PT851028E - Linha imortalizada de células epiteliais humanas da córnia - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "LINHA IMORTALIZADA DE CÉLULAS EPITELIAIS HUMANAS DA CÓRNEA" A presente invenção tem como objectivo uma nova linha imortalizada de células epiteliais humanas da córnea, assim como a sua utilização em processos de identificação de agentes mutagénicos, tóxicos ou benéficos para o metabolismo das células da córnea.

Estado da técnica

Desde há muitos anos, são realizados esforços para desenvolver linhas celulares humanas adaptadas ao estudo das doenças humanas, como, por exemplo, infecções, inflamações ou cancros. De entre as células frequentemente envolvidas no aparecimento de doenças, podem-se contar as células epiteliais que são sensíveis ao ambiente do corpo humano.

As células epiteliais distinguem-se das outras células do corpo humano pela expressão de compostos ou estruturas encontradas apenas nas células epiteliais, como, por exemplo, as citoqueratinas (Moll et al., Cell, 31, 11-24, 1982), as ligações entre as células (Gumbiner et al., Cell, 69, 385-387, 1992) e a vimentina (Richard et ai., Arch. Dematol. Res., 282, 512-515, 1990). 1 São, igualmente, encontrados outros compostos, geralmente nas células epiteliais humanas, mas não unicamente nas células epiteliais, como os citocromos P450 (Mercúrio et al., Biochem. Biophy. Research Communications, 210, n°2, 350-355, 1995;

McKinnon et al., Gut, 36, 259-267, 1995), as enzimas envolvidas na defesa contra a oxidação celular (dismutase de superóxido de Cu/Zn, peroxidase do glutationo, redutase do glutationo e catalase: Albers et ai., Toxicology and Applied Pharmacology, 109, 507-513, 1991 ) e/ou na destoxificação de electrófilos (α, μ ou π transferases de S do glutationo, : Singh et al. Exp. Eye Res., 40, 431-437, 1985; redutase de aldeido: Ellis et al.,

Biochemical J., 312, 535-541, 1995)

As células epiteliais da córnea humana distinguem-se, igualmente, de outras células epiteliais humanas pela expressão de compostos que são unicamente encontrados nas células epiteliais da córnea, como, por exemplo, a citoqueratina com 64 kD e a transferase de S do glutationo hGST 5.8, encontradas nos tecidos oculares (hGST 5.8: Singhal et al., Invest.

Ophthalmol. Vis. Sei., 36, 142-150, 1995; 64kD: Kiritoshi et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei., 32, 3073-3077, 1991). A análise da expressão de determinadas citocinas e factores de crescimento nas células epiteliais da córnea humana, sem estimulação inflamatória, foi já determinada por Cubitt et al., Wilson et al., Kennedy et al. e De-Quan et al. (J. Celullar

Physiol, 163, 61-79, 1995; J. Clinicai Investigation, 95, 82-88, 1995; Invest. Ophtha. & Visual Sei., 33, 1756-1762, 1992;

Invest. Ophtha. & Visual Sei., 36, 330-340, 1995; Invest. Ophtha. & Visual Sei., 34, 3199-3210, 1993). Para além disso, Rosenbaum et al. sugeriram que o perfil em citocinas das células da córnea pode ser um meio de detectar eficazmente a presença de 2 determinadas doenças da córnea (Invest. Ophthalmol. Vis. Sei., 36, 2151-2155, 1995). 0 perfil de expressão de determinadas citocinas e factores de crescimento nas células epiteliais da córnea permite, consequentemente, caracterizar e diferenciar as células epiteliais normais da córnea de outras células e, em particular, das células epiteliais anormais da córnea.

Para além disso, os métodos de rastreio de moléculas não-inflamatórias para os olhos recorrem a animais de laboratório. Para obviar o facto de existirem diferenças perceptiveis, morfológicas e bioquímicas, entre os olhos humanos e os dos animais, Hainsworth et al. propõem realizar estes testes de rastreio em culturas de células epiteliais primárias da córnea (J. Tissue Culture Meth., 13, 45-48, 1991).

Infelizmente, as culturas de células primárias de córnea deixam de se multiplicar após uma ou duas passagens, consistindo, cada passagem, na repicagem das células para meio fresco, após o crescimento até à confluência. Para além disso, estas células primárias não sobrevivem a uma congelação em azoto líquido.

Para atenuar estes inconvenientes, foram desenvolvidas linhas de células epiteliais humanas da córnea por Kahn et al. (Investigative Opht. & Visual Sei., 34, 3429-3441, 1993) e

Araki-Sasaki et al. (Investigative Opht. & Visual Sei., 36, 614-621, 1995). Infelizmente, estas linhas não são ainda totalmente satisfatórias.

De facto, as linhas desenvolvidas por Kahn et al. não se encontram completamente imortalizadas, uma vez que estas conservam algumas características originais de diferenciação, até, aproximadamente, 25 passagens sucessivas em cultura (ver Kahn et al.) . Estas linhas libertam, também, vírus SV40 no meio 3 de cultura (ver a análise de Araki-Sasaki et al.). Finalmente, não é conhecido se estas expressam, de facto, outros marcadores de diferenciação, tais como a transferase de S do glutationo hGST5.8 e um perfil adequado em citocinas e em factores de crescimento, assim como marcadores específicos ou necessários a uma reacção inflamatória. Para além disso, o documento US 5585265 (C.R. Kahn, J Rhim) descreve linhas de células epiteliais humanas da córnea.

