JP3931212B2 - ヒト上皮大腸不死化細胞株 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明の目的は、新規なヒト上皮大腸不死化細胞株、この細胞株を得るための方法、および、特に腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有する物質の同定方法におけるこの細胞株の使用に関する。
【0002】
【従来の技術】
長年の間、例えば感染症、炎症または癌のようなヒトの疾患の研究に適したヒト細胞株の開発が試みられてきた。疾患の発生にしばしば関係する細胞には、上皮細胞、特に人体の環境に対して、および特に食事の条件に対して感受性のある腸管の上皮細胞がある。
【0003】
上皮細胞は、人体の他の細胞とは、例えば、サイトケラチン(モル(Moll)ら、Cell,31,11−24,1982)、細胞間の結合組織(グンビネル(Gumbiner)ら、Cell,69,385−387,1992)、小腸に特異的なアルカリ性ホスファターゼ(ヅデジャ(Dudeja)ら、Gastroenterology、105、357−366、1993)、サイトクロームP450(メルキュリオ(Mercurio)ら、Biochem.Biophy.ResearchCommunications,210,No.2,350−355,1995;マキノン(McKinnon)ら、Gut,36,259−267,1995)、細胞酸化防御に関与する酵素(Cu/Zn−スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラーゼ;アルベース(Albers)ら、Toxicology and Applied Pharmacology,109,507−513,1991)、および/または親電子物質の無毒化(グルタチオン−S−トランスフェラーゼおよびキノンリダクターゼ;チェネビックス−トレンチ(Chenevix-Trench )ら、Carcinogenesis,16,No.7,1655−1657,1995)、およびビメンチン(リチャード(Richard )ら、Arch.Dematol.Res.,282,512−515,1990)のような、主に上皮細胞中に存在する化合物または構造の発現において異なる。
【0004】
さらに、ヒト腸管の上皮細胞はインビトロで乳酸菌に粘着することができる(バーネット(Bernet)ら、Gut,35,483−489,1994;US 5,032,399)。
【0005】
最後に、ヒト大腸の上皮細胞はまた、例えば、表面絨毛組織(フリードリッヒ(Friedrich )ら、Bioassays,12,No.9,403−408,1990)、ショ糖イソマルターゼ(ギブソン(Gibson)ら、Gut,35,791−797,1994;ポール(Paul)ら、Am.Pysio.Soc.,C266−C278,1993)、いくつかのクラスII主要組織適合抗原(MHCクラスII抗原)(メイアー(Mayer )ら、Gastroenterology,100,3−12,1991)、およびジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV;ハウリ(Hauri )ら、J.Cell.Biol.,101,836−851,1985)のような、ヒト腸管の上皮細胞に主に存在する化合物または構造の発現において、他のヒト上皮細胞とは異なる。
【0006】
ヒト大腸の上皮細胞株の調製は、ヒト腫瘍細胞の選択により行われる。例えば、スタウファー(Stauffer)らは、p53突然変異を有し、特に腫瘍抗原CEAを発現する2つの株NCM356とNCM425の選択を記載している(TheAmerican jounal of surgery,169,190−196(1995))。これらの細胞は、腫瘍化(tumorigenic transformation)段階であり、上皮細胞の腫瘍化の発生の研究にとって興味深い。
【0007】
ヒト大腸癌から単離される他のヒト大腸上皮細胞株も公知であり、例えば、CaCO−2株(ATCC HTB37;フォー(Fogh)ら、J.Natl.Cancer Inst.,58,209−214,1977)およびHT29株(ATCC HTB38;フォー(Fogh)ら、Human tumour Cells In Vitro,145−159,1975)がある。
【0008】
正常細胞を不死化すること、すなわち無限に増殖できるようにすることもできる。正常細胞は、10継代以上は生存しない。そのため、細胞のトランスフェクション法では、特別に適応させたベクター、例えばラージT抗原(アール・ディー・ベリー(R.D. Berry)ら、Br.J.Cancer,57,287−289,1988)の配列よりなるSV40ベクター、またはヒトパピローマウイルス(US 5,376,542)のDNA配列よりなるベクターの助けを借りる方法が一般的に使用される。
【0009】
サンダーソン(Sanderson )らは、胎児の小腸の正常細胞を不死化した(Int.Arch.Allergy Immunol.,107,396−397,1995)。しかし、これらの細胞はまだ、生理学的に正常の成人細胞とは異なる。
【0010】
現在まで、成人大腸の正常上皮細胞の不死化は報告されていない。不死化技術は知られていても、ヒト細胞を不死化して、腫瘍化の兆候を示さずに元々の性質を保存する最適条件を見つけることは非常に困難である。
【0011】
不死化細胞を増殖させる条件の1つは、特定の培地でのそれらの増殖である。文献に記載されている培地は、それぞれのタイプの細胞に特異的であり、他のタイプの細胞には簡単に応用できない。例えば、ギブソン(Gibson)ら(Gut,35,791−797,1991)、ファイファー(Pfeifer )ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,5123−5127,1993)、およびクルカニ(Kulkani )ら(Carcinogenesis,16,No.10,2515−2521,1995)に記載された無血清培地を挙げることができる。
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒト大腸の正常上皮細胞に遺伝的かつ生理学的に関連する新規のヒト大腸上皮細胞株を、両者を区別することが困難な程度まで、提供することである。特にこれらの細胞株は、腫瘍マーカーを発現しない。これらの細胞株はさらに、ヒト大腸の正常の上皮細胞に存在する多くの特異的なマーカーを発現する。
【0013】
【課題を解決するための手段】
この目的のために、本発明は、腫瘍マーカーを発現せず、非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、およびヒトの大腸の非不死化上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーを発現し、インビトロで乳酸菌CNCM I−1225株に粘着することができる、ヒト上皮大腸不死化細胞株に関する。
【0014】
本発明の目的はまた、例えばヒト大腸の上皮細胞の培養物と不死化に適応させた無血清培地である。この培地は、例えば無機塩、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、BSA、ホスホリルエタノールアミン、エタノールアミン、ビタミン、およびホルモンのような、動物細胞の培養に使用される無血清培地に通常見いだされる成分を含む。この培地は、さらに微量元素、ビタミンCとレチノイン酸よりなるビタミン、トリヨードチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、ウシ下垂体抽出物、インスリン、上皮増殖因子(EGF)およびトランスフェリンよりなるホルモンのいくつかの新規の組合せを含む。
