRNA 요법을 포함한 RNA 요법은 임상 환경에서 두각을 나타내고 있다. 따라서, 안전하고 효과적인 RNA 요법을 개발 및/또는 합성하는 방법이 필요하다.
본 개시내용은 높은 수율의 시험관내 전사를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 무엇보다도, 본 개시내용은 삼투물질의 부재에서 상승된 온도에서 정상적으로 기능하지 않는 RNA 중합효소(예를 들어, 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소)로 그러한 상승된 온도에서 시험관내 전사(예를 들어, 시험관내 RNA 전사)를 촉진하기 위한 수단으로서 하나 이상의 삼투물질이 사용될 수 있다는 통찰력을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 본 명세서에 기재된 기술(예를 들어, 상승된 온도(예를 들어, 야생형 RNA 중합효소가 그러한 하나 이상의 삼투물질의 부재에서 정상적으로 기능하지 않는 온도)에서 하나 이상의 삼투물질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)의 존재에서 야생형 RNA 중합효소로 RNA 전사를 수행하는 것)이 감소된 면역원성 및/또는 세포 독성을 갖는 RNA를 생성할 수 있다는 것을 추가로 제공한다. 이러한 특성은, 예를 들어, RNA 생성물의 치료 효능을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 합성된 RNA 생성물의 더 높은 순도가 인코딩된 단백질의 더 높은 효율 번역을 가능하게 할 수 있기 때문에, 본 명세서에 기재된 기술은 mRNA의 생산에 특히 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 일부 실시형태에서 mRNA이거나 이를 포함할 수 있는 RNA 생성물을 생성할 수 있다. RNA 생성물의 예는, 예를 들어, 억제성 RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유전자 요법 및 백신을 포함한다.
무엇보다도, 본 개시내용은 RNA 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 시험관내 전사 혼합물을 인큐베이션하고, 이에 의해 복수의 단일-가닥 RNA 분자를 포함하는 RNA 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물은 표적 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 DNA 주형, RNA 중합효소 프로모터 서열을 인식하는 적어도 하나의 RNA 중합효소, 각각의 유형이 상이한 뉴클레오시드를 포함하는 적어도 2개의 상이한 유형의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 리보뉴클레오티드, 및 삼투물질을 포함하는 전사 완충액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 삼투물질은 아미노산-기반 삼투물질, 메틸아민 삼투물질, 탄수화물 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 메틸아민 삼투물질은 글리세로포스포릴콜린 트리메틸아민 N-옥사이드, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 탄수화물 삼투물질은 소르비톨, 글리세롤, 미오니시톨, 디글리세롤 포스페이트, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 프롤린-기반 삼투물질, 글리신-기반 삼투물질, 엑토인-기반 삼투물질, 알라닌-기반 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 알라닌-기반 삼투물질은 베타-알라닌이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 글리신-기반 삼투물질이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 글리신-기반 삼투물질은 베타인이거나 베타인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 베타인은 시험관내 전사 혼합물에 적어도 0.25M, 적어도 0.5M, 적어도 0.75M, 적어도 1M, 적어도 1.5M, 적어도 2M 또는 적어도 2.5M의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 베타인은 시험관내 전사 혼합물에 최대 15M, 최대 10M, 적어도 5M, 또는 적어도 2.5M의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 베타인은 시험관내 전사 혼합물에 약 0.5M 내지 약 10M, 또는 약 2M 내지 약 5M의 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, RNA 중합효소는 박테리오파지 RNA 중합효소이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 박테리오파지 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소, N4 비리온 RNA 중합효소, 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 박테리오파지 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 적어도 37℃의 온도에서 발생한다.
일부 실시형태에서, T7 RNA 중합효소는 야생형 T7 RNA 중합효소이고 인큐베이션 단계는 약 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃ 또는 더 높은 온도에서 발생한다.
일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 가이드 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, siRNA, 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA, 또는 메신저 RNA(mRNA)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, mRNA 분자는 5' 캡을 포함한다.
일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 각각이 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성이다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물보다 더 낮은 수준의 이중-가닥 RNA를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 RNA 생성물로부터 임의의 이중-가닥 RNA를 제거하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서보다 더 많은 양의 단일-가닥 RNA 분자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 RNA 분자의 양은 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자의 백분율이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 인큐베이션 단계 후에 시험관내 전사 혼합물로부터 DNA를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제거하는 것은 인큐베이션 단계 후에 시험관내 전사 혼합물에 DNase를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, DNA 주형은 고체 기질 상에 고정된다. 일부 실시형태에서, DNA를 제거하는 것은 시험관내 전사 혼합물로부터 고체 기질을 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 고체 기질은 비드이다.
일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자 각각은 적어도 100개 뉴클레오티드이거나 더 긴, 예를 들어 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드이거나, 또는 더 긴 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자 각각은 200,000개 이하의 뉴클레오티드, 150,000개 이하의 뉴클레오티드, 100,000개 이하의 뉴클레오티드, 또는 50,000개 이하의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 표적 서열이 단일-가닥 RNA 분자로 전사되기에 충분한 시간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 또는 더 긴 시간 동안 수행된다.
본 개시내용은 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 RNA 생성물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물 내 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)가 세포 배양물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 시험관내 세포 배양물이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 생체외 세포 배양물이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)가 대상체에 존재한다. 일부 실시형태에서, 접촉 단계는 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생산된 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자(들)의 발현 수준과 비교하여 단일-가닥 RNA 분자(들)로부터의 발현 수준을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생산된 RNA 생성물과 접촉된 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 생존력과 비교하여, RNA 생성물과의 접촉 후 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 생존력을 증가시킨다.
본 개시내용은 또한 시험관내 전사 혼합물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물은 표적 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 DNA 주형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물은 RNA 중합효소 프로모터 서열을 인식하는 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물은 적어도 2개의 상이한 유형의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 리보뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 유형은 상이한 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물은 아미노산-기반 삼투물질, 메틸아민 삼투물질, 탄수화물 삼투물질, 또는 이의 조합을 포함하는 삼투물질을 포함하는 전사 완충액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 메틸아민 삼투물질은 글리세로포스포릴콜린, 트리메틸아민 N-옥사이드, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 탄수화물 삼투물질은 소르비톨, 글리세롤, 미오니시톨, 디글리세롤 포스페이트, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 프롤린-기반 삼투물질, 글리신-기반 삼투물질, 엑토인-기반 삼투물질, 알라닌-기반 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 알라닌-기반 삼투물질은 베타-알라닌이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 글리신-기반 삼투물질이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 글리신-기반 삼투물질은 베타인이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소는 야생형 T7 RNA 중합효소이거나 이를 포함한다.
본 개시내용은 RNA 생성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, RNA 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 가이드 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, siRNA, 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA, 또는 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 생성물은 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA 분자는 5' 캡을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 각각 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 단일-가닥 RNA 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성이다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서보다 더 낮은 수준의 이중-가닥 RNA를 갖는다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서보다 더 많은 양의 단일-가닥 RNA 분자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 RNA 분자의 양은 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자의 백분율이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.
도 1은 37℃, 45℃ 및 50℃에서 베타인의 존재 및 부재에서 본 명세서에 기재된 예시적인 T7 합성 제제로부터의 이중-가닥 DNA의 수율을 나타내는 선 그래프를 포함한다.
