DE69433977T2

DE69433977T2 - Unsterbliche menschliche zellinien, die exogenes cytochrom p-450 gen enthalten

Info

Publication number: DE69433977T2
Application number: DE69433977T
Authority: DE
Inventors: Curtis C. Harris; Harry V. Gelboin; Frank J. Gonzalez; Katharine C. Mace; Andrea M.A. Pfeifer
Original assignee: Nestec SA; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Nestec SA; US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1994-05-17
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2014-05-18
Also published as: EP0700442B1; DK0700442T3; WO1994026905A1; EP0700442A1; CA2163233C; AU6914594A; US5660986A; CA2163233A1; AU697896B2; US5506131A; DE69433977D1; ATE275203T1; ES2229219T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf unsterbliche humane Bronchial-Epithelzellen und humane Leber-Epithelzellen, die verschiedene Cytochrom-P450-Gene enthalten, sowie die Verwendung dieser Zellen. Die Erfindung bezieht sich auch auf den Aufbau und die Anwendung rekombinanter Vektoren mit DNA-Sequenzen zur Kodierung, sowie die effiziente Expression enzymatisch aktiver Cytochrome P450 in Säugetierzellen.
Die Cytochrome P450 sind eine große Familie von Hämoproteinenzymen, die Xenobiotika wie Drogen, Karzinogene und Umweltgifte sowie Endobiotika wie Steroide, Fettsäuren und Prostaglandine metabolisieren. Einige der Substanzen der Cytochrom P450 Familie sind sowohl in Tier- als auch in Kulturzellen induzierbar, während andere konstitutive Formen nicht induzierbar sind. Diese Enzymgruppe hat sowohl schädliche als auch nützliche Eigenschaften. Schädlich ist die metabolische Umwandlung von Xenobiotika in toxische, mutagene und karzinogene Formen.
Die toxikologische Untersuchung von Drogen, potentiellen Karzinogenen, Lebensmitteln, Lebensmittelzusatzstoffen und -kontaminanten wurde in Tieren und jüngst auch in In-vitro-Systemen, wie Bakterien (Ames-Test) und Tierzellkulturmodellen durchgeführt. Diese Systeme sind benachteiligt, da sie nicht über einen humanspezifischen Metabolismus verfügen. Daher ist die Extrapolation zur Bestimmung des Risikos für den Menschen schwierig und potentiell falsch. Die Bakterientestsysteme und einige der Tierzellkulturmodelle verfügen nicht über einen kompletten Metabolismus und stellen keine schädlichen Verbindungen fest, die von einer Aktivierung bestimmter Stoffwechselwege abhängen, z. B. dem der Cytochrom P450-Enzyme. In der Vergangenheit wurde diese Situation umgangen, indem den Tierzellkulturen aus Rattenleber isolierte Stoffwechselenzyme hinzugefügt wurden. Diese Methode birgt zwei wesentliche Probleme. Erstens ist der resultierende Stoffwechsel nicht unbedingt der gleiche wie beim Menschen. Zweitens könnte es sein, dass hochreaktive Metaboliten nicht unbedingt ihr Zielmolekül erreichen und folglich der Erfassung entgehen.
Obwohl versucht wurde, menschliche Stoffwechselenzyme in eine humane Zelllinie einzuführen, weist diese Methode ernsthafte Mängel auf. (Crespi, Progress in clinical and Biological Research, Vol. 340B Mendelsohn and Albertini (eds).
Wiley-Liss, New York 97-106, 1990.) Die Humanzellen sind Lymphoblasten, die kein Hauptzielgewebe für Zytotoxine, Mutagene und Karzinogene darstellen und wegen fehlender Induzierer keine natürliche Cytochrom P450-Aktivität aufweisen. Darüber hinaus fehlen in diesen Zellen andere, zum Aktivierungsprozess gehörende Enzyme, zum Beispiel Epoxyd-Hydrolase, die dann über Gentransfertechnologie eingeführt werden müssen. Dieses System stellt daher ein künstliches Modell mit einer fraglichen Korrelation zur In-vivo-Situation dar.
Eine kurze und allgemeine Diskussion über ein Verfahren zur Umwandlung von Leberzellen ist aus PNAS 34/0, 1993, S. 174 bekannt. Es ist noch nicht sehr gut erforscht, welche Faktoren bei verschiedenen transformierten Zelllinien zu einer Abweichung der funktionellen Eigenschaften führen bzw. wie sie kontrolliert werden können. Wahrscheinlich ist die Qualität des Spenders (z. B. Alter, Geschlecht, Gewicht), von dem die Leberzellen stammen, einer der für solche Abweichungen verantwortlichen Faktoren; potentielle Spender sind jedoch selten und der Forscher hat nur eine sehr beschränkte Auswahl.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Daher ist es wünschenswert, ein System von In-vitro-Humanzelllinien zu haben, welches der in-vivo-Verhältnisse im Menschen entspricht. Die vorliegende Erfindung stellt isolierte, humane nicht onkogene Zelllinien aus Bronchial- und Leberepithelzellen mit unbegrenztem Proliferationspotential bereit, welche daher unsterblich sind.
Eine Anwendungsform dieser Erfindung betrifft eine stabile, nicht onkogene, humane Bronchialepithel-Zelllinie, die ohne Alterung wachsen kann, wenn sie in-vitro in einem Wachstumsmedium kultiviert wird und ein exogenes Cytochrom P450-Gen enthält, welches die Fähigkeit hat, in der Zelllinie exprimiert zu werden. Das Gen kann über Transfektion oder Infektion inseriert werden. Zu den in dieser Zelllinie exprimierten P450 Genen gehören 1A1, 1A2, 2A6, 3A3, 3A4, 2B6, 2B7, 2C9, 2D6 und/oder 2E1. Bevorzugte Zelllinien sind beliebige der folgenden: BEAS-2B-1A1, BEAS-2B-1A2, BEAS-2B-2A6, BEAS-2B-3A3, BEAS-2B-3A4, BEAS-2B-2B6, BEAS-2B-2B7, BEAS-2B-2C9, BEAS-2B-2D6, BEAS-2B-2E1 oder ein Homolog oder Derivat dieser Zelllinien. Die BEAS-2E-1A1 Zelllinie ist eine BEAS-2B Zelllinie mit dem Cytochrom P450 1A1 Gen, die BEAS-2B-1A2 Zelllinie ist eine BEAS-2B Zelllinie mit dem Cytochrom P450 1A2 Gen usw. Die P450-Gene sind vorzugsweise aktiv an einen Zytomegalovirus-Promotor gebunden, damit eine effiziente Genexpression erreicht wird. Eine besonders bevorzugte Zelllinie ist die BEAS-2B-1A2 bzw. ein Homolog oder Derivat davon.
Eine zweite Anwendungsform dieser Erfindung betrifft eine stabile, humane Leberepithel-Zelllinie aus nicht onkogenen Zellen, die ohne Alterung wachsen kann, wenn sie in-vitro in einem Wachstumsmedium kultiviert wird und ein exogenes Cytochrom P450 Gen enthält, welches die Fähigkeit hat, in der Zelllinie exprimiert zu werden. Das Gen kann über Transfektion oder Infektion inseriert werden. Zu den in dieser Zelllinie exprimierten P450 Genen gehören 1A1, 1A2, 2A6, 3A3, 3A4, 2B6, 2B7, 2C9, 2D6 und/oder 2E1. Zu den bevorzugten Zelllinien gehören beliebige der folgenden: THLE-5B-1A1, THLE-5B-1A2, THLE-5B-2A6, THLE-B5-3A3, THLE-5B-3A4, THLE-5B-2B6, THLE-5B-2B7, THLE-5B-2C9, THLE-5B-2D6, THLE-5B-2E1 oder ein Homolog oder Derivat dieser Zelllinien. Die THLE-5B-1A1 Zelllinie ist eine THLE-5B Zelllinie mit dem Cytochrom P450 1A1 Gen, die THLE-5B-1A2 Zelllinie ist eine THLE-5B Zelllinie mit dem Cytochrom P450 1A2 Gen usw. P450 Gene sind vorzugsweise aktiv an einen Zytomegalovirus-Promotor gebunden, damit eine effiziente Genexpression erreicht wird. Eine besonders bevorzugte Zelllinie ist die THLE-5B-1A2 bzw. ein Homolog oder Derivat davon.
In einer weiteren Anwendungsform dieser Erfindung werden unterschiedliche Anwendungsmethoden der Zelllinien beschrieben. Zum Beispiel wird eine Methode beschrieben, mit der Mutagenität, Zytotoxizität oder Karzinogenität eines Mittels identifiziert bzw. getestet werden kann. Diese umfasst folgende Schritte: a) Reaktion, Kultur oder Inkontaktbringen der Zelllinie mit einem Mittel, das unter dem Verdacht steht, mutagen, zytotoxisch oder karzinogen zu sein und b) Bestimmen oder Kontrollieren der Auswirkungen oder Veränderungen an der Zelllinie, die auf Mutagenität, Zytotoxizität oder Karzinogenität hinweisen.