【0015】
本発明の別の面は、ヒト大腸の上皮細胞の新規な不死化方法であって、ヒト大腸から得られる初代上皮細胞の培養物を調製し、培養物を組換えウイルスで感染させ、不死化細胞を前記した無血清培地で培養する上記方法に関する。
【0016】
本発明の別の面は、腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性を確認する方法であって、(1)腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有することが疑われる物質を、前記細胞株を有する培養物と反応、培養または接触させ、そして(2)該細胞株に対するこの物質の作用を定量または測定する上記方法に関する。
【0017】
本発明はまた、前記のヒト大腸の不死化上皮細胞、前記の培地、および突然変異誘発性、毒性または有効性物質の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キットに関する。
【0018】
最後に本発明の目的はまた、腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有する物質の同定方法における、前記細胞株の使用、および活性薬剤としてのその細胞株の使用である。
【0019】
【発明の実施の形態】
本発明において、「正常細胞」、「初代細胞」または「非不死化細胞」という表現は、有害な生理学的または遺伝学的欠陥のない健常成人の大腸から集めることができ、かつ元々の分化特性を失わず限定された時間培養することができる、ヒト大腸の上皮細胞を意味する。
【0020】
一方、「不死化細胞」という表現は、無限に(例えば、60継代以上)増殖することができるように、DNA構築体により遺伝子操作を受けた細胞を意味する。すなわち、スタウファー(Stauffer)らにより選択された腫瘍細胞、またはCaCO−2株およびHT29株は、本発明により不死化された細胞と考えられる。
【0021】
同様に、「継代」という用語は、細胞株のコンフルエントな培養物の一定分割量を取り、新鮮な培地に接種し、そしてコンフルエンスすなわち飽和が得られるまで、その細胞株を培養することよりなる方法を意味する。すなわち、細胞株は伝統的に、新鮮な培地中で連続的に継代して培養される。数回継代すると元々の分化特性を失うこともあることに注意すべきである。従って、何回継代しても(好ましくは少なくとも60継代)その特性を保存している細胞株を得ることは非常に有益である。
【0022】
最後に、「元々の分化特性」という表現は、ヒト上皮細胞上に特異的に見いだされるマーカー、およびヒト大腸上皮細胞上に特異的に見いだされる分化マーカーの両方を意味する。
【0023】
本発明のヒト上皮大腸不死化細胞株は腫瘍マーカーを発現せず、すなわち発癌性突然変異を有さないかもしくはメッセンジャーRNA(mRNA)を発現せず、または癌細胞への細胞の形質転換に特徴的な分化した細胞構造および/もしくはタンパク質を有さない。これらのマーカーの存在は、例えば放射標識プローブを用いるハイブリダイゼーションまたはmRNAのRT−PCRにより検出される。細胞中のマーカーの存在は、その細胞が、免疫防御のないマウスに対して、数ヶ月後癌を引き起こすことができることを意味せず、それらの元々の細胞と比較した細胞の腫瘍化を反映している。
【0024】
好ましくは本発明の細胞株は、p53突然変異(ラビガー(Lavigeur)ら、Mol.Cell.Biol.,9,3982−3991,1989;ドネハウアー(Donehower )ら、Nature,356,215−221,1992)、癌胎児性抗原(CEA;スタウファー(Stauffer)ら)、および/またはAPC遺伝子の突然変異(腺腫様結腸ポリープ症;ハーゲスト(Hargest )ら、Gut,37,826−829,1995)を有さない。
【0025】
一方本発明の上皮細胞株は、正常ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカーを発現する。これらのマーカーは、例えば皮膚、目、腸管、または肝臓から得ることができるヒト上皮細胞の大部分にのみ一般的に見いだされる、メッセンジャーRNA(mRNA)、タンパク質、および/または分化した細胞構造でもよい。従って本発明のヒト上皮細胞は、異なる型の上皮細胞に見いだされる少なくとも2つのマーカーを発現する。好ましくは本発明の細胞は、少なくともサイトケラチン、細胞間の結合組織(タイトジャンクション("tight junctions" )とも呼ぶ)、小腸アルカリ性ホスファターゼ、サイトクロームP450、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、キノンリダクターゼ(QR)、Cu/Zn−スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GP)およびカタラーゼ(CA)から形成される群から選択される上記マーカーを発現する。
【0026】
従って本発明の細胞株は、細胞酸化に関与する酵素(SOD、GPおよびCA)、および/または親電子物質の無毒化に関与する酵素(GSTおよびQR)を発現する。従ってこれらの細胞株は、ヒト大腸の粘膜の炎症または過敏性の現象の研究に特に適している。
【0027】
本発明の細胞株はまた、ヒト大腸の非不死化上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーも発現する。これらのマーカーは、大腸の上皮細胞にのみ見いだされるmRNA、タンパク質または分化した細胞構造でもよい。好ましくは本発明の細胞株は、代謝分化マーカーとして、表面絨毛組織、ショ糖イソマルターゼ、大腸上皮細胞に特異的なMHCクラスII抗原、およびジペプチジルペプチダーゼIVから形成される群から選択される少なくとも2つのマーカーを発現する。
【0028】
同様に、本発明の細胞株は好ましくは、ヒトガンマ−インターフェロンの存在下で、MHCクラスII抗原のHLA−DRおよびHLA−DP抗原を発現するが、HLA−DQ抗原を発現しない(HLA−DQの発現は腫瘍形成性と関連付けられている)。
【0029】
本発明の細胞株はまた、インビトロでラクトバシラス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)CNCM I−1225株に粘着することができる。このために、乳酸菌の培養物は、本発明の細胞株のコンフルエントな培養物上に広げ、コンフルエントな培養物を洗浄し、次にこの細胞株の絨毛組織に粘着している細菌の数を数えなければならない。好ましくは本発明の細胞株は、本発明の100個の大腸細胞当たり少なくとも80個の細菌の割合でインビトロで乳酸菌CNCM I−1225株に粘着することができる(特に80〜200)。
【0030】
本発明の細胞株はまた、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile )にインビトロで粘着し、および/または他の粘着性乳酸菌、例えばビフィドバクテリア(bifidobacteria)、特にパスツール研究所(Pasteur Institute )(パリ、フランス)に寄託され、それぞれ寄託番号CNCM I−1226、CNCM I−1227、およびCNCM I−1228を受けている、Applied Env.Microb.,59,4121−4128,1993およびEP577904(ネッスル(Nestle))に記載のビフィドバクテリア(bifidobacteria)に粘着することができる。
