JPH1028580A - ヒト上皮大腸不死化細胞株 - Google Patents

ヒト上皮大腸不死化細胞株

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なヒト上皮大腸不死化細胞株、この細胞
株を得るための方法、及び、特に腸管細胞の代謝に対し
て突然変異誘発性、毒性又は有効性を有する物質の同定
方法の提供。 【解決手段】 非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マ
ーカー、及びヒトの大腸の非不死化上皮細胞に特異的な
代謝分化マーカーを発現し、インビトロで乳酸菌ＣＮＣ
Ｍ−１２２５株に粘着することができる、腫瘍マーカー
の欠如したヒト不死化大腸上皮細胞株。ヒト大腸の上皮
細胞の培養物及び不死化に適応させた無血清培地。腸管
細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性又は有効性を
有することが疑われる物質を、ヒト上皮大腸不死化細胞
株を有する培養物と反応、培養又は接触させ、該細胞株
に対するこの物質の作用を定量又は測定する、腸管細胞
の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性又は有効性
を確認する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の目的は、新規なヒト
上皮大腸不死化細胞株、この細胞株を得るための方法、
および、特に腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、
毒性または有効性を有する物質の同定方法におけるこの
細胞株の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】長年の間、例えば感染症、炎症または癌
のようなヒトの疾患の研究に適したヒト細胞株の開発が
試みられてきた。疾患の発生にしばしば関係する細胞に
は、上皮細胞、特に人体の環境に対して、および特に食
事の条件に対して感受性のある腸管の上皮細胞がある。
【０００３】上皮細胞は、人体の他の細胞とは、例え
ば、サイトケラチン（モル（Moll）ら、Ｃｅｌｌ，３
１，１１−２４，１９８２）、細胞間の結合組織（グン
ビネル（Gumbiner）ら、Ｃｅｌｌ，６９，３８５−３８
７，１９９２）、小腸に特異的なアルカリ性ホスファタ
ーゼ（ヅデジャ（Dudeja）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ
ｏｌｏｇｙ、１０５、３５７−３６６、１９９３）、サ
イトクロームＰ４５０（メルキュリオ（Mercurio）ら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏ
ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２１０，Ｎｏ．２，３５０
−３５５，１９９５；マキノン（McKinnon）ら、Ｇｕ
ｔ，３６，２５９−２６７，１９９５）、細胞酸化防御
に関与する酵素（Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスム
ターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラー
ゼ；アルベース（Albers）ら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，
１０９，５０７−５１３，１９９１）、および／または
親電子物質の無毒化（グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼおよびキノンリダクターゼ；チェネビックス−ト
レンチ（Chenevix-Trench ）ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ，１６，Ｎｏ．７，１６５５−１６５７，１９
９５）、およびビメンチン（リチャード（Richard ）
ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，２８２，５
１２−５１５，１９９０）のような、主に上皮細胞中に
存在する化合物または構造の発現において異なる。
【０００４】さらに、ヒト腸管の上皮細胞はインビトロ
で乳酸菌に粘着することができる（バーネット（Berne
t）ら、Ｇｕｔ，３５，４８３−４８９，１９９４；Ｕ
Ｓ ５，０３２，３９９）。
【０００５】最後に、ヒト大腸の上皮細胞はまた、例え
ば、表面絨毛組織（フリードリッヒ（Friedrich ）ら、
Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１２，Ｎｏ．９，４０３−４０
８，１９９０）、ショ糖イソマルターゼ（ギブソン（Gi
bson）ら、Ｇｕｔ，３５，７９１−７９７，１９９４；
ポール（Paul）ら、Ａｍ．Ｐｙｓｉｏ．Ｓｏｃ．，Ｃ２
６６−Ｃ２７８，１９９３）、いくつかのクラスII主要
組織適合抗原（ＭＨＣクラスII抗原）（メイアー（Maye
r ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１００，
３−１２，１９９１）、およびジペプチジルペプチダー
ゼIV（ＤＰＰIV；ハウリ（Hauri ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，１０１，８３６−８５１，１９８５）のよ
うな、ヒト腸管の上皮細胞に主に存在する化合物または
構造の発現において、他のヒト上皮細胞とは異なる。
【０００６】ヒト大腸の上皮細胞株の調製は、ヒト腫瘍
細胞の選択により行われる。例えば、スタウファー（St
auffer）らは、ｐ５３突然変異を有し、特に腫瘍抗原Ｃ
ＥＡを発現する２つの株ＮＣＭ３５６とＮＣＭ４２５の
選択を記載している（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕ
ｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｅｒｙ，１６９，１９０−１９
６（１９９５））。これらの細胞は、腫瘍化（tumorige
nic transformation）段階であり、上皮細胞の腫瘍化の
発生の研究にとって興味深い。
【０００７】ヒト大腸癌から単離される他のヒト大腸上
皮細胞株も公知であり、例えば、ＣａＣＯ−２株（ＡＴ
ＣＣ ＨＴＢ３７；フォー（Fogh）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５８，２０９−２１４，１
９７７）およびＨＴ２９株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３８；フ
ォー（Fogh）ら、Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ Ｃｅｌｌ
ｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１４５−１５９，１９７５）が
ある。
【０００８】正常細胞を不死化すること、すなわち無限
に増殖できるようにすることもできる。正常細胞は、１
０継代以上は生存しない。そのため、細胞のトランスフ
ェクション法では、特別に適応させたベクター、例えば
ラージＴ抗原（アール・ディー・ベリー（R.D. Berry）
ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７，２８７−２８９，
１９８８）の配列よりなるＳＶ４０ベクター、またはヒ
トパピローマウイルス（ＵＳ ５，３７６，５４２）の
ＤＮＡ配列よりなるベクターの助けを借りる方法が一般
的に使用される。
【０００９】サンダーソン（Sanderson ）らは、胎児の
小腸の正常細胞を不死化した（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌ
ｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７，３９６−３９
７，１９９５）。しかし、これらの細胞はまだ、生理学
的に正常の成人細胞とは異なる。
【００１０】現在まで、成人大腸の正常上皮細胞の不死
化は報告されていない。不死化技術は知られていても、
ヒト細胞を不死化して、腫瘍化の兆候を示さずに元々の
性質を保存する最適条件を見つけることは非常に困難で
ある。
【００１１】不死化細胞を増殖させる条件の１つは、特
定の培地でのそれらの増殖である。文献に記載されてい
る培地は、それぞれのタイプの細胞に特異的であり、他
のタイプの細胞には簡単に応用できない。例えば、ギブ
ソン（Gibson）ら（Ｇｕｔ，３５，７９１−７９７，１
９９１）、ファイファー（Pfeifer ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５１２３−
５１２７，１９９３）、およびクルカニ（Kulkani ）ら