도 2는 본 명세서에 기술된 예시적인 방법을 포함하는, 상이한 전사 방법을 사용하여 합성된 RNA 분자로 형질감염 후 A549 세포의 생존력을 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
도 3은 본 명세서에 기술된 예시적인 방법을 포함하는, 상이한 전사 방법을 사용하여 합성된 RNA 분자에 의한 NF-kB 리포터 활성화를 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
도 4는 본 명세서에 기술된 예시적인 방법을 포함하는, 상이한 전사 방법을 사용하여 합성된 FLuc mRNA로 형질감염된 A549 세포에서 루시퍼라제 신호를 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
도 2는 본 명세서에 기술된 예시적인 방법을 포함하는, 상이한 전사 방법을 사용하여 합성된 RNA 분자로 형질감염 후 A549 세포의 생존력을 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
도 3은 본 명세서에 기술된 예시적인 방법을 포함하는, 상이한 전사 방법을 사용하여 합성된 RNA 분자에 의한 NF-kB 리포터 활성화를 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
도 4는 본 명세서에 기술된 예시적인 방법을 포함하는, 상이한 전사 방법을 사용하여 합성된 FLuc mRNA로 형질감염된 A549 세포에서 루시퍼라제 신호를 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
특정 정의
본 출원에서, 문맥상 달리 명백하지 않는 한, (i) 용어 "a"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (ii) 용어 "또는"은 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (iii) 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 단독으로 또는 하나 이상의 추가 구성요소 또는 단계와 함께 제시되든 항목별 구성요소 또는 단계를 포괄하는 것으로 이해될 수 있고; 그리고 (iv) 범위가 제공되는 경우 평가변수가 포함된다.
약 또는 대략적으로 : 값과 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 본 명세서에 사용된 용어 "약" 및 "대략적으로"는 참조된 값에 대한 맥락에서 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥에 익숙한 당업자는 그 문맥에서 "약" 또는 "대략적으로"에 의해 포괄되는 적절한 변동 정도를 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략적으로"는 참조된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 미만 이내의 값 범위를 포괄할 수 있다.
투여 : 본 명세서에 사용된 용어 "투여"는 전형적으로, 예를 들어 조성물이거나, 이에 포함되거나 또는 달리 전달되는 생성물의 전달을 달성하기 위해 세포, 조직, 대상체 또는 시스템에 조성물의 투여를 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 이용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 국소 등일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 투여는 기관지(예를 들어, 기관지 점적에 의함), 협측, 진피(예를 들어, 진피, 피내, 피부내, 경피 등에 하나 이상의 국소적일 수 있거나 이를 포함할 수 있음), 장내, 동맥-내, 피내, 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 뇌실내, 특정 기관 내(예를 들어 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(예를 들어, 기관내 점적에 의함), 질, 유리체 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 단일 용량만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 고정된 수의 용량의 적용을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간상 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간으로 분리된 개별 용량) 복용인 복용을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 복용(예를 들어, 관류)를 포함할 수 있다.
비교할 수 있는 : 본 명세서에 사용된 용어 "비교할 수 있는"은 서로 동일하지 않을 수 있지만 그 사이에 비교를 허용할 만큼 충분하게 유사하여 당업자가 관찰된 차이점 또는 유사점에 기초하여 결론이 합리적으로 도출될 수 있음을 이해할 것인, 둘 이상의 제제, 물질, 상황, 조건 세트 등을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조건, 상황, 개체 또는 모집단의 비교할 수 있는 세트는 다수의 실질적으로 동일한 특징 및 하나 또는 소수의 다양한 특성을 특징으로 한다. 당업자는 그 맥락에서 둘 이상의 그러한 제제, 물질, 상황, 조건 세트 등이 비교할 수 있는 것으로 간주되기 위해 임의의 주어진 상황에서 어느 정도의 동일성이 요구되는지 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자는 상황, 개체 또는 모집단의 세트가, 상황, 개체 또는 모집단의 상이한 세트로 또는 그 아래서 얻은 결과 또는 현상에서 차이는 변하는 이들 특징에서 변이로 인한 것이거나 변이를 나타내는 것이다는 합리적인 결론을 보증하기에 충분한 수와 유형의 실질적으로 동일한 특성에 의해 특징되어질 때, 서로 비교할 수 있음을 이해할 것이다.
발현 : 본 명세서에 사용된 용어 핵산 서열의 "발현"은 핵산 서열로부터 임의의 유전자 생성물의 생성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자 생성물은 전사체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 생성물은 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열의 발현은 다음 중 하나 이상을 포함한다: (1) (예를 들어, 전사에 의한) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생성; (2) RNA 전사체의 처리(예를 들어, 스플라이싱, 편집 등); (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형.
숙주 세포 : 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 외인성 DNA(재조합 또는 기타)가 도입된 세포를 지칭한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자는 그러한 용어가 특정 대상체 세포 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본 명세서에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 외인성 DNA(예를 들어, 재조합 핵산 서열)를 발현하기에 적합한 임의의 생명계로부터 선택된 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 것(단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포(예를 들어, 대장균, 바실러스 spp., 스트렙토마이세스 spp. 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. 세레비지애, S. 폼베, P. 파스토리스, P. 메탄올리카 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, Trichoplusia ni 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 세포 융합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트 또는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵생물이고 다음 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), 저캇, 다우디, A431 (표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3 A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 전술한 세포로부터 유래된 세포주. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함한다.
"개선하다", "증가하다", "억제하다" 또는 "감소하다" : 본 명세서에서 사용된 용어 "개선하다", "증가하다", "억제하다", "감소하다" 또는 이의 문법적 등가물은 기준선 또는 기타 참조 측정과 관련한 값을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조 측정은 특정 제제 또는 치료의 부재 존재에(예를 들어, 전 및/또는 후에), 또는 적절한 비교 가능한 참조 제제의 존재에서 그렇지 않은 비교 가능한 조건 하에서 특정 시스템(예를 들어, 단일 개체)에서의 측정이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조 측정은 관련 제제 또는 치료의 존재에서 특정 방식으로 반응할 것으로 알려져 있거나 예상되는 비교 가능한 시스템에서의 측정이거나 이를 포함할 수 있다.
핵산/올리고뉴클레오티드 : 본 명세서에 사용된 용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고, 적어도 3개 뉴클레오티드 또는 초과의 중합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 단일 및 이중 가닥 부분 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 포스포디에스테르 연결을 포함하는 백본을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 포스포디에스테르 및 비-포스포디에스테르 연결 둘 모두를 포함하는 백본을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 핵산은 예를 들어 "펩티드 핵산"에서와 같이 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 5'-N-포스포르아미다이트 연결 및/또는 하나 이상의 펩티드 결합을 포함하는 백본을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 또는 모든 천연 잔기(예를 들어, 아데닌, 시토신, 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 구아닌, 티민, 우라실)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상, 또는 모든 비-천연 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-천연 잔기는 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 6-O-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기, 및 이의 조합)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-천연 잔기는 천연 잔기에서의 것과 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 RNA 또는 폴리펩티드와 같은 기능적 유전자 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, 효소 합성(예를 들어, 상보적 주형에 기초한 중합, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내, 재조합 세포 또는 시스템에서 번식, 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 또는 20,000 또는 더 많은 잔기 또는 뉴클레오티드 길이이다.
뉴클레오티드 : 본 명세서에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 당업계에서 인정하는 의미를 지칭한다. 다수의 뉴클레오티드가, 예를 들어 RNA 올리고뉴클레오티드의 크기의 표시로서 사용되는 경우, 특정 수의 뉴클레오티드는, 예를 들어 RNA 올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 상의 뉴클레오티드의 수를 지칭한다.
약학적 조성물 : 본 명세서에 사용된 용어 "약학적 조성물"은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 활성제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 모집단에 투여될 때 미리결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 요법으로 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 다음에 적합한 것을 포함하는 고체 또는 액체 형태에서 투여를 위해 특별히 제형화될 수 있다: 경구 투여, 예를 들어 드렌치(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어 협측, 설하 및 전신 흡수에 대해 표적화된 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 서방성 제형과 같은, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여; 국소 적용, 예를 들어 크림, 연고, 또는 피부, 폐 또는 구강에 적용되는 제어-방출 패치 또는 스프레이; 질내로 또는 직장내로, 예를 들어 페서리, 크림 또는 폼; 설하로; 눈으로; 경피적으로; 또는 비강으로, 폐 및 기타 점막 표면.