【0031】
本発明の細胞株はまた、炎症物質に接触した後、多くのサイトカイン(例えば、サイトカインIL−1β、IL−1Ra、TNFα、IL−6およびIL−8)を発現することができる。
【0032】
本発明はまた、特に1996年4月16日にドイツ微生物および培養物寄託機関(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen)(マシェローダー・ヴェーグ(Mascheroder Weg )1b、D−38124、ブラウンシュバイク(Braunschweig)、ドイツ)に寄託され、寄託番号DSM ACC2258を受けている本発明の不死化細胞株に関する。
【0033】
本発明のヒト大腸上皮細胞株は、繰り返し(特に、少なくとも40〜80回)継代した後も元々の分化特性を有効に保存している。しかし、40回継代した後は、またはそれ以前でも、染色体の断片の喪失のために細胞株の核型が変化することがあることに注意すべきである。しかし、これらの細胞株は一般的に、同じ完全なセットの各染色体対を保存し、これにより元々の分化特性の発現が保存される。
【0034】
本発明の別の面は、本発明のヒト大腸の上皮細胞の培養物および不死化に適応させた無血清培地に関する。培地は特に、繰り返し継代しても無限に本発明の元々の分化特性を維持するように適応される。他の培地を使用すると、本発明の細胞株は、数回の連続した継代(例えば、5〜10回の継代)後にその元々の分化特性を喪失するかも知れない。この培地はまた、本発明の細胞株を継続して不死化するのに必須である。従ってその特徴的構成成分の1つが抑制されると、一般的に本発明の大腸の上皮細胞の不死化が失われる。
【0035】
この培地は、通常無血清の動物細胞培養培地に存在する成分、すなわち無機塩、グルコース、緩衝液(ヘペス、例えば:バイオフルーイッズ(Biofluids ))、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、BSA、ホスホリルエタノールアミン、エタノールアミン、ビタミン、およびホルモンを含有してもよい。DMEM培地(バイオフルーイッズ社(Biofluids Inc.)、米国)のような市販の培地は、この培地の調製のためのベースにすることができる。
【0036】
本発明の培地の新規性は、その成分のいくつかの新しい組合せであり、通常必要とされる他の化合物は当業者に公知の範囲内で変化し得る。これらの必須成分は、微量元素、ビタミンCとレチノイン酸よりなるビタミン、ならびにトリヨードチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、ウシ下垂体抽出物、インスリン、EGFおよびトランスフェリンよりなるホルモンである。
【0037】
すなわちこの培地は、1〜100nMの微量元素、10〜1000nMのレチノイン酸、10〜1000nMのトリヨードチロニン(T3)、0.1〜50nMのデキサメタゾン、1〜100nMのハイドロコーチゾン、1〜100μg/mlのビタミンC、1〜100μg/mlのウシ下垂体抽出物、0.1〜50μg/mlのインスリン、0.1〜50ng/ml のEGFおよび0.1〜100μg/mlのトランスフェリンを含んでよい。
【0038】
微量元素は、例えばセレン、マンガン、ケイ酸塩、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、およびこれらの塩により形成される群から選択される化合物が選択される。
【0039】
培地に通常含有される無機塩のうち、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、硫酸カリウム、塩素酸カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、重炭酸ナトリウム、亜硝酸第二鉄、メタバナジン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸第二銅、塩素酸マグネシウム、塩素酸マンガン、硫酸ニッケル、酢酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩素酸スズ、および硫酸亜鉛から形成される群からの塩が選択される。
【0040】
特に培地は、混入する繊維芽細胞の成長を阻害するために80μM未満のカルシウムを含有するように注意すべきである。しかし、カルシウム濃度は1mMまで上げることができ、これはいくつかの実験では必要であった(ジャンクションタンパク質の分極と発現)。数回の継代後は、それ以上繊維芽細胞を増殖させる危険はなく、これは初代細胞の処理による初期混入物質であるかも知れない。
【0041】
同様に、培地に通常含有される他のビタミンは、例えば、D−パントテン酸カルシウム、塩素酸コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビオチンおよびシアノコバラミンから形成される群から選択される他のビタミンが選択される。
【0042】
最後に、本発明の細胞株を継続して得ることを可能にする培地は、好ましくは下記の表1に記載の組成物B50を有する。
【0043】
本発明の別の面は、ヒト大腸の上皮細胞の不死化方法であり、ここでヒト大腸から得られる初代上皮細胞の培養物を調製し、その培養物を組換えウイルスで感染させ、不死化細胞を前記の無血清培地中で培養する。
【0044】
その前に、好ましくは以下の工程が使用される:
(1)ヒト大腸の上皮組織の試料を得る;
(2)この試料を、インビトロで培養するために調製する;
(3)上皮細胞を無血清培地に接種し、細胞の付着とその増殖を促進するコーティングを有する培養プレートに接種する;
(4)コンフルエントな増殖を最適化するために、培地を必要に応じてできるだけ頻繁に交換する;
(5)細胞に組換えウイルスを感染させる;
(6)そして、不死化細胞を、前記の無血清培地で培養する。
【0045】
さらに詳細には、工程1)は、腸管の手術時の健常人からの大腸細胞試料の入手に関する。工程2)において、試料を培地で洗浄し、小片に切り、物理的および/または化学的手段により上皮部分を他の組織から分離する。例えば、組織の小片を、0.5%トリプシンと0.1%EDTAを含有する溶液に、細胞の分離を達成するのに充分な時間入れ、次にトリプシンインヒビターを数分間加え、最後に培地(好ましくは、前記の培地)を加える。
【0046】
工程3)では、上皮細胞を、プレートの無血清培地、好ましくは前記の無血清培地に接種する。培養プレートは好ましくは、フィブロネクチン、BSAおよびI型コラーゲン(レクナー(Lechner )ら、J.Tissue Cult.Meth.,9,43−48,1985)よりなるコーティングを有する。
【0047】
工程4)では、上皮細胞を含有する培地を、コンフルエントな増殖を最適化するために必要に応じてできるだけ頻繁に交換する。好ましくは培地を1日置きに交換する。利用可能な表面積の90%のオーダーのコンフルエンスに達した後(これは、通常接種後10日目に起きる)、細胞をトリプシンとEDTAの溶液で処理して分離する。
【0048】
分離した細胞を工程5)で、好ましくは前記のコーティングを有する培養プレートの、例えば前記の感染培地に移す。次に細胞を組換えウイルスを用いて従来法に従って感染させる。当業者は非常に多くのトランスフェクション法を利用できる。例えば、WO96/07750、クラウディア・チェン(Claudia Chen)ら(Mol.and Cell.Biol.,7,2745−2752,1987)、またはウィルソン(Wilson)ら(Analytical Biochemistry,226,212−220,1995)に記載の方法がある。