（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，Ｎｏ．１０，
２５１５−２５２１，１９９５）に記載された無血清培
地を挙げることができる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
大腸の正常上皮細胞に遺伝的かつ生理学的に関連する新
規のヒト大腸上皮細胞株を、両者を区別することが困難
な程度まで、提供することである。特にこれらの細胞株
は、腫瘍マーカーを発現しない。これらの細胞株はさら
に、ヒト大腸の正常の上皮細胞に存在する多くの特異的
なマーカーを発現する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明は、腫瘍マーカーを発現せず、非不死化ヒト上皮細胞
に特異的な代謝マーカー、およびヒトの大腸の非不死化
上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーを発現し、インビ
トロで乳酸菌ＣＮＣＭ−１２２５株に粘着することがで
きる、ヒト上皮大腸不死化細胞株に関する。
【００１４】本発明の目的はまた、例えばヒト大腸の上
皮細胞の培養物と不死化に適応させた無血清培地であ
る。この培地は、例えば無機塩、グルコース、ピルビン
酸ナトリウム、アミノ酸、ＢＳＡ、ホスホリルエタノー
ルアミン、エタノールアミン、ビタミン、およびホルモ
ンのような、動物細胞の培養に使用される無血清培地に
通常見いだされる成分を含む。この培地は、さらに微量
元素、ビタミンＣとレチノイン酸よりなるビタミン、ト
リヨードチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾ
ン、ウシ下垂体抽出物、インスリン、上皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）およびトランスフェリンよりなるホルモンのいく
つかの新規の組合せを含む。
【００１５】本発明の別の面は、ヒト大腸の上皮細胞の
新規な不死化方法であって、ヒト大腸から得られる初代
上皮細胞の培養物を調製し、培養物を組換えウイルスで
感染させ、不死化細胞を前記した無血清培地で培養する
上記方法に関する。
【００１６】本発明の別の面は、腸管細胞の代謝に及ぼ
す物質の突然変異誘発性、毒性または有効性を確認する
方法であって、（１）腸管細胞の代謝に対して突然変異
誘発性、毒性または有効性を有することが疑われる物質
を、前記細胞株を有する培養物と反応、培養または接触
させ、そして（２）該細胞株に対するこの物質の作用を
定量または測定する上記方法に関する。
【００１７】本発明はまた、前記のヒト大腸の不死化上
皮細胞、前記の培地、および突然変異誘発性、毒性また
は有効性物質の代謝応答を測定するための試薬を含んで
なる、診断キットに関する。
【００１８】最後に本発明の目的はまた、腸管細胞の代
謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有する
物質の同定方法における、前記細胞株の使用、および活
性薬剤としてのその細胞株の使用である。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明において、「正常細胞」、
「初代細胞」または「非不死化細胞」という表現は、有
害な生理学的または遺伝学的欠陥のない健常成人の大腸
から集めることができ、かつ元々の分化特性を失わず限
定された時間培養することができる、ヒト大腸の上皮細
胞を意味する。
【００２０】一方、「不死化細胞」という表現は、無限
に（例えば、６０継代以上）増殖することができるよう
に、ＤＮＡ構築体により遺伝子操作を受けた細胞を意味
する。すなわち、スタウファー（Stauffer）らにより選
択された腫瘍細胞、またはＣａＣＯ−２株およびＨＴ２
９株は、本発明により不死化された細胞と考えられる。
【００２１】同様に、「継代」という用語は、細胞株の
コンフルエントな培養物の一定分割量を取り、新鮮な培
地に接種し、そしてコンフルエンスすなわち飽和が得ら
れるまで、その細胞株を培養することよりなる方法を意
味する。すなわち、細胞株は伝統的に、新鮮な培地中で
連続的に継代して培養される。数回継代すると元々の分
化特性を失うこともあることに注意すべきである。従っ
て、何回継代しても（好ましくは少なくとも６０継代）
その特性を保存している細胞株を得ることは非常に有益
である。
【００２２】最後に、「元々の分化特性」という表現
は、ヒト上皮細胞上に特異的に見いだされるマーカー、
およびヒト大腸上皮細胞上に特異的に見いだされる分化
マーカーの両方を意味する。
【００２３】本発明のヒト上皮大腸不死化細胞株は腫瘍
マーカーを発現せず、すなわち発癌性突然変異を有さな
いかもしくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を発現
せず、または癌細胞への細胞の形質転換に特徴的な分化
した細胞構造および／もしくはタンパク質を有さない。
これらのマーカーの存在は、例えば放射標識プローブを
用いるハイブリダイゼーションまたはｍＲＮＡのＲＴ−
ＰＣＲにより検出される。細胞中のマーカーの存在は、
その細胞が、免疫防御のないマウスに対して、数ヶ月後
癌を引き起こすことができることを意味せず、それらの
元々の細胞と比較した細胞の腫瘍化を反映している。
【００２４】好ましくは本発明の細胞株は、ｐ５３突然
変異（ラビガー（Lavigeur）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，９，３９８２−３９９１，１９８９；ドネハ
ウアー（Donehower ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３５６，２１
５−２２１，１９９２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ；スタ
ウファー（Stauffer）ら）、および／またはＡＰＣ遺伝
子の突然変異（腺腫様結腸ポリープ症；ハーゲスト（Ha
rgest ）ら、Ｇｕｔ，３７，８２６−８２９，１９９
５）を有さない。
【００２５】一方本発明の上皮細胞株は、正常ヒト上皮
細胞に特異的な代謝マーカーを発現する。これらのマー
カーは、例えば皮膚、目、腸管、または肝臓から得るこ
とができるヒト上皮細胞の大部分にのみ一般的に見いだ
される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク
質、および／または分化した細胞構造でもよい。従って
本発明のヒト上皮細胞は、異なる型の上皮細胞に見いだ
される少なくとも２つのマーカーを発現する。好ましく
は本発明の細胞は、少なくともサイトケラチン、細胞間
の結合組織（タイトジャンクション（"tight junction
s" ）とも呼ぶ）、小腸アルカリ性ホスファターゼ、サ
イトクロームＰ４５０、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）、キノンリダクターゼ（ＱＲ）、Ｃ
ｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰ）およびカタラー
ゼ（ＣＡ）から形成される群から選択される上記マーカ
ーを発現する。
【００２６】従って本発明の細胞株は、細胞酸化に関与
する酵素（ＳＯＤ、ＧＰおよびＣＡ）、および／または
親電子物質の無毒化に関与する酵素（ＧＳＴおよびＱ
Ｒ）を発現する。従ってこれらの細胞株は、ヒト大腸の
粘膜の炎症または過敏性の現象の研究に特に適してい
る。
【００２７】本発明の細胞株はまた、ヒト大腸の非不死
化上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーも発現する。こ
れらのマーカーは、大腸の上皮細胞にのみ見いだされる
ｍＲＮＡ、タンパク質または分化した細胞構造でもよ
い。好ましくは本発明の細胞株は、代謝分化マーカーと
して、表面絨毛組織、ショ糖イソマルターゼ、大腸上皮
細胞に特異的なＭＨＣクラスII抗原、およびジペプチジ
ルペプチダーゼIVから形成される群から選択される少な
くとも２つのマーカーを発現する。
【００２８】同様に、本発明の細胞株は好ましくは、ヒ
トガンマ−インターフェロンの存在下で、ＭＨＣクラス
II抗原のＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰ抗原を発現す
るが、ＨＬＡ−ＤＱ抗原を発現しない（ＨＬＡ−ＤＱの
発現は腫瘍形成性と関連付けられている）。
【００２９】本発明の細胞株はまた、インビトロでラク
トバシラス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii
）ＣＮＣＭ−１２２５株に粘着することができる。こ
のために、乳酸菌の培養物は、本発明の細胞株のコンフ
ルエントな培養物上に広げ、コンフルエントな培養物を
洗浄し、次にこの細胞株の絨毛組織に粘着している細菌