As linhas imortalizadas desenvolvidas por Araki-Sasaki et al. são, por outro lado, incapazes de se estratificarem em ensaios de reconstrução da córnea in vivo (ver Araki-Sasaki et al.) e não é conhecido se estas expressam determinados marcadores da diferenciação, tais como a transferase de S do glutationo hGST5.8 e um perfil adequado em citocinas e em factores de crescimento, assim como marcadores específicos ou necessários a uma reacção inflamatória 0 objectivo da invenção visa o fornecimento de uma nova linha de células epiteliais humanas da córnea que se aproximam geneticamente e fisiologicamente das células epiteliais normais da córnea humana, de forma a que esta possa ser utilizada, eficazmente, em ensaios de rastreio de moléculas potencialmente inflamatórias.

Sumário da invenção

Para esta finalidade, a invenção refere-se à linha imortalizada de células epiteliais humanas da córnea apresentando o número de depósito CNCM 1-1777. 4

Um outro aspecto da invenção refere-se a um novo processo para identificar o efeito mutagénico, tóxico ou benéfico de um agente sobre o metabolismo das células da córnea, no qual (1) é feita reagir uma cultura compreendendo uma linha celular de acordo com a invenção com um agente suspeito de ser um agente mutagénico, tóxico ou benéfico para o metabolismo das células da córnea humana e (2) são determinados os efeitos do referido agente sobre a referida linha celular. A invenção refere-se, também, a um kit de diagnóstico compreendendo células epiteliais imortalizadas da córnea humana de acordo com a invenção e a reagentes para determinar uma resposta metabólica das referidas células a agentes mutagénicos, tóxicos ou benéficos para as referidas células.

Por fim, a invenção tem, também, como objectivo a totalidade das utilizações da linha celular de acordo com a invenção, em processos de identificação de agentes mutagénicos, tóxicos ou benéficos para o metabolismo das células da córnea, assim como a totalidade das utilizações destas linhas como agente farmacêutico activo.

Descrição das figuras

Figura 1: representação esquemática do plasmídeo pZIPSVU19 que foi utilizado para preparar o vector pl/SV40U19 destinado a imortalizar as células epiteliais primárias da córnea humana

Figura 2: percentagem de acumulação de [3H] fosfoinositideos por células epiteliais primárias da córnea humana e por 5 células CNCM, em função da concentração de bradicinina aplicada.

Figura 3: percentagem de acumulação de [3H] fosfoinositídeos por células epiteliais primárias da córnea humana e por células CNCM, em função da concentração de histamina aplicada.

Figura 4: percentagem de acumulação de [3H] fosfoinositídeos por células epiteliais primárias da córnea humana e por células CNCM, em função da concentração de PAF aplicada.

Descrição detalhada da invenção

No contexto da presente invenção, as expressões "células normais", "células primárias" ou "células não-imortalizadas" designam células epiteliais da córnea humana que podem ser retiradas da córnea de um adulto saudável, não apresentando deficiências fisiológicas ou genéticas impeditivas e que podem ser cultivadas durante um tempo limitado, sem que estas percam as suas características de diferenciação original.

Pelo contrário, a expressão "células imortalizadas" designa células que sofreram uma manipulação genética, através de uma construção de ADN que as torna capazes de se multiplicarem indefinidamente, ou seja, após mais de 25 passagens, de um modo preferido, pelo menos, 60 passagens.

Do mesmo modo, a palavra "passagem" designa o processo consistindo em retirar uma alíquota de uma cultura confluente ou em saturação de uma linha celular, inocular em meio fresco e 6 cultivar a linha até à confluência ou saturação. As linhas celulares são, deste modo, cultivadas tradicionalmente por passagens sucessivas em meios frescos. Deve ser referido que as linhas celulares podem perder as suas caracteristicas de diferenciação original após várias passagens sucessivas. É, consequentemente, extremamente vantajoso ser possivel dispor de uma linha cujas caracteristicas são conservadas, mesmo após numerosas passagens, de um modo preferido, pelo menos, 30 a 60 passagens.

Finalmente, a expressão "caracteristicas de diferenciação original" designa simultaneamente os marcadores encontrados especificamente nas células epiteliais humanas e os marcadores de diferenciação encontrados, especificamente, nas células epiteliais da córnea humana. A linha imortalizada de células epiteliais da córnea humana, de acordo com a invenção, não expressa marcadores tumorais, ou seja, não apresenta genes cancerígenos ou não expressa ARN mensageiro (ARNm), proteínas e/ou estruturas celulares diferenciadas, caracteristicas da transformação das células em células tumorais. A presença destes marcadores pode ser detectada, por exemplo, por hibridação ou PCR do seu ADN com uma sonda específica, por anticorpos e/ou microscopia electrónica. A presença de um marcador numa célula não significa que a referida célula seja susceptível de conferir, após alguns meses, um cancro a um murganho sem defesa imunitária, mas traduz antes um estado transformado canceroso das células, em comparação com as células originais das quais estas provêm. A linha de acordo com a invenção é, também, desprovida de vírus, ou seja, esta é incapaz de produzir os vírus que a 7 imortalizaram inicialmente, como é o caso das linhas desenvolvidas por Kahn et al. (ver a introdução de Araki-Sasaki et al.) . A linha de acordo com a invenção é capaz de se estratificar, ou seja, é capaz de se organizar em camadas sucessivas. Para isto, basta cultivar a linha de acordo com a invenção até à confluência, num meio sem soro, compreendendo 1,5 mM de CaCl, por exemplo, após observar visualmente se as células se desenvolvem em camadas.

Pelo contrário, a linha de acordo com a invenção, expressa marcadores metabólicos específicos de células epiteliais humanas normais, ou sejam, marcadores geralmente encontrados nas células epiteliais.