【0049】
好ましくは、T抗原(T−Ag)、不活性化ウイルス複製開始点(MuLVレトロウイルス)、および選択可能な遺伝子を含有する組換えSV40ウイルスが使用される。例えば、図1に記載の構築体が使用され、その配列はジーンバンク(GeneBank)データベースから入手できる(受け入れ番号M64753号;ストックシュレーダー(Stockshlaeder )ら、Human Gen.Therapy,2,33−39,1991)。他の適当なベクターは、例えば、T−Agをコードする遺伝子、選択可能な遺伝子および/またはヒト複製開始点を含む市販のベクターから、当業者は容易に作製可能であろう。例えば、T−Agをコードする遺伝子を含有するプラスミドATCC37460およびATCC37640がある。
【0050】
工程6)では、上皮細胞を好ましくは前記のコーティングを含む培養プレートの新鮮な増殖培地に移す。
【0051】
本発明の上皮細胞株の元々の性質を知ると、免疫学的、薬学的および毒性研究において、その応用が予想できる。
【0052】
すなわち、本発明の細胞株は、例えば(1)腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有することが疑われる物質を、本発明の細胞株を有する培養物と反応、培養または接触させ、そして(2)細胞株に対する物質の作用を定量または測定する方法における、腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性をスクリーニングするのに特に適している。
【0053】
従って、本発明の上皮細胞、本発明の培地、および突然変異誘発性、毒性または有効性物質の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キットの調製も予想される。
【0054】
本発明の細胞株はまた、組換えタンパク質の発現に適する。外来DNAのトランスフェクション法は、現在当業者に公知である(例えば、WO94/05472を参照)。
【0055】
本発明の細胞株はまた、体外(ex vivo )での遺伝子治療に有用な可能性がある。これらの細胞株は、治療的応用を目的とする遺伝子を発現する組換え細胞の成長のための適切な手段である。本発明の細胞株により提供される1つの利点は、これらは動物の血清に接触されないため、ウイルスまたは他の病原体により汚染される危険性を大きく低下させる。
【0056】
本発明の細胞株の調製の実施例に関して、以下の追加の記載により、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、まず使用される培地を記載し、次に比較例を示す。しかしこれらの例は例示目的であって、本発明を限定するものではない。細胞株、SV40の調製、トランスフェクションおよびマーカーの発現の解析は、他に特に記載しない場合は、サムブルーク(Sambrook)らのマニュアル(分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press )、米国、1989)に従って行われる。記載したパーセントは、他に特に記載しない場合は、重量%である。
【0057】
【表1】
培地: 表1
─────────────────────────────────
成分 培地A50 培地B50
─────────────────────────────────
無機塩
NaCl 6.400 g/l 6.400 g/l
KCl 0.400 g/l 0.400 g/l
MgSO4 −7H2 O 0.200 g/l 0.200 g/l
CaCl2 0.200 g/l 0.200 g/l
NaH2 PO4 −H2 O 0.13 g/l 0.13 g/l
NaHCO3 3.7 g/l 3.7 g/l
Fe(NO3 )2 −9H2 O 0.0001g/l 0.0001g/l
他の成分
グルコース 4.50 g/l 4.50 g/l
ヘペス 20 mM 20 mM
フェノールレッド 0.010 g/l 0.010 g/l
ピルビン酸ナトリウム 0.110 g/l 0.110 g/l
BSA 0.3 % 0.3 %
PE 0.5 μM 0.5μM
アミノ酸
L−アルギニン−HCl 0.0840g/l 0.0840g/l
L−シスチン 0.0480g/l 0.0480g/l
L−グルタミン --- 2 mM
グリシン 0.0300g/l 0.0300g/l
L−ヒスチジン−HCl−H2 O 0.0420g/l 0.0420g/l
L−イソロイシン 0.1048g/l 0.1048g/l
L−ロイシン 0.1048g/l 0.1048g/l
L−リジン−HCl 0.1462g/l 0.1462g/l
L−メチオニン 0.0300g/l 0.0300g/l
L−フェニルアラニン 0.0660g/l 0.0660g/l
L−セリン 0.0420g/l 0.0420g/l
L−スレオニン 0.0952g/l 0.0952g/l
L−トリプトファン 0.0160g/l 0.0160g/l
L−チロシン 0.0720g/l 0.0720g/l
L−バリン 0.0936g/l 0.0936g/l
ビタミン
D−カルシウム−パントテン酸 0.004 g/l 0.004 g/l
塩化コリン 0.004 g/l 0.004 g/l
葉酸 0.004 g/l 0.004 g/l
イノシトール 0.008 g/l 0.008 g/l
ニコチンアミド 0.004 g/l 0.004 g/l
ピリドキシン−HCl 0.004 g/l 0.004 g/l
リボフラビン 0.0004g/l 0.0004g/l
チアミン−HCl 0.004 g/l 0.004 g/l
ビタミンC --- 0.030 g/l
レチノイン酸 10 nM 100 nM
微量元素 --- 10 nM
ホルモン
インスリン 0.005 g/l 0.005 g/l
EGF 1 ng/ml 1 ng/ml
トランスフェリン 0.005 g/l 0.005 g/l
T3 --- 100 nM
デキサメタゾン --- 1 nM
ハイドロコーチゾン --- 10 nM
ウシ下垂体抽出物 --- 0.038 g/l
抗菌剤
ファンジゾン(Fungizone ) 0.25 μg/ml 0.25 μg/ml
ペニシリン 2.5 U/ml 2.5 U/ml
ストレプトマイシン 5 μg/ml 5 μg/ml
ゲンタマイシン 10μg/ml 10μg/ml
───────────────────────────────────
(PE:ホスホリルエタノールアミンとエタノールアミンの混合物)
【0058】
比較例
ストックシュレーダー(Stockshlaeder )らにより記載され、T抗原をコードする遺伝子、プサイ遺伝子、選択マーカーヒスチジノール脱水素酵素(HSD)、およびLTRプロモーターを含んでなる、ベクターpLXSHD+SV40+(ジーンバンク(GeneBank)、受け入れ番号M64753号;ストックシュレーダー(Stockshlaeder )ら、Human Gen.Therapy,2,33−39)(図1に示す)を使用する。
【0059】