の数を数えなければならない。好ましくは本発明の細胞
株は、本発明の１００個の大腸細胞当たり少なくとも８
０個の細菌の割合でインビトロで乳酸菌ＣＮＣＭ−１２
２５株に粘着することができる（特に８０〜２００）。
【００３０】本発明の細胞株はまた、クロストリジウム
・ディフィシル（Clostridium difficile ）にインビト
ロで粘着し、および／または他の粘着性乳酸菌、例えば
ビフィドバクテリア（bifidobacteria）、特にパスツー
ル研究所（Pasteur Institute ）（パリ、フランス）に
寄託され、それぞれ寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１２２６、
ＣＮＣＭ Ｉ−１２２７、およびＣＮＣＭ Ｉ−１２２
８を受けている、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏ
ｂ．，５９，４１２１−４１２８，１９９３およびＥＰ
５７７９０４（ネッスル（Nestle））に記載のビフィド
バクテリア（bifidobacteria）に粘着することができ
る。
【００３１】本発明の細胞株はまた、炎症物質に接触し
た後、多くのサイトカイン（例えば、サイトカインＩＬ
−１β、ＩＬ−１Ｒａ、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ
−８）を発現することができる。
【００３２】本発明はまた、特に１９９６年４月１６日
にドイツ微生物および培養物寄託機関（Deutsche Samml
ung Von Mikroorganismen und Zellkulturen）（マシェ
ローダー・ヴェーグ（Mascheroder Weg ）１ｂ、Ｄ−３
８１２４、ブラウンシュバイク（Braunschweig）、ドイ
ツ）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８を受
けている本発明の不死化細胞株に関する。
【００３３】本発明のヒト大腸上皮細胞株は、繰り返し
（特に、少なくとも４０〜８０回）継代した後も元々の
分化特性を有効に保存している。しかし、４０回継代し
た後は、またはそれ以前でも、染色体の断片の喪失のた
めに細胞株の核型が変化することがあることに注意すべ
きである。しかし、これらの細胞株は一般的に、同じ完
全なセットの各染色体対を保存し、これにより元々の分
化特性の発現が保存される。
【００３４】本発明の別の面は、本発明のヒト大腸の上
皮細胞の培養物および不死化に適応させた無血清培地に
関する。培地は特に、繰り返し継代しても無限に本発明
の元々の分化特性を維持するように適応される。他の培
地を使用すると、本発明の細胞株は、数回の連続した継
代（例えば、５〜１０回の継代）後にその元々の分化特
性を喪失するかも知れない。この培地はまた、本発明の
細胞株を継続して不死化するのに必須である。従ってそ
の特徴的構成成分の１つが抑制されると、一般的に本発
明の大腸の上皮細胞の不死化が失われる。
【００３５】この培地は、通常無血清の動物細胞培養培
地に存在する成分、すなわち無機塩、グルコース、緩衝
液（ヘペス、例えば：バイオフルーイッズ（Biofluids
））、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ＢＳＡ、ホ
スホリルエタノールアミン、エタノールアミン、ビタミ
ン、およびホルモンを含有してもよい。ＤＭＥＭ培地
（バイオフルーイッズ社（Biofluids Inc.）、米国）の
ような市販の培地は、この培地の調製のためのベースに
することができる。
【００３６】本発明の培地の新規性は、その成分のいく
つかの新しい組合せであり、通常必要とされる他の化合
物は当業者に公知の範囲内で変化し得る。これらの必須
成分は、微量元素、ビタミンＣとレチノイン酸よりなる
ビタミン、ならびにトリヨードチロニン、デキサメタゾ
ン、ハイドロコーチゾン、ウシ下垂体抽出物、インスリ
ン、ＥＧＦおよびトランスフェリンよりなるホルモンで
ある。
【００３７】すなわちこの培地は、１〜１００nMの微量
元素、１０〜１０００nMのレチノイン酸、１０〜１００
０nMのトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．１〜５０nMの
デキサメタゾン、１〜１００nMのハイドロコーチゾン、
１〜１００μg/mlのビタミンＣ、１〜１００μg/mlのウ
シ下垂体抽出物、０．１〜５０μg/mlのインスリン、
０．１〜５０ng/ml のＥＧＦおよび０．１〜１００μg/
mlのトランスフェリンを含んでよい。
【００３８】微量元素は、例えばセレン、マンガン、ケ
イ酸塩、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、お
よびこれらの塩により形成される群から選択される化合
物が選択される。
【００３９】培地に通常含有される無機塩のうち、塩素
酸ナトリウム、塩素酸カリウム、硫酸カリウム、塩素酸
カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、重炭酸ナトリウ
ム、亜硝酸第二鉄、メタバナジン酸アンモニウム、モリ
ブデン酸アンモニウム、硫酸第二銅、塩素酸マグネシウ
ム、塩素酸マンガン、硫酸ニッケル、酢酸ナトリウム、
ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ケイ酸
ナトリウム、塩素酸スズ、および硫酸亜鉛から形成され
る群からの塩が選択される。
【００４０】特に培地は、混入する繊維芽細胞の成長を
阻害するために８０μＭ未満のカルシウムを含有するよ
うに注意すべきである。しかし、カルシウム濃度は１mM
まで上げることができ、これはいくつかの実験では必要
であった（ジャンクションタンパク質の分極と発現）。
数回の継代後は、それ以上繊維芽細胞を増殖させる危険
はなく、これは初代細胞の処理による初期混入物質であ
るかも知れない。
【００４１】同様に、培地に通常含有される他のビタミ
ンは、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩素酸コ
リン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキ
シン、リボフラビン、チアミン、ビオチンおよびシアノ
コバラミンから形成される群から選択される他のビタミ
ンが選択される。
【００４２】最後に、本発明の細胞株を継続して得るこ
とを可能にする培地は、好ましくは下記の表１に記載の
組成物Ｂ５０を有する。
【００４３】本発明の別の面は、ヒト大腸の上皮細胞の
不死化方法であり、ここでヒト大腸から得られる初代上
皮細胞の培養物を調製し、その培養物を組換えウイルス
で感染させ、不死化細胞を前記の無血清培地中で培養す
る。
【００４４】その前に、好ましくは以下の工程が使用さ
れる： （１）ヒト大腸の上皮組織の試料を得る； （２）この試料を、インビトロで培養するために調製す
る； （３）上皮細胞を無血清培地に接種し、細胞の付着とそ
の増殖を促進するコーティングを有する培養プレートに
接種する； （４）コンフルエントな増殖を最適化するために、培地
を必要に応じてできるだけ頻繁に交換する； （５）細胞に組換えウイルスを感染させる； （６）そして、不死化細胞を、前記の無血清培地で培養
する。
【００４５】さらに詳細には、工程１）は、腸管の手術
時の健常人からの大腸細胞試料の入手に関する。工程
２）において、試料を培地で洗浄し、小片に切り、物理
的および／または化学的手段により上皮部分を他の組織
から分離する。例えば、組織の小片を、０．５％トリプ
シンと０．１％ＥＤＴＡを含有する溶液に、細胞の分離
を達成するのに充分な時間入れ、次にトリプシンインヒ
ビターを数分間加え、最後に培地（好ましくは、前記の
培地）を加える。
【００４６】工程３）では、上皮細胞を、プレートの無
血清培地、好ましくは前記の無血清培地に接種する。培
養プレートは好ましくは、フィブロネクチン、ＢＳＡお
よびＩ型コラーゲン（レクナー（Lechner ）ら、Ｊ．Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９，４３−４８，
１９８５）よりなるコーティングを有する。
【００４７】工程４）では、上皮細胞を含有する培地
を、コンフルエントな増殖を最適化するために必要に応
じてできるだけ頻繁に交換する。好ましくは培地を１日
置きに交換する。利用可能な表面積の９０％のオーダー
のコンフルエンスに達した後（これは、通常接種後１０
日目に起きる）、細胞をトリプシンとＥＤＴＡの溶液で
処理して分離する。
【００４８】分離した細胞を工程５）で、好ましくは前
記のコーティングを有する培養プレートの、例えば前記
の感染培地に移す。次に細胞を組換えウイルスを用いて
従来法に従って感染させる。当業者は非常に多くのトラ
ンスフェクション法を利用できる。例えば、ＷＯ９６／
０７７５０、クラウディア・チェン（Claudia Chen）ら
（Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２７４