약학적으로 허용가능한 : 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물을 제형화하기 위해 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제에 적용되는, 본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한"은 담체, 희석제 또는 부형제가 조성물의 다른 성분과 양립가능해야 하고 그 수용자에게 해롭지 않아야 한다는 것을 의미한다.
폴리펩티드 : 본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 적어도 3개 이상의 아미노산의 중합체의 당업계에서 인정하는 의미를 갖는다. 당업자는 용어 "폴리펩티드"가 본 명세서에 인용된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드뿐만 아니라 기능적, 생물학적 활성, 또는 특징적인 단편을 나타내는 폴리펩티드, 이러한 완전한 폴리펩티드의 부분 또는 도메인(예를 들어, 적어도 하나의 활성을 보유하는 단편, 부분 또는 도메인)을 포괄하도록 충분히 일반적인 것으로 의도됨을 이해할 것이다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 모두를 함유할 수 있고 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변형은, 예를 들어 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
RNA 올리고뉴클레오티드 : 본 명세서에 사용된 용어 "RNA 올리고뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 부분 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 상기 "핵산/올리고뉴클레오티드"의 정의에 기재된 바와 같은 백본 구조를 포함할 수 있다. RNA 올리고뉴클레오티드는 조절 RNA(예를 들어, siRNA, 마이크로RNA 등), 또는 메신저 RNA(mRNA) 올리고뉴클레오티드일 수 있다. RNA 올리고뉴클레오티드가 mRNA 올리고뉴클레오티드인 일부 실시형태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 그의 3' 말단에 폴리(A) 영역을 포함한다. RNA 올리고뉴클레오티드가 mRNA 올리고뉴클레오티드인 일부 실시형태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 예를 들어 mRNA를 인식하고 리보솜에 부착하여 번역을 개시하기 위해 5' 말단에 당업계에서 인정하는 캡 구조를 포함한다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 예를 들어 mRNA 합성, 및 조직 배양과 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적으로 본 명세서에 참조로 포함된, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 참조.
대상체 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 일부 실시형태에서는 태아기 인간 형태를 포함함)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 취약하다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 어떠한 증상 또는 특징도 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특징인 하나 이상의 특성을 갖는 사람이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개체이다.
특정 실시형태의 상세한 설명
mRNA 요법의 임상적 생존가능성에 대한 유의한 도전은 외인성 RNA에 대한 선천성 면역 반응을 감소시키는 것이다. 이들 요법에 대한 선천성 면역 반응의 대부분은 시험관내 전사 동안 생성된 다양한 오염물질의 인식에 의해 주도된다. RIG-I는 캡핑되지 않은 ssRNA 및 dsRNA의 검출을 담당하는 반면, MDA5 및 PKR은 작은 비정상 전사체 및 큰 dsRNA 부산물을 검출할 수 있다. 선천성 면역 시그널링이 NF-kB 및 IRF 상향 조절의 경로에 수렴하기 때문에 이들 센서에 의한 인식 우회는 RNA-기반 치료에 중요하다. PKR 시그널링은 그 자체로 번역 기계의 억제에 의하여 전체 단백질 합성을 직접적으로 감소시킨다. 이들 경로의 활성화는 궁극적으로 mRNA 전달 요법의 감소된 효능을 초래할 수 있는 항-바이러스 상태의 확립으로 이어진다.
선천성 면역 센서의 능력을 감소시켜 합성 RNA를 검출하는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(
등, Mol Ther. 2008, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨) 및 제제로부터 오염물질을 직접적으로 제거하기 위한 HPLC 정제(
, Muramatsu, Ludwig, & Weissman, NAR 2011, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨)의 사용을 포함하여 이 문제를 해결하기 위해 상당한 작업이 수행되었다. 불행히도, HPLC 정제는 비용이 많이 들고 공정 동안 샘플의 손실로 인해 최적의 수율보다 낮을 수 있으며, 이는 대규모의 합성에서 사소한 문제가 된다. 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 사용은 상업적 적용에서 그 사용을 위한 라이선스 계약의 필요성에 의해 복잡하다. 시험관내 전사 조건의 최적화에 대한 보다 최근의 연구는 감소된 면역원성을 갖는 RNA를 제공했지만(Mu, 등, NAR 2018, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨), 그러나 또한 대규모 합성을 금지할 수 있는 낮은 수율의 단점이 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대규모 합성을 허용하는 시험관내 전사로부터 높은 수율을 유지하면서 본 발명자들의 mRNA 요법에 대한 선천성 면역 반응을 감소시키는 문제를 해결하는 기술을 제공한다. 초기 가설은 상승된 온도에서의 시험관내 전사가 임의의 수의 메커니즘에 의해 dsRNA 부산물의 합성을 감소시킬 수 있다는 것이었다. 생각할 수 있는 일부 메커니즘에는 DNA 주형에 대한 RNA 중합효소의 감소된 비특이적 결합 및 주형의 비-프로모터 말단에서 중합효소의 감소된 재-개시가 포함된다. 이들 메커니즘은 IVT 센스 RNA가 시스에서 중합효소 및 자가-프라임을 재결합할 수 있다는 발견(Gholamalipour, Mudiyanselage, & Martin NAR 2018, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨) 및 생성된 결과적인 헤어핀이 고수율 IVT 조건 하에서 프로모터 의존적 T7 개시와 경쟁할 수 있다는 발견과 일치한다. Wu, Asahara, Tzertzinis, & Roy, RNA 2020(그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨)은 최근에 열안정성 T7 RNA 중합효소 변이체를 사용한 고온 시험관내 전사가 시험관내 전사 생성물의 자가-프라이밍을 감소시켜 dsRNA 부산물의 합성을 감소시킬 수 있다고 보고했다. 그 작업은 야생형 T7 RNA 중합효소가 45C 이상의 온도에서 비활성이기 때문에 새로운 열안정성 T7 프로모터-의존성 RNA 중합효소의 설계에 의존했다. 글리신-기반 삼투물질은 고온에서 단백질을 안정화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났지만(Santoro, 등 Biochemistry 1992, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨), 안정한 RNA를 합성하기 위한 고수율 방법에 대한 분야에서의 요구가 남아 있다.
본 개시내용은 고수율의 시험관내 전사를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 시험관내 전사 반응에 대한 삼투물질, 예를 들어 베타인의 첨가가, 예를 들어 상승된 온도, 예를 들어, 45C 이상에서의 온도에서 야생형 T7 RNA 중합효소를 사용하면서 RNA의 고수율 합성을 허용한다는 통찰력을 제공한다. 추가로, 본 개시내용은 삼투물질의 존재에서 시험관내 전사에 의해 생성된 RNA가 감소된 면역원성 및/또는 높은 발현을 가질 수 있다는 것을 제공한다.