SV40ウイルスは、リンチとミラー(Lynch and Miller)の方法(J.Virol.,65,3887−3890,1991)に従って調製した。このために、外生(ecotropic )細胞株Psi2(マン(Mann)ら、Cell,33,153−159,1983)、および両性栄養性細胞株PA317(ATCC CRL9078)を、10%胎児牛血清含有DMEM培地(ダルベッコー(Dulbecco)、米国)中で、37℃で5%CO2 含有空気中で培養した。これらの細胞株は、250mMのCaCl2 と10μgのベクターpLXSHD+SV40+を用いて常法に従って別々にトランスフェクションし、48時間インキュベート後トリプシンで処理し、等量混合し、そして全体を37℃で5%CO2 含有空気中でインキュベートした。70%のコンフルエンスになるまで増殖させた後、ウイルスをPC−1(ベントレックス(Ventrex )、米国)で集めた。ろ過後(0.45μm、ミクロポア(Micropore ))、ウイルスの量をNIH3T3細胞(ATCC CRL1658)で測定した。
【0060】
S状結腸憩室の出現のため、69才の高齢女性から生検により大腸の初代細胞を得た。試料をDMEM培地で洗浄し、小片に切り、上皮部分を他の組織から分離し、プレート上の上皮細胞をDMEM培地に接種した。培養プレートを、5mgのヒトフィブロネクチン(シグマ(Sigma ))、5mlのビトロゲン(Vitrogen)100(コラーゲン社(Collagen Corp.)、パロアルト(Palo Alto )、カリホルニア州、米国)、50mlの0.1%BSA(バイオフルーイッズ(Biofluids ))、および残りのDMEM培地を含有する500mlの溶液でプレインキュベートした。コンフルエントな増殖を最適化するために、上皮細胞を含有する培地を必要に応じて頻回に交換した。
【0061】
1週間の培養後90%のオーダーのコンフルエンスに達した後、細胞を常法によりトリプシンとEDTAの溶液で処理して分離する。分離した細胞を、前記のコーティングを有する培養プレートに移し、前記のA50培地に移した。
【0062】
次に培養物を、前述のように調製したT抗原(T−Ag)を含有する8μg/mlのポリブレン(polybrene )と高力価のSV40ウイルス(105 〜107 CFU)の存在下で感染させた。2時間インキュベートした後、培養物をPBSで洗浄し、A50新鮮培地を加えた。
【0063】
残念ながら細胞は以後、増殖がゆっくりし過ぎて、ヒト大腸の上皮細胞に匹敵する増殖を示すクローンを選択することができなかった。
【0064】
実施例1
A50培地の代わりに表1に示したB50培地を使用した以外はまったく同様にして、ヒト大腸の上皮細胞を、前記比較例に示したように感染させた。
【0065】
ウイルスで2時間インキュベートした後、培地をPBSで洗浄し、新鮮なB50培地を加え、各継代でヘペス緩衝液(バイオフルーイッズ(Biofluids ))中の0.02%トリプシン、1%ポリビニルピロリドンおよび0.02%エチレングリコール溶液中で処理して細胞を分離するように注意して、新鮮なB50培地で連続的に継代して培養した。
【0066】
培養プレート上で成長する細胞コロニーのサイズを観察することにより、成長の早いものを選択した。こうして、6つのヒト上皮大腸不死化細胞株を選択することができ、このうち1つを1996年4月16日にドイツ微生物および培養物寄託機関(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSM)(マシェローダー・ヴェーグ(Mascheroder Weg )1b、D−38124、ブラウンシュバイク(Braunschweig)、ドイツ)に寄託し、寄託番号DSM ACC2258を受けた。
【0067】
1.DSM ACC2258株の核型の解析
40継代目に採取したDSM ACC2258株の4つの核型を調製する(マニュアル「ヒトの細胞遺伝学、ルーニイ,ディー・イー(Rooney DE )、チェプルコウスキー,ビー・エィチ(Czepulkowski BH )編、アイラールエルプレス(IRL Press )、オックスフォード、1986」に記載の方法、参考のため本明細書に引用される)。結果は、6つの異なる染色体が失われたかまたは傷害を受けたことを示す。従ってこの細胞株は、各対の染色体の1つの染色体をそのゲノム中に完全に保存する。細胞株の性はXO/XXである。1セットの染色体の喪失は、この細胞株の腫瘍化を示すものではないことに注意すべきである。
【0068】
2.DSM ACC2258株の腫瘍形成性
46継代目に採取した107 個のDSM ACC2258株を、スタウファー(Stauffer)ら(前述)の記載した方法に従って、免疫防御能力のない(「ヌード」)マウスに注入する。8ヶ月以上たっても腫瘍の形成は見られない。この細胞株の非腫瘍形成性は、この細胞株の非腫瘍化を示すものではない。例えば、スタウファー(Stauffer)らが記載したNMC456株は、ヌードマウス中で腫瘍を誘導しないが、腫瘍化に特徴的な腫瘍マーカーを発現する。
【0069】
3.DSM ACC2258株での腫瘍マーカーの発現
スタウファー(Stauffer)らの方法に従って、DSM ACC2258株が以下の腫瘍マーカーを発現するか否かを測定する:p−53突然変異、癌胎児性抗原(CEA)および腺腫様結腸ポリープ症(APC)遺伝子。
【0070】
結果はすべてのこれらのマーカーについて陰性であり、これはこの細胞株の非腫瘍化の状態を示す。
【0071】
4.DSM ACC2258株のウイルス汚染
DSM ACC2258株が、C型肝炎ウイルス(HSV)、B型肝炎ウイルス(HBV)および後天性免疫不全症ウイルス(HIV−1)により汚染されているか否かを測定する。
【0072】
HBVの解析のために、フェノールとクロロホルム溶液で処理して、次にエタノールで沈殿させて、約2×106 個の細胞からDNAを抽出する。次にDNA試料について、ウイルスのプレ−コア領域(リンチ(Lynch )ら、J.Virol.,65,3887−3890)に特異的なプライマーを用いるPCR増幅を行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。比較のために、10〜105 個のHBV(アナワ・バイオメディカル・サービシーズ・6・プロダクト(Anawa Biomedical Services 6 Product )、米国)を含有する血清の希釈物を、平行して同じ方法で解析する。
【0073】
HIV−1の解析のために、前述のDNA試料について、ウイルスのGAG領域に特異的なプライマーを用いてPCR増殖を行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。比較のために、10〜105 個のHIV−1(アナワ・バイオメディカル・サービシーズ・6・プロダクト(Anawa Biomedical Services 6 Product )、米国)を含有する血清の希釈物を、平行して同じ方法で解析する。
【0074】
HCVの解析のために、コムクジンスキー(Chomczynski )ら(Anal.Biochem.,162,156−159,1987)の方法により、約2×106 個の細胞からRNAを抽出する。常法に従って逆転写を行い、得られた相補的DNAについて、ウイルスの非コード5’領域に特異的なプライマーを用いてPCR増殖を行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。比較のために、10〜105 個のHCV(アナワ・バイオメディカル・サービシーズ・6・プロダクト(Anawa Biomedical Services 6 Product )、米国)を含有する血清の希釈物を、平行して同じ方法で解析する。
【0075】
結果は3つのウイルスの存在は陰性である。
【0076】
5.ヒト上皮細胞に特異的なマーカーの発現
【0077】