５−２７５２，１９８７）、またはウィルソン（Wilso
n）ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，２２６，２１２−２２０，１９９５）に記載の方
法がある。
【００４９】好ましくは、Ｔ抗原（Ｔ−Ａｇ）、不活性
化ウイルス複製開始点（ＭｕＬＶレトロウイルス）、お
よび選択可能な遺伝子を含有する組換えＳＶ４０ウイル
スが使用される。例えば、図１に記載の構築体が使用さ
れ、その配列はジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）デー
タベースから入手できる（受け入れ番号Ｍ６４７５３
号；ストックシュレーダー（Stockshlaeder ）ら、Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２，３３−３９，１
９９１）。他の適当なベクターは、例えば、Ｔ−Ａｇを
コードする遺伝子、選択可能な遺伝子および／またはヒ
ト複製開始点を含む市販のベクターから、当業者は容易
に作製可能であろう。例えば、Ｔ−Ａｇをコードする遺
伝子を含有するプラスミドＡＴＣＣ３７４６０およびＡ
ＴＣＣ３７６４０がある。
【００５０】工程６）では、上皮細胞を好ましくは前記
のコーティングを含む培養プレートの新鮮な増殖培地に
移す。
【００５１】本発明の上皮細胞株の元々の性質を知る
と、免疫学的、薬学的および毒性研究において、その応
用が予想できる。
【００５２】すなわち、本発明の細胞株は、例えば
（１）腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性ま
たは有効性を有することが疑われる物質を、本発明の細
胞株を有する培養物と反応、培養または接触させ、そし
て（２）細胞株に対する物質の作用を定量または測定す
る方法における、腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変
異誘発性、毒性または有効性をスクリーニングするのに
特に適している。
【００５３】従って、本発明の上皮細胞、本発明の培
地、および突然変異誘発性、毒性または有効性物質の代
謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キット
の調製も予想される。
【００５４】本発明の細胞株はまた、組換えタンパク質
の発現に適する。外来ＤＮＡのトランスフェクション法
は、現在当業者に公知である（例えば、ＷＯ９４／０５
４７２を参照）。
【００５５】本発明の細胞株はまた、体外（ex vivo ）
での遺伝子治療に有用な可能性がある。これらの細胞株
は、治療的応用を目的とする遺伝子を発現する組換え細
胞の成長のための適切な手段である。本発明の細胞株に
より提供される１つの利点は、これらは動物の血清に接
触されないため、ウイルスまたは他の病原体により汚染
される危険性を大きく低下させる。
【００５６】本発明の細胞株の調製の実施例に関して、
以下の追加の記載により、本発明をさらに詳細に説明す
る。これらの実施例は、まず使用される培地を記載し、
次に比較例を示す。しかしこれらの例は例示目的であっ
て、本発明を限定するものではない。細胞株、ＳＶ４０
の調製、トランスフェクションおよびマーカーの発現の
解析は、他に特に記載しない場合は、サムブルーク（Sa
mbrook）らのマニュアル（分子クローニング：実験室マ
ニュアル（Molecular Cloning: A LaboratoryManua
l）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）、
米国、１９８９）に従って行われる。記載したパーセン
トは、他に特に記載しない場合は、重量％である。
【００５７】
【表１】培地 ： 表１ ───────────────────────────────── 成分 培地Ａ５０ 培地Ｂ５０ ───────────────────────────────── 無機塩 ＮａＣｌ 6.400 g/l 6.400 g/l ＫＣｌ 0.400 g/l 0.400 g/l ＭｇＳＯ4 −７Ｈ2 Ｏ 0.200 g/l 0.200 g/l ＣａＣｌ2 0.200 g/l 0.200 g/l ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｈ2 Ｏ 0.13 g/l 0.13 g/l ＮａＨＣＯ3 3.7 g/l 3.7 g/l Ｆｅ（ＮＯ3 ）2 −９Ｈ2 Ｏ 0.0001g/l 0.0001g/l 他の成分 グルコース 4.50 g/l 4.50 g/l ヘペス 20 mM 20 mM フェノールレッド 0.010 g/l 0.010 g/l ピルビン酸ナトリウム 0.110 g/l 0.110 g/l ＢＳＡ 0.3 % 0.3 % ＰＥ 0.5 μM 0.5μM アミノ酸 Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ 0.0840g/l 0.0840g/l Ｌ−シスチン 0.0480g/l 0.0480g/l Ｌ−グルタミン --- 2 mM グリシン 0.0300g/l 0.0300g/l Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2 Ｏ 0.0420g/l 0.0420g/l Ｌ−イソロイシン 0.1048g/l 0.1048g/l Ｌ−ロイシン 0.1048g/l 0.1048g/l Ｌ−リジン−ＨＣｌ 0.1462g/l 0.1462g/l Ｌ−メチオニン 0.0300g/l 0.0300g/l Ｌ−フェニルアラニン 0.0660g/l 0.0660g/l Ｌ−セリン 0.0420g/l 0.0420g/l Ｌ−スレオニン 0.0952g/l 0.0952g/l Ｌ−トリプトファン 0.0160g/l 0.0160g/l Ｌ−チロシン 0.0720g/l 0.0720g/l Ｌ−バリン 0.0936g/l 0.0936g/l ビタミン Ｄ−カルシウム−パントテン酸 0.004 g/l 0.004 g/l 塩化コリン 0.004 g/l 0.004 g/l 葉酸 0.004 g/l 0.004 g/l イノシトール 0.008 g/l 0.008 g/l ニコチンアミド 0.004 g/l 0.004 g/l ピリドキシン−ＨＣｌ 0.004 g/l 0.004 g/l リボフラビン 0.0004g/l 0.0004g/l チアミン−ＨＣｌ 0.004 g/l 0.004 g/l ビタミンＣ --- 0.030 g/l レチノイン酸 10 nM 100 nM 微量元素 --- 10 nM ホルモン インスリン 0.005 g/l 0.005 g/l ＥＧＦ 1 ng/ml 1 ng/ml トランスフェリン 0.005 g/l 0.005 g/l Ｔ３ --- 100 nM デキサメタゾン --- 1 nM ハイドロコーチゾン --- 10 nM ウシ下垂体抽出物 --- 0.038 g/l 抗菌剤 ファンジゾン（Fungizone ） 0.25 μg/ml 0.25 μg/ml ペニシリン 2.5 U/ml 2.5 U/ml ストレプトマイシン 5 μg/ml 5 μg/ml ゲンタマイシン 10μg/ml 10μg/ml ─────────────────────────────────── （ＰＥ：ホスホリルエタノールアミンとエタノールアミンの混合物）
【００５８】比較例 ストックシュレーダー（Stockshlaeder ）らにより記載
され、Ｔ抗原をコードする遺伝子、プサイ遺伝子、選択
マーカーヒスチジノール脱水素酵素（ＨＳＤ）、および
ＬＴＲプロモーターを含んでなる、ベクターｐＬＸＳＨ
Ｄ＋ＳＶ４０＋（ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）、
受け入れ番号Ｍ６４７５３号；ストックシュレーダー
（Stockshlaeder ）ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ
ａｐｙ，２，３３−３９）（図１に示す）を使用する。
【００５９】ＳＶ４０ウイルスは、リンチとミラー（Ly
nch and Miller）の方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，３
８８７−３８９０，１９９１）に従って調製した。この
ために、外生（ecotropic ）細胞株Ｐｓｉ２（マン（Ma
nn）ら、Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９，１９８
３）、および両性栄養性細胞株ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ９０７８）を、１０％胎児牛血清含有ＤＭＥＭ培
地（ダルベッコー（Dulbecco）、米国）中で、３７℃で
５％ＣＯ2 含有空気中で培養した。これらの細胞株は、
２５０mMのＣａＣｌ2 と１０μｇのベクターｐＬＸＳＨ
