NO319494B1 - Kulturmedium, fremgangsmate for udodeliggjoring av epitelceller i human tykktarm, udodeliggjort cellelinje, in vitro fremgangsmate for identifisering av stoffers pavirkning pa tarmceller, diagnostisk sett og anvendelse av cellelinjen i nevnte fremgangsmate og for fremstilling av et farmasoytisk middel. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et serumfritt kulturmedium egnet for dyrking og udødeliggjøring av epitelceller fra human tykktarm. Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for å udødeliggjøre slike epitelceller og en human udødeliggjort kolonepitelcellelinje. Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for identifisering av ulike stoffers påvirkning på tarmceller, et diagnostisk sett og anvendelse av cellelinjen i nevnte fremgangsmåte og for fremstilling av et farmasøytisk middel.

I mange år har det vært forsøkt å utvikle humane cellelinjer som er tilpasset for studering av humane sykdommer, så som infeksjoner, betennelser eller cancerformer. Blant celler som ofte er involvert i begynnelsen av sykdommer er epitelceller, spesielt epitelceller i tarmkanalen som er følsomme for omgivelsene til det humane legemet, og spesielt har betingelser i dietten.

Epitelceller er forskjellige fra andre celler i det humane legemet når det gjelder ekspresjon av forbindelser eller strukturer som hovedsakelig finnes i epitelcellene, sånn som for eksempel cytokeratiner (Moll et al., Cell, 3L 11-24,1982), koblinger mellom celler (Gumbine et all., Cell, 69* 385-387,1992), alkalisk fosfatase som er spesifikke for tarmen (Dudeja et al., Gastroenterology, 105.. 357-366m 1993), cytokromer P 450 (Mercurio et al., Biochem. Biophy. Research Communications, 210. No. 2,350-355, 1995; McKinnon et al., Gut, 36, 259-267,1995), enzymer involvert i cellulært oksidasjonsforsvar (Cu/Zn-superoxide dismutase, glutathione peroxidase og catalase; Albers et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 109. 507-513, 1991) og/eller i detoksifisering av elektrofiler (glutathion-S-transferase og quinon reductase; Chenevix-Trench et al., Karsinogenesis, 16, No. 7,1655-1657,1995) og vimentin (Richard et al., Arch. Dematol. Res. 282,512-515,1990).

I tillegg har epitelcellene i human tarmkanal evnen til å adherere til melkesyrebakterier in vitro (Bemet et al., Gut. 35.483-489,1994; US 5, 032, 399).

Epitelcellene i human tarm er også forskjellige fra andre humane epitelceller i ekspresjon av forbindelser eller strukturer som finnes hovedsakelig i epitelcellene i den humane tarmen, som for eksempel, overflatevilli (Friedrich et al., Bioassays, 12, No. 9, 403-408,1990), sucrose isomaltase (Gibson et al., Gut, 35, 791-797,1994; Paul et al., Am. Pysiol. Soc, C266-C278,1993), visse klasser II vevsforlikelighetsantigener (Mayer et al., Gastroenterology, 100,3-12,1991) og dipeptidylapeptidase IV (DPPIV; Hauri et al., J. Cell. Biol., 101, 836-851,1985).

Fremstilling av en epitelcellelinje i human tarm kan bli utført ved seleksjon av humane cancerceller. Stauffer et al. har følgelig beskrevet seleksjon av to linjer NCM356 og NCM425 som omfatter p53 mutasjon og som uttrykker spesielt tumorantigen CEA (The American journal of surgery, 169, 190-196,1995). Disse cellene representerer et tumorigen transformasjonsstadium, og er av interesse for studering av utviklingen til tumorigen transformasjon av epitelcellene.

Andre humane tarmepitelcellelinjer isolert fra et humant tarm adenom er også kjent, som for eksempel linjen CaCO-2 (ATCC HTB37; Fogh et al., J. Nati. Cancer Inst., 58, 209-214, 1997) og HT29 (ATCC HTB38; Fogh et al., Human tumour Cells In Vitro, 145-159, 1975).

Det er også mulig å udødeliggjøre normale celler, dvs. gjøre dem i stand til å formeres i det uendelige. Normale celler overlever derimot ikke mer enn 10 passasjer. Teknikker for transfeksjon av celler, ved hjelp av spesielt tilpassede vektorer, sånn som SV40 vektoren omfatter en sekvens av T-antigen (R.D. Berry et al., Br.J. Cancer, 57,287-289, 1988) eller en vektor omfattende DNA-sekvenser av human papillomavirus (US 5,376,542) blir generelt anvendt.

Sanderson et al. har følgelig udødeliggjort normale celler fra føtal tynntarm (Int. Arch. Allergy Immunol., 107. 396-397, 1995). Disse cellene er derimot fortsatt fysiologisk forskjellig fra normale voksne celler.

Moyer et al., Gastroenterology, vol. 108, nr. 4, 1995 beskriver normale og pre-neoplastiske/neoplastiske tykktarmsceller. Moyer et al., beskriver også de kjente genetiske og biokjemiske trekk ved flere udødeliggjorte cellelinjer og beskriver videre isolering og karakterisering av ikke-transformerte kolonepitelceller, og i særdeleshet en CM4660 (N3)-linjen som utrykker visse epitelmarkører. Moyer et al., beskriver utvelgelse av to cellelinjer som begge omfatter P53-mutasjonen og som spesielt uttrykker tumorantigenet CAE. Disse celler er på et preliminært stadium i forhold til cancertransformasjon og er av verdi for å studere utvikling av cancertransformasjon av epitelceller.

Berry et al., British Journal of Cancer, vol 57,1988 side 287-289 beskriver udødeliggjøring av føtale kolonceller ved hjelp av et SV40-virus, med den effekt at en hvilken som helst celle som oppnås vil mer eller mindre fremvise føtale egenskaper, men ikke egenskaper tilhørende normale epitelceller. Cellene som var oppnådd uttrykker kun en differensieringsmarkør og har ikke evne til å adherere melkesyrebakterier. Cellelinjen beskrives å medføre "knuter" hos mottakerdyret, hvilket indikerer en tumorigen adferd.

US patent S 032 399 beskriver en ren bakteriekulturstamme av arten lactobacillus acidophillus som kan adherere til slimhinneceller i human tynntarm.

Frem til nå er det ikke blitt rapportert udødeliggj øring av normale epitelceller fra voksen human tarm. Til tross for at udødeliggjøring av teknikker er kjent er det fortsatt meget vanskelig å finne optimale tilstander for udødeliggjøring av en human celle slik at den beholder sine opprinnelige karaktertrekk og uten å vise tegn på en tumorigen transformasjon.

En av tilstandene for å propagere udødeliggjorte celler er deres vekst i et spesielt dyrkningsmedium. Kulturmediet beskrevet i litteraturen er alle spesifikke for en celletype og kan vanskelig anvendes på andre celletyper. Som eksempel kan nevnes at serumfritt medium beskrevet av Gibson et al. (Gut, 35,791-797,1991), Pfeifer et al.

(Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90,5123-5127,1993) og Kulkani et al. (Cacinogenesis, 16, No. 10, 2515-2521,1995).

Formålet ifølge oppfinnelsen er å tilveiebringe nye humane tarm epitel cellelinjer som er genetiske og fysiologiske relatert til normale epitelceller i human tarm i den grad det er vanskelig å skille disse. Disse cellelinjene uttrykker ikke tumormarkører. Disse linjene uttrykker, i tillegg, mange spesifikke markører som er til stede i normale epitelceller i human tarm.