5.a.サイトケラチン:DSM ACC2258株の培養物の細胞を、100%冷メタノール溶液によりガラスプレートに付着させ、次にプレートを、0.05Mトリス(pH8.6)、1.8%NaClおよび0.2%ポリエチレングリコール2000を含有する緩衝液(TNP緩衝液)で洗浄する。次に細胞を、サイトケラチンに特異的なマウス抗体(抗−CHペプチド4、7、8、13、14、17、18、19、20、シグマ(Sigma )、米国)の存在下で30分インキュベートする。0.5%BSA含有TNP緩衝液で3回洗浄した後、免疫蛍光化合物を含むヤギ抗−マウスIgG抗体(1:300、FITCヤギ抗−マウスIgG;ビオシス(Biosys))でプレートを30分インキュベートする。前記緩衝液で3回洗浄した後、プレートを固定し、蛍光顕微鏡で解析する。すべての細胞はサイトケラチン7、8、および17について陽性である。
【0078】
5.b.ビメンチン:サイトケラチンの解析と同じ方法で、前記の固定細胞について、マウス抗−ビメンチン抗体(ダコ(DAKO)、米国)に反応させ、次に前記ヤギ抗マウスIgG抗体と反応させる。蛍光顕微鏡により、すべての細胞はビメンチンについて陽性である。
【0079】
5.c.細胞間の結合組織(タイトジャンクション):DSM ACC2258株の細胞をコンフルエンスになるまでガラスプレートで培養し、0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.4)中2.5%のグルタルアルデヒド溶液で室温で1時間処理して固定する。同じリン酸緩衝液で2回洗浄後、細胞を再び同じ緩衝液中2%のOsO4 溶液で固定する。次に細胞を、30、50、70、90および100%のエタノール(ポラロン・エクイップメント社(Polaron Equipment Ltd.)、ワットフォード(Watford )、英国)で連続的に脱水し、次に細胞を細かい金の層から回収する(SEMコーティングユニットE5100、ポラロン(Polaron ))。次に細胞を電子顕微鏡(フィリップス505SEM)により観察する。この解析は、細胞が上皮細胞に特徴的な細胞間結合組織を有することを示す。
【0080】
5.d.アルカリ性ホスファターゼ:DSM ACC2258株の細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性を、ダールキスト(Dahlquist )ら(Analytical Biochemistry,22,99−107,1968)の方法を再現するシグマ(Sigma )の市販キットを用いて測定する。図2に示す結果は、DSM ACC2258株の細胞(Oc11、Oc12、Oc14)は、ヒト大腸上皮癌細胞CaCO−2に匹敵するホスファターゼ活性を示すが、ヒト大腸上皮癌細胞HT−29より高い活性を示すことを示した。結果C、Q、D、H、Pは、実施例2に示す他のヒト大腸上皮細胞株に関連する。
【0081】
5.e.サイトクロームP450:DSM ACC2258株の細胞によるサイトクロームの発現を、異なるサイトクロームP450に特異的なDNAプライマーを用いて公知のRT−PCR法により解析する。これらのプライマーは、ジーンバンク(GeneBank)データベースから入手できる、異なるサイトクロームのDNA配列から調製することが便利である(CYP1A1:受け入れ番号X02612;CYP2C:受け入れ番号M61855またはM61858またはM61856またはM61854;CYP2D6:受け入れ番号M33388;CYP2E1:受け入れ番号J02843;CYP3A5:受け入れ番号J04813;CYP1A2:受け入れ番号Z00036;CYP2A6:受け入れ番号M33318;CYP2B6:受け入れ番号M29874)。
【0082】
このために細胞をコンフルエンスになるまで、35mmプレート(コスター(Costar))で培養し、RNAイージー(RNAeasy )キット(キアゲン(Qiagen))を用いてRNAを抽出し、逆転写を行い(RT−PCR用の1本鎖cDNA合成キット(1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR)、ベーリンガーマンハイム(Boehringer-Mannheim ))、得られた相補的DNAを異なるサイトクロームP450に特異的なDNAプライマーを用いてPCR増幅を行い、次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。
【0083】
結果は、細胞がサイトクロームCYP1A1、CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、およびCYP3A5を発現することを示す。一方、細胞は、サイトクロームCYP1A2、CYP2A6およびCYP2B6について陰性である。サイトクロームCYP3A5の発現はまた、抗−CYP3A5ポリクローナル抗体(オキシゲン(Oxygene )、米国)を用いて、DSM ACC2258細胞のタンパク質抽出物のウェスタンブロット解析により確認される。
【0084】
5.f.細胞性酸化と親電子物質の無毒化に関与する酵素:DSM ACC2258株の細胞を培養し、コムクジンスキー(Chomczynski )ら(Anal.Biochem.,162,156−159,1987)の方法により、RNAを抽出し、DNAプローブを、Cu/Zn−スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GP)、カタラーゼ(CA)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、およびキノンリダクターゼ(QR)のDNA配列(これらはジーンバンク(GeneBank)データベースから入手できる)から、DNAプローブを調製し(GST:受け入れ番号X08058;GP:受け入れ番号M21304;CA:受け入れ番号M81578;SOD:受け入れ番号729336;QR:受け入れ番号M81596_600)、次にこれらのプローブでRNAに対してノーザンブロッティングを行い、これらの酵素の転写を確認する。
【0085】
結果は、すべての細胞が、SOD、GP、CA、GSTおよびQR活性をコードする遺伝子の転写を発現することを示す。従ってDSM ACC2258株は、細胞の酸化と親電子物質の無毒化に関与する酵素を発現する。
【0086】
6.ヒト大腸の上皮細胞に特異的なマーカーの発現
【0087】
6.a.表面絨毛組織:前記5.c.に記載のように、電子顕微鏡による細胞の解析は、支持体に粘着するものとは反対の極に短い絨毛組織が存在することを明瞭に示す。
【0088】
6.b.ショ糖イソマルトース:ショ糖イソマルトースは、ヒト大腸の上皮細胞に特異的である。ショ糖イソマルトースの存在は、DSM ACC2258細胞のコンフルエントな培養物を1ng/ml のヒト組換えTGF−β(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))に48時間接触させた後、前記5.e.項で記載したようにRT−PCR法によるメッセンジャーRNAのレベルで証明することができる。DNAプライマーは、常法に従いジーンバンク(GeneBank)データベースから入手できるショ糖イソマルトース遺伝子のDNA配列(受け入れ番号X63597 S41833 S41836)から調製される。
【0089】
6.c.ジペプチジルペプチダーゼ IV:DPPIVは、ヒト大腸の上皮細胞に特異的である。その存在は、前記5.e.項で記載したようにRT−PCR法によるメッセンジャーRNAのレベルで証明することができる。DNAプライマーは、常法に従いジーンバンク(GeneBank)データベースから入手できるDPPIV遺伝子のDNA配列(受け入れ番号U13710−35)から調製される。