Ｄ＋ＳＶ４０＋を用いて常法に従って別々にトランスフ
ェクションし、４８時間インキュベート後トリプシンで
処理し、等量混合し、そして全体を３７℃で５％ＣＯ2
含有空気中でインキュベートした。７０％のコンフルエ
ンスになるまで増殖させた後、ウイルスをＰＣ−１（ベ
ントレックス（Ventrex ）、米国）で集めた。ろ過後
（０．４５μｍ、ミクロポア（Micropore ））、ウイル
スの量をＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
８）で測定した。
【００６０】Ｓ状結腸憩室の出現のため、６９才の高齢
女性から生検により大腸の初代細胞を得た。試料をＤＭ
ＥＭ培地で洗浄し、小片に切り、上皮部分を他の組織か
ら分離し、プレート上の上皮細胞をＤＭＥＭ培地に接種
した。培養プレートを、５mgのヒトフィブロネクチン
（シグマ（Sigma ））、５mlのビトロゲン（Vitrogen）
１００（コラーゲン社（Collagen Corp.）、パロアルト
（Palo Alto ）、カリホルニア州、米国）、５０mlの
０．１％ＢＳＡ（バイオフルーイッズ（Biofluid
s））、および残りのＤＭＥＭ培地を含有する５００ml
の溶液でプレインキュベートした。コンフルエントな増
殖を最適化するために、上皮細胞を含有する培地を必要
に応じて頻回に交換した。
【００６１】１週間の培養後９０％のオーダーのコンフ
ルエンスに達した後、細胞を常法によりトリプシンとＥ
ＤＴＡの溶液で処理して分離する。分離した細胞を、前
記のコーティングを有する培養プレートに移し、前記の
Ａ５０培地に移した。
【００６２】次に培養物を、前述のように調製したＴ抗
原（Ｔ−Ａｇ）を含有する８μg/mlのポリブレン（poly
brene ）と高力価のＳＶ４０ウイルス（１０5 〜１０7
ＣＦＵ）の存在下で感染させた。２時間インキュベート
した後、培養物をＰＢＳで洗浄し、Ａ５０新鮮培地を加
えた。
【００６３】残念ながら細胞は以後、増殖がゆっくりし
過ぎて、ヒト大腸の上皮細胞に匹敵する増殖を示すクロ
ーンを選択することができなかった。
【００６４】実施例１ Ａ５０培地の代わりに表１に示したＢ５０培地を使用し
た以外はまったく同様にして、ヒト大腸の上皮細胞を、
前記比較例に示したように感染させた。
【００６５】ウイルスで２時間インキュベートした後、
培地をＰＢＳで洗浄し、新鮮なＢ５０培地を加え、各継
代でヘペス緩衝液（バイオフルーイッズ（Biofluids
））中の０．０２％トリプシン、１％ポリビニルピロ
リドンおよび０．０２％エチレングリコール溶液中で処
理して細胞を分離するように注意して、新鮮なＢ５０培
地で連続的に継代して培養した。
【００６６】培養プレート上で成長する細胞コロニーの
サイズを観察することにより、成長の早いものを選択し
た。こうして、６つのヒト上皮大腸不死化細胞株を選択
することができ、このうち１つを１９９６年４月１６日
にドイツ微生物および培養物寄託機関（Deutsche Samml
ung Von Mikroorganismen und Zellkulturen）（ＤＳ
Ｍ）（マシェローダー・ヴェーグ（Mascheroder Weg ）
１ｂ、Ｄ−３８１２４、ブラウンシュバイク（Braunsch
weig）、ドイツ）に寄託し、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２
２５８を受けた。
【００６７】１．ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株の核型の解
析 ４０継代目に採取したＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株の４つ
の核型を調製する（マニュアル「ヒトの細胞遺伝学、ル
ーニイ，ディー・イー（Rooney DE ）、チェプルコウス
キー，ビー・エィチ（Czepulkowski BH ）編、アイラー
ルエルプレス（IRL Press ）、オックスフォード、１９
８６」に記載の方法、参考のため本明細書に引用され
る）。結果は、６つの異なる染色体が失われたかまたは
傷害を受けたことを示す。従ってこの細胞株は、各対の
染色体の１つの染色体をそのゲノム中に完全に保存す
る。細胞株の性はＸＯ／ＸＸである。１セットの染色体
の喪失は、この細胞株の腫瘍化を示すものではないこと
に注意すべきである。
【００６８】２．ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株の腫瘍形成
性 ４６継代目に採取した１０7 個のＤＳＭ ＡＣＣ２２５
８株を、スタウファー（Stauffer）ら（前述）の記載し
た方法に従って、免疫防御能力のない（「ヌード」）マ
ウスに注入する。８ヶ月以上たっても腫瘍の形成は見ら
れない。この細胞株の非腫瘍形成性は、この細胞株の非
腫瘍化を示すものではない。例えば、スタウファー（St
auffer）らが記載したＮＭＣ４５６株は、ヌードマウス
中で腫瘍を誘導しないが、腫瘍化に特徴的な腫瘍マーカ
ーを発現する。
【００６９】３．ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株での腫瘍マ
ーカーの発現 スタウファー（Stauffer）らの方法に従って、ＤＳＭ
ＡＣＣ２２５８株が以下の腫瘍マーカーを発現するか否
かを測定する：ｐ−５３突然変異、癌胎児性抗原（ＣＥ
Ａ）および腺腫様結腸ポリープ症（ＡＰＣ）遺伝子。
【００７０】結果はすべてのこれらのマーカーについて
陰性であり、これはこの細胞株の非腫瘍化の状態を示
す。
【００７１】４．ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株のウイルス
汚染 ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＳ
Ｖ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および後天性免疫不
全症ウイルス（ＨＩＶ−１）により汚染されているか否
かを測定する。
【００７２】ＨＢＶの解析のために、フェノールとクロ
ロホルム溶液で処理して、次にエタノールで沈殿させ
て、約２×１０6 個の細胞からＤＮＡを抽出する。次に
ＤＮＡ試料について、ウイルスのプレ−コア領域（リン
チ（Lynch ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，３８８７−
３８９０）に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅を
行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化
エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。比較のため
に、１０〜１０5 個のＨＢＶ（アナワ・バイオメディカ
ル・サービシーズ・６・プロダクト（Anawa Biomedical
Services 6 Product ）、米国）を含有する血清の希釈
物を、平行して同じ方法で解析する。
【００７３】ＨＩＶ−１の解析のために、前述のＤＮＡ
試料について、ウイルスのＧＡＧ領域に特異的なプライ
マーを用いてＰＣＲ増殖を行う。次に増幅生成物をアガ
ロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線
で可視化する。比較のために、１０〜１０5 個のＨＩＶ
−１（アナワ・バイオメディカル・サービシーズ・６・
プロダクト（Anawa Biomedical Services 6 Product
）、米国）を含有する血清の希釈物を、平行して同じ
方法で解析する。
【００７４】ＨＣＶの解析のために、コムクジンスキー
（Chomczynski ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１
６２，１５６−１５９，１９８７）の方法により、約２
×１０6 個の細胞からＲＮＡを抽出する。常法に従って
逆転写を行い、得られた相補的ＤＮＡについて、ウイル
スの非コード５’領域に特異的なプライマーを用いてＰ
ＣＲ増殖を行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分
離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。
比較のために、１０〜１０5 個のＨＣＶ（アナワ・バイ
オメディカル・サービシーズ・６・プロダクト（Anawa
Biomedical Services 6 Product ）、米国）を含有する
血清の希釈物を、平行して同じ方法で解析する。
【００７５】結果は３つのウイルスの存在は陰性であ
る。
【００７６】５．ヒト上皮細胞に特異的なマーカーの発
現
【００７７】５．ａ．サイトケラチン：ＤＳＭ ＡＣＣ
２２５８株の培養物の細胞を、１００％冷メタノール溶
液によりガラスプレートに付着させ、次にプレートを、