Foreliggende oppfinnelse angår således serumfritt kulturmedium egnet for dyrking og udødeliggjøring av epitelcellene i human tykktarm, omfattende uorganiske salter, glukose, natrium pyruvat, aminosyrer, BSA, etanolamin, fosforetanolamin, vitaminer og hormoner, kjennetegnet ved at mediet omfatter sporelmenter, vitaminer bestående av vitamin C og retinoisk styre, og hormoner bestående av trijodtyrodin, deksametason, hydrokortison, bovint hypofysekjertelekstrakt, insulin, EGF og transferrin.

Et aspekt av oppfinnelsen angår kulturmedium, kjennetegnet ved at mediet omfatter 1-100 nM sporelementer, 10-1000 nM retinoisk syre, 10-1000 nM trijodtyrodin, 0.1-50 nM deksametason, 1-100 nM hydrokortison, 1-100 ug/ml vitamin C, 1-100 \ ig/ m\ bovint hypofysekjetrelekstrakt, 0.1-50 u,g/ml insulin, 0.1-50 ng/ml EGF og 0.1-100 p. g/ml transferrin.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår kulturmedium kjennetegnet ved at de uorganiske saltene blir valgt fra gruppen bestående av natriumklorat, kaliumklorat, kaliumsulfat, kalsiumklorat, dibasisk natriumfosfat, natrium bikarbonat, jernnitritt, ammonium metevanadat, ammonium molybdat, kobbersulfat, magnesiumklorat, manganklorat, nikkelsulfat, natriumacetat, natriumpyruvat, natriumselenitt, natrium-silikat, tinnklorat og sinksulfat.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår kulturmedium kjennetegnet ved at vitaminene blir valgt fra gruppen dannet av kalsium D-pantotenat, kolinklorat, folinsyre, inositol, nikotinamid, pyridoksin, riboflavin, tiamin, biotin og cyano-kobalamin.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår kulturmedium kjennetegnet ved at mediet omfatter mindre enn 8 uM kalsium.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår kulturmedium kjennetegnet ved at det har sammensetningen B50 definert i tabell 1.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for udødeliggjøring av epitelcellene i human tykktarm, kjennetegnet ved at en kultur av primære epitelceller avledet fra den humane tykktarmen blir fremstilt, kulturen blir infisert med et rekombinant virus, og udødeliggjorte celler blir dyrket i serumfritt kulturmedium ifølge oppfinnelsen.

Et aspekt av oppfinnelsen angår en fremgangsmåte kjennetegnet ved at de primære epitelcellene blir dyrket i serumfritt kulturmedium ifølge oppfinnelsen.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår en fremgangsmåte kjennetegnet ved at kulturen blir infisert med et rekombinant SV40 T-Ag-virus inneholdende en del av MuLV-retroviruset.

Foreliggende oppfinnelse angår videre humane kolon epitelcellelinjer udødeliggjort ved anvendelse av et rekombinant virus, der cellelinjen

er i stand til å formere seg i minst 40 påfølgende passasjer,

mangler tumormarkører,

uttrykker metabolske markører spesifikke for ikke-udødeliggjorte, humane epitelceller og metabolske differensieringsmarkører spesifikke for ikke-udødeliggjorte, humane kolonepitelceller,

er i stand til å adherere, in vitro, til melkesyrebakteriestammen CNCM I-1225, og

er i stand til å frembringes ifølge en fremgangsmåte ifølge kravene 7 til 10, med den forutsetning at dette ekskluderer cellelinjer som er oppnådd ved en fremgangsmåte for å oppnå en hovedsakelig ren, udødeliggjort human epitelcellelinje, som omfatter

(a) frembringelse av en primær kultur av humane epitelceller oppnådd ved anvendelse av et fibroblast-samdyrkingssystem omfattende en første populasjon av celler omfattende en kultur av humane fibroblaster på et substrat i et egnet medium, et støttemateriale slik som en membran der støttematerialet er plassert over fibroblastkulturen, og en annen, heterogen populasjon av celler tilført

støttematerialet og omfattende humane epitelceller,

(b) utsåing av en tredje populasjon av celler omfattende en kultur av humane

fibroblaster på et annet substrat i et egnet medium,

(c) selektiv løsning av ikke-epiteliale celler fra substratet ved å inkubere samkulturen med et egnet løsrivelsesmiddel for en tidsperiode tilstrekkelig for å løsne ikke-epiteliale celler fra substratet uten å løsne en vesentlig mengde av

epitelcellene,

(d) plassering av støttematerialet over fibroblastkulturen oppnådd i trinn (b), slik at

en hovedsakelig ren epitelcellestamme opprettholdes på støttematerialet, og

(e) udødeliggjøring av den hovedsakelige rene epitelcellestammen med minst en retrovirusvektor som har en ekspresjonskassett omfattende et nukleinsyremolekyl som koder for et papillomavirus polypeptid valgt fra gruppen bestående av E6 og E7 og kombinasjoner av disse, og kontrollsekvenser som dirigerer transkripsjonen av nukleinsyremolekylet slik at sekvensen kan transkriberes og translateres i den transfekterte cellelinjen.

Et aspekt av oppfinnelsen angår en udødeliggjort linje kjennetegnet ved at den uttrykker, som metabolsk markør spesifikk for ikke-udødeliggjorte humane epitelceller, minst to markører valgt fra gruppen dannet av cytokeratiner, koblinger mellom celler, alkalisk fosfatase, cytokromene P450, en glutation-S-transferase, quinon reduktase, Cu/Zn-superoksid dismutase, glutation peroksidase og en katalase.

Gt annet aspekt av oppfinnelsen angår en udødeliggjort linje kjennetegnet ved at den uttrykker, som metabolsk differensieringsmarkør, minst to markører valgt fra gruppen dannet av overflatevilli, sukrose isomaltase, klasse II vevsforlikelighets-komplekset og dipeptidylpeptidase IV.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår en udødeliggjort linje kjennetegnet ved at den uttrykker HLA-DR- og HLA-DP-antigener fra klasse II vevsforlikelighetskomplekset, og som ikke uttrykker HLA-DQ-antigenet til nevnte kompleks, i nærvær av human gamma-interferon.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår en udødeliggjort linje kjennetegnet ved at den har evnen til å adherere in vitro til melkesyrebakteriestammen CNCM1-1225 i et forhold på minst 80 bakterier pr. 100 tykktarmsepitelceller.

Et annet aspekt av oppfinnelsen angår en udødeliggjort linje kjennetegnet ved at den har deponeringsnummer DSM ACC2258.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for identifisering av den mutagene, toksiske eller fordelaktige effekten til et middel på metabolismen til cellene i tarmkanalen, hvor (1) et middel antatt å være et mutagent, toksisk eller fordelaktig middel for metabolisme av cellene i tarmkanalen blir omsatt, dyrket eller brakt i kontakt med en kultur omfattende en cellelinje beskrevet ovenfor, og (2) effekten av nevnte middel på nevnte cellelinje blir bestemt eller målt.

Oppfinnelsen vedrører også et diagnostisk sett som omfatter de udødeliggjorte epitelcellene til human tarm beskrevet ovenfor, kulturmediet beskrevet ovenfor og reagenser for å bestemme en metabolsk respons i nevnte celler overfor mutagene, toksiske eller fordelaktige midler med hensyn på metabolismen til cellene i tarmkanalen.

Oppfinnelsen angår også en hvilken som helst anvendelse av cellelinjene beskrevet ovenfor, i fremgangsmåter for identifikasjon av mutagene, toksiske eller fordelaktige midler for metabolisme av cellene i tarmkanalen, samt en hvilken som helst anvendelse av nevnte linjer som et aktivt farmasøytisk middel.

Beskrivelse av figurer.

Figur 1: Vektor pLXSHD+SV40+ anvendt for å udødeliggjøre epitelcellene i human tarm. Figur 2: Ekspresjon av tarmalkalisk fosfatase aktivitet i forskjellige cellelinjer avledet fra epitelcellene i human tarm. Figur 3: Prosentandel av udødeliggjorte epitel celler ifølge oppfinnelsen som uttrykker klasse IIMHC (HLA) antigener i nærvær av gamma-interferon som en funksjon av tiden.