In dieser Erfindung wird ebenfalls eine Methode beschrieben, die chemotherapeutische oder chemopräventive Wirkung eines Mittels zu identifizieren oder zu testen. Diese umfasst folgende Schritte: a) Reaktion, Kultur oder Inkontaktbringen der Zelllinie mit einem Mittel, das unter dem Verdacht steht, bei Vorhandensein eines Karzinogens chemotherapeutisch bzw. chemopräventiv zu wirken und b) Bestimmen oder Kontrollieren dieser Auswirkungen oder Veränderungen an der Zelllinie, die auf chemotherapeutische Eigenschaften hinweisen. Das Mittel kann vor dem Karzinogen zugegeben werden, um die präventive Wirkung des Mittels zu messen.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird eine Methode vorgestellt, die durch ein Karzinogen oder Xenobiotikum aktivierten Metaboliten zu bestimmen. Diese umfasst folgende Schritte: a) Reaktion, Kultur oder Inkontaktbringen der Zelllinie mit dem verdächtigten Karzinogen oder Xenobiotikum und b) Identifizierung der Metaboliten bzw. Ihrer Wirkungen.
Auch werden die in einer der Methoden eingesetzten Diagnosesets für die Zelllinien, Medien und Reagenzien vorgestellt.
Verschiedene andere Zielsetzungen und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Diese und andere Gegenstände, Eigenschaften und viele der begleitenden Vorteile der Erfindung werden nach Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung besser verständlich, wenn die dieses Patent begleitenden Zeichnungen berücksichtigt werden.
1 zeigt den schematischen Aufbau eines rekombinanten Vektors für die Expression der Cytochrom P450 Gene und die Transfektion der Vektoren in die BEAS-2B Zellen.
2 zeigt eine Karte der pCMV und der Cytochrom P450 Fragmente, die in diesen Vektor inseriert werden.
3 zeigt einen Western Blot von BEAS-2B-CMV-1A2 Zellen, die die Expression von CYP1A2 in diesen Zellen bestätigen. Abkürzungen: B = BEAS-2B, cl = Klon, m = mikrosomal.
4 zeigt einen Western Blot von BEAS-2B-CMV-2A6 Zellen, die die Expression von CYP2A6 in diesen Zellen bestätigen.
5 zeigt einen Western Blot von BEAS-2B-CMV-3A4 Zellen, die die Expression von CYP3A4 in diesen Zellen bestätigen.
6 zeigt einen Western Blot von BEAS-2B-CMV-2E1 Zellen, die die Expression von CYP2E1 in diesen Zellen bestätigen.
7 zeigt einen Western Blot von BEAS-2B-CMV-2D6 Zellen, die die Expression von CYP2D6 in diesen Zellen bestätigen.
8 zeigt einen Western Blot von THLE-5B-CMV-1A2 Zellen, die die Expression von CYP1A2 in diesen Zellen bestätigen. Abkürzungen: T = THLE-5B.
9 zeigt den Zeitverlauf der Ethoxycumarin O-Deethylase-Aktivität in THLE-5B-CMV-1A2 Zellen.
10 zeigt die Zytotoxizität von Aflatoxin B₁ in den THLE-5B-CMV-1A2 und THLE-5B-CMV-Neozelllinien.
11 zeigt die Zytotoxizität von Aflatoxin B₁ in den BEAS-2B-CMV-3A4, BEAS-2B-CMV-2A6, BEAS-2B-CMV-1A2 und BEAS-2B-CMV-Neozelllinien.
12 zeigt die Zytotoxizität von Aflatoxin B₁ bzw. Aflatoxin G₁ in BEAS-2B-pXT1 und BEAS-2B-1A2 Zelllinien.
13 zeigt die Zytotoxizität von PhIP in den THLE-5B-CMV-1A2 und THLE-5B-CMV-1A2 Zelllinien.
14 zeigt die Zytotoxizität von Diethylnitrosamin in den BEAS-2B-CMV-2E1 und BEAS-2B-CMV-Neozelllinien.
15 zeigt die Zytotoxizität von Dimethylnitrosamin in den BEAS-2B-CMV-2E1 and BEAS-2B-CMV-Neozelllinien.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die obigen sowie verschiedene weitere Inhalte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden erreicht durch (a) Konstruktion rekombinanter Vektoren mit cDNA-Sequenzen, die Cytochrom P450 Proteine kodieren, so dass Säugetier- und insbesondere Humanzellen die P450 Proteine wirksam exprimieren, wenn sie mit den besagten rekombinanten Vektoren infiziert bzw. transfektiert werden und (b) Bereitstellung funktionell intakter Zelllinien mit Cytochromproteinen, ohne dass die Enzymaktivität durch äußere Zugabe von NADPH Cytochrom P450 Reduktase stimuliert werden muss.
Wenn nicht anders festgelegt, haben sämtliche technische und wissenschaftliche Begriffe in der vorliegenden Erfindung die in dem Fachbereich allgemein übliche Bedeutung, zu dem diese Erfindung gehört. Wenn auch in der Praxis oder beim Testen der vorliegenden Erfindung beliebige Methoden und dem hier beschriebenen ähnliches oder gleichwertiges Material benutzt werden kann, werden die bevorzugten Methoden und Material im Folgenden beschrieben. Sämtliche in dieser Anwendung aufgeführten Publikationen und Patentdokumente werden im Sinne der Quellenangabe angegeben.
I. Unsterbliche Zelllinien.
Die Cytochrom P450 exprimierenden, stabilen, unsterblichen Zelllinien der Erfindung stammen aus unsterblichen, nicht onkogenen Lungen- und Leberzellen. Unsterbliche Zellen werden Primärzellen als Testsystem vorgezogen, da die Ergebnisse besser reproduzierbar und kostengünstiger in der Vorbereitung sind (wenn eine unsterbliche Zelllinie vorhanden ist). Unsterbliche Zelllinien aus Lungen- und Lebergewebe dienen als Modell für die Toxizitätssysteme der entsprechenden Gewebe, aus denen sie stammen. Nicht onkogene unsterbliche Zellen sind besonders vorteilhaft, da sie normalen Gewebezellen ähnlicher sind und da sie zur Bestimmung des karzinogenen Potentials der Testsubstanzen eingesetzt werden können. Der Begriff nicht onkogen wird verwendet, um Zellen zu beschreiben, die keine Tumorzellen bilden, wenn sie einem Testtier, wie z. B. einer Maus, subkutan gespritzt werden. Die P450 exprimierenden unsterblichen Zelllinien der vorliegenden Erfindung sind stabil in dem Sinne, dass nach Einführung eines äußeren P450-Gens nach mindestens 50 Passagen keine messbare Reduktion der P450-Expression auftritt.
Eine unsterbliche Zelllinie wird aus Zellen eines bestimmten Gewebes eines einzigen humanen Spenders hergestellt. Ein Homolog von dieser Zelllinie ist eine zweite Zelllinie, die nach der gleichen Methode aus dem gleichen Gewebe, aber von einem anderen Spender hergestellt wird. Zum Beispiel sind die Zelllinien THLE-2, THLE-3 und THLE-5 Homologe (siehe Beispiel 1). Verschiedene geklonte Isolate einer Zelllinie werden als Zelllinien-Derivate bezeichnet. Zum Beispiel sind die Zelllinien THLE-5B-c15.3 und THLE-5B-cl5.4 Derivate der Zelllinie THLE-5B.
Unsterbliche Zellen behalten vorzugsweise die Expression von Phase II-Enzymen, wie Epoxyd-Hydrolase, Katalase, Glutathion-Peroxydase, Superoxyd-Dismutase und Glutathion S-Transferase. Diese Enzyme spielen bei der Entgiftung von Xenobiotika eine Rolle, und ihr Vorhandensein erhöht die Aussagekraft eines Testsystems auf Zelltoxizität als Modell für humane Gewebe.
Obwohl unsterbliche Zelllinien primären Zellen als Toxizitätstestsysteme aus den oben genannten Gründen vorzuziehen sind, konnte beobachtet werden, dass bestehende unsterbliche Zelllinien eines oder mehrere P450-Cytochrome nicht oder nur gering exprimieren. Die P450 Enzyme sind für die metabolische Umwandlung bestimmter Xenobiotika in toxische, mutagene oder karzinogene Formen erforderlich. Daher werden die unsterblichen Zellen der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren exogenen Cytochrom P450 Genen transfektiert, um die Expression der endogenen Gene zu unterstützen.
Die exogenen P450 Gene sind aktiv an (einen) Expressionsvektor(en) gebunden, so dass die Gene so exprimiert werden, dass sie wirksame P450 Enzyme produzieren. Funktionelle P450 Enzyme sind fähig, eines oder mehrere Substrate aus Tabelle 1 zu metabolisieren.