RNA 생성물을 생산하기 위한 예시적인 방법
무엇보다도, 본 개시내용은 RNA 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 시험관내 전사 혼합물을 인큐베이션하고 이에 의해 복수의 단일-가닥 RNA 분자를 포함하는 RNA 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물은 표적 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 DNA 주형, RNA 중합효소 프로모터 서열을 인식하는 적어도 하나의 RNA 중합효소, 각각의 유형이 상이한 뉴클레오시드를 포함하는 적어도 2개의 상이한 유형의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 리보뉴클레오티드, 및 삼투물질을 포함하는 전사 완충액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 삼투물질은 아미노산-기반 삼투물질, 메틸아민 삼투물질, 탄수화물 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 메틸아민 삼투물질은 글리세로포스포릴콜린 트리메틸아민 N-옥사이드, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 삼투물질은 소르비톨, 글리세롤, 미오니시톨, 디글리세롤 포스페이트, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 프롤린-기반 삼투물질, 글리신-기반 삼투물질, 엑토인-기반 삼투물질, 알라닌-기반 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 알라닌-기반 삼투물질은 베타-알라닌이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 글리신-기반 삼투물질이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 글리신-기반 삼투물질은 베타인이거나 베타인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 베타인은 시험관내 전사 혼합물에 0.25M, 적어도 0.5M, 적어도 0.75M, 적어도 1M, 적어도 1.5M, 적어도 2M 또는 적어도 2.5M의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 베타인은 시험관내 전사 혼합물에 최대 15M, 최대 10M, 적어도 5M, 또는 적어도 2.5M의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 베타인은 시험관내 전사 혼합물에 약 0.5M 내지 약 10M, 또는 약 2M 내지 약 5M의 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, RNA 중합효소는 박테리오파지 RNA 중합효소이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 박테리오파지 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소, N4 비리온 RNA 중합효소, 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 박테리오파지 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 적어도 37℃, 적어도 40℃, 적어도 45℃, 적어도 46℃, 적어도 47℃, 적어도 48℃, 적어도 49℃, 적어도 50℃, 적어도 51℃, 적어도 52℃, 적어도 53℃, 적어도 54℃, 적어도 55℃, 적어도 60℃, 또는 적어도 65℃의 온도에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 최대 75℃, 최대 70℃, 최대 65℃, 최대 60℃, 최대 59℃, 최대 58℃, 최대 57℃, 최대 56℃ 또는 최대 55℃의 온도에서 발생한다.
일부 실시형태에서, T7 RNA 중합효소는 야생형 T7 RNA 중합효소이고 인큐베이션 단계는 약 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 또는 더 높은 온도에서 발생한다.
일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 가이드 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, siRNA, 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA, 또는 메신저 RNA(mRNA)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA 분자는 5' 캡을 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA 분자는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA 분자는 적어도 하나의 인트론을 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA 분자는 적어도 하나의 비번역된 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 각각 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성이다. 일부 실시형태에서, 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생성된다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서보다 더 낮은 수준의 이중-가닥 RNA를 갖는다. 일부 실시형태에서, 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생성된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 RNA 생성물로부터 임의의 이중-가닥 RNA를 제거하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서보다 더 많은 양의 단일-가닥 RNA 분자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생성된다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 RNA 분자의 양은 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자의 백분율이다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 RNA 분자의 양은 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자의 수이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 예를 들어 인큐베이션 단계 후에 시험관내 전사 혼합물로부터 DNA를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제거하는 것은 인큐베이션 단계 후에 시험관내 전사 혼합물에 DNase를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, DNA 주형은 고체 기질 상에 고정화된다. 일부 실시형태에서, DNA를 제거하는 것은 시험관내 전사 혼합물로부터 고체 기질을 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 고체 기질은 비드이다.
일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 각각 적어도 100개 뉴클레오티드이거나 더 긴, 예를 들어 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드이거나, 또는 더 긴 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자 각각은 200,000개 이하의 뉴클레오티드, 150,000개 이하의 뉴클레오티드, 100,000개 이하의 뉴클레오티드, 또는 50,000개 이하의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 표적 서열이 단일-가닥 RNA 분자로 전사되기에 충분한 시간 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 또는 더 긴 시간 동안 수행된다.
RNA 생성물을 포함하는 예시적인 조성물
본 개시내용은 RNA 생성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, RNA 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 가이드 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, siRNA, 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA, 또는 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 생성물은 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA 분자는 5' 캡을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 복수의 단일-가닥 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 각각이 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 각각 적어도 100개 뉴클레오티드이거나 더 긴, 예를 들어 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드이거나, 또는 더 긴 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 단일-가닥 RNA 분자 각각은 200,000개 이하의 뉴클레오티드, 150,000개 이하의 뉴클레오티드, 100,000개 이하의 뉴클레오티드, 또는 50,000개 이하의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물, 예를 들어 삼투물의 부재 및 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성이다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물, 예를 들어 삼투물의 부재 및 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생성된 RNA 생성물보다 더 낮은 수준의 이중-가닥 RNA를 갖는다.
일부 실시형태에서, RNA 생성물은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물, 예를 들어 삼투물질의 부재 및 약 37 ℃의 인큐베이션 온도에서 생성된 RNA 생성물보다 더 많은 양의 단일-가닥 RNA 분자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 RNA 분자의 양은 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자의 백분율이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있으며, 이는 본 명세서에 사용된 바와 같이, 원하는 특정 투여 형태에 적합하도록, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 기타 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 방부제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 참고로 본 명세서에 포함됨)는 약학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 염 용액(예를 들어, NaCl), 식염수, 완충 식염수, 글리세롤, 당 예컨대 만니톨, 수크로오스 또는 기타, 덱스트로오스, 지방산 에스테르 등, 뿐만 아니라 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물은 원하는 경우 보조제(예를 들어, 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충액, 착색제, 향료 및/또는 방향 물질 등)와 혼합될 수 있으며, 이는 활성 화합물과 유해하게 반응하거나 그의 활성을 방해하지 않는다. 특정 실시양태에서, 정맥내 투여에 적합한 수용성 담체가 사용된다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 멸균될 수 있다.
원하는 경우 적합한 약학적 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다.
약학적 조성물은 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제형화될 수 있다. 약학적 조성물의 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 정맥내 투여용 조성물은 전형적으로 멸균 등장성 수성 완충액에서 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사의 부위에 통증을 완화하기 위해 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 샤세와 같은 기밀하게 밀봉된 용기에 건조 동결건조 분말 또는 물이 없는 농축액으로, 개별적으로 또는 단위 투여 형태에서 함께 혼합되어 공급된다. 약학적 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약학적 등급 물, 식염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약학적 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공되어 투여 이전에 성분이 혼합될 수 있다.
본 명세서에 제공된 약학적 조성물의 설명이 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 약학적 조성물에 대한 것이지만, 당업자는 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물 또는 세포에 시험관 또는 생체외에 투여하기에 적합하다는 것을 이해할 것이다. 시험관내 또는 생체외에서 다양한 동물 또는 세포에 투여하기에 적합한 조성물을 제공하기 위해 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물의 변형은 잘 이해되고, 통상적으로 숙련된 개업의, 예를 들어 수의 약리학자는 필요하면 단지 일상적인 실험으로 그러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 약학적 조성물의 제형은 약리학의 분야에서 공지되거나 이후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 희석제 또는 다른 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연합시킨 다음, 필요 및/또는 바람직한 경우 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "단위 용량"은 본 명세서에 기재된 약학적 조성물의 별개의 양이다.
예시적인 전달의 방법
본 개시내용은 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA 생성물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, RNA 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, 조성물에서 RNA 생성물은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물, 예를 들어 삼투물질의 부재 및 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)가 세포 배양물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 시험관내 세포 배양물이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 생체외 세포 배양물이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)가 대상체에 존재한다. 일부 실시형태에서, 접촉 단계는 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물, 예를 들어 삼투물질의 부재 및 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생성된 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자(들)로부터의 발현의 수준과 비교하여 단일-가닥 RNA 분자(들)로부터의 발현의 수준을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물, 예를 들어 삼투물질의 부재 및 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 생상된 RNA 생성물과 접촉된 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 생존력과 비교하여 RNA 생성물과의 접촉 후 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 생존력을 증가시킨다.