Estes marcadores específicos podem ser um ARN mensageiro (ARNm), uma proteina e/ou uma estrutura celular diferenciada podendo ser provenientes de células epiteliais, por exemplo, da pele, do olho, do tracto intestinal ou do figado. As células epiteliais humanas de acordo com a invenção expressam, pelo menos, dois marcadores escolhidos do grupo formado por vimentina, citoqueratinas, ligações entre as células (também designadas em inglês como "tight junctions"), citocromos P450, transferase de S do glutationo (GST), dismutase do superóxido de Cu/Zn (SOD), peroxidase do glutationo (GP), redutase do glutationo (GR), catalase (CA) e redutase do aldeído (AR).

Pode ser, também, observado que a linha de acordo com a invenção pode expressar enzimas envolvidas na oxidação celular (SOD, GP, GR e CA) e/ou na destoxificação de electrófilos (GST, AR). Esta linha está, deste modo, particularmente adaptada ao 8 estudo dos fenómenos das inflamações ou das irritações da córnea humana. A linha celular de acordo com a invenção expressa, também, marcadores metabólicos de diferenciação que são específicos das células da córnea, nomeadamente, das células epiteliais da córnea humana (ver Reiners et al., Carcinogenesis, 11, 957-963, 1990) . Estes marcadores de diferenciação podem ser um ARNm, uma proteina ou uma estrutura celular diferenciada. A linha de acordo com a invenção, expressa, pelo menos, 2 marcadores de diferenciação escolhidos do grupo formado por citoqueratina com 64 kD, transferase de S do glutationo hGST5.8 e um perfil em citocinas e factores de crescimento compreendendo os compostos TNFa, IL-Ιβ, IL-Ια, IL-6, IL-8, GM CSF-β, IL-ra, TGF-βΙ, TGF-βΙ, TGFa, EGF, PDGF-β. A linha de acordo com a invenção é, igualmente, capaz de expressar, pelo menos, um marcador especifico de uma reacção inflamatória, ou seja, uma molécula que é detectável quando a célula reage a uma estimulação inflamatória e/ou a uma molécula ou a uma estrutura que são necessárias a uma reacção inflamatória.

As estimulações inflamatórias podem ser induzidas quando as linhas de acordo com a invenção são colocadas em contacto com, por exemplo, um microrganismo da espécie Pseudomonas aeruginosa (Kernacki et al., J Ocul. Pharmacol., 10, 281-288, 1994), com o factor de activação das plaquetas PAF (Bazan et al., Exp. Eye Research, 14, 769-775, 1995), com 12-O-tetradecanoilforbol (TPA: agente promotor de tumores), com histamina (Sharif et al., J. Ocular Pharmacol., 10, 653-664, 1994), com bradicinina 9 (Sharif et ai., Neurochem. Int., 18, 89-96, 1991) ou com outros compostos inflamatórios. A colagenase I é um marcador facilmente detectável quando uma linha é submetida a uma estimulação inflamatória (Bazan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 8678-8682, 1993). Podem ser, também, detectados outros marcadores, como, por exemplo, o c-fos (ver Bazan et al.), os intermediários araquidónicos 12-HETE e de 12-HETrE (Conners et ai., Inves. Ophth. & Visu. Sei., 36, 828-840, 1995) ou um novo perfil em citocinas e em factores de crescimento. A linha de acordo com a invenção é, igualmente, capaz de expressar, pelo menos, um marcador necessário a uma reacção inflamatória, tal como, por exemplo, o receptor da bradicinina, o receptor da histamina, o receptor do PAF e o sistema da transdução de um sinal pelos fosfoinositideos (Phosphoinositide turnover signal transduction pathway; Sharif et ai., Neurochem. Res., 12, 1313-1320, 1993). A invenção refere-se, em particular, a uma linha imortalizada, de acordo com a invenção, que foi depositada, sob o Tratado de Budapeste, junto da Collection Nationale de

Cultures de Microorganismes, Instituto Pasteur, 25 Rua Docteur Roux, 75724 Paris, 22 de Outubro de 1996, onde esta recebeu o número de depósito CNCM 1-1777. A linha epitelial de acordo com a invenção conserva as suas caracteristicas de diferenciação original, mesmo após numerosas passagens, nomeadamente, pelo menos, 25 passagens, de um modo preferido, pelo menos, 30 a 100 passagens. 10

Para obter a linha de acordo com a invenção, pode ser preparada uma cultura de células epiteliais primárias provenientes da córnea humana, infectar a cultura com um virus recombinante e cultivar as células imortalizadas num meio de cultura sem soro. Para esta finalidade, o especialista na técnica dispõe de numerosos meios de cultura sem soro. A titulo de indicação, podem-se citar, por exemplo, os meios sem soro descritos por Gibson et al. (Gut, 35, 791-797, 1991), Pfeifer et al. (Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 90, 5123-5127, 1993), Kulkani et al. (Carcinogenesis, 16, O \—1 0 £ 2515-2521, 1995) ou, por exemplo, nos documentos EP96201064.1 e US08/576483. Um meio sem soro perfeitamente adaptado às necessidades deste processo é o meio KGM (Clonetics, US) . A linha de acordo com a invenção foi obtida realizando as etapas seguintes: (1) é obtida uma amostra de tecidos epiteliais de uma córnea humana; (2) esta amostra é preparada, tendo em vista a sua cultura in vitro; (3) as células epiteliais são inoculadas num meio de cultura sem soro e em placas de cultura compreendendo um revestimento que facilita a ligação das células e o seu crescimento; (4) o meio é modificado as vezes necessárias para optimizar o crescimento confluente; (5) as células são infectadas com um virus recombinante; 11 (6) e as células imortalizadas são cultivadas num meio de cultura sem soro.