II. Cytochrom P450 Gene und Vektoren
Genom- oder c-DNA-Klone, die Cytochrom P450 Gene kodieren, können mittels Hybridisierungsproben isoliert werden, die auf Basis von Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen für das gewünschte Gen entworfen wurden. Die Proben können aufgrund von chemischer Synthese oder Polymerase-Kettenreaktion mit Primern konstruiert werden, basierend auf Sequenzdaten, um DNA-Fragmente aus Pools oder Bibliotheken zu amplifizieren. (US Patente 4,683,195 und 4,683,202.) Nukleotid-Substitute, Deletionen, Additionen und ähnliche können auch in die zu klonenden Cytochrom P450 DNA-Fragmente eingebaut werden, so lange die biologische Funktion des Expressionsproduktes nicht substantiell gestört wird. (Maniatis, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. 1989 and Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987). Die Klone können exprimiert oder das untersuchungsrelevante P450-Gen entnommen oder zur Verwendung in anderen Systemen synthetisiert werden. Die Sequenzen verschiedener cDNA-Isolate werden für Cytochrom P4502C9 beschrieben (Umbenhauer, et al., Biochem., 26: 1094–1099, 1987 and Kimura, et al., Nucl. Acids Res., 15: 10053–10054, 1987); P4502E1 (Song, et al., J. Biol. Chem., 261: 16689–16697, 1986 and Umeno, et al, Biochem., 27: 9006–9013, 1988); and P4503A4 (Beaune, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 8064–8068, 1986 and Gonzales, et al., DNA, 7: 79–86, 1988). Cytochrom P450 1A2 wird beschrieben durch Jaiswal, et al., Nucl. Acids Res., 14: 6773–6774, 1986; 2A3 durch Yamano, et al., Biochem., 291322–1329, 1990; und 2D6 durch Gonzalez, et al., Genomics, 2: 174–179, 1988.
Die einzelnen Cytochrome aus der Cytochrom P450-Familie unterscheiden sich in der Substratspezifität und in den Gewebetypen voneinander, in denen sie vorzugsweise exprimiert werden. Tabelle 1 zeigt die Gewebe, in denen die verschiedenen P450 Cytochrome typischerweise exprimiert werden und listet auch geeignete Karzinogene auf, um die Expression eines bestimmten P450-Cytochroms einer Zelllinie zu testen. Die verschiedenen Cytochrome der P450-Familie werden zuweilen mit Abkürzungen bezeichnet. Zum Beispiel bedeutet CYP1A1 Cytochrom P450 1A1; CYP1A2 bedeutet P450 1A2 und so weiter. Der Begriff „P450-Gen" umfasst Gene, die mit bekannten P450-Genen unter zwingenden Bedingungen hybridisieren, oder deren Expressionsprodukte sich spezifisch an Antikörper gegen bekannte P450 Enzyme binden. TABELLE 1

B(a)P: Benzpyren;
AAF: Acetylaminofluoren;
AF: Aminofluoren;
IQ: 2-Amino-3-methylimidazo(4,5-f)quinolin;
MeIQ: 2-Amino-3,4-dimethyl-imidazo(4,5-f)quinolin;
DEN: N-Nitrosodiethylamin;
DMN: N-Nitrosodimethylamin;
AFB₁: Aflatoxin
B₁, AFG₁: Aflatoxin G1; B(a)P7,8-diol;
NNK: 4-(Methytnitrosamino)-1-3-pyridyl)1-Butanon
LI: Leber;
Lu: Lunge;
In: Darm;
P1a: Plazenta;
NE: Nasenepithel.

III. Expressionssysteme
Die Cytochrom P450 Gene können über Transfektion von Plasmid-DNA oder durch retrovirale Infektion in die Zelllinien transferiert werden. Der virale Vektor ist vorzugsweise replikationsgestört, so dass stabile Zelllinien erzielt werden, die P450 Gene exprimieren. Die Transfektion der Zellen kann nach üblichen Methoden erfolgen, wie Calcium- oder Strontiumphosphat-Behandlung, Mikroinjektion, Elektroporation oder Lipofektion. Zum Beispiel können die Zellen mit einem molo-ny-LTR betriebenen Promotor oder einem Vaccinia-Virus infiziert oder mit einem Adenovirus-Promotor, einem HIV-Promotor oder einem CMV-Promotor lipofektiert werden. Das transfektierte DNA-Plasmid kann ein auswählbares Markergen enthalten oder kann mit einem Plasmid ko-transfektiert werden, das einen auswählbaren Marker enthält, und in einigen Fällen enthält der Retrovirusvektor ein auswählbares Markergen. Wo ein oder mehrere auswählbare Marker zusammen mit dem P450-Gen in die Zellen transferiert werden, können die Zellpopulationen, die das P450-Gen enthalten, durch Auswahl des bzw. der Marker identifiziert und angereichert werden. Die Marker sollten vorzugsweise gegen Antibiotika wie Tetracycline, Hygromycin, Neomycin und ähnliche resistent sein.
IV. Nutzen der Zelllinien
Die unsterblichen, nicht onkogenen, stabilen, P450-exprimierenden Zelllinien der vorliegenden Erfindung haben folgenden Nutzen:

(1) Identifikation potentieller chemopräventiver Medikamente. Diese Zellen dienen dazu, geeignete chemische Substanzen für die Behandlung von Krebs und verwandten Krankheiten zu ermitteln, indem sie in vitro in Medien gezüchtet werden, die die zu testende Substanz enthalten. Nach einer geeigneten Expositionszeit wird dann bestimmt, ob und in welchem Umfang Genotoxizität, DNA-Adduktbildung, Mutagenität, Zellveränderung bzw. Zytotoxizität als Folge der Exposition mit einem Karzinogen festgestellt werden kann, z. B. aufgrund eines Trypan Blue Exclusion Assays oder eines ähnlichen Assays (Paterson, Methods Enzymol., 58: 141, 1979), oder aufgrund von Wachstums-Assays wie z. B. Kolonienbildungsfähigkeit (MacDonald, et al., Exp. Cell. Res., 50: 417, 1968). Sämtliche der vorgestellten Methoden sind in dem Fachbereich wohlbekannte Standardmethoden. Ist eine potentielle krebsbekämpfende Substanz identifiziert, können diese und die Zellen in weiteren Studien wie z. B. Medikamentenentwicklung verwendet werden.
(2) Studien zur Kontrolle der epithelialen Differenzierung, und zur Identifikation chemischer und biologischer Mittel, die die epitheliale Differenzierung hervorrufen (nur Bronchialzellen). Dies wird mit den oben beschriebenen Assays bei normalen humanen Bronchialepithelzellen erreicht (Masui, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 2438, 1986). Einige Zellen können die Fähigkeit der epithelialen Differenzierung als Antwort auf das Serum beibehalten. Die Induktion terminaler Differenzierung könnte ein effizienter Weg sein, das Krebswachstum unter Kontrolle zu bringen. Chemische und biologische Substanzen werden auf ihre Fähigkeit getestet, Differenzierung zu induzieren, indem sie dem Wachstumsmedium dieser Zellen beigefügt werden, und nach einem geeigneten Zeitintervall wird bestimmt, ob eine gewisse Palette von Änderungen einschließlich dem Stoppen der DNA-Synthese und morphologische Veränderungen im Sinne einer epithelialer Differenzierung aufgetreten sind. Die Zellen sind auch nützlich für die Untersuchung der biologischen Mechanismen der epithelialen Differenzierung, und die Existenz von sowohl serum-resistenten und serum-sensitiven Zelllinien ermöglicht den Vergleich und die Identifizierung von Genen, die am Prozess der Differenzierung mitwirken.
(3) Programmierter Zelltod. Die Zelllinien werden auch eingesetzt, um Substanzen zu identifizieren, die den programmierten Zelltod bzw. Apoptosis hervorrufen, was bedeutende Auswirkungen auf die Vorbeugung maligner Transformationen haben könnte. Der programmierte Zelltod wird durch DNA-Fragmentierung oder Zelloberflächen-Antigenanalyse untersucht.
(4) Verwendung rekombinanter DNA-Expressionsvektoren zur Produktion relevanter Proteine. Zum Beispiel kann ein Gen, welches ein Protein von therapeutischem Wert kodiert, mit den dieses steuernden DNA-Segmenten rekombiniert werden (z. B. solche, die einen Promotor mit oder ohne Enhancer-Sequenz enthalten), in die Zelle transferiert werden (z. B. durch Strontiumphosphat-Transfektion) und dann kann das produzierte Protein aus dem Überstand der Kultur oder einem Zellextrakt durch im Fachbereich wohlbekannte Routineverfahren gewonnen werden.
(5) Studien zum Metabolismus von Karzinogenen und anderen Xenobiotika. Karzinogene und andere Xenobiotika können dem Wachstumsmedium dieser Zellen hinzugefügt werden. Anschließend kann durch Techniken wie Dünnschichtchromatographie oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und ähnliche das Auftreten der Metaboliten dieser Verbindungen überwacht werden.
(6) Studien zur DNA-Mutagenese. Substanzen, von denen bekannt ist oder von denen vermutet wird, dass sie Mutagene oder Vorläufer von Mutagenen sind, können dem Wachstumsmedium der Zellen zugesetzt werden. Anschließend können die Mutationen untersucht werden, z. B. durch das Erfassen des Auftretens medikamentenresistenter mutanter Zellkolonien (Thompson, Methods Enzymol., 58: 308, 1979). Das Gleiche gilt für die zell-bedingte DNA-Mutagenese durch die Kokultur der Zellen mit Zelltypen, von denen bekannt ist oder von denen vermutet wird, dass sie mutagene Verbindungen abgeben (Hsu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 2003, 1978). Das P450-Enzym kann auch mit einer Untersuchung zur Mutagendetektion verknüpft werden, z. B. Ames Salmonellen/Mikrosomensystem für die Detektion oder Prüfung der Mutagenhäufigkeit durch Umweltgifte, Karzinogene und ähnliche (Ames, et al., Mut. Res., 31: 347, 1975). Andere im Fachbereich wohlbekannte Standardmethoden wie Chromosomenaberration und Induktion von Schwesterchromosomenaustausch in Ovarienzellen chinesischer Hamster (Galloway, et al., Environ. Mutagen., 7: 1, 1985) oder Mutageneseversuche an Mauslymphomzellen können natürlich auch eingesetzt werden, um die Mutagenität zu untersuchen.