키트
본 개시내용의 또 다른 양태는 시험관내 전사 혼합물을 위한 성분을 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물 성분은 RNA 중합효소 프로모터 서열을 인식하는 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물 성분은 적어도 2개의 상이한 유형의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 리보뉴클레오티드이거나 이를 포함하며, 각각의 유형은 상이한 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사 혼합물 성분은 삼투물질을 포함하는 전사 완충액이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼투물질은 아미노산-기반 삼투물질, 메틸아민 삼투물질, 탄수화물 삼투물질, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 메틸아민 삼투물질은 글리세로포스포릴콜린, 트리메틸아민 N-옥사이드, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 삼투물질은 소르비톨, 글리세롤, 미오니시톨, 디글리세롤 포스페이트, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 프롤린-기반 삼투물질, 글리신-기반 삼투물질, 엑토인-기반 삼투물질, 알라닌-기반 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 알라닌-기반 삼투물질은 베타-알라닌이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산-기반 삼투물질은 글리신-기반 삼투물질이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 글리신-기반 삼투물질은 베타인이거나 베타인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소는 야생형 T7 RNA 중합효소이거나 이를 포함한다.
키트는 임의의 적용가능한 방법, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 베타인이 있거나 없는 야생형 T7 RNA 중합효소 HiScribe 중합효소 혼합물을 사용한 37℃ IVT 및 높은 온도 IVT의 사이드바이사이드(side-by-side)
이 실시예는 본 명세서에 기술된 예시적인 방법을 사용하여 RNA의 합성을 기술한다. 특히, 이 실시예는 베타인의 존재에서 야생형 T7 RNA 중합효소를 사용한 합성 반응에서 dsRNA의 양이 감소되었다는 것을 제공한다.
핵산 2차 구조가 dsRNA 생성을 검정할 때 미칠 수 있는 임의의 영향에 대한 개념의 증명 및/또는 제어를 시험하기 위해 구조화되지 않은 것으로 간주된 dsDNA 서열 512B를 사용하여 높은 온도 IVT 연구를 수행했다(Mu, 등, NAR 2018, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨).
512B의 서열(5'에서 3'로)는 다음과 같았다:
TAATACGACT CACTATAGGG AGAAGCTCTC TTACACCTGA TTCATTTCCA TTGTTTTCTG CAGCAGCAAT CCGGTTTCTG TCTTCAATTG TCAACAGTTC CTCCTCCATG CACTTATCCA AGACGTCTCT AACTAGAAGC TTGTCCACCA GAGTGGGCTG AAGGAGGTTC AGCAGTTGGA GATATTCATC ATGAGCGTTC TCAAACGATG GAGAGGGCAA GTCCGTGAGC TCAGGGTTCA TGTAGCGGGC GGCCAGAGGG CTGCCGGTTC TCCGGAGGGC CTCCACGAAT TCCCGAGTCC AACCAAGGTG CCAGACTCCC TTCTCCAAGG TGCTCAGCAG CAGTTCAACT GCCTGCATGT TCCCGGAGGT GGCGACTGTC CTCTGAATCT GCTCCTTCAC CTCTGCAGGC AGAAAGGTCA GGTAGTCCAG CACAGGCTCC ACCTGGATGT ACATTTTCAC CCTGGCCCTG AAGCACGAGA TGAGATAGCG GAAATTCTCG TCTGTGGAAT ACCCATTCGA CATTCTCCC
dsDNA 512B IVT 주형은 512B ssDNA가 생성된 IDT 플라스미드 중간체의 PCR 증폭에 의해 생성되었다. 증폭은 0.25μM 각 프라이머 512B T7 fwd 및 512B rev, 1X Herculase II 완충액, 250uM 각 dNTP, 10ng 512B 플라스미드(Integrated DNA Technologies), 및 0.4μL Herculase II 효소로 구성된 20μL 반응에서 수행되었다. PCR 생성물은 QiaQuick PCR Clean Up Kit(Qiagen)로 정제되었고 30μL 10mM Tris-Cl pH 8.5 안으로 용리되었다. 용리된 생성물 전체를 50μL 반응에서 125U의 Dpn1 효소(New England Biolabs)로 처리하여 주형 플라스미드를 단리하였다. 단리된 생성물은 Clean and Concentrator-5(Zymo Research)로 정제되고 10μL 10mM Tris-HCl pH 8.5 안으로 용리되었다.
상업적으로 이용가능한 고수율 IVT 조건을 대표하는 10μL 대조군 반응은 100ng Luc2 T7 주형, 5mM 각 NTP, 1X HiScribe 전사 완충액 및 1μL HiScribe 중합효소 혼합물(NEB)로 구성되었고 37C에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 높은 온도 IVT는 2M 베타인 보충이 있거나 없이 45℃ 및 50℃ 둘 모두에서 시험되었다. 이들 반응은 2M 베타인의 첨가가 있거나 없이 37℃ 대조군 반응으로 설정된 동일한 반응으로 구성되었다. 반응은 후속적으로 각각의 온도에서 2시간 동안 인큐베이션되었다.
RNA 농도는 NanoDrop OneC 기기(Thermo Scientific)에서 RNA 적용을 사용하여 결정되었다.
각 IVT 제제에서 dsRNA 오염물질의 상대 농도를 검정하기 위해 Viral dsRNA 검출 키트(CisBio)의 적응된 프로토콜을 따랐다. 사용된 dsRNA 검출 키트는 세포 용리물에서 바이러스 게놈 복제를 검출하기 위한 검정으로서 CisBio에서 상업적으로 이용할 수 있었다. 키트는 2개의 dsRNA 검출 항체의 샌드위치 검정을 사용했다. 첫 번째는 Europium Cryptate 공여체로 표지되었고 두 번째는 d2 수용체로 표지된다. 각 항체의 1:50 희석 혼합물 10μL를 총 RNA 10μL의 용액에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 매우 근접한 두 항체에 의한 dsRNA의 결합 및 330 nm 파장 광으로 공여체의 여기는 665nm의 방출 파장에서 형광을 발하는 수용체 쪽으로 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 촉발한다. 665nm에서 수용체 방출 신호 대 620nm에서 공여체 방출 신호의 비율을 계산하면 dsRNA 농도에 비례하는 원시 신호 강도 값이 제공된다. 데이터 분석에 사용될 수 있는 처리된 신호 강도 값을 얻기 위해 모든 비율에 104의 인수를 곱했다. (Viral Double-stranded RNA Detection Kit, CisBio, 64RNAPEG.)
모든 RNA 샘플은 40μL 1X 용리 완충액(Cisbio)에 100ng/uL 총 RNA의 작업 농도로 희석되었다. 1X 용리 완충액에 1:4 일련의 희석이 각 샘플에 대해 0.391ng/μL의 최소 농도로 수행되었다. 항체 용액은 검출 완충액(Cisbio)에서 각 항체의 1:50 희석액 400uL를 혼합함에 의해 제조되었다. 10μL 항체 용액이 10μL의 각 RNA 희석 시리즈에 이중으로 첨가되었고 4℃에서 밤새 낮은 부피 96웰 검정 플레이트(Cisbio)에서 인큐베이션되었다. 각 반응에서 총 dsRNA는 665nm에서의 신호(수용체 방출) 대 620nm에서의 신호(공여체 방출)의 비율을 계산하고 바이러스 dsRNA 검출 키트에 기술된 대로 104의 인수를 곱하여 검정했다. 각 총 RNA 농도에서 처리된 신호 비율을 산점도 상에 플롯팅되었다. 검정의 한 가지 가능한 한계는 dsRNA로의 포화가 FRET를 촉발하기 위해 서로 너무 멀리 떨어져 있는 항체의 결합을 초래하기 때문에 높은 농도의 dsRNA가 더 낮은 신호 비율로부터 위음성을 초래할 수 있다는 것이었다. 그러나, 검정은 샘플 사이 dsRNA 양에서의 상대적인 차이를 평가하는 데 유용했다. 도 1에 도시된 바와 같이, 샘플 내 베타인의 존재는 dsRNA의 양의 감소와 상관관계가 있었다.