Innenfor foreliggende oppfinnelse angir uttrykkene "normale celler", "primære celler" eller "ikke-udødeliggjorte celler" epitelcellene i human tarm som kan bli samlet fra tarmen til en frisk voksen som ikke har fysiologiske eller genetiske mangler, og som kan bli dyrket i en begrenset tid uten å miste sine opprinnelige differensieringskaraktertrekk.

Uttrykket "udødeliggjorte celler" angir celler som har gjennomgått en genetisk manipulasjon ved hjelp av en DNA konstruksjon som gjør at de har evne til å formere seg uendelig, dvs. i mer en 60 passasjer. Cancercellene valgt av Stauffer et al., eller linjene CaCO-2 og HT29 blir følgelig ikke betraktet som celler som er blitt udødeliggjort ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ordet "passasje" angir prosessen bestående av å ta en alikvot av en konfluent kultur av en cellelinje, inokulere dette i et friskt medium og dyrking av linjen helt til konfluens eller metning blir oppnådd. Cellelinjene blir følgelig tradisjonelt dyrket ved suksessive overpassasjer til friskt medium. Cellelinjene kan miste deres opprinnelige differensierings-karaktertrekk etter flere påfølgende passasjer. Det er derfor ekstremt fordelaktig å kunne oppnå en linje hvor karaktertrekkene blir konservert selv etter mangfoldige passasjer, fortrinnsvis minst 60 passasjer.

Uttrykket "opprinnelige differensieringskaraktertrekk" angir både markører som finnes spesifikt på humane epitelceller og differensieringsmarkører som finnes spesifikt på humane tarm epitelceller.

Human tarmepitel udødeliggjort cellelinje ifølge oppfinnelsen uttrykker ikke tumormarkører, dvs. har ikke karsinogene mutasjoner eller uttrykker ikke budbringer RNA (mRNA) eller differensierte cellulær struktur og/eller proteiner karakteristiske for transformasjon av cellene til tumorceller. Tilstedeværelse av disse markører kan bli detektert ved hybridisering eller RT-PCR av mRNA med spesifikke radiomerkede prober. Tilstedeværelse av en markør i en celle betyr ikke at nevnte celle har evne til å utvise en cancerform etter noen få måneder på en mus uten immunforsvar, men reflekterer derimot en tumorigen transformert tilstand i cellene sammenlignet med de opprinnelige cellene som de er avledet fra.

Linjene ifølge foreliggende oppfinnelse har ikke p53 mutasjonen (Lavigeur et al., Mol. Cell. Biol., 9,3982-3991,1989) Donehower et al., Natur, 356,215-221,1992) karsinomembryonalt antigen (CEA; Stauffer et al.) og/eller mutasjon i APC-genet (adenomatous polyposis coli; Hargest et al., Gut, 37,826-829, 1995).

Epitelcellelinjer ifølge oppfinnelsen uttrykker derimot metabolske markører spesifikke for normale humane epitel celler. Disse markørene kan være en budbringer RNA (mRNA), et protein og/eller en differensiert cellulær struktur som generelt finnes bare i de fleste humane epitelcellene, med evne til å bli avledet fra huden, øyet, tarmkanalen eller leveren for eksempel. Humane epitelceller ifølge oppfinnelsen kan derfor uttrykke minst to markører som finnes i forskjellige typer av epitelceller. Cellene ifølge oppfinnelsen uttrykker følgelig nevnte markører valgt fra gruppen dannet av i det minste cytokeratiner, koblinger mellom cellene (også betegnet "tight junction"), tarmalkalisk fosfatase, cytokromene P450, glutation-transferase (GST), quinon reduktase (QR), Cu/Zn-superoksid dismutase (SOD), glutation perioksidase (GP) og catalase (CA).

Linjene ifølge oppfinnelsen kan derfor uttrykke enzymer som er involvert i cellulær oksidasjon (SOD, GP og CA) og/eller detoksifisering av elektrofiler (GST og QR). Disse linjene er følgelig spesielt tilpasset for studering av fenomenet betennelser eller irritasjoner i slimhinnemembranene til den humane tarm.

Cellelinjene ifølge oppfinnelsen uttrykker også metabolske differensieirngsmarkører som er spesifikke for ikke-udødeliggjorte epitelceller i human tarm. Disse markørene kan være et mRNA, et protein, eller en differensiert cellulær struktur som bare finnes i epitelcellene i tarmen. Linjene ifølge oppfinnelsen uttrykker fortrinnsvis, som metabolske differensieirngsmarkører, minst to markører valgt fra gruppen dannet av overflatevilli, sukrose isomaltase, klasse II vevsforlikelighetskomplekser som er spesifikke for tarm epitelcellene og dipeptidylpeptidase IV.

Linjene ifølge oppfinnelsen uttrykker fortrinnsvis HLA-DR og HLA-DR antigener av klasse II vevsforlikelighetskomplekser (MHC H) og uttrykker ikke HLA-DQ antigen, i nærvær av human gamma-interferon (ekspresjon av HLA-DQ er blitt assosiert med tumorgenisitet).

Linjene ifølge oppfinnelsen har også evne til å adherere in vitro lactobacillus gonsonistamme CNCM-1225. En kultur av melkesyrebakterier kan følgelig bli spredt over en konfluent kultur av en linje ifølge oppfinnelsen, hvorpå den konfluente kulturen vaskes og deretter blir antall bakterier som adhererer til villi på nevnte linjer målt. En linje ifølge oppfinnelsen har evne til å adherere in vitro stammen av melkesyrebakteriestammen CNCM-1225 i et omfang på minst 80 bakterier pr. 100 tarmceller ifølge oppfinnelsen, spesielt 80-200.

Linjene ifølge oppfinnelsen skal også kunne adherere in vitro til Clostridium diffisil og/eller til andre adherente melkebakterier, som bifidobakterier, spesielt bifidobakteriene beskrevet i Applied Env. Microb., 59,4121-4128, 1993 og EP577904 (Nestlé), som er blitt deponert til Pasteur Institut, Paris, Frankrike, hvor de ble tildelt deponeringsnumrene CNCM 1-1226, CNCM 1-1227 og CNCM 1-1228.

Linjene ifølge oppfinnelsen skal også kunne uttrykke mange cytokiner etter å ha vært i kontakt med et inflammasjonsmiddel, dvs. cytokinene IL-lfi, IL-lRa, TNF, IL-6 og IL-8.

Oppfinnelsen vedrører også spesielt en udødeliggjort linje ifølge oppfinnelsen som er blitt deponert til Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Tyskland, 16. April 1996, med deponeringsnummer DSM ACC2258.

Human tarm epitellinjer ifølge oppfinnelsen har fordelaktig konservert deres

opprinnelige differensieringskaraktertrekk selv etter mange passasjer, spesielt minst 40-80 passasjer. Det kan imidlertid etter 40 passasjer, og til og med før, sees en forandring i de karyotypen til linjene på grunn av tap av fragmenter av kromosomer. Disse linjene har imidlertid bevart det samme intakte sett av hvert kromosompar og dette muliggjør at de også har konservert ekspresjon av deres opprinnelige differensieringskaraktertrekk.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører et serumfritt kulturmedium tilpasset til dyrking og udødeliggjøring av epitelcellene i human tarm ifølge oppfinnelsen. Dette kulturmediet er spesielt tilpasset for å opprettholde i det uendelige, under suksessive passasjer, de opprinnelige differensieringskaraktertrekkene til linjene ifølge oppfinnelsen. Dersom andre kulturmedier blir anvendt vil linjene ifølge oppfinnelsen tape sine opprinnelige differensieringskaraktertrekk etter noen få etterfølgende passeringer, for eksempel 5-10 passasjer. Dette mediet er også essensielt for vellykket udødeliggjøring av linjene ifølge oppfinnelsen. Suppresjbn av et av dets karakteristiske bestanddeler fører følgelig generelt til mangel på udødeliggjøring av epitelcellene i tarmen ifølge oppfinnelsen.