Mais detalhadamente, a etapa 1) refere-se à obtenção de amostras de células da córnea de indivíduos normais no momento de actos cirúrgicos. Na etapa 2), pode-se lavar a amostra no meio de cultura, seccioná-la em fragmentos, separar a parte epitelial dos outros tecidos através de meios físicos e/ou químicos. Por exemplo, os fragmentos de tecidos podem ser colocados numa solução compreendendo uma protease durante um tempo suficiente para permitir a separação das células.

Na etapa 3) , podem-se inocular as células epiteliais num meio de cultura sem soro, apresentando as placas de cultura, um revestimento constituído, por exemplo, por uma solução de gelatina a 0,01-1%.

Na etapa 4), o meio de cultura contendo as células epiteliais é modificado as vezes necessárias para optimizar um crescimento confluente. De um modo preferido, o meio é substituído cada dois dias. Após ter sido obtida uma confluência de cerca de 90% da superfície disponível, o que geralmente ocorre 10 a 14 dias após a inoculação, as células são separadas por tratamentos numa solução de proteases.

As células separadas são transferidas para a etapa 5) num meio de cultura fresco, então as células são, seguidamente, infectadas de uma forma clássica com um vírus recombinante. Encontram-se, à disposição do especialista na matéria muitas técnicas de transfecção. A título de exemplo podem-se citar as técnicas descritas no documento W096/07750, por Claudia Chen et 12 al. (Mol. and Cell. Biol., 7, 2745-2752, 1987) ou por Wilson et ai. (Analytical Biochemistry, 226, 212-220, 1995).

De um modo preferido, é utilizado um virus recombinante SV40, compreendendo o Antigénio T (Ag-T), uma origem de replicação do virus inactivado e um gene de selecção. A titulo de exemplo, pode ser utilizada a construção de ADN pLXSHD+SV40+ descrita por Stockshlaeder et ai., cuja sequência está disponivel na base de dados GeneBank (n° de acesso M64753; Human Gen. Therapy, 2, 33-39, 1991).

Podem ser, também, facilmente construídos outros vectores adequados, pelo especialista na técnica, a partir de vectores disponíveis comercialmente, compreendendo o gene codificante para Ag-T, um gene de selecção e/ou uma origem de replicação do virus inactivado. A titulo de exemplo, a construção pl/SV40U19 pode ser preparada, criando locais BamHI nas extremidades do fragmento Bgl-Hpal do SV40 e por clonagem deste fragmento no local BamHI do plasmideo pZIPSVU19 descrito na figura 1, abaixo, por Jat et ai., Mol. Cell. Biol., 9, 1672-1681, 1989.

Na etapa 6) as células epiteliais são transferidas para um meio de crescimento fresco, em placas de cultura tendo o revestimento descrito acima.

Sendo conhecidas as propriedades novas e originais da linha de células epiteliais de acordo com a invenção, é possível considerar a sua aplicação em estudos imunológicos, farmacológicos e toxicológicos A linha de acordo com a invenção está, deste modo, particularmente adaptada para o rastreio de agentes mutagénicos, 13 tóxicos ou benéficos para o metabolismo das células da córnea, por exemplo, num processo no qual (1) é feito reagir, é cultivado ou é colocado em contacto um agente suspeito de ser um agente mutagénico, tóxico ou benéfico para o metabolismo das células da córnea, com uma cultura compreendendo a linha celular de acordo com a invenção, e (2) são determinados ou medidos os efeitos do referido agente sobre a referida linha celular. É, também, possivel considerar, igualmente, a preparação de um kit de diagnóstico compreendendo as células epiteliais de acordo com a invenção e reagentes para determinar uma resposta metabólica das referidas células a agentes mutagénicos, tóxicos ou benéficos. A linha de acordo com a invenção está, também, adaptada à expressão de proteínas recombinantes. Os métodos de transfecção de ADN exógeno são, actualmente, bem conhecidos do especialista na técnica (ver, por exemplo, documento WO 94/05472) A linha de acordo com a invenção tem, também, uma utilidade potencial na terapia genética ex vivo. Esta linha poderá constituir, de facto, um instrumento adequado para desenvolver células recombinantes, expressando os genes de interesse, tendo em vista uma aplicação terapêutica. Uma vantagem apresentada adicionalmente pela linha de acordo com a invenção, é que esta não está exposta a um soro animal, o que reduz consideravelmente os riscos de contaminações potenciais por virus ou outros agentes patogénicos. A presente invenção é descrita abaixo mais detalhadamente utilizando a descrição adicional que se irá seguir, a qual se refere a exemplos de preparações da linha celular de acordo com 14 a invenção. A cultura das linhas celulares, a preparação de vectores SV40, a transfecção, a preparação de sondas e de iniciadores de ADN e a análise da expressão dos marcadores são, na ausência de indicações em contrário, realizadas de acordo com os protocolos descritos nas referências citadas acima e nos do trabalho de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Manual Laboratory, Cold Spring Harbor Press Laboratory, U.S.A., 1989).

As percentagens são fornecidas em peso, salvo indicação em contrário.

Exemplo 1 0 plasmideo pl/SV40U19 é construído, criando locais BamHJ nas extremidades do fragmento Bgl-Hpal do SV40 e clonando este fragmento no local BamíLT do plasmideo pZIPSVU19 descrito por Jat et al., Mol. Cell. Biol., 9, 1672-1681, 1989. A titulo de indicação, o vector pZIPSVU19, representado esquematicamente na figura 1, compreende o marcador de selecção neomicina e o LTR do virus Moloney. 0 virus SV40 é preparado de acordo com uma versão modificada do protocolo de Lynch e Miller (J. Virol., 65, 3887- 3890, 1991). Para esse fim, são cultivadas as linhas celulares