０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．６）、１．８％ＮａＣｌお
よび０．２％ポリエチレングリコール２０００を含有す
る緩衝液（ＴＮＰ緩衝液）で洗浄する。次に細胞を、サ
イトケラチンに特異的なマウス抗体（抗−ＣＨペプチド
４、７、８、１３、１４、１７、１８、１９、２０、シ
グマ（Sigma ）、米国）の存在下で３０分インキュベー
トする。０．５％ＢＳＡ含有ＴＮＰ緩衝液で３回洗浄し
た後、免疫蛍光化合物を含むヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体
（１：３００、ＦＩＴＣヤギ抗−マウスＩｇＧ；ビオシ
ス（Biosys））でプレートを３０分インキュベートす
る。前記緩衝液で３回洗浄した後、プレートを固定し、
蛍光顕微鏡で解析する。すべての細胞はサイトケラチン
７、８、および１７について陽性である。
【００７８】５．ｂ．ビメンチン：サイトケラチンの解
析と同じ方法で、前記の固定細胞について、マウス抗−
ビメンチン抗体（ダコ（ＤＡＫＯ）、米国）に反応さ
せ、次に前記ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応させる。蛍
光顕微鏡により、すべての細胞はビメンチンについて陽
性である。
【００７９】５．ｃ．細胞間の結合組織（タイトジャン
クション）：ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株の細胞をコンフ
ルエンスになるまでガラスプレートで培養し、０．１Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中２．５％のグルタルア
ルデヒド溶液で室温で１時間処理して固定する。同じリ
ン酸緩衝液で２回洗浄後、細胞を再び同じ緩衝液中２％
のＯｓＯ4 溶液で固定する。次に細胞を、３０、５０、
７０、９０および１００％のエタノール（ポラロン・エ
クイップメント社（Polaron Equipment Ltd.）、ワット
フォード（Watford ）、英国）で連続的に脱水し、次に
細胞を細かい金の層から回収する（ＳＥＭコーティング
ユニットＥ５１００、ポラロン（Polaron））。次に細
胞を電子顕微鏡（フィリップス５０５ＳＥＭ）により観
察する。この解析は、細胞が上皮細胞に特徴的な細胞間
結合組織を有することを示す。
【００８０】５．ｄ．アルカリ性ホスファターゼ：ＤＳ
Ｍ ＡＣＣ２２５８株の細胞のアルカリ性ホスファター
ゼ活性を、ダールキスト（Dahlquist ）ら（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，９９−
１０７，１９６８）の方法を再現するシグマ（Sigma ）
の市販キットを用いて測定する。図２に示す結果は、Ｄ
ＳＭ ＡＣＣ２２５８株の細胞（Ｏｃ１１、Ｏｃ１２、
Ｏｃ１４）は、ヒト大腸上皮癌細胞ＣａＣＯ−２に匹敵
するホスファターゼ活性を示すが、ヒト大腸上皮癌細胞
ＨＴ−２９より高い活性を示すことを示した。結果Ｃ、
Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｐは、実施例２に示す他のヒト大腸上皮細
胞株に関連する。
【００８１】５．ｅ．サイトクロームＰ４５０：ＤＳＭ
ＡＣＣ２２５８株の細胞によるサイトクロームの発現
を、異なるサイトクロームＰ４５０に特異的なＤＮＡプ
ライマーを用いて公知のＲＴ−ＰＣＲ法により解析す
る。これらのプライマーは、ジーンバンク（ＧｅｎｅＢ
ａｎｋ）データベースから入手できる、異なるサイトク
ロームのＤＮＡ配列から調製することが便利である（Ｃ
ＹＰ１Ａ１：受け入れ番号Ｘ０２６１２；ＣＹＰ２Ｃ：
受け入れ番号Ｍ６１８５５またはＭ６１８５８またはＭ
６１８５６またはＭ６１８５４；ＣＹＰ２Ｄ６：受け入
れ番号Ｍ３３３８８；ＣＹＰ２Ｅ１：受け入れ番号Ｊ０
２８４３；ＣＹＰ３Ａ５：受け入れ番号Ｊ０４８１３；
ＣＹＰ１Ａ２：受け入れ番号Ｚ０００３６；ＣＹＰ２Ａ
６：受け入れ番号Ｍ３３３１８；ＣＹＰ２Ｂ６：受け入
れ番号Ｍ２９８７４）。
【００８２】このために細胞をコンフルエンスになるま
で、３５mmプレート（コスター（Costar））で培養し、
ＲＮＡイージー（RNAeasy ）キット（キアゲン（Qiage
n））を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写を行い（ＲＴ−
ＰＣＲ用の１本鎖ｃＤＮＡ合成キット（1st Strand cDN
A Synthesis Kit for RT-PCR）、ベーリンガーマンハイ
ム（Boehringer-Mannheim ））、得られた相補的ＤＮＡ
を異なるサイトクロームＰ４５０に特異的なＤＮＡプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、次に増幅生成物をア
ガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外
線で可視化する。
【００８３】結果は、細胞がサイトクロームＣＹＰ１Ａ
１、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、および
ＣＹＰ３Ａ５を発現することを示す。一方、細胞は、サ
イトクロームＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６およびＣＹＰ
２Ｂ６について陰性である。サイトクロームＣＹＰ３Ａ
５の発現はまた、抗−ＣＹＰ３Ａ５ポリクローナル抗体
（オキシゲン（Oxygene ）、米国）を用いて、ＤＳＭ
ＡＣＣ２２５８細胞のタンパク質抽出物のウェスタンブ
ロット解析により確認される。
【００８４】５．ｆ．細胞性酸化と親電子物質の無毒化
に関与する酵素：ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株の細胞を培
養し、コムクジンスキー（Chomczynski ）ら（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９
８７）の方法により、ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡプローブ
を、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰ）、カタラ
ーゼ（ＣＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）、およびキノンリダクターゼ（ＱＲ）のＤＮ
Ａ配列（これらはジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）デ
ータベースから入手できる）から、ＤＮＡプローブを調
製し（ＧＳＴ：受け入れ番号Ｘ０８０５８；ＧＰ：受け
入れ番号Ｍ２１３０４；ＣＡ：受け入れ番号Ｍ８１５７
８；ＳＯＤ：受け入れ番号７２９３３６；ＱＲ：受け入
れ番号Ｍ８１５９６＿６００）、次にこれらのプローブ
でＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行い、これ
らの酵素の転写を確認する。
【００８５】結果は、すべての細胞が、ＳＯＤ、ＧＰ、
ＣＡ、ＧＳＴおよびＱＲ活性をコードする遺伝子の転写
を発現することを示す。従ってＤＳＭ ＡＣＣ２２５８
株は、細胞の酸化と親電子物質の無毒化に関与する酵素
を発現する。
【００８６】６．ヒト大腸の上皮細胞に特異的なマーカ
ーの発現
【００８７】６．ａ．表面絨毛組織：前記５．ｃ．に記
載のように、電子顕微鏡による細胞の解析は、支持体に
粘着するものとは反対の極に短い絨毛組織が存在するこ
とを明瞭に示す。
【００８８】６．ｂ．ショ糖イソマルトース：ショ糖イ
ソマルトースは、ヒト大腸の上皮細胞に特異的である。
ショ糖イソマルトースの存在は、ＤＳＭ ＡＣＣ２２５
８細胞のコンフルエントな培養物を１ng/ml のヒト組換
えＴＧＦ−β（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dic
kinson））に４８時間接触させた後、前記５．ｅ．項で
記載したようにＲＴ−ＰＣＲ法によるメッセンジャーＲ
ＮＡのレベルで証明することができる。ＤＮＡプライマ
ーは、常法に従いジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）デ
ータベースから入手できるショ糖イソマルトース遺伝子
のＤＮＡ配列（受け入れ番号Ｘ６３５９７ Ｓ４１８３
３ Ｓ４１８３６）から調製される。
【００８９】６．ｃ．ジペプチジルペプチダーゼIV：Ｄ
ＰＰIVは、ヒト大腸の上皮細胞に特異的である。その存
在は、前記５．ｅ．項で記載したようにＲＴ−ＰＣＲ法
によるメッセンジャーＲＮＡのレベルで証明することが
できる。ＤＮＡプライマーは、常法に従いジーンバンク
（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースから入手できるＤＰ
ＰIV遺伝子のＤＮＡ配列（受け入れ番号Ｕ１３７１０−