실시예 2: 상업적으로 이용가능한 높은 온도 전사 반응에 대한 본 명세서에 기술된 예시적인 방법에 따라 생성된 RNA 생성물의 비교
이 실시예는 상업적으로 이용가능한 높은 온도 전사 반응 성분을 사용하는 필적하는 방법과 본 명세서에 기술된 바와 같은 예시적인 RNA 합성 방법의 비교를 기술한다. 이 실시예는 본 명세서에 기술된 바와 같은 예시적인 RNA 합성 조성물 및 방법이 물론 상업적으로 이용가능한 반응 키트 및 방법보다 약간 양호하지는 않지만 수행되었음을 입증한다.
반딧불이 루시페라아제의 최적화된 버전을 인코딩하는 luc2 유전자는 pGL4.10[luc2](Promega)으로부터 증폭되었다. 증폭은 0.25μM 각 프라이머 Luc2_fwd 및 Luc2_rev, 1X Herculase II 완충액, 25mM 각 dNTP, 30ng pGL4.10[luc2] 플라스미드(Promega), 0.25M 베타인 및 0.4μL Herculase II 효소로 구성된 20μL 반응에서 70℃의 어닐링 온도에서 수행되었다. PCR 산물은 QiaQuick PCR Clean Up Kit(Qiagen)로 정제되었고 30μL 10mM Tris-HCl pH 8.5 안으로 용리되었다. 용리된 생성물 전체를 50μL 반응에서 125U의 Dpn1 효소(New England Biolabs)로 처리하여 주형 플라스미드를 소화(digest)하였다. 소화된 생성물은 QiaQuick PCR Clean Up Kit(Qiagen)로 정제되었고 50μL 10mM Tris-HCl pH 8.5 안으로 용리되었다. 이 소화된 일차 PCR 생성물은 그 다음 0.25μM 각 프라이머 T7-GGG_fwd 및 120pA_rev, 1X Herculase II 완충액, 25mM 각 dNTP, 10ng Luc2 일차 증폭 생성물 및 0.4μL Herculase II 효소로 구성된 20μL 반응에서 50C에서 증폭되었다. 이 2차 PCR 생성물은 QiaQuick PCR Clean Up Kit(Qiagen)를 사용하여 세정되고 30uL 10mM Tris-HCl pH 8.5 안으로 용리되었다. 그 다음 용리된 PCR 생성물은 10분 동안 1% EX 겔(Thermo Scientific)의 10 레인에 걸쳐 20μL의 물에서 50ng/μL의 농도로 실행하였다. 주 밴드는 QiaQuick Gel Isolation Kit를 사용하여 절제되고 처리되었다. 겔 단리된 생성물은 50μL 10mM Tris HCl pH 8.5 안으로 용리되었다. 주형을 추가로 농축하기 위해 용리된 생성물은 DNA Clean & Concentrator-5(Zymo Research)를 사용하여 10μL의 10mM Tris-HCl pH 8.5 안으로 다시 세정되었다.
사용된 프라이머의 서열은 다음과 같았다:
ㆍLuc2_fwd
CTTGTTCTTT TTGCAGAAGC TCAGAATAAA CGCTCAACTT TGGCCACCat ggaagatgcc aaaaacatta agaagggc
ㆍLuc2_rev
AGAATGTGAA GAAACTTTCT TTTTATTAGG AGCAGATACG AATGGCTACA TTTTGGGGGA CAACATTTTG TAAAGTGTAA GTTGGTATTA TGTAGCTTAG AGACTCCATT CGGGTGTTCT TGAGGCTGGT CTATCATTAc acggcgatct tgccgcc
ㆍT7-GGG_fwd
gaattTAATA CGACTCACTA TAGGGcttgt tctttttgca gaagc
ㆍ120pA_rev
TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT agaatgtgaa gaaactttct ttttattag
상업적으로 이용가능한 고수율 IVT 조건을 대표하는 20μL 대조군 반응은 150ng luc2 T7 주형, 7.5mM 각 NTP, 1X HiScribe 전사 완충액 및 2uL HiScribe 중합효소 믹스(NEB)로 구성되었고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 2M 베타인 보충을 사용한 50℃ HiScribe 반응은 2M 베타인의 첨가를 제외하고 37C IVT 대조군 반응과 동일한 시약으로 구성되었다. 이것은 후속적으로 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다.
본 발명자들의 높은 온도 제조 방법의 생성물과 상업적으로 이용가능한 높은 온도 전사 시약의 생성물을 비교하기 위해, Hi-T7 중합효소 믹스(NEB)의 맞춤형 고유 고수율 제형으로부터 생산된 IVT RNA를 상업적 시약을 사용하여 생산된 것과 비교했다. 이전 연구(미공개)에서는 NEB로부터 수득된 고유 완충액 제형과 비교하여 인-하우스 T7 완충액 제형에서 이러한 중합효소 믹스에서 더 양호한 전사 품질을 발견했다. NEB의 고유 High Yield Hi-T7 중합효소 믹스를 사용한 20μL 전사 반응에는 150ng Luc2 T7 주형, 7.5mM 각 NTP, 1X 인-하우스 T7 전사 완충액, 및 Hi-T7 중합효소 믹스(NEB)의 2μL 고유 높은 수율 제형이 포함되었다. 반응물은 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다.
모든 IVT 생성물은 Monarch 50μg RNA Clean Up 키트(NEB)를 사용하여 세정되고 40μL 뉴클레아제-없는 물 안으로 용리되었다. 그런 다음 용리된 생성물은 1X DNase I 완충액 및 5U의 DNase I(RNase-free)(New England Biolabs)로 구성된 50μL 반응에서 37℃에서 15분 동안 소화되어 DNA 주형을 분해했다. DNase I 처리된 샘플은 Monarch 500ug RNA Clean Up 키트(New England Biolabs)를 사용하여 세정되고 40μL 뉴클레아제-없는 물 안으로 용리되었다.
DNAse I 처리된 생성물은 A549 세포 배양 실험에서 최적의 발현을 위해 자연적으로 발생하는 2'-O-메틸화된 5' m7G 캡을 갖는 mRNA를 생성하기 위해 2'-O-메틸트랜스퍼라제(NEB)를 갖는 백시니아 캡핑 효소 키트를 사용하여 효소적으로 캡핑되었다. 캡핑 이전에 각 IVT RNA는 캡핑을 억제할 수 있는 임의의 5' 2차 구조를 변성시키기 위해 65C에서 5분 동안 변성되었고 즉시 얼음 위에 2분 동안 배치되었다. 각 20uL 캡핑 반응은 6ug IVT RNA, 1X 캡핑 완충액, 0.5mM GTP, 0.2mM SAM, 10U 백시니아 캡핑 효소 및 50U mRNA 캡 2'-O-메틸트랜스퍼라제(NEB)로 구성되었다. 캡핑 반응은 37C에서 1시간 동안 인큐베이션되었다.
캡핑된 모든 mRNA는 Monarch 10ug RNA Clean Up 키트(NEB)를 사용하여 세정되었고 10uL 뉴클레아제-없는 물 안으로 용리되었다. 농도는 표 2에 나열되어 있다.
실시예 3: 베타인 농도 구배를 갖는 50℃에서의
시험관내
전사
이 실시예는 상이한 베타인 농도를 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 예시적인 RNA 합성 조성물 및 방법을 기술한다. 이 실시예는 50℃에서 수행된 전사 반응에서 베타인 농도를 증가시키는 것은 RNA 생성물의 양을 증가시키는 것을 초래한다는 것을 입증한다.
200ng T7 주형, 5mM 각 NTP, 1X HiScribe 전사 완충액 및 2uL HiScribe 중합효소 혼합물(NEB)을 함유하는 20μL 시험관내 전사 반응에 0M, 0.5M, 1M 또는 2M 베타인을 보충하고 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션하였다.