Psi2 ecotrópica (Mann et al., Cell, 33, 153-159, 1983) e PA317 anfotrópica (ATCC CPL9078) em meio DMEM (Dulbecco, USA) compreendendo 10% de soro fetal de vitelo, a 37 °C e sob uma atmosfera compreendendo CO2 a 5%. Estas linhas são transfectadas classicamente, separadamente, utilizando CaC12 250 mM e 10 pg do plasmideo pl/SV40U19, são submetidas a um tratamento com tripsina após 48 h de incubação, são misturadas em quantidades iguais e o total é incubado a 37 °C, sob uma atmosfera 15 compreendendo CO2 a 5%. Após crescimento até 80% de confluência os virus são recolhidos em meio sem soro KGM-1 (=meio KBM de Clonetics, US, compreendendo, adicionalmente, CaCl 0,15 mM, extracto de hipófise bovina 30 pg/mL, hidrocortisona 0,5 pg/mL, insulina 5 pg/mL, transferina 10 pg/mL, promotor do crescimento epidérmico murino (EGF) 10 ng/mL, penicilina 10000 U/mL e Estreptomicina 10000 U/mL). Após filtração (0,45 pm, Micropore), é determinada a quantidade de virus nas células NIH 3T3 (ATCC CRL 1658).

As células primárias epiteliais da córnea foram obtidas após biópsia do olho de um dador com 73 anos morto após enfarte do miocárdio. A amostra é lavada em tampão fosfato PBS, é tratada a 4 °C durante 24 h com dispase II 10 U/mL (Boehringer Mannheim, n° 295825) num tampão compreendendo 50% de meio KGM-2 (= KBM + CaCl 0,05 mM, extracto de hipófise bovina 30 pg/mL, promotor do crescimento epidérmico murino 10 ng/mL, hidrocortisona 0,5 pg/mL, anfotericina B 0,05 pg/mL, insulina 5 pg/mL, transferina 10 pg/mL, gentamicina 50 pg/mL). Após incubação, as células são separadas manualmente, são lavadas em meio DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco, US)

compreendendo 10% de soro fetal, bovino, são centrifugadas, os sedimentos são retomados em meio KGM-2 e são espalhadas sobre placas de cultura previamente pré-incubadas numa solução de gelatina A a 0,1% (G2500 Sigma). As placas são incubadas a 37 °C sob uma atmosfera compreendendo 100% de humidade relativa, oxigénio a 95% e dióxido de carbono a 5%. O meio de cultura contendo as células epiteliais é modificado as vezes necessárias, para optimizar um crescimento confluente.

Após ter sido obtida uma confluência da ordem dos 90%, após 2 semanas de cultura, as células são separadas classicamente, 16 por tratamento numa solução de dispase II. As células separadas são seguidamente transferidas para meio KGM-1 e em placas de cultura pré-incubadas com uma solução de gelatina A a 0,1%. As culturas são, seguidamente, infectadas na presença de 8 pg/mL de polibreno e um titulo elevado de virus recombinante SV40 ( 105-107 CFU) preparado como descrito acima. Após 2 h de incubação com o virus, as culturas são lavadas em PBS e as células são cultivadas por passagens sucessivas em meio KGM-1 fresco, tendo o cuidado de, sucessivamente, em cada passagem, lavar as células num tampão HBSS (Hanks Balnced Salt Solution, Biofluids n° 325); separá-las através de um tratamento durante 12 h a 37 °C numa solução compreendendo dispase II 2,4 U/mL, tampão HBSS a 50% e meio KBM a 50%; recolhê-las em meio KBM; centrifugá-las; retomar o sedimento em meio KBM-l; seguidamente, espalhar as células sobre novas placas frescas.

As células transformadas foram purificadas a partir das células epiteliais primárias por passagens sucessivas. Após diluição das células transformadas, previamente separadas pela dispase II, num meio de cultura, foi possível seleccionar 9 linhas imortalizadas individualizadas de células epiteliais da córnea humana, das quais uma foi depositada, sob o Tratado de Budapeste, junto da Collection Nationale de Cultures de

Microorganismes, Instituto Pasteur, 25 Rua Docteur Roux, 75724 Paris, 22 de Outubro de 1996, onde esta recebeu o número de depósito CNCM 1-1777. 1. Análise do cariótipo da estirpe CNCM 1-1777 A análise do cariótipo da estirpe CNCM 1-1777 foi realizada pelo "Children's Hospital of Michigan", 3901 Beaubien Blvd, 17

Detroit, em conformidade com o método descrito no manual "Human cytogenetics, Edts : Rooney DE, Czepulkowski BH, IRL Press, Oxford, 1986. Os resultados mostram que a linha conserva intacto, no seu genoma, um cromossoma de cada par de cromossomas. 0 sexo da linha é XX. 2. Tumorigenicidade da estirpe CNCM 1-1777 São injectadas 107 células da linha CNCM 1-1777, obtidas na 33a passagem, em murganhos sem defesa imunitária ("nude") de acordo com o protocolo descrito por Stauffer et al. (The American journal of surgery, 169, 190-196, 1995). Não é visível qualquer formação de tumor após vários meses. 4. Contaminação virai da linha CNCM 1-1777

Foi determinado se a linha CNCM 1-1777 está contaminada pelo virus da hepatite C (HCV), pelo vírus da hepatite B (HBV) e pelo vírus da SIDA (HIV-1). Os resultados das experiências abaixo descritas são negativos para a presença dos 3 vírus.

Para a análise do HBV, é extraído ADN a partir de, aproximadamente, 2 x 106 células, por tratamento com soluções de fenol e clorofórmio, seguido por uma precipitação com etanol. As amostras de ADN são, então, submetidas a uma amplificação por PCR utilizando iniciadores específicos para a região pré-núcleo do vírus (Linche et ai., J. Virol., 65, 3887-3890). Os produtos da amplificação são, seguidamente, separados em gel de agarose e visualizados sob U.V. na presença de brometo de etídio. Para comparação, é analisada, da mesma forma, em paralelo, uma 18 diluição de um soro contendo 10-105 HBV (Anawa Biomedical

Services 6 Product, USA).