(7) Untersuchung von Chromosomen schädigenden Mitteln. Substanzen, deren chromosomenschädigende Wirkung bekannt ist oder vermutet wird, können dem Kulturmedium dieser Zelllinien zugesetzt werden, und dann kann das Ausmaß an Chromosomenschädigung gemessen werden, und zwar durch Verfahren wie Messung der Häufigkeit des Schwesterchromosomenaustausches (Latt, et al., In: Tice, R. R. and Hollaender, A. Sister Chromatic Exchanges, New York: Plenum Press, pp. 11 ff., 1984).
(8) Studien zur malignen Veränderung. Chemische, physikalische und virale Substanzen und transferierte Gene einschließlich Onkogene, mutante Tumor-Suppressorgene und Genom-DNA mit hohem Molekulargewicht aus Tumoren werden in die Zellen eingeführt, und die malignen Veränderungen durch Standardversuche bestimmt, wie z. B. von einem Haften auf Kulturschalen („anchorage independant") unabhängiges Wachstum bzw. Tumorbildung bei thymusdefizienten Nacktmäusen.
(9) Prüfung auf potentielle Chemotherapeutika. Durch den Transfer von Onkogenen oder chemischen Karzinogenen (wie in Absatz 7 oben) veränderte Zellen werden eingesetzt, um Chemotherapeutika zu ermitteln aufgrund von Tests, die die Reversion des veränderten Zellphänotyps durch vermindertes 50bb Agarwachstum bzw. vermindertes Tumorwachstum bei Nacktmäusen untersuchen.
(10) Studien zur Zellbiochemie. Zum Beispiel korrelieren Änderungen des intrazellulären pH-Wertes und des Calcium-Gehalts mit dem Zellwachstum und der Wirkung exogener Agenzien einschließlich, aber nicht ausschließlich, der in Absatz 1 bis 9 oben beschriebenen. Um den intrazellulären pH-Wert und den Calcium-Gehalt zu untersuchen, werden Zellen in geeigneten Kulturgefäßen mit einem Fluoreszenzindikator versetzt und die Fluoreszenzemission mit einem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen (Grynkiewicz, et al., J. Biol. Chem., 260: 3440–3450, 1985).
(11) Untersuchung von Zellantworten zu Wachstumsfaktoren und Produktion von Wachstumsfaktoren. Die Zellen können eingesetzt werden, um die für Wachstum und Differenzierung von humanen Bronchial- und Leberepithelzellen bedeutenden Wachstumsfaktoren zu identifizieren und zu reinigen. Die Zellen der vorliegenden Erfindungen sind besonders nützlich für solche Anwendungen, da sie in einem serumfreien Medium wachsen. Daher können die Antworten auf Wachstumsfaktoren in einem genau definierten Wachstumsmedium untersucht werden, und sämtliche Faktoren, die die Zellen produzieren, können ohne die durch das Vorhandensein von Serum auftretenden Komplikationen identifiziert und gereinigt werden.
(12) Untersuchung intrazellulärer Kommunikation z. B. durch dye scrape loading Assays. Um zu bestimmen, ob in vitro wachsende Zellen die Fähigkeit haben, über intrazelluläre Kontakte (gap junctions) zu kommunizieren, können die Kulturen geschabt werden z. B. mit einem Skalpel bei Vorhandensein eines Fluoreszenzfarbstoffes im Wachstumsmedium. Die Zellen am Wundrand werden mechanisch zerrissen und nehmen daher Farbstoff auf; ob intrazelluläre Kommunikation stattgefunden hat, kann durch das Vorhandensein von Farbstoff in den weiter von der Wunde entfernten Zellen festgestellt werden.
(13) Bestimmung von Zelloberflächenantigenen. Die Zellen werden mit einem Antikörper gegen das untersuchungsrelevante Zelloberflächenantigen inkubiert und dann mit einem zweiten Antikörper in Reaktion gebracht, welcher an einen Fluorenzenzfarbstoff gebunden ist. Die Zellen werden dann mit einem FACS (fluorescence activated cell sorter) diskriminiert, um zu bestimmen, ob sie fluoreszent sind und daher das Zelloberflächenantigen aufweisen.
(14) Hybriduntersuchungen zur Identifizierung der Tumorsuppressor-Aktivität. Um zu bestimmen, ob diese Zelllinien Tumorsuppressorgene enthalten, werden sie mit malignen Tumorzellen zusammengeführt. Das Vorhandensein der Tumorsuppressorgene wird durch den Verlust der Malignität angezeigt, z. B. bestimmt durch den Verlust der Tumorbildungsfähigkeit bei thymusdefizienten Nacktmäusen in den Hybridzellen. See Stanbridge, et al., Science, 215: 252–259, 1982.
(15) Identifizierung neuartiger Gene. Neuartige Gene, einschließlich transformierende Gene in natürlich auftretenden Tumoren, wie in Absatz 8 oben beschrieben, Wachstumfaktorgene wie in Absatz 11 oben beschrieben, Tumorsuppressorgene wie in Absatz 14 oben beschrieben, unter Verwendung von Standardmethoden der Molekularbiologie (Davis, et al., Methods in Molecular Biology, New York: Elsevier, 1986) und Klonungstechniken wie cDNA-Subtraktion u. ä. Diese Gene und ihre Derivate können in der Gentherapie verwendet werden.

Selbstverständlich können Laborkits für die Ermittlung von Karzinogenen oder antineoplastisch wirkenden Substanzen und für andere Verwendungen als die hier beschriebenen, leicht zusammengestellt werden, einschließlich Gefäße für die Zelllinie(n) der vorliegenden Erfindung, Medien für die Zellfortpflanzung und Reagenzien bzw. Geräte für die Bestimmung von morphologischen, physiologischen bzw. genetischen Antworten bei den Zelllinien und sämtliches Zubehör, das routinemäßig zu solchen Laborkits gehört. Durchführungsanweisungen, können ebenfalls dazugehören.
Beispiele
Beispiel 1. Herstellung unsterblicher Zellen
A. Bronchialzellen
Die unsterblichen humanen Bronchialepithel-Zelllinien, die zur Herstellung der Cytochrom P450-transfektierten Zellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind im US Patent 4.885.238 beschrieben. Diese Zelllinien werden folgendermaßen hergestellt.
Normale humane Bronchialepithelzellen (NHBE) wurden, wie durch Lechner, et al. beschrieben (J. Tissue Culture Methods, 9: 43–48, 1985), aus Bronchialgewebeproben von Nekropsien krebsfreier Subjekte entnommen. Die NHBE-Zellen wurden mit dem Adenovirus-12 SV40 Hybridvirus infiziert. In allen Fällen wurde die Lebensdauer dieser Kulturen im Vergleich zu NHBE verlängert, die meisten Kulturen durchlebten eine verlängerte Alterungsperiode, die als "Krise" bezeichnet wird. Nach längerer Kultur ergaben sich in manchen Fällen Zellkolonien, die der Alterung entgangen waren; diese überlebenden Kolonien wurden anschließend über längere Zeit passagiert und zeigten ein unbegrenztes Wachstumspotential.
Wie NHBE-Zellen, aber anders als Bronchial-Krebszellen, behielten einige der so veränderten Zelllinien die Fähigkeit, als Antwort auf eine Serumexposition eine epitheliale Differenzierung hervorzubringen. Die Injektion dieser Zellen in bestrahlte thymusdefiziente Nacktmäuse ergab nach bis zu neun Monaten keine Tumorbildung. Außerdem wurde festgestellt, dass diese Zelllinien geeignete Empfänger für die Transfektion zusätzlicher Gene darstellen und für die Untersuchung des Zytotoxizitätspotentials chemischer und physikalischer Agenzien, der Wachstumsinhibition oder der Förderungsfähigkeit biologischer Substanzen und des epithelialen Differenzierungspotentials chemischer und biologischer Substanzen nützlich waren.
Entwicklung der BEAS-2B Zelllinie
Eine in dieser Erfindung bevorzugte Zelllinie ist die BEAS-2B, die folgendermaßen hergestellt wurde. NHBE-Zellen wurden ausgehend von Explantaten aus Autopsiegewebeproben krebsfreier Subjekte, wie durch Lechner et al., J. Tissue Culture Methods, 9: 43–48, 1985 beschrieben, kultiviert. Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium, LHC-9, kultiviert, durch Trypsinisierung gewonnen und in 10 ml Wachstumsmedium in 100 mm Kulturschalen eingesät (Lux, Miles Scientific, Naperville, IL), dessen Wachstumsoberflächen mit einer Lösung aus Rinderserumalbumin, Fibronektin und Kollagen überzogen war (Lechner, et al., supra.).