모든 IVT 생성물은 Monarch 500μg RNA Clean Up 키트(NEB)를 사용하여 세정되고 40μL 뉴클레아제-없는 물 안으로 용리되었다. 그런 다음 용리된 생성물은 1X DNase I 완충액 및 5U의 DNase I(RNase-free)(New England Biolabs)로 구성된 50μL 반응에서 37℃에서 15분 동안 단리되어 DNA 주형을 분해했다. DNase I 처리된 샘플은 Monarch 50ug RNA Clean Up 키트(New England Biolabs)를 사용하여 세정되고 50μL 뉴클레아제-없는 물 안으로 용리되었다. 0M, 0.5M, 1M 또는 2M 베타인을 함유하는 각 반응 생성물의 농도는 표 3에 제시되어 있다.
RNA 농도는 NanoDrop OneC 기기(Thermo Scientific)에서 RNA 적용을 사용하여 결정되었다.
실시예 4: A549 세포 배양 방법
이 실시예는 본 명세서에 기재된 바와 같은 예시적인 RNA 합성 조성물 및 방법을 사용하여 합성된 RNA 생성물로 형질감염될 때 세포(예를 들어, A549 세포)에서 관찰된 효과를 기술한다. A549-Dual은 10% 열-불활성화된 소태아혈청, 100 단위/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 10μg/mL 블라스티시딘 및 100μg/mL 제오신이 보충된 높은 글루코스 GlutaMAX 둘베코의 변형된 이글 배지에서 배양되고 37℃ 및 5% CO2에서 유지되었다. 세포는 형질감염 1일 이전에 6,000 세포/웰로 96-웰에 도말되었다. 100ng의 각 mRNA는 2μL mRNA 부스트 시약: 1μg mRNA 및 2μL TransIT-mRNA 시약: 1μg mRNA를 사용한 TransIT-mRNA Transfection Kit(MirusBio)를 사용하여 형질감염되었다. 형질감염은 이중으로 수행되었다. 얻어진 결과는 도 2, 3 및 4에 도시되어 있다. 생존력과 루시퍼라제 발현은 ONE-Glo + Tox 루시퍼라제 리포터 및 세포 생존력 검정(Promega)을 사용하여 결정되었다. NF-κB 활성화는 제조업체가 설명한 대로 QUANTI-Blue 검출 시약(InvivoGen)을 사용하여 SEAP 리포터 유전자를 통해 측정되었다.
실시예 5: 수득된 결과의 논의
상기 표 1은 RNA 수율이 임의의 삼투물질(예를 들어, 베타인)의 부재에서 시험관내 전사가 37℃보다 높은 온도에서 수행될 때 유의하게 감소된 반면 삼투물질(예를 들어, 베타인) 보충은 이러한 높은 온도에서 RNA 수율을 유의하게 개선했음을 나타낸다. 표 3은 50℃에서 삼투물질 농도(예를 들어, 베타인 농도)와 IVT 수율 사이의 관계를 추가로 나타낸다. 예를 들어, 표 3은 일부 실시형태에서 0.5M 삼투물질(예를 들어, 베타인) 보충이 무 보충과 비교하여 RNA 수율의 개선을 제공한다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 삼투물질(들)은, 예를 들어, 적어도 0.2M, 적어도 0.3M, 적어도 0.4M, 적어도 0.5M, 적어도 0.6M, 적어도 0.7M, 적어도 0.8M, 적어도 0.9M, 적어도 1M, 적어도 1.5M, 적어도 2M, 적어도 2.5M, 적어도 3M, 적어도 3.5M, 적어도 4M, 적어도 4.5M, 적어도 5M, 적어도 5.5M, 적어도 6M, 적어도 6.5M, 적어도 7, 적어도 7.5M, 적어도 8M, 적어도 8.5M, 적어도 9M, 적어도 9.5M, 적어도 10M 이상을 포함하는, 적어도 0.1M 이상의 농도로 시험관내 전사 완충액 혼합물에 존재할 수 있다.
도 1은 상승된 온도(예를 들어, 37℃ 이상의 온도)에서 시험관내 전사로 인한 dsRNA에서의 감소를 나타낸다. 도시된 데이터는 표시된 각 합성 방법에서 얻은 샘플의 다양한 희석 인자에서 dsRNA의 양을 반영한다. 검정의 한 가지 가능한 한계는 dsRNA로의 포화가 FRET를 촉발하기 위해 서로 너무 멀리 떨어져 있는 항체의 결합을 초래하기 때문에 높은 농도의 dsRNA가 더 낮은 신호 비율로부터 위음성을 초래할 수 있다는 것이었다. 그러나, dsRNA 양에서 차이는 각 샘플에 대한 총 RNA의 낮은 범위에서 분명하다. 45℃에서의 전사는 그 자체로 dsRNA 양을 감소시키는 것으로 보이지만, 특정 이론에 얽매이지 않고, 일부 실시형태에서, 45℃에서의 전사 수율은 대규모 합성의 경우 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 50℃의 온도에서 삼투물질(예를 들어, 베타인) 보충을 갖는 시험관내 전사는 삼투물질(예를 들어, 베타인)이 없는 45℃ IVT 합성의 것과 비교하여 고수율 합성 및 낮은 dsRNA 양 둘 모두를 허용한다.
37℃ 시험관내 전사로부터 높은 양과 비교하여 dsRNA에서 이 감소의 효과는 도 2, 3 및 4에 제시된 데이터에서 분명하다. 개선된 생존력은 도 2에 도시된 반면 감소된 면역원성은 도 3에 나타나 있다. 비교가능한 루시퍼라제 발현은 도 4의 모든 합성 방법에서 관찰된다. 예를 들어, 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소를 사용하는 높은 온도 시험관내 전사 반응에 베타인과 같은 삼투물질의 첨가는 감소된 면역원성 및/또는 독성을 갖는 높은 수율의 RNA를 생산하는데 유용하다.
등가물
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어는 달리 명확하게 표시되지 않는 한, 당업계에서 이해되는 의미에 따른다. 당업자는 본 개시내용에 대한 다양한 변경, 변형 및 개선이 당업자에게 용이하게 일어날 것임을 인식할 것이다. 이러한 변경, 변형 및 개선은 본 개시내용의 일부로 의도되고 발명의 사상 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 예시에 불과하고, 이하의 특허청구범위에 의해 추가로 상세하게 기술되는 경우 본 개시내용에 기재된 임의의 발명이다.