Para a análise do HIV-1, as amostras de ADN descritas acima são submetidas a uma amplificação por PCR, utilizando iniciadores específicos para a região GAG do virus. Os produtos da amplificação são, seguidamente, separados em gel de agarose e visualizados sob U.V. na presença de brometo de etidio. Para comparação, é analisada, da mesma forma, em paralelo, uma diluição de um soro contendo 10-105 HIV (Anawa Biomedical

Services 6 Product, USA).

Para a análise do HCV, o ARN é extraído a partir de cerca de 2xl06 células, pelo método de Chomczynski et al. (Biochem

Anal., 162, 156-159, 1987). É realizada, classicamente, uma transcrição reversa e o ADN complementar obtido é submetido a uma amplificação por PCR, utilizando iniciadores específicos para a região 5' não codificante do virus. Os produtos da amplificação são, seguidamente, separados num gel de agarose e visualizados sob U.V. na presença de brometo de etidio. Para comparação, é analisada, da mesma forma, em paralelo, uma diluição de um soro contendo 10-105 HCV (Anawa Biomedical Services 6 Product, USA). 5. Marcadores específicos de células epiteliais humanas para a linha CNCM 1-1777 5. a. Citogueratinas: são fixadas as células de uma cultura da linha CNCM 1-1777, obtidas na 22a passagem, em placas em vidro, utilizando uma solução a 100% de metanol frio, seguidamente, as placas são lavadas num tampão 19 compreendendo Tris 0,05 M pH 8,6, NaCl a 1,8% e

polietilenoglicol 2000 a 0,2% (tampão TNP). As células são, seguidamente, incubadas durante 30 minutos na presença de anticorpos de murganho específicos para determinadas citoqueratinas (anti-CH péptido 4, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 19, 20: Sigma e Boehringer) . Após 3 lavagens em tampão TNP compreendendo BSA a 0,5%, as placas são incubadas durante 60 min com um anticorpo de cabra anti IgG de murganho, compreendendo um composto imunofluorescente (1:300, FITC-goat anti mouse IgG; Biosys) . Após 3 lavagens no tampão anterior, as placas são fixadas e analisadas por fluorescência sob microscopia. Todas as células são positivas para as citoqueratinas 4, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 19. 5.b. Vimentina: são fixadas as células de uma cultura da linha CNCM 1-1777, obtidas na 22a passagem, como descrito acima. Seguidamente, as células fixadas são submetidas a um anticorpo de murganho anti-vimentina (DAKO, USA), seguido do anticorpo de cabra anti-IgG de murganho referido acima. Todas as células são positivas para a vimentina sob microscopia de fluorescência. 5.c. Ligações entre as células: as células da linha CNCM I-Í777, obtidas na 22a passagem, são cultivadas, em placa de vidro, até à confluência, são fixadas por tratamento com uma solução de glutaraldeido a 2,5% num tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 1 h, à temperatura ambiente. Após duas lavagens no mesmo tampão fosfato, as células são novamente fixadas numa solução de 0s04 a 2% no 20 mesmo tampão. As células são, seguidamente, desidratadas em soluções sucessivas de etanol a 30, 50, 70, 90 e 100% (Polaron Equipment Ltd., Watford, UK), seguidamente, as células são revestidas com uma camada fina de ouro (SEM coating unit E5100, Polaron). As células são, seguidamente, examinadas sob microscopia electrónica (Philips 505 SEM). A análise revela que as células apresentam ligações intercelulares que são caracteristicas das células epiteliais ("tight junctions" em inglês). 5.d. Citocromo P450: E analisada a expressão dos citocromos pelas células da linha CNCM 1-1777, obtidas na 30a passagem, através da técnica conhecida de RT-PCR, utilizando iniciadores de ADN específicos para diferente citocromos P450. Estes iniciadores foram preparados classicamente, a partir das sequências de ADN de diferente citocromos que estão acessíveis na base de dados GeneBank (CYP1A1: n° de acesso X02612; CYP2C: n° de acesso M61855 ou M61858 ou M61856 ou MM61854; CYP2D6: n° de acesso M33388; CYP1A2: n° de acesso Z00036) .

Para tal, as células são cultivadas até à confluência em caixas com 35 mm (Costar) , o ARN é extraído utilizando o kit RNAeasy (Qiagen), é realizada uma transcrição reversa (lst Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR, Boehringer Mannheim), o ADN complementar obtido é submetido a uma amplificação por PCR utilizando os iniciadores de ADN específicos para diferentes citocromos P450, os produtos da amplificação são, então, separados em gel de agarose e são visualizados sob U.V., na presença de brometo de etídio. Os 21 resultados mostram que as células CNCM 1-1777 expressam os citocromos CPY1A1, CYP1A2, CYP2C, CYP2D6. 5.e. Enzimas envolvidas na oxidação celular e na destoxificação de electrófilos: são cultivadas as células da linha CNCM 1-1777, obtidas na 30a passagem, o ARN é extraido pelo método de Chomczynski et al. (Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987), seguidamente, é realizada uma

transferência de Northern deste ARN com sondas de ADN codificando parcialmente para a dismutase de superóxido de Cu/Zn (SOD), para a peroxidase do glutationo (GP), para a catalase (CA) e para a transferase π de S do glutationo (GSTn). As sondas de ADN são preparadas, classicamente, a partir de sequências de ADN de genes codificantes para estas enzimas que estão disponíveis na base de dados GeneBank (GSTn: n° de acesso X08058; GP: n° de acesso M21304; CA: n° de acesso M81578; SOD: n° de acesso 729336). Os resultados destes ensaios mostram que todas as células expressam uma transcrição dos genes codificantes para a actividade SOD, GP, CA e GSTn.