【0090】
6.d.MHCクラス II 抗原:大腸の上皮細胞は、γ−インターフェロン(γ−IFN)の存在下で、MHCクラスII抗原(HLA抗原)を発現することができる。このために、DSM ACC2258細胞を、B50培地中で、100U/mlの組換えγ−IFN(ベーリンガーマンハイム(Boehringer-Mannheim ))の存在下で、12、24、36、および48時間培養する。細胞を、0.025%トリプシンとEDTA(ギブコ・ライフ・テクノロジー(Gibco Life Technologie)、米国)を含む溶液により分離し、HLA−DR、HLA−DPおよびHLA−DQ抗原に特異的な抗体(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)、米国)の存在下でインキュベートし、フローサイトメーター(ファクスキャン(FACScan )、ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて分離する。
【0091】
図3に示す結果は、12時間の培養物からのHLA−DP抗原の発現を示し、24時間と48時間で濃度が上昇することを示す。24時間の培養後にHLA−DRの発現が観察され、36時間と48時間に最大濃度に達する。一方、HLA−DQ抗原は誘導されず、これは大腸の初代上皮細胞での観察結果(メイアー(Mayer )ら)を確認している。
【0092】
7.微生物への粘着
【0093】
7.a.細菌CNCM I−1225株への粘着:ヒトの小腸には無数の非病原性細菌が住み着いており、その中に乳酸菌およびビフィドバクテリア(bifidobacteria)があり、そのいくつかは小腸粘膜の絨毛組織に粘着している。小腸管の上皮細胞に強く粘着することが知られているラクトバシラス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)株CNCM I−1225(EP577904;バーネット(Bernet)ら)を、酸素の非存在下で、100μCの3Hアデニン(adenine)含有MRS培地(マン、ロゴサおよびシャープ(Man, Rogosaand Sharpe)、バイオカー(Biokar))中で12時間培養する。
【0094】
DSM ACC2258細胞をコンフルエンスになるまで、2週間培養し、次に前記12時間MRS培地、新鮮なMRS培地、または前記12時間MRS培養物から得られた4×108 細胞/ml を含むリン酸緩衝液(pH6.5)で、37℃で1時間インキュベートする。DSM ACC2258細胞をPBSで3回洗浄し、1M NaOH溶液で溶解し、次に細胞から放出される放射能強度を、シンチレーションカウンターで測定する。
【0095】
比較のために、CaCO−2株を前記方法と同じ方法で培養し、CNCM I−1225株でインキュベートし、細胞から放出される放射能強度を測定する。
【0096】
下記の表2に示す結果は、DSM ACC2258細胞は、CNCM I−1225細菌ならびにCaCO−2細胞に粘着することができることを示す。また12時間のLA−1株の培養物は、細菌の粘着を促進する因子を明らかに含有することがわかる。細菌を加えた新鮮なMRS培地は、低いレベルの粘着を示す。さらに、インビボで小腸管で見いだされるものと類似のpHであるpH6.5は、pHが5のオーダーより低い新鮮なMRS培地で得られる粘着レベルと比較すると、細菌の粘着を促進することがわかる。
【0097】
【表2】
【0098】
細菌CNCM I−1225を保持するDSM ACC2258株の能力はまた、バーネット(Bernet)らの方法(Gut,35,483−489,1994)により測定される。簡単に説明すると、100個の大腸細胞に粘着する細菌の数を肉眼で測定する。このために、12時間MRS培地、または12時間MRS培養物から得られた4×108 細胞/ml を含む新鮮なMRS培地を使用する。さらに、3つの調製物について解析を行い、各調製物について20枚の顕微鏡写真をランダムに使用する。
【0099】
比較のために、細菌CNCM I−1225を保持するCaCO−2細胞株の能力を、同じ方法で測定する。
【0100】
下記の表に示す結果は、この細胞株は多くの細菌を保持することができることを示す。また、12時間LA−1株の培養物は、細菌の粘着を促進する因子を明らかに含有することを注意すべきである。細菌を加えた新鮮なMRS培地では、このような高い粘着レベルを得ることはできない。
【0101】
【表3】
【0102】
7.b.クロストリジウム・ディフィシル( Clostridium difficile )および/または粘着性ビフィドバクテリア( bafidobacteria )への粘着:
Applied Evn.Microb.,59,4121−4128,1993およびEP577904(ネッスル(Nestle))に記載の細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile )および粘着性ビフィドバクテリア(bafidobacteria)を保持するDSM ACC2258株の能力も、測定する。結果は、この細胞株は多くの数の各細菌を保持することができることを示す。
【0103】
8.サイトキニン発現:炎症物質の存在下または非存在下で、DSM ACC2258株の細胞によるサイトキニンの発現を、異なるサイトキニンに特異的なDNAプライマーを用いて公知のRT−PCR法により測定する。これらのプライマーは常法に従い、ジーンバンク(GeneBank)データベースの異なるサイトキニンのDNA配列(受け入れ番号:TNFα:X02910;IL−1β:M15840;IL−6:M14584;IL−8:M28130;IL−ra:M97748)から調製される。炎症の誘導は、1mMのヒスタミンまたは20ng/ml のTPAとともに細胞株を24時間インキュベートすることにより行なった。
【0104】
比較のために、正常の大腸組織、HT−29およびCaCO−2腫瘍形成性細胞株を用いて同じ解析を行なった。結果を下記の表4に示す。
【0105】
【表4】
【0106】
実施例2
実施例1で成長させた他のヒト上皮大腸不死化細胞株は、前記DSM ACC2258株と類似の特徴を示す。例えば、他の5つの株(C、Q、D、H、P)のアルカリ性ホスファターゼ活性を図2に示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒト大腸の上皮細胞の不死化に使用されるベクターpLXSHD+SV40+。
【図2】ヒト大腸の上皮細胞から得られる異なる細胞株による小腸アルカリ性ホスファターゼ活性の発現を示すグラフ。
【図3】時間の関数としての、ガンマ−インターフェロンの存在下でMHCクラスII(HLA)抗原を発現する本発明の不死化上皮細胞の割合を示すグラフ。
Claims (19)
- 非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、およびヒトの大腸の非不死化上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーを発現し、インビトロで乳酸菌CNCM I−1225株に粘着することができる、腫瘍マーカーの欠如したヒト不死化大腸上皮細胞株。
- 非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカーとして、サイトケラチン、細胞間の結合組織、アルカリ性ホスファターゼ、サイトクロームP450、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、キノンレダクターゼ、Cu/Zn−スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラーゼから形成される群から選択される少なくとも2つのマーカーを発現する、請求項1に記載の不死化細胞株。