Dette mediet kan omfatte alle bestanddeler som vanligvis finnes i serumfrie dyrecelle-kulturmedier, dvs. uorganiske salter, glukose, en buffer (HEPES, for eksempel: Biofluider), natriumpyruvat, aminosyrer, BSA, fosfoetanolamin, etanolamin, vitaminer og hormoner, for eksempel. Kommersielle kulturmedier så som DMEM-medium (Biofluids Inc., USA) kan følgelig virke som grunnlag for tilberedning av dette mediet.

Nyheten til mediet ifølge oppfinnelsen ligger i en ny kombinasjon av noen av dets bestanddeler, mens de andre forbindelsene varierer noen ganger innenfor grensene kjent for personer innenfor dette fagområdet. Disse essensielle bestanddelene er sporelementer, vitaminer bestående av vitamin C og retinoisk syre, og hormoner bestående av triiodotyrodin, dexametason, hydrokortison, bovint hypofysekjetrelekstrakt, insulin, EGF og transferrin.

Dette kulturmediet kan følgelig omfatte 1-100 nM sporelementer, 10-100 nM retinoisk syre, 10-1000 nM triiodotyrodin (T3), 0.1-50 nM dexametason, 1-100 nM hydrokortison, 1-100 ug/ml vitamin C, 1-100 ug/ml bovin hypofysekjertelekstrakt, 0.1-50 ug/ml insulin, 0.1-50 ug/ml EGF og 0.1-100 ug/ml transferrin.

Blant sporelementene kan det velges forbindelser valgt fra gruppen dannet av selen, mangan, silikat, molybden, vanadium, nikkel, tinn og saltene derav.

Blant uorganiske salter som vanligvis blir inkludert i mediet kan det bli valgt salter fra gruppen dannet av natriumklorat, kalsiumklorat, kalsiumsulfat, kaliumklorat, dibasisk natriumfosfat, natriumbikarbonat, jemnitritt, ammonium metevanadat, ammonium molybdat, kobbersulfat, magnesiumklorat, manganklorat, nikkelsulfat, natriumasetat, natriumyruvat, natriumselenitt, natriumsilikat, tinnklorat og sinksulfat.

Mediumet må inneholde mindre enn 80 uM eller kalsium i form av uorganiske salter for å inhibere utviklingen av kontaminerende fibroblaster. Kalsiumkonsentrasjonen kan imidlertid økes til 1 mM, som er nødvendig i noen eksperimenter (polarisering, ekspresjon av "tight junction"-proteiner osv.) Etter flere passasjer er det ikke ytterligere risiko for formering av fibroblaster som kan være tidlige kontaminanter forårsaket av prosessering av primære celler.

Blant andre vitaminer som vanligvis er inkludert i mediet kan det bli valgt andre vitaminer valgt fra gruppen dannet av kalsium D-pantotenat, cholinklorat, folinsyre, inositol, nikotinamid, pyridoksin, riboflavin, tiamin, biotin og cyanokobalamin.

Et kulturmedium som gjør det mulig å oppnå linjer ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis sammensetningen BSO definert i tabell 1 nedenfor.

Et annet aspekt av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for udødeliggjøring av epitelcellene i human tarm hvor en kultur av primære epitelceller avleder fra human tarm blir dannet, kulturen blir infisert med en rekombinant virus, udødeliggjorte celler blir dyrket i serumfritt kulturmedium beskrevet ovenfor.

Før dette blir følgende trinn fortrinnsvis anvendt:

1. en prøve av epitelvev fra en human tarm blir oppnådd; 2. denne prøven blir tilberedt for dyrkning in vitro; 3. epitelcellene blir inokulert i et serumfritt kulturmedium og på kulturskåler omfattende et belegg som letter festing av cellene og deres vekst; 4. mediet blir skiftet så mange ganger som det er behov for å optimalisere konfluentvekst: 5. cellene blir infisert med et rekombinant virus; 6. og udødeliggjorte celler blir dyrket i det serumfrie kulturmedium beskrevet ovenfor.

Trinn (1) vedrører oppnåelse av prøver av tarmceller fra normale individer under kirurgiske inngrep i tarmkanalen. I trinn (2) kan prøven bli vasket i kulturmediet, kuttet i stykker og epiteldelen separert fra annet vev ved fysisk og/eller kjemiske metoder. For eksempel kan vevstykket bli plassert i en oppløsning omfattende omtrent 0,5% trypsin og 0,1% EDTA i tilstrekkelig lang tid for å oppnå separering av celler og deretter blir ren trypsininhibitor tilsatt i noen minutter, og til slutt blir kulturmediet som beskrevet ovenfor tilsatt.

I trinn (3) kan epitelcellene bli inokulert på skåler i et serumfritt kulturmedium, fortrinnsvis det som er beskrevet ovenfor. Kulturskålene har fortrinnsvis et belegg bestående av oppløsning av fibronektin, BSA og type 1 kollagen (se Lechner et al., J.

Cult.Meth., 9,43-48,1985).

I trinn (4) blir kulturmediet inneholdende epitelcellene skiftet så mange ganger som nødvendig for å optimalisere en konfluent vekst. Mediet blir fortrinnsvis erstattet annenhver dag. Etter å ha oppnådd konfluens på 90% av tilgjengelig overflateareal, som generelt oppstår 10 dager etter inokulasjon, blir cellene separert ved behandlinger i oppløsninger av trypsin og EDTA.

Separerte celler blir overført i trinn (5) til et infeksjonsmedium, for eksempel det som er beskrevet ovenfor, på kulturskåler som fortrinnsvis har belegget beskrevet ovenfor. Cellene blir deretter infisert på konvensjonell måte med et rekombinant virus. Mange transfeksjonsteknikker er tilgjengelige for personer innenfor dette fagområdet. Som eksempel kan det nevnes teknikker beskrevet i WO96/07750 av Claudia Chen et al.

(Mol. og Cell. Biol. 7,2745-2752,1987) eller av Wilson et al. (Analytical Biochemistry, 226. 212-220. 1995).

Et rekombinant SV40-virus omfattende T-antigen (T-Ag) et inaktivert virus replikasjonsorigo (MuLV retrovirus) og et selekterbart gen blir anvendt. Som eksempel kan konstruksjonen presentert i figur 1 hvor sekvensen er tilgjengelig i genbank databanken (ekspresjonsnr. M64753; Stockshlaeder et al., Human Gen. Therapy, 2,33-39,1991) bli anvendt.

Andre hensiktsmessige vektorer kan også lett bli konstruert av fagfolk innen området fra kommersielt tilgjengelige vektorer omfattende for eksempel genet kodende for T-Ag, et selekterbart gen og/eller et humant replikasjons origo. Som eksempel kan det nevnes plasmidene ATCC37460 og ATCC37640 som inneholder genet kodende for T-Ag.

I trinn (6) blir epitelcellene overført til et friskt vekstmedium på kulturskåler fortrinnsvis omfattende belegget beskrevet ovenfor.

Med kjennskap til nye og opprinnelige egenskaper til epitelcellelinjene ifølge oppfinnelsen kan deres anvendelse bli belyst i immunologiske, patologiske og toksikologiske studier.