３５）から調製される。
【００９０】６．ｄ．ＭＨＣクラスII抗原：大腸の上皮
細胞は、γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の存在下
で、ＭＨＣクラスII抗原（ＨＬＡ抗原）を発現すること
ができる。このために、ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８細胞
を、Ｂ５０培地中で、１００U/mlの組換えγ−ＩＦＮ
（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim ））
の存在下で、１２、２４、３６、および４８時間培養す
る。細胞を、０．０２５％トリプシンとＥＤＴＡ（ギブ
コ・ライフ・テクノロジー（Gibco Life Technologi
e）、米国）を含む溶液により分離し、ＨＬＡ−ＤＲ、
ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ抗原に特異的な抗体
（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、米
国）の存在下でインキュベートし、フローサイトメータ
ー（ファクスキャン（FACScan ）、ベクトン・ディッキ
ンソン（Becton Dickinson））を用いて分離する。
【００９１】図３に示す結果は、１２時間の培養物から
のＨＬＡ−ＤＰ抗原の発現を示し、２４時間と４８時間
で濃度が上昇することを示す。２４時間の培養後にＨＬ
Ａ−ＤＲの発現が観察され、３６時間と４８時間に最大
濃度に達する。一方、ＨＬＡ−ＤＱ抗原は誘導されず、
これは大腸の初代上皮細胞での観察結果（メイアー（Ma
yer ）ら）を確認している。
【００９２】７．微生物への粘着
【００９３】７．ａ．細菌ＣＮＣＭ−１２２５株への粘
着：ヒトの小腸には無数の非病原性細菌が住み着いてお
り、その中に乳酸菌およびビフィドバクテリア（bifido
bacteria）があり、そのいくつかは小腸粘膜の絨毛組織
に粘着している。小腸管の上皮細胞に強く粘着すること
が知られているラクトバシラス・ジョンソニイ（Lactob
acillus johnsonii ）株ＣＮＣＭ−１２２５（ＥＰ５７
７９０４；バーネット（Bernet）ら）を、酸素の非存在
下で、１００μＣの 3Ｈアデニン（adenine ）含有ＭＲ
Ｓ培地（マン、ロゴサおよびシャープ（Man, Rogosa an
d Sharpe）、バイオカー（Biokar））中で１２時間培養
する。
【００９４】ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８細胞をコンフルエ
ンスになるまで、２週間培養し、次に前記１２時間ＭＲ
Ｓ培地、新鮮なＭＲＳ培地、または前記１２時間ＭＲＳ
培養物から得られた４×１０8 細胞/ml を含むリン酸緩
衝液（ｐＨ６．５）で、３７℃で１時間インキュベート
する。ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８細胞をＰＢＳで３回洗浄
し、１Ｍ ＮａＯＨ溶液で溶解し、次に細胞から放出さ
れる放射能強度を、シンチレーションカウンターで測定
する。
【００９５】比較のために、ＣａＣＯ−２株を前記方法
と同じ方法で培養し、ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５株でイン
キュベートし、細胞から放出される放射能強度を測定す
る。
【００９６】下記の表２に示す結果は、ＤＳＭ ＡＣＣ
２２５８細胞は、ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５細菌ならびに
ＣａＣＯ−２細胞に粘着することができることを示す。
また１２時間のＬＡ−１株の培養物は、細菌の粘着を促
進する因子を明らかに含有することがわかる。細菌を加
えた新鮮なＭＲＳ培地は、低いレベルの粘着を示す。さ
らに、インビボで小腸管で見いだされるものと類似のｐ
ＨであるｐＨ６．５は、ｐＨが５のオーダーより低い新
鮮なＭＲＳ培地で得られる粘着レベルと比較すると、細
菌の粘着を促進することがわかる。
【００９７】
【表２】 表２ ──────────────────────────────────── 細胞株 インキュベーション条件 ％ 3Ｈ−アデニン ──────────────────────────────────── DSM ACC2258 12時間ＭＲＳ 30.2 新鮮なＭＲＳ 11.8 緩衝液ｐＨ6.5 13.03 ──────────────────────────────────── CaCo-2 12時間ＭＲＳ 34.8 新鮮なＭＲＳ 6.1 緩衝液ｐＨ6.5 8.3 ────────────────────────────────────
【００９８】細菌ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５を保持するＤ
ＳＭ ＡＣＣ２２５８株の能力はまた、バーネット（Be
rnet）らの方法（Ｇｕｔ，３５，４８３−４８９，１９
９４）により測定される。簡単に説明すると、１００個
の大腸細胞に粘着する細菌の数を肉眼で測定する。この
ために、１２時間ＭＲＳ培地、または１２時間ＭＲＳ培
養物から得られた４×１０8 細胞/ml を含む新鮮なＭＲ
Ｓ培地を使用する。さらに、３つの調製物について解析
を行い、各調製物について２０枚の顕微鏡写真をランダ
ムに使用する。
【００９９】比較のために、細菌ＣＮＣＭ Ｉ−１２２
５を保持するＣａＣＯ−２細胞株の能力を、同じ方法で
測定する。
【０１００】下記の表に示す結果は、この細胞株は多く
の細菌を保持することができることを示す。また、１２
時間ＬＡ−１株の培養物は、細菌の粘着を促進する因子
を明らかに含有することを注意すべきである。細菌を加
えた新鮮なＭＲＳ培地では、このような高い粘着レベル
を得ることはできない。
【０１０１】
【表３】 表３ ──────────────────────────────── 細胞株 インキュベーション条件 数/100細胞 標準偏差 ──────────────────────────────── DSM ACC2258 12時間ＭＲＳ 118 7 新鮮なＭＲＳ 13 4 ──────────────────────────────── CaCo-2 12時間ＭＲＳ 124 13 新鮮なＭＲＳ 9 4 ────────────────────────────────
【０１０２】７．ｂ．クロストリジウム・ディフィシル
（Clostridium difficile ）および／または粘着性ビフ
ィドバクテリア（bafidobacteria）への粘着：Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｅｖｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，５９，４１２１−４
１２８，１９９３およびＥＰ５７７９０４（ネッスル
（Nestle））に記載の細菌クロストリジウム・ディフィ
シル（Clostridium difficile ）および粘着性ビフィド
バクテリア（bafidobacteria）を保持するＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２２５８株の能力も、測定する。結果は、この細胞株
は多くの数の各細菌を保持することができることを示
す。
【０１０３】８．サイトキニン発現：炎症物質の存在下
または非存在下で、ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株の細胞に
よるサイトキニンの発現を、異なるサイトキニンに特異
的なＤＮＡプライマーを用いて公知のＲＴ−ＰＣＲ法に
より測定する。これらのプライマーは常法に従い、ジー
ンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースの異なるサ
イトキニンのＤＮＡ配列（受け入れ番号：ＴＮＦα：Ｘ
０２９１０；ＩＬ−１β：Ｍ１５８４０；ＩＬ−６：Ｍ
１４５８４；ＩＬ−８：Ｍ２８１３０；ＩＬ−ｒａ：Ｍ
９７７４８）から調製される。炎症の誘導は、１mMのヒ
スタミンまたは２０ng/ml のＴＰＡとともに細胞株を２
４時間インキュベートすることにより行なった。
【０１０４】比較のために、正常の大腸組織、ＨＴ−２
９およびＣａＣＯ−２腫瘍形成性細胞株を用いて同じ解
析を行なった。結果を下記の表４に示す。
【０１０５】
【表４】 表４ ─────────────────────────────────── ｍＲＮＡ 大腸組織 DSM ACC2258 HT-29 CaCO-2 非誘導 非誘導／誘導 非誘導／誘導 非誘導／誘導 ─────────────────────────────────── IL-1β + + ++ - ++ - + IL-ra - - + + ++ - + TNF α - + ++ + ++ + ++ IL-6 + + ++ + ++ + ++ IL-8 - + ++ + ++ + ++ ───────────────────────────────────