- 代謝分化マーカーとして、表面絨毛組織、ショ糖イソマルターゼ、大腸上皮細胞に特異的なMHCクラスII抗原、およびジペプチジルペプチダーゼIVから形成される群から選択される少なくとも2つのマーカーを発現する、請求項1に記載の不死化細胞株。
- ヒトガンマ−インターフェロンの存在下で、MHCクラスII抗原のHLA−DR抗原およびHLA−DP抗原を発現するが、該MHCクラスII抗原のHLA−DQ抗原を発現しない、請求項3に記載の不死化細胞株。
- 100個の大腸上皮細胞当たり少なくとも80個の細菌の割合で、インビトロで乳酸菌CNCM I−1225株に粘着することができる、請求項1に記載の不死化細胞株。
- 寄託番号DSM ACC2258を有する、請求項1に記載の不死化細胞株。
- 無機塩、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、BSA、エタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン、ビタミン、およびホルモンからなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の不死化細胞株の培養に適応させた無血清培地であって、培地は、微量元素、ビタミンCとレチノイン酸からなるビタミン、ならびにトリヨードチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、ウシ下垂体抽出物、インスリン、上皮増殖因子(EGF)およびトランスフェリンからなるホルモンを含んでなることを特徴とする、上記培地。
- 培地は、1〜100nMの微量元素、10〜1000nMのレチノイン酸、10〜1000nMのトリヨードチロニン、0.1〜50nMのデキサメタゾン、1〜100nMのハイドロコーチゾン、1〜100μg/mlのビタミンC、1〜100μg/mlのウシ下垂体抽出物、0.1〜50μg/mlのインスリン、0.1〜50ng/mlのEGFおよび0.1〜100μg/mlのトランスフェリンを含んでなることを特徴とする、請求項7に記載の培地。
- 請求項7に記載の培地であって、無機塩は、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、硫酸カリウム、塩素酸カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、重炭酸ナトリウム、亜硝酸第二鉄、メタバナジン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸第二銅、塩素酸マグネシウム、塩素酸マンガン、硫酸ニッケル、酢酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩素酸スズ、および硫酸亜鉛から形成される群から選択されることを特徴とする、上記培地。
- ビタミンは、D−パントテン酸カルシウム、塩素酸コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビオチンおよびシアノコバラミンから形成される群から選択される、請求項7に記載の培地。
- 培地は、80μM未満のカルシウムを含むことを特徴とする、請求項7に記載の培地。
- 培地は、下記の組成:
無機塩
NaCl 6.400 g/l
KCl 0.400 g/l
MgSO4−7H2O 0.200 g/l
CaCl2 0.200 g/l
NaH2PO4−H2O 0.13 g/l
NaHCO3 3.7 g/l
Fe(NO3)2−9H2O 0.0001 g/l
他の成分
グルコース 4.50 g/l
ヘペス 20 mM
フェノールレッド 0.010 g/l
ピルビン酸ナトリウム 0.110 g/l
BSA 0.3 %
PE 0.5μM
アミノ酸
L−アルギニン−HCl 0.0840 g/l
L−シスチン 0.0480 g/l
L−グルタミン 2 mM
グリシン 0.0300 g/l
L−ヒスチジン−HCl−H2O 0.0420 g/l
L−イソロイシン 0.1048 g/l
L−ロイシン 0.1048 g/l
L−リジン−HCl 0.1462 g/l
L−メチオニン 0.0300 g/l
L−フェニルアラニン 0.0660 g/l
L−セリン 0.0420 g/l
L−スレオニン 0.0952 g/l
L−トリプトファン 0.0160 g/l
L−チロシン 0.0720 g/l
L−バリン 0.0936 g/l
ビタミン
D−カルシウム−パントテン酸 0.004 g/l
塩化コリン 0.004 g/l
葉酸 0.004 g/l
イノシトール 0.008 g/l
ニコチンアミド 0.004 g/l
ピリドキシン−HCl 0.004 g/l
リボフラビン 0.0004 g/l
チアミン−HCl 0.004 g/l
ビタミンC 0.030 g/l
レチノイン酸 100 nM
微量元素 10 nM
ホルモン
インスリン 0.005 g/l
EGF 1 ng/ml
トランスフェリン 0.005 g/l
T3 100 nM
デキサメタゾン 1 nM
ハイドロコーチゾン 10 nM
ウシ下垂体抽出物 0.038 g/l
抗菌剤
ファンジゾン(Fungizone) 0.25μg/ml
ペニシリン 2.5 U/ml
ストレプトマイシン 5 μg/ml
ゲンタマイシン 10 μg/ml
(PE:ホスホリルエタノールアミンとエタノールアミンの混合物)
を有することを特徴とする、請求項7に記載の培地。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の不死化細胞株の調製方法であって、ヒト大腸から得られる初代上皮細胞の培養物を調製し、培養物を組換えウイルスで感染させて不死化細胞とし、その不死化細胞を請求項7〜12までのいずれか1項に記載の無血清培地で培養する、上記方法。
- 初代上皮細胞を、請求項7〜12までのいずれか1項に記載の無血清培地で培養する、請求項13に記載の方法。
- 培養物を、MuLVレトロウイルスの一部を含有するSV40 T−Ag組換えウイルスで感染させる、請求項13に記載の方法。
- 腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性を確認する方法であって、(1)腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有することが疑われる物質を、請求項1〜6までのいずれか1項に記載の細胞株を有する培養物と反応、培養または接触させ、そして(2)該細胞株に対するこの物質の作用を定量または測定する、上記方法。
- 請求項1〜6までのいずれか1項に記載のヒト大腸の不死化上皮細胞、請求項7〜12までのいずれか1項に記載の培地、および突然変異誘発性、毒性または有効性物質に対する該細胞の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キット。
- 請求項1〜6までのいずれか1項に記載のヒト大腸の不死化上皮細胞を使用することからなる、腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有する物質の同定方法。
- 請求項1〜6までのいずれか1項に記載のヒト大腸の不死化上皮細胞からなる、薬剤組成物。
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