Linjene ifølge oppfinnelsen er følgelig spesielt tilpasset for screening av mutagene, toksiske eller fordelaktige midler for metabolisme av cellene i tarmkanalen, som for eksempel i en fremgangsmåte hvor (1) et middel antatt for å være et mutagent, toksisk eller fordelaktig for metabolisme av cellene i tarmkanalen blir omsatt, dyrket eller brakt i kontakt med en kultur som omfatter en cellelinje ifølge oppfinnelsen, og (2) effekten av nevnte middel på nevnte cellelinje blir bestemt eller målt.

Det kan også bli fremstilt et diagnostisk sett omfattende epitelcellene ifølge oppfinnelsen, kulturmediet ifølge oppfinnelsen og reagenser for bestemmelse av en metabolsk respons av nevnte celler overfor mutagene, toksiske eller fordelaktige midler.

Linjene ifølge oppfinnelsen er også tilpasset for ekspresjon av rekombinante proteiner. Fremgangsmåtene for transfeksjon av fremmed DNA er nå velkjent for fagfolk innenfor dette området (se for eksempel WO94/05472).

Linjene ifølge oppfinnelsen har også en potensiell nytteverdi i genterapi ex vivo. Disse linjene kan utgjøre et egnet redskap for utvikling av rekombinante celler som uttrykker gener av interesse for terapeutiske formål. En fordel er også at linjene ifølge oppfinnelsen ikke blir eksponert for et dyreserum som betraktelig reduserer risikoene for potensielle kontaminasjoner av virusene eller andre patogene midler.

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj nedenfor og nedenfor følger også eksempler på fremstilling av cellelinjene ifølge oppfinnelsen.

Disse eksemplene blir etterfulgt av en beskrivelse av det anvendte kulturmediet samt et sammenlignende eksempel. Disse eksemplene illustrerer oppfinnelsen. Cellekulturen, fremstilling av SV40-vektorer, transfeksjon og analyser av ekspresjoner av markører blir dersom ikke annet er angitt utført ifølge fremgangsmåtene beskrevet i manualen til Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989). Prosentandelene er angitt i vekt dersom ikke annet er angitt.

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL

Vektoren pLXSHD+SV40+ beskrevet av Stockshlaeder et al. (GeneBank, aksesjonsnummer No. M64753; Stockshleder et al., Human Gen. Therapy, 2,33-39) som er representert i figur 1 og som omfatter genets kodende for stort T-antigen, psi-gen,

selekterbar markør histidino dehydrogenase (HSD) og er LTR-promoteren, blir anvendt.

SV40-virusene blir fremstilt ifølge en modifisert versjon av Lynch og Miller prosedyren (J. Virol., 65,3887-3890,1991). De ekotropiske cellelinjene Psi2 (Mann et al., Cell, 33, 153-159,1983) og de ampotropiske cellelinjene PA327 (ATCC CRL9078) blir dyrket i DMEM-medium (Dulbecco, USA) omfattende 10% føtalt kalveserum, ved 37°C og under en atmosfære omfattende 5% C02- Disse linjene blir konvensjonelt transfektert separat ved anvendelse av 250 mM CaCl2 og 10 pg vektor pLXSHD+SV40+, og uttatt for å behandling med trypsin etter 481 inkubasjon, blandet i en lik mengde og det hele blir inkubert ved 37°C under en atmosfære omfattende 5% CO2. Etter dyrking til 70% konfluens blir virusene høstet i serumfritt medium PC-2 (Ventrex, USA). Etter filtrering (0.45 pm, Micropore), blir mengde virus bestemt på NIH 3T3 celler (ATCC CRL 1658).

Primærcellene i tarmen blir oppnådd etter biopsi av en 69 år gammel kvinne på grunn av forekomst av et sigmoid divertikulum. Prøven blir vasket i DMEM kulturmedium,

kuttet i stykker, den epiteliale delen blir separert fra annet vev, epitelceller på skåler blir inokulert i DMEM-medium. Kulturskålene blir preinkubert i en 500 ml oppløsning omfattende 5 mg human fibronektin (Sigma), 5 ml Vitrogen 100 (Collagen Corp. Palo Alto, Ca., USA) 50 ml. Av en 0.1% BSA oppløsning (Biofuids) og gjenværende DMEM-medium. Kulturmediet inneholdende eptelialceller blir skiftet så mange ganger som det er nødvendig for å optimalisere en konfluent vekst. Etter å ha nådd en konfluens i størrelse 90% etter en uke av kulturen blir cellene hensiktsmessig separert ved behandlinger i oppløsninger av trypsin og EDTA. Cellene som blir separert blir overført på kulturskåler som har belegget beskrevet ovenfor og i A50-mediet beskrevet ovenfor.

Kulturene blir deretter infisert i nærvær av 8 pg/ml polybren og et høyt rekombinant SV40 virum titer (10<5->10<7>CFU) omfattende T-antigen (T-Ag) fremstilt som beskrevet ovenfor. Etter 2 t inkubasjon blir kulturene vasket i PBS og A 50 friskt vekstmedium blir tilsatt.

Cellene utviser deretter en vekst som er så sakte at det er umulig å selektere en klon som har en vekst som kan sammenlignes med epitelcellene i human tarm.

EKSEMPEL 1

Epitelcellene i human tarm blir infisert som beskrevet i sammenlignes eksempelet ovenfor og den eneste forskjellen er at A50-mediet blir erstattet med B50-mediet beskrevet i tabell 1 ovenfor.

Etter 2 t inkubasjon med virus blir kulturene vasket i PBS, B50 friskt vekstmedium blir tilsatt og cellene dyrket ved suksessive passasjer i frist B50-medium og hver passasje blir utført slik at cellene separeres ved en behandling i en oppløsning omfattende 0.02% trypsin, 1% polyvinyl-pyrolidin og 0.02% etylenglykol i HEPES buffer (Biofluids).

Ved å observere størrelsen på cellekoloniene som utvikles på kulturskålene blir de som blir utviklet hurtig valgt. Det var følgelig mulig å selektere 6 human tarmepitel udødeliggjorte cellelinjer hvor en ble deponert til Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany, 16. April 1996, med deponeringsnummer DSM ACC2258.

1. Analyse av karvotype til stammen DSM ACC2258.

4 karyotyper av DSM ACC2258-stammen som ble tatt ved passering 40 blir fremstilt (metoden beskrevet i manualen "Human cytogenetics, Edts.: Rooney DE, Czepulkowksi BH, IRL Press. Oxford, 1986" inkorporert som referanse). Resultatene viser at 6 forskjellige kromosomer gikk tapt eller var skadet. Linjen konserverer derfor intakt i dets genom et kromosom av hvert par av kromosomer. Kjønnet til linjen er XO/XX. Det er å bemerke at tap av ett sett kromosom ikke er et tegn på en tumorigen transformasjon av nevnte linje.

2. Tumorigenisitet til stammen DSM ACC2258.

10 celler av DSM ACC2258 linjen, tatt etter 46. passasje, blir injisert i en mus uten immunforsvar ("naken") ifølge prosdyren beskrevet av Stauffer et al. (ovenfor). Ingen tumordannelse er synlig etter mer enn 8 måneder. Dtke-tumorigenisiteten til linjene er ikke tegn på ikke-tumorigen transformasjon av nevnte linje. NMC456 linjene beskrevet av Stauffer et al. induserer ikke tumorer i nakne mus til tross for at den uttrykker tumormarkører karakteristisk for dets tumorigene transformasjon.

3. Ekspresjon av tumormarkører i DSM ACC2248 linjen.

Den blir bestemt ifølge prosedyren beskrevet av Stauffer et al. om DSM ACC2258 linjen uttrykker følgende tumormarkører: p-5 3-mutasjon, karsinomembryonalt antigen (CEA) og mutasjon i adenoma colyposis koli (APC)-genet.

Resultatene er negative for alle disse markørene som indikerer en tilstand med ikke-tumorigen transformasjon av linjen.