Das Adenovirus 12-SV40 (Ad12SV40) Hybridvirus (Schell, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 55: 81–88, 1966) wurde in Vero-Zellen angezüchtet, wie beschrieben durch Rhim, et al., Proc. Natl. Sci, U.S.A., 78: 313–317, 1981. NHBE-Zellen wurden vier Stunden lang und mit einer großen Anzahl, etwa 100, Infektionen mit dem Virus bei 37°C versetzt. Als die Kulturen eine Konfluenz erreichten, wurde von jeder Schale eine Subkultur in zwei 75 cm² Flaschen angelegt. Die Zellen wurden erneut bis zur Konfluenz angezüchtet und wurden dann zweimal wöchentlich gefüttert, bis transformierte Kolonien entstanden und die normalen Zellen alterten. Die Alterung der normalen Zellen wurde durch Exposition der Kulturen mit 1% FCS (Fetales Kälberserum) in LHC-9 während 28 Tagen beschleunigt (Lechner, et al., Differentiation, 25: 229–237, 1984); die weitere Kultur dieser Zellen erfolgte in serumfreiem LHC-9 Medium. Von einzelnen Kolonien wurden 41 Tage nach der Virusinfektion Subkulturen angelegt, und von diesem Versuch abgeleitete Zellstämme wurden als BEAS-2B bezeichnet. Northern Blots von BEAS-2B Zellen haben gezeigt, dass diese Zellen Phase II Enzyme exprimieren, wie Epoxyd-Hydrolase, Katalase, Glutathion-Peroxydase, Superoxyd-Dismutase und Glutathion-S-Transferase.
Wenn die Zellen mit exogenen P450 Cytochromen supplementiert werden, stellen die BEAS-2B Zellen ein authentisches Modellsystem zur Analyse von normalem Lungengewebe in vivo dar. BEAS-2B Zellen stammen von humanen Bronchialepithelzellen ab und sind wahrscheinlich die Vorläuferzellen aller Lungenkrebstypen. Darüber hinaus, außer für P450 Cytochrome, die gering oder gar nicht exprimiert werden, exprimieren die BEAS-2B Zellen viele Enzyme, die beim Aktivierungsprozess von Karzinogenen und Mutagenen mitwirken, wie z. B. Glutathion-S-Transferase, Epoxyd-Hydrolase und NADPH-Cytochrom P450-Reduktase. BEAS-2B Zellen wurden unter den Bedingungen der Budapest Treaty at the American Type Culture Collection angemeldet und erhielten die Zugangsnummer CRL9609.
B. Leberzelllinien
Herstellung und Eigenschaften von unsterblichen, nicht onkogenen humanen Leberzelllinien (vor Transfektion mit exogenen P450-Genen) werden in der gleichzeitig angemeldeten Anwendung USSN 07/844.873 hinreichend detailliert ausgeführt. Relevante Details für die Anzüchtung von Zelllinien werden weiter unten beschrieben. Die Eigenschaften der Zelllinien sind zusammengefasst.
(1) Anzüchtung, Herstellung
8a) Primärkultur von normalem reifem Lebergewebe
Das LCM Medium (Lechner, J. F. et al., Cancer Detect. Prev. 14: 239 (1989)) besteht aus PFMR-4 Medium (Biofluids, Rockville, MD), bei dem die Ca²⁺ Konzentration auf 0.4 mM begrenzt und Arginin durch 0.3 mM Ornithin ersetzt wurde, angereichert mit Insulin (1.45 μM), Transferrin (125 nM), Choleratoxin (300 pM), Hautwachstumsfaktor (825 pM), Hydrokortison (0.2 μM), Trijodthyronin (10 nM), Retinolsäure (10 nM), Phosphoethanolamin (0.5 μM), Ex-Cyte V (312 μM), Rinderhypophysenextrakt (7.5 μg Protein/ml), und chemisch denaturiertes Serum.
Das durch Hep-G2-Zellen konditionierte LMC-Medium (= HGLCM) wurde mit Hep-G2 Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) hergestellt, die in einem DMEM-Medium gehalten und mit 10% fetalem Kälberserum angereichert wurden. Fast konfluente Kulturen solcher Zellen wurden zweimal mit LCM gewaschen und dann während 72 Stunden in LCM gehalten. Der Überstand des Mediums (HGLCM) wurde entfernt, mittels Filtration durch eine 0,22 μm Membran sterilisiert und unter sterilen Bedingungen aufbewahrt.
Normale Leberepithelzellen wurden durch Kollagenase-Dispase-Perfusion des linken unteren Leberlappens von Lebern erwachsener Spender bei sofortiger Autopsie ohne klinische Anzeichen von Krebs gewonnen (Hsu, I. C. et al., In Vitro Cell Develop. Biol. 21: 154 (1985)). Die Kulturen wurden in Flaschen inokuliert, die vorher mit Kollagen-I überzogen wurden (Vitrogen^TM, Celtrix Laboratories, Palo Alto, CA) und dann über Nacht in Waymouth Medium + 10% fetales Kälberserum inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Kulturen mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS) gespült und das Medium durch HGLCM ausgetauscht.
Innerhalb von 2 bis 4 Tagen Isolierungszeit der normalen Zellen wurden Gruppen von zufällig angeordneten replizierenden Zellen mit einer epithelartigen Morphologie offensichtlich. Diese Kulturen bildeten nach 10 bis 14 Tagen Inkubation eine konfluente Einzellenschicht. Diese normalen Zellen könnten bei einer 1 : 4-Splitrate mit derselben Kollagenase-Dispase-Lösung subkultiviert werden, die zur Erstellung der Primärkultur verwendet wurde, um die Zellen von der Oberfläche des Kulturgefäßes zu entfernen. Die durchschnittliche Lebensdauer dieser normalen Leberepithelzellen betrug 12 Populationsverdopplungen.
(b) Produktion des SV40 Tag-exprimierenden Retrovirus
Ein rekombinantes Retrovirus, welches das breite T Antigen Gen SV40 trägt, wurde durch Insertion des BgII-HpaI-Fragments der SV40 Viral-DNA (Nukleotide 5235–2666) in den BamHI Bereich des pZipNeoSVX (Jat, P. S. et al., Mol. Cell. Biol. 6: 1204 (1986)) Retrovirusvektors konstruiert, und zwar mittels BamHI-Linker und Standard-DANN-Rekombinationstechniken. Bei dem Fragment des verwendeten SV40-Genoms fehlten der Frühpromotor und der Bereich der Polyadenylation.
Infektiöse rekombinante Viruspartikel wurden hergestellt durch Infektion der amphotropen Verpackungszelllinie PA317 mit dem rekombinanten Ecotropic Virus, erstellt durch Transfektion des oben erhaltenen Vektors in die Ecotropic Verpackungslinie Psi2. Die transfektierten Zellen wurden durch Neomycin-Selektion isoliert, und 10 Klone wurden isoliert. Die geklonten PA317-Zellen wurden in DMEM-Medium fortgepflanzt, das mit 10% FBS angereichert war. Das Medium wurde durch ein serumfreies PC-1 Medium ausgetauscht (Ventrex Laboratories, Portland, ME). Das entnommene Virus wurde durch Infektion von 8 × 10⁴ NIH 3T3 Zellen in einer 60 mm Schale mit den verschiedenen Verdünnungen des überstehenden Mediums, das das Virus enthält, unter Beimischung von 8 μg/ml Polybren getitert. Nach 10 Tagen wurden die Kolonien unter Verwendung von 750 μg/ml Neomycin gezählt.
(c) Infektion primärer Lebergewebekulturzellen
Ein Viruspool von 7 der 10 Klone der transfektierten PA317 Zellen wurden verwendet, um die primären Lebergewebekulturen zu infizieren. 8 × 10⁴ Zellen der Primärkulturen wurden mit dem rekombinanten Virus während 2 Stunden in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren in einem PC-1 Medium infiziert. Nach der Infektion wurden die Kulturen mit HEPES gepufferter Salzlösung (HBS) gewaschen und in LCM-Medium inkubiert. Die Infektion mit dem rekombinanten Virus führte dazu, dass nahezu alle Leberzellen der Kultur begannen, sich rasch zu teilen. Mehrere Kulturen wurden so erstellt. All diese Kulturen wurden als Massenkulturen passagiert. Zunächst erfolgten in den THLE-Zellen etwa 25 Populationsverdoppelungen in den ersten sechs Wochen nach der Infektion, dann verminderte sich das Wachstum merklich. Die Zellen wurden bei jeder Passage in der ersten Wachstumsperiode kryokonserviert.
Die THLE-2-Zelllinie wurde am 16. Mai 1989 unter den Bedingungen des Budapest Treaty at the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD angemeldet und erhielt die Zugangsnummer CRL10149. Die THLE-3-Zelllinie wurde am 14. Januar 1993 unter den Bedingungen des Budapest Treaty at the American Type Culture Collection angemeldet und erhielt die Zugangsnummer CRL 11233. Die THLE-5-Zelllinie (zuweilen auch als "THLE-5B" bezeichnet) wurde am 23. April 1992 unter den Bedingungen der Budapest Treaty at the American s Type Culture Collection angemeldet und erhielt die Zugangsnummer CRL11113.
Die THLE-5B-Zelllinie wurde in vielen der Untersuchungen der Beispiele 2–5 verwendet.
(2) Eigenschaften der THLE-Zelllinien
DNA-Transformation. Die THLE-Zellen enthalten nach der Bestimmung durch Southern Blotting ungefähr eine Kopie des SV40 T Antigen-Gens.