Para além disso, a expressão da redutase do glutationo é, igualmente, confirmada pelo teste enzimático descrito por Gondhowiardjo (Cornea, 12, 310-314, 1993). A actividade catalase é, também, confirmada pelo teste enzimático descrito por Aeby et al. (Method & Enzymology, 105, 121-126, 1984). Por fim, a actividade de redutase de aldeído é, também, detectada pelo teste enzimático descrito por Ellis et al. (Blochemlcal Journal, 312, 535-541, 1995). 22 6. Marcadores específicos das células epiteliais da córnea para a linha CNCM 1-1777 6.a. Expressão da citoqueratina com 64 kD: como para a análise das citoqueratinas descritas acima, as células são fixadas em placas de vidro, utilizando uma solução de metanol frio a 100%, seguidamente, as placas são lavadas em tampão TNP (ver acima). Seguidamente, as células são incubadas durante 30 min na presença de anticorpos de murganho, específicos para a citoqueratina com 64 kD (Anticorps AE5, ICM Biomedical Inc, US). Após 3 lavagens no tampão TNP, compreendendo BSA a 0,5%, as placas são incubadas durante 30 min com um anticorpo de cabra anti IgG de murganho compreendendo um composto imunofluorescente (1:300, FITC-Goat anti mouse IgG; Biosys). Após 3 lavagens no tampão anterior, as placas são fixadas e são analisadas por fluorescência sob microscopia. As células são positivas para a citoqueratina com 64 kD. 6.b. Expressão da transferase de S do glutationo hGST5.8: é analisada a expressão da transferase de S do glutationo hGST5.8 através do teste descrito por Singhal et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sei., 36, 142-150, 1995). Em resumo, são misturados um extracto citossólico 10 pg/mL da linha CNCM 1-1777 com 4-hidroxinonenal 0,1 mM e glutationo 0,5 mM em tampão fosfato de potássio 100 mM a pH 6,5, seguidamente, é medida a actividade enzimática pela modificação da absorvência da mistura a 224 nm. Os resultados mostram que a linha CNCM I- 1777 expressa uma actividade transferase de S do glutationo hGST5.8. 23 6.c. Perfil de expressão das citocinas e dos factores de crescimento: são cultivadas células da linha CNCM 1-1777, obtidas na 30a passagem, o ARN é extraído, seguidamente, é realizado um PCR sobre este ARN, com diferentes

iniciadores, para confirmar a transcrição dos ARN

codificantes para as citocinas e/ou os factores de crescimento seguintes: TNFa, IL-Ιβ, IL-la, IL-6, IL-8, GM CSF-β, IL-ra, TGF-βΙ, TGF^2, TGFa, EGF e PDGF-β.

Estes iniciadores correspondem a uma parte dos genes codificantes para estes compostos, estando as sequências de ADN dos referidos genes acessíveis na base de dados GeneBank (n° de acesso TNFa: X02910; IL-Ιβ: M15840; IL-la: M15329; IL-6: M14584, Rosenbaum et al., Inv. Opth. & Vi. Sc., 36, 2151-2155, 1995/ IL-8: M28130; GM CSF-β: X03021; IL-ra: M97748, Kennedy et al., J. Clinic Inv., 95, 82-88, 1995; TGF-βΙ: X02812, Nishida et al., Curr. Eye Res., 14, 235-241, 1995; TGF^2: Y00083; TGFa: M22440; EGF: L17 0 3 2; Ρϋ6Ρβ: X02811).

Para comparação, é realizada a mesma análise do perfil de expressão das citocinas e dos factores de crescimento, sobre o ARN proveniente de tecidos epiteliais da córnea humana (4 biópsias diferentes) .

Os resultados são apresentados na tabela 1 abaixo. O sinal * indica que a expressão dos compostos IL-Ιβ, TNFa, IL-la, IL-6 e IL-8, foi igualmente confirmada por testes ELISA a partir do meio de cultura das células CNCM 1-1777. Encontram-se comercialmente disponíveis anticorpos específicos contra as diferentes citocinas (IL-Ιβ, TNFa: BioSource Inter., US, N° de catálogo KHC0012 e KHC3013; IL-la, IL-6 e IL-8: CLB corp., US, N° de catálogo M1901, M1916, M1918). 24

Tabela 1

Citocinas e factores de Crescimento CNCM 1-1777 Biópsia 1 Biópsia 2 Biópsia 3 Biópsia 4 TNFa* + + /- + /- + /- + /- IL-Ιβ* +++ + ++ + ++ IL-la* +++ + /- ++ + +++ IL-6* ++ + + - - IL-8* +++ + /- + + ++ GMCSF-β ++ + /- + /- + /- + /- IL-ra ++ + +++ ++ + TGF-βΙ +++ + ++ + ++ TGF-p2 + + + + ++ ++ ++ TGFa + + + + + + + ++ EGF + + + + + + + + +++ PDGF-β + + /- + /- + /- + /- (-: não detectado; +/-: detectado ligeiramente; +++: abundante) 7. Marcadores específicos de uma reacgão inflamatória para linha CNCM 1-1777 7. a. Colagenase I: a colagenase I é uma molécula cuja expressão caracteriza um estado normal de inflamação das células da córnea. É possivel detectar a expressão da colagenase por PCR, transferência de Western ou Elisa. Para detectar a colagenase I por PCR, são cultivadas células CNCM 1-1777, obtidas na 29a passagem, na presença de 20 25 ng/mL de TPA durante 16 a 24 h, o ARN é extraído e é detectada a presença de ARNm da colagenase I por PCR, com um iniciador derivado da sequência de ADN da colagenase I (Genebank: n° X05231).