4. Viral kontaminasjon av DSM ACC2258- linjen.

Det blir bestemt om DSM ACC2258-linjen er kontaminert av hepatitt C-virus (HCV), hepatitt B-virus (HB V) og aids-virus (HIV-l).For analysering av HB V blir DNA ekstrahert fra omtrent 2x10^ celler ved behandling med fenol og kloroformoppløsninger etterfulgt av en etanolfelling. DNA-prøvene blir deretter utsatt for en PCR-amplifikasjon ved anvendelse av primere spesifikk for pre-kjerne regionen til viruset (Lynch et al., J. Virol., 65,3887-3890). Amplifiseringsproduktene blir deretter separert på en agarosegel, og de blir visualisert under UV i nærvær av etidiumbromid. For sammenligning blir en fortynning av serum inneholdende 10-10^ HBV (Anawa Biomedical Services 6 Product, USA) analysert på samme måte, parallelt.

For analysering av HIV-1 blir DNA-prøvene beskrevet ovenfor utsatt for PCR-amplifisering ved anvendelse av primere spesifikke for GAG-regionen til viruset. Amplifseringsproduktene blir deretter separert på en agarosegel og de blir visualisert under UV i nærvær av etidium bromid. For sammenligning blir en fortynning av et serum inneholdende 10-IO<5> HIV-1 (Anawa Biomedical Services 6 Product, USA) analysert på samme måte, parallelt.

For analysering av HCV blir RNA ekstrahert fra omtrent 2x10^ celler ifølge metoden til Chomeczynski et al. (Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987). En revers transkripsjon blir hensiktsmessig utført, og komplementært DNA som blir oppnådd blir utsatt for en PCR amplifisering ved anvendelse av primere spesifikke for ikke-kodende 5 -regionen til viruset. Amplifiseringsproduktene blir deretter separert på en agarosegel, og de blir visualisert under UV i nærvær av etidiumbromid. For sammenligning blir en fortynning av et serum inneholdende 10-10^ analysert på samme måte, parallelt.

Resultatene er negative for tilstedeværelse av 3 virus.

5. Ekspresjon av markører spesifikke for human epitelceller.

5. a. Cvtokeratiner: Cellene til en kultur av DSM ACC2258-linjen blir koblet på glass-skåler av en 100% kald metanol oppløsning og deretter blir skålene vasket i en buffer omfattende 0.05M Tris pH 8.6,1.8% NaCl og 0.2% polyetylenglykol 2000 (TNP buffer). Cellene blir deretter inkubert i 30 min i nærvær av museantistoffer spesifikke for visse cytokeratiner (anti-CH peptide 4,7, 8,13,14,17,18,19, 20, Sigma, USA). Etter 3 vaskinger i TNP-buffer omfattende 0,5% BSA, blir skålene inkubert i 30 min med et geiteanti-muse-IgG-antistoff omfattende en immunfluorescert forbindelse (1:300, FITC geiteanti-mus IgG; Biosys). Etter 3 vaskinger i foregående buffer blir skålene fiksert og de blir analysert ved fluorescens mikroskopi. Alle cellene er positiv for cytokeratinene 7, 8 og 17. 5. b. Vimentin: På samme måte som for analysering av cytokeratiner blir de fikserte cellene beskrevet ovenfor utsatt for et museanti-vimentinantistoff (DAKO, USA) og deretter far geiteanti-muse-IgG-antistoff nevnt ovenfor. Ved fluorescensmikroskopi er alle cellene positive for vimentin. 5. c. Koblinger mellom cellene ( tette grenser) : Cellene fra DSM ACC2258 blir dyrket på en glasskål helt til de blir konfluente og de blir fiksert ved behandling med en 2,5% glutaraldehyd oppløsning i en 0.1 M fosfatbuffer pH 7.4 i 11 ved romtemperatur. Etter to vaskinger i samme fosfatbuffer blir cellene på ny fiksert i en 2% OsC«4 oppløsning i samme buffer. Cellene blir deretter dehydrert i følgende oppløsninger av etanol ved 30, 50, 70, 90 og 100% (Polaron Equipment Ltd., Watford, UK) og deretter blir cellene fjernet av et ifnt gullag (SEM beleggenhet E5100, Polaron). Cellene blir deretter undersøkt ved elektronmikroskopi (Philips 505 SEM). Analysene viser at cellene har intercellulære forbindelser som er karakteristiske for epitelcellene. 5. d. Alkalisk fosfatase: Alkalisk fosfataseaktiviteten til cellene fra DSM ACC2258-linjen blir bestemt ved hjelp av Sigma kommersielle sett som reproduserer metoden beskrevet av Dahlquist et al. (Analytical Biochemistry, 22,99-107,1968). Resultatene presentert i figur 2 viser at cellene fra DSM ACC2258-linjen (Ocl 1, Ocl2, Ocl4) uttrykker en fosfataseaktivitet som kan sammenlignes med den til humane tarmepitelcancercellene CaCO-2, men høyere enn humane tarmepitelcancercellene HT-29. Resultatene C, Q, D, H, P vedrører andre human tarmepitellinjer presentert i eksempel 2. 5. e. Cvtokrom P45Q: Ekspresjon av cytokromer av cellene fra DSM ACC2258-linjen blir analysert ved hjelp av kjent RT-PCR teknikk ved anvendelse av DNA primerne spesifikke for forskjellige cytokromer P4S0. Disse primerne ble konvensjonelt dannet fra DNA sekvensen til forskjellige cytokromer tilgjengelig fra genbankdatabasen (CYP1A1: aksesjonsnummer X02612: CYP2C, aksesjonsnummerM61855 eller M61858 eller M61856 eller MM61854; CYP2D6: aksesjonsnummer M33388; CYP2E1: aksesjonsnummer J02843; CYP3A5: aksesjonsnummer J04813; CYP1A2: aksesjonsnummer Z00036; aksesjonsnummer M33318; CYP2B6: aksesjonsnummer M29874).

Cellene blir følgelig dyrket helt til de blir konfluente på 35 mm skåler (Costar), RNA blir ekstrahert ved hjelp av RNA easy-kit (Qiagen), en revers transkripsjon blir utført (første tråd cDNA syntese-sett for RT-PCR, Boehringer Mannheim) komplementært DNA oppnådd blir utsatt for en PCR-amplifisering ved anvendelse av DNA-primere spesifikke for forskjellige cytokromer P450, amplifiseringsproduktene blir deretter separert på en agarosegel og de blir visualisert under UV i nærvær av etidiumbromid.

Resultatene viser at celler uttrykker cytokromene CYP1A1, CYP2C, CYP2D6, CYP2E1 og CYP3A5. Derimot er cellene negative for cytokromene CYP1A2, CYP2A6 og CYP2B6. Ekspresjon av cytokrom CYP3A5 blir også bekreftet ved Westem-analyser av et proteinekstrakt fra DSM ACC2258-celler ved hjelp av et anti-CYP3A5 polyklonalt antistoff (Oxygene, USA). 5. f. Enz<y>mer involvert i cellulær oksidasjon og detoksifiserine av elektrofiler: Celler fra DSM ACC2258-linjen blir dyrket, RNA blir ekstrahert ifølge Chomczynski et al. method (Anal. Biochem., 162,156-159,1987), DNA prober blir dannet fra DNA-sekvensene til Cu/Zn-superoksid dismutase (SOD), glutation peroxidase (GP), katalase (CA), glutation-S-transferase (GST) og quinon reduktase (QR), som er tilgjengelig i genbankdatabasen (GST: aksesjon nr. X08058; GP: aksesjonsnummer M21304; CA: aksesjonsnummer M81578; aksesjonsnummer 729336; QR: aksesjonsnummer M81596 600), og deretter blir et Northern-blot utført på RNA med disse probene for å bekrefte transkripsjon av disse enzymene.