Unsterblichkeit. Das Wachstum ging nach etwa 25 Populationsverdoppelungen (PDs) in den ersten 6 Wochen nach der Infektion merklich zurück. Zu diesem Zeitpunkt wurden auch in frühen Passagen kryokonservierte THLE-Zellen verwendet, um die Wachstumsantworten auf die Anreicherungen des LCM-Mediums zu bestimmen.
Die klonale Wachstumsrate könnte durch Weglassen der Fett- (ExCyte V) und Choleratoxinanreicherungen, durch Ersatz von Ornithin durch Arginin und von dem HepG2-Medium durch T2-CM optimiert werden. Mit diesem veränderten Wachstumsmedium (MLCM) haben die THLE-Zellen > 130 PDs ohne eine Spur von Alterung erfahren. Die sichtbare maximale PD-Zeit liegt bei 24 Stunden, und die Koloniebildungsfähigkeit liegt bei ca. 15%.
Expression der Phänotypenmerkmale von Hepatozyten
Cytokeratin 18, aber nicht Cytokeratin 19, war in den frühen Passagen der THLE-Zellen einheitlich exprimiert, während bei Passage 10–12 alle Zellen ebenfalls Cytokeratin 19 exprimierten. Die Expression von α-Fetoprotein oder Faktor VIII wurde bei den Früh- oder Spätpassagen nicht detektiert, während α₁-Antitrypsin and α₂-Makroglobulin vorhanden waren. Albumin wurde im Zytoplasma der THLE-Zellen im Früh-Passagestadium leicht durch immunzytochemische Nachweismethoden detektiert. Inseln von Albumin-positiven Zellen wurden umgeben von Büscheln weniger intensiv gefärbter Zellen, die verschiedene Zellklone oder -typen anzeigten. Die Immunblot-Analysen zeigten, dass die THLE-Zellen bei den Spät-Passagen Albumin absondern. Die Albuminabgabe der THLE-Zellen lag zwischen ca. 300 pg/ml und 14,5 ng/ml. γGT war in einigen THLE-Zellkolonien bei zytochemischen Nachweisen schwach positiv, wie auch in den Primärkolonien vor Einführung des SV40 T-Antigens. Im gleichen Test waren die 3T6-Zellen negativ, während HepG2-Zellen eine hohe Enzymaktivität zeigten.
Karyotypische und onkogene Analyse. Die Karyotypanalyse zeigte, dass THLE-Zellen hypodiploid sind, wobei die meisten Karyotypen fast diploid sind. Die typischen Auswirkungen des SV40 T-Antigens wurden bei der 22. Passage ebenfalls in den THLE-Zellen detektiert, d. h. Monosomie am Chromosom 13 und Deletionen an den Chromosomen 2 und 8. Bei der Untersuchung der Zelllinien auf Tumorbildung durch subkutane Injektion von je 10⁶ Zellen in thymusdefiziente Nacktmäuse (20 Tiere) wurden nach 12 monatiger Beobachtung keine Tumoren festgestellt.
Untersuchungen zum Metabolismus. Metabolismus, Zytotoxizität und DNA-Adduktbildung wurden an drei verschiedenen Klassen von Karzinogenen in THLE-Zellen untersucht. AFB₁ B[a]P bzw. DMN bedingen die dosisabhängige Zytotoxizität der THLE-Zellen, die auf die metabolische Aktivierung dieser Promutagene in gentoxischen Metaboliten hinweist. AFB₁, DMN bzw. B[a]P bildeten jeweils 3.5 ± 0.9, 30.4 + 3.9, und 1.5 ± 0.1 fmol Adduktmasse pro μg DNA bei THLE-Zellen, die in Roller Bottles gezüchtet wurden. Das bedeutendste Addukt, das in den mit ³H-labeled B[a]P behandelten Zellen gefunden wurde, war chromatographisch nicht von dem Hauptprodukt zu unterscheiden, das gebildet wurde, wenn die DNA mit (±)%7, t-8-Dihydroxy-c-9,10-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren (BPDE) in Reaktion gebracht wurde. Die ³²P-postlabeling-Analyse ergab das Addukt von N¹-Methyldeoxyguanosin in den mit DMN inkubierten THLE-Zellen. Das Hauptaddukt bei den THLE-Zellen nach Exposition mit AFB₁ war 8,9-Dihydro-8-(2,6-diamino-4-oxo-3,4-dihydropyrimid-5-yl-formamido)-9-hydroxyaflatoxin B₁, (AFB₁-FAPyr), während AFB₁diol und 8,9-Dihydro-8(N¹-guanyl)-9-hydroxyaflatoxin B₁ seltener als Addukte auftraten. Die Vorinkubation von Zellen mit Aroclor 1254, ein Induktor von CYP1A1/1A2, verstärkte die Bildung von Addukten aufgrund von B[a]P um das 3-fache auf 4.9 ± 2.7 fmol/μg DNA, verminderte die Addukte aufgrund von DMN auf 3.4 ± 0.1 fmol/μg DNA, und hatte keine Auswirkungen auf DNA-Adduktbildung (1.6 ± 0.4 fmol/μg DNA) durch AFB₁. Die Vorbehandlung mit β-Naphthoflavon verhinderte die Fähigkeit der THLE-Zellen, B[a]P zu aktivieren. Ganz ähnlich verringerte eine Ethanolbehandlung der THLE-Zellen die metabolische Aktivierung des DMN.
Expression von Phase I und Phase II Enzymen. Die quantitative RNA-Analyse der CYP1A1 mRNA stimmte mit den Ergebnissen der DNA-Adduktanalyse überein. CYP1A1 mRNA war in Roller Bottle Kontrollkulturen nicht nachweisbar. Die Exposition mit Aroclor 1254 bzw. B[a]P erhöhte den Gehalt an CYP1A1 mRNA. Wurden die Zellen mit beiden Agenzien behandelt, erschienen die CYP1A1-Auswirkungen beider Komponenten additiv. Im Gegensatz dazu induzierten weder DMN noch AFB₁ die Expression von CYP1A1 mRNA in Roller Bottle Kulturen von THLE-Zellen. Andere CYPs (CYP1A2, CYP2A3, CYP2E1, CYP2D6 und CYP3A4) waren mittels RNA Blot-Analyse nicht nachweisbar.
Die THLE-Zellen exprimieren die gleiche Menge Epoxyd-Hydrolase mRNA, aber weniger NADPH CYP Reduktase mRNA. Entgiftungsenzyme wie Superoxyd-Dismutase, Katalase und Glutathion-Peroxydase werden in den THLE-Zellen in mRNA-Mengen exprimiert, die denen von humanem Lebergewebe ähnlich sind. GSTπ mRNA wurde im Lebergewebe des Spenders nicht gefunden, wurde aber durch die THLE-Zellen exprimiert. Dagegen wurde GST-α mRNA nur im Original-Lebergewebe gefunden (Daten nicht gezeigt).
Schlussfolgerungen. Diese Ergebnisse zeigen, dass THLE-Zelllinien viele der Eigenschaften zeigen, die dem Ruhezustand normaler reifer Leberzellen entsprechen, abgesehen von der vollen Expression aller Cytochrom P450-Enzyme. Obwohl THLE-Zellen in der Lage sind, einige toxische, karzinogene oder mutagene Substanzen zu metabolisieren, bleibt diese Fähigkeit weit unter den mit Cytochrom P450 transfektierten THLE-Zellen der vorliegenden Erfindung. Siehe Beispiel 5.
Beispiel 2. Einführung von P450-Enzymen in unsterbliche Zellen
A. pXT1 Fehlerhaftes Retrovirus Infektionssystem
cDNA für die Cytochrom-P450-Enzyme 1A2, 2A3, 3D6, 2E1 und 3A4 wurden mittels rekombinanter amphotropher Hochtiter-Retroviren in die BEAS-2B-Zellen eingeführt. Diese Retroviren wurden generiert durch Klonen der entsprechenden c-DNAs in ein pXT1-Plasmid (Boulter, et al., Nucleic Acid, 15: 7194, 1987) und Transfektion der rekombinanten Plasmide in eine kokultivierte Verpackungslinie mit amphotrophen (PA317) und Ecotropic-Verpackungen (Psi2) mit Calciumphosphat-Fällung (Bestwick, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5404–5408, 1988) (Siehe 1).
Nach 10 Tagen wurde das Virus aus konfluenten PA317/Psi2 Kulturen gesammelt und in serumfreies PC-1 Medium überführt (Ventrex Laboratories, Inc., Portland, OR). Die Titer wurden aus NIH3T3-Zellen bestimmt und als überstehende neomycin-resistente Kolonien/ml exprimiert. Die BEAS-2B Zellen wurden 2 Stunden mit den P450-Viren bzw. den Kontrollviren infiziert, pXT1-Plasmid, in ein PC-1 Medium überführt, welches mit 8 μg/ml Polybren angereichert war (Tabelle 2).