Para detectar a colagenase I por transferência de Western, após terem sido cultivadas células CNCM 1-1777 na presença de 20 ng/mL de TPA durante 16 a 24 h, o meio de cultura é recuperado, é concentrado com um filtro Amicon30®, as proteína são separadas por electroforese num gel de poliacrilamida SDS-page, estas são transferidas para um filtro por transferência de Western, o filtro é submetido a um primeiro anticorpo anti-colagenase I (Córtex Biochem, US, n° 60338P), a um segundo anticorpo ligado a uma peroxidase (Pierce, US, n° 31400), seguidamente, ao substrato da peroxidase.

Para detectar a colagenase I por Elisa, é suficiente utilizar o kit hMMP-1 da Amershan (catálogo, rpn 2610), seguindo as recomendações do fornecedor.

Os resultados mostram que é possível detectar a expressão da colagenase I quando as células CNCM 1-1777 são submetidas a um tratamento inflamatório. Por outro lado, quando as células CNCM 1-1777 não são colocadas em contacto com TPA, estas não expressam colagenase I detectável por PCR, transferência de Western ou Elisa. 7,b. Marcadores necessários a uma reacção inflamatória: os receptores da bradicinina, da histamina, do PAF e o sistema de transdução dos fosfoinositídeos são marcadores 26 essenciais para que a linha CNCM 1-1777 possa estar fisiologicamente num estado normal de inflamação. Para detectar a presença destes marcadores, são incubadas células CNCM 1-1777 ou células epiteliais primárias da córnea humana, na presença de compostos inflamatórios que são supostos de interagirem com receptores ligados ao sistema de transdução de sinais inflamatórios pelos fosfoinositideos e é medida a concentração de moléculas de fosfato do inositol (PI), deste modo, produzidas. A acumulação do PI é, de facto, caracteristica da existência de receptores dos compostos inflamatórios.

Os ensaios são baseados nos protocolos de Sharifs et al. descritos em J. Ocular Pharmacol., 10, 653-664, 1994; e

Neurochem Res., 12, 1313-1320, 1993. Em resumo, são cultivadas cerca de 2,5 x 105 células CNCM 1-1777, em placas compreendendo 24 poços, em meio DMEM, na presença de [3H]mio-inositol (1 pCi/0,5 mL; 15-17 Ci/mM, Amersham Corp.), durante 24 h a 37 °C. O meio dos poços é aspirado e estes são expostos durante 60 min a 37 °C, a meio DMEMs compreendendo LiCl 10 mM, tampão HEPES 15 mM e diferentes concentrações de bradicinina (Collaborativw Biomedical, US) , de histamina (Sigma US) ou PAF (BioMol Research Lab, US) . Para inactivar a reacção, o meio é, então, aspirado e é adicionado ácido fórmico 0,1 M aos poços. Seguidamente, as células são um lisadas, os compostos são separados do lisado numa coluna de permuta iónica (resina de AGlx8; coluna Econo®, Biorad, US), eluindo a coluna com 10 mL de água desionizada e 8 mL de uma solução de formato de amónio 50 mM e a radioactividade libertada pelas fracções de eluição é quantificada com um contador de cintilação. 27

Os resultados são analisados de acordo com o método descrito por Sharif et al. (Neurochem. Int., 18, 89-96, 1991). O valor EC50 define a concentração de composto necessária para estimular 50% do máximo da actividade do sistema de transdução dos fosfoinositideos.

Os resultados apresentados nas figuras 2, 3 e 4, mostram que as células CNCM 1-1777 apresentam receptores da bradicinina, da histamina, do PAF e que estas se comportam como células epiteliais primárias da córnea humana.

Exemplo 2

Como descrito no exemplo 1, é analisada a capacidade da linha CNCM 1-1777, obtida na passagem 106, expressar marcadores metabólicos específicos das células epiteliais humanas não-imortalizadas, marcadores metabólicos de diferenciação, específicos das células epiteliais não-imortalizadas da córnea humana e marcadores de uma reacção inflamatória. Os resultados são comparáveis aos apresentados no exemplo 1.

Lisboa, 19 de Janeiro de 2007 28

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Linha imortalizada de células epiteliais humanas da córnea, capaz de se estratificar e capaz de expressar marcadores metabólicos específicos das células epiteliais humanas não-imortalizadas, marcadores metabólicos de diferenciação, específicos das células epiteliais não-imortalizadas da córnea humana e marcadores específicos de uma reacção inflamatória, apresentando a referida linha imortalizada o número de depósito CNCM 1-1777.
2. 2. Processo para identificar o efeito mutagénico, tóxico ou benéfico de um agente sobre o metabolismo das células da córnea, no qual (1) é feito reagir uma cultura compreendendo uma linha celular de acordo com a reivindicação 1 com um agente suspeito de ser um agente mutagénico, tóxico ou benéfico para o metabolismo das células da córnea humana e (2) são determinados os efeitos do referido agente sobre a referida linha celular.
3. 3. Kit de diagnóstico compreendendo as células epiteliais imortalizadas da córnea humana, de acordo com a reivindicação 1 e reagentes para determinar uma resposta metabólica das referidas células a agentes mutagénicos, tóxicos ou benéficos.
4. 4. Utilização das células epiteliais imortalizadas da córnea humana, de acordo com a reivindicação 1, em processos de identificação de agentes mutagénicos, tóxicos ou benéficos para o metabolismo das células da córnea. 1
5. 5. Utilização de células epiteliais imortalizadas da humana de acordo com a reivindicação 1, como um farmacêutico activo. Lisboa, 19 de Janeiro de 2007 córnea agente 2