Resultatene viser at alle cellene uttrykker en transkripsjon av gener kodende for SOD-GP, CA, GST og QR-aktivitet. DSM ACC2258-linjen uttrykker derfor enzymer involvert i cellulær oksidasjon og detoksifisering av elektrofiler.

6. Ekspresjon av markører spesifikke for epitelcellene i human tarm.

6. a. Overflatevillositer: Som beskrevet i pkt. 5.c ovenfor viser analyser ved elektronmikroskopi av cellene klart tilstedeværelse av korte villi ved polen motsatt den som adherer til bæreren. 6, b. Sukrose- isomaltase: Sukrose-isomaltase er spesifikk for epitelcellene i human tarm. Tilstedeværelse av sukrose-isomaltase kan bli demonstrert på budbringer RNA-nivå ved RT-PCR-teknikken beskrevet ovenfor i punkt 5.e etter eksponering av en konfluent kultur av DSM ACC2258-celler i 481 til 1 ng/ml av human rekombinant TGF-P (Beton Dickinson). DNA-primerne blir konvensjonelt dannet fra DNA-sekvensen til sukrose-isomaltasegenet tilgjengelig på genbankdatabasen (aksesjonsnummer X63S97 S41833 S41836). 6. c. Dipepitidvlpeptidase IV: DPPIV er spesifikk for epitelcellene i human tarm. Tilstedeværelsen derav kan bli demonstrert på messenger RNA-nivå ifølge RT-PCR-teknikken beskrevet ovenfor i pkt. 5.e. DNA primerene blir konvensjonelt dannet fra DNA-sekvensen til DPPIV-genet tilgjengelig på genbankdatabasen (aksesjonsnummer Ul 3710-35). 6. d. Klasse JJ vevsforlikelighetskompleks: Epitelceller på tarmen kan uttrykke klasse II vevsforlikelighetskompleks (HLA antigener) i nærvær av y-interferon (y-IFN). DSM ACC2258-cellene blir dyrket i B50-medium, i nærvær av 100 U/ml rekombinante y-LFN (Boehringer Mannheim) etter 12,24, 36 og 48 t dyrkning. Cellene blir separert på en oppløsning omfattende 0.025% trypsin og EDTA (Gibco Life Technologie, USA) og de blir inkubert i nærvær av antistoffer spesifikke for HLA-DR-HLA-DP og HLA-DQ-antigener (Becton-Dickinson, USA), og de blir separert ved anvendelse av et flowcytometer (FACS can, Becton-Dickinson).

Resultatene presentert i figur 3 viser en ekspresjon av HLA-DP antigen fra 12 t kultur, med økende konsentrasjoner etter 24 og 481. Ekspresjon av HLA-DR blir observert etter 241 dyrkning med maksimale konsentrasjoner etter 36 og 481. Derimot blir HLA-DQ-antigenet ikke indusert og dette bekrefter observasjoner dannet på primære epitelceller i tarmen (Mayer et al.)

7. Adhesjon til mikroorganismer.

7. a. Adhesjon til stammen av bakterien CNCM- 1225: Human tarm blir kolonisert av et stort antall ikke-patogene bakterier, som lactobacilli og bifido bakteriene, og noen har evne til å adherere til villi i tarmslimhinnemembranen. Lactobacillus johnsonii stamme CNCM-1225, kjent for å adherere sterkt til epitelcellene i tarmkanalen (EP577904; Bernet et al.), og blir dyrket i 121 i et MRS-medium (Man, Rogosa and Sharpe, Biokar) omfattende 100 pC <3>Hadenin, i fravær av oksygen. DSK ACC2258-cellene blir dyrket i to uker helt til de blir konfluente, og de blir deretter inkubert 11 ved 37°C med 12-t MRS-medium beskrevet ovenfor, eller et friskt MRS-medium eller en fosfatbuffer pH 6.5 omfattende 4x10 o celler pr. ml avledet fra 12-t MRS-kulturen beskrevet ovenfor. DSM ACC2258-cellene blir vasket tre ganger med PBS, analysert med IM NaOH-oppløsning, og deretter blir radioaktivitetsintensiteten frigjort av cellene målt ved hjelp av en scintillasjonsteller.

For sammenligning blir stammen CaCO-2 dyrket på samme måte som beskrevet ovenfor og inkubert med stammen CNCM 1-1225 og den radioaktive intensiteten som blir frigitt fra cellene blir målt.

Resultatene presentert i tabell 2 nedenfor viser at DSM ACC2258-cellene har evne til å adherere CNCM 1-1225 bakteriene samt CaCO-2 cellene. Det er også å bemerke at kulturen av 12-h LA-1 stammen inneholder faktorer som fremmer adhesjonen av bakteriene. Det friske MRS-mediet som blir tilsatt bakterier utviser et lavere adhesjonsnivå. Det kan videre bli observert at en pH på 6.5 som er lik det som er tilstede i tarmkanalen in vivo også fremmer adhesjon av bakterier når det sammenlignes med adhesjonsnivået oppnådd med friskt MRS-medium som har en pH på 5.

Kapasiteten DSM ACC2258-linjen har til å beholde bakterien CNCM 1-1225 blir også målt ifølge metoden beskrevet av Bernet et al. (Gut, 35,483-489,1994). Antall bakterier som adhererer til 100 tarmceller blir bestemt visuelt. Et 12-t MRS kulturmedium, eller friskt MRS-medium omfattende 4x 10 celler pr. ml avledet fra 12-t MRS-kulturen blir anvendt. Analysen blir utført på tre preparater og 20 mikrografer blir tatt tilfeldig i hvert preparat som blir anvendt.

Til sammenlikning ble kapasiteten CaCO-2-linjen har til å beholde bakteriene CNCM 1-1225 målt på samme måte.

Resultatene presentert i tabellen nedenfor viser at linjen har evne til å beholde et betydelig antall bakterier. Det kan også bli bemerket at kulturen av 12-t LA-1 stammen inneholder faktorer som fremmer adhesjon av bakteriene. Friskt MRS-medium hvor det ble tilsatt bakterier gjør det ikke mulig å oppnå et slikt høyt adhesjonsnivå.

7. b. Adhesjon til Clostridium difficile og/ eller adherente bifidobakterier:

Kapasiteten til DSM ACC2258-linen må tilbakeholde bakteriene Clostridium difficile og adherente bifidobakterier beskrevet i Applied Env. Microb., 59,4121-4128,1993 og i EP577904 (Nestlé) er blitt analysert. Resultatene viser at linjen også har evne til å beholde et betydelig antall av hver bakterie. 8. Cvtokinekspresjon: Ekspresjon av cytokiner i cellene av DSM ACC2258-linjen, nærvær eller ikke av et inflammasjonsmiddel blir analysert ved hjelp av kjent RT-PCR-teknikk ved anvendelse av DNA primere spesifikke for forskjellig cytokiner. Disse primerene ble hensiktsmessig fremstilt fra DNA sekvensen til forskjellige cytokiner tilgjengelig på genbankdatabasen (aksesjonsnummer: TNFa: X02910; IL-Ip: M15840; IL-6: M14584; IL-8: M28130; IL-ra: M97748). Induksjon av betennelsen ble utført ved inkubering av linjen med mM histamin eller 20 ng/ml TPA i løpet av 241.

For sammenligning ble samme analysen utført med et normalt tarmvev, HT-29 og CaCO-2 tumorigene cellelinjer. Resultatene er presentert i tabell 4 nedenfor.

EKSEMPEL 2

De andre humane tarmepitel udødeliggjorte cellelinjene utviklet i eksempel 1 utviser karaktertrekk lignende de som er beskrevet ovenfor for DSM ACC2258-stammen. Som eksempel er alkalisk fosfataseaktiviteten til 5 andre linjer betegnet C, Q, D, H, P presentert i figur 2.