TABELLE 2
Es wurde das gleiche Zellenverhältnis gegenüber den koloniebildenden Einheiten des Virus verwendet. Achtundvierzig Stunden nach der Infektion wurden die BEAS-2B-Zellen 8 Tage lang mit 125 μg/ml Neomycin nach G418 Neomycin-Resistenz ausgewählt. Später wurden die Zellen mittels Western Blot-Analyse nach dem Vorhandensein der eingeführten Gene ausgewählt. Für BEAS-2B-1A2 wurde beispielhaft festgestellt, dass die Population und 3 Klone (Klon 8 > Klon 3 > Klon 6) das dem P450-Retrovirus entsprechende Protein exprimierten. In Übereinstimmung damit zeigte Klon 8 (cl 8) die höchste Empfindlichkeit, er reagierte bis zu 150 mal empfindlicher auf die zytotoxische Wirkung und bis zu 250 mal auf die gentoxische Wirkung der Modellverbindung AFB₁ als die Kontrollzelllinie.
B. CMV-Plasmid-Lipofektionssystem
pCMV-Cytochrom-P450 Konstruktionen wurden durch die Klonierung humaner Cytochrom P450 cDNAs an der 3'-Seite des Promotors des Zytomegalovirus (CMV) in der immediate-early Genregion generiert. Siehe 2. cDNA-Fragmente wurden in den BamHI-Bereich (nach Änderungen an den klebrigen Enden) des pCMV-Neoplasmids (freundlicherweise zur Verfügung gestellt durch Bert Vogelstein, Johns Hopkins University) inseriert, um die pCMV Cytochrom P450 Konstruktionen zu generieren. Die Konstruktion von pCMV wird beschrieben von Baker et al., Science (1990) 249: 912–915). pA ist die Polyadenylations-Sequenz des β-Globin-Gens beim Kaninchen. Neo ist das selektierbare Neomycin-Gen, das G418 Selektions-Resistenz verleiht. Amp^R entspricht dem Ampicillin-Resistenzgen.
pCMV-Cytochrom P450-Konstruktionen (und ein unveränderter pCMV-Vektor als Kontrolle) wurden mittels Lipofektion in Leber- und Brochialzelllinien eingeführt. Kurze Beschreibung: es wurden 1,10⁶ Zellen mit 10 μg DNA in 5 ml Opti-MEM Medium (GIBCO-BRL) lipofektiert, das 50 μl Lipofektin (GIBCO-BRL) enthielt. Nach 3 Stunden wurden die Zellen gewaschen, und ein frisches Medium mit 10% chemisch denaturiertem fetalem Kälberserum (Upstate Biotechnology, Inc., New York) wurde zugegeben. Nach 48 Stunden wurden die transfektierten THLE-5B bzw. BEAS-2B Zellen nach G418-Resistenz während zwei Wochen mit 50 μg/ml G418 selektiert.
Beispiel 3: Immunblots-Analyse von eingeführten P450-Genen
Nach Einführung der P450-Gene durch defektive Replikation, Retrovirus-Infektion oder Lipofektion, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Zelllinien mittels Western Blotting auf Expression von P450- Genen getestet. Für die Gesamtproteinextraktion (etwa 2.10⁴ Zellen) vorgesehene Proben und humane mikrosomale Cytochrom P450-Standardfraktionen (10 μg)(Gentest Corp., Woburn, MA)(als positive Kontrollen) wurden einem SDS-PAGE Verfahren unterzogen (15% Polyacrylamidgele) und mit einem semi-dry Elektroblotter (Ancos, Dänemark) auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Die Filter wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen das getestete Cytochrom P450 (Verdünnung 1 : 50) inkubiert und mit einem ImmunoPure ABC Kaninchen-IgG-Farbkit (Alkalinphosphatase) entwickelt (Pierce, Socochim SA, Schweiz). 3–7 zeigen die Expression der P450 Cytochrome 1A2, 2A6, 3A4, 2E1 und 2D6 in entsprechenden BEAS-2B Zellen, die mit dem entsprechenden, an den pCMV-Vektor gebundenen Gen transfektiert wurden. Es werden auch die Standardmikrosomenfraktionen (M) als positive Kontrollen und BEAS-2B-Zellen gezeigt, die mit unverändertem pCMV (B-CMV-neo) als negative Kontrollen transfektiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass transfektierte exogene P450-Cytochromgene in BEAS-2B-Zellen exprimiert werden. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Transfektion von THLE-5B-Zellen erzielt. 8 zeigt, dass die Expression von Cytochrom P450-1A2 in THLE-5B-CMV 1A2 Zelllinien erzielt wurde. In den THLE-5B-CMV Kontrollzellen wurde keine Expression beobachtet. Diese Zellen haben keine exogenen P450-Gene.
Beispiel 4. Metabolismus von Cytochrom P450-Substraten in mit exogenen P450-Genen transfektierten Zellen
Zellen, die exogene P450-Gene enthalten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, P450-Substrate zu metabolisieren, wobei die Funktionsfähigkeit der P450-Enzyme mittels Expression der exogenen Gene gezeigt wurde. In einem Versuch wurde Ethoxycumarin als ein Substrat verwendet, um die Funktionsfähigkeit von Cytochrom P450 1A2 in BEAS-2B- und THLE-5B-Zellen zu bestimmen. Kulturen wurden mit einer Dichte von 0.25 bis 0.5 10⁶ Zellen pro 60-mm Petrischale ausgestrichen. Am nächsten Tag wurde das Medium durch 2 ml Assaypuffer ersetzt (0.2 M Saccharose, 0.05 M Tris, pH 8.5, 0.01 M MgCl₂), der 250 μM 7-Ethoxycumarin-Substrat enthielt. Nach Inkubation bei 37°C während der gewünschten Zeit wurden 1.0 ml des Überstands durch Hinzugabe von 100 μl 20%igem TCA angesäuert. Nach Zentrifugieren wurde der Überstand mit 2.0 ml eines 1.6 M Glycin-NaOH Puffers bei pH 10.3 gemixt und die Fluoreszenz bei einem Signal von 390 nm und einer Emission bei 440 nm gemessen. Die Quantifizierung kann durch Vergleich mit der Fluoreszenz einer bekannten Menge Umbelliferon erreicht werden. Tabelle 3 zeigt die ECD-Aktivität von AHH-1A2/Hyg (Lymphoblast Zelllinie mit CYP1A2, beschrieben durch Crespi, supra), BEAS-2B-1A2 cl8 (BEAS-2B Zelllinie mit CYP1A2 gebunden an das pXT1-Expressionssystem), BEAS-2B-CMV-1A2 cl2 (BEAS-2B Zelllinie mit CYP1A2 gebunden an das pCMV-Expressionssystem), THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 und THLE-5B-CMV-1A2 cl5.4 (verschiedene Klone der THLE-5B-Zellen mit CYP1A2 Cytochrom gebunden an den pCMV-Vektor). 4 zeigt den Zeitablauf der ECD-Aktivität bei CYP1A2 für die THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 und THLE-5B-CMV-1A2 cl5.4 Zelllinien.
TABELLE 3
In einem ähnlichen Versuch wurde auch gezeigt, dass THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 Zellen fähig sind, Ethoxyresofurin-Substrat etwa 100-mal schneller zu metabolisieren als THLE-5B-CNV-neo cl5.16 Kontrollzellen. Siehe Tabelle 4. Dies bestätigt, dass die aus der Expression der exogenen Gene resultierenden CYP1A2-Enzyme auch beim Ethoxyresofurin-Stoffwechsel funktionieren.
TABELLE 4
In einem weiteren Versuch wurde gezeigt, dass BEAS-2B-Zellen, die exogenes Cytochrom P450 2A6 enthalten, fähig sind, Cumarin im Vergleich zu Kontrollzellen in hohen Raten zu metabolisieren. Dies deutet auf die Funktionalität des 2A6-Expressionsproduktes hin. Siehe Tabelle 5.
TABELLE 5
Beispiel 5. Zytotoxizität und Gentoxizitäts-Analyse von P450-exprimierenden Zelllinien
A. AFB₁ Zytotoxizitätsanalyse
Die Kulturen wurden den angegebenen Aflatoxin B₁ (AFB₁)-Konzentrationen ausgesetzt. Jede Kultur enthielt etwa 1 × 10⁵ Zellen pro 60 mm-Petrischale. Nach 28 Stunden wurden die Zellen gewaschen und frisches Medium zugegeben. Nach 5 Tagen wurde die Zellanzahl bestimmt. Die Zytotoxizität wird als Überlebensrate im Vergleich zu unbehandelten Vergleichszellen ausgedrückt. Die Werte werden als Mean ± SD zweier unabhängiger Versuche ausgedrückt.
Tabelle 6 und 10 vergleichen die relative Überlebensrate verschiedener Zelltypen nach Behandlung mit unterschiedlichen Dosen AFB₁. AHH-1A2/Hyg ist die P450-exprimierende Lymphoblast-Zelllinie nach Crespi, supra, und AHH-1TK+/- ist eine Kontrollzelllinie ohne exogenes P450-Gen; BEAS-2B-1A2 cl8 und BEAS-2B-CMV-1A2 cl2 sind BEAS-2B Zelllinien mit einem exogenen P450-Gen unter der jeweiligen Kontrolle von pXT1- bzw. pCMV-Expressionssystemen; BEAS-2B-pXT1 cl4 und BEAS-2B-CMV-neo cl2 sind BEAS-2B-Zelllinien mit unveränderten pXT1- und pCMV-Expressionsvektoren; THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 ist eine THLE-5B-Zelllinie mit CYP1A2 an einem pCMV-Vektor, und THLE-5B-CMV-neo cl5.16 ist eine THLE-5B-Kontrollzelllinie mit unverändertem pCMV-Vektor. Die Überlebensrate der THLE-5B-Stämme wurde ebenfalls durch ein 96-Well-Mikrotiter Assay bestimmt. In diesem Assay wurden pro Well 1 × 10⁴ Zellen 28 Stunden mit AFB₁ behandelt. Vier bis fünf Tage später wurden die Zellen mit Crystal Violett gefärbt. Nach der Farbextraktion wurden die Platten bei 630 nm gelesen. Tabelle 6 AFB₁-Zytotoxizität und ECD-Aktivität in 1A2-exprimierenden Zellen Relative Überlebensrate

0,6 cm: 1.10³ Zellen/0,6 cm wurden mit AFB₁ 28 Stunden lang in Kontakt gebracht, 5 Tage später wurden die Zellen ausgezählt.