당업자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 검정 또는 기타 공정에서 수득된 값에 기인하는 편차 또는 오류의 전형적인 표준을 인식할 것이다. 발명의 배경을 기술하고 발명의 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본 명세서에 참조된 간행물, 웹사이트 및 기타 참고 자료는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
발명의 실시형태가 그 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 발명의 범주를 제한하지 않고 예시하기 위한 것임을 이해해야 하다. 본 발명의 범주는 본 명세서에 첨부된 청구범위에 의해 정의되고 본 명세서에 기술된 특정 실시형태에 의해 제한되지 않는다. 다른 양태, 이점 및 변형은 다음 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> HELIX NANOTECHNOLOGIES, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR RNA SYNTHESIS
<130> 2012611-0030
<140> PCT/US2021/030332
<141> 2021-04-30
<150> 63/019,158
<151> 2020-05-01
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 529
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 1
taatacgact cactataggg agaagctctc ttacacctga ttcatttcca ttgttttctg 60
cagcagcaat ccggtttctg tcttcaattg tcaacagttc ctcctccatg cacttatcca 120
agacgtctct aactagaagc ttgtccacca gagtgggctg aaggaggttc agcagttgga 180
gatattcatc atgagcgttc tcaaacgatg gagagggcaa gtccgtgagc tcagggttca 240
tgtagcgggc ggccagaggg ctgccggttc tccggagggc ctccacgaat tcccgagtcc 300
aaccaaggtg ccagactccc ttctccaagg tgctcagcag cagttcaact gcctgcatgt 360
tcccggaggt ggcgactgtc ctctgaatct gctccttcac ctctgcaggc agaaaggtca 420
ggtagtccag cacaggctcc acctggatgt acattttcac cctggccctg aagcacgaga 480
tgagatagcg gaaattctcg tctgtggaat acccattcga cattctccc 529
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 2
cttgttcttt ttgcagaagc tcagaataaa cgctcaactt tggccaccat ggaagatgcc 60
aaaaacatta agaagggc 78
<210> 3
<211> 157
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 3
agaatgtgaa gaaactttct ttttattagg agcagatacg aatggctaca ttttggggga 60
caacattttg taaagtgtaa gttggtatta tgtagcttag agactccatt cgggtgttct 120
tgaggctggt ctatcattac acggcgatct tgccgcc 157
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 4
gaatttaata cgactcacta tagggcttgt tctttttgca gaagc 45
<210> 5
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 5
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
agaatgtgaa gaaactttct ttttattag 149
Claims (50)
- 시험관내 전사 혼합물을 인큐베이션하고, 이에 의해 복수의 단일-가닥 RNA 분자를 포함하는 RNA 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 RNA 생성물을 생산하는 방법으로서,
여기서 시험관내 전사 혼합물은,
(i) 표적 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 DNA 주형;
(ii) RNA 중합효소 프로모터 서열을 인식하는 적어도 하나의 RNA 중합효소;
(iii) 각각의 유형이 상이한 뉴클레오시드를 포함하는, 적어도 2개의 상이한 유형의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 리보뉴클레오티드; 및
(iv) 삼투물질을 포함하는 전사 완충액을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 삼투물질은 아미노산-기반 삼투물질, 메틸아민 삼투물질, 탄수화물 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이들을 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 메틸아민 삼투물질은 글리세로포스포릴콜린 트리메틸아민 N-옥사이드 또는 이의 조합이거나 이들을 포함하는, 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 탄수화물 삼투물질은 소르비톨, 글리세롤, 미오니시톨, 디글리세롤 포스페이트, 또는 이의 조합이거나 이들을 포함하는, 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산-기반 삼투물질은 프롤린-기반 삼투물질, 글리신-기반 삼투물질, 엑토인-기반 삼투물질, 알라닌-기반 삼투물질, 또는 이의 조합이거나 이들을 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 알라닌-기반 삼투물질은 베타-알라닌이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산-기반 삼투물질은 글리신-기반 삼투물질이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 글리신-기반 삼투물질은 베타인이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 베타인은 시험관내 전사 혼합물에 약 0.5M 내지 약 10M, 또는 약 2M 내지 약 5M의 농도로 존재하는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 중합효소는 박테리오파지 RNA 중합효소이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 박테리오파지 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소, N4 비리온 RNA 중합효소, 또는 이의 변이체인, 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 박테리오파지 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 적어도 37℃의 온도에서 일어나는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 T7 RNA 중합효소는 야생형 T7 RNA 중합효소이고 상기 인큐베이션 단계는 약 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 또는 더 높은 온도에서 일어나는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 가이드 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, siRNA, 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA, 또는 메신저 RNA(mRNA)이거나 이들을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 mRNA 분자는 5' 캡을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 단일-가닥 RNA 분자는 각각 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서보다 더 낮은 수준의 이중-가닥 RNA를 갖는, 방법.
- 제20항에 있어서, RNA 생성물로부터 임의의 이중-가닥 RNA를 제거하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서보다 더 큰 양의 단일-가닥 RNA 분자를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계 후에 시험관내 전사 혼합물로부터 DNA를 제거하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 제거하는 단계는 인큐베이션 단계 후에 DNase를 시험관내 전사 혼합물에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 주형은 고체 기질 상에 고정화되는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 DNA를 제거하는 것은 시험관내 전사 혼합물로부터 고체 기질을 분리하는 것을 포함하는, 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 고체 기질은 비드인, 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 단일-가닥 RNA 분자 각각은 적어도 100개 뉴클레오티드이거나 더 긴, 예를 들어 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드이거나, 또는 더 긴 길이를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 단일-가닥 RNA 분자 각각은 200,000개 이하 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 표적 서열이 단일-가닥 RNA 분자로 전사되기에 충분한 시간 동안 수행되는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 또는 더 긴 시간 동안 수행되는, 방법.
- 하나 이상의 포유동물 세포를 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 RNA 생성물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 조성물에서 RNA 생성물은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물보다 덜 면역자극성인, 방법.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 포유동물 세포는 세포 배양에 존재하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 세포 배양은 시험관내인, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 세포 배양은 생체외인, 방법.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 포유동물 세포는 대상체에 존재하는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물인, 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
- 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물에서 단일-가닥 RNA 분자(들)로부터의 발현의 수준과 비교하여, 단일-가닥 RNA 분자(들)로부터의 발현의 수준을 증가시키는, 방법.
- 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 삼투물질의 부재에서 생성된 RNA 생성물과 접촉된 하나 이상의 포유동물 세포의 생존력과 비교하여, RNA 생성물과의 접촉 후 하나 이상의 포유동물 세포의 생존력을 증가시키는, 방법.
- 하기를 포함하는 시험관내 전사 혼합물:
표적 서열에 작동가능하게 연결된 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 DNA 주형;
RNA 중합효소 프로모터 서열을 인식하는 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소;
각각의 유형이 상이한 뉴클레오시드를 포함하는, 적어도 2개의 상이한 유형의 리보뉴클레오티드를 포함하는 복수의 리보뉴클레오티드; 및
아미노산-기반 삼투물질, 메틸아민 삼투물질, 탄수화물 삼투물질, 또는 이의 조합을 포함하는 삼투물질을 포함하는 전사 완충액. - 제43항에 있어서, 상기 메틸아민 삼투물질은 글리세로포스포릴콜린, 트리메틸아민 N-옥사이드, 또는 이의 조합이거나 이들을 포함하는, 시험관내 전사 혼합물.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 탄수화물 삼투물질은 소르비톨, 글리세롤, 미오니시톨, 디글리세롤 포스페이트, 또는 이의 조합이거나 이들을 포함하는, 시험관내 전사 혼합물.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산-기반 삼투물질은 프롤린-기반 삼투물질, 글리신-기반 삼투물질, 엑토인-기반 삼투물질, 알라닌-기반 삼투물질 또는 이의 조합이거나 이들을 포함하는, 시험관내 전사 혼합물.
- 제46항에 있어서, 상기 알라닌-기반 삼투물질은 베타-알라닌이거나 이를 포함하는, 시험관내 전사 혼합물.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산-기반 삼투물질은 글리신-기반 삼투물질이거나 이를 포함하는, 시험관내 전사 혼합물.
- 제48항에 있어서, 상기 글리신-기반 삼투물질은 베타인이거나 이를 포함하는, 시험관내 전사 혼합물.
- 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 박테리오파지 RNA 중합효소는 야생형 T7 RNA 중합효소이거나 이를 포함하는, 시험관내 전사 혼합물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063019158P | 2020-05-01 | 2020-05-01 | |
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| PCT/US2021/030332 WO2021222856A1 (en) | 2020-05-01 | 2021-04-30 | Compositions and methods for rna synthesis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=78373983
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227042021A KR20230034208A (ko) | 2020-05-01 | 2021-04-30 | Rna 합성을 위한 조성물 및 방법 |
Country Status (7)
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|---|---|
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| EP (1) | EP4143312A1 (ko) |
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