Claims (19)

1. Semmfritt kulturmedium egnet for dyrking og udødeliggjøring av epitelcellene i human tykktarm, omfattende uorganiske salter, glukose, natrium pyruvat, aminosyrer, BSA, etanolamin, fosforetanolamin, vitaminer og hormoner, karakterisert ved at mediet omfatter sporelementer, vitaminer bestående av vitamin C og retinoisk styre, og hormoner bestående av trijodtyrodin, deksametason, hydrokortison, bovint hypofysekjertelekstrakt, insulin, EGF og transferrin.

2. Kulturmedium ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet omfatter 1-100 nM sporelementer, 10-1000 nM retinoisk syre, 10-1000 nM trijodtyrodin, 0.1-50 nM deksametason, 1-100 nM hydrokortison, 1-100 pg/ml vitamin C, 1-100 ug/ml bovint hypofysekjertelekstrakt, 0.1-50 pg/ml insulin, 0.1-50 ng/ml EGF og 0.1-100 pg/ml transferrin.

3. Kulturmedium ifølge krav 1, karakterisert ved at de uorganiske saltene blir valgt fra gruppen bestående av natriumklorat, kaliumklorat, kaliumsulfat, kalsiumklorat, dibasisk natriumfosfat, natrium bikarbonat, jernnitritt, amonium metevanadat, ammonium molybdat, kobbersulfat, magnesiumklorat, manganklorat, nikkelsulfat, natriumacetat, natriumpyruvat, natriumselenitt, natrium-silikat, tinnklorat og sinksulfat.

4. Kulturmedium ifølge krav 1, karakterisert ved at vitaminene blir valgt fra gruppen dannet av kalsium D-pantotenat, kolinklorat, folinsyre, inositol, nikotinamid, pyridoksin, riboflavin, tiamin, biotin og cyano-kobalamin.

5. Kulturmedium ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet omfatter mindre enn 8 pM kalsium.

6. Kulturmedium ifølge krav 1, karakterisert ved at det har sammensetningen B50 definert i tabell 1.

7. Fremgangsmåte for udødeliggjøring av epitelcellene i human tykktarm, karakterisert ved at en kultur av primære epitelceller avledet fra den humane tykktarmen blir fremstilt, kulturen blir infisert med et rekombinant virus, og udødeliggjorte celler blir dyrket i serumfritt kulturmedium ifølge ett av kravene 1 til 6.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at de primære epitelcellene blir dyrket i serumfritt kulturmedium ifølge ett av kravene 1 til 6.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at kulturen blir infisert med et rekombinant SV40 T-Ag-virus inneholdende en del av MuLV-retroviruset.

10. Fremgangsmåte for identifisering av den mutagene, toksiske eller fordelaktige effekten til et middel for metabolismen til cellene i tarmkanalen in vitro, karakterisert ved at (1) et middel antatt å være et mutagent, toksisk eller fordelaktig middel for metabolisme av cellene i tarmkanalen blir omsatt, dyrket eller brakt i kontakt med en kultur omfattende en cellelinje ifølge ett av kravene 11 til 16 og (2) effektene av nevnte middel på nevnte cellelinje blir bestemt eller målt.

11. Humane kolon epitelcellelinjer udødeliggjort ved anvendelse av et rekombinant virus, der cellelinjen er i stand til å formere seg i minst 40 påfølgende passasjer, mangler tumormarkører, uttrykker metabolske markører spesifikke for ikke-udødeliggjorte, humane epitelceller og metabolske differensieringsmarkører spesifikke for ikke-udødeliggjorte, humane kolonepitelceller, er i stand til å adherere, in vitro, til melkesyrebakteriestammen CNCM 1-1225, og er i stand til å frembringes ifølge en fremgangsmåte ifølge kravene 7 til 10, med den forutsetning at dette ekskluderer cellelinjer som er oppnådd ved en fremgangsmåte for å oppnå en hovedsakelig ren, udødeliggjort human epitelcellelinje, som omfatter (a) frembringelse av en primær kultur av humane epitelceller oppnådd ved anvendelse av et fibroblast-samdyrkingssystem omfattende en første populasjon av celler omfattende en kultur av humane fibroblaster på et substrat i et egnet medium, et støttemateriale slik som en membran der støttematerialet er plassert over fibroblastkulturen, og en annen, heterogen populasjon av celler tilført støttematerialet og omfattende humane epitelceller, (b) utsåing av en tredje populasjon av celler omfattende en kultur av humane fibroblaster på et annet substrat i et egnet medium, (c) selektiv løsning av ikke-epiteliale celler fra substratet ved å inkubere samkulturen med et egnet løsrivelsesmiddel for en tidsperiode tilstrekkelig for å løsne ikke-epiteliale celler fra substratet uten å løsne en vesentlig mengde av epitelcellene, (d) plassering av støttematerialet over fibroblastkulturen oppnådd i trinn (b), slik at en hovedsakelig ren epitelcellestamme opprettholdes på støttematerialet, og (e) udødeliggjøring av den hovedsakelige rene epitelcellestammen med minst en retrovirusvektor som har en ekspresjonskassett omfattende et nukleinsyremolekyl som koder for et papillomavirus polypeptid valgt fra gruppen bestående av E6 og E7 og kombinasjoner av disse, og kontrollsekvenser som dirigerer transkripsjonen av nukleinsyremolekylet slik at sekvensen kan transkriberes og translateres i den transfekterte cellelinjen.

12. Udødeliggjort linje ifølge krav 11, karakterisert ved at den uttrykker, som metabolsk markør spesifikk for ikke-udødeliggjorte humane epitelceller, minst to markører valgt fra gruppen dannet av cytokeratiner, koblinger mellom celler, alkalisk fosfatase, cytokromene P450, en glutation-S-transferase, quinon reduktase, Cu/Zn-superoksid dismutase, glutation peroksidase og en katalase.

13. Udødeliggjort linje ifølge krav 11, karakterisert ved at den uttrykker, som metabolsk differensieringsmarkør, minst to markører valgt fra gruppen dannet av overflatevilli, sukrose isomaltase, klasse II vevsforlikelighets-komplekset og dipeptidylpeptidase IV.

14. Udødeliggjort linje ifølge krav 13, karakterisert ved at den uttrykker HLA-DR- og HLA-DP-antigener fra klasse II vevsforlikelighets-komplekset, og som ikke uttrykker HLA-DQ-antigenet til nevnte kompleks, i nærvær av human gamma-interferon.

15. Udødeliggjort linje ifølge krav 11, karakterisert ved at den har evnen til å adherere in vitro til melkesyrebakteriestammen CNCM 1-1225 i et forhold på minst 80 bakterier pr. 100 tykktarmsepitelceller.

16. Udødeliggjort linje ifølge krav 11, karakterisert ved at den har deponeringsnummer DSM ACC2258.

17. Diagnostisk sett, karakterisert ved at det omfatter de udødeliggjorte epitelcellene i human tykktarm ifølge ett av kravene 11 til 16, kulturmediet ifølge ett av kravene 1 til 6 og reagenser for å bestemme en metabolsk respons av nevnte celler overfor mutagene, toksiske eller fordelaktige midler med hensyn på metabolismen til cellene i tarmkanalen.

18. Anvendelse av udødeliggjorte epitelceller fra human tykktarm ifølge ett av kravene 11 til 16 i fremgangsmåte for identifikasjon av mutagene, toksiske eller fordelaktige midler for metabolisme til cellene i tarmkanalen.

19. Anvendelse av udødeliggjorte epitelcellene i human tarm ifølge ett av krav 11 til 16 for fremstilling av et aktivt farmasøytisk middel.