96 wells: 1.104 Zellen/Vertiefung wurden mit AFB₁ 28 Stunden lang in Kontakt gebracht, 4 bis 5 Tage später wurden die Zellen mit Cristall Violett angefärbt. Nach Eluierung wurden die Platten bei 630 nm gelesen.

Tabelle 6 zeigt, dass alle Zelllinien, die ein exogenes P450-Gen enthielten, eine geringere Überlebensrate zeigten als die entsprechenden Kontrollzelllinien. Die Tabelle zeigt auch, dass BEAS-2B-Zellen, die das P450-Gen aus dem pCMV exprimieren, empfindlicher reagieren als die BEAS-2B-Zellen, die das P450-Gen aus dem pXT1 exprimieren, was darauf hindeutet, dass eine aktive Bindung eines P450-Gens an den Zytomegalovirus-Promotor des pCMV eine höhere P450-Expression ermöglicht. Von den verschiedenen getesteten Zelllinien zeigten die THLE-5B-Zellen mit einem P450-Gen, das an das pCMV-Expressionssystem gebunden ist, die größte Empfindlichkeit für AFB₁.
TABELLE 7
Tabelle 7 zeigt die CD50-Werte abgeleitet von den Daten aus Tabelle 6. Die CD50-Rate ist die Dosis an Karzinogen, die gebraucht wird, um eine Überlebensrate von 50% zu erzeugen. Aus dieser Tabelle können ähnliche Schlussfolgerungen gezogen werden wie die für Tabelle 6 oben erörterten.
BEAS-2B-Kulturen, die andere exogene Cytochrom-P450-Gene enthalten, wurden auch auf Aflatoxin B₁-Zytotoxizität getestet, zusammen mit geeigneten Kontrollzellen. 11 zeigt, dass BEAS-2B-CMV-3A4 cl7 Zellen (BEAS-2B Zellen mit einem exogenen Cytochrom-P450 3A4 Gen gebunden an den pCMV-Vektor) und BEAS-2B-CMV-2A6 cl5 (BEAS-2B Zellen mit einem exogenen Cytochrom-P450 2A6 Gen gebunden an den pCMV-Vektor) größere Zytotoxizität aufweisen als BEAS-2B-CMV-neo cl2 Zellen (BEAS-2B Zellen mit pCMV-Vektor, aber ohne exogenes P450-Gen).
B. Gentoxizitätsanalyse mit AFB₁
Tabelle 8 zeigt die DNA-Adduktbildung mit AFB₁ für die BEAS-2B-1A2 cl8 Zelllinie im Vergleich zu einer BEAS-2B-pXT1 cl4 Kontrollzelllinie. Es handelt sich um die gleichen Zelllinien wie in Tabelle 6 beschrieben. Die Adduktbildung war in Klon 8 um den Faktor 1000 erhöht.
TABELLE 8
C. AFG₁-Zvtotoxizitätsanalyse
12 zeigt die Analyse der Zytotoxizität an den BEAS-2B-pXT1 und BEAS-2B-1A2 Klonen von Aflatoxin G₁ im Vergleich zu Aflatoxin B₁. Die Zellen wurden 28 Stunden lang unterschiedlichen Mutagenkonzentrationen ausgesetzt. Jede Kultur enthielt 250 Zellen pro 60 mm-Petrischale. Nach 7–10 Tagen wurde die Zytotoxizität durch Messung der Kolonienanzahl auf jeder Platte bestimmt. Die Kolonienanzahl der mutagenbehandelten Kulturen wurde durch die Kolonienanzahl der unbehandelten Kulturen dividiert, um die relative Überlebensrate zu bestimmen. Jeder Zeitpunkt entspricht mindestens 3 unabhängigen Versuchen. 12 zeigt, dass BEAS-2B-1A2 Zellen sowohl gegenüber Aflatoxin B₁ als auch gegenüber Aflatoxin G₁ empfindlicher reagieren als Kontrollzellen, die kein exogenes Cytochrom P450-1A2 Gen aufweisen.
D. PhIP Zytotoxizitätsanalyse
Die THLE-5B-Zellen, die Cytochrom CYP1A2 aus dem pCMV-Vektor exprimieren, wurden nach der in Beispiel 5 A beschriebenen Methode auf PhIP-Zytotoxizität getestet. Dabei wurden die Zellkulturen mit den angegebenen PhIP-Konzentrationen in Kontakt gebracht. 13 zeigt, dass die THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 Zelllinie sehr viel empfindlicher auf PhIP reagiert als der Kontrollstamm THLE-5B-CMV-neo cl5.18 (der den unveränderten pCMV-Vektor enthält).
E. Zytotoxizitätsanalyse mit Diethylnitrosamin and Dimethylnitrosamin
BEAS-2B-Zellen, die Cytochrom P450 2E1 aus dem pCMV-Vektor exprimieren, wurden auf Zytotoxizität gegenüber Diethylnitrosamin und Dimethylnitrosamin getestet. 14 und 15 zeigen, dass diese Zellen empfindlicher auf Diethylnitrosamin und Dimethylnitrosamin reagieren als Kontrollzelllinien mit unverändertem pCMV-Vektor.
Abbildung 1
Titel Abbildungen 3 bis 8

3: Cytochrom P450 Expression in mit CMV-1A2 lipofektierten BEAS-2B Zellen
4: Cytochrom P450 Expression in mit CMV-2A6 lipofektierten BEAS-2B Zellen
5: Cytochrom P450 Expression in mit CMV-3A4 lipofektierten BEAS-2B Zellen
6: Cytochrom P450 Expression in mit CMV-2E1 lipofektierten BEAS-2B Zellen
7: Cytochrom P450 Expression in mit CMV-2D6 lipofektierten BEAS-2B Zellen
8: Cytochrom P450 Expression in mit pCMV-1A2 lipofektierten THLE-5B Zellen

Abb. 9 bis 15

Claims

Nicht-onkogene, stabile menschliche reife Leberepithel-Zelllinie, die ein in ihr exprimierbares exogenes Cytochrom-P450-Gen enthält und durch Einfügen des exogenen Cytochrom-P450-Gens in eine unter der Referenz ATCC CRL 11113 angemeldete THLE-5B-Zelllinie oder in ein geklontes Isolat davon hergestellt wird.
Zelllinie nach Anspruch 1, bei der das exogene Cytochrom-P450-Gen aus der aus den Cytochromen P450 1A1, 1A2, 2A6, 3A3, 3A4, 2B6, 2B7, 2C9, 2D6, 2E1 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Zelllinie nach Anspruch 1 oder 2, bei der das exogene Cytochrom-P450-Gen zweckmäßig mit einem Cytomegalovirus-Promoter verbunden ist.
Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das exogene Cytochrom-P450-Gen 1A2 ist.
Verfahren zum Identifizieren oder Testen der Mutagenität, Zytotoxizität oder Karzinogenität einer Substanz, das folgende Schritte umfasst: a) Reaktion, Kultur oder Inkontaktbringen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Substanz, von der angenommen wird, dass sie mutagen, zytotoxisch oder karzinogen ist; und b) Bestimmen oder Kontrollieren der Auswirkungen auf die Zelllinie, die auf eine Mutagenität, Zytotoxizität oder Karzinogenität hinweisen.
Verfahren zum Identifizieren oder Testen der chemopräventiven Wirkung einer Substanz, das folgende Schritte umfasst: a) Reaktion, Kultur oder Inkontaktbringen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Substanz, von der angenommen wird, in Gegenwart eines Karzinogens chemopräventiv zu sein; und b) Bestimmen oder Kontrollieren der Auswirkungen auf die Zelllinie, die auf eine chemopräventive Wirkung hinweisen.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Substanz mit der Zelllinie zum Reagieren gebracht, zur Kultur angelegt oder in Kontakt gebracht wird, bevor das Karzinogen hinzugefügt wird.
Verfahren zur Bestimmung der durch ein Karzinogen oder ein Xenobiotikum aktivierten Metabolite, das folgende Schritte umfasst: a) Reaktion, Kultur oder Inkontaktbringen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit dem in Verdacht stehenden Karzinogen oder Xenobiotikum; und b) Identifizieren der Metabolite und/oder deren Auswirkungen.
Diagnosekit, das die Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ein Wachstumsmedium für die Zelllinie und Reagenzien zum Diagnostizieren einer Antwort der Zelllinie auf eine karzinogene, mutagene oder toxische Substanz umfasst.