【０１０６】実施例２ 実施例１で成長させた他のヒト上皮大腸不死化細胞株
は、前記ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８株と類似の特徴を示
す。例えば、他の５つの株（Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｐ）のア
ルカリ性ホスファターゼ活性を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト大腸の上皮細胞の不死化に使用されるベク
ターｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０＋。
【図２】ヒト大腸の上皮細胞から得られる異なる細胞株
による小腸アルカリ性ホスファターゼ活性の発現を示す
グラフ。
【図３】時間の関数としての、ガンマ−インターフェロ
ンの存在下でＭＨＣクラスII（ＨＬＡ）抗原を発現する
本発明の不死化上皮細胞の割合を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マ
    ーカー、およびヒトの大腸の非不死化上皮細胞に特異的
    な代謝分化マーカーを発現し、インビトロで乳酸菌ＣＮ
    ＣＭ−１２２５株に粘着することができる、腫瘍マーカ
    ーの欠如したヒト不死化大腸上皮細胞株。
  2. 【請求項２】 非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マ
    ーカーとして、サイトケラチン、細胞間の結合組織、ア
    ルカリ性ホスファターゼ、サイトクロームＰ４５０、グ
    ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、キノンレダクタ
    ーゼ、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ、グ
    ルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラーゼから形成
    される群から選択される少なくとも２つのマーカーを発
    現する、請求項１に記載の不死化細胞株。
  3. 【請求項３】 代謝分化マーカーとして、表面絨毛組
    織、ショ糖イソマルターゼ、大腸上皮細胞に特異的なＭ
    ＨＣクラスII抗原、およびジペプチジルペプチダーゼIV
    から形成される群から選択される少なくとも２つのマー
    カーを発現する、請求項１に記載の不死化細胞株。
  4. 【請求項４】 ヒトガンマ−インターフェロンの存在下
    で、ＭＨＣクラスII抗原のＨＬＡ−ＤＲ抗原およびＨＬ
    Ａ−ＤＰ抗原を発現するが、該複合体のＨＬＡ−ＤＱ抗
    原を発現しない、請求項３に記載の不死化細胞株。
  5. 【請求項５】 １００個の大腸上皮細胞当たり少なくと
    も８０個の細菌の割合で、インビトロで乳酸菌ＣＮＣＭ
    Ｉ−１２２５株に粘着することができる、請求項１に
    記載の不死化細胞株。
  6. 【請求項６】 寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２２５８を有す
    る、請求項１に記載の不死化細胞株。
  7. 【請求項７】 無機塩、グルコース、ピルビン酸ナトリ
    ウム、アミノ酸、ＢＳＡ、エタノールアミン、ホスホリ
    ルエタノールアミン、ビタミン、およびホルモンからな
    る、ヒト大腸の上皮細胞の培養物および不死化に適応さ
    せた無血清培地であって、培地は、微量元素、ビタミン
    Ｃとレチノイン酸からなるビタミン、ならびにトリヨー
    ドチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、ウ
    シ下垂体抽出物、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）
    およびトランスフェリンからなるホルモンを含んでなる
    ことを特徴とする、上記培地。
  8. 【請求項８】 培地は、１〜１００nMの微量元素、１０
    〜１０００nMのレチノイン酸、１０〜１０００nMのトリ
    ヨードチロニン、０．１〜５０nMのデキサメタゾン、１
    〜１００nMのハイドロコーチゾン、１〜１００μg/mlの
    ビタミンＣ、１〜１００μg/mlのウシ下垂体抽出物、
    ０．１〜５０μg/mlのインスリン、０．１〜５０ng/ml
    のＥＧＦおよび０．１〜１００μg/mlのトランスフェリ
    ンを含んでなることを特徴とする、請求項７に記載の培
    地。
  9. 【請求項９】 請求項７に記載の培地であって、無機塩
    は、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、硫酸カリウ
    ム、塩素酸カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、重炭
    酸ナトリウム、亜硝酸第二鉄、メタバナジン酸アンモニ
    ウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸第二銅、塩素酸
    マグネシウム、塩素酸マンガン、硫酸ニッケル、酢酸ナ
    トリウム、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウ
    ム、ケイ酸ナトリウム、塩素酸スズ、および硫酸亜鉛か
    ら形成される群から選択されることを特徴とする、上記
    培地。
  10. 【請求項１０】 ビタミンは、Ｄ−パントテン酸カルシ
    ウム、塩素酸コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンア
    ミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビオチ
    ンおよびシアノコバラミンから形成される群から選択さ
    れる、請求項７に記載の培地。
  11. 【請求項１１】 培地は、８０μＭ未満のカルシウムを
    含むことを特徴とする、請求項７に記載の培地。
  12. 【請求項１２】 培地は、表１に定義した組成Ｂ５０を
    有することを特徴とする、請求項７に記載の培地。
  13. 【請求項１３】 ヒト大腸の上皮細胞の不死化方法であ
    って、ヒト大腸から得られる初代上皮細胞の培養物を調
    製し、培養物を組換えウイルスで感染させ、不死化細胞
    を請求項７〜１２までのいずれか１項に記載の無血清培
    地で培養する、上記方法。
  14. 【請求項１４】 初代上皮細胞を、請求項７〜１２まで
    のいずれか１項に記載の無血清培地で培養する、請求項
    １３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 培養物を、ＭｕＬＶレトロウイルスの
    一部を含有するＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ組換えウイルスで感
    染させる、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変
    異誘発性、毒性または有効性を確認する方法であって、
    （１）腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性ま
    たは有効性を有することが疑われる物質を、請求項１〜
    ６までのいずれか１項に記載の細胞株を有する培養物と
    反応、培養または接触させ、そして（２）該細胞株に対
    するこの物質の作用を定量または測定する、上記方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜６までのいずれか１項に記
    載のヒト大腸の不死化上皮細胞、請求項７〜１２までの
    いずれか１項に記載の培地、および突然変異誘発性、毒
    性または有効性物質に対する該細胞の代謝応答を測定す
    るための試薬を含んでなる、診断キット。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜６までのいずれか１項に記
    載のヒト大腸の不死化上皮細胞を使用することからな
    る、腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性また
    は有効性を有する物質の同定方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜６までのいずれか１項に記
    載のヒト大腸の不死化上皮細胞からなる、薬剤組